내분비계장애물질에 대한 생물학적 분석법 적용연구(Ⅲ) -...

발 간 등록 번 호 NIER NO. 2010-53-1228

11-1480523-000343-01

내분비계장애물질에 대한

생물학적 분석법 적용연구(Ⅲ)

환경건강연구부 위해성평가연구과

김수진, 정기은, 이병천, 강성욱, 엄익춘, 류지성, 이재안, 남규찬, Duong N.C.

Application of Bioassay for

Endocrine Disrupting Chemicals (Ⅲ)

Suejin Kim, Kieun Joung, Byoungcheun Lee, Sungwook Kang,

Igchun Eom, Jisung Ryu, Jaean Lee, Kyuchan Nam, Duong N.C.

Risk Assessment Division

Environmental Health Research Department

National Institute of Environmental Research

2010

목 차❚

i

목 차

목 차 ······················································································································· i표 목 차 ······················································································································ ii그림목차 ····················································································································· iiiAbstract ····················································································································· ⅳ

Ⅰ. 서 론 ····················································································································· 1

Ⅱ. 연구내용 및 방법 ······························································································ 3

1. 환경시료 채취 및 전처리 ··············································································· 3

2. 생물학적 분석법을 이용한 내분비계장애 추정물질 분석 ······················· 5

3. 기기분석법을 이용한 내분비계장애 추정물질 분석 ································· 8

4. 생물학적 분석 결과와 기기분석 결과의 상관성 분석 ··························· 11

Ⅲ. 연구결과 및 고찰 ···························································································· 13

1. 생물학적 분석기법별 민감도 확인 ····························································· 13

2. 환경 중 내분비계장애 추정물질의 생물학적 분석 결과 ······················· 14

3. 환경 중 내분비계장애 추정물질의 기기분석 결과 ···································22

4. 생물학적 분석법과 기기분석법의 상관성 ················································· 26

Ⅳ. 결 론 ················································································································· 30

참고문헌 ···················································································································· 31

목 차❚

ii

표 목 차

<표 1> Sampling Lists and Information ···························································· 3

<표 2> Conditions for Chemical Analysis of Estrogenic EDs ······················ 9

<표 3> Conditions for Chemical Analysis of Dioxin-like EDs ·················· 10

<표 4> Estrogenic Activity of Environmental Samples ································ 15

<표 5> Dioxin-like Activity of Environmental Samples ······························· 20

<표 6> Concentration of Estrogens in Environmental Samples ················· 22

<표 7> Concentration of Phenols in Environmental Samples ···················· 23

<표 8> Concentration of Phthalates in Environmental Samples ················ 24

<표 9> Concentration of PCDD/Fs and Co-PCBs in Environmental Samples

···································································································································· 25

<표 10> Measured and Estimated EEQ values of Environmental Samples

···································································································································· 27

<표 11> Measured and Estimated TEQ values of Sediment Samples ····· 29

목 차❚

iii

그 림 목 차

<그림 1> Preparation of Environmental Samples ············································ 4

<그림 2> Principle of ER Yeast two-hybrid Assay ········································· 5

<그림 3> Principle of ER-CALUX Assay ··························································· 6

<그림 4> Principle of EROD Assay ···································································· 7

<그림 5> Principle of DR-CALUX Assay ·························································· 8

<그림 6> Dose-Response of 17β Estradiol ······················································ 13

<그림 7> Dose-Response of 2,3,7,8-TCDD ······················································· 14

<그림 8> Correlation between Estrogenic EDs Detection Methods ··········· 17

<그림 9> Correlation between Dioxin-like EDs Detection Methods ·········· 21

<그림 10> Correlation between Bioassay and Chemical Analysis ············· 29

목 차❚

iv

Abstract

This study was conducted to select integrated toxicity assessment tools

for the endocrine disrupting chemicals (EDs) in the environment. Focusing

on the estrogenic and dioxin-like EDs, we evaluated the applicability of

various bioassay methods using environmental samples and standard

materials.

1. CALUX assay, mammalian reporter gene assay, was more sensitive than

Yeast two-hybrid assay.

- In the ER Yeast two-hybrid assay and ER-CALUX assay, EC50 values for

17β estradiol were determined at the nM and pM level, respectively.

And detection limits were 0.16 nM ∼ 0.1 pM.

- EROD assay and DR-CALUX assay showed 18.6 pM and 9.7 pM of EC50

values for 2,3,7,8-TCDD. And detection limits of each method were 3.3

pM and 4.7 pM, respectively.

2. In case of dioxin-like EDs, bioassay and chemical analysis showed good

correlation (r2

= 0.75 ∼ 0.92). But the absolute TEQ values of bioassay

were higher than those of chemical analysis.

- In the case of estrogenic EDs, correlation between bioassay and chemical

analysis was low. However, the r2 values were over 0.4 when assessing

water samples using Yeast two-hybrid assay, which results are of

significance considering the characteristics of environmental samples.

3. There were good correlation (r2 = 0.61 ∼ 0.84) between bioassay

methods for dioxin-like EDs in water/sediment samples and estrogenic

EDs in sediment samples.

4. Taken together, bioassay can be recommended as an integrated toxicity

assessment tool for the measurement of EDs in the environmental

목 차❚

v

matrices. However, further research to establish pre-treatment methods

considering the characteristics of environmental matrices is needed to

overcome some restrictions of bioassay.

목 차❚

- 1 -

Ⅰ. 서 론

내분비계장애 추정물질(Endocrine Disrupting Chemicals; EDs)은 자연환경에

존재하는 화학물질 중 생물체 내에 흡수되어 호르몬에 의한 내분비계의 정상적인

기능을 방해하는 물질로써 일명 “환경 호르몬”이라고 불리는 물질이다. 현재

내분비계 장애현상을 유발하는 것으로 알려진 물질로는 각종 산업용 화학물질,

살충제 및 제초제 등의 농약류, 다이옥신 등의 유기염소계 물질, 수은 등의

중금속류가 있다. 그러나 이들 물질이 생물체에 미치는 영향에 대해 아직 명확히

밝혀진 바가 없고 단지 그 영향을 추정만 하고 있는 상태이기 때문에 국제적

으로 합의된 내분비계장애 추정물질 목록은 없다. 우리나라의 경우에도 별도의

목록은 없으며 세계야생생물기금(World Wildlife Fund; WWF1))에서 정한 바 있는

67종의 내분비계장애 추정물질을 바탕으로 조사 및 연구가 추진되어 왔다.

