1) INTRODUÇÃO

Em média, a matéria seca que uma planta acumula é composta em 96% por carbono,

oxigênio e hidrogênio. Entre os elementos minerais, o nitrogênio é o elemento presente em

maior concentração, o qual situa-se em torno de 1,5% da matéria seca.

O nitrogênio faz parte de um grande número de diferentes substâncias as quais

perfazem muitas diferentes funções na planta, como podemos ver na figura abaixo:

Durante o crescimento auxotrófico das plantas, o nitrogênio inorgânico é assimilado

na síntese de moléculas orgânicas, e se encontra presente nestas principalmente na forma

NH3. Duas principais formas de assimilação do nitrogênio podem existir:

• Fixação do nitrogênio molecular (N2) do ar

• Assimilação do nitrato (NO3

-

) ou amônia (NH4) contido na água ou no solo

Dentre essas duas formas, a predominante é a assimilação do nitrato, a qual é

responsável por 99% do nitrogênio na biosfera. A assimilação na forma de amônia é

relativamente insignificante, exceto em solos pouco drenados ou alagados, quando essa

forma de nitrogênio não pode ser prontamente convertida pelas bactérias nitrificadoras

presentes no solo. A amônia, contudo, é continuamente adicionada naturalmente aos solos

como produto final da degradação da matéria orgânica dos organismos em decomposição,

sendo rapidamente convertida em nitrato na maioria dos solos.

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Marcelo Francisco Pompelli, Leonardo Carnevalli DiasMarcelo Francisco Pompelli, Leonardo Carnevalli DiasMarcelo Francisco Pompelli, Leonardo Carnevalli DiasMarcelo Francisco Pompelli, Leonardo Carnevalli Dias

Figura 1 - Estrutura de algumas substâncias que contém nitrogênio e que realizam diferentes funções

nas plantas.

O ciclo do nitrogênio apresenta as principais origens e transformações do nitrogênio,

onde ocorre um processo cíclico de sua transformação da forma inorgânica à orgânica, e

vice-versa, dentro das cadeias tróficas da biosfera. Como se pode observar a fixação

biológica é muito maior do que a soma da fixação atmosférica com a fixação industrial.

Também podemos observar que a fixação biológica fornece menos do que 10% do total de N

adquirido pelas plantas. Outros valores não apresentados na figura abaixo correspondem, por

exemplo, a voltatização da amônia.

Figura 2 - Esquema resumido do Ciclo do Nitrogênio

2) ASSIMILAÇÃO DO NITRATO

A assimilação do nitrato corresponde a 99% do nitrogênio adquirido pelas plantas, e é

catalizada pela ação das enzimas redutase do nitrato e redutase do nitrito.A enzima redutase

do nitrato (NR) é uma enzima citosólica que cataliza a reação de redução do nitrato a nitrito,

enquanto a enzima redutase do nitrito (NiR) é uma enzima cloroplastídica que converte o

nitrito a amônio.

3) REDUÇÃO DO NITRATO A NITRITO

Cada subunidade de uma nitrato redutase (NR) das plantas superiores é composta de

três grupos prostéticos: FAD (dinucleotídeo da flavina-adenina), grupo heme, e de uma

pterina (molécula orgânica contendo o molibdênio complexado; fig 3). Devido a importância

desse elemento mineral para a atividade dessa enzima é que plantas com deficiência de

molibdênio apresentam acumulação de nitrato. O domínio FAD da NR é responsável pelo

captura de dois elétrons do NAD(P)H. Os elétrons passam então para o grupo heme,

chegando então a pterina (abreviada como MoCo), aonde os elétrons são cedidos a uma

molécula de nitrato, formando então uma molécula de nitrito.

Essa enzima também é capaz de transportar elétrons do NADPH ao Fe3-

, ou do metil-

viologênio ao nitrato, ou do NADPH ao clorato (ClO3

-), transformando-o em clorito (ClO

2

-),

o qual é tóxico podendo levar a planta à morte. O clorato tem sido utilizado para obter

mutações que anulam ou reduzem fortemente a atividade da NR, e tem sido utilizado no

passado com um herbicida não seletivo para matar plantas daninhas nas estradas de ferro.

