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腸 管 組 織侵 入 性大 腸 菌(0164:H-)に よる食 中毒 事例

-原 因食品が特定された大規模発生事例一

佐賀県衛生研究所

山村 勝幸 角 典子 江頭 康

福岡 逸朗 本村 資光 土田 龍馬

(平 成3年12月24日 受 付)

(平 成4年2月17日 受 理)

Key words: enteroinvasive Escherichia coli, diarrhea,

food poisoning, outbreak

要 旨

1988年7月14日 「ご ど うふ(笹 雪 豆腐)」を主 要 な原 因 食品 とす る食 中毒 事件 が発 生 した.摂 食者 数918

名,患 者 数 は670名(発 症 率73.0%)で あ った.患 者 の主症 状 は下痢(93.4%),発 熱(77.5%),腹 痛(64.5%),

?吐(19.9%)で,高 熱 と頻 回 の水様 下痢 が特 徴的 に認 め られた.潜 伏 期 間 は1～156時 間,平 均35時 間

で あ った.

患 者22検 体(22/32),豆 腐 製造 関 係者5検 体(5/10)の ふん便 及 び患者 の摂 食残 品 ご ど うふ1検 体 か

ら,腸 管 組織 侵入 性大 腸菌(EIEC)0164:H一 を検 出 した.

患 者,製 造 関係 者,食 品 由来 のEIEC菌 株 はHeLa細 胞 ・HEp-2細 胞 へ の侵 入性,Serenytest及 び侵

入性 プ ラス ミド由来 菌 体外膜 蛋 白を検 出す るELISAtest(東 京 都立 衛生 研究 所 に依頼)に よ りそ の病 原

性 が確認 され た.

EIEC菌 株 の 多 くは,治 療 に使用 されたkanamycin(KM),oHoxacin(OFLX)を 始 めgentamicin

(GM), ampicillin(ABPC), carbenicillin(CBPC), cephloridine(CER), cephalothin(CET), nalidixic

acid (NA), polymyxin-B(PB), minocycline(MINO), tetracycline(TC), chloramphenico1 (CP)

に 良好 な感受 性(≦0.19～6.25μg/m1)を 示 した が,fosfomycin(FOM)で は若干 の ば らつ き(6.25～25.0

μ9/ml)が あ り,豆 腐製 造 関係者 由来 の1株 はMINO,TC,FOM,CPに 耐性(25～ ≧100μ9/ml)で

あ った.

調 査 の結果,ご ど うふ の多 くが摂 食時 まで 常温 に置 かれ て いた こ とが判 明 した ため,患 者 由来 のEIEC

O164:H一 を同食 品 に1～10CFU/ml添 加 し,当 時 の平 均気 温29℃ に置 き菌数 の変 動 を見た.菌 数 は6,

12,24時 間 後 にそれ ぞれ 約102,105,108CFU/mlと 増 加 し,患 者 の摂 食状 況か ら濃厚 感染 が示 唆 され た.

原 因食品 へ の汚染経 路 は解 明 され なか ったが,水 槽 で冷 却 し,ご ど うふ として固化 後,包 装 に至 るまで

の製 造過 程 で汚染 され た もの と思わ れた.

序 文

国 内 に お け る 腸 管 組 織 侵 入 性 大 腸 菌(enter-

oinvasiveEscherichiacoli,以 下EIECと 略)の

検 出報 告 数1)は,毒 素 原 性 大 腸 菌(enterotoxigenic

Ecoli,ETEC)や 腸 管 病 原 性 大 腸 菌(enteropth-

ogenicEcoli,EPEC)に 比 べ る とは る か に 少 な

く,同 様 に 食 中 毒 も1959年 に新 潟 県 で 発 生 し た

0136:K78:H一 に よ る 国 内 最 初 の 事 件2)以 降,

1980年 ま で に6件(そ の多 くは1970年 以 前 の事 件)

が 報 告 され て い る に す ぎ な い.し か し,1980年 代

別刷請求先:(〒849)佐 賀市八丁畷 町1-20

佐賀県衛生研究所 山村 勝幸

平成4年6月20日

762 山村 勝幸 他

の後半から鹿児島県,神 奈川県,香 川県の事件3)の

ように,0152:K+や0164:K+な どの新たな血

清型による食中毒が散見されるようになってきて

いる.私 達は,1988年7月 これまでに国内最大規

模 と思われるEIECに よる食中毒事件を経験 した

ので,そ の概要 と分離菌株の性状などについて報

告す る.

