工學碩士學位請求論文

Lactobacillus 균주가 생산하는 세포외다당류와

biofilm간의 상 계에 한 연구

Correlation between exopolysaccharide production

and biofilm formation in Lactobacillus spp.

2006年 2月

仁荷大學校 大學院

生物工學科

崔 允 道

工學碩士學位請求論文

Lactobacillus 균주가 생산하는 세포외다당류와

biofilm간의 상 계에 한 연구

Correlation between exopolysaccharide

production and biofilm formation in Lactobacillus spp.

2006年 2月

仁荷大學校 大學院

生物工學科

崔 允 道

Lactobacillus 균주가 생산하는 세포외다당류와

biofilm간의 상 계에 한 연구

Correlation between exopolysaccharide

production and biofilm formation in Lactobacillus spp.

2006年 2月

指 敎授 在 成

이 論文을 工學碩士學位 論文으로 提出함.

仁荷大學校 大學院

生物工學科

崔 允 道

이 論文을 崔允道의 碩士學位論文으로 認定함.

2006年 2月

主審 : ㊞

副審 : ㊞

委員 : ㊞

- i -

요 약

이 연구에서 건강한 여성의 질에서 분리된 108개의 lactobacillus 다

량의 exopolysaccharide (EPS)의 생산가능성과 고 항균활성 능력을 갖는

Lactobacillus paracasei KLB58을 분리하 다. 선별된 KLB58을 EPS의 화학

인 분석을 해 NTG (1-Methyl-3-nitro-1- nitrosoguanidine) 처리하여 높

은 cell surface hydrophobicity (CSH)를 갖는 돌연변이주를 확보하 다. 첫

번째로 실험균주들이 생산하는 EPS의 량을 최 화하기 해 다양한 배양 조

건하에서 phenol-sulfuric acid test를 수행하 다. 배양온도 20 ℃에서 44시간

정치 배양시켰을 때 가장 높은 EPS 생산량을 보 다. 두 번째로 KLB58과 돌

연변이주의 EPS 생산과 biofilm 형성간의 상호 계에 한 연구를 수행하

다. 실험결과 돌연변이주보다 더 높은 EPS 생산량을 갖는 KLB58이 biofilm

한 더 많이 형성하는 것으로 나타났다. 이상의 결과로 Lactobacillus spp.에

서 biofilm의 형성에 향을 미치는 요한 인자 하나는 EPS임을 본 연구

에서 처음으로 확인하 다. 마지막으로 실험균주로부터 분리된 EPS의 화학

인 분석을 시도하여 구성 단당류의 조성을 결정하 다. KLB58이 생산하는

EPS는 fructose, glucose, galactose, mannose, ribose, fucose, rhamnose로 구

성된 반면에 돌연변이주의 EPS는 glucose, galactose, mannose, ribose, fucose

로 구성되었다.

- ii -

AB S T RACT

In a previous study, we have isolated Lactobacillus spp. from healthy

human and examined various characteristics such as exopolysaccharide

(EPS) production and biofilm production. We have selected L. paracasei

KLB58 having high EPS productivity and NTG (1-Methyl-3-nitro-1-

nitrosoguanidine) mutant having high cell surface hydrophobicity (CSH) for

chemical analysis of their EPS. First, we have performed phenol sulfuric

acid test under various growth condition for optimization of EPS

production. The highest EPS producction was found to occur at 20 ℃

during 44 hour static cultivation. Secondly, we performed a comparative

study on EPS productivity and biofilm formation between the KLB58 and

its CSH mutant. The results showed that wild type strain formed more

biofilm than mutant did. We also attempted to determine monosaccharide

composition of the EPS by using spiking method. Monosaccharide of

KLB58's EPS was found to consist of fructose, glucose, galactose,

mannose, ribose, fucose and rhamnose whereas the mutant's EPS consisted

of glucose, galactose, mannose, ribose, and fucose. Further chemical

analysis is under way.

- iii -

목 차

요 약 ······························································································································· i

ABSTRACT ································································································································ ii

목 차 ································································································································ iii

그 림 목 차 ···················································································································· vi

표 목 차 ························································································································· vii

I. 서 론 ····························································································································· 1

1. Probiotics ··············································································································· 1

1.1 Probiotics의 정의 ························································································· 1

1.2 Lactobacilli의 특징 ······················································································ 2

2. 유산균이 생산하는 물질 ····················································································· 4

2.1 유산균이 생산하는 다당류 ········································································· 4

2.2 유산균으로부터 형성되는 biofilm ···························································· 7

II. 연구 목 ···················································································································· 9

III. 재료 방법 ··········································································································· 10

1. 시험 균주 조군 선별 ··············································································· 10

1.1 균주 배양 조건 ····················································································· 10

1.2 조군 선별 (NTG mutagenesis) ·························································· 10

2. 세포 표면 물성의 변화 ····················································································· 11

2.1 Hydrophobicity 측정 ················································································· 11

- iv -

2.2 Remonal kinetics 측정 ············································································· 12

3. 생성물질에 한 연구 ······················································································· 13

3.1 EPS의 정량화 ····························································································· 13

3.2 Biofilm 형성량 측정 ·················································································· 15

4. EPS 구성 단당류의 화학분석 ········································································· 15

4.1 UVD/HPLC 분석 ······················································································· 15

4.1.1 가수분해 과정 ······················································································ 16

4.1.2 2-Aminobenzoic ethyl ester(ABEE)를 이용한 유도체화 반응 16

4.1.3 단당류 조성 확인 ················································································ 17

4.2 GC/MS system ·························································································· 17

4.2.1 Alditol-acetate 유도체화 과정 ························································· 17

4.3 FT-IR 측정 ································································································· 18

IV. 결과 ·························································································································· 19

1. 시험 균주 조군 선별 ··············································································· 19

1.1 배양 균주 특성 ··················································································· 19

1.2 돌연변이주의 선별방법 ············································································· 19

2. 세포 표면 물성의 변화 ····················································································· 21

2.1 Hydrophobicity 측정 ················································································· 21

2.2 Removal kinetics 측정 ············································································· 22

3. 생성물질에 한 연구 ······················································································· 25

3.1 EPS의 정량화 ····························································································· 25

3.1.1 EPS 분리의 문제 ············································································ 25

3.1.2 EPS 분리를 한 배지 성분의 변화 ·············································· 26

3.1.3 EPS 분리방법 개선을 통한 최 화 ················································ 27

- v -

3.1.4 EPS 정량화 결과 ················································································ 29

3.2 Biofilm 형성량 측정 ·················································································· 30

4. EPS 구성 단당류의 화학분석 ········································································· 33

4.1 단당류 조성 확인 ······················································································· 33

4.2 GC/MS system ·························································································· 38

4.3 FT-IR 측정 ································································································· 39

V. 결론 고찰 ············································································································ 42

VI. 참고문헌 ·················································································································· 45

- vi -

그 림 목 차

Fig. 1 Lactic acid bacteria에 의해 생산되는 EPS의 특징 ································· 5

Fig. 2 EPS 생합성 pathway ······················································································ 6

Fig. 3 Bacteria에 의한 biofilm 형성과정 일러스트 ············································· 8

Fig. 4 배양시간 N-source에 따른 단당류 소모량 측정 ······························ 14

Fig. 5 2-Aminobenzoic ethyl ester(ABEE) 유도체 물질 ································· 16

Fig. 6 KLB58 (오른쪽)과 돌연변이주 (left)의 colony 형태 비교 ····················· 20

Fig. 7 KLB58과 돌연변이주들의 Hydrophobicity test ······································ 21

Fig. 8 시료가 소수성층으로 섞여들어가는 kinetics 측정 결과 ······················· 23

Fig. 9 KLB58과 돌연변이주의 removal rate 결과 ············································· 24

Fig. 10 MRS에서 KLB58의 배양시간에 따른 EPS 정량화 실험결과 ············· 26

Fig. 11 SDM에서 시험 균주의 EPS량 비교 결과 ················································ 27

