平成28年度第6回がん検診細胞診・組織診従事者講習会

弘前大学大学院・保健学研究科

渡邉 純

平成２９年３月2日（木） 高崎

子宮内膜および頸部の組織・細胞診のトピック

本日の講演内容Ⅰ．子宮内膜組織・細胞診

１．子宮内膜癌の将来予測

２．不規則増殖期内膜と増殖症の鑑別は可能か？

３．異型のない増殖症と異型増殖症の鑑別は可能か？

４．子宮内膜液状化検体細胞診 (Liquid-based cytology:LBC)

Ⅱ．子宮頸部組織・細胞診

１．WHO新分類 (2014) の変更点

２．HPV検出法

１．子宮内膜癌の将来予測

性ステロイドホルモン標的臓器の腫瘍

アンドロゲンと前立腺癌

エストロゲン、プロゲステロンと乳癌

エストロゲンと子宮内膜癌（類内膜腺癌）

2. 不規則増殖期内膜と増殖症の鑑別は可能か？

子宮体癌取扱い規約 第3版 (2012)

子宮内膜類内膜癌の多段階発癌モデル

Normal

EM

Hyperplastic

EM

Hyperplasia

異型なし 異型ありG1 G３

正常内膜 内膜増殖症 類内膜腺癌 類内膜腺癌過形成性内膜

hMLH1メチル化3% hMLH1メチル化50%

PTEN変異30%

hMLH1メチル化50%

K-ras変異15% K-ras変異30%

p53変異10%

PTEN変異50%

p53変異 50%

β-catenin変異15% β-catenin変異40%

HER2変異25%

PIK3CA変異 30％PIK3R1変異 20-40%

その他の癌（抑制）遺伝子

エストロゲン高値の持続

ARDA1A変異40%

• 組織診（生検）：腺管の量的な差であり、厳密に区別するのは困難

• 細胞診：ゴールドスタンダードの組織診でさえ厳密に区別するのが困難であり、細胞診ではなおさら困難

2. 不規則増殖期内膜と増殖症の鑑別は可能か？

子宮体癌取扱い規約 第3版 (2012)

３．異型のない増殖症と異型増殖症の鑑別は可能か？

3. 異型のない増殖症と異型増殖症の鑑別は可能か？

子宮体癌取扱い規約 第3版 (2012)

• 細胞異型で異型のない増殖症と異型増殖症は鑑別できる可能性がある。

ただし、厳密に区別するのは困難な症例がある

• 内膜細胞診の今後の目標（私見）

細胞異型と構造異型を有する腫瘍性病変

(すなわち異型増殖症以上）を拾い上げること

が肝要

3. 異型のない増殖症と異型増殖症の鑑別は可能か？

４．子宮内膜液状化細胞診（内膜LBC)

• ThinPrep法

• SurePath (Thinlayer) 法

• TACAS法

液状化検体細胞診Liquid based cytology（LBC) とは

・細胞診材料を直に液体中に回収、固定・保存し、薄い層に吸着させる方法.・一度の細胞採取により複数の標本の作製が可能.

（免疫染色、遺伝子検査）・細胞の有効活用 （HPVなど他検査へ応用可能）．

++ + ++ +++++

SurePath法の原理

1. 遠心分離により、診断に支障をきたす赤血球、粘液残骸、白血球が分離。

2. スライドコート剤でスライド表面は“＋”に荷電。

3. 細胞蛋白成分は“ー”に荷電。4. 沈渣を添加すると、 “＋” “ー”の荷電と細胞の重力により比重の重い細胞（異型細胞が想定）から自然沈下してスライド表面に吸着。（重力沈降法）

