中性瘀血藥鍼과 當歸鬚散加味湯이 외상성 뇌손상 흰쥐의...

한방재활의학과학회지 제20권 제1호 (2010년 01월)

JOrientalRehabMed2010;20(1):13-26

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￭ 접 수 :2010년 1월 6일, 수정 :2010년 1월 14일, 채택 :2010년 1월 16일￭ 교신저자 :최진봉,광주광역시 남구 월산동 동신대학교 광주한방병원 한방재활의학과

Tel:(062)350-7219,E-mail:[email protected]

中性瘀血藥鍼과 當歸鬚散加味湯이 외상성 뇌손상 흰쥐의

신경보호에 미치는 영향

정일문⋅최진봉

동신대학교 한의과대학 한방재활의학과교실

Neuroprotective Effects of Neutral Pharmacopuncture for Blood

Stasis and Tangguisusangami-tang(dangguixusanjiawei-tang ) in

the Experimental Traumatic Brain Injury Rats

Il-Moon Jong, O.M.D., Jin-Bong Choi, O.M.D.

Dept. of Oriental Rehabilitation Medicine, College of Oriental Medicine, Dong-Shin University

Objectives:

ThisstudywasdesignedtoevaluateneuroprotectiveeffectsofNeutralPharmacopunctureforBloodStasis(NPBS)intoSP10andTangguisusangami-tang

(dangguixusanjiawei-tang)(TGT)intheexperimentalTraumaticBrainInjury(TBI)rats.

Methods:

Maleratsweredividedinto4groups.GroupⅠ wasnotreatmentafterTBI.GroupⅡ wastreatmentwithNPBSintoSP10afterTBI.GroupⅢ was

treatmentwithTGTafterTBI.GroupⅣ wasNPBSintoSP10andTGTafterTBI.

Theauthorcarriedoutneurologicalmotorbehavioral,histologicalassessmenttest.

Results:

1.Inneurologicalmotorbehaviortests,motorandcognitivefunctionrecoverywassignificantlyincreasedintheGroupⅡ,Ⅲ,Ⅳ.AlsoGroupⅣ was

increasedascomparedwithGroupⅡ,Ⅲ.

2.InBAXexpression,accordingtopriorityGroupⅣ,Ⅲ,Ⅱ,Ⅰ weredecresedin7and14dayslater.EspeciallyGroupⅣ wassignificantlydecreased

in14dayslater.

3.InBCL-2expression,GroupⅣ wasincreasedslightlyin7dayslater.MostincresedexpressionwasexperimentedintheGroupⅣ in14dayslater.

4.InTUNELexpression,Ⅳ wasdecreasedascomparedwitheachGroupⅠ,Ⅱ,Ⅲ in7dayslater.GroupⅣ,Ⅲ weredecreasedascomparedwith

eachGroupⅠ,Ⅱ in14dayslater.

Conclusions:

Accordingtotheresults,NPBSandTGTcaninhibitapoptosisofcellsafterTBIinratsbycontolofBAXandBCL-2,TUNELexpression.Andalsocan

helpneurologicalmotorbehavioralfunction.

Keywords:SP10,NeutralPharmacopunctureforBloodstasis,Tangguisusangami-tang(dangguixusanjiawei-tang),Neuroprotectiveeffect


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Ⅰ. 서 론

외상성 뇌손상(traumaticbraininjury)은 교통

사고,낙상,폭력,스포츠 손상 등 외부의 충격으

로 인해 뇌가 손상당하는 것으로 인지능력이나

신체기능에 장애를 초래하고,의식 감소나 변화

가 일어나 일시적이거나 지속적인 장애 또는 전

체적 기능장애를 유발시켜 심리적으로나 사회적

으로 적응하지 못하는 결과가 나타난다1).

일반적으로 외상성 뇌손상은 손상 직후 일차

적으로 기계적 손상을 유발시키고,그 후 여러

시간에 걸쳐 세포 및 분자적 수준에서 신경세포

의 자연사(apoptosis)와 관련된 에너지 대사 장

애,이온 항상성 및 뇌혈관 장벽 파괴,단백질 발

현의 변화,부종,유해한 신경화학물질과 효소의

활성으로 기능적 및 구조적 변화를 일으키는 이

차적 손상을 유발 한다2,3).

최근 외상성 뇌손상 분야의 한의학적 치료에

대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.외상성 뇌

손상을 유발한 흰쥐에 인삼사포닌을 투여하여 신

경보호 작용에 대한 연구4)가 보고 된 바 있고,

홍삼을 처방하여 BAX와 BCL-2의 발현에 유의한

효과가 있었음이 보고5)된 논문도 있으나 한약치

료와 약침의 신경보호 작용에 대한 연구는 부족

한 실정이다.또한 血海(SP10)와 약침의 뇌손상

회복에 대한 연구도 風池에 천마약침을 시술이

뇌허혈에 미치는 영향6)을 보고한 논문과 당귀약

침의 血海(SP10)자입이 뇌허혈에 미치는 영향7)

에 대한 논문 등이 있으나 약침과 탕약의 투여

및 병용투여에 대한 외상성 뇌손상의 회복에 대

한 연구는 부족한 실정이다.