내분비계장애 추정물질에 대한 과학적 관리 기반을 마련하기 위해 환경부를

비롯한 관련 부처를 중심으로 1999년부터 환경 중 내분비계장애 추정물질 잔류

실태 및 생물체 영향 등을 조사해오고 있다. 그 동안의 조사 결과에 따르면, 국내

환경 중 내분비계장애 추정물질의 농도는 외국과 비교했을 때 낮거나 유사한

수준인 것으로 나타났다. 또한 소형 소각로 설치를 금지하거나 PCB류에 오염된

변압기나 콘덴서 등에 엄격한 관리 기준을 적용하는 등 각종 제도적 노력을

기울임으로써 환경 중 내분비계장애 추정물질의 농도는 지속적으로 감소하는

추세이다(국립환경과학원 2007). 그러나 환경 중에 서식하는 생물체에서는 여전히

이성생식세포가 발견되는 등 내분비계장애현상이 보고되고 있다.

환경 중에는 다양한 화학물질이 혼재하며 이들 사이의 상호작용에 따라

독성영향이 달리 나타난다. 또한 저농도·만성노출에 따른 독성영향 평가의

중요성이 날로 증가하고 있다. 따라서 환경 중에 존재하는 다양한 화학물질에

의한 내분비계 장애영향을 효과적으로 평가하기 위해서는 낮은 농도까지 검출할

수 있을 정도로 충분히 민감하며 혼합물질에 의한 복합영향까지 통합적으로 평가

1) 현재는 존재하지 않음

목 차❚

- 2 -

할 수 있는 시험법이 필요하다. 기존의 기기분석법은 오염원 파악이 가능하고

분석 결과의 신뢰성 및 재현성이 우수하다는 장점이 있는 반면, 시간·비용 측면

에서 경제성이 낮은 것이 단점으로 알려져 있다. 이러한 맥락에서 시험 조작이

비교적 간단하고 대량의 시료를 동시에 분석할 수 있어 시간 및 비용 측면에서

경제적인 방법으로 평가되는 생물학적 분석법이 주목받고 있다. 그러나 기존의

기기분석법과 더불어 생물학적 분석법을 내분비계장애 추정물질에 대한 통합

평가 수단으로 이용하기 위해서는 사전에 이들 방법의 활용성을 면밀히 검토할

필요가 있다.

본 연구는 환경 중 내분비계장애 추정물질의 효과적인 관리에 필요한 통합평가

수단을 발굴하기 위해 생물학적 분석법의 활용성 검토를 목적으로 수행하였다.

에스트로겐성 및 다이옥신성 내분비계장애 추정물질을 중심으로 다양한 생물학적

분석법의 민감도를 살펴보고 이를 이용하여 환경시료 중 내분비계 장애영향을

통합적으로 평가하였다. 아울러, 기존의 기기분석법과 생물학적 분석법 사이의

상관성을 분석하여 환경 중 내분비계 장애영향에 대한 통합평가 수단으로써

생물학적 분석법의 활용성을 평가하였다.

Ⅱ. 연구내용 및 방법❚

- 3 -

No. of Sample S i t e

Water

W01 난지하수종말처리장 유입수서울 고양시 덕양구 현천동 673-2

W02 난지하수종말처리장 방류수

W03 굴포하수종말처리장 유입수경기도 부천시 오정구 대장동 434

W04 굴포하수종말처리장 방류수

W05 중랑하수종말처리장 유입수서울 성동구 차장터 5길 10

W06 중랑하수종말처리장 방류수

W07 시화공단 폐수종말처리장 유입수 경기도 시흥시 정왕동 시화공단

폐수종말처리장W08 시화공단 폐수종말처리장 방류수

W09 반월공단 폐수종말처리장 유입수 경기도 안산시 반월공단

폐수종말처리장W10 반월공단 폐수종말처리장 방류수

Sediment

S01 안산천 퇴적물 경기도 안산시 사동 시화호 합류지점

S02 신길천 퇴적물 경기도 안산시 성곡동 시흥5교

S03 옥구천 퇴적물 경기도 시흥시 정왕동 시화호 합류지점

S04 정왕천 퇴적물 경기도 시흥시 정왕동 시화호 합류지점

S05 반월천 퇴적물 경기도 안산시 본오동 시화호 합류지점

Ⅱ. 연구내용 및 방법

1. 환경시료 채취 및 전처리

가. 환경시료 채취시료 채취용 용기는 빛에 의한 광분해 및 목적물질의 흡착을 방지하기 위해

암갈색 유리병을 이용하였으며, 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올,

증류수의 순서로 세척하여 사용하였다. 채취한 시료는 냉장 상태로 운반한

뒤, 분석할 때까지 4℃에서 냉장 보관하였다.

<표 1> Sampling Lists and Information


- 4 -

나. 환경시료의 전처리수질 시료는 유리섬유 여과지를 이용해 여과한 후, 고상 추출법(Solid

Phase Extraction; SPE)으로 추출하였다. 디클로로메탄(Dichloromethane;

DCM)으로 고상 카트리지 내 목적 물질을 용출시킨 후, 감압 증발기 및 질소

가스를 이용하여 증발 농축하였다. 퇴적물 시료는 동결건조한 후, 잘게 부수어

건조하였다. 건조한 퇴적물 시료를 2.0 mm의 체로 체별한 후, 무수황산나트

륨을 넣고 잘 섞어 실온에서 방치하였다. 건조된 시료를 디클로로메탄을

이용해 약 6시간 속실렛 추출한 뒤, 감압 증발기 및 질소가스를 이용해 건고

농축하였다. 농축한 수질 및 퇴적물 시료는 기기 분석 및 생물학적 분석을 위

해 메탄올 또는 디메틸설폭사이드(Dimethyl sulfoxide; DMSO)로 재용해하여

기기 분석 및 생물학적 분석에 사용하였다(그림 1).