Fig. 12 SDM'에서 KLB58의 배양시간 침 시간 조 후 EPS 정량화

결과 ································································································································ 29

Fig. 13 SDM'에서 KLB58과 E2의 EPS 생산량 비교 ············································· 30

Fig. 14 야생형과 돌연변이주의 biofilm 형성량 비교 ··············································· 31

Fig. 15 KLB58의 biofilm이 Ruthenium red에 의해 염색된 미경 사진 ········ 32

Fig. 16 가수분해된 KLB58의 ABEE 유도체화 처리한 크로마토그램 ··············· 35

Fig. 17 Monosaccharides STD를 ABEE 유도체화 처리한 크로마토그램 ·········· 36

Fig. 18 KLB58의 alditol-acetate 유도체화 처리한 GC/MS 크로마토그램

결과 ································································································································ 38

Fig. 19 KLB58과 돌연변이주의 FT-IR 스펙트럼 ····················································· 40

- vii -

표 목 차

Table 1. Probiotic bacteria의 주된 특성 ································································ 3

Table 2. MRS, SDM, SDM' 의 성분비교 ··························································· 11

Table 3. 크로마토그램에 의한 KLB58의 EPS 단당류 조성 측정 ·················· 37

Table 4. FT-IR의 피크 분석 (Oust. 2004) ·························································· 41

- 1 -

I . 서 론

1 . P robiotics

1 .1 P robiotics의 정 의

로바이오틱스(probiotics)란 항생물질(antibiotics)에 비되어 사용되는

말로서 그리스어의 생명을 한(for life) 뜻으로 유래되었으며, 생물간의

공생 계(probiosis)를 의미하는 생태학 용어에 기원을 두고 있다.

Probiotic가 장내 미생물 균형에 도움을 주는 미생물이나 물질들을 뜻하

는 용어로 Parker(1974)에 의해 처음으로 정의된 이후에 probiotics란 용어는

리 사용되어 왔는데 일반 으로 가축에게 여되는 생균, 사균, 발효부산물

들을 포함하며 이들 에 표 인 것들로는 Bacillus균, 효모, 소화효소제

이들의 복합제가 있다.

Fuller(1989)는 “숙주의 안 과 건강에 유효한 미생물의 구성물질이나 생

산물질”로 probiotics를 정의하 으며, 최근 Expert commission 에 의해 “인체

내로 섭취되어 고유의 성분을 바탕으로 건강을 유지시키는 살아있는 미생물

(Guarner and Schaafsma 1998)”로 정의되었다. 더불어 Probiotics는 사람이나

동물에 건조된 세포형태나 발효산물 형태로 여되어 사람이나 동물숙주의 장

내균총을 개선함으로서 좋은 향을 주는 단일 는 복합균주 형태의 생균으

로 정의되고 있다. 다음과 같은 조건을 만족하면 Probiotics라고 할 수 있다.

1). 사람 내부(Human origin)에 기생

2). 산과 담즙에 안정 이며 사람이 먹었을 때 안 성 유지

- 2 -

3). 장내 막에 부착하여 세균이나 세균에서 분비되는 물질에 항하는

기능보유

일반 으로 Lactobacillus acidophilus, L. faecium, L. casei,

Bifidobacterium bifidum, B. longum 효모 Saccharomyces boulardii 등이

probiotics로 사용되고 있으며, 이러한 생균 활성 미생물(probiotic bacteria)은

Table 1 과 같은 주요 특징과 이 을 가지고 있다. 한 장내 감염에 한 면

역성 증진, 설사성 질환의 방, 결장암(colon cancer) 방, 고콜 스테롤

증(hypercholestero-laemia; 액 에 콜 스테롤이 과잉으로 존재하는 상태)

방, 유당(lactose)의 이용성 개선, 상부 장 (upper gastrointestinal tract)

질병의 방, 장 막벽(gut mucosal barrier)의 안정화 등 치료학 효과를 가

지고 있다(Ouwehand et al. 2002).

1 .2 L actobacilli의 특 징

인간의 구강계, 소화계, 비뇨생식기계의 정상균총으로 서식(Elmer et al.

1996, Pavlova et al. 1997)하는 Lactobacillus spp.는 lactic acid를 생성하여

pH를 산성화하여 병원성 세균을 무력화시키며, 생성된 과산화수소는 세포에

강한 산화작용 단백질 구조를 괴하여 병원균을 사멸시킨다(Eschenbach

et al. 1989, Kim et al. 1994). 한 Lactobacillus spp.에 의해 생성된 항생물

질인 bacteriocin은 여러 가지 부패산물을 생산하는 균의 생육을 억제한다

(Ahn and Stiles. 1990, McAuliffe et al. 1998). 인간과 동물의 식이요법 치료

제와 정장제로 사용되는 Lactobacillus spp.는 probiotics로 많이 연구가 되어

있다(Jo et al. 1997, Verellen et al. 1998).

한 일부 유산균들은 bacteriocin 등의 항균 단백질을 생성하여 물리

- 3 -

․화학 타격으로 병원균의 성장을 지시킨다. 한 안 하며 균형 잡힌

미생물의 생태계를 유지한다(Eschenbach et al. 1989, Kin et al. 1994,

Salminen et al. 1996). 이러한 lactobacilli는 최근들어 질병의 치료와 방, 건

강 회복과 유지는 물론 생물학 작용제(biotherapeutic agents)로 불려지고

있으며 항생제와는 구별된 정장제로 심의 이 되고 있다(Reid 1999).

Table 1. Probiotics bacteria의 주된 특성

P roperty B enefit

Resistance to pancreatic enzymes,

acid and bile

Adhesion to the intestinal mucosa

Human origin

Documented health effects

Safe

Good technological properties

Survival of passage through the intestinal

tract

Immune modulation

Pathogene exclusion

Enhanced healing of damaged mucosa

Prolonged transient colonization (?)

Species specific interactions with the host

Proposed health effects are 'true'

No health risk to consumer

Strain stability

Production at large scale

Oxygen tolerance

- 4 -

2. 유 산균이 생산하는 물 질

2.1 유 산균이 생산하는 다당류

Probiotic bacteria로 주로 사용되는 균주인 lactobacilli와 bifidobacteria의

일부 균주는 exopolysaccharide (EPS)를 생산한다. 사실 EPS를 생산하는 균

주의 건강 증진 효과는 biopolymer의 생물학 활성과 한 련이 있으며,

EPS가 prebiotics 는 항암, 항궤양, 면역 조 는 콜 스테롤 하 기능

등을 갖으므로 인체내 건강에 기여한다고 보았다(De Vuyst and Degeest.

1999) (Fig. 1, 2). 특히 유산균은 식품의 질과 련되어 식품 산업에서 요

한 균주이므로 EPS를 자체 생산하는 균주의 경우 더욱 더 심이 되어왔다.

Lactic acid bacteria (LAB)는 generally recognized as safe (GRAS) 등 의

organism 이므로 LAB가 생산하는 EPS 한 천연 발효 유제품의 질과 도

를 향상시킬 수 있는 안정된 첨가물로 사용된다(Richard. 2003). 유산균에서

분리된 다당류는 다양한 식품에 천연 첨가제로 사용되어 식품의 안정성, 성,

분산성, 그리고 교질화 등에 요한 효과를 제공하며, 동․식물성 식품의 섭취

시 작에도 요한 역할을 한다 (Van den Berg et al. 1995). 한 발효 유제

품의 유동성과 섭취 시 감 등에서 요한 역할을 하는 다당류는 성 증가

와 합음 젤라틴 괴 방지 등을 해 요구르트 산업에서 폭넓게 사용되어 지

고 있다.

