生物学実験演習プリント

Ⅰ　実験・研究のはじめに

［１］研究テーマを決める

　１）テーマの吟味自分で決めるにしても指導者に決めてもらうにしても、ここが一番大事である。そのテーマが

自己の研究環境に合っていることが必要である。いくら立派なテーマでも、予算、機器、技術、期間などを総合的に考慮する必要がある。

　２）テーマの具体化研究テーマはその分野で現在まで判っていることを踏まえ (総説や論文の読破により現状を把

握する)、この研究ではここの未解決部分を解明するという具体的な課題の設定(仮説の証明の具体化)が必要である。例として、すでに他者により冷蔵庫が冷えないという現象が報告されているとき、その原因には①停電、②コンセントが抜けている、③メインスイッチが OFF、④機械の故障の可能性の仮説を立て、実験ではそのひとつひとつを検証すれば原因がつきとめられる。つまり、“その原因は②であった”という論文が出来る。最初のうちは下敷きとなる論文を探して、その骨格を利用して自己のカラーを上塗りする方法が無難である。

３）テーマの独創性当たり前のことであるがその研究は世界初でなければ意味がない。そのためには、研究テーマ

に自己の研究環境の独創性を生かした工夫が大切である。

［２］研究の進め方

　１）研究テーマの全体構成　　先に挙げた研究テーマを実証する場合、実際は 4～７の個別の研究課題をひとつのストーリー

にすることが多い。その個別のテーマが具体的なそれぞれの実験となる。論文でいえば、図ひとつや表ひとつが個別のテーマである。それぞれの個別のテーマが関連をもち、未知の分野に進歩することが大切である(つまり、それぞれの関係からこのことが新たに言える)。

２）個別のテーマの実験法　①　実験目的

はじめにその実験の目的を明確にする。実験が終了した場合に得られる結果を、どのような図、あるいはどのような表にするのかをあらかじめ想定することが必要である。具体的にはどの濃度、どの時間、どの組合せで変化は上がるのか、あるいは下がるのか、依存性、相関性、因果関係、などが言えるように設定する。なるべく定性より定量的に関連づける方がよい。

②　実験計画(材料と方法)　 Ⅰ：あらかじめ実験方法を正確に綿密に作成する。実験の成功・失敗はここの部分で決まる。

使用した薬品や材料、処理時間や温度のメモ、試薬の濃度等もあらかじめ計算しておく（暗算も厳禁）。Ⅱ：実験のプログラムも作り、何時から準備、何時から操作開始、何時終了、いつ片付け等の日程や時刻を決めておく。Ⅲ：必要な場合は予備的実験により必要な技術や、至適試薬濃度、至適処理時間の妥当性を調べておく。ほとんどの場合は予備実験が必要である。むしろ、10 の予備実験でひとつの本実験が普通である。

③ 実験結果(データ取り)あらかじめ実験結果のデータ記載欄を作っておく。写真の場合もあらかじめ添附場所を決めておく。データは速やかに記入出来るよう準備しておくことが大切である。

1

生物学実験演習プリント

④ 実験のまとめと考察　 実験結果は、実験目的の項で設定した図や表にまとめ、それを解釈・考察する。また発表用の

図・グラフ・写真を作成する（エクセルによるグラフ作りや表作り、統計学的処理、写真撮影とその原稿の処理等を習得）。

［３］研究の発表

　　　　研究結果は通常は学会においてスライドによる口頭発表・ポスター展示発表などを行う。いずれの場合も発表では研究の背景から、目的・結果・考察をみんなに判りやすく、しかも正確に紹介することが大切である。この演習ではパワーポイントによる口頭発表をする。また最終的には本実験を論文として高山まで提出する(後期定期試験開始日までに共通教育の事務、山下さんへ)。

　　１）発表のポイント 観察や実験結果は基本的に過去形で表現する。 結果では事実をそのまま淡々と具体的に表現(集落数が 2.7倍になったなど)する。抽象的用語(殺菌・増殖・耐性など)や副詞や形容詞はなるべく使用しない。