여과

시료 2.5L GF/C

동결건조건조시료 100g

산성화초산:물:메탄올

10 mL/시료수 1L

Soxhlet ExtractionDCM 16 hr

SPE Extraction메탄올/초순수

세정(2.5 mL/min)

GF/C 추출메탄올 30 mL 초음파 추출

황화물 제거구리알갱이

SPE 용출

농축농축

용매치환 용매치환

(A) 수질 시료 (B) 퇴적물 시료

<그림 1> Preparation of Environmental Samples.


- 5 -

2. 생물학적 분석법을 이용한 내분비계장애 추정물질 분석

가. 에스트로겐성 EDs에 대한 생물학적 분석

(1) ER Yeast two-hybrid assay

ER Yeast two-hybrid 방법은 S. Arulmozhiraja와 F. Shiraishi의 방법을

토대로 사람 및 송사리(medaka)의 에스트로겐 수용체(Estrogen Receptor;

ER)를 도입해 형질변환 시킨 효모를 이용하였다(Arulmozhiraja et al., 2005;

Shirashi et al., 2000). 시험 전날, 효모를 배지에 식균하여 30℃에서 16시간

배양하였다. 이 배양액에 화학물질 또는 전처리한 환경시료를 첨가하여 30℃

에서 4시간 노출시킨 후, 세포 용해액 및 반응 혼합액을 넣고 37℃에서 1시간

동안 반응시켰다. 최종적으로 발광 촉진액을 첨가하고 발광정도를 측정함으로써

에스트로겐 활성도를 평가하였다(그림 2).

<그림 2> Principle of ER Yeast two-hybrid Assay.

(2) ER-CALUX assay

ER-CALUX (Estrogen Receptor-Chemically Activated LUciferase

eXpression) 방법은 ERE-Luciferase 리포터 유전자를 도입해 형질전환시킨


- 6 -

U2OS 세포(human osteosarcoma cell line, 사람 골육아종 세포)를 이용하였으며

이는 네덜란드 BDS사(BioDetection Systems Inc.)에서 개발된 세포주이다. 세포를

96 well plate에 주입하고 37℃에서 24시간 배양하였다. 다음날, 화학물질 또는

전처리한 환경시료를 처리하고 37℃에서 24시간 노출시킨 뒤, 세포 용해액 및

반응 혼합액을 넣고 발광정도를 측정함으로써 에스트로겐 활성도를 평가하였다.

본 연구에서 사용된 ER-CALUX 방법의 원리는 그림 3과 같다.

<그림 3> Principle of ER-CALUX Assay.

나. 다이옥신성 EDs에 대한 생물학적 분석

(1) EROD assay

EROD (7-Ethoxyresorufin-O-dealkylase) 방법은 다이옥신성 물질이 다환상

탄화수소 수용체(Aryl-hydrocarbon Receptor; AhR), 일명 다이옥신 수용체

(Dioxin Receptor; DR)라 불리는 수용체에 결합하여 시토크롬 1A(Cytochrome

P450 1A; CYP1A) 효소 발현을 유도하는 기전을 이용한 방법으로 본 연구에서는

랫드 간암 세포주인 H4IIE 세포주(KCLB No. 21548)를 사용하였다. 다이옥신성


- 7 -

EDs에 의해 발현이 유도된 CYP1A 효소가 비형광성 물질인 7-ethoxyresorufin을

형광성 물질인 resorufin으로 전환시키는 정도를 측정함으로써 다이옥신 활성도를

평가한다. 먼저 48 well plate에 세포를 주입하고 37℃에서 24시간 배양한 뒤

다음날, 세포에 화학물질 또는 환경 시료를 처리하였다. 37℃에서 24시간 노출

시킨 뒤, ethoxyresorufin 및 NADPH를 넣고 반응시킨 다음 형광정도를 측정

하였다. EROD 방법의 원리는 그림 4와 같다.

<그림 4> Principle of EROD Assay.

(2) DR-CALUX assay

DR-CALUX (Dioxin Receptor-Chemically Activated LUciferase eXpression)

방법은 네덜란드 BDS사(BioDetection Systems Inc.)에서 개발하여 특허를 받은

형질전환 세포주를 사용하였다. DRE-Luciferase 리포터 유전자를 도입해 형질

전환 시킨 세포주는 다이옥신류 화학물질에 반응하여 발광효소가 발현되는데,

발현된 발광효소의 활성을 측정함으로써 시료 중 다이옥신량을 간접적으로

정량하는 방법이다. 96 well plate에 세포를 주입한 뒤 37℃에서 24시간 배양

하고 다음날, 화학물질 또는 전처리한 환경 시료를 처리하였다. 37℃에서 24시

간 노출시킨 뒤, 세포 용해액 및 반응 혼합액을 넣고 발광정도를 측정하였다.


- 8 -

본 연구에서 사용된 DR-CALUX 방법의 원리는 그림 5와 같다.

<그림 5> Principle of DR-CALUX Assay.

3. 기기분석법을 이용한 내분비계장애 추정물질 분석

가. 에스트로겐성 EDs 분석에스트로겐성 EDs인 에스트로겐류(4종), 프탈레이트류(9종) 및 페놀류(9종)

를 대상으로 환경시료 중 농도를 분석하였다. 에스트로겐성 물질은

LC/MSMS를, 프탈레이트류 및 페놀류는 GC/MS를 이용하여 분석하였으며

자세한 분석 조건은 표 2와 같다.

나. 다이옥신성 EDs 분석환경시료를 대상으로 GC/HRMS를 이용하여 다이옥신성 EDs인 PCDD/F

류(17종) 및 Co-PCB류(7종) 농도를 분석하였다. 자세한 분석 조건은 표 3과

같다.