Figura 3 - Estrutura da enzima nitrato redutase e seqüência de transporte de elétrons entre os

seus grupos prostéticos.

O nitrato é assimilado nas folhas e também nas raízes das plantas. Na maioria das

plantas herbáceas, as quais possuem um crescimento relativamente rápido, a assimilação do

nitrato ocorre primariamente nas folhas, embora a assimilação nas raízes pode

freqüentemente ter um papel importante nos estágios iniciais do desenvolvimento dessas

mesmas plantas. Em contraste, muitas plantas lenhosas (arbustos e árvores), e também

legumes, podem ter a assimilação do nitrogênio ocorrendo em altos níveis nas raízes.

As raízes das plantas contêm um sistema de absorção de nitrato o qual é dependente

indiretamente de energia (dependente do gradiente de prótons criados pela ATPase da

membrana), o qual pode ter alta afinidade pelo nitrato, podendo absorver nitrogênio do solo

mesmo que em concentrações tão baixas quanto 10 uM. Para cada molécula de NO3

-

absorvida, dois prótons são co-transportados por um carregador simporte do nitrato. Dessa

forma, a absorção do nitrato é altamente dependente da geração do ATP pelas mitocôndrias

das células das raízes, podendo essa absorção ser drasticamente reduzida ou mesmo anulada

quando a geração do ATP é reduzida, como quando da ocorrência da hipoxia (baixos níveis

de oxigênio) nas raízes. Também os íons NH4

+

inibem a absorção de nitrato.

Figura 4 - Possíveis rotas na Assimilação do nitrogênio em plantas.

O nitrato absorvido pelas raízes pode ser armazenado temporariamente neste órgão

nos vacúolos de suas células corticais e epidérmicas. A amônia é utilizada pode ser utilizada

nessas células para a síntese de amidas (como por exemplo, da asparagina e da glutamina).

Esses dois aminoácidos são então transportados para a parte aérea da planta através do

xilema (fig. 5). O transporte de amidas da raiz pode coexistir com o transporte de nitrato.

O nitrato transportado até as células do mesófilo é reduzido a nitrito pela enzima

redutase do nitrato presente no citosol e então até amônia pela enzima redutase do nitrito no

cloroplasto (fig. 5).

Figura 5 - Absorção do nitrato por uma célula e as possíveis rotas de seu metabolismo ou

compartimentalização.

4) REDUÇÃO DO NITRITO A AMÔNIA

A redução do nitrito a amônia requer mais energia do que a redução do nitrato a

nitrito. Na redução do nitrito é requerido o uso de seis elétrons, os quais são catalizados pela

enzima redutase do nitrito (NiR), a qual localiza-se exclusivamente nos plastídeos. O doador

de elétrons é a ferredoxina.

A redutase do nitrito contém um grupo 4Fe-4S, uma molécula de FAD e um grupo

siroheme. Esses três grupos formam uma cadeia de transporte de elétrons da ferredoxina ao

nitrito.

A capacidade de redução do nitrito no cloroplasto é muito maior do que a capacidade

de redução do nitrato no citosol, em parte devido a alta afinidade daquela enzima pelo nitrito.

Este fato é importante, visto que o nitrito pode ser tóxico a célula vegetal

Figura 6 - Esquema mostrando a reação catalisada pela NiR e a seqüência de transporte de

elétrons entre os grupos prostéticos da enzima.

5) ASSIMILAÇÃO DA AMÔNIA:

A assimilação da amônia envolve principalmente a atividade de duas enzimas que

atuam seqüencialmente, a sintetase da glutamina (GS) e a sintase do glutamato (GOGAT). A

enzima GS está presente nos cloroplastos e transfere a recém sintetizada molécula de amônia

em glutamina, às custas de ATP e glutamato. A sintetase da glutamina também possui alta

afinidade pela amônia, de tal forma que não ocorre acúmulo desse composto que também

pode ser bastante tóxico à célula vegetal.

Figura 7 - Detalhes das reações catalizadas pela GS e GOGAT na assimilação da amônia

Nas plantas C3 ocorre um alto nível de fotorrespiração. A quantidade de amônia

liberada durante a oxidação da glicina é cerca de 5 a 10 vezes maior do que a quantidade de

amônia gerada pela assimilação do nitrato. Dessa forma somente uma pequena proporção da

sintese de glutamina nas folhas é diretamente envolvida na assimilação do nitrato. Existe

também uma isoforma de sintetase da glutamina no citosol das células das plantas.