본 실험에 사용된 穴인 血海(SP10)는 足太陰脾

經의 經穴로 슬개골 내측 상방 2寸에 위치한 穴

位로,穴性은 調血和營,淸瀉血熱,宣通下焦 등이

고,主治症으로는 血熱證,血瘀證,血虛證,出血證

등이있어,子宮出血,月經不順 등의 부인병과 貧

血,瘀血疾患에 이용한다8-10).또한 중성어혈 약침

은 活血祛瘀止痛 작용에 解熱消炎 작용이 강화된

瘀血치료에 근거한 것으로 氣滯血瘀로 인한 제반

통증을 치료하며 부종이 있는 頭部打撲傷에 효

능이 있다고 알려져 있다11).

當歸鬚散은 李梴12)에 의해 제시된 처방으로 破

瘀行氣溫經之劑로 氣血의 循環을 도우며 祛瘀13)

하는 효능이 있어 타박손상에 사용되고 있으며,

최근에는 Endotoxin으로 수발된 혈전증14)과 지구

성 운동능력회복과 탈수소 효소 농도에 미치는

영향15)등에 활용 되고 있다.이러한 당귀수산에

發表升散,活血行氣止痛의 효능16)이 있는 藁本,

川芎,荊芥를 加味해 頭部에서 나타나는 증상에

치료하였다.

이에 본 연구에서는 외상성 뇌손상의 신경보

호작용의 中性瘀血藥針과 當歸鬚散加味湯의 투

여 및 병용투여의 효과를 연구하고자 외상성 뇌

손상 흰쥐 모델을 대상으로 신경학적 운동행동평

가와 조직화학적기법(histochemistry)을 이용하여

신경학적 운동행동 평가,신경세포의 자연사 과

정,안전성 평가 등을 알아본 결과 유의성 있는

결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

Ⅱ. 재료 및 실험방법

1.재료

1) 동물

본 연구에서는 체중이 약 250±50g의 Sprague

-Dawley계 흰쥐(8주령,웅성,대한실험동물)를 각

군당 20마리씩 할당하여 80마리를 사용하였다.

中性瘀血藥鍼과 當歸鬚散加味湯이 외상성 뇌손상 흰쥐의 신경보호에 미치는 영향

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사육실 온도는 25±1℃,습도 55±10%를 유지하

였으며,명암은 12시간 주기로 하였다.고형사료

(삼양주식회사,한국)와 물은 자유롭게 먹도록 하

였다.

외상성 뇌손상을 실험적으로 일으킨 후 무작위

로 다음과 같이 실험군 설정을 분류하였다.Group

Ⅰ(Control,n=20),GroupⅡ(NeutralPharmacopuncture

forBloodstasis,n=20),GroupⅢ(Tangguisusangami

-tang(dangguixusanjiawei-tang),n=20),GroupⅣ

(NeutralPharmacopunctureforBlood stasis+

Tangguisusangami-tang,n=20)으로 나누었다

2) 약재

실험에 사용된 약재는 동신대학교 부속 광주

한방병원에서 구입한 후 정선해서 사용하였고,

當歸鬚散加味湯의 구성약물은 方藥合編 17)처방

을 근거로 하였으며,분량 및 생약명은 다음과

같다(TableⅠ).

HerbalName PharmacognosticName Amount

當歸尾 RadixAngelicaeGigantis 5.62g

赤芍藥 RadixPaeoniaeRubra 3.75g

烏藥 RadixLinderae 3.75g

香附子 RhizomaCyperi 3.75g

蘇木 CaesalpiniasappanLinne 3.75g

藁本 RhizomaLigustici 3.75g

荊芥 HerbaSchizonepetae 3.75g

川芎 RhizomaChuanxiong 3.75g

紅花 CarthmusTinctoriusLinne 3.00g

桃仁 SemenPersicae 2.65g

桂心 CortexCassiae 2.25g

甘草 RadixGlycyrrhizae 1.87g

TotalAmount 41.64g

TableⅠ.PrescriptionofTangguisusangami-tang(dangguixusanjiawei

-tang)

2.실험방법

1) 검액의 제조

當歸鬚散加味湯 10첩 분량인 416.40g을 3,000

㎖ 플라스크에 증류수 1,500㎖와 함께 120분 가

열하고 전탕액을 여과지로 여과하여 5,000rpm

으로 30분간 원심분리하여 상청액을 취하였다.

