Cellular Microbiology细胞微生物学

郭晓奎

上海交通大学医学院病原学教研室

内容内容• 序 序 • 微生物学概论 微生物学概论 • 细胞生物学概论 细胞生物学概论 • 细胞微生物学研究方法 细胞微生物学研究方法 • 细菌致病岛 ：细菌致病岛 ：• 细菌的分泌系统 ：细菌的分泌系统 ：• 细菌对宿主细胞的粘附 ：细菌对宿主细胞的粘附 ：• 细菌对宿主细胞骨架的操纵和利用 ：细菌对宿主细胞骨架的操纵和利用 ：• 细菌蛋白毒素 ：细菌蛋白毒素 ：• 细菌蛋白毒素在细胞生物学及药理学中的应用 ：细菌蛋白毒素在细胞生物学及药理学中的应用 ：• 微生物与细胞凋亡 ：微生物与细胞凋亡 ：• 天然免疫应答 ：天然免疫应答 ：• TollToll 样受体与抗感染免疫 ：样受体与抗感染免疫 ：• 获得性免疫应答 ：获得性免疫应答 ：• 细胞微生物学展望 细胞微生物学展望

概念和定义

1996 年，《 Science 》杂志对这一新学科作了如下的描述：“细胞微生物学是在细胞生物学和微生物学间的界面形成的。虽然传统的细胞生物学早已应用微生物感染宿主的策略来进行研究，但用病原体来研究细胞生物学问题，近来已获得很有价值的结果，并证明这是一条很有希望的途径。”

1999 年《 Cellular Microbiology 》杂志创刊

Cellular Microbiology

Bacteriology– The study of bacteria– Early discipline did not address the aspects of the environment on bacterial

‘factors’– Absent (unobserved) features of pathogens

The discipline of cellular microbiology addresses host-pathogen interactions to elucidate pathogenesis (the creation of a pathologic condition).

Pathogen: A microorganism that causes disease– Disease: Absence of ease; uneasiness, discomfort; inconvenience,

annoyance; disquiet, disturbance; trouble

Bacterial pathogens often infect animals and plants– Interact, invade, colonize and infect hosts

• Culminating in disease (but not always)• Aggressive, Opportunistic, Quiescent

– Infection: The agency, substance, germ, or principle by which (an infectious) disease is communicated or transmitted; morbific influence

微生物学概述

专性胞内菌专性胞内菌专性胞内菌是指不能在肉汤培养基中生长，专性胞内菌是指不能在肉汤培养基中生长，只能在体内或者体外培养细胞中繁殖的一只能在体内或者体外培养细胞中繁殖的一类微生物。类微生物。

• 衣原体衣原体• 贝纳柯克斯体贝纳柯克斯体• 埃立克体埃立克体• 立克次体立克次体

衣原体衣原体（ Chlamydia）

沙眼衣原体的包涵体沙眼衣原体的包涵体

贝纳柯克斯体贝纳柯克斯体（ Coxiella burnetii ）贝纳柯克斯体又称贝纳柯克斯体又称 QQ 热柯克斯体，引起人类热柯克斯体，引起人类 QQ 热，是立热，是立克次体中惟一可不借助于媒介节肢动物而通过气溶胶使人克次体中惟一可不借助于媒介节肢动物而通过气溶胶使人及动物发生感染的病原体。及动物发生感染的病原体。

埃立克体埃立克体（ Ehrlichia ）埃立克体是新发现的人类病原体之一，可导致人体急性埃立克体是新发现的人类病原体之一，可导致人体急性发热、疲乏、肌痛、头痛、血象异常发热、疲乏、肌痛、头痛、血象异常 (( 白细胞减少，相对白细胞减少，相对淋巴细胞增高淋巴细胞增高 )) ，并伴有肝、脾、淋巴结肿大等。 ，并伴有肝、脾、淋巴结肿大等。

犬巨噬细胞中的查菲埃立克体犬巨噬细胞中的查菲埃立克体

立克次体立克次体（ Rickettsia ）

立克次体属有两种主要群：斑疹伤寒群靠虱传播，斑疹立克次体属有两种主要群：斑疹伤寒群靠虱传播，斑疹热群则靠蜱传播。热群则靠蜱传播。

能在吞噬细胞中生长繁殖的兼性胞内菌能在吞噬细胞中生长繁殖的兼性胞内菌

这类细菌既能在细胞外生长，也能进入吞这类细菌既能在细胞外生长，也能进入吞噬细胞并在其中繁殖。噬细胞并在其中繁殖。

• 嗜肺军团菌嗜肺军团菌• 分枝杆菌分枝杆菌• 诺卡菌属诺卡菌属

嗜肺军团菌嗜肺军团菌（ Legionella pneumophila ）

需氧，需氧， GG-- 杆菌。杆菌。

““ 复制吞噬体”复制吞噬体”