Figura 8 - Compartimentalização das reações da assimilação do nitrato e da fotorrespiração

em células mesofílicas. A amônia pode ser formada na descarboxilação da glicina na

fotorrespiração (colorida em preta), ou através da assimilação do nitrato.

O herbicida glicofosinato (Nome comercial Basta) é um análogo do glutamato, e

enibe a enzima sintetase de glutamina (GS). Este herbicida, ao ser aplicado as plantas enibe a

GS, levando a planta a morte devido a acumulação de amônia.

Figura 9 - Estrutura química do herbicida Basta (glicofusinolato), inibidor da GS.

A glutamina formada no cloroplasto serve como substrato juntamente com uma

molécula de α-cetoglutarato, e é convertida a duas moléculas de glutamato através da enzima

sintase do glutamato (também chamada de glutamina-oxoglutarato aminotransferase,

GOGAT), utilizando o poder redutor da ferredoxina. Algumas plantas podem conter uma

outra enzima equivalente, a qual utiliza, o NADPH como redutor ao invés da ferredoxina.

O α-cetoglutarato, requerido para a reação catalisada pela sintase do glutamato, é

transportada aos cloroplastos por uma proteína translocadora específica, a qual é um

carregador antiporter, o qual utiliza como contraíon o malato . Este transporte pode ocorrer

em ambas direções, ou seja, do cloroplasto para o citosol ou vice-versa. Outra proteína

transportadora transporta glutamina para fora do cloroplasto, às custas do contratransporte de

glutamato do citosol para essa organela.

Outra reações de assimilação de amônia é a reação promovida pela enzima

desidrogenase do glutamato (GDH). Essa enzima normalmente possui baixa atividade,

contribuindo pouco para a síntese de glutamato em relação a enzima GOGAT (figura 10)

Figura 10 - Detalhes da reação catalisada pela enzima GDH.

6) ASSIMILAÇÃO DO NITRATO NAS RAÍZES.

A assimilação do nitrato pode ocorrer somente na folha, tanto na folha como na raiz,

ou exclusivamente na raiz, dependendo do genótipo da planta. Enquanto o poder redutor nas

folhas é fornecido diretamente no local onde é necessário o maior consumo de poder redutor

(redução do nitrato a nitrito no cloroplasto), o poder redutor necessário para promover as

mesmas reações na raiz provém da oxidação dos carboidratos transportados pelo floema

(sacarose), através do Ciclo Oxidativo das Pentoses. Este ocorre dentro de plastídeos

denominados de leucoplastos, necessitando então do transporte de hexoses-P do citosol para

dentro dessas organelas.

Para ocorrer essa redução do nitrato no leucoplasto de uma célula da raiz, é

necessária a atuação de uma proteína carregadora antiporter, a qual contratransporta triose-P

do leucoplasto para o citosol. Essa triose-P é originada no próprio Ciclo das Pentoses. Esse

ciclo produz então o poder redutor necessário para a produção de ferredoxina reduzida

(necessário para a redução do nitrito) e para sustentar a atividade da sintase do glutamato

dependente de NADPH. A redução do nitrato nas raízes geram amidas como subprodutos

(glutamina e asparagina), as quais então são transportadas para as folhas via a corrente

transpiratória do xilema.

Figura 11 - Esquema da redução do nitrato nos leucoplastos das raízes e a importância do

Ciclo das pentoses no suprimento de poder redutor

7) CUSTO ENERGÉTICO E REGULAÇÃO DA ASSIMILAÇÃO DO

NITRATO

A assimilação do nitrogênio pelas tem um alto custo energético para as plantas. A

regulação dessa rota metabólica exerce-se principalmente no controle da atividade da NR e

da GS.

Figura 12 = Custo energético da assimilação do nitrogênio. O gasto de poder redutor foi

transformado em ATP deforma a permitir a comparação. Este gasto não está especificado

para a síntese de outros aminoácidos ou substâncias sintetizadas a partir desses.