그 후 rotaryvacuum evaporator(EYELA Co.

Japan)에 넣어 감압 농축한 후 freezedryer(일신

주식회사.한국)로 동결 건조시켜 82.45g(수득

율 19.8%)을 얻어 검액으로 사용하였다.냉동 건

조하여 분말로 제조한 후 當歸鬚散加味湯 분말을

600㎎/㎏씩 증류수에 용해하여 1일 1회 경구 투

여하였다.

2) 中性瘀血藥鍼의 제조

500g(梔子 151g,玄胡索,乳香,沒藥 각 60g,

桃仁,赤芍藥,丹蔘 각 46g,蘇木 31g)의 약재를

채반에 담아 ultrapurewater(3차 증류수기

UltaPure900,USA)에서 세척하였다.이후 반응

조 하부에 약재를 넣고 3차 증류수를 부어서 약

80~90분 동안 약재를 불려주었다.약재를 불린

후 105℃에서 120min동안 전탕한 다음 호스

의 위치를 증류 냉각관 쪽으로 바꿔주어서 흐르

게 하고 107℃로 올려주었다.추출시간은 3시간

이상 소요 되었다.추출이 끝나고 1ℓ PYREX병

에 받아진 약침액은 무기염류를 침강시키기 위해

서 하루 동안 냉장 보관하였다.무기염류를 침강

시킨 약침을 상층액을 분리하여 얻어내는데 추출

물을 pH Meter기(ORION,USA)를 사용하여

Na3PO4(Sodium phosphate)를 첨가하여 pH가

pH 7.25～7.35가 되게 조절,약전소금(NaCl)을

첨가하여 0.9%등장액이 되도록 염도계(DEMTRA.

Japan)를 이용하여 조절하였다.이후 filter장치를

준비하고 여과지 0.45㎛→0.2㎛→0.1㎛ cellulose

여과지(whatman,Germany)로 음압을 이용하여

여과하고 고압증기멸균기(highpressuresterilizer,


16

신진,한국)에 넣어 30분간 121℃,1.5기압으로

고압 멸균한 후 냉장보관하며 사용하였다.

3) 외상성 뇌손상 유발18)

외상성 뇌손상을 유발하기 위해 weight-drop

형태의 기구를 사용한 Marmarou등의 연구방법

을 이용하였다.실험동물의 전신 마취를 유도하

기 위하여 럼푼(Rompun,바이엘 코리아)과 염산

케타민(KetamineHCL,유한양행)을 1:1로 혼합

하여 복강내 주사(3㎖/㎏)한 후,탄력성이 있는

foam bed위에 흰쥐의 전신을 올려놓았다.두부

를 삭모하고 피부를 절개하여 두개골을 노출시키

고 bregma와 lambda사이에 직경 10㎜,두께 3

㎜의 stainlesssteeldisc를 고정하였다.Plaxiglas

tube를 흰쥐의 두부에 있는 stainlesssteeldisc에

수직으로 고정하고,450g의 추를 1m 높이에서

관을 통해 자유 낙하시켜 유발하였다.실험이 이

루어지는 동안 흰쥐의 직장 내 체온을 측정하고,

발열 패드를 이용하여 36.5℃～ 37.5℃를 유지

시켰다.

4) 當歸鬚散加味湯의 투여 및 약침의 시술

외상성 뇌손상 유발 6시간 후부터 동결건조 된

當歸鬚散加味湯을 흰쥐 1마리당 600㎎/㎏씩 1

일 1회 경구 투여하였고,중성어혈약침은 血海

(SP10)에 0.1㎖씩 1일 1회 주사하였다.

3.결과측정

1) 신경학적 운동행동 검사(Neurological motor behavioral

test)

외상성 뇌손상 유발 전,유발 1일 후,7일 후,

14일 후에 신경행동학적 평가로 rotarodtest,beam

-walkingtest,posturereflextest의 3가지로 동일

평가자에 의하여 맹검 방법을 이용하여 3회 평가

하였다.

(1)Rotarodtest19)

Rotarodtest(rod:직경 7.5㎝,길이 10㎝,높

이 35㎝)는 흰쥐의 운동 결손과 균형 유지를 평

가하기 위해 사용되었다.처음 4rpm으로 시작

하여 10초당 4rpm씩 가속하여 20rpm에서 떨

어지지 않고 몇 초간 버티는지(최대 60초까지)

측정하였으며,3회 측정하여 평균값을 비교하였

다.

