ENZIMOINMUNOENZAYO

ENZIMOINMUNOENZAYOEl enzimoinmuniensayo es una tecnica versatil y muy sensible, que puede utilizarse para detectar y medir tanto Ag como Ac. Los conjugados que se emplean tienen como marcadores a diversas enzimas. Las enzimas mas utilizadas son la peroxidasa, la fosfatasa alcalina y la galactosidasaEsta tcnica recibe diferentes nombres de acuerdo al soporte sobre el que se realiza; cuando es en placa se denomina ELISA, sobre tejido, inmunohistoquimica y sobre celulas inmunocitoquimica.

ELISADel ingles enzyme-linked inmunosorbent assay.La prueba se realiza en placa de plstico (poliestireno de 8 x 12 cm que contiene 96 pocillos, cada uno de aprox. 1 cm de profundidad y 0.7 cm de diametro.Existen muchas variantes de ELISA y su diseo depende de lo que se quiera determinar.El mas utilizado es el ELISA indirecto que se usa para determinar la presencia de Ac en una muestra problema, utilizando como conjugado un Ac anti-Ig marcado con una enzima.Los ELISA directos se usa para determinar Ag.Los Ag se pueden determinar con ELISA de tipo sandwich (o captura) y competitivas

ELISA

ELISAPara detectar la presencia de este conjugado, se agrega a la reaccin un sustrato especifico de dicha enzima sobre su sustratoSi luego de la reaccin inmunologica y los posteriores lavados. El reactivo marcado permanace unido a la fase solida, al agregar la mezcla de sustrato-cromogeno la enzima actuara sobre su sustrato, modificandolo y este producto inducira a un cambio de color en el cromogeno soluble sobrenadante

ELISALa intensidad del color es directamente proporcional a la cantidad de anti-Ig marcada que se haya captado, y esta a su vez sera proporcional a la cantidad de Ac que se encuentren en la muestra problema.La intensidad del color se puede estimar a simple vista (cualitativo), o lo que es ms adecuado, mediante espectrofotometria, expresandose como densidad optica

ELISA CUALITATIVO Y CUANTITATIVOCUALITATIVO

Para determinar presencia o ausencia de Ag o AcCUANTITATIVO

Determinar la cantidad de AcTitulo

TCNICAS DE ELISAAnalisis Competitivos

Conjugado Ag-EnzimaConjugado Ac marcado con EnzimaAnalisis No Competitivos

SandwichIndirecto para medir Ac

EQUIPOSEstufa calor seco 37CPipetas AutomaticasLavador de ElisaLector de Elisa

ELISA INDIRECTOELISA indirecto que se usa para determinar la presencia de Ac en una muestra problema, utilizando como conjugado un Ac anti-Ig marcado con una enzima.

ELISA INDIRECTO

ELISA INDIRECTO

ELISA DE CAPTURA O SANDWICHEste tipo de ELISA puede utilizarse tanto para la deteccin de Ag como la de Ac.

ELISA COMPETITIVOEste tipo de ELISA puede utilizarse tanto para la deteccin de Ag como la de Ac.En el ejemplo. Se basa en la competencia por la unin con el Ac de captura entre el Ag de la muestra y el Ag marcado con enzima. Y el cambio de color es inversamente proporcional a la concentracin de Ag de la muestra

Tipos de Ac usados en ELISAAc Policlonales, obtenidos a partir del suero de animales inmunizados con el Ag de interesAc monoclonales, es decir obtenidos por un unico clon de clulas plasmaticas, por lo tanto con unica especificidad.Anticuerpos anti-inmunoglobulinas, obtendos por inmunizacin con Ig de una especie determinada en un animal de otra especie. Ejm Ac generados en conejo anti-IgG bovina

CUT OFFSignificado del concepto de Valor de corteValor limite entre un resultado Positivo y Negativo o Reactivo y No ReactivoCO=CN+0.300 (Valor va a depender de la Pba a detectar)Zona Gris: +/- 10%CO

FALSOS POSITIVOSReaccin cruzadas entre Ac con especificidades similares

Enfermedades autoinmunesEmbarazadasPresencia de virus con Epstein Barr, gripe, etcContaminacin cruzadas entre muestrasDeterioro de los reactivosErrores tcnicos

FALSOS NEGATIVOSPacientes no han generado los Ac en estudioLos Ac de la muestra no tiene especificidad contra los Ag de la prueba o viceversaDeterioro de los ReactivosErrores tcnicos

APLICACIONES CLINICASDiagnostico de infecciones por microorganismos (viral, bacteriano, parasitario, etc) al detectar la presencia de Ag del agente infecciosoConfirmacin de la presencia de Ac, puede ser Ac contra cualquier microorganismo (viral, bacteriano, parasitario, etc), inclusive vacunas, autoanticuerpos, etcCuantifiaccin de metabolitos: hormonas, medicamentos, marcadores tumorales, Inmunoglobulinas, etc.