A redução do nitrato e a assimilação do CO2 pelo Ciclo de Calvin são reações

competidoras pelo poder redutor e por energia (NADPH e ATP), e precisam ser bem

reguladas de forma que uma não prejudique a outra. A assimilação do nitrogênio dessa forma

deve ser favorecida somente a partir do momento quando a planta possui níveis adequados

de carboidratos, visto que o esqueleto dos aminoácidos é composto basicamente de carbono

originado de metabólitos intermediários da respiração. O nível de assimilação de nitrogênio

precisa também ser regulado de forma que a produção de aminoácidos não exceda a

demanda. Também é importante que a redução do nitrato não exceda a redução do nitrito,

visto que o nitrito, quando acumulado, pode ser tóxico a célula. Acumulação do nitrito pode

ocorre r sob hipoxia, quando a reação da NiR é inibida.

O NADH requerido para a redução do nitrato no citosol pode também ser

providenciado durante a noite, via a degradação glicolítica de carboidratos. Contudo, a

redução do nitrito e a assimilação da NH4+

nos cloroplastos depende fundamentalmente da

fotossíntese, a qual produz poder redutor e ATP necessários às reações. A capacidade do

Ciclo das Pentoses nas folhas em suprir o poder redutor para essas duas reações é bastante

limitado. Sendo assim, durante a noite, a redução do nitrato precisa ser fortemente reduzida

ou mesmo desligada, de forma a impedir a acumulação do nitrito em níveis tóxicos. Uma

forma de obter essa regulação é a soma do efeito de duas características, como a vida curta

da proteína NR (vida média de poucas horas , a qual é degradada no final do dia, e da

transcrição de seus genes de forma controlada pela luz. Assim, níveis significativos dessa

enzima somente serão observados durante o dia.

Uma maneira de regular a assimilação do nitrogênio de forma a não prejudicar outros

processos metabólicos , também pode ocorrer via a regulação da transcrição dos genes da

NR. Altos níveis de nitrato ou de carboidratos podem estimular a transcrição, de forma que a

enzima esteja presente em níveis adequados ao nível de energia disponível da planta, bem

como na disponibilidade de seu substrato (fig. 13). De maneira oposta, a transcrição pode ser

inibida, quando a célula acumula altos níveis de glutamina, por exemplo, de forma que a

atividade dessa enzima não leve a acumulação de aminoácidos acima da demanda da célula,

o que poderia levar a redução, por exemplo, da concentração de outros metabólitos

necessários a respiração ou outros rotas bioquímicas.

Figura 13 - Regulação da atividade da NR a nível transcripcional e através de sua inibição

pela proteína 14-3-3.

A regulação a nível de transcrição é um mecanismo que pode necessitar mais do que

uma hora, e pode não ser rápida para evitar efeitos quando a sua atividade está acima da

demanda da célula. Outros mecanismos mais rápidos são necessários. A fosforilação da

enzima é um passo essencial na redução da atividade dessa enzima. Ela é necessária para que

um inibidor, a proteína 14-3-3 possa ligar-se a essa enzima, resultando então em sua

inativação. A cinase da NR é estimulada por íons Ca2+

e inibida por triose-P e Glicose 6-P.

Outra enzima, a fosfatase da NR, é necessária para desfosforilar a NR, e então reativá-la.

Esse processo lembra também a SPS, a qual torna-se menos ativa quando fosforilada.

8) UM GRANDE ESPECTRO DE AMINOÁCIDOS É O PRODUTO FINAL

DA ASSIMILAÇÃO DO NITRATO

A síntese de aminoácidos ocorre principalmente no cloroplasto. O espectro de

aminoácidos sintetizados depende da espécie de planta e das condições metabólicas. Na

maioria dos casos, são o glutamato e a glitumina a maior porção dos aminoácidos

sintetizados. O glutamato é exportado do cloroplasto em troca pelo malato, e a glutamina na

troca pelo glutamato. Também serina e glicina, os quais são formados como produtos da

fotorespiração, podem representar uma condirável porcal do total de aminoácidos presentes

em uma célula mesofílica. Já em plantas C4 a alanina e o aspartato podem representar fração

significativa da composição de aminoácidos de células das folhas.