(2)Beam-walkingtest20,21)

Beam-walkingtest는 전정 감각의 통합,전정

운동(vestibulomotor)의 기능 및 정교한 운동 협

응을 평가하기 위해 사용되었다.높이 30㎝의

나무 상자를 마주 보게 배치하고 폭 3㎝,길이

120㎝의 나무 막대를 올려놓았다.막대의 한쪽

끝은 20×16×20㎝의 어두운 상자를 배치하고

막대의 반대 끝에서 상자를 향해 건너갈 수 있도

록 소리자극(avoidancestimulus)을 적용하여 막

대를 완전히 건너는데 걸리는 시간(sec)을 3회 측

정하여 평균값을 비교하였다.

(3)Posturalreflextest22)

흰쥐를 꼬리부터 들어 올려서 바닥에 천천히

내려놓을 때 앞다리가 대칭적으로 바닥을 짚으면

3점,외상부위 반대쪽의 앞다리가 몸통 쪽으로

굴곡 되면 2점,앞다리뿐만 아니라 어깨나 몸통

등도 굴곡 되면 1점을 주었으며,3회 측정하여

평균값을 비교하였다.

2) 면역조직화학적 검사


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(1)Bax와 Bcl-2의 면역조직화학적 염색

파리핀 포매된 뇌 조직절편을 5㎛의 두께로

자른 다음 조직 슬라이드에 올린 후,xylene처리

를 하여 탈파라핀 과정을 거치고 여러 단계의 알코

올로 처리하여 수화과정을 거친 뒤 3% hydrogen

peroxide에 조직을 담구어 30분간 incubation한

후 phosphate-bufferedsaline(PBS,pH7.4)에 담

궈 씻어내었다.

일차항체로 항 Bax 단백항체(Santa Cruz

Biotechnology,CA,USA),항 Bcl-2단백항체(Santa

CruzBiotechnology,CA,USA)를 각각 1:500의 비

율로희석하여 조직에 도포하고 4℃에서 overnight

로 incubation한 후 PBS로 세척하였다.PBS로 씻은

후 quickkit(DAKO LSABⓇkit,DAKO Corp.,

Carpinteria,CA,USA)의 biotinylatedanti-rabbit

/anti-mouseimmunoglobulins를 도포하여 30분

간 incubation하였다.PBS로 세척한 후 streptavidin

peroxidase를 도포한 후 10분간 incubation하였

다.PBS로 씻어낸 후 DAB(3,3̀-diaminobenzidine,

DAKO Corp.,Carpinteria,CA,USA)용액을 도

포하여 발색시켰다.그 후 hematoxyline으로 대

조염색을 실시 후 탈수 및 청명화 과정을 거친

후 봉입하였다.

(2)TUNEL의 면역조직화학적 염색

파라핀 포매된 뇌조직을 3㎛의 두께로 자른

다음 조직 슬라이드에 mount하여 실온에서 건조

시킨 후,xylene처리를 하여 탈파라핀 과정을 거

쳤다.ProteinaseK(DAKO Corp.,Carpinteria,

CA,USA)를 조직 위에 떨어뜨리고 실온에서 반

응시켜 proteolyticperoxideinPBS에 실온에서

5분간 담궈 endogenousperoxidase의 작용을 막

은 후 PBS로 세척하였다.이후 H202에서 30분간

반응을 시킨 후 ApopTagⓇ kit(S7100-kit,Oncor,

SanDiego,CA,USA)를 사용하여 염색하였다.

즉,equilibrationbuffer를 조직이 덮일 정도로

슬라이드에 떨어뜨려 실온에서 반응시킨 다음 가

볍게 털어내고 reactionbuffer와 TdTenzyme을

9:1로 혼합하여 제조한 workingstrengthTdT

enzyme을 가한 후 37℃ humidifiedchamber에

서 1시간 동안 배양하였다.1시간 배양한 조직

슬라이드를 stop/washbuffer에 담근 후 약간 흔

들어 주며 실온에서 10분간 배양하였다.그 후 PBS

로 세척하고 anti-digoxigeninperoxidaseconjugate

를 슬라이드에 도포한 뒤 실온의 humidified

chamber에서 30분간 incubate하고 난후 PBS로

씻어 낸 후 DAB용액으로 실온에서 발색시켰다.

에탄올을 이용한 탈수(dehydration)과정과 자일렌

(xylene)을 이용한 청명(cleaning)과정을 거쳤다.

3) 간과 신장 적출 검사

中性瘀血藥針과 當歸鬚散加味湯의 독성 평가를

위해14일 후간과신장을적출하여 축화된 변형 방지

를 위해 10% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)

에 고정하였다.고정된 조직은 24시간 후 흐르는

물에 수세한 다음 일반적인 조직의 탈수,투명

및 침투과정을 자동조직 처리장치(4640B,Sakura,

Japan)기기를 사용하여 14시간 동안 처리하였다.