考察では実験の結果が他の報告とどのように位置づけられるかを示す(どこが同じで、どこが違う)。

考察では事実から、どのような一般的(抽象的)な説明が可能か述べる。 考察で言いたいが、けれども言い過ぎの場合は逃げ道を作る・・・断定できない場合は「こ

うである可能性が示唆される」、「こうであるかもしれない」などの表現を用いて逃げる。同じ分野の研究者はお互いがライバルであり、言い過ぎると必ず反撃に合うので適切な表現に心がける。

［４］発表論文の構成

　　　論文は投稿する予定の雑誌の各巻（Vol）の第１号(No)に投稿規定（Instruction to Authors）が掲載されている。Googl で雑誌名を検索し、その雑誌の HP には投稿規定が載せてある。現在は電子投稿も増えてきた。それに従って体裁を整える。また“論文と図表の書き方”に関するマニュアル本が多数あるのでそれらを参考にしてルールに従って作成する。初歩的な誤りだけで査読者(レフェリー)から受理不可(unacceptable)となることがある。最初のうちは、自己の研究の発表論文に多数引用した雑誌が取り敢えず投稿の雑誌となるが、その雑誌の論文を丁寧にまねていくのが良い。

　１）論文の種類　　（１）総説 review・・・・・・現在までに発表された学説のまとめと批判　　（２）原著 original・・・・・・著者の研究報告　　（３）報告 report・・・・・・ 症例報告などでデータの羅列でよい　　（４）短報 short communication・・・原著に準じるが速報性がある、刷り上がり 2ページ以

内が原則　　（５）抄録 summary・・・・・・学会発表の要約、学会発表の場合事前に学会に送付する。　２）原著論文の構成

Title（表題）内容を簡潔に２～３行に

Authors(著者)　　順序は共同研究者と相談、記載法や所属機関名などや投稿規定に合わせる　　Abstract（要約）内容事実の要約（Abstract）を観念化・抽象化・理論化・一般論化する。…現在形

Introduction（目的）実験の背景説明と、その実験の作業仮説（Hypothesis）を設定する。…現在形

Materials and Methods（材料と方法）

2

生物学実験演習プリント材料や方法を、再試・追試出来る様に正確に記載する。…過去形

Results（結果）実験の事実を正確に、科学的、淡々と、客観的に述べる。定性的より定量的表現をする。また、図や表あるいは写真にまとめることが望ましい。…過去形

Discussion（考察）実験の事実を基に、実験の目的や実験の作業仮説と得られた結果の説明、また他の研究と比較、位置づけや今後の展望を述べる。…現在形

Acknowledgments（謝辞）実験をサポートしてくれた人に感謝を記載する。

Keywords実験の内容を表す単語や学名など、数単語を検索用に記載する。

References（引用文献）引用した、他の研究論文を記載する。

Running head / Running headline （欄外見出し）ページの上欄外に、数語の見出しを付ける。

Ⅱ　予備実験A　手指の細菌観察

自分の手指に着いている細菌を調べる。10 / 16　【１】手指の細菌　①採取と培養　１）準備

　　①　１枚の普通寒天平板培地/人、マジックインク、手指、消毒液、等２）操作

　（１）採取① 平板培地の裏側をマジックインク適当に分割し、区画に採取条件など、グループ、氏名を記入する。

② 各自の左右（？）の手、親指の第１関節内側を培地面に軽くスタンプする。この場合、手洗い前後、消毒剤処理の有り無しなどを比較してもよい。各班の自由課題とする。

　（２）培養①　37℃、１日間の培養を行う（米子）。

10 / 2０　　　　【１】手指の細菌　②観察・染色・記載・写真

１）準備① 前回の培養普通寒天平板培地普通寒天平板培地(１枚/人)

② その他ディスポ白金耳とディスポ白金耳捨て容器、顕微鏡、グラム染色セット（ハッカー液、ルゴール液、エタノール、パイフェル液、スライドグラス、コルネット鉗子、DW点眼瓶、バーナー、ツェーデル油、乾燥用ロ紙、エタノール・エーテル綿）、等

２）操作（１）培地上の細菌集落観察

①　培地上の細菌集落を観察・スケッチする。観察・記載は科学の始まりで、どうしてこうなるの?　いくつの科学的説明、可能性を考えられるかがその人の科学的能力を示す。この方法を開発した人は、19 世紀後半のコッホという科学者で、微生物の性質を利用した分離定量方法、微生物研究法の基礎的手法である。この技術で、細菌の研究は爆発的に進展した。