O carbono assimilado pela fotossíntese é a fonte dos carbonos que vão compor o

“esqueleto” dos aminoácidos. A figura abaixo ilustra as origens dos aminoácidos a partir dos

intermediários da glicólise ou da fotossíntese.

Figura 14 - Principais rotas de biossíntese de aminoácidos em folhas de plantas. O

glutamato e a glutamina também participam em várias reações de transaminação na síntese

de outros aminoácidos (detalhe não mostrado na figura)

Como pode ser observado na figura acima, o 3-PGA é o precursor mais importante

para a síntese de aminoácidos.

A enzima PEPC também tem importância na síntese de aminoácidos. A reação

catalizada por essa enzima também é mostrada na figura abaixo. Ela produz o oxalacetato a

partir do PEP, e o oxalacetato possui duas funções básicas na assimilação do nitrato, ou ele é

convertido por transaminação a aspartato o qual é precursor para a síntese de cinco outros

aminoácidos (asparagina, treonina, isoleucina, lisina e metionina), ou, junto com o piruvato,

é o precursor para a formação do α-cetoglutarato, o qual é convertido por transaminação a

glutamato, sendo o precursor de outros aminoácidos (glutamina, arginina e prolina). Já o

glicolato formado pela fotorespiração é o precursor para a formação da glicina e serina.

9) A SÍNTESE DO GLUTAMATO REQUERE A PARTICIPAÇÃO DO

METABOLISMO MITOCONDRIAL

Como visto anteriormente, o glutamato é formado a partir do α-cetoglutarato, o qual

pode ser fornecido pelo desvio deste intermediário do Ciclo de Krebs. O piruvato e o

oxalacetato podem ser transportados do citosol para a mitocôndria por translocadores

específicos (fig. 15). Parte das reações do Ciclo de Krebs podem também existir no citossol

das plantas devido a presença da desidrogenase do isocitrato dependente do NADP e da

aconitase neste compartimento celular o qual pode então sintetizar esse importante precursor

da síntese dos aminoácidos. Para que isso ocorra, o citrato tem que ser transportado para o

citosol por um carregador antiporter o qual utiliza o oxalacetato como molécula contra-

transportada.

Figura 15 - Esquema mostrando os intermediários da respiração e outras rotas metabólicas

associadas a síntese de aminoácidos.

10) ALTOS NÍVEIS DE AMÔNIA OU NITRATO PODEM SER TÓXICOS

As plantas podem armazenar significantes quantidades de nitrato em seus vacúolos.

Quando este armazenamento se realiza em altos níveis, quando por exemplo as plantas são

cultivadas sob excesso de adubação nitrogenada, ele pode resultar em risco de morte para

seres humanos. O nitrato (NO3

-

) pode ser convertido a nitrito (NO2) no fígado. O nitrito

então pode-se ligar a hemoglobina de forma irreversível, e torná-la incapaz de ligar o

oxigênio. A deficiência no transporte de oxigênio derivado desse efeito pode levar a morte

ou lesões cerebrais, em uma doença denominada de methemoglobinemia. Outro aspecto

tóxico do nitrato na saúde humana é sua conversão em nitrosaminas, uma classe de

compostos com alta capacidade mutagênica. Contudo, altos níveis de nitrato podem não ser

tóxicos às plantas, principalmente devido a sua capacidade de transportá-lo para o vacúolo,

evitando efeitos osmóticos ou iônicos negativos no metabolismo das células vegetais.

Figura 16 - Esquema representando o efeito tóxico da amônia na dissipação de gradiente de

prótons entre as duas faces de uma membrana.

Ao contrário do nitrato, altos níveis de amônia podem ser tóxicos tanto para as

plantas como para os animais. No caso do último, um receptor olfativo é presente, o qual é

ligado a reação de repulsão ao cheiro da amônia. A toxidez da amônia deve-se ao seu poder

de dissipar gradientes de prótons presentes entre as duas faces de uma mesma membrana. Na

figura abaixo exemplifica-se a potencial atuação da amônia na redução do gradiente

protônico em diferentes compartimentos das células das plantas.

A dissipação do gradiente iônico leva a redução da geração de ATP, da polaridade da

membrana (e, portanto, leva a redução da atividade de proteínas transportadoras), resulta em

alterações de pH.