分枝杆菌分枝杆菌（ Mycobacterium ）结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌分别是人结核病和麻风病的病原体。结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌分别是人结核病和麻风病的病原体。从从 20042004 年以来，结核病已经超过肝炎一跃成为我国危害最严重的传年以来，结核病已经超过肝炎一跃成为我国危害最严重的传染病。我国有近染病。我国有近 5.55.5 亿人口感染结核分枝杆菌，活动性肺结核病人高亿人口感染结核分枝杆菌，活动性肺结核病人高达达 500500 万。同时每年新增万。同时每年新增 130130 万活动性病人，死于结核病人数达万活动性病人，死于结核病人数达 1313万万。。

麻风分枝杆菌麻风分枝杆菌

诺卡菌属诺卡菌属（ Nocardia ）

一是诺卡放线菌病，主要由星形诺卡菌，少数由巴西诺卡菌一是诺卡放线菌病，主要由星形诺卡菌，少数由巴西诺卡菌和豚鼠诺卡菌引起；二是足菌肿，由马杜拉诺卡菌引起。据和豚鼠诺卡菌引起；二是足菌肿，由马杜拉诺卡菌引起。据报道星形诺卡菌常定植于非酸性的巨噬细胞囊泡中。报道星形诺卡菌常定植于非酸性的巨噬细胞囊泡中。

能在非吞噬细胞内繁殖的兼性胞内菌能在非吞噬细胞内繁殖的兼性胞内菌

• 巴通体巴通体• 布鲁菌属布鲁菌属• 产单核细胞李氏菌 产单核细胞李氏菌 • 沙门菌属沙门菌属• 志贺菌属志贺菌属

巴通体巴通体（ Bartonella ）

巴通体属有两种人类病原体：汉赛巴通体和五日热巴通体属有两种人类病原体：汉赛巴通体和五日热巴通体。巴通体。

布鲁菌属布鲁菌属（ Brucella ）布鲁菌属有六种细菌，其中羊布鲁菌、牛布鲁菌、猪布鲁菌布鲁菌属有六种细菌，其中羊布鲁菌、牛布鲁菌、猪布鲁菌和犬布鲁菌对人致病，且病种多样，引起全身感染和局部感和犬布鲁菌对人致病，且病种多样，引起全身感染和局部感染（败血症、骨髓炎和神经病变）。染（败血症、骨髓炎和神经病变）。

产单核细胞李氏菌产单核细胞李氏菌（ Listeria monocytogenes ）

革兰阳性的产单核细胞李斯特菌可导致人与动物严重的食革兰阳性的产单核细胞李斯特菌可导致人与动物严重的食源性感染。李斯特菌病是一种中枢神经系统和胎儿感染性源性感染。李斯特菌病是一种中枢神经系统和胎儿感染性疾病疾病。。

沙门菌属沙门菌属（ Salmonella ）沙门菌属有很多种类，其中肠道沙门菌受到最广泛的沙门菌属有很多种类，其中肠道沙门菌受到最广泛的关注。它有两种研究广泛的血清型：人伤寒沙门菌和关注。它有两种研究广泛的血清型：人伤寒沙门菌和鼠伤寒沙门菌。鼠伤寒沙门菌。

• 毒素依赖性毒素依赖性• 非毒素依赖性非毒素依赖性

志贺菌属志贺菌属（ Shigella ）

志贺菌属可分为痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志志贺菌属可分为痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌和宋内志贺菌四群，它们引起细菌性痢疾。贺菌和宋内志贺菌四群，它们引起细菌性痢疾。

无芽胞胞外菌无芽胞胞外菌

• 革兰阴性菌革兰阴性菌：不动杆菌、气单胞菌、百日咳鲍特菌、弯曲：不动杆菌、气单胞菌、百日咳鲍特菌、弯曲杆菌属、大肠埃希菌、流感嗜血杆菌和杜氏嗜血杆菌、幽杆菌属、大肠埃希菌、流感嗜血杆菌和杜氏嗜血杆菌、幽门螺杆菌、肺炎克雷伯菌、多杀巴斯德菌、铜绿假单胞菌、门螺杆菌、肺炎克雷伯菌、多杀巴斯德菌、铜绿假单胞菌、霍乱弧菌、耶尔森菌、奈瑟菌、伯氏疏螺旋体和苍白密螺霍乱弧菌、耶尔森菌、奈瑟菌、伯氏疏螺旋体和苍白密螺旋体、问号钩端螺旋体、支原体。旋体、问号钩端螺旋体、支原体。