파라핀 블록의 제작과 냉각은 자동 포매장치

(Tissue-Tex,Sakura,Japan)를 사용하였다.제작

된 파라핀 블록을 회전식 미세박절기(Rotary,

Microtome2040,Sakura,Japan)를 사용하여 조

직을 수직방향으로 4-5㎛ 두께로 연속절편하여,

부유온수조와 신전기 과정을 거쳐 슬라이드에 부

착시켰다.자일렌으로 5분씩 3회에 걸쳐 탈파라

핀 과정을 진행하였고,고농도에서 저농도로 알

코올에 1분씩 함수한 후 흐르는 물에 3분간 수세

하였다.헤마톡실린 용액(hematoxylinsolution)

에 5분간 핵염색 후 다시 수세하여 에오진 용액


18

(eosinsolution)으로 3분간 세포질 염색 후 수세

하였다.저농도에서 고농도로 3단계 탈수과정을

진행하였으며,자일렌 용액에 3단계 함수하여 조직

을 청명(cleaning)하게 한 후 카나다 발삼(canada

balsam)으로 봉입하였다.봉입한 조직을 광학현

미경(OlympusBX50,Japan)을 사용하여 조직을

촬영하였다.

4.통계 처리

본 연구의 통계학적 분석은 SPSS12.0ver.for

windows®을 사용하였다.각 군의 실험결과는 평

균과 표준편차로 나타내었고,각 실험군 간의 시

간 경과에 따른 차이를 비교하기 위해 일원배치

분산분석(one-wayANOVA)을 실시하였고,사후

검정은 Duncaǹsmultiplerangetest를 실시하였

다.분석 시 유의수준 (p


19

GroupsDays

Pre(baseline) 1d 7d 14d

Ⅰ 3.00±0.00 1.20±0.45 1.60±0.55 2.20±0.45*

Ⅱ 3.00±0.00 1.00±0.00 1.80±0.45 2.40±0.55*†

Ⅲ 3.00±0.00 1.20±0.45 2.00±0.71 2.60±0.55*†

Ⅳ 3.00±0.00 1.40±0.55 2.20±0.84 3.00±0.00†

Valuesareshowedmean±SD.

*,†:Valuewith differentsuperscriptsinthesamecolumn

(days)aresignificant(p


20

Fig.2.RepresentativesectionsofBcl-2expressionsin

TBI-induced7thand14thday(Lt.4pics:7thday,

Rt.4pics:14thday).

3) TUNEL 염색

TUNEL염색을 이용한 세포사멸 부위를 면역

조직화학염색을 통하여 관찰한 결과,유발 1일

후에는 모든 군에서 면역반응 발현이 상당히 증

가하였고,유발 7일 후에 GroupⅠ,Ⅱ,Ⅲ은 다소

감소된 면역반응을 보인 반면,GroupⅣ는 현저

하게 감소된 면역반응을 보였다.유발 14일 후에

는 GroupⅢ과 Ⅳ에서 감소된 면역반응을 보였

다.유발 14일 후에 GroupⅣ와 Ⅲ은 Ⅰ,Ⅱ에 비

해 현저하게 감소된 면역반응을 확인할 수 있었

다(TableⅦ,Fig.3).

GroupTime(day)

Pre 1d 7d 14d

Ⅰ - +++ ++ ++

Ⅱ - +++ ++ ++

Ⅲ - +++ ++ +

Ⅳ - +++ + +

-:Negative,+:Mildpositive,++:Moderatepositive,+++:

Strongpositive

TableⅦ.EffectofNeutralPharmacopunctureforStaticBlood

andTangguisusangami-tang(dangguixusanjiawei

-tang)onTUNELExpressionsinCerebralCortex

ofTBIRats

Fig.3.RepresentativesectionsofTUNELexpressions

TBI-induced7thand14thday(Lt.4pics:7thday,

Rt.4pics:14thday).

3.독성 평가

1) 간독성 검사

當歸鬚散加味湯이 간독성에 미치는 영향을 알

아보기 위해 각 군에서 외상성 뇌손상 유발 전과

유발 14일 후에 간을 적출하여 H&E염색을 통

해 변화를 관찰하였다.그 결과,모든 실험군에서

정상적인 소견을 보여 當歸鬚散加味湯으로 인한

간손상은 나타나지 않았음을 확인하였다(Fig.4).

Fig.4.Histologicalfindingsoftheliverat14thday.

2) 신장독성 검사

當歸鬚散加味湯이 신장독성에 미치는 영향을

알아보기 위해 각 군에서 외상성 뇌손상 유발 전

과 유발 14일 후에 신장을 적출하여 H&E염색

을 통해 변화를 관찰하였다.그 결과,모든 실험


21

군에서 정상적인 소견을 보여 當歸鬚散加味湯으

로 인한 간손상은 나타나지 않았음을 확인하였다

(Fig.5).

Fig.5.Histologicalfindingsofthekidneyat14thday.