②　大きさ、形、色調、臭い等の原因を考察する。また手指の汚染を考察する。①～②は文章で

3

生物学実験演習プリント記載もする。科学的記載方法、文学的ではダメである。

（２）集落の細菌のグラム染色『　<塗抹＞

① スライドグラスをコルネット鉗子で挟む。② は DW点眼瓶で粟粒量の水を載せる。多すぎるのは乾燥しないので良くない。③ 平板培地の集落を新しいディスポ白金線で採る（かるく触れる）。④ 採取した菌をグラス上の水に混ぜ、塗り広げる。菌の濃い部分と薄い部分をつくる気持ち

で！⑤ ディスポ白金線を消毒液入容器に捨てる。⑥ 塗抹面の乾燥をする。乾燥すると表面の光沢が変化する。⑦ グラスを電気バーナーで約 30秒間、軽く熱して火炎固定（滅菌と固着）し、冷却する。＜グラム染色＞① 塗抹面にハッカー液を載せ、１分間染色する。② 塗抹面の裏側から水流を当て、水洗する。③ ルゴール液を載せ、１分間処理する。④ 同様に水洗する。⑤ エタノールを載せ、約 15秒間の脱色をする。⑥ 同様に水洗する。⑦ パイフェル液を載せ、１分間染色する。⑧ 同様に水洗する。⑨ ロ紙を用いて乾燥させる。＜顕微鏡観察＞① 塗抹面にツェーデル油を米粒量載せる。② 対物レンズを 100倍に設定する。③ レンズを遠ざける方向で、ピントを合わせる。反対にするとレンズが破損する。④ 観察・スケッチ・文字でも記録する。携帯のシャメールでも写真が撮影できる。あとで PC

に取り込んでプリント保存可能である。手指には付着菌と定住菌が付いている。<記載方法＞菌の形状（球状が球菌、棒状が桿菌）菌の配列性(ブドウの房状、連鎖性、単在性、束状、ローマ字型など)グラム染色性(紫色がグラム陽性菌、紅色が陰性菌)、等の記載をする。

⑤ 観察が終われば、エーテル・エタノール液で対物 100倍レンズを拭く。必ず忘れないように、そうしないと次回あるいは来年の学生はレンズが使えなくなる。　　　　　　　

』B　デンプン分解菌の検索

自然界に生息する細菌のなかからデンプンを分解する細菌を見つけ、その性状を調べる。

10 / 20 　【１】デンプン分解菌の検索　①材料の選択

　１）準備　①　各自ひとつの小型プラスチックチューブ

２）操作①　来週１０／２７　までに、デンプン分解菌が生息していそうな場所の材料(土壌、落ち葉、汚水、ヒト唾液、食品などの極少量を、プラスチックチューブに入れて用意する。プラスチック分解菌を入れると、チューブが消えてしまうので念のために・・。デンプンを利用する細菌がどんなところにいるのか？

4

生物学実験演習プリント10 / 27　【１】デンプン分解菌の検索　②材料の培養　１）準備　①　１枚のデンプン加普通寒天培地/ 人

②　生理的食塩水(全体で数 10 ml)と 2ml駒込ピペット(シリコンキャップ付き)③　ディスポ白金耳と消毒液入りディスポ白金耳捨て容器④　サインペン２）操作①　材料が液性のものなら、ディスポ白金耳で 1ループ採取する。②　材料が固形性のものなら、生理的食塩水を約 1ml加えて、ディスポ白金耳で１ループ採取す

る。③　採取した白金耳の微生物を、デンプン加培地上の全面に、画線希釈しながら接種する。④　シャーレのふたに、グループ名と材料を記入する。⑤　米子で 3 ７℃、24h の培養を行う。