材料および方法

1.菌 検索材料

患者32名 と某豆腐製造所の製造関係者10名 のふ

ん便42検 体,吐 物1検 体,患 者の食べ残 した 「ご

どうふ(笹 雪豆腐)」(回 収時は常温で5日 間経過)

1検 体,み そ汁1検 体,同 製造所で7月15日 製造

されたこどうふ,厚 揚げ豆腐 など6検 体.

7月17日 採水された豆腐の冷却用水槽の水など

豆腐製造所の使用水4検 体.

2.菌 検索方法

食中毒起因菌の検索,同 定は常法に従い実施 し

た.EIECの 検索は,ふ ん便については直接分離培

養のみ,食 品及び吐物ではE.C培 地(日 本製薬)

による増菌培養を併用 した.分 離培地はDHL及

びデゾキシコレー ト寒天培地(日 水製薬)を 用い

た.

3.分 離菌株(0164:H-)の 病原性試験

(1)細 胞 侵入性試1験:HeLa細 胞 とHEp-2細

胞を用い,Osadaら4)の 方法に準拠して実施した.

(2)セ レニーテス ト:モ ルモットはハー トレイ

系(体 重200～300g,雄)を 用い常法5)に従い実施

した.ま た陰性対照 としてLT産 生性大腸菌(06:

K15)液 とニュー トリエソ ト・プロス(OXOID)

を用いた.観 察は4日 間行った.

(3)ELISAtest6):東 京都立衛生研究所に依頼

した.

(4)毒 素産生試験

LT産 生性:CHO細 胞7)と市販 のRPLAキ ッ

ト(栄 研化学)で 行 った.

ST産 生 性:乳 の み マ ウ ス法6)及 び市 販 の

ELISAキ ット(デ ソカ生研)を 用いた.な お,毒

素産生用培地 は上記RPLAキ ット添付のものを

使用 した.

VT産 生性:Obrienら9)の 方法に準拠 し,除 鉄

した シ ソ ケー ス ・プ ロス を 用 い て被 検 液 を作 成 し

実 施 した.

4.薬 剤 感 受 性 試 験

ofloxacin(OFLX,第 一 製 薬),kanamycin

(KM, Sigma), chloramphenicol(CP, Sigma,),

gentamicin (GM, Sigma), fosfomycin (FOM,

Sigma), tetracycline(TC, Sigma), minocycline

(MINO, Sigma), ampicillin(ABPC, Sigma),

carbenicillin (CBPC, Sigma), cephaloridine

(CER, Sigma), cephalothin (CET, Sigma),

nalidixic acid(NA, Sigma), polymixin-B(PB,

Sigma),erythromycin(EM,Sigma)の13薬 剤

についてEIEC(0164:H-)28菌 株の発育最小阻

止濃度を常法により測定した.

5.「 ごどうふ」中のEIEC(0164:H一 菌株増

殖試験

患者由来(0164:H-)菌 株 をニュー トリエ ン

ト・プロスで37℃,18時 間培養し添加用l菌液 とし

た.市 販のこどうふを滅菌 し滅菌水道水で2倍 に

希釈後,ス トマッカーを用いて3分 間均質化 した

もの に1～10CFU/ml及 び103CFU/mlに な る よ

うにそれぞれ菌液を添加 した.次 いでこれを よく

混和 し10mlず つ試験管に分注後,食 中毒発生当時

の平均気温であった29℃ に保温し,6,12,24時

間毎にデ ソキシコレー ト寒天培地を用いて混釈培

養 し菌数を測定 した.

成 績

1.食 中毒発生状況

(1)食 中毒発生の経過

Table1に 事件の概要10)を示した.

1988年7月14日,佐 賀県有田町の家庭で初盆の

精進料理を食べた9名 が入院している旨,某 病院

から伊万里保健所に連絡があ り事件が探知 され

た.