• 革兰阳性菌革兰阳性菌：白喉棒状杆菌、葡萄球菌、链球菌。：白喉棒状杆菌、葡萄球菌、链球菌。

产芽胞胞外菌产芽胞胞外菌

• 炭疽芽胞杆菌炭疽芽胞杆菌

• 厌氧芽胞梭菌属厌氧芽胞梭菌属

炭疽芽胞杆菌炭疽芽胞杆菌 （ Bacillus anthracis ）

炭疽芽孢杆菌是人类历史上第一个被发现的炭疽芽孢杆菌是人类历史上第一个被发现的病原菌。病原菌。

厌氧芽胞梭菌属厌氧芽胞梭菌属 （ Clostridum ）

11．肉毒梭菌 ．肉毒梭菌 22．艰难梭菌 ．艰难梭菌 33．产气荚膜梭菌 ．产气荚膜梭菌 44．破伤风梭菌．破伤风梭菌

真菌真菌

• 烟曲霉菌是一种最常见的由空气传播的腐生菌类。人类和烟曲霉菌是一种最常见的由空气传播的腐生菌类。人类和动物不断的吸入这种菌的孢子。正常免疫功能的宿主通过动物不断的吸入这种菌的孢子。正常免疫功能的宿主通过先天免疫机制可以除去这种孢子，这些宿主只会有一些轻先天免疫机制可以除去这种孢子，这些宿主只会有一些轻微的临床症状如曲霉瘤和过敏性肺支气管曲霉病。 微的临床症状如曲霉瘤和过敏性肺支气管曲霉病。

• 假丝酵母是人类真菌病最常见病原体。有几种假丝酵母菌假丝酵母是人类真菌病最常见病原体。有几种假丝酵母菌可导致人类感染，其中最主要的是白假丝酵母 可导致人类感染，其中最主要的是白假丝酵母

• 新生隐球菌是一种重要的条件致病性酵母样真菌 新生隐球菌是一种重要的条件致病性酵母样真菌 • 荚膜组织胞浆菌引起组织胞浆菌病，以侵犯单核荚膜组织胞浆菌引起组织胞浆菌病，以侵犯单核——巨噬细巨噬细

胞系统和肺部为主的深部真菌病 胞系统和肺部为主的深部真菌病 • 卡氏肺孢菌常引起免疫缺陷病人尤其是卡氏肺孢菌常引起免疫缺陷病人尤其是 AIDSAIDS 病人肺炎。 病人肺炎。

寄生虫寄生虫

• 溶组织内阿米巴致阿米巴痢疾，是寄生虫病的第三大死因。溶组织内阿米巴致阿米巴痢疾，是寄生虫病的第三大死因。

• 利什曼原虫是利什曼病的病原体。利什曼病既可引起局部利什曼原虫是利什曼病的病原体。利什曼病既可引起局部损伤（皮肤），也可导致系统疾病（内脏），感染人口高损伤（皮肤），也可导致系统疾病（内脏），感染人口高达达 11千万人，主要发生在白蛉传播区域 千万人，主要发生在白蛉传播区域

• 恶性疟原虫以按蚊为传播媒介，是疟疾的病原体 恶性疟原虫以按蚊为传播媒介，是疟疾的病原体 • 刚地弓形虫是一种机会性致病原虫，寄生于宿主有核细胞，刚地弓形虫是一种机会性致病原虫，寄生于宿主有核细胞，

可造成多种脏器和组织损害，引起弓形虫病 可造成多种脏器和组织损害，引起弓形虫病 • 克氏锥虫是人类克氏锥虫病，或称恰加斯病的病原体。 克氏锥虫是人类克氏锥虫病，或称恰加斯病的病原体。

细胞结构

细胞由脂质双层所组成的膜包绕（ 1 ），细胞质中含有核（ 2 ），由核膜包绕，核膜的作用主要是作为 DNA 的支架。当细胞外界的信号与膜受体结合后（ 3 ），触发了激酶磷酸化的级联反应（ 4 ），这一过程包括磷酸化细胞浆中的蛋白或磷酸化细胞核中核因子（ 5 ）来调节 DNA的转录和细胞分裂（ 6 ）。细胞骨架中微管（ 7 ）是作作为线粒体运动（ 8 ）和胞内小泡（ 9 ）运送货物的轨道。细胞之间（ 10 ）或细胞与基质间（ 11 ）通过肌动蛋白（ 12 ）上的粘附分子而相互连接。核膜与内质网（ 13 ）相连，分泌性蛋白在合成期间被转移到内质网内，糖基化后通过高尔基体达细胞膜并进入小泡内（ 14 ）。细胞通过内吞作用摄取外界分子（ 15 ），这些分子在溶酶体（图 2-1 中 L ）中被降解。而胞质中的蛋白分子可被蛋白酶体水解。肌动蛋白丝在膜表面可形成广泛的突起，称为片状伪足 (16) ；或形成长的突起，称线足 (17) 。