- 9 -

Chemicals Analysis Condition

LC Condition

ColumnGemini C18 column

(150 × 2 mm, 5µm)

Guard columnZORBAX Eclipse XDB-C8

(2.1 × 12.5 mm, 5µm)

Estrogen Mobile phase A: Water, B: Methanol

- Estrone Flow rate 0.3 mL/min

- 17β estradiol Injection volume 10 µL

- Estriol

Mobile gradient

Time 0min A: 95% B: 5%

- 17α ethinylestradiol Time 4min A: 0% B: 100%

Time 12min A: 0% B: 100%

Time 15min A: 95% B: 5%

Time 20min A: 95% B: 5%

MS/MS Condition

Source temp. 120oC

Desolvation temp. 420oC

Capillary voltage 3.5 kV

Desolvation Gas Flow 850 L/hr

Cone Gas Flow 30 L/hr

Detection mode Multiple Reaction Monitoring (MRM)

Ionization mode Electrospray negative (ESI-)

GC Condition

Phthalate Column DB-5MS (30 m × 0.25 ㎜ × 0.25 ㎛)

- Di-ethyl Carrier gas He (99.999%)

- Di-propyl Injection temp. 260 ℃

- Di-butyl Injection mode Splitless

- Di-pentylOven temp.

100℃(0min) → (10℃/min) →

- Di-hexyl 230℃(0 min) → (10℃/min) →

- Di-cyclohexyl 270℃(8min)

- Di-ethylhexyl MS Condition

- Benzyl-butyl Emission 34.6 μA

Diethyl-hexyladipate

Ionization mode EI-Selected Ion Monitoring

Electron energy 70eV

Source Chamber temp. 230℃

<표 2> Conditions for Chemical Analysis of Estrogenic EDs


- 10 -

<표 2> Conditions for Chemical Analysis of Estrogenic EDs (continued)


GC Condition

Phenol Column DB-5 (30m × 0.25㎜ × 0.25㎛)

- 4-t-Butyl Carrier gas He (99.999%)

- 4-n-Butyl Injection temp. 280 ℃

- 4-n-Pentyl Injection mode Splitless

- 4-n-HexylOven temp.

100℃(2min) → (10℃/min) → 240℃

- 4-n-Heptyl (2min) → (20℃/min)→ 300℃(5min)

- 4-t-Octyl MS Condition

- 4-n-Octyl Ionizing mode EI/SIM

- Nonyl Interface temp. 300 ℃

Bisphenol A Electron energy 70 eV

<표 3> Conditions for Chemical Analysis of Dioxin-like EDs


GC Condition

Column DB-5MS (10m × 0.18㎜ × 0.18㎛)

Carrier gas He (99.9999%)

Injection temp. 310 ℃

Injection mode Splitless

Oven temp.(PCDD/Fs)

140℃(4min) → (15℃/min) → 220℃

PCDD/Fs → (1.5℃/min)→ 240℃(2min)

Co-PCBsOven temp.(Co-PCBs)

100℃ → (25℃/min) → 180℃(1min)

→ (1.8℃/min) → 220℃ (2min) →

(10℃/min) → 300℃ (6min)

HRMS Condition

Ionizing mode EI/SIM

Chamber temp. 300 ℃

Accel. voltage 10 Kv

Ionizing Current 600 uA


- 11 -

4. 생물학적 분석 결과와 기기분석 결과의 상관성 분석

가. 에스트로겐성 EDs에 대한 분석 결과의 상관성

에스트로겐성 EDs에 대한 생물학적 분석 결과와 기기분석 결과의 상관성은

환경시료의 생물학적 분석값(E2 equivalent concentration; EEQ)과 에스트로겐

활성 예측값(estimated EEQ)을 비교하는 방법으로 평가하였다. 에스트로겐

활성 예측값은 기기분석에서 도출된 개별 물질 농도를 이용하여 아래의 식에

따라 계산하였다.

×여기에서, RP = 상대 활성도(Relative Potency)

C = 개별 물질 농도(Concentration)

에스트로겐성 EDs 물질의 상대 활성도는 국제적으로 공인된 값이 없으므로

본 연구에서 도출된 상대 활성도를 이용하였다. 상대 활성도는 개별 화학물질의

용량-반응 실험에서 도출된 해당물질의 EC50값과 17β estradiol (E2)의 EC50값의

비를 이용하여 아래 식에 따라 계산하였다.

나. 다이옥신성 EDs에 대한 분석 결과의 상관성

환경시료(퇴적물 시료) 중 다이옥신성 EDs에 대한 생물학적 분석 결과와

기기분석 결과의 상관성은 환경시료의 생물학적 분석값(Toxic Equivalents;

TEQ, 독성등가량)을 다이옥신 활성 예측값(estimated TEQ)과 비교하는 방법

으로 평가하였다. 다이옥신 활성 예측값은 에스트로겐 활성 예측값과 마찬

가지로 기기분석에서 도출된 개별 물질 농도에 상대 활성도인 독성등가계수

(Toxic Equivalents Factors; TEF)를 곱한 뒤 이를 모두 더하여 계산하였다.


- 12 -

PCDD/F 및 Co-PCB의 상대 활성도는 세계보건기구(World Health

Organization; WHO)에서 발표하여 국제적으로 공인되어 사용되고 있는

WHO-TEF값을 활용하였다(van den Berg et al., 2006).

×여기에서, TEF = 독성등가계수(Toxic Equivalents Factors)

C = 개별 물질 농도(Concentration)

Ⅲ. 연구결과 및 고찰❚

- 13 -

(M)ER Yeast-two hybrid ER

CALUXhER mER

EC50 3.53E-8 1.14E-8 4.90E-12

Detection Limit 1.60E-10 <1.02E-11 <1.00E-13

Ⅲ. 연구결과 및 고찰

1. 생물학적 분석기법별 민감도 확인

가. 에스트로겐성 EDs 분석을 위한 생물학적 분석법의 민감도에스트로겐성 EDs 분석을 위한 생물학적 분석 기법별 민감도를 확인하기

위해 표준물질인 17β estradiol (E2)을 사용하여 용량-반응 곡선을 작성하였다.

E2에 대한 반수영향농도(EC50, 50% Effective Concentration)는 사람과 송사리

에스트로겐 수용체를 도입한 효모에서 각각 35.3 nM 및 11.4 nM 이었으며

검출한계는 각각 0.16 nM과 10.2 pM 이하로 나타났다. ERE-Luciferase 리포터

유전자를 도입한 사람 골육아종 세포에서 EC50값은 4.9 pM이었으며 검출한계는

0.1 pM 이하로 나타났다(그림 6). 이러한 결과는 효모보다는 사람 세포에

리포터 유전자를 도입한 생물학적 분석법이 더 민감한 결과를 보인다는 기존

연구 결과와 일치하였다(Legler et al., 2002; Leusch et al., 2010).