Ⅳ. 고 찰

외상성 뇌손상의 치료로서 병리학적 기전과

신경보호 약물의 확인을 시도하여 뇌손상시 유병

률이나 사망률을 낮추기 위한 여러 가지 동물 실

험들이 진행되고 있다23).흰쥐를 해부학적 특성

상 인간의 두부외상발생의 초기단계에서부터 유

사하게 재현시키기는 어렵지만 궁극적으로는 뇌

조직에 변형을 가져와 인간의 두부 외상시와 유

사한 결과를 나타내어 유용한 모델로 사용될 수

있다22).

일반적으로 외상성 뇌손상에 의한 세포들의

파괴 기전은 칼슘,칼륨,나트륨,마그네슘 등의

전해질 항상성의 변화,염증성 및 면역계의 변화24),apoptosis나 programmedcelldeath발생기

전25),freeradical

26),glutamate독성

27),calcium

overload28),nitricoxide(NO)29)및 여러 cytokines30)

등의 요인들이 관여하는 것으로 알려져 있다.과

거에는 외상성 뇌손상에 의한 신경세포의 사망을

괴사에 의한 것으로 설명하였으나,최근에는 신

경세포의 자연사가 신경세포의 사망 기전으로 설

명되고 있다31,32).인간에서는 심하지 않은 외상성

뇌손상의 경우 신경세포의 자연사가 충격 후 1일

째에 최고조에 달하고,약 22주 이후까지도 자연

사가 지속되는 것으로 보고 되었으나3),실험동물

의 경우에는 충격 후 2주 이상 자연사가 지속되

며,충격 1시간 후부터 2일까지 자연사하는 신경

세포 수가 증가하며,2일부터 2주까지 점차 감소

하는 것으로 보고 된다33,34).이러한 두 가지 세포

사의 형태는 다양한 치료방법으로 조절이 가능하

며 치료의 목표로 인식되고 있다35).현재까지 다

양한 치료방법들이 개발되고 있으나 그 효과가

일시적이고 미약하며,다양한 약물들의 경우에는

간독성과 오심,구토 등의 부작용들 때문에 사용

논란의 여지가 많은 상태이다.

본 연구에 사용된 當歸鬚散은 打撲損傷으로

인한 瘀血을 치료하는 대표처방36)으로 當歸尾․

赤芍藥․烏藥․香附子․蘇木․紅花․桃仁․桂

心․甘草로 구성되어있다.여기에 頭部로 引經하

는 藁本․川芎․荊芥를 가미하여 頭部瘀血치료

즉 외상성 뇌손상을 치료할 수 있을 것이라고 생

각하여 사용하였다.當歸鬚散은 活血祛瘀하는 當

歸尾와 蘇木,營血을 補하는 赤芍藥,理氣行氣하

는 烏藥,香附子,破瘀活血하는 桃仁,紅花,溫經

通絡하는 桂心,調和諸藥하는 甘草 등으로 구성

되어있다13).여기에 發表,袪風止痛의 효능이 있

는 藁本,荊芥,活血行氣止痛하는 川芎을 加味하

였다.또한 藁本,川芎의 경우 升散하는 작용으로

頭部로 도달하게 해주는 역할도 해준다16).

약침요법이란 그동안의 침요법이 질병의 치료

나 예방을 목적으로 일정한 경혈에 물리적인 자

극을 주던 치료 형태에서 한 단계 더 발전하여

약재의 화학적인 자극을 경혈에 추가한 방법이다37).약침요법은 약효가 신속하고 치료 용량이 적

으며 약물이 위장관에서 파괴되는 것을 방지하고

내복하기 힘든 환자에게 사용할 수 있다는 장점


22

등이 있다38).

중성어혈 약침은 梔子,玄胡索,乳香,沒藥,桃

仁,赤芍藥,丹蔘,蘇木으로 구성되어 있다37).梔

子는 淸熱瀉火凉血,玄胡索은 活血散瘀,理氣止

痛,乳香은 活血止痛,消腫生肌,沒藥은 散血祛瘀,

消腫止痛,桃仁은 活血祛瘀,潤腸通便,赤芍藥은

淸熱凉血,散瘀止痛,丹蔘은 活血祛瘀,凉血消腫,

蘇木은 行血散瘀,消腫止痛하는 효능이 있어 中

性瘀血藥鍼은 活血祛瘀止痛 작용에 解熱消炎작

용이 강화된 瘀血치료처방으로 氣滯血瘀로 인한

제반통증에 유효하다고 보고되고 있다37).

약침을 투여한 穴位는 血海(SP10)로서 ‘혈액이

모이는 곳’이란 뜻으로 주로 혈병을 다스리다는

의미이고,이명은 血郄,白蟲窠이며 足太陰脾經의

경혈로 슬개골 內側 상방 2촌에 위치한다.穴性

은 調血和營,淸瀉血熱,宣通下焦,健脾利濕 등이

며,主治는 자궁내막염,대하,피부소양증,단독

등의 血熱症,빈혈,經閉,血虛頭痛,痺證 등의 血

虛證,月經困難,月經痛 등의 血瘀證,기능성 자궁

출혈,崩漏不止,血尿,痔出血 등의 出血證이다8,9).