調査の結果,原 因食品は某豆腐製造所で7月13

日から7月15日 にかけて製造されたこどうふなど

(一部に豆腐や厚揚げ豆腐によると思われ る患者

も認め られた.)で あることが判明した.こ れらの

豆腐類は,佐 賀県内及び長崎県北西部で販売され

摂食者数は918名,患 者は佐賀県,長 崎県,福 岡県

で670名(発 症率73.0%)に 達 した.

感染症学雑誌 第66巻 第6号

腸管組織侵入性大腸菌0164:H一 による食中毒事例 763

Table 1 Outline of the outbreak of food poison-

ing by enteroinvasive Escherichia coli 0164: H

ご ど うふ は 豆 乳 と澱 粉 が 主 成 分 の豆 腐 の1種

で,柔 らか く型 崩 れ しや す い た め水 と共 に袋 詰 め

して 販 売 さ れ て お り,夏 期 に 精 進 料 理 と して主 に

用 い られ る.同 地 域 で は 従 来 か ら冷 蔵 す る と固 く

な る と い うこ とで 常 温 に 置 か れ る こ とが 多 か っ

た.

(2)潜 伏 期 間

患 者 は原 因 食 品 の 摂 食 後1～156時 間 で 発 症 し

て お り,最 頻 値(Mode)は26時 間(24～28時 間),

平 均 値 は 約35時 間 で あ っ た(Table1).

(3)症 状

患 者670名 の 主 な症 状 は,下 痢93.4%(626/670),

発 熱77.5%(591/670),腹 痛64.5%(432/670)で,

患 者 の32.4%(217/670)に39℃ 以 上 の 発 熱,29.5%

(198/670)に10回 以 上 の 下 痢 が 認 め ら れ て い る

(Table1).

便 性 状 は,水 様 性 が78.8%(493/626)と 大 部 分

で,粘 血 性,血 性 の も の は2.7%(17/626)と 少 な

か った.な お 入 院 患 者 はKM,OFLXな ど の抗 菌

薬 の 投 与 を受 け1週 間 程 度 で 軽 快 して い る.

2.細 菌 検 査 結 果

(1)食 中 毒 起 因 菌 検 出状 況

Table 2 Result of investigation for causative organisms in Godofu (Sasayuki tofu)

assocciated poisoning (July, 1988)

a) enteroinvasive Escherichia coli, b) Staphylococcus aureus, c) Bacillus cereus, d) Aeromonas

hydrophila, e) Patient's leftover (manufactured on July 13), f) Manufactured on July 15, g)

Collected on July 16

平成4年6月20日

764 山村 勝幸 他

Table 3 Biochemical propertiesa) of 28 0164: H

strains of enteroinvasive Escherichia coli der-

ived from an event of food poisoning (July,

1899)

a) Incubation temperature in each test: 37'C*Source of isolates : Patient (n=22) , Tofu worker (n=

5), patient's leftover (n=1).

患 者22名,豆 腐 製 造 従 事 者5名 の ふ ん便 及 び 患

者 の 摂 食 残 品 ご ど うふ1検 体,合 計28検 体 か ら

EIEC(0164:H-)を 検 出 した(Table2)。

また 長 崎 県 に お い て も食 品,患 者 ふ ん便 な ど62

検 体 の菌 検 索 が な され,患 者 ふ ん 便10検 体 よ り同

菌 が 検 出 され て い る.

食 中 毒 起 因 菌 は,そ の 他 に 豆 腐 や 患 者 便 か ら

Bacillus cerens,St4phylococcnsaureusな どが 検

出 さ れ た が,い ず れ も少 数 検 体 か ら の 分 離 に と ど

ま っ た.

(2)同 定 試 験 結 果

各 由 来 か ら分 離 され た28菌 株 はTable 3の と

お り,TSI培 地,LIM培 地 な どでEIECに 合 致 し

た 性 状11)を示 した.そ の他 の 生 化 学 的 性 状 で は,定

型 的 な 大 腸 菌 とほ ぼ 同様 の 成 績 が 得 られ た.ま た

血 清 型 別 試 験 で は,診 断 用 型 別 血 清0164型 に特 異

的 凝 集 が 認 め られ た.