EPS는 존재하는 치에 따라 크게 다음과 같은 두가지로 분류될 수 있

다. 세포표면에 하게 연결된 형태의 cell-bound EPS와 세포표면에 느슨하

게 연결된 released EPS의 두가지이다. cell-bound EPS는 주로 capsular

polysaccharide 형태를 나타내고, released EPS는 slime polysaccharide 형태를

- 5 -

가진다(Richard 2003). 본 연구에서 분리되는 EPS는 주로 released EPS이다.

유산균에서는 다당류가 소량 생산되므로 이를 최 화하는 연구가 수행되

어져왔고, 보고된 실험결과 다당류 생산에 향을 미치는 요소는 다음과 같다.

1). 유산균의 배양 온도와 배양 시간

2). 배지의 탄소원과 기 탄소원의 농도

3). 유산균 배양시 산소와 pH 조건

그 외 질소원에 따라서도 다당류의 생산에 차이를 보 다 (Degeest and de

Vuyst 1999, Pham et al. 2000, Petry et al. 2000, Van den Berg et al. 1995).

Figure 1. Lactic acid bacteria에 의해 생산되는 EPS의 특징

- 6 -

Figure 2. EPS 생합성 pathway

- 7 -

2.2 유 산균으로부 터 형 성 되 는 biofilm

Biofilm은 넓은 의미로 외부 세포막 사이를 둘러싼 표면에 련된 미생

물의 집합체라고 정의할 수 있다(Costerton. 1994). Bacterial biofilm은 미생물

이 생존하기 해 표면 는 미생물끼리 착하고 있는 형태를 의미하며 Fig

3. 과 같은 과정을 거처서 형성된다. 이 의 연구를 살펴보면 gram-positive

bacteria인 Staphylococcus epidermidis의 경우는 표면에 처음으로 부착을 개

시하는데 있어서 EPS가 필요하다고 나타나며, Pseudomonas aeruginosa와

Escherichia coli 등의 균주는 EPS의 합성이 표면에 bacteria의 부착을 유도한

다고 나타난다(Paul. 2000). 아직 Lactobacillus spp.에서는 EPS와 biofilm의 연

계에 한 연구가 활발히 진행되고 있지 않지만, 다른 균주에서의 EPS가

biofilm 형성에 갖는 역할은 정황 인 근거로서 EPS와 biofilm의 형성이 서로

한 계에 있음을 시사하고 있다. Generally recognised as safe

(GRAS)(Shin. 2002)로 인정받는 Lactobacillus spp.가 생산하는 EPS와 biofilm

형성 사이의 상 계의 규명은 Lactobacillus spp.가 식품분야와 각종

건강식품에서 요한 probiotics로 역할을 차지하는 균주임을 감안할 때 상당

히 의미있는 연구라 할 수 있겠다.

Lactobacillus spp.가 가지는 특성으로 여성의 질 내에서 pH 안정화

병원균의 억제와 같은 항균활성 기능을 담당한다고 알려져 있다(Chang.

2002, McGoarty. 1993, Song. 1999). Lactobacilli가 여성의 질 내부에서 갖는

항균활성 능력에 한 여러 가지 메커니즘 하나는 상피세포에 존재하는

receptor를 인지하는데 lactobacilli와 병원체가 경쟁 계에 있기 때문에 병원체

의 생장을 해한다(Soledad. 1998)고 알려져 있다. 이는 Lactobacillus spp.의

질 내 상피세포에 한 “부착능력”의 요성을 의미하며 이러한 과정을 통해

질 내 상피세포에서 biofilm이 형성됨을 유추할 수 있다. 미생물로부터 형성되

- 8 -

는 biofilm은 특히 hydrophobicity나 hydrophilicity와 같은 표면 물성에 의해

향을 받게 된다고 알려져 있으므로 본 연구에서는 cell surface

hydrophobicity (CSH)(Park et al. 2000, Chang. 2002)의 변화가 두드러지는

KLB58과 돌연변이주의 둘간의 EPS 생산과 biofilm 형성량의 변화에 을

두어 어떠한 상 계가 존재하는지 살펴보았다.

Figure 3. Bacteria에 의한 biofilm 형성과정 일러스트

(http://www.biofilmsonline.com/cgi-bin/biofilmsonline/ed_how_primer.html

인용)

- 9 -

I I . 연구 목

본 연구의 목 은 이 연구에서 건강한 한국인 체내에서 분리한 정상

세균총으로 상존하는 108개의 lactobacilli 에서 뛰어난 항균활성으로 선별된

Lactobacillus paracasei KLB58이 생산하는 EPS의 최 생산배양조건 분

리조건을 확립하고 EPS 구성 단당류의 화학 인 분석을 통한 균주개량기반을

확립하며, KLB58에 의해 형성되는 biofilm이 EPS와 어떤 상 계에 있는지

규명하는데 있다.

- 10 -

I I I . 재 료 방 법

1 . 시 험 균주 조 군 선 별

1 .1 균주 배 양 조 건

본 실험에서 인체내에서 정상 세균총으로 분리된 108개의 Lactocacilli

선별된 L. paracasei KLB58이 이용되었다. L. paracasei KLB58과 EPS 결핍

돌연변이는 MRS (de Man Rogosa Sharped) 배지에서 정치배양 되었고 배양

온도는 37℃ 다. CSH test를 하여 18시간 정치배양된 배양액을 사용하

다.

1 .2 조 군 선 별 ( N T G mutag enesis)

5 ml의 MRS 배지에 L. paracasei KLB58의 colony를 종하여 37℃에

서 8시간 이상 배양 한 후 1 ml의 배양액을 1.5 ml microtube에 각각 분주한

후 원심분리 하 다(15,000 rpm, 3 min). 원심분리된 cell pellet을 1 ml의

normal MRS로 세척 후 1 ml의 normal MRS에 탁 하 다. 세포 탁액에

10 μl (500 μg/ml)의 NTG를 첨가한 후 37℃에서 30분간 정치 하 다

(Kumaresan et al. 1995). NTG 처리된 세포 탁액은 원심분리(15,000 rpm, 3

min) 후 1 ml의 normal MRS 배지로 2회 세척되었으며 200 μl씩 MRS agar

plate에 도말 하 다.

- 11 -

Table 2. MRS, SDM, SDM' 의 성분비교

성 분 MRS(g/L) SDM(g/L)SDM '

(g/L)

Glucose 20 20 20

Bacto tryptose 10 - 5

Beef extract 10 5 -

Yeast extract 5 - -

Sodium acetate 5 5 5

Ammonium citrate 2 2 2

K2HPO4 2 2 2

Tween 80 1 1 1

Trace solution 2 2 2

Bacto casamino acid - - 20

2. 세포 표 면 물 성 의 변 화

2.1 H ydrophobicity 측 정

소수성층으로 hexadecane을 사용하여 세포표면의 소수성을 정성 으로

측정하 다. 돌연변이주와 야생형의 배양액을 각각 8,000 rpm에서 10분간 원

심분리하여 수거한 후 phosphate buffer (pH 7.0)로 2회 세척하 다.

- 12 -

Hexadecane을 1:1 (v/v)로 첨가한 후 1분간 교반하 다. 실온에서 1시간 정치

한 후 수용액상과 유기용액상의 탁도를 육안 찰하 다(Park et al. 2000).

2.2 Remov al k inetics 측 정

세포표면의 소수성을 정량화하기 하여 세포가 hydrophobic layer

(hexadecane)로 섞이는 kinetics를 측정하 다. 세포배양액을 원심 분리하여

고액 분리 후 phosphate buffer (pH 8.0)로 2회 세척하 다. 기의 optical

density (O.D., A0)를 400 nm에서 0.95-1.05 의 범 에 맞추어 최종 으로

탁하 다. 5ml glass vial에 세포 탁액 2 ml을 담고 hexadecane을 각각 100,

500, 1,000 μl로 첨가하 다. 혼합물을 5 씩 교반하여 혼합한 후, 1시간 동안

정치하 으며, 수용액상의 탁도(At)를 400 nm에서 측정하 다.

흡수율, 즉 removal rate는

log (AtA0

100 )

로 계산하 고, 3회 실험 후 통계처리 하 으며 linear regression을 이용하

다(Park et al. 2000).