5. 細胞は吸着できる空きスペースに吸着。

SurePath法の利点

１．観察容易、検鏡時間の短縮（１分程度）

２．不適正標本がなくなり診断精度の向上

３．採取細胞のｌｏｓｓが減少

４．感染症とコンタミのリスク軽減

５．同じカテゴリーの均一な複数標本作成可能、

他の検査へ応用可能

６．長期保存可能、保存状態良好

SurePath法の欠点

１．背景が十分に反映されにくい傾向

２．希釈の誤り

３．細胞径、核径がややコンパクト

４．コストが高い

５．標本作成に手間と時間 (用手法）

６．検体容器の保存場所が必要

内膜LBCと従来法との所見の相違

LBC法は

１．細胞集塊数が多く収集され、かつ、集塊のほつれや集塊の重積性などの構造異型が保持される。

２．細胞集塊を構成する細胞数が少なく、面積も小さい。

３．核面積、核小体面積とも小さいが、N/N比は高く、

核小体は明瞭化する。

従来法（エンドサイト法）との相違

• 背景：

１） 検鏡に支障をきたす余分な背景(赤血球、粘液など）が

省かれので観察が容易。

２) 従来標本に比べ背景が十分に反映されにくい傾向があ

り、若干の経験が必要。

従来法（エンドサイト法）との相違

• 出現形式：

１） 細胞集塊の数は多いが、小型化。

２）集塊の辺縁は全体に丸みを帯びており、かつ、

洗浄されてきれいになり最外層核の観察が容易。

３） 重積集塊内の腺腔や個々の細胞も幾分観察が容易。

４） 明細胞腺癌ではミラーボールパターンが出現。

従来法（エンドサイト法）との相違

細胞形態 ：小型化。

細胞質 ：染色性に変わりなし。

核 ：小型化。

クロマチン：淡明化。

核小体 ：クロマチンがやや淡明化した分、明瞭化。

免疫染色 ：余分な背景が除去され、また重積性が軽度で、

評価が容易。

腺の構造異型と細胞像

構造異型 細胞像

• のう胞化 拡張腺管

• 間質内芽出・分岐 偽乳頭状

• 乳頭状 乳頭状、樹枝状

• Back to back、cribriform 腺密集増殖

本日の講演内容Ⅰ．子宮内膜組織・細胞診

１．子宮内膜癌の将来予測

２．不規則増殖期内膜と増殖症の鑑別は可能か？

３．異型のない増殖症と異型増殖症の鑑別は可能か？

４．子宮内膜液状化検体細胞診 (Liquid-based cytology:LBC)

Ⅱ．子宮頸部組織・細胞診

１．WHO新分類 (2014) の変更点

２．HPV検出法

LEGH

• 好発部位：子宮頸部体部側(内子宮口付近）

• 組織像：嚢胞状に拡張した大型腺管の周囲

に小型内頸部腺が分葉状増生

• 細胞像

①シート状、②細胞質粘液黄金色、③核は基底側

④核異型乏しい、⑤核分裂像の欠如

• 胃型粘液（中性ムチン）

パパニコロウ染色：黄金色（LBCでは認識困難傾向）

特殊染色：PAS(+), Al-blue(±)

免疫染色：HIK1083(+), MUC6(+)

• HPV (rare)

MDA• 頸部腺癌全体の１－３％

• 好発部位：SC junctuin• 組織像 Mucinous type (Ｓｕｂｔｙｐｅ:Endometrioid, Clear cell)

１．正常頸管腺と区別困難な腺管からなる腺癌

２．①腺の乱雑な配列（ヘアピンループ状、鋭角的屈曲）

②正常の深さを超える深い浸潤（5ｍｍ超）、③間質反応

④少なくとも一部に核異型、⑤核分裂・アポトーシス像

• 細胞像

①細胞質粘液黄金色、②核偽重層化、③配列乱れ

④核異型、(粘液多い割に）円形、立体・緊満感、核小体

---------腺癌としての異型を見出す

⑤核分裂• 胃型粘液（中性ムチン）

パパニコロウ染色：黄金色

特殊染色：PAS(+), Al-blue(±)

免疫染色：HIK1083(+), MUC6(+), CEA(focal+), ER(-), PR(-), p16(-)

• HPV （rare）

Mucinous adenocarcinoma

gastric phenotype• 組織像：細胞質豊富,淡明・境界明瞭・高度腺癒合• 細胞像

①細胞質粘液黄金色、②核重層化、③配列乱れ

④核異型---------腺癌としての明らかな異型あり⑤核分裂像

• 胃型粘液（中性ムチン）パパニコロウ染色：黄金色特殊染色：PAS(+), Al-blue(±)

免疫染色：HIK1083(+), MUC6(+)

• HPV(rare)

発癌経路モデル

正常頸管腺

幽門腺化生

MDA AC,gLEGH

AIS

STK11遺伝子変異(P-J synd.)