(3)病 原 性

病 原 性 試 験 成 績 をTable4に 示 し た.各 由 来

0164:H-菌 株 はHEp-2細 胞,HeLa細 胞 に侵 入

し増 殖 し た(Fig.1).

セ レニ ー ・テ ス トで は,0164:H一 菌 液 を 点 眼

した モ ル モ ッ トに3～4日 目後,流 涙,軽 度 の 結

膜 の 充 血 が 見 られ,対 照 のLT産 生 大 腸 菌 液 及 び

ニ ュー ト リエ ン ト ・プ ロ ス を点 眼 した モ ル モ ッ ト

に は異 常 が 認 め られ な か った.

また,ELISAtestに よ っ て本l菌が 侵 入 性 プ ラ ミ

ド由来 の 菌 体 外 膜 蛋 白を 保 有 す る こ とが判 明 し,

各 由来 菌 株 の 組 織 侵 入 性 が 確 認 され た.

Table 4 Result of pathogenicity test with enteroinvaisve Eschrichia coli 0164: H-derived from an

event of food poisoning (July, 1988)

a) Test with one strain derived from each source, b) Detection of invasive plasmid-derived adventitial protein

(conducted at Tokyo Metropolitan Research Laboratory of Public Health), c) LT: heat-labile toxin, d) ST:

heat-stable toxin, e) VT: vero cell toxin

感染症学雑誌 第66巻 第6号

腸管組織侵入性大腸菌0164:Hlに よる食中毒事例 765

Fig. 1 Invasion of Escherichia, coli 0164: H isolated from food poisoning patient's into cells

left : HEp-2 cells, right : HeLa cells (Giemsa's stain X 1, 000)

Table 5 Drug susceptibility of 28 0164: H strains of enteroinvasive Escherichia calla' derived from an

event of food poisoning (July, 1988)

a) Source of strains: Patient (n=22), Tofu worker (n=5), Patient's leftover (n=1),b) One strain derived from a tofu

worker

毒 素 試 験 で は,各 由 来 菌 株 と もLT,ST,VT産

生 が 認 め られ な か った.

(4)薬 剤 感 受 性

分 離 され たEIEC(0164:H-)28菌 体 は,患 者

の 治 療 に使 用 さ れたKM,OFLXに 良 好 な感 受 性

(≦0,19～6。25μg/ml)が あ り,そ の 他 の薬 剤 に 対

して もお お む ね 感 受 性(≦0.19～6。25μg/ml)を 示

した.

た だ,豆 腐 製 造 関 係者(保 菌 者)1名 か ら分 離

さ れ た 菌 株 は,MINO,TC,FOM,CPに 耐 性

(25～ ≧100μg/ml)で あ っ た(Table5).

(5)増 殖 実 験 結 果

滅 菌 した こ ど うふ にEIEC(0164:Hl)を 接 種

し29℃(事 件 当 時 の平 均 気 温)に 置 いた 場 合,菌

数 は1～10CFU/ml接 種 した もの で は6,12,24時

間 後 に102,!05,108CFU/ml,ま た103CFU/ml接

種 した も の で は6,12,24時 間 後 に!05,107,108

CFU/mlと そ れ ぞ れ増 加 した(Figl2).

平 成4年6,月20日

766 山村 勝幸 他

Fig. 2 Changes in the number of Enteroinvasive Escherichia coli 0164: H—- cells

within "Godofu (Sasayuki tofu)"

EIEC: Enteroinvasive Escherichia coli

Experimental conditions: After 15 minutes of sterilization at 121•Ž, a one-to-five

dilution of "Godofu" was prepared with sterilized tap water. It was then added

with a solution containing the organism cultured for 18 hours in nutrient broth.

After mixing, the mixture was allowed to stand at 29•Ž and organism cells were

counted using desoxycholate agar.

考 察

EIEC(0164:H-)の 国内での集団発生は,本

事件の他に2事 例(神 奈川県川崎市,1986年12月

と香川県,1988年2月)が 報告1)3)されている.

いずれも比較的新しい事例であり,今 後 とも同

菌型による事件発生には注意が必要であろう.