- 13 -

3 . 생성 물 질 에 한 연구

3 .1 E P S 의 정 량 화

EPS정량을 해서 Phenol-sulfuric acid 방법을 사용하 으며 이 실험에

필요한 standard는 glucose를 이용하여 측정했다(Cerning et al. 1994). 효율

인 실험을 해 MRS 배지가 아닌 SDM‘ 배지에서 Fig. 4 에서 알 수 있듯이

단당류가 거의 소모되는 시 인 48시간 동안 시험균주를 배양하 다. 배지내

에는 yeast extract와 beef extract는 EPS 정량에 향을 수 있어 배제 하

고 신 bacto casamino acid를 질소 원으로 사용하 다.

EPS 분리는 다음과 같이 행하 다. 배양한 배지내 sample을 각각 300μl를

취한 후 10,000g에서 5분간 원심 분리하여 cell을 제거하 다. cell이 제거된

배지에 3배 volume의 100% ice cold ethanol을 처리한 후 EPS 침 을 해서

-70℃에서 30분간 유지하 다. 그런 후 4,000g에 10분간 원심 분리하여 상등

액은 버리고 pellet을 취하 다. 이 게 만들어진 pellet에 공침된 단당 salt

를 제거하기 해 80% ethanol로 washing후 4,000g에서 다시 원심 분리하

으며 이 과정을 2번 반복하 다.

최종 으로 형성된 pellet을 300μl 증류수에 희석시켰다. 이 게 얻어진

sample을 Phenol-sulfuric acid method를 통해 EPS양을 측정하 다.

- 14 -

Figure 4. 배양시간 N-source에 따른 단당류 소모량 측정

- 15 -

3 .2 B iofilm 형 성 량 측 정

Biofilm 형성량을 측정하기 하여 ruthenium red microplate assay가 사용되

었다. 배양 에 미리 Microtiter는 30분간 각 well에 70% EtOH 150 μl 를 처

리하여 멸균한다. Overnight 배양한 균주의 1%를 fresh MRS 배지에 종한

후 멸균 PVC microtiter plate의 각 well에 100 μl씩 종하고, 시료 바깥열에

멸균 MRS 배지를 종하여 blank well로써 사용한다. 이때 각 well의 바깥

행열은 증발손실을 최소화 하기 해 150 μl의 멸균증수를 종한다. 36℃에서

48시간동안 배양한 후 microtiter에 착하지 못한 세포를 pipetting을 통해 조

심스럽게 제거한다. 액상 ruthenium red (0.1%, 150 μl) solution을 각 well에

첨가하고 실온에서 biofilm을 45분간 염색시킨 후 용액을 조심스럽게

polystyrene microplate에 옮긴다. Microplate reader로 450 nm의 optical

density를 읽는다. Blank well의 평균값에서 측정값을 뺀값이 biofilm에 부착

된 ruthenium red의 량이다(Monica et al. 2003).

4 . E P S 구성 단 당류의 화 학 분 석

4 .1 U V D / H P L C 분 석

KLB58 시료를 roraevaporator 장치로 건조시킨 후 건조된 KLB 58시료

는 100mL의 methanol용액으로 soxhlet 추출 장치를 사용하여 배지 내 포함되

어 있던 단당류와 올리고당을 선택 으로 추출한다. 추출된 당류는 가수분해

과정을 거친다.

- 16 -

4 .1 .1 가수 분 해 과 정

추출 건조된 KLB58 유산균 다당류 시료는 다량의 루코오스와 소량의

올리고당 불순물로 구성되므로, 1.0M H2SO4 용액으로 85℃에서 6시간 동

안 가수분해 시키고 0.1M NaOH용액으로 화 시켜 유도체화 과정을 한 가

수분해 시료를 비한다.

4 .1 .2 2- Aminobenz oic ethyl ester( AB E E ) 를 이용 한 유 도 체 화 반 응

가수분해된 KLB 58 유산균 다당류 시료 100μL를 분취하고, 80μL의

1.4M NaBH3CN, 80μL의 acetic acid, 400μL의 0.6M ABEE를 혼합하여 80℃에

서 30분 동안 유도체화 반응을 시키고 상온까지 식힌다.(Hughes. 1991, Fotini.

2003)

O

CH2OH

OH

OH

OH

OHH2N

C

O

O Et

NaBH3CN(cat)

MeOH,AcOH,80℃

OH

CH2

CH2OH

OH

OH

OH

NHH

C

O

O Et

+

Figure 5. 2-Aminobenzoic ethyl ester(ABEE) 유도체 물질

- 17 -

4 .1 .3 단 당류 조 성 확 인

단당류 조성을 확인하기 해 Alltima C18정지상이 충 된 마이크로 컬

럼(0.5mm I.D X 300mm)을 사용하 다. 용매의 조성은 88/12 v/v(%) 100mM

Sodium citrate pH 5.5/THF 조건 하에서 유도체화된 단당류들을 분리 확인

하 다. 각 단당류의 확인은, 1개의 표 단당류로 이루어진 표 시료들을 유

도체화하여 비하고 이것들을 하나씩 spiking 하여 자라나는 우리의 치

를 확인함으로써 수행하 다. KLB 58 유산균 다당류 시료 내 단당류들의 정

확한 정량분석을 해 시료 내 존재하는 단당류농도와 비슷한 농도로 비된

표 단당류 시료를 유도체화 시켜 one point calibration 방법으로 정량 분석

하 다. 가수분해된 KLB 58 시료와 표 단당류 시료는 동시에 유도체화 반

응을 진행 하 고 여러 배치를 반복 측정하여 단당류 조성을 결정 하 다

(Hughes. 1991, Fotini. 2003).

4 .2 G C/ M S system

특성 피크를 확인하기 한 유도체화 방법으로 alditol-acetate 유도체화

과정이 사용되었다.

4 .2.1 Alditol- acetate 유 도 체 화 과 정

5.0mg씩 측정된 rhmanose, fucose, ribose, xylose, fructose, mannose,

glucose, 그리고 galactose를 500μL의 물에 녹여 시료를 비고, 5mg의

NaBH4를 200μL의 물에 녹여 1 용액에 첨가한 후 상온에서 1시간 동안 반응

- 18 -

시킨다. 과량의 borohydride를 제거시키기 해 acetic acid를 첨가 하고, 생성

된 boric acid를 제거 하기 하여 200μL의 acetic acid/MeOH(1:9 v/v%), 그

리고 250μL의 methanol 용액으로 세척한 후 건조 시킨다. 그다음에 295μL의

1-methyl imidazole과 150μL의 acetic anhydride를 첨가하고 상온에서 10분동

안 반응시킨다. 500μL의 toluene을 첨가 후 건조, 1.0mL의 methylene chloride,

그리고 1.0mL의 H2O용액으로 추출 후 유기 층은 건조 시킨다. 마지막으로 최

종 200μL의 acetone에 녹여 GC/MS 장치에 주입한다(Hughes. 1991, Fotini.

2003).

4 .3 F T - I R 측 정

KLB58 야생형과 돌연변이주의 외선 흡수 스펙트럼을 조사하기 하

여 외선 분 장치 (FT-IR 300E, JASCO)를 사용하 다. 시료 비는 MRS

배지와 배양배지를 KBr cell 표면에 떨어뜨린 후 건조시킴으로써 행해졌다.

FT-IR 측정은 4000-500㎝-1

의

장범 에 걸쳐, 2㎜/sec의 스캔 속도와 4㎝-1

의 해상도로 수행되었다(Oust et al. 2004).

- 19 -

I V . 결 과

1 . 시 험 균주 조 군 선 별

1 .1 배 양 균주 특 성

기존에 발표된 연구에 의하면 Lactobacillus spp.의 기 정지기

(stationary phase)에 세포는 다량의 2차 사산물과 EPS를 생산한다고 보고

된 바 있으며 L. paracasei KLB58과 EPS 결핍 돌연변이주는 배양후 18시간

에 기 정지기를 보 다. 따라서 CSH test를 수행하기 하여 MRS 배지에

서 18시간 배양한 배양액을 이용하 다.