한의학에서는 외상성 뇌손상의 경우 東醫寶

鑑 36)에서 打撲,墜落 등과 상응한다고 볼 수 있

으며,대부분 어혈의 관점으로 다루고 있는데,이

에 저자는 當歸鬚散加味湯을 투여하고,중성어혈

약침을 血海(SP10)에 시술하여 어혈성 뇌졸중 상

태를 개선시킬 수 있을 것으로 기대되어 흰쥐에

유발된 외상성 뇌손상 모델을 통한 신경학적 운

동 회복상태 및 세포 재생을 관찰하고자 본 실험

을 실행하게 되었다.

실험동물을 대상으로 한 외상성 뇌손상 모델

에서 신경보호 효과를 비교할 때 무엇보다 중요

한 것이 신경학적 운동행동 평가이며 이는 신경

학적 변화에 대한 평가 시 매우 중요한 부분이라

고 할 수 있다.

본 연구에서 當歸鬚散加味湯 복용에 대한 안

정성 검사로 실험종료일에 간과 신장의 조직학적

검사 결과 아무런 이상 소견은 없었고,정상적인

대사가 이루어졌음을 확인할 수 있었다.

當歸鬚散加味湯과 중성어혈 약침의 신경보호

효과 분석을 위하여 신경학적 운동행동 평가 중

rotarodtest와 Beam-walkingtest에서는 외상성

뇌손상 유발 7일 후와 14일 후에 통계학적으로

유의한 차이를 보였고,유발 7일 후에는 Group

Ⅰ과 Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,GroupⅡ와 Ⅳ에서 유의한 차이

를 보였고,유발 14일 후에는 GroupⅠ과 Ⅱ,Ⅲ,

Ⅳ,GroupⅡ와 Ⅳ,GroupⅢ과 Ⅳ에서 유의한

차이를 보였다(TableⅡ,Ⅲ).그러나 posturalreflex

test에서는 유발 후 모든 시기에서 유의한 차이를

보이지 않았고,유발 14일 후에 GroupⅠ과 Ⅳ에

서 유의한 차이를 보였다(TableⅣ).Posturalreflex

test는 신경학적 결손 유무를 평가하는 데는 유용

하나 변화 여부를 평가하는 것에는 다소 어려움이

있어 이러한 결과가 나왔다고 사료된다.Hamm

등19)은 rotarodtest가 beam-walkingtest나 postural

reflextest보다 운동 장애를 제시하는데 월등하

며,치료효과나 약물 반응을 평가하는데 우수하

다고 보고하였다.

한편,신경세포의 자연사에 대한 분자생물학적

기전 중 가장 명확한 것이 caspase와 Bax및

Bcl-2의 작용기전이다39).Bax와 Bcl-2는 세포 자연

사 과정에 관여하는 Bcl-2familyprotein으로 사

망신호를 받은 세포가 이를 따를지 무시할지를

결정하게 되며 기능상 두 군으로 나뉘게 된다.

Bax가 과도하게 발현될 경우 mitochondria로부

터 cytochromeC가 분비되어 세포는 자연사 과

정을 일으키게 된다40).따라서 Bax는 다양한 세

포 외부로부터의 유해자극에 대하여 신경세포의

손상 가능성 여부를 결정하거나,자연사가 일어

나는 신경세포에서 장차 신경세포가 사망할 것이

라는 것을 판별할 수 있는 중요한 지표로 사용


23

된다41).반면,Bcl-2는 cytochromeC의 분비를 억

제하여 세포의 자연사를 막고 생존을 증강시킨

다.따라서 Bax와 Bcl-2는 같은 Bcl-2family이지

만 그 역할이 서로 반대인 것으로 알려져 있으며

이들이 작용하는 방법에 대한 여러 견해가 있다42).또한 TUNEL은 세포 자연사의 지표로 사용되

고 있는 검사법으로 광범위한 조직을 관찰할 수

있으며 정량적 분석이 가능하므로 세포 자연사의

범위를 판정하기에 적합하다.뿐만 아니라 TUNEL

검사를 동시에 시행함으로써 세포 자연사 진단을

더욱 정확하게 할 수 있다43).