11 / 5　【１】デンプン分解菌の検索　③観察・染色・記載・写真　１）準備　①　前回培養したデンプン加培地　1枚/人

②　その他物差し、ディスポ白金耳と消毒液入りディスポ白金耳捨て容器、顕微鏡、グラム染色セット、等

　２）操作（１）集落の観察とデンプン分解菌の検出と観察　①　培地のデンプン顆粒が消失している場所(デンプン分解酵素産生細菌による顆粒の消失)の中

央に集落形成している細菌集落をさがす。②　顆粒消失集落数と非消失集落数を数える。生息菌中のデンプン分解菌の割合を求める。③　代表的な集落をスケッチする。また、最大の顆粒消失円の直径を測る。その集落形成細菌の

デンプン分解活性を示す。（２）最大の顆粒消失円を形成した、集落形成細菌のグラム染色

①　スライドグラスをコルネット鉗子で挟む。③ グラス上に DW点眼瓶で粟粒量の水を載せる。④　デンプン加培地の該当する集落の一部にディスポ白金耳で軽く触れ、菌を採取する。⑤　その菌をグラス上の水に混ぜ、塗り広げる。菌の濃い部分と薄い部分をつくる気持ちで！⑥　ディスポ白金耳を消毒液入り容器に捨てる。⑦　塗抹面の乾燥をする。乾燥すると表面の光沢が変化する。⑧　以下、3ページの＜グラム染色＞と<顕微鏡観察＞を行う。観察・記載・写真を忘れないよ

うに!!

11/10　【１】手指の細菌の発表

結果の参考例・・・・次ページ

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　【２】デンプン分解菌の検索発表

5

生物学実験演習プリント　　結果の参考例・・・・次ページ

グラフ作成

6

選択

選択

選択

手指の集落数

手洗い前 手洗い後Aさん 34 56Bさん 23 45Cさん 67 120Dさん 34 23

手洗い前 手洗い後平均 39.5 61標準偏差 19.1 41.7

t- : 検定 等分散を仮定した２標本による検定

平均分散観測数プールされた分散

自由度t P(T<=t) 片側t 境界値 片側P(T<=t) 両側t 境界値 両側

分解菌 非分解菌 測定総数グランド 34 5 39畑 56 23 79唾液 21 45 66下水 34 40 74

場所によるデンプン分解菌の割合

手指の細菌数

0

20

40

60

80

100

120

140

検査

/集落数シャ

ーレ

手洗い前手洗い後

手洗いと細菌数変化

0

20

40

60

80

100

120

処理

/集落数シャ

ーレ

環境中のデンプン分解菌

0%20%40%60%80%

100%

材料

分解菌

と非

分解禁

の割

合

非分解菌分解菌

環境中のデンプン分解菌

0102030405060708090

場所

/集落数シャ

ーレ デンプン

非分解菌

デンプン分解菌

生物学実験演習プリント

グラフ作成例

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生物学実験演習プリント

Ⅲ本実験

A 抗菌因子産生菌

臨床で感染症に適用される抗生物質とは、ある微生物の産生が産生し他の微生物に障害作用を示す因子である。微生物同志もお互いに生残をかけて自己の生残の為の武器を持っている一例である。この研究では、こうした因子を産生する細菌を探すことを目的と

する。

11/1 ７　【１】はじめに

作業仮説の設定と実験の目的の明確化①既に判っていること・・・文献の検索をする。検索は、keywords として soil bacteria, antibiotics, antibacterial factor/ 土壌細菌、抗生物質、抗菌因子などで調べる。② そこで、この実験では・・・表皮ブドウ球菌(ヒトの皮膚に常在するブドウ球菌、仲間には黄色ブドウ球菌もいる)に対する新しい抗菌因子産生細菌株を取得し、新しい坑生物質として実用化できる糸口を見つけることを目的とする。

目的を達成するための実験方法解析手段を吟味する（いくらノーベル賞クラスの目的でも、それを解明する手段がなければ…、予算、技術、計測機器、期間など）。今回は私が考えます。

【２】抗菌因子産生菌　①材料の選択　１）準備　①　１本/人のプラスチックチューブ抗菌因子産生実験１１／２７　　および１本/人のプラスチ

ックチューブ食品中の微生物１１／２７　　２）操作

① 次回の為に抗菌因子産生実験用の材料(草地、グランド、森、ガソリンスタンド、河川、海、砂丘、風呂場の汚水など)を約 1 g、あるいは 1 ml を空きチューブに入れてくる。また、食品中の微生物用の食品(微生物が存在すると考えられる)を 1 ml、あるいは 1 g空きチューブに次回までに用意する。良く考えて材料を選ぶこと。