3q gain, 1p loss

HPV High risk感染

内頸部型粘液腺癌

AIS,g

鑑別診断ー細胞像LEGH

①細胞質粘液黄金色、②シート状、③核は基底側

④核異型乏しい、⑤核分裂像の欠如

AIS g・MDA

①細胞質粘液黄金色、②核偽重層化、③配列乱れ

④核異型--------腺癌としての異型を見出す、⑤核分裂像

AC, g

①細胞質粘液黄金色、②核重層化、③配列乱れ

④核異型---------腺癌としての明らかな異型あり

⑤核分裂像

免疫染色

EC LEGH AIS,g MDA AC, g AIS AC, EC

HIK1083 - + + + - -MUC6 - + + + - -CEA - ± ± ± + +p16 - - - - + +HPV - - - - + +Ki67 - low middle highhigh high

まとめ

１．細胞質粘液黄金色は胃幽門腺粘液（中性粘液）を想起

２．構造異型と核異型の有無で良悪を鑑別

３．腺癌としての異型が明らかであれば、

AC, gastric phenotypeの可能性も考慮

胃幽門腺化生 ・ LEGH

AIS,g ・ MDA ・ AC, g

• ジェノタイピング法

近年開発されたreverse line-blot array (linear-

array, LA)での HPV遺伝子型検出方法では、子宮頸部に感染する39種類のHPV遺伝子型が検出可能。

• In situ hybridization法

高感度の非放射性標識プローブを用いたin situ

hybridization (ISH)ではHPVの局在と感染様式を検出可能。

今回紹介する方法

１）検体採取部位；子宮頸部

採取器具；Cervex-Brush COMBI (Rover, MBL)

Cytobrush (Medscand Medical)

固定保存液；SurePath® Preservative Fluid

採取器具に残った細胞を浮遊させ固定。

固定された検体は、室温保存で4週間、

冷暗所保存で6ヶ月保存可能。

Cervex-Brush

COMBI

Cytobrush

SurePath®

Preservative

Fluid

[検体採取法と保存]

2）DNA抽出

アンプリリュートリキッドメディア抽出試薬セット（Roche Diagnostics, MBL）を用いて抽出した。

3） PCR

アンプリコアリニアアレイHPVジェノタイピングキットを使用。

・標的遺伝子型（39種類）

高リスク群：16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68

低リスク群：6, 11, 42, 43, 44

リスク不明群：26, 40, 53, 55, 54, 61, 62, 64, 66, 67, 69, 70, 71, 72, 73,

81,82, 83, 84, CP6108, and IS39

・Internal Controlとしてβ-globinを同時に増幅

4）ハイブリダイゼーション

アンプリコアリニアアレイ検出用試薬セットを使用し、PCR産物とHPVに特異的なプローブをナイロンメンブレン上でハイブリダイゼーションした。

LINEAR ARRAY HPV Genotyping Testのアウトライン

ストレプトアビジン

ビオチン

ナイロンメンブレン

プローブ

GT 16GT 18

GT 45

Numerical

order

of genotypes

Reference

Line

Low Globin

High Globiｎ

Step2. ターゲットDNAをPCRにより増幅

Step3. PCR産物とHPV特異的なプローブをナイロンメンブレン上でハイブリダイゼーション

Step4. 目視による結果判定

Sample量

250μℓ

資料提供 ロシュ・ダイアグノスティックス社

・HPVのL1領域をPGMYプライマーにて増幅

・Internal Controlとしてβ-globinを同時に増幅

Step1.サンプル調製（DNA抽出）

所要時間約2～3時間 所要時間約３時間

所要時間2.5～3時間

58

58

68

35

52

51

CP6108

16

51

(-)16 16

• ハイブリダイゼーション判定例

各HPV遺伝子型のHPV感染率

HP

V

感染率

HPV 遺伝子型

0%

10%

20%

30%

40%

16 52 58 31 18 51 33 39 53 68 61 66 82 35 56 71 54 62 70 6 81 42 45 11 26 40 59 67 69 84