본 연구의 결과,Bax는 유발 1일 후에는 실험

군 모두에서 일정하게 증가하다가 유발 7일과 14

일 후에 GroupⅣ,Ⅲ,Ⅱ,Ⅰ의 순으로 증가하다

가 감소하였고(Table.Ⅴ,Fig.1),Bcl-2는 유발 1

일 후에는 큰 변화가 없다가 유발 7일 후에 Group

Ⅳ에서 증가를 하고,유발 14일 후에 GroupⅡ,

Ⅲ,Ⅳ에서 증가를 하였다(TableⅥ,Fig.2).이는

신경세포의 자연사를 억제하기 위한 mechanism

이 작용된 것으로 사료된다.일시적인 Bax의 증

가가 있었으나 이어서 나타난 Bcl-2의 의미 있는

증가가 신경세포의 자연사를 궁극적으로 억제하

여 GroupⅣ에서는 유발 7일 후에서부터 TUNEL

면역반응 세포의 수가 의미 있게 적어지면서 유

발 14일 후에서의 생존세포가 많았으며(TableⅦ,

Fig.3),이는 신경학적 운동행동 평가에서도 유

의한 회복을 보인 것으로 사료된다.이는 當歸鬚

散加味湯과 중성어혈 약침이 외상성 뇌손상을 유

발한 cerebralcortex에서 신경세포 손상을 방어

하였음을 보여주는 것이다.

특히 當歸鬚散加味湯과 중성어혈 약침의 효능

은 단독으로 쓰인 군보다도 복합적으로 같이 적

용하였을 경우 신경학적 운동행동 평가와 면역학

적 염색 검사 모두에서 가장 우수한 효능을 나타

냈으며 이는 단독 투여보다 복합투여가 신경보호

에 있어 더 우수한 효과를 보일 것으로 생각된

다.

이상의 실험 결과를 총괄해보면 當歸鬚散加味

湯과 중성어혈 약침이 신경학적 운동 능력 회복

과 유전자 발현에서 신경학적 자연사를 억제하는

작용이 있는 것으로 생각되며 특히 병용 투여군

에서 효과가 있는 것으로 사료되어 외상성 뇌손

상 치료에 응용할 수 있으리라 생각된다.하지만

약침의 성분이 정확하게 파악이 안 되었으며,검

액 역시 성분에 있어 정확한 분석이 필요하고,

검액에 쓰이는 약제의 표준화와 일반화의 어려움

은 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

V. 결 론

中性瘀血藥鍼과 當歸鬚散加味湯이 외상성 뇌

손상(traumaticbraininjury)흰쥐의 신경보호 작

용에 미치는 영향을 살펴본 결과 다음과 같은 결

론을 얻었다.

1.Rotarodtest에서는 외상성 뇌손상 유발 7일

후에 GroupⅠ과 Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ에서,GroupⅡ

와 Ⅳ에서 유의한 차이를 보였고,유발 14일

후에는 GroupⅠ과 Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,GroupⅡ와

Ⅳ,Ⅲ과 Ⅳ에서 유의한 차이를 보였다.

3.Beam-walkingtest에서는 외상성 뇌손상 유

발 7일 후에 GroupⅠ과 Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Group

Ⅱ와 Ⅳ에서 유의한 차이를 보였고,유발 14

일 후에는 GroupⅠ과 Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Group

Ⅱ와 Ⅳ,GroupⅢ과 Ⅳ에서 유의한 차이를

보였다.

4.Posturalreflextest에서는 유발 14일 후에


24

GroupⅠ과 Ⅳ에서 유의한 차이를 보였다.

5.Bax의 면역반응에서는 유발 1일 후에는 모

든 군에서 점차 증가하다가 유발 7일 후에

Ⅰ은 현저하게 증가,GroupⅡ와 Ⅲ은 다소

감소,Ⅳ는 현저하게 감소되었다.유발 14일

후에 GroupⅠ은 감소,Ⅱ는 일정수준을 유

지,Ⅲ은 다소 감소,Ⅳ는 현저하게 감소됨

을 보였다.

6.Bcl-2의 면역반응에서는 7일 후에 GroupⅣ

에서 다소 증가,유발 14일 후에는 Group

Ⅱ와 Ⅲ에서 다소 증가,Ⅳ에서는 현저하게

증가됨을 보였다.

7.TUNEL염색에서는 유발 7일 후에 Group

Ⅰ,Ⅱ ,Ⅲ은 다소 감소,Ⅳ는 현저하게 감

소됨을 보였다.유발 14일 후에 GroupⅣ

와 Ⅲ은Ⅰ,Ⅱ에 비해 현저하게 감소됨을

보였다.

이상의 결과로 볼 때,외상성 뇌손상에서 中性

瘀血藥鍼과 當歸鬚散加味湯이 cerebralcortex에

서 Bax발현의 감소,BCL-2발현의 증가,TUNEL

발현의 감소를 가져와 신경세포의 자연사를 억제

하는 신경보호 작용이 있음을 알 수 있었으며,

특히 병용 투여의 경우 더욱 우수한 것으로 나타

났다.

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