1 .2 돌 연변 이주의 선 별 방 법

NTG mutagenesis에서 30분간 배양한 L. paracasei KLB58 세포 탁액

으로부터 NTG처리하지 않은 조군과 비교하여 실험군은 1/107

으로 5-10%의

생존율이 확인 되었다. Plate 당 100여개의 NTG에 의한 무작 유 자 돌

연변이체로 상되는 colony들을 획득 하 으며 colony의 형태를 기 로 EPS

결핍 돌연변이를 선별하 다. KLB58의 colony는 둥근 반원형의 맑은 유백색

의 형태를 띄는 반면 EPS 결핍 돌연변이는 거칠고 납작하며 불투명한 colony

의 형태를 보 다(Fig. 6).

일차 으로 선별된 돌연변이주는 오염여부를 확인하기 해 과산화수소

test를 통한 catalase 음성반응과 미경 찰을 통하여 이차확인 되었다. 16S

- 20 -

rDNA RFLP 실험을 통해 서로 동일한 균주인지 유 자 벨에서 재차 확인

을 하게 되었다(data not shown).

Figure 6. KLB58 (오른쪽)과 돌연변이주 (left)의 colony 형태 비교

- 21 -

2. 세포 표 면 물 성 의 변 화

2.1 H ydrophobicity 측 정

정성 인 분석 결과 야생형의 경우 소수성층인 hexadecane 층으로 거의

섞여 들어가지 못한 결과를 얻은 반면, 돌연변이주는 hexadecane 층으로 많은

양의 세포가 섞여 들어가 맑고 투명한 수용액상을 확인할 수 있었다(Fig. 7).

이 에서 야생형에 비해 가장 두드러진 차이를 보이는 E2가 실험균주로 사용

되었다. 야생형과 돌연변이주의 소수성 측정 결과가 하게 다른 것으로 나

타남에 따라 돌연변이주의 표면물성이 야생형에 비해 높은 소수성을 나타냄을

알 수 있었다. Hydrophobicity의 차이가 하게 나타남에 따라 다음 실험으

로 정량 인 분석이 수행되었다.

Figure 7. KLB58과 돌연변이주들의 Hydrophobicity test

- 22 -

2.2 Remov al k inetics 측 정

소수성에 한 정량 인 분석을 하여 소수성 층으로 섞여 들어가는

kinetics를 측정하 다. 돌연변이주는 야생형에 비해 높은 adhesion rate를 보

다. 단 으로 돌연변이의 경우 동일한 양의 hexadecane 1,000 μl에 30 간

처리하 을 때 41%가 흡수된 반면, 야생형의 경우 32%가 흡수되었고, 100 μl

에서 30 처리하 을 때에도 돌연변이형은 49%가 흡수된 반면, 야생형은

24%가 흡수된 것으로 나타났다. 얻어진 결과를 각각의 농도의 변화와 처리시

간의 변화에 따라 도시하 다(Fig. 8). 변화의 정도를 간단히 보이기 하여

각각의 시간에 따른 감소정도를 소수성 층과 친수성 층의 부피비에 하여 다

시 도시하 다(Fig. 9).

Fig. 9 그래 의 기울기를 취하여 각각의 돌연변이주와 야생주의 소수성

층으로의 removal coefficient를 구하 다. 돌연변이주의 경우 -1.2×10-4

이고,

야생형의 경우 -0.8×10-4

이므로 돌연변이주가 야생형에 비해 더 높은 소수성

을 갖는 것으로 나타났다.

- 23 -

Time(sec)

0 5 10 15 20 25 30 35

Log(

A t X

100

/ A 0

)

1.7

1.8

1.9

2.0

100 µl500 µl1,000 µlPlot 1 Regr

Time(sec)

0 5 10 15 20 25 30 35

Log(

A t X

100

/ A 0

)

1.65

1.70

1.75

1.80

1.85

1.90

1.95

2.00

2.05

100 µl500 µl1,000 µlPlot 1 Regr

Figure 8. 시료가 소수성층으로 섞여들어가는 kinetics 측정 결과

(A : KLB58, B : 돌연변이주)

A

B

- 24 -

(VH/VW) X 100

0 10 20 30 40 50 60

Slop

e of

Fig

. 4 a

nd F

ig. 5

gra

ph

-0.010

-0.008

-0.006

-0.004

-0.002

0.000

Slope of wild typeSlope of mutantPlot 1 Regr

Figure 9. KLB58과 돌연변이주의 removal rate 결과

(hexadecane과 수용액의 volume ratio(VH/VW)에 함수로 계산되었으

며, 각각의 removal rate는 그림 4의 기울기로부터 얻어졌다. 이 그

래 의 기울기는 removal coefficient를 의미한다.)

- 25 -

3 . 생성 물 질 에 한 연구

3 .1 E P S 의 정 량 화

3 .1 .1 E P S 분 리 의 문 제

시험균주를 배양하기 한 배지로 MRS가 사용되 왔었는데 CSH test와

같은 실험에서는 실험결과가 배지 성분에 의해 향을 받지 않으므로 상 이

없었으나 실험실 수 에서 세포외 다당류를 분리하기 한 실험인 phenol

sulfuric acid method를 수행하기에는 부 한 것으로 단되었다. 그 이유

는 배양배지에서 균주를 제거한 후 다당류를 침 시키는 과정에서 배지성분의

단당류가 공침 되는 상이 발생하 고 다당류뿐만이 아니라 염 는 불순

물이 침 물에 섞여 있어서 EPS 정량화 실험시 재 성이 나타나지 않았기 때

문이다. Fig. 10 을 보면 MRS 배지에서 KLB58이 생산하는 EPS를 phenol

sulfuric acid method를 사용해서 정량화한 결과인데 시간이 지날수록 균체수

는 증가하므로 EPS의 양 한 증가해야하나 오히려 실험결과는 감소하는 것

으로 나타났다.

EPS를 포함한 침 물에서 염, 불순물 단당류를 제거하기 해 80%

EtOH로 washing하는 과정에서도 MRS는 재 성을 나타내지 않았고, 불순물

과 단당뿐만이 아니라 다당류라고 여겨지는 침 물의 부분이 함께 washing

되는 상이 발생하 다.

- 26 -

Hour

0 2 4 6 8 10

O.D

490

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

Figure 10. MRS에서 KLB58의 배양시간에 따른 EPS 정량화 실험결과

3 .1 .2 E P S 분 리 를 한 배 지 성 분 의 변 화

MRS가 아닌 SDM (table 1)에서의 실험 결과도 역시 phenol sulfuric

acid test에는 부 합 하다고 명되었다. Fig. 11 을 보면 SDM에서 배양한

phenotype상 분명이 다른 형태를 갖는 돌연변이주 들과 야생형이 모두 동일

한 정도의 세포외 다당류를 생산하는 것으로 나타났다. 동일한 균주로 3번 반

복한 실험결과가 모두 재 성이 없고 야생형과 돌연변이 모두가 비슷한 정도

로 세포외 다당류가 측정되는 것으로 보아 MRS와 SDM 둘다 포함하고 있는

특정한 성분 때문이 원인이 된다고 단하 다. SDM을 기 으로 각 성분을

조사한 결과 beef extract나 yeast extract와 같은 complex media가 실험결과

에 향을 미치는 것으로 나타났다. 따라서 complex media를 포함하지 않으

면서 균체의 성장에는 향을 미치지 않는 변형된 SDM 배지를 제작하 고,

제작된 SDM‘의 성분은 table 1 과 같다.