EIECは 赤痢-菌に近い病原性を有してお り,患

者の症状は赤痢に酷似すると言われている12).近

年,EIECは 赤痢菌 と同様にプラス ミド(120～140

メガダル トン)及 び染色体上に,組 織侵入性など

に関わる病原性遺伝子を保有 していることが明ら

かにされ13)～15),分子遺伝学的分野からもその病原

性が裏付けられた.

ただ,今 回の事件では,患 者の約30%(200名 程

度)に39℃ 以上の発熱と10回 以上の水様下痢が認

められるなど比較的重症者が多かったが,赤 痢症

に特有 とされる裏急後重,粘 血便などが確認され

たものは少数(2.7%)に とどまった.患 者の同様

な症状は,1963年7月 の山形県16)(原因食品不明,

患者数567名),同 年9.月 の静岡県17)(原因食品「お

はぎ」,患 者数17名 うち死者4名)で 発生した事件

などでも見 られているよ うである.

本事件の場合,ご どうふなどの豆腐類が原因食

品となったが,過 去のEIEC食 中毒事件1)～3)で豆

腐類が主要な原因食品として報告 された事例は,

私達が知 り得た限 りにおいては他に認 め られな

かった.

今回の豆腐類へのEIEC汚 染源については,従

来からヒトが主要な保菌動物であると言われてい

る18)ことから,ま ずEIEC(0164:H-)が 検出さ

れた豆腐製造関係者(事 件の前後無症状)が 考 え

られ,そ の他にも厳属昆虫などの関与が疑われた

が,結 局解明までには至 らなかった.

ただ製造工程中,材 料の豆乳や澱粉は混合,蒸

し煮の段 階で充 分 に加 熱処 理(100℃ ・30分,

120℃ ・1～2分)さ れてお り,EIECの 汚染は,

材料が型枠に流し込まれ水槽中で固化 ・保存 され

た後,包 装 されるまでの間に起 こった ものと推察

された.

なお豆腐製造所では,水 槽への給水に公共上水

道を用いていたが給水栓には豆腐類の塩素臭を防

ぐ目的で簡易浄水器が取 り付けてあ り,一 旦水槽

がEIECに 汚染された場合,残 留塩素濃度の低減

化のため汚染が継続することも考えられた.

豆腐類は7月13日 の場合,7時 頃まで製造され

そのあと販売されているが,患者の多 くは購入後,

常温に置かれた こどうふを当日の昼食または夕食

時に摂食していた.

この場合EIEC菌 数は,ご どうふへの添加実験

から単純に推測すると,昼 食時に数百倍,夕 食時

感染症学雑誌 第66巻 第6号

腸管組織侵入性大腸菌0164:H-に よる食中毒事例 767

には数十万倍程度にまで増加 していたものと推測

される.

以上のような患者の摂食状況及び実験結果など

から,摂 食者の高率発症の主な原因は濃厚感染に

よるものであろ うと考えられた.

EIECに よる食中毒事件の場合,原 因食品から

菌が検出された例は比較的少ない1)～3)19).

私達は患者の摂食残品をEC培 地で増菌 し,100

枚以上の分離用平板培地を用い多数のコロニーを

拾 うことでようや くEIECを 分離することができ

たが,こ のような検索方法は膨大な時間 と労力が

必要であ り問題点が多い.

今後,迅 速で高精度なPCR法 などの菌検索方

法が広 く普及することを期待 したい.

なお本論文の要旨は,第63回 日本感染症学会総会(1984.

4,盛 岡市)で 報告した.

謝辞ELISA試 験を実施くださり,病原性試験方法など

ご指導を賜りました東京都立衛生研究所松下 秀先生,工

藤泰雄先生に深謝し,ご助言を賜りました国立予防衛生研

究所細菌部,渡 邊治雄先生に厚く御礼を申し上げます.

また細菌検査,疫 学調査など多大なご協力をいただいた

佐賀県伊万里保健所及び長崎県衛生公害研究所の関係各位

に心から感謝の意を表します.

文 献

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感 染症 課 感 染 症対 策 室: 病 原 微 生 物検 出情 報 (月

幸浸), 7 (8), p.1, p.20, 1986.