细胞信号转导细胞信号转导

膜转运膜转运

细胞微生物学

细胞对细菌生长的影响细胞对细菌生长的影响

• 麻风分枝杆菌（引起麻风病）和梅毒螺旋体（引起梅毒）。麻风分枝杆菌（引起麻风病）和梅毒螺旋体（引起梅毒）。这些细菌需要在动物体内才能繁殖，如培养麻风分枝杆菌需这些细菌需要在动物体内才能繁殖，如培养麻风分枝杆菌需要犰狳（要犰狳（ armadilloarmadillo ）。）。

• 细菌生长并不仅与营养供应成线性关系，而是更可能受一些细菌生长并不仅与营养供应成线性关系，而是更可能受一些特定蛋白质及细菌和真核细胞都都会产生的其他因子的控制。特定蛋白质及细菌和真核细胞都都会产生的其他因子的控制。

细胞对细菌生长的影响细胞对细菌生长的影响• 藤黄微球菌：这种细菌的生长一段时间后再更换新的培养基，藤黄微球菌：这种细菌的生长一段时间后再更换新的培养基，营养充足，细菌在分裂多代后仍然会停止生长，可能是由于营养充足，细菌在分裂多代后仍然会停止生长，可能是由于细胞分裂抑制因子的产生。如果将处于生长状态的藤黄微球细胞分裂抑制因子的产生。如果将处于生长状态的藤黄微球菌的培养基加入到细胞上去，细菌继续生长，说明细菌生长菌的培养基加入到细胞上去，细菌继续生长，说明细菌生长依赖于一些特定的生长因子，这些生长因子可能是由细菌或依赖于一些特定的生长因子，这些生长因子可能是由细菌或者与细菌接触的细胞产生的。者与细菌接触的细胞产生的。

• 相当数量的源于真核细胞的分子如相当数量的源于真核细胞的分子如 5-5-羟色胺、儿茶酚胺等羟色胺、儿茶酚胺等可促进细菌生长，而且过去几年内也一直有多种不同的细胞可促进细菌生长，而且过去几年内也一直有多种不同的细胞因子促进多种细菌生长的报道。因子促进多种细菌生长的报道。

细胞因子在细菌生长过程中起作用细胞因子在细菌生长过程中起作用？

之所以不能产生可重复的结果是由于新分离的产毒株菌很快之所以不能产生可重复的结果是由于新分离的产毒株菌很快丧失了它们对丧失了它们对 IL-1IL-1 的反应能力。这提示可能有一种的反应能力。这提示可能有一种 IL-1IL-1 结结合和转导系统被宿主细胞的某些因子诱导并且在这些诱导信合和转导系统被宿主细胞的某些因子诱导并且在这些诱导信号消失后此系统也迅速消失。另外一组研究人员报道大肠埃号消失后此系统也迅速消失。另外一组研究人员报道大肠埃希菌产毒株与两种生长促进因子希菌产毒株与两种生长促进因子 IL-2(TIL-2(T 淋巴细胞的生长因淋巴细胞的生长因子子 )) 和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ GM-CSFGM-CSF ，中性白细，中性白细胞和单核细胞生长因子）共同孵育时生长会加速。 胞和单核细胞生长因子）共同孵育时生长会加速。 IL-2IL-2 热热不稳定，加热或加入不稳定，加热或加入 IL-2IL-2 中和抗体可阻断其作用。此株大肠中和抗体可阻断其作用。此株大肠埃希菌含有埃希菌含有 IL-2IL-2 及及 GM-CSFGM-CSF 的受体的可能性是通过细菌耗的受体的可能性是通过细菌耗尽了尽了 IL-2IL-2 的介质而得到间接证明的。的介质而得到间接证明的。 IL-2IL-2 的促生长作用可的促生长作用可以解释接受以解释接受 IL-2IL-2治疗的癌症病人或治疗的癌症病人或 AIDSAIDS 病人高水平的机会病人高水平的机会性感染。性感染。

Charles DinarelloCharles Dinarello 实验室认为实验室认为 IL-1IL-1 可促进大肠埃希菌产毒可促进大肠埃希菌产毒株的生长。比较大肠埃希菌株的生长。比较大肠埃希菌 66个产毒株及个产毒株及 44个无毒株发现，个无毒株发现，前者在前者在 IL-1IL-1浓度低至浓度低至 10ng/ml10ng/ml 时生长仍增快（通过观察时生长仍增快（通过观察CFUCFU）。而无毒株对）。而无毒株对 IL-1IL-1 不起反应。其他细胞因子如不起反应。其他细胞因子如 IL-4IL-4 、、TNFTNF 对产毒株的生长亦无影响。值得注意的是对产毒株的生长亦无影响。值得注意的是 IL-1IL-1诱导的诱导的细菌生长几乎可以完全被一种天然抑制剂细菌生长几乎可以完全被一种天然抑制剂 IL-1raIL-1ra所抑制，这所抑制，这提示其中有提示其中有 IL-1IL-1 受体的参与。产毒株以细胞浓度依赖方式结受体的参与。产毒株以细胞浓度依赖方式结合合 IL-1IL-1 ，在，在 20pg/ml20pg/ml 的浓度时达饱和。标记性的浓度时达饱和。标记性 IL-1IL-1 的结合的结合可被过量的未标记可被过量的未标记 IL-1IL-1竞争，每个细菌有竞争，每个细菌有 20-400020-4000个结合个结合位点，比人或鼠细胞上的位点，比人或鼠细胞上的 IL-1IL-1 受体数量明显要多。这些发现受体数量明显要多。这些发现很有趣但具有一定的争议。很有趣但具有一定的争议。