複合感染

単独感染

CP

6108IS39

26.4

79.5 7984.9

91.4

62.5

1.9 2.3 4.8 0.9 0 0

11.3

22.712.9 10.4 7.1

12.5

0

20

40

60

80

100

normal CIN1 CIN2 CIN3 SCC AC

n=53 n=44 n=62 n=106 n=70 n=16

highrisklowriskunspecified

Po

sitiv

e r

atio

(%

)

各リスクごとのHPV感染率

低リスク群の単独感染は子宮頸部病変からは認められなかった。

単独感染で認められたリスク不明群のHPVのうちわけ。

SCC(2例)：66型(1例)、70型(1例)

CIN3(3例)：62型(1例)、71型(1例)、82型(１例)

CIN2(1例)：82型(1例)、

CIN1(2例)：54型(1例)、62型(１例)

in situ hybridization (ISH)

対象：HPV16型がLA法で検出された55症例CIN1: 2, CIN2: 8, CIN3: 22, 扁平上皮癌: 21，腺

癌: 2

使用プライマー：HPV16型特異的プライマー(DAKO, Kyoto, Japan)

・ISH判定の実際

B: Punctate パターン： SCC (×200)A: Diffuse パターン： CIN 2 (×200)

Evans (2002)による50症例の検討では、ISHにおいて

● diffuse パターン：HPV-DNAがepisomalに存在● punctate パターン：HPV-DNAがintegrate（宿主細胞に取り込まれている）

Signal types CIN1 (%) CIN2 (%) CIN3 (%) SCC (%) AC (%)

D 1 (50) 3 (37.5) 9 (40.9) 1 (4.8) - -

D+P - - - - 2 (9.1) 5 (23.8) - -

P - - 1 (12.5) 6 (27.3) 13 (61.9) 1 (50)

Negative 1 (50) 4 (50) 5 (22.7) 2 (9.5) 1 (50)

Total number 2 (100) 8 (100) 22 (100) 21 (100) 2 (100)

D: diffuseパターン P: punctuateパターン

13

1

7

13

0

2

4

6

8

10

12

14

CIN SCC

Diffuse

Punctate

•Diffuseパターンは子宮頸部異形成で、punctateパターンは扁平上皮癌で多く認められた。

ISHより

●Punctateパターンは子宮頸癌から多く検出

↓16型のHPV-DNAが

episomalに存在していれば良好な経過integrateしていると前癌状態から癌化の可能性

遺伝子型+感染様式リスクの予想が可能となる事が示唆

結論

1. 本邦の子宮頸部病変では、HPV16、52、58、31型の順に高頻度に認められた。

2. いくつかのリスク不明型(66型、70型など）が高リスクである可能性が示唆された。

3. 子宮頸部病変の遺伝子型と感染様式を検出することで、リスクの予想が可能となることが示唆された。

本日の講演内容のまとめ１Ⅰ．子宮内膜組織・細胞診１．子宮内膜癌の将来予測

●子宮内膜癌は増加する。

２．不規則増殖期内膜と増殖症の鑑別は可能か？

●細胞診で不規則増殖期内膜と増殖症を厳密に区別するのは困難である。

３．異型のない増殖症と異型増殖症の鑑別は可能か？

●細胞異型で鑑別できる可能性がある。

●細胞異型と構造異型を有する腫瘍性病変 (異型増殖症以上）を拾い上げることが肝要である。

本日の講演内容のまとめ２

Ⅰ．子宮内膜組織・細胞診４．子宮内膜液状化検体細胞診 (Liquid-based cytology:LBC)

●内膜LBC法に特徴的な細胞像を理解した上で鏡検することで、内膜LBC法は有用な方法である。

●内膜LBCの免疫染色により予後因子判定が可能

本日の講演内容のまとめ３Ⅱ．子宮頸部組織・細胞診

１．WHO新分類 (2014) の変更点

●粘液腺癌、胃型が追加された。

２．HPV検出法

●本邦の子宮頸部病変では、HPV16、52、58、31型の順に高頻度に認められた。

●いくつかのリスク不明型(66型、70型など）が高リスクである可能性が示唆された。

●子宮頸部病変の遺伝子型と感染様式を検出することで、リスクの予想が可能となることが示唆された。