- 27 -

Figure 11. SDM에서 시험 균주의 EPS량 비교 결과

3 .1 .3 E P S 분 리 방 법 개 선 을 통 한 최 화

배지 성분을 complex media가 포함되지 않도록 수정하 지만 여 히 기

존의 phenol sulfuric acid test에 의한 다당류 분리 방법에는 재 성이 잘 되

지 않고 실험 시간이 무 길다는 단 이 있어서 실험방법을 다음과 같이 수

정하 다. 이번 실험에서 수정된 다당류 분리 방법이 기존의 방법과 다른 은

첫 번째 원심분리 후 침 시간과 온도를 4℃, overnight 침 에서 -70℃, 30분

침 으로 수정한 이다. 침 시간을 낮은 온도에서 짧게 임으로서 공 침

될 수 있는 배지내 단당류의 량을 최소화 할 수 있고 체 인 실험 시간을

일 수 있어서 실험실 수 의 EPS 정량화 방법을 효율성을 개선하 다.

두 번째로 침 시킨 시료를 10,000g에서 30분간 원심분리 하던것을 4,000g에

서 10분간 원심분리 하는 것으로 수정하 다. 역시 공침 될 수 있는 단당류

- 28 -

의 량을 최소화하기 하여 실험시간과 원심분리 속도를 으며, 실험 시간

단축을 이루어내었다. 마지막으로 80% EtOH로 washing을 2번 반복하는 과정

이 포함되었는데, 이 과정에서 침 된 단당류 salt가 효율 으로 제거되는

것이 확인되었고 washing 시간 washing 후 침 시간의 최 화 실험을 수

행해서 다량의 EPS를 얻을 수 있으면서 체 인 실험시간을 단축시킬 수 있

는 최 값을 찾아내었다. Fig. 12 를 보면 30‘과 180’은 -70℃에서 침 시간

(분)을 의미하고, -5와 -10은 80%EtOH로 washing한 후 침 시간(분)을 의미

하며 0h와 24h는 균주 배양시간을 의미하고 S는 control로 사용된 glucose를

뜻한다. 침 시간과는 무 하게 EPS의 량이 거의 동일하게 측정되었으므로

실제 실험에서 사용된 침 시간은 각 침 시간의 최소시간으로 결정하 다.

실험결과가 모든 경우에서 시간이 증가함에 따라 EPS의 량도 증가하는 것으

로 나타났다.

기존의 phenol sulfuric acid method에 비해 이번 실험에서 수행된

modified phenol sulfuric acid method이 가지는 의미는 실험 시간을 단축시키

면서 다당류의 가장 효율 인 분리법을 제시함에 있다고 할 수 있고, 실험의

3 원칙인 신속, 정확, 간단을 만족시키는 높은 효율성을 이루어냈다고 할 수

있다.

- 29 -

Figure 12. SDM'에서 KLB58의 배양시간 침 시간 조 후 EPS 정량화

결과

3 .1 .4 E P S 정 량 화 결 과

와같이 배지성분의 변화와 실험방법의 개선을 통한 KLB58과 돌연변

이주의 생산된 EPS의 측정결과는 Fig. 13 과 같다. 이 결과에서 KLB 58 wild

type strain은 약 47mg/L, mutant starin은 12mg/L로 wild type이 약 4배정도

EPS 생산량이 높게 측정되었다.

Cell 당 EPS 생산량은 48시간 EPS 생산량을 같은 시간 의 균의

growth O.D 600nm로 나 값을 통해 확인하 다. 48시간 각 균의 O.D값은

wild type은 3.030이 으며 mutant인 경우 2.810이 다. 이 게 측정된 cell당

- 30 -

EPS양은 wild type인 경우 약 15mg/L, mutant 경우는 4mg/L정도로 역시 4

배정도 높다는 것을 확인할 수 있었다.

mg/

L

0

10

20

30

40

50

KLB 58 wild type strainKLB 58 mutant

mg/

L/O

.D

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

KLB 58 wild type strainKLB 58 mutant

Figure 13. SDM'에서 KLB58과 E2의 EPS 생산량 비교

(왼쪽은 standard curve로 환산한 생산량을, 오른쪽 그래 는 환산된 생산량을

O.D.로 나 어 O.D. 당 specific EPS량을 나타낸다.)

3 .2 B iofilm 형 성 량 측 정

0.1% ruthenium red를 45분간 실온에서 염색하여 blank로 사용된

normal MRS 배지의 optical density에서 야생형과 돌연변이주의 O.D. 값과의

- 31 -

차이를 그래 로 나타내었다(Fig. 14). 총 5회 독립된 실험하 고(W1, M1 ~

W5, M5) 각 실험마다 6개의 값에서 큰값과 작은값을 빼고난 나머지를 평균

하 다. 5번의 실험 모두 정도의 차이는 있으나 일반 으로 야생형이 돌연변

이주보다 biofilm을 25% 정도 더 생산하는 것으로 나타났다. Fig. 13 과 비교

할 때 돌연변이주보다 많은 EPS를 생산하는 야생형이 biofilm 역시 돌연변이

주보다 더 많이 형성하므로 EPS의 생산량과 biofilm 형성과는 비례 계가 성

립하는 것으로 상할 수 있다. KLB58이 ruthenium red로 염색된 형태는

Fig. 15 와 같다.

W1 M1 W2 M2 W3 M3 W4 M4 W5 M5

O.D

. 450

nm

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

0.030

Ruthenium red 0.1%

Figure 14. 야생형과 돌연변이주의 biofilm 형성량 비교

- 32 -

Figure 15. KLB58의 biofilm이 Ruthenium red에 의해 염색된 미경 사진

( 학 100배율이며, Crystal violet(purple)는 주로 bacterial cell을 염

색하고 ruthenium red(pink)는 EPS matrix로 구성된 biofilm을 염색

한다.)

- 33 -

4 . E P S 구성 단 당류의 화 학 분 석

4 .1 단 당류 조 성 확 인

Alltima C18 정지상이 충 된 마이크로 컬럼(0.5mm I.D X 300mm)을 사

용하여 용매의 조성은 88/12 v/v(%) 100mM Sodium citrate pH 5.5/ THF 조

건 하에서 유도체화된 단당류들을 분리 확인 하 다. 확인된 단당류들은 그림

10 과 같이 fructose, glucose, galactose, mannose, ribose, fucose, 그리고

rhamnose로 총 7 종류의 단당류가 확인 되었다. 각 단당류의 확인은, 1개의

표 단당류로 이루어진 표 시료들을 유도체화하여 비하고 이것들을 하나

씩 spiking 하여 자라나는 우리의 치를 확인함으로써 수행하 다.

KLB 58 유산균 다당류 시료 내 존재하는 다당류의 조성은 측정된 크로

마토그램으로부터 각 단당류들의 면 과 높이 측정으로 결정하여 table 3 에

요약하 다.

2-Aminobenzoic ethyl ester를 이용한 유도체화 반응은 aldose뿐만 아니

라 ketose 특히 fructose의 검출에 유용하게 활용될 수 있음을 발견하 다.

ABEE‐당 유도체 화합물들은 307nm에서 최 흡수 장을 나타내며, 매우 낮

은 농도의 단당류들의 농도를 결정하는데 있어서 각각의 성분들에 해 재

성있는 자료를 얻게 하 다. 단당류들의 분리를 해 사용된 Alltima C18 컬

럼은 glucose와 galactose의 분리가 다소 겹치는 상을 제외하고는 만족할

만하 다. 겹침 상은 glucose의 농도가 galactose에 비하여 비정상 으로

크지 않으면 거의 사라진다.

유도체화 과정을 거친 KLB58 시료의 단당류 성분은 fructose, glucose,

- 34 -

galactose, mannose, ribose, fucose, 그리고 rhamnose로 구성되어 있음을 확

인할 수 있다(Fig. 16, 17). 하지만 fructose와 glucose의 성분은 다른 단당류들

에 비해 상 으로 굉장히 많은 양이 존재하는 것으로 확인되었다. 상당히

많은 양의 glucose와 fructose가 존재하는 이유는 KLB58의 성장을 해 상당

한 양의 glucose가 배지에 포함되었고, 80% EtOH로 세척하는 과정을 거쳤으

나 완 이 단당류가 제거되지 않아서 다당류 침강조작에서 공침하 기 때문이

다. 한 KLB58의 분해 효소에 의해 생성된 올리고당이 분해되어 glucose와

fructose가 일부 생성되었기 때문이다.