(A) hER Yeast two-hybrid assay (B) mER Yeast two-hybrid assay

(C) ER-CALUX assay

<그림 6> Dose-Response of 17β Estradiol.


- 14 -

(M) EROD DR-CALUX

EC50 1.86E-11 9.68E-12

Detection Limit 3.30E-12 4.70E-12

나. 다이옥신성 EDs 분석을 위한 생물학적 분석법의 민감도다이옥신성 EDs 분석을 위한 생물학적 분석 기법별 민감도를 확인하고자

표준물질인 2,3,7,8-TCDD를 사용하여 용량-반응 곡선을 작성하였다(그림 7).

EROD 방법과 DR-CALUX 방법에서 도출된 2,3,7,8-TCDD에 대한 EC50값은

각각 18.6 pM과 9.7 pM로 기존의 문헌값과 유사한 수준으로 나타났다(Murk

et al., 1996; Harmer et al., 2000; Behnisch et al., 2002). 검출한계는 EROD

방법과 DR-CALUX 방법에서 각각 3.3 pM과 4.7 pM로 나타났다.

(A) EROD assay (B) DR-CALUX assay

<그림 7> Dose-Response of 2,3,7,8-TCDD.

2. 환경 중 내분비계장애 추정물질의 생물학적 분석 결과

가. 에스트로겐성 EDs 환경 중에 혼합물 형태로 존재하는 에스트로겐성 내분비계장애 추정물질의

영향을 통합적으로 분석하기 위해 수질시료(하․폐수처리장 유입·방류수) 및

퇴적물 시료를 대상으로 ER Yeast two-hybrid 방법 등 생물학적 분석방법을

이용하여 에스트로겐성 활성도를 측정하였다. 환경시료의 에스트로겐성 활성은


- 15 -

E2에 대한 상대활성도, 즉 EEQ (E2 Equivalent Concentration)로 표기하였다

(표 4).

수질 시료의 경우, 유입수와 방류수의 에스트로겐 활성을 비교해보면 분석

방법별로 차이는 있으나 전반적으로 유입수에 비해 방류수의 에스트로겐

활성도가 감소되는 것으로 나타났다. 하·폐수처리장의 처리효율을 살펴보면

시료별, 분석법별로 상이한 결과를 보였는데 이는 시료에 따라 에스트로겐성

EDs 물질의 조성비가 다르고 분석법별로 에스트로겐성 EDs 물질에 대한

반응성에 차이가 있기 때문인 것으로 해석할 수 있다.

<표 4> Estrogenic Activity of Environmental Samples

SiteER Yeast two-hybrid assay ER-CALUX

assayhER mER

Water

(ng-EEQ/L)

W01 (Inf) 68.10 42.21 114.8

W02 (Eff) 32.69 5.72 4.3

W03 (Inf) 57.20 27.24 25.4

W04 (Eff) 49.03 4.90 6.7

W05 (Inf) 54.48 6.92 20.2

W06 (Eff) 57.20 5.45 50.1

W07 (Inf) 70.82 54.47 81.1

W08 (Eff) 70.82 5.45 8.4

W09 (Inf) 76.27 35.41 105.9

W10 (Eff) 70.82 4.63 0.86

Sediment(ng-EEQ/kg)

S01 70.82 7.35 51

S02 87.16 21.79 63

S03 103.50 245.14 1587

S04 201.56 313.24 3297

S05 103.50 18.25 1877

※ N.D. : not detected; Inf : Influent; Eff : Effluent


- 16 -

위에서 산출된 EEQ값을 토대로 생물학적 분석법 사이의 상관성을 살펴

보았다(그림 8). 전반적으로 송사리 에스트로겐 수용체인 mER 도입 효모를

이용한 분석법과 ER-CALUX 방법은 매질에 상관없이 상관성이 0.6이상으로

나타나 비교적 높은 상관성을 보였다. 매질별로 상관성을 살펴보면 퇴적물의

경우, 생물학적 분석법 사이의 상관성이 0.61 ∼ 0.82 사이로 높게 나타났다.

반면, 수질의 경우에는 사람 에스트로겐 수용체인 hER을 도입한 효모를 이용한

분석법과 다른 에스트로겐성 EDs 분석법을 비교하였을 때 0.25 ∼ 0.29 사이의

낮은 상관성을 보였다.


- 17 -

(A) hER Yeast two-hybrid vs mER Yeast two-hybrid

<그림 8> Correlation between Estrogenic EDs Detection Methods.

[Unit : ng-EEQ/L (water), ng-EEQ/kg (sediment)]


- 18 -

(B) mER Yeast two-hybrid vs ER-CALUX

<그림 8> Correlation between Estrogenic EDs Detection Methods. (continued)



- 19 -

(C) hER Yeast two-hybrid vs ER-CALUX

<그림 8> Correlation between Estrogenic EDs Detection Methods. (continued)



- 20 -

나. 다이옥신성 EDs

다이옥신성 내분비계장애 추정물질에 대해서도 하수처리장 유입·방류수 및

퇴적물 시료를 대상으로 EROD 방법 등의 생물학적 분석법을 이용하여 환경

시료 중에 존재하는 모든 다이옥신성 내분비계장애 추정물질을 통합적으로

평가하였다. 환경시료의 다이옥신성 활성은 독성등가량(TEQ)으로 표기하였다

(표 5).

<표 5> Dioxin-like Activity of Environmental Samples

Site EROD assay DR-CALUX assay

Water

(pg-TEQ/L)

W01 (Inf) 589.05 139.48

W02 (Eff) 519.82 52.75

W03 (Inf) 375.76 80.02

W04 (Eff) 452.33 69.64

W05 (Inf) 259.32 34.77

W06 (Eff) 236.36 48.09

W07 (Inf) 473.80 43.83

W08 (Eff) 342.49 60.61

W09 (Inf) 788.97 184.14

W10 (Eff) 259.32 43.83

Sediment(ng-TEQ/kg)

S01 68.50 16.81

S02 108.65 26.77

S03 262.17 43.89

S04 207.93 43.87

S05 103.96 14.82



- 21 -

각각의 생물학적 분석 방법에서 도출된 TEQ값을 토대로 두 가지 방법의

상관성을 분석한 결과, r2 = 0.771로 비교적 높은 상관성을 보였다(그림 9).