付録実習１　ヒト歯垢の微生物１）準備① 爪楊枝、消毒液入り容器、グラム染色セット、顕微鏡、など

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生物学実験演習プリント２）操作

（１）塗抹標本作製①　スライドグラスに DW点眼瓶で水を粟粒量に載せる。②　爪楊枝で歯垢を採り、グラス上の水に混ぜ、塗り広げる。爪楊枝は消毒入り容器に捨てる。③　乾燥させる。

（２）グラム染色①　グラム染色を、前述(ページ３)の方法で行う。

（３）顕微鏡観察　①　顕微鏡観察を前述(ページ３)の方法で行う。

②歯垢の細菌群観察・スケッチする。文字での記録と口腔内細菌の菌種の大別をする。③上気道への内因感染（風邪など）や齲歯の原因との関連を考察する。

11 / 2 ７　 　【１】抗菌因子産生菌　②選択培養(混合培養)　　１）準備

① 前回渡しておいた材料の入ったチューブ(各自持参)② １枚の普通寒天平板培地／人③　表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）の菌液とスポイト④　その他、生理的食塩水（希釈液）と 2ml駒込ピペット、ディスポ滅菌綿棒とそれを捨てる容

器、マジックインクなど１）操作

（１）表皮ブドウ球菌（指示菌）の接種① 普通寒天培地平板を用意する。② 塗抹用ディスポ綿棒を準備する。③ Staphylococcus epidermidis　菌液１～２滴の平板に滴下する。④ 塗抹用ディスポ綿棒で、滴下した菌液を丁寧に培地平板全面に、丁寧に塗り広げる。⑤　塗抹用ディスポ綿棒を消毒液入り容器に捨てる。

（２）材料の処理と接種①　(1)　土壌などの固形物は試験管に入れて、希釈液を約１ ml加える軽く混ぜる。その上部(沈殿部でない)の液をディスポ白金耳で取り指示菌を塗抹した培地面に画線希釈接種する。(2)　液状の材料はそのままディスポ白金耳で取り指示菌を塗抹した培地面に画線希釈接種する。つまり、表皮ブドウ球菌と材料の検査細菌の混合培養を行う。ディスポ白金耳を消毒液入り容器に捨てる。

　（３）培養　①　接種された培地平板を 37℃、数日間の培養(米子)をする。

11 /２ 7　付録実習２　食品中の微生物

１）準備①　前回渡しておいたチーブの食品(漬け物、納豆、ヨーグルト、チーズ、ミルミル、味噌など)② ディスポ白金耳とそれを捨てる消毒入り容器、グラム染色セット、顕微鏡、など２）操作

（１）塗抹標本作製①　スライドグラスに DW点眼瓶で水を粟粒量に載せる。②　ディスポ白金耳で食品材料を少量採り、グラス上の水に混ぜ、塗り広げる。ディスポ白金耳

は消毒入り容器に捨てる。③　乾燥させる。

（２）グラム染色

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生物学実験演習プリント①　グラム染色を、前述(ページ３)の方法で行う。

（３）顕微鏡観察　①　顕微鏡観察を前述(ページ３)の方法で行う。

②　食品の細菌群観察・スケッチする。文字でも記載する。③　食品中に細菌が多数いた場合は、それを食べたときヒトの消化器系における細菌の運命を考察せよ。何故、腹痛・下痢にならないか?　消化器系における有用な細菌は？　有害な細菌はどのようなしくみで死滅させられるのか？

12 / 1 【１】抗菌因子産生菌　③追加選択培養

１）準備①　前回接種した選択培養(混合培養)の培地平板　（1枚/人）②　１枚の普通寒天培地平板／人③　指示菌の Staphylococcus epidermidis　の菌液とスポイト(前回と同様)④　その他、ディスポ綿棒とそれを捨てる消毒液入り容器、マジックインク、など２）操作