- 35 -

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5(A )

87654

3

21

mv

m in

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0

0

2

4 (B )

87

6

54

3

21

mv

m in

Figure 16. (A) 가수분해된 KLB58의 ABEE 유도체화 처리한 크로마토그램

(B) (A)의 크로마토그램을 확 시킨 그래

(1,2; fructose 3; glucose 4; galactose 5; mannose 6; ribose 7;

fucose 8; rhamnose.)

- 36 -

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5 (A )

87654

3

21

mv

m in

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0

0

2

4

6

8

1 0 (B )

87

65

4

3

21

min

m in

Figure 17. (A) Monosaccharides STD를 ABEE 유도체화 처리한 크로마토그램

(B) 가수분해한 KLB58에 ABEE 유도체한 후 ABEE STD를 spiking

했을때 나타나는 chromatogram (standards 각각에 해당하는 peak

가 자라 남 을 확 인하 다. 1,2; fructose 3; glucose 4; galactose 5;

mannose 6; ribose 7; fucose 8; rhamnose)

- 37 -

Table 3. 크로마토그램에 의한 KLB58의 EPS 단당류 조성 측정

※ 면 측 정 에 의한 단 당류들 의 농 도 ( mg / mL )

　 F ructose G lucose G alactose M annose Ribose F ucose Rhamnose

측 정 1 3 8 .09 2 3 6.9 61 0.9 8 8 1 .28 9 0.7 1 9 0.21 8 0.4 1 9 4

측 정 2 3 7 .4 5 8 3 4 .4 60 1 .025 1 .3 8 5 0.7 8 6 0.21 1 0.4 01

측 정 3 3 8 .4 65 3 5 .7 08 0.9 8 2 1 .3 9 2 0.7 64 0.208 0.3 67

농 도 평 균 3 8 .005 3 5 .7 09 0.9 9 8 1 .3 5 5 0.7 5 6 0.21 2 0.3 9 6

표 편차 0.5 09 1 .25 1 0.023 0.05 8 0.03 3 6 0.005 4 5 0.0260

상 표 편차% 1 .3 3 9 3 .5 02 2.3 4 8 4 .24 9 4 .4 4 3 2.5 66 6.5 8 2

몰 농 도 ( mmol/ mL ) 0.21 1 0.1 9 8 0.005 5 3 0.007 5 2 0.005 04 0.001 29 0.0021 7

몰 비 1 63 .1 23 1 5 3 .27 2 4 .28 3 5 .8 1 8 3 .8 9 8 1 1 .67 9

※ 높 이 측 정 에 의한 단 당류들 의 농 도 ( mg / mL )

　 F ructose G lucose G alactose M annose Ribose F ucose Rhamnose

측 정 1 3 6.3 3 4 .8 1 .06 1 .4 7 0.7 04 0.23 0 0.3 66

측 정 2 3 8 .1 3 7 .9 1 .1 6 1 .5 1 0.7 8 4 0.25 3 0.3 8 9

측 정 3 3 6.1 3 6.9 1 .03 1 .4 2 0.7 1 5 0.24 0 0.3 8 4

평 균 3 6.8 3 6.6 1 .08 1 .4 7 0.7 3 4 0.24 1 0.3 7 9

상 오 차 1 .1 1 1 .62 0.067 0.04 62 0.04 3 6 0.01 1 3 0.01 2

표 상 오 차% 3 .01 4 .4 4 6.1 9 3 .1 5 5 .9 4 4 .7 03 3 .1 7

몰 농 도 ( mmol/ mL ) 0.204 0.203 0.006 0.008 1 4 0.004 8 9 0.001 4 7 0.00208

몰 비 1 3 9 .0 1 3 8 .0 4 .09 5 .5 4 3 .3 3 1 1 .4 2

- 38 -

4 .2 G C/ M S system

유도체화된 단당류들은 두 개의 이성체 피크를 갖는 fructose를 제외하

고는 하나의 피크로 나타났으나, 두 개의 fructose 피크는 mannose, glucose와

겹치는 상이 발생하 다(Fig. 18). (Column : SGE(BPX-70) 30m X 0.25mm

I.D)

Carbohydrate Retention T ime

Rhamnose 12.467

Fucose 13.100

Ribose 16.083

Mannose 25.133

Galactose 26.317

Glucose 27.967

Fructose 24.900, 27.800

Figure 18. KLB58의 alditol-acetate 유도체화 처리한 GC/MS 크로마토그램

결과 (1; rhamnose, 2; fucose, 3; ribose, 4; mannose, 5; galactose,

6; glucose 7, 8; fructose)

- 39 -

4 .3 F T - I R 측 정

KLB58과 돌연변이주의 FT-IR 스펙트럼은 Fig. 19 에 나타내었다.

Oust(2004) 등은 1400 - 720 ㎝-1

역이 Lactobacillus 종의 식별에 가장

합하다고 하 다. 이 보고서(Oust. 2004, Filip. 2001)의 FT-IR의 피크 분석

(table 4)을 토 로 우리의 측정결과를 분석하 다.

피크모양이 유사하다는 것은 이들을 구성하는 물질이 모두 동일하다는 것

을 의미한다. IR 피크 모양(피크의 치)은 어떠한 작용기를 지니고 있느냐를

별하는 것인데 Fig. 19 와 같이 유사한 피크모양이 나오는 것은 시료가

분자 물질이 아니고 생명체이기 때문에 생명체를 이루는 구성물질이 유사하므

로 당연한 결과이다. 따라서 FT-IR 실험을 통해 두 균주간의 차이를 피크 모

양의 차이에 의한 구성물질의 차이보다는 각 역에서의 흡수량의 차이를 통

해 비교하 다. 흡수량이 많다는 것은 빛을 흡수하는 용질이 많다는 것으로

해석할 수 있으므로, 두 균주간 생산량에 있어서 두드러진 차이를 보이는

EPS와 련된 부분인 세포벽내의 다당류를 나타내는 1200 - 900 ㎝-1

역에

서 돌연변이주가 KLB58보다 더 많은 다당류를 포함하고 있는 것으로 나타났

다. 다른 역에서도 흡수량의 차이를 보이지만 피크의 형태가 유사하므로 다

른 역에서의 양 인 차이가 EPS와는 무 하므로 본 연구에서는 논의하지

않았다.

KLB58과 돌연변이주의 세포벽내의 다당류의 양이 FT-IR의 결과에서

KLB58보다 돌연변이주가 더 많은 것으로 나타났는데, 이 결과를 통해 돌연변

이주의 생성된 EPS를 세포벽 밖으로 분비하는 메커니즘이 NTG에 의해 손

되었을 것이라는 상을 할 수 있다. 따라서 세포벽 내부에는 KLB58보다 돌

연변이주가 더 많이 EPS를 포함하고 있으나 정작 분비된 EPS의 량은 돌연변

이주가 더 은 것으로 나타난다.

- 40 -

4000.00 500.00Wavenumber[cm-1]0.33

1.00

Abs

Figure 19. KLB58과 돌연변이주의 FT-IR 스펙트럼

(흡수량이 높은쪽이 돌연변이주이며, 낮은쪽이 KLB58이다.)