2) 寺 山 武, 塩 沢寛 治: 病原 大 腸 菌. 食 中 毒 菌 の制

禦 (坂 井 千 三 編), p.53-59, 中央 法 規, 1988.

3) 国 立 予防 衛 生 研究 所, 厚 生省 保 健 医療 局 結 核難 病

感 染 症課 感 染 症対 策 室: 病 原 微 生 物検 出情 報 (月

報), 12 (1), p.1, p.24, 1991.

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本耕 一 郎, 工 藤 泰 雄: 毒素 原 性 大 腸 菌が 産 生 す る

エ ソテ ロ トキ シ ソ の検 査法, コ レ ラ菌 と毒 素原 性

大腸 菌 の検 査法 (日 本 細菌 学 会 教 育委 員 会 編), 細

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病原 大 腸 菌 食 中毒. 食 衛誌, 30: 463-465, 1989.

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Infect. Immun., 39: 1392-1402, 1983.14) Hale, T.L., Sonsonetti, P.J., Schad, P.A., Autin,

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lence plasmid and plasmid-associated outermembrane proteins in Shigella flexneri, Shigellasonnei, and Escherichia coli. Infect. Immun., 40:340-350, 1983.

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17) 厚 生省 環 境 衛 生局 編:「 お は ぎ」 に よる食 中 毒.

全 国 食 中毒 事 件録, p.121-137, 1963.

18) 坂 崎利 一: 食 中毒 (坂 崎 利 一 編). 病 原 大腸 菌, 中

央 法規, p.148-191, 1981.

19) Marier, R. & Wells, J.G.: An outbreak of

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disease traced to imported French cheese. Lan-

cet, 15: 1376-1378,.1973.

平成4年6月20日

768 山村 勝幸 他

Food Poisoning Caused by Enteroinvasive Escherichia coli (O164:H-)-A Case in which the Causative Agent was Identified

Katuyuki YAMAMURA, Noriko SUMI, Yasushi EGASHIRA, Itsuroh FUKUOKA,Sukemitsu MOTOMURA & Ryuma TSUCHIDA

Saga Prefectural Institute of Public Health

Food poisoning due to "Godofu (Sasayuki tofu)" as a main causative foodstuff which broke out on

July 14, 1988. There were 670 out of 918 persons who ingested this food who became ill (incidence

73.0%).

The main symptoms were diarrhea (93.4%), fever (77.5%), abdominal pain (64.5%), and vomiting

(19.9%). A high degree of fever and watery diarrhea were characteristic of this poisoning.

The average latent period was 35 hours with a range of one to 156.

The O164:H- strains of enteroinvasive Escherichia coli (EIEC) were detected from 22 of the 32

fecal samples collected from the patients, five of ten samples collected from workers engaged in tofu

making, and one sample of leftover Godofu.

The virulence of EIEC strains isolated from the patients, workers, and leftover food was

confirmed by invasion into HeLa and HEp-2 cells, Sereny test, and ELISA test to detect invasive

plasmid-derived protein of the organism (conducted at Tokyo Metropolitan Research Laboratory of

Public Health).

These EIEC strains were sensitive (- 0.19 to 6.25,ug/ml) to GM, ABPC, CBPC, CER, CET, NA,

PB, MINO, TC and CP as well as KM and OFLX which were used for treatmnet. However, their

susceptibility to FOM varied to some extent (6.25 to 25.0,ug/ml) and one strain isolated from a tofu

worker was resistant to MINO, TC, FOM and CP (25 to >-100,ug/ml).

Since investigation revealed that Godofu was left at room temperature about 29•Ž until ingested,

we did a experiment to check the bacterial growth in Godofu under similar conditions at the time of

outbreak.

One to ten CFU/ml of EIEC O164:H- strain derived from patients was inoculated into Godofu and

left at 29•Ž. The number of cells was increased to about 102, 105, and 105, and 108 CFU/ml after 6, 12

and 24 hrs of standing, respectively.

Patients probably ingested Godofu contaminated by multified bacteria.

The route of contamination into the causative food could not be elucidated, but contamination of

EIEC to the water tank used for harding tofu was suspected.

感染症学雑誌 第66巻 第6号