（１）前回の培地平板の観察と抗菌因子産生菌の選択①　検体細菌の集落周縁に指示菌の発育阻止帯が形成されているかどうかを調べる。阻止帯が形

成されていない場合は、その可能性が高そうな集落を選ぶ。表皮ブドウ球菌の集団にうち勝って発育した細菌集落という選択条件を課している。つまり、やや大きめでその集落辺縁で表皮ブドウ球菌の発育抑制的な集落を選ぶ。どの集落を選ぶかが運命分かれ道である。各自約８個を選び、シャーレの裏から丸印を付けて次の操作に使用する。朝青龍より安馬か？？？

（２）指示菌の接種①　新しい普通寒天平板を各自１枚用意する。マジックインクで裏から 8区画する。②　ディスポ綿棒を準備する。③　Staphylococcus epidermidis　菌液１～２滴の新しい平板に滴下する。④ ディスポ綿棒で指示菌の菌液を丁寧に平板全面に塗り広げ、乾燥させる。⑤　ディスポ綿棒を消毒入り容器に捨てる。

（３）培養平板から集落からの分離と培養①　シャーレの裏から丸印を付けた目的の細菌集落を、ディスポ白金線を用いて、指示菌接種し

8区画された培地平板の一画の真ん中に点状に穿刺する。1平板で８個は検査できる(詳細は板書する)。

　②　3 ７℃、1晩の培養する(米子)。

12 / 8 【１】抗菌因子産生菌　④分離培養　１）準備　 ①　前回培養した追加選択培養平板　1枚/人

②　４枚の普通寒天培地平板／グループ③　その他、ディスポ白金耳とそれを捨てる消毒入り容器、マジックインクなど２）操作

（１）集落からの分離と命名　①　最も広い指示菌 Staphylococcus epidermidis の発育阻止円を示す細菌集落を平板より、

グループで 4 個選び、インクで裏から○を画く。菌株の命名、たとえば Koyama 株などとする。

（２）細菌株の抗菌活性①　選んだ 4株の、表皮ブドウ球菌発育阻止円の直径を測る(複数箇所の測定をし、平均値を出

す)。詳細は板書します。この阻止円の直径を抗菌因子の抗菌活性とします。必ずメモしてお

10

生物学実験演習プリントいて下さい。大切！！

（３）細菌株の分離培養①　選んだそれぞれの集落の中心に、ディスポ白金耳で軽く触れ、採取する。

　②　採取した１株ずつ新しい平板培地の端の１カ所突き刺す(穿刺培養、詳細は板書します)。ディスポ白金耳は消毒入り容器に捨てる。

　③　別のディスポ白金耳を用いて、つき刺した箇所から、全面に画線希釈接種する。孤立した集落が形成されることが大切である。表皮ブドウ球菌の全面への塗抹とは違う。ディスポ白金耳は消毒入り容器に捨てる。

　④　37℃、1晩の培養する(米子)。

12 / 15 【１】抗菌因子産生菌　④染色・観察・記載・写真、⑤生物学的、生化学的性状（１）

１）準備①　前回培養した、孤立集落からの分離培養された集落平板（4菌株・4枚／グループ）②　ディスポ白金耳とそれを捨てる消毒入り容器、グラム染色セット、顕微鏡、など③　チトクロームオキシダーゼ試薬含有綿棒、スライドグラスとカタラーゼ試薬瓶、⑤　チトクロームオキシダーゼ陽性菌対照(緑膿菌)とカタラーゼ陽性菌対照(緑膿菌)の培養して

ある培地平板⑥　生物学的・生化学的性状検査の為の、ドリガルスキー改変軟寒天培地 4本/グループ、クリグ

ラー半斜面培地 4本/グループ２）操作

　（１）分離培養された培地平板からの、目的菌の選択　　①　前回分離培養した材料中には、目的の抗菌因子産生株と表皮ブドウ球菌株があった。そこで、

目的の抗菌因子産生株を孤立した集落から数個選び、シャーレの裏側に丸を付ける。マークした細菌を下記の試験に使用する。

　（２）抗菌因子産生株のグラム染色　　①　集落の細菌をグラム染色する。観察・記載・写真等の記録をする。　（３）チトクロームオキシダーゼ試験　　①　チトクロームオキシダーゼ試薬含有綿棒（１％テトラメチルパラフェニレンジアミン塩酸