다만, 두 방법에서 도출된 TEQ값의 절대적 수치를 비교해보면 EROD 방법

에서 도출된 TEQ값이 DR-CALUX 방법에서 도출된 TEQ값에 비해 약 4배

∼ 11배 정도 높은 것으로 나타났다. 이러한 현상은 Ẅolz 등의 연구에서도

보고된 바 있으며 두 가지 생물학적 분석법의 종말점 차이에서 기인한 것으로

추정된다(Ẅolz et al., 2008). 두 방법 모두 AhR 수용체를 매개로 한 기전에

근거한 방법이나 EROD 방법의 경우, 내인성 단백질인 CYP1A 효소 발현에

따른 활성 변화를, DR-CALUX는 외인성 리포터 유전자에 코딩(coding)된

luciferase 효소의 발현에 따른 활성 변화를 측정한다는 측면에서 다소 차이가

있다.

<그림 9> Correlation between Dioxin-like EDs Detection Methods.



- 22 -

3. 환경 중 내분비계장애 추정물질의 기기분석 결과

가. 에스트로겐성 EDs

환경 중에 존재하는 대표적인 에스트로겐성 내분비계장애 추정물질에 대해

수질 및 퇴적물 시료를 대상으로 환경 중 잔류 농도를 분석하였다. 분석대상은

에스트로겐류(4종), 프탈레이트류(9종), 알킬페놀류(9종)이며 그 결과는 표 6

∼8과 같다. 수질 시료 중 알킬페놀류는 하·폐수처리장 유입수에 비해 방류수

에서 그 농도가 현저히 감소하는 경향을 나타냈으나, 에스트로겐류인 E1, E2,

EE2 및 일부 프탈레이트류(di-butyl phthalate, di-ethylhexyl phthalate)의 경우

오히려 방류수에서 농도가 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 현상은 하·폐수

처리 과정에서 미생물 분해로 인해 포합체(conjugate)가 분해되었기 때문인

것으로 분석된다(Lee et al., 2007). 퇴적물에서 주로 검출되는 에스트로겐성

물질은 E1, EE2, 4-t-octylphenol, nonylphenol, bisphenol A 및 di-ethylhexyl

phthalate로 나타났다.

<표 6> Concentration of Estrogens in Environmental Samples

Site E1 E2 E3 EE2

Water

(ng/L)

W01 (Inf) 4.12 <0.56 ND <0.90

W02 (Eff) 2.70 <0.56 ND 1.36

W03 (Inf) 5.45 <0.56 0.33 <0.90

W04 (Eff) 5.79 ND ND 1.73

W05 (Inf) 10.39 <0.56 ND 2.98

W06 (Eff) 7.07 <0.56 <0.06 6.30

W07 (Inf) 6.68 <0.56 0.11 4.86

W08 (Eff) 9.86 <0.56 ND 2.32

W09 (Inf) 8.74 ND ND 1.86

W10 (Eff) 8.91 <0.56 <0.06 5.08

Sediment(ng/kg)

S01 473.21 24.03 2.96 282.87

S02 500.76 12.84 1.73 286.32

S03 501.48 5.30 ND 308.24

S04 513.74 3.82 ND 187.61

S05 544.09 ND 7.58 367.07


E1 : Estrone; E2 : 17β estradiol; E3 : Estriol; EE2 : 17α ethinylestradiol


- 23 -

<표 7> Concentration of Phenols in Environmental Samples

Site

Phenol

BPA4-t-

Butyl

4-n-

Butyl

4-n-

Pentyl

4-n-

Hexyl

4-t-

Octyl

4-n-

Heptyl

4-n-

OctylNonyl

Water

(ng/L)

W01 (Inf) ND 22.78 ND ND 9.80 3.14 ND 96.93 ND

W02 (Eff) ND 1.10 ND ND 0.44 0.16 ND 4.63 0.27

W03 (Inf) ND 22.09 ND ND 9.07 2.93 ND 42.72 ND

W04 (Eff) ND ND ND ND 0.40 0.15 0.08 2.66 0.06

W05 (Inf) ND 22.14 ND ND 9.81 3.00 ND 52.44 ND

W06 (Eff) ND ND ND ND ND 0.15 ND 2.46 0.19

W07 (Inf) ND 22.32 ND ND 33.36 2.94 0.68 27.97 7.05

W08 (Eff) ND ND ND ND 0.84 0.29 ND 1.86 0.12

W09 (Inf) ND ND ND ND ND 0.29 ND 2.31 ND

W10 (Eff) ND 1.13 ND ND 0.42 0.15 ND 1.12 0.38

Sediment

(ng/kg)

S01 ND 338 ND ND 1,865 75 ND 3,653 329

S02 ND 243 ND ND 292 ND ND 410 616

S03 ND ND ND ND 2,513 660 381 32,562 1,550

S04 ND 322 ND ND 447 66 ND 3,085 121

S05 ND 350 ND ND 231 70 80 3,793 195

※ ND : not detected; Inf : Influent; Eff : Effluent


- 24 -

<표 8> Concentration of Phthalates in Environmental Samples

SitePhthalate Di-ethylhexyl

adipateDi-ethyl Di-propyl Di-butyl Di-pentyl Di-hexyl Benzyl-butyl Di-cyclohexyl Di-ethylhexyl

Water

(μg/L)

W01 (Inf) ND ND ND ND ND ND ND ND ND

W02 (Eff) ND ND 2.45 ND ND ND ND 4.13 ND

W03 (Inf) 0.85 ND 15.71 ND ND ND ND 1.35 ND

W04 (Eff) ND ND ND ND ND ND ND 1.08 ND

W05 (Inf) ND ND ND ND ND ND ND ND 0.69

W06 (Eff) ND ND 6.63 ND ND ND ND 0.72 ND


W08 (Eff) ND ND 1.47 ND ND ND ND ND ND


W10 (Eff) ND ND ND ND ND ND ND ND ND

Sediment

(μg/kg)

S01 ND ND ND ND ND ND ND 448.82 ND

S02 ND 18.84 ND ND ND ND ND 603.73 ND

S03 ND ND 723.63 ND ND ND ND 3,533.28 ND

S04 ND ND ND ND ND 14.12 ND 1,433.07 ND

S05 ND ND ND ND ND 13.64 ND 1,416.46 ND

※ ND : not detected; Inf : Influent; Eff : Effluent


- 25 -

나. 다이옥신성 EDs

환경 중에 존재하는 다이옥신성 EDs인 PCDD/F 17종과 Co-PCB 12종에

대해 퇴적물 시료를 대상으로 환경 중 잔류 농도를 분석한 결과, 탄소수 7개

이상의 다이옥신류(HpCDD, OCDD, HpCDF, OCDF)가 주로 검출되었으며

PCB류는 지점별로 상이하나 PCB105, 118 및 156이 비교적 높은 농도로 검출

되었다(표 9).