细胞因子在细菌生长过程中起作用细胞因子在细菌生长过程中起作用？

促进自由生活细菌生长的细胞因子促进自由生活细菌生长的细胞因子细胞因子细胞因子 生长被促进的细菌生长被促进的细菌白介素白介素 11 （（ IL-1IL-1）） EE ．． colicoli产毒株产毒株白介素白介素 22 （（ IL-2IL-2）） EE ．． colicoli产毒株产毒株巨噬细胞集落刺激因子巨噬细胞集落刺激因子（（ CSFCSF））

EE ．． colicoli产毒株产毒株

上皮生长因子（上皮生长因子（ EGFEGF）） 结核分枝杆菌结核分枝杆菌鸟分枝杆菌鸟分枝杆菌

肿瘤坏死因子（肿瘤坏死因子（ TNFTNF）） EE ．． ColiColi沙门菌属沙门菌属鼠伤寒沙门菌鼠伤寒沙门菌福氏志贺菌福氏志贺菌

细菌对细胞的影响

细菌细菌 蛋白蛋白 机制机制大肠埃希菌（大肠埃希菌（ E.coliE.coli）） CDTCDT （（ ii ）） cdc2cdc2蛋白激酶去磷酸化蛋白激酶去磷酸化大肠埃希菌（大肠埃希菌（ E.coliE.coli）） CNF1CNF1 （（ ii ）作用于）作用于 rhorho

大肠埃希菌（大肠埃希菌（ E.coliE.coli）） CPECPE （（ ii ）？）？幽门螺杆菌（幽门螺杆菌（ H.pylorH.pylorii ））

100kDa100kDa蛋白蛋白 （（ ii ）？）？

核梭杆菌核梭杆菌 aa 95kDa95kDa蛋白蛋白 （（ ii ）抑制细胞周期素产生）抑制细胞周期素产生放线菌放线菌 GapstatinGapstatin （（ ii ）抑制细胞周期素）抑制细胞周期素 BB 的产生的产生直肠弯曲菌直肠弯曲菌 aa 48kDa48kDa蛋白蛋白 （（ ii ）？）？支气管败血症鲍特菌支气管败血症鲍特菌 DNTDNT （（ ii ）抑制胞质分裂）抑制胞质分裂鼠伤寒沙门菌鼠伤寒沙门菌 ST1ST1 （（ ii ）？）？卡氏肺孢菌卡氏肺孢菌 ？？ （（ ii ）抑制）抑制 cdc2cdc2

布氏锥虫布氏锥虫 ？？ （（ ii ）阻断细胞于）阻断细胞于 GG00/G/G11 机制不明机制不明

牙龈卟啉单胞菌牙龈卟啉单胞菌 aa FAFFAF （（ pp ）？）？霍乱弧菌霍乱弧菌 霍乱肠毒素霍乱肠毒素 （（ pp ）？）？多杀巴斯德菌多杀巴斯德菌 PMTPMT （（ pp ）？）？汉塞巴通体汉塞巴通体 ？？ 选择性地作用于血管内皮细胞选择性地作用于血管内皮细胞

调节细胞周期的细菌蛋白

病毒 病毒蛋白 宿主同源物 功能牛痘病毒 CrmA Serpin类蛋白酶抑制

剂抑制 ICE/阻断 IL-1β合成

杆状病毒 P35 蛋白酶抑制剂 抑制 ICE/阻断 IL-1β合成牛痘病毒 B15R IL-1β受体 抑制 IL-1β活性HVS ORF78 可溶性 IL-8受体 抑制 IL-8活性HCMV US28 可溶性 IL-8受体 阻断趋化因子活性粘液瘤病毒 T2 可溶性 TNF受体 阻断 TNF活性粘液瘤病毒 T7 可溶性 IFNγ受体 阻断 IFNγ活性粘液瘤病毒 SERP-1 丝氨酸蛋白酶抑制剂 抑制 ICE？粘液瘤病毒 粘液瘤生长因子 上皮生长因子样蛋白 促进细胞生长SFV T2 可溶性 TNF受体 阻断 TNF活性EBV BCRF1 IL-10 抗炎EHV2 IL-10样蛋白 IL-10 抗炎痘病毒类 EGF ， TGFα 细胞生长促进剂？KSHV v-趋化因子 MIP-Ⅰ ， MIP-Ⅱ ？KSHV v-IL-6 IL-6 抑制凋亡？KSHV v-IRF IRF ？