- 41 -

Table 4. FT-IR의 피크 분석 (Oust. 2004)

범 FT-IR 피크 분석

①

3000 – 2800 cm-1

박테리아 세포막의 지방산

--> 3300 ; H-bonded OH groups, NH2 stretching

(adenine, quanine, cytosine)

②

1800 – 1500 cm-1

단백질과 펩티드의 아미드 결합

--> 1660 - 1535 ; NH2 bending, C=O, C=N stretching

(amide I and II)

③

1500 – 1200 cm-1

단백질과 지방산 혼합

--> 1467 – 1455 ; C-H deformations of CH2 or CH3 groups

in aliphatics

1396 - 1389 ; C-H bending, -CH3 stretch (fatty acids)

1240 – 1235 ; C-N stretching (amide III)

④

1200 – 900 cm-1

세포벽안의 다당류

--> 1150 - 1000 ; C-O, PO2- stretching (glycopeptides, ribose)

⑤

900 – 500 cm-1

“true” fingerprint 역

--> 965 – 760 ; P-O-C, P-O-P stretching

(phospholipids, ribosephosphate chain pyrophosphate)

650 – 485 ; C-O-C, P-O-C bonding (RNA, aromatics)

- 42 -

V . 결 론 고 찰

NTG mutagenesis는 세포내/외부에 걸쳐 무작 변형을 야기시키므로

phenotype만을 놓고 특성을 정의함은 무리가 따른다(Goldmacher et al. 1986).

다만 돌연변이주의 분자 벨에서의 동정을 통한 분석과 세포수 의 찰과 같

은 수행된 여러 가지 돌연변이주 선별방법을 통해서 야생형과 표면물성 변화

가 두드러진 차이 을 보이는 E2를 실험 상으로 선정하 다(Fig. 7).

세포표면의 물성이 변화함은 세포표면에 부착된 여러 물질이 변화함을 의미한

다. Fig. 6 에서 나타난 바와 같이 표면물성의 변화가 결국 세포군락의 형태변

형을 야기하므로 세포표면에 부착된 물질 특히 EPS의 량과 세포표면의 물

성변화와는 한 계가 있을 것으로 사료된다.

NTG mutagenesis에 의해 야기된 돌연변이는 EPS 정량화 실험을 통해

확인되듯 EPS 생성량의 차이를 나타내어 세포표면의 소수성 증가를 유발하

다. 바꾸어 말하면, hydrophilic한 세포 외부를 향해있는 polysaccharide 부분

이 돌연변이에 의해 결실되어 상 으로 야생형보다 돌연변이주가 좀더

hydrophobic하게 되었다고도 설명할 수 있다(Rosenberg. 1986).

Removal kinetics 측정 시 세포액 비 hexadecane의 량이 높아짐에 있

어서 돌연변이주의 흡수율이 야생형에 비해 높게 나타났으나(Fig. 9), 흡수율

이 크게 변하지 않거나 혹은 작은 hexadecane의 량 일 때 흡수율이 높은

hexadecane의 량보다 더 큰 것으로 나타났다(Fig. 8 (B)). 실험 결과만을 놓고

단하면 명확히 NTG에 의해 표면물성이 높은 소수성을 갖도록 돌연변이가

발생하 지만 와 같은 상이 발생하는 원인은 세포액이 소수성층으로 섞여

들어갈 때 한계값 이상으로는 이동되지 않았기 때문이다. 야생형과 돌연변이

주의 removal coefficient 차이 한 크지 않음을 볼 때, 본 실험이 갖는 의의

- 43 -

는 돌연변이를 통해 세포 고유의 물성을 변화시킬 수 있으며 그 결과로 나타

나는 세포외 다당류의 생산량 차이가 biofilm의 형성에 향을 수 있다는

실험 증거를 제시하는데 있다.

실험균주가 생산하는 EPS를 정량화하기 한 방법으로 phenol-sulfuric

acid method가 사용되었다. 그러나 아이러니하게도 기존의 참고논문들 (Maite

et al. 2003, Cerning et al. 1994)에 나와있는 실험방법을 그 로 KLB58에

용하면 재 성이 나타나지 않았다. 오히려 CSH test나 미경 찰, phenotype

콜로니 찰 등에 의해 정황상 더 많은 EPS를 생산할 것으로 상되는

KLB58이 돌연변이주보다 더 은 EPS를 생산하는 결과가 나타났다. 정확한

결과를 유도하기 해 새로운 실험방법 재료가 도입되었다. 변화된 배지와

실험방법을 통해 더 정확하고 더 빠르게 EPS를 분리할 수 있었다.

biofilm 실험에서 야생형이 돌연변이주보다 biofilm을 더 많이 형성하는

것으로 나타났다. EPS 정량화 실험과 biofilm test를 상호 비교해 봤을 때 동

일한 패턴으로 실험 결과가 나타나는 것으로 보아 기존에 알려진 여러 균주와

마찬가지로 Lactobacillus spp.에서도 EPS가 biofilm을 형성하는데 매우 요

한 인자라는 사실을 알 수 있다(Paul. 2000). 여성의 질 내에서 Lactobacillus

spp.가 병원체와 경쟁하여 상피세포에 존재하는 receptor를 인지한 후에 상피

세포에 부착하게 되고, 그 이후에 biofilm을 형성하기 때문에(Soledad. 1998)

거꾸로 biofilm의 형성된 량이 다면 Lactobacillus spp.가 상피세포에 하여

갖는 “부착능력” 한 낮다고 말할 수 있고 표면물성 한 변화하 다고 단

할 수 있다. EPS의 생산량이 높은 균주일수록 질 내 상피세포에 더 많은

biofilm을 형성하여 더 높은 부착력을 갖는 것으로 상된다.

화학분석을 통해 KLB58이 생산하는 EPS의 단당류 분석을 수행하 다.

애 의 목 은 EPS의 분자량 분포를 확인하는 것이었으나 물에 녹인 KLB58

시료의 MALDI 측정결과 분자량 2,000 내외의 크기를 갖는 올리고당이 주성

- 44 -

분인 것으로 나타나 분자량 분포를 구하는 의미가 소멸되었다(data not

shown). 물론 물에 녹지 않은 다당류의 주요 성분은 분자량이 더 클 것으로

상되지만, KLB58이 생산하는 EPS 분해효소(Pham. 2000)에 의해

fragmentation이 일어나는 것 한 배제할 수 없다. 본 연구에서 올리고머 형

태의 EPS를 분석한 결과 7개의 단당류로 구성되었음을 확인하 고, 단당류

분석방법을 확립하 으므로 원하는 단당류 조성을 갖는 EPS를 얻기 한 다

양한 실험이 가능해 졌다. 따라서 앞으로의 연구는 배지성분의 변화에 의해

구성단당류의 성분 한 변화하는지 확인하는 실험이 진행되어야 할 것이다.

이 연구에서 EPS 생산에는 priming GT (glycosyltransferase) gene이

여한다고 알려져 있다(Cathy. 2003). Priming GT gene의 체 sequence가

분리되고 EPS 생합성의 메카니즘이 유 자 벨에서 분석되면, 여성의 질 내

부에 존재하는 유산균은 그 역할이 매우 크다는 것을 감안할 때(Chang. 2002,

McGoarty. 1993, Song. 1999) EPS의 과발 을 통해 여성의 질 내 상피세포에

더 높은 부착력을 갖고 항균력이 우수한 고(高) 기능성 우량균주를 개발할 수

있을 것이다.

본 연구에서는 Lactobacillus spp.의 표면물성 변화에 따른 EPS의 생산

과 biofilm의 형성과의 계를 밝혔으며, Lactobacillus spp.에서 biofilm을 형

성하는 요한 인자 하나는 EPS라는 것을 실험 으로 분석하 다. , 실

험배지 방법의 변화를 통해 Lactobacillus spp.에서 EPS 정량화와 분리된

EPS의 단당류 분석방법을 확립하 다. 이번 연구를 바탕으로 앞으로는 동물

세포(상피세포)에 실제로 배양된 균주에서 EPS와 biofilm의 상 계가 용

되는지에 하여 연구되어야 할 것이며, 다량의 EPS를 생산하는 최 조건을

균주 배양과 련된 외부 환경인자와 균주 내 priming GT gene과 같은 내부

유 인자의 개량을 통해 찾아내는 것이 선행되어야 할 것이다.

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