塩）で集落を約３秒間、 軽く押さえる。　　②　1 分以内に綿棒の菌付着部位が青色に変化すると、チトクローム オキシダーゼ陽性(酵素を

有する菌である)とする。オキシダーゼ試薬含有綿棒は消毒入り容器に捨てる。（４）カタラーゼ試験

　　①　点眼用瓶のカタラーゼ試薬（３％過酸化水素水）をスライドグラス上に米粒量、4 カ所に滴下する。

②　ディスポ白金耳で集落の菌を採取し、カタラーゼ試薬（過酸化水素水）中で混ぜる。　　③　過酸化水素がカタラーゼより酸素に分解され、発泡すればカタラーゼ陽性である。スライド

グラスとディスポ白金耳は消毒入り容器に捨てる。　（５）生物学的、生化学的検査　　①　抗菌因子産生菌の 4株それぞれをドリガルスキー改変軟寒天培地にディスポ白金耳で穿刺接

種する。ディスポ白金耳は消毒入り容器に捨てる。②　抗菌因子産生菌の 4株それぞれをクリグラー半斜面培地に、高層部にディスポ白金耳で穿刺接種し、連続的に斜面部に画線培養する。詳細は板書します。ディスポ白金耳は消毒入り容器に捨てる。

③　両培地の菌を、37℃で、24 時間培養する(米子)。

12 / 22 【１】抗菌因子産生菌　⑥生物学的・生化学的性状（２）

　１）準備

11

生物学実験演習プリント①　前回接種して培養したドリガルスキー改変軟寒天培地②　前回接種して培養したクリグラー半斜面培地２）操作

（１）ドリガルスキー改変軟寒天培地の変化と判定

培地変化 判定

全体が無変化 菌が発育していない。表面部のみ細菌痕で緑色 好気性菌・・・発育していればブドウ糖非発酵的分解である。呼吸では

酸の産生は微量で黄色にはならない。下層部の穿刺線部にのみ細菌痕で緑色

嫌気性菌・・・下層部が黄色になればブドウ糖発酵による有機酸の産生で培地は酸性化し、BTB は黄色となる。嫌気性菌は呼吸しない。

表面部と下層部に細菌痕で全体が黄色

通性菌・・・呼吸と発酵する。培地全体が発酵により酸性となり、BTBは黄色となる。

濁り(穿刺線に濁り) 鞭毛をもつ細菌で運動をする。寒天濃度が 0.3%であることに留意BTB：ブロムチモールブルー・・・・黄色は酸性、青色はアルカリ性

（２）クリグラー半斜面培地の変化と判定

斜面部 高層部 判定

赤 赤 非発育。発育していればブドウ糖・乳糖非発酵菌(呼吸による酸化)である。赤 黄 ブドウ糖の発酵的分解菌・・・斜面部の呼吸では炭酸ガス産生による培地の酸

性化より、アミノ酸の分解によるアンモニア産生で培地の pH はよりアルカリ化となり、PH は赤色となる。高層部では発酵により有機酸産生により、培地は酸性化して pH は黄色となり、PH は黄色となる。

黄 黄 乳糖の発酵的分解菌・・・・・・培地の乳糖はブドウ糖より大量に含まれているので、発酵産物である有機酸で酸性化がアルカリ化を上回る。

培地の亀裂 難水様性のガス産生菌・・ガスがたまり亀裂が生じる。黒 硫化水素産生菌・・・培地中の鉄が硫化鉄となり黒色化する。

PH:フェノールレッド・・・・黄色は酸性、赤色はアルカリ性

【２】結果全体のまとめ

結果は表、図、写真等にまとめる。Excel により表、図、写真等原稿を作り、PowerPointに張り付ける。

１）結果のまとめ　　　

　　　　＜まとめ方の一例＞ 分離菌株(4株)の集落の性状・・・集落の形状 分離菌株の坑菌活性・・・発育阻止帯の直径 分離菌株の細菌学的性状・・・形態、染色性 分離菌株の生物学的性状・・・運動性、好気性、嫌気性 分離菌株の生化学的性状・・・カタラーゼ、チトクロームオキシダーゼ、ブドウ糖・乳糖分解(呼吸・発酵)