<표 9> Concentration of PCDD/Fs and Co-PCBs in Environmental Samples

ChemicalsSediment (pg/g)

S01 S02 S03 S04 S05

2,3,7,8-TCDD 0.250 0.649 0.782 0.299 0.199

1,2,3,7,8-PeCDD 0.000 2.844 0.000 2.993 0.000

1,2,3,4,7,8-HxCDD 0.749 2.046 3.570 2.643 0.498

1,2,3,6,7,8-HxCDD 1.148 3.593 6.993 4.539 1.145

1,2,3,7,8,9-HxCDD 0.749 2.944 4.352 3.491 0.647

1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 9.032 28.144 74.328 36.409 8.661

OCDD 32.285 94.212 279.902 106.733 39.622

2,3,7,8-TCDF 1.198 4.341 5.330 5.087 0.896

1,2,3,7,8-PeCDF 2.146 7.236 16.430 9.676 2.190

2,3,4,7,8-PeCDF 2.894 10.030 15.061 14.065 2.041

1,2,3,4,7,8-HxCDF 4.391 15.519 30.220 19.451 4.430

1,2,3,6,7,8-HxCDF 3.393 12.275 24.597 16.708 2.837

2,3,4,6,7,8-HxCDF 4.441 4.790 8.753 7.382 0.896

1,2,3,7,8,9-HxCDF 3.792 15.020 28.606 20.798 2.787

1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 16.267 71.208 156.235 88.728 11.847

1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 2.196 13.772 29.242 15.761 0.697

OCDF 12.325 71.407 172.469 82.793 7.865

3,4,4‘,5-TeCB(81) 0.539 3.162 35.693 5.301 0.703

3,3',4,4'-TeCB(77) 7.514 63.629 776.587 97.145 10.794

2',3,4,4',5-PeCB(123) 4.007 82.514 162.004 146.879 7.561

2,3',4,4',5-PeCB(118) 33.396 658.399 1298.637 1310.991 59.316

2,3,4,4',5-PeCB(114) 1.556 14.508 54.205 43.037 1.576

2,3,3',4,4'-PeCB(105) 15.563 264.403 752.939 562.750 25.946

3,3',4,4',5-PeCB(126) 1.997 13.343 19.352 22.500 2.389

2,3',4,4',5,5'-HxCB(167) 2.942 38.818 63.638 70.004 4.691

2,3,3',4,4',5-HxCB(156) 6.973 105.873 152.828 204.784 9.853

2,3,3',4,4',5'-HxCB(157) 2.037 20.622 32.553 45.320 2.239

3,3',4,4',5,5'-HxCB(169) 0.538 1.782 4.100 3.218 0.482

2,3,3',4,4',5,5'-HpCB(189) 1.292 11.653 16.212 16.777 1.410


- 26 -

4. 생물학적 분석법과 기기분석법의 상관성

환경 중 내분비계장애영향에 대한 통합평가 스크리닝 수단으로써 생물학적

분석법의 적용성을 평가하기 위해 생물학적 분석 결과와 기기분석 결과의 상관성을

살펴보았다. 생물학적 분석을 통해 도출된 값(EEQ값 또는 TEQ값)을 기기분석

결과를 토대로 추정한 예측값(estimated EEQ 또는 estimated TEQ값)과 비교

하였다.

가. 에스트로겐성 EDs 분석 결과의 상관성에스트로겐성 EDs 물질에 대해서는 국제적으로 공인된 상대 활성도가 없기

때문에 본 연구에서는 생물학적 분석 방법과 기기분석 방법의 상관성 비교에

앞서 먼저 생물학적 분석법을 이용하여 개별 에스트로겐성 EDs 물질에 대한

상대 활성도를 도출하였다(개별 물질에 대한 상대 활성도는 본 보고서에 수록

하지 않음). 기기분석 대상인 에스트로겐류 4종, 알킬페놀류 9종, 프탈레이트류

9종에 대해 ER Yeast two-hybrid 및 ER-CALUX 방법으로 용량-반응 실험을

수행하여 각각의 물질에 대한 상대 활성도를 도출하였다. 이 값에 기기분석에서

도출된 농도를 곱한 뒤, 모두 더하여 에스트로겐 활성 예측값을 구하고 생물학적

분석에서 도출된 실측값과 비교하였다(표 10). 전반적으로 에스트로겐성 EDs에

대한 생물학적 분석 결과와 기기분석 결과의 상관성은 매우 낮은 수준인 것으로

나타났다. 이러한 결과는 에스트로겐성 EDs 물질의 작용 기전에 있어 시료 중

에 혼재하는 각종 유․무기 물질 및 중금속 등이 길항작용을 일으키기 때문인 것

으로 추정된다(Nishihara et al., 2000; Holdbrook et al., 2005; Yamamoto et al.,

2003). 다만, 수질시료의 경우 hER 및 mER 도입 효모를 이용한 생물학적 분석

결과를 기기분석 결과와 비교하였을 때 r2값이 각각 0.408, 0.478로 나타나 환경

시료의 특성을 고려할 때 다소 의미있는 결과를 보였다.