病毒的细胞因子调节基因及其表达产物

蛋白 被抑制的细胞因子霍乱肠毒素 TNF

百日咳毒素 IL-1

炭疽水肿毒素 TNF

铜绿假单胞杆菌外毒素 IL-1 ， TNF淋巴毒素， IFNγ

D 型肉毒毒素 TNF

小肠结肠炎耶氏菌 YopB TNF

紫茉莉变形菌属 39kDa蛋白 TNF

鼠伤寒沙门菌产生 T细胞增殖抑制剂（ ST1）

IL-2

布氏杆菌源蛋白 TNF

肠致病型大肠埃希菌蛋白 IL-2 ， IL-4 ， IL-5 ， IFNγ

伴放线菌素嗜血菌 14kDa蛋白 IL-2 ， IL-4 ， IL-5 ， IFNγ

细菌的抗细胞因子蛋白

细菌对细胞的粘附细菌对细胞的粘附

黏附 黏附

EPITHELIUMEPITHELIUM

receptorreceptor

BACTERIUMBACTERIUM

黏附主要由黏附素 (adhesin) 介导 G- 菌毛组分 G+ 菌体表面毛发样突出物

生化反应生化反应

组织特异性组织特异性

Normal / Commensal Flora

Human 30,000-50,000 genes ~250 cell types

Ratio of Bacteria to Human Cells 10-100 : 1 Estimated Bacterial Species in the Intestinal Tract• 400-600 species per person (as many as 75% are unknown)in a recent survey >8000 ribotypes have been identified from GI tract of 140 samples

• 1200 + bacteriophage/viruses (in 5g of feces)

~1,000,000 bacterial genes in the GI tract alone (predict 30% of these to be novel and unlnown function =300,000) The total number of genes of the gut flora is 50-100 times that of the human genome.

(Similar numbers for the oral-nasal cavity)

• Normal Flora are significant component of the “host environment” for many pathogens.

•This is a dynamic community likely to have high rates of horizontal gene transfer.

20022002 年美国微生物学家田纳西州大学年美国微生物学家田纳西州大学SavageSavage 教授提出教授提出————正常菌群在生态正常菌群在生态学上应当被看作是宿主的一个学上应当被看作是宿主的一个器官器官或一或一个个系统系统。。

正常菌群与宿主之间的作用是非常正常菌群与宿主之间的作用是非常重要重要并且非常并且非常复杂复杂的。 的。

正常菌群正常菌群

有人提出一个解释共栖矛盾的假说：细胞因子释有人提出一个解释共栖矛盾的假说：细胞因子释放的失败是因为正常菌群中的细菌可以产生、释放的失败是因为正常菌群中的细菌可以产生、释放一些可以调节上皮细胞致炎因子含量的蛋白质，放一些可以调节上皮细胞致炎因子含量的蛋白质，微生物因子。可以：①直接抑制致炎因子的形成；微生物因子。可以：①直接抑制致炎因子的形成；②诱导抗炎因子的合成，如②诱导抗炎因子的合成，如 IL-10IL-10 和和 TGFβTGFβ ；③；③两者兼有；④通过一些未知的机制在粘膜下调节两者兼有；④通过一些未知的机制在粘膜下调节细胞因子网络。 细胞因子网络。

正常菌群正常菌群

我们预测正常菌群中的细菌可能产生相当数量的蛋白，这我们预测正常菌群中的细菌可能产生相当数量的蛋白，这些蛋白可调节粘膜细胞因子体系并防止粘膜受到细菌释放些蛋白可调节粘膜细胞因子体系并防止粘膜受到细菌释放的致炎症组分的作用而发生炎症。因此这些蛋白具有潜在的致炎症组分的作用而发生炎症。因此这些蛋白具有潜在的治疗作用。的治疗作用。分泌性蛋白酶是细菌用来控制宿主反应的另外一种机制。分泌性蛋白酶是细菌用来控制宿主反应的另外一种机制。蛋白酶与许多特发性疾病如肺气肿、哮喘、关节炎及癌症蛋白酶与许多特发性疾病如肺气肿、哮喘、关节炎及癌症有关。细菌蛋白酶除了在营养及细菌生长方面有作用外，有关。细菌蛋白酶除了在营养及细菌生长方面有作用外，现又有证据表明，细菌可通过释放蛋白酶调节炎症机制。现又有证据表明，细菌可通过释放蛋白酶调节炎症机制。