２）考察12

生物学実験演習プリント　　　　＜考察についての一例＞

分離した菌株はどのような細菌か、資料を参考にしてその可能性を出来るだけ絞り込む。

矛盾する検査の結果はないか？ 因子の想定される性状(水溶性、低分子、安定性など)について。 その他

1/19　

【１】抗菌因子産生菌の発表（１）PowerPoint による発表（各グループ 10 分）をする。目的(簡単)、方法(簡単)、結果(表

や図にまとめる)、考察等に分けてみんなに判りやすいこと、また成果を正確に表現できていることが大切である。

（２）論文原稿としても記録する。Word による A4版用紙での論文原稿をグループ単位で作成する。体裁は配布している投稿原稿を参考にする。その一部を後期定期試験開始日までに（事務の山下さん）提出すること。

付表

(1)　普通寒天培地　　　　肉エキス　　　　　　1g ペプトン　　　　　　1g 　　　塩化ナトリウム　　 0.3g 寒天　　　　　　　　1.5g　　　　DW 　　　　　　　100ml

(2)　デンプン加普通寒天培地　　　　　上記の普通寒天培地に不溶性デンプンを 5%加えたもの

(3)　ドリガルスキー改変軟寒天培地　　　　肉エキス　　　　　　0.4 g

　　ペプトン　　　　　　1.0 g ブドウ糖　　　　　　1.0 g ブロムチモール青　　0.004 g 　(pH 指示薬;アルカリで青色、酸性で黄色) 寒天　　　　　　　　0.３ g

　　　　　DW 100 ml

(4)　クリグラー半斜面寒天培地　　　　　肉エキス　　　　　　0.4g 　　　ペプトン　　　　　　1.5g　　　　　乳糖　　　　　　　　１ｇ

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生物学実験演習プリント　　　　　ブドウ糖　　　　　　0.1g　　　　　塩化ナトリウム　　　0.5g　　　　　チオ硫酸ナトリウム　0.003g　　　　　亜硫酸ナトリウム　　0.04g　　　　　硫酸第一鉄　　　　　0.02g　　　　　フェノールレッド　　0.002g　 (pH 指示薬;アルカリで赤色、酸性で黄色)

寒天　　　　　　　　1.5 g　　　　　　　　　　DW　　　　　　　100ml

　　

＜参考＞（１） ペプトンを呼吸・発酵で利用するとアンモニアを産生して培地はアルカリ化する。（２） 糖を呼吸で利用すると炭酸ガス産生を産生して培地はややアルカリ化する。糖を発酵で

利用すると酢酸、乳酸、蟻酸などを産生し培地は酸性化する。（３） 硫黄含有アミノ酸を分解すると硫化水素を産生し培地に鉄などの金属があると硫化鉄など

を産生し培地は黒色化する。（４） 寒天濃度が 1.5%濃度であると培地は堅く運動性細菌も培地を動き回ることは出来ないが、

0.3%濃度であれば培地は軟らかく運動性細菌は培地中を動き回れる。

細菌やウイルスに対する薬剤

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生物学実験演習プリント

グラム陰性菌の鑑別

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生物学実験演習プリント

グラム陽性菌の鑑別

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生物学実験演習プリント

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結果のまとめと考察例 （SH-G株の例）

生物学実験演習プリント

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投稿規定

生物学実験演習プリント

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投稿規定

生物学実験演習プリント

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生物学実験演習プリント

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生物学実験演習プリント

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生物学実験演習プリント

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生物学実験演習プリント

手指の細菌資料

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生物学実験演習プリント

歯周病と歯垢・細菌　資料

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生物学実験演習プリント

デンプン分解酵素　資料

なお、このノート(学生に無料配布)作成に当たり下記の資料を借用させて頂いた。深く感謝し、厚く御礼いたします。　　　　鳥取大学医学部　高山寿雄

（１） ウィキペディア26

生物学実験演習プリント

（２） ドクタープラザＨＰ（３） 美容ライブラリー HP（４） 日本臨床微生物学会・学会誌（５） 微生物検査学、太田、金森ら編集、近代出版(東京)（６） 医学細菌の同定の手引き、坂崎利一監修、近代出版(東京)

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