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<표 10> Measured and Estimated EEQ values of Environmental Samples

hER Yeast two hybrid mER Yeast two hybrid ER-CALUX

Measured EEQ Estimated EEQ Measured EEQ Estimated EEQ Measured EEQ Estimated EEQ

W01 (Inf) 68.10 16.24 42.21 10.85 114.8 2.03

W02 (Eff) 32.69 11.74 5.72 4.90 4.3 4.52

W03 (Inf) 57.20 27.63 27.24 26.33 25.4 2.8

W04 (Eff) 49.03 20.95 4.90 2.09 6.7 6.83

W05 (Inf) 54.48 39.05 6.92 8.38 20.2 11.95

W06 (Eff) 57.20 30.96 5.45 10.50 50.1 17.98

W07 (Inf) 70.82 28.47 54.47 11.12 81.1 14.52

W08 (Eff) 70.82 35.71 5.45 4.10 8.4 10.17

W09 (Inf) 76.27 33.44 35.41 21.53 105.9 8.77

W10 (Eff) 70.82 33.42 4.63 3.37 0.86 16.05

S01 70.82 1948.01 7.35 706.79 51 914.27

S02 87.16 2062.07 21.79 500.15 63 926.25

S03 103.50 3388.18 245.14 5150.52 1587 1017.06

S04 201.56 2514.43 313.24 879.48 3297 708.84

S05 103.50 2712.42 18.25 1009.11 1877 1134.2

※ Inf : Influent; Eff : Effluent


- 28 -

나. 다이옥신성 EDs 분석 결과의 상관성퇴적물 시료를 대상으로 PCDD/F 17종과 Co-PCB 12종에 대한 기기분석

에서 도출된 다이옥신 활성 예측값과 생물학적 분석에서 도출된 다이옥신

활성값을 비교하였다(표 11, 그림 10). EROD 방법 및 DR-CALUX 방법에서

도출된 TEQ값과 기기분석 결과를 토대로 한 예측 TEQ값의 상관성(r2)은 각각

0.751과 0.918로 높은 상관성을 보였다. 다만, 절대적인 TEQ값을 비교하면

생물학적 검정법에 의한 TEQ값이 기기분석 방법에 의한 값보다 높은 것으로

나타났다. EROD 방법의 경우 7배 ∼ 37배 정도 높게 나타났고, DR-CALUX

방법의 경우 1.5배 ∼ 5.5배 정도 높게 나타났다. 이는 기존의 연구에서도

보고된 바 있으며 WHO-TEF값이 없는 화학물질 중에 다이옥신성 활성을 가진

물질에 의해 나타난 활성 때문인 것으로 해석할 수 있다. 생물학적 분석에

사용한 시료의 경우 기기분석용 시료와 달리 복잡한 전처리 과정을 거치지

않기 때문에 PAH 등 다이옥신성 활성을 나타내는 물질이 잔존할 가능성이

있다. PAH를 비롯한 다양한 구조의 화학물질이 다이옥신 활성을 나타낸다는

연구 보고가 있었으며 이들 물질에 의한 상가작용이나 상승작용에 의해 TEQ값이

증가할 가능성도 배제할 수 없다(Till et al., 1997; Giepsy et al., 2002;

Behnisch et al., 2003).


- 29 -

<표 11> Measured and Estimated TEQ values of Sediment Samples

Site

(pg-TEQ/g)

Measured TEQ Estimated TEQ

EROD assay DR-CALUX assay HRGC/MS

S01 68.50 16.81 3.68

S02 108.65 26.77 15.38

S03 262.17 43.89 21.99

S04 207.93 43.87 19.71

S05 103.96 14.82 2.78

(A) EROD vs HRGC/MS (B) DR-CALUX vs HRGC/MS

<그림 10> Correlation between Bioassay and Chemical Analysis.

Ⅳ. 결 론❚

- 30 -

Ⅳ. 결 론

본 연구는 환경 중 내분비계 장애영향에 대한 신속하고 경제적인 통합평가

기법 발굴을 목표로 수행하였다. 에스트로겐성 및 다이옥신성 내분비계장애

추정물질을 중심으로 환경시료(하·폐수처리장 5개 지점의 유입·방류수와 시화

안산지역 5개 지점의 퇴적물 시료)와 2종의 표준물질(17β estradiol 및

2,3,7,8-TCDD)을 이용하여 생물학적 분석법의 활용성을 평가한 결과는 다음과 같다.

1. 표준물질에 대한 생물학적 분석법의 민감도는 포유류 세포에 리포터 유전자를

도입한 CALUX 방법이 우수하였다.

- 효모를 이용한 ER Yeast two-hybrid 방법과 포유류 세포를 이용한

ER-CALUX 방법은 각각 nM과 pM 수준에서 17β estradiol에 대한 EC50값

을 보였으며 검출한계는 0.2 nM ∼ 0.1 pM 이었다.

- EROD 및 DR-CALUX 방법은 2,3,7,8-TCDD에 대한 EC50값이 각각 18.6 pM

과 9.7 pM이었으며 검출한계는 각각 3.3 pM과 4.7 pM이었다.

2. 생물학적 분석법과 기기분석법의 상관성은 r2값이 0.75 ∼ 0.92로 다이옥신성

물질이 높았다. 다만, 절대적인 TEQ값은 생물학적 방법에 의한 값이 더 높았다.

3. 에스트로겐성 물질에 대한 생물학적 분석법과 기기분석법 사이의 상관성은

낮았으나 효모를 이용한 수질시료 평가결과 상관성(r2)이 0.4 이상으로

나타나 환경시료의 특성을 고려할 때 다소 의미있는 결과를 보였다.

4. 다이옥신성 물질 및 퇴적물 중 에스트로겐성 물질에 대한 생물학적 분석

방법 사이의 상관성은 r2값이 0.61 ∼ 0.84로 비교적 높았다.

이상의 결과들로부터 생물학적 분석법은 몇 가지 제한점이 있으나 환경 중에

존재하는 다양한 화학물질의 내분비계 장애영향을 통합적으로 평가하기 위한

수단으로서 충분한 활용 가치가 있다고 판단된다. 다만, 향후 추가 연구를 통해

매질별 특성을 고려한 간편하고 최적화된 전처리 방법이 도출된다면 본 연구에서

나타난 생물학적 분석법의 제한점은 극복될 수 있을 것으로 판단된다.

참 고 문 헌❚

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