以肠道内正常菌群与细胞相互作用为例以肠道内正常菌群与细胞相互作用为例

• 肠道的黏膜表面巨大，是病原微生物感染的主要位点，同时是正常菌群和抗原同宿主相互作用的主要位点。

• “岗哨细胞” (Sentinel cells)—— 感知环境，协同防御 – 上皮细胞– 巨噬细胞– 上皮内树突样细胞

• 对外界刺激作出反应，释放趋化因子（ chemokines

）和细胞因子，促发炎症（ recruit inflammatory）和激活免疫细胞来控制潜在的感染因子。

图 1 菌群－宿主相互作用 缩写： Ag ，抗原； APC ，抗原递呈细胞； DC ，树突状细胞； EC ，肠上皮细胞； FAE ，滤泡相关性上皮细胞； M ， M 细胞； MALT ，黏膜相关淋巴组织； MHC ，主要组织相关复合体； NOD ，核苷酸结合寡聚化结构域受体； PAMP ，病原相关分子模型； PRR ，模式识别受体； TLR ， Toll 样受体。

模式识别受体模式识别受体（（ Pattern recognition receptors,PRRPattern recognition receptors,PRR ））

肠道上皮细胞产生不同的肠道上皮细胞产生不同的 PRRPRR识别微生物的基序识别微生物的基序，也就是病原相关分子模式，也就是病原相关分子模式 (Pathogen-(Pathogen-associated molecular pattern, PAMP)associated molecular pattern, PAMP) 。。PAMPPAMP 进化上高度保守而且在同类微生物中恒定不进化上高度保守而且在同类微生物中恒定不变，哺乳动物可以通过少量的变，哺乳动物可以通过少量的 PRRPRR识别大部分微识别大部分微生物。 生物。

• 两类受体家族：两类受体家族：– TollToll 样受体（样受体（ TLRTLR））– 核苷酸结合寡聚化结构域受体（核苷酸结合寡聚化结构域受体（ NODNOD） ）

TLR

TLRTLR 是跨膜蛋白，细胞外侧结构域具有富含亮氨是跨膜蛋白，细胞外侧结构域具有富含亮氨酸的重复序列，胞内侧具有高度保守的酸的重复序列，胞内侧具有高度保守的 Toll/IL-1Toll/IL-1受体结构域（受体结构域（ TIRTIR）。）。

共共 1111 种：编号为种：编号为 TLR1-11TLR1-11– 位于细胞表面的位于细胞表面的 TLR TLR ：： TLR1TLR1 ，， -2-2 ，， -3-3 ，， -5-5

，， -6-6– 位于细胞内层的位于细胞内层的 TLR TLR ：： TLR7,-8TLR7,-8 和和 -9-9

• TLR2 识别革兰阳性细菌肽聚糖（ PGN ）层的脂蛋白和脂磷壁酸（ LTA ）。

• TLR3 识别感染宿主细胞的病毒复制过程中合成的双链 RNA。

• TLR4 主要由 PAMP 中最典型的 LPS 激活。 • TLR5 识别革兰阳性和阴性菌的鞭毛蛋白。 • TLR7 识别病毒的单链 RNA ，鼠类的 TLR7 和人类的 TLR8

可以识别来自 HIV-1 的富含 GU 的单链 RNA 。• TLR9 识别未甲基化的 CpG序列。 • TLR11 可以识别非致病性大肠杆菌并且保护肾脏不会由大肠杆菌引起上行性感染

特发性疾病特发性疾病

心血管疾病心血管疾病 (( 高血压、中风、窒息性疼痛、心肌梗塞和动脉粥高血压、中风、窒息性疼痛、心肌梗塞和动脉粥

样硬化 样硬化 ):):患牙周疾病的病人心血管疾病的发病率较高患牙周疾病的病人心血管疾病的发病率较高

细菌性心内膜炎

病毒性心肌炎

牙菌斑与心血管系统感染

特发性疾病特发性疾病

胃和十二指肠溃疡胃和十二指肠溃疡 ::H.pyloriH.pylori

特发性疾病关节炎关节炎 : : 感染感染

特发性疾病特发性疾病

肿瘤肿瘤 : : H.pyloriH.pylori

特发性疾病特发性疾病

哮喘：哮喘盛行的一个可能解释是结核病例的减少。当人群感染结核增多时，大多数个体的 Th1 反应大大升高（ Th1 是对抗胞内微生物所必需的），而人群不再感染结核时， Th2 反应相对突出，正是这种反应引发了与特异性免疫反应和哮喘有关的肥大细胞及嗜酸性细胞。

贫血的病人与恶性疟原虫贫血的病人与恶性疟原虫

我们知道镰刀状细胞贫血或地中海贫血的病人对恶性疟原虫的敏感性降低，认为这是由于杂合体更易在它们的红细胞上表达疟疾抗原。就易感性及对细菌感染的反应而言，越来越多的证据表明，细胞因子基因启动子的多态性在其中起着重要所用。例如，一些个体可能针对某一特定致炎因子产生比其他个体更多的 IL-1 或 IL-6 ，这些细胞因子的升高可能是保护性的，然而细胞因子同时又可引起组织病变，因此过量产生也具有损伤性。鉴于存在大量的这种蛋白以及它们与天然或获得性免疫反应的密切关系，揭开它们对细菌感染易感的基因组学将是一个重要并且必要的任务。

古细菌古细菌

古细菌作为共栖微生物存在于反刍动物及人类中。有关古细菌真核细胞之间的相互作用仍存在许多问题：古细菌之间有多少交流？古细菌是否会致病？古细菌与细菌之间作用的本质是什么？

研究方法

Cellular Microbiology is a new discipline in Microbiology aimed at understanding how

bacteria, both commensals and pathogens, interact with the cells and matrices of the host. It utilises the methods of classic microbiology

combined with molecular biology, cell biology, structural biology, immunology ,

bioinformatics and omics.

cag-pathogenicity island (PAI) encoded T4SS

Ito, Handbook of physiology 1966.

基因报告系统基因报告系统

• lacZ – beta-galactosidase

• cat– Chlormaphenicol acetyltransferase– Assayable and selectable

• luciferase– from luminescent vibrios– allows real-time measurements– needs oxygen

lacZ 融合

promoterless lacZ

beta-galactosidase

rbs/ATG

rbs/AUG

substrate colour change

mRNA

promoter from test gene

lacZ 融合promoterless lacZ transposon

Replica-plate onto X-gal plates

High iron Low iron

Select for further study

Reporter genes

• Green Fluorescent Protein– From jelly fish– Allows expression assay

by fluoresence– Stable, therefore

cumulative measurement– Allows bacterial cells to be

sorted, visualised inside eukaryotic cells

体内表达技术体内表达技术 (IVET)(IVET)

Mahan MJ, Slauch JM, Mekalanos JJSelection of bacterial virulence genes that are specifically induced

in host tissues

Science 1993 Jan 29;259(5095):686-688• A genetic system was devised that positively selects for

bacterial genes that are specifically induced when bacteria infect their host.

• S. typhimurium genes identified show a marked induction in bacteria recovered from mouse spleen.

• Mutations in all ivi (in vivo-induced) genes that were tested conferred a defect in virulence.

IVETIVET

purA lacZ

promoter of test gene

library of such constructs put into mice

can only survive if purA gene expressed in vivo from promoter

screen out genes that are active in vitro and in vivo by looking at colonies on X-gal

white colonies contain promoters active only in vivo

IVET

Mahan MJ et al.Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host.

Proc Natl Acad Sci U S A 1995 Jan 31;92(3):669-673 • IVET approach expanded

– to use antibiotic resistance for selection in host tissues

• new transcriptional-fusion vector, pIVET8 – contains promoterless cat and lacZY

• Pool of S. typhimurium clones with random cat-lac fusions– used to infect BALB/c mice – mice treated with intraperitoneal injections of chloramphenicol– bacteria recovered– screened for lack of lacZY expression on laboratory medium

IVET

Camilli A, Beattie DT, Mekalanos JJ

Use of genetic recombination as a reporter of gene expression.

Proc Natl Acad Sci U S A 1994 91:2634-2638

• gene expression reporter cassette that permits the generation of transcriptional fusions to tnpR encoding site-specific recombinase of gamma delta

• Induction fusions results in production of TnpR,causing excision of a linked tetracycline-resistance reporter gene.

• Loss of tetracycline resistance in descendant bacteria serves as a permanent and heritable marker of prior gene expression.

体内诱导的抗原技术 体内诱导的抗原技术 IVIATIVIAT

• In vivo induced antibody technology– Take antibodies from infected animal or

human– Adsorb out those that react with lab-grown

bacteria– Screen expression library to find in vivo-

specific proteins

Handfield M, Brady LJ, Progulske-Fox A, Hillman JD.IVIAT: a novel method to identify microbial genes expressed specifically during human infections. Trends Microbiol. 2000 Jul;8(7):336-9. Review.

Evidence of importance of actA

12h

36h

Gastric cells SGC7901 cocultured with BCS of H.pylori isogenic strains show different morphology in cytoskeleton, especially in the assembly of tubulin and architecture of the microtubule cytoskeleton.

免疫

Systems Biology

Omics

Genomics

Transcriptomics

Proteomics

Metabolomics

Interactomics

Molecular Biology

生物组学技术 ----------- 蛋白质组学 /转录组学

Microarray experimental overview

Scan slideAnalyze data

Grow cells

Isolate RNA Make labeled cDNA

Mix and hybridize

37C 25C