物質創成科学研究科 池田 篤志

２０１０・７・２６ 新技術説明会（東京）

光アンテナ-フラーレン二元系を用いる光がん治療薬

1

フラーレン（C60）

フラーレン 炭素のみからなるサッ

カーボール状の物質

•電子を受け取りやすい•電子を放出しやすい

•超伝導材料•導電性材料•半導体材料•生理活性材料

C60のトルエン溶液C60の結晶

特 徴

機 能

2

フラーレン（C60）を水に溶かす ーその意味ー

生体内への応用

DNAの光切断 HIVプロテアーゼの阻害

化粧品への応用 ー 活性酸素除去作用三菱商事が研究開発会社「ビタミンC60バイオリサーチ」を設立

（２００３年７月）

水に溶かすことにより

光がん治療

がん細胞

3

１．合成化学的手法

２．超分子化学的手法

二重結合の減少

性能の劣化

可溶化剤の使用

弱い相互作用を利用

水溶性置換基の導入

これまでの C60の水溶化法

4

高速振動粉砕法による γ-CDx2・C60/70錯体の調製

メノウボール

γ−シクロデキストリン（γ-CDx） HSVM1800 rpm

20 min

水による抽出

C60/70

均一溶液

γ-CDx2·C60 /70 錯体

高速振動粉砕法(HSVM)による調製O

OH

HO OH

O OO

OH

HO OH

O

OH

HO OH

高速振動粉砕機（Retsch）

機能化が難しい

安定性が低い

問題点

短時間で作製できる

高濃度（数mM）で溶解

K. Komatsu, K. Fujiwara, Y. Murata, T. Braun, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1999, 2963.

5

ドラッグキャリヤーとしてのリポソームの利用

リポソームを用いる利点

• 不溶性薬剤を取り込むことができる

• 生体適合性が高い

• 機能化が容易

• 粒径制御が容易

内水相

脂質膜

疎水性薬剤

親水性薬剤

脂質分子＋薬物の有機溶媒

乾燥

超音波照射

薄膜 薬物含有リポソーム水溶液

水

従来の方法 －事前混合法

問題点：薄膜作製時に薬剤が会合する 可溶化能が低い6

+ 混合 80℃

2 時間

交換反応法による C60含有リポソームの調製

γ-CDx2·C60 錯体

O

OH

HO OH

O OO

OH

HO OH

O

OH

HO OH

γ-CDx

2n + n +

リポソーム C60含有リポソーム

80℃

2 時間

反応スキーム

A. Ikeda, T. Sato, K. Kitamura, K. Nishiguchi, Y. Sasaki, J. Kikuchi, T. Ogawa, K. Yogo, T. Takeya, Org. Biomol. Chem., 3, 2907–2909 (2005). A. Ikeda, Y. Doi, K. Nishiguchi, K. Kitamura, M. Hashizume, J. Kikuchi, K. Yogo, T. Ogawa, T. Takeya, Org. Biomol. Chem., 5, 1158-1160 (2007).

実際の操作

7

γ-CDx2·C60 錯体 リポソーム

熱

イメージ

30%C60含有リポソームのcryo-TEM交換反応法により準備したC60含有リポソーム

交換反応法と事前混合法の比較

8

[C60]/[脂質] 安定性 粒径制御

交換反応法 ◎ ◎ ◎30%以上 1か月以上安定 エクストルーダー使用可能

事前混合法 △ × △（従来法） 4%以下 2週間以内に沈澱 超音波のみ

交換反応による C70含有リポソームの調製

γ-CDx2·C60 錯体

O

OH

HO OH

O OO

OH

HO OH

O

OH

HO OH

γ-CDx

2n + n +

リポソーム C60含有リポソーム

80℃

2 時間

C60

A. Ikeda, Y. Doi, M. Hashizume, J. Kikuchi, T. Konishi, J. Am. Chem. Soc., 129, 4140-4141 (2007).Y. Doi, A. Ikeda, M. Akiyama, M. Nagano, T. Shigematsu, T. Ogawa, T. Takeya, T. Nagasaki, Chem.-Eur. J., 14, 8892–8897 (2008).

O

OH

HO OH

O OO

OH

HO OH

O

OH

HO OH

γ-CDx

2n + n +

C70含有リポソーム

30℃

＜ 1 分γ-CDx2·C70 錯体

C70

リポソーム

9

交換反応法

１．非常に操作が簡便である

２．リポソーム以外の様々な材料に適用できる

（例えば、高分子ミセル、細胞、など）

・臓器が温存できる

・患者への負担が少ない

光線力学治療法（PDT）

光照射

がん腫瘍

がん等の光線力学治療薬

光増感剤（ PDT 薬剤）

48～72時間後

10

N

NH

NHN

NaOOC(CH2)2 CH3

NaOOC(CH2)2

H3C

R CH3

CHO

CH3

CH3

N

NH

NHN

NaOOC(CH2)2 CH3

H3C

(CH2)2

NaOOC(CH2)2 CH3

CH3

CHO

CO

N

NH

NHN

H3C (CH2)2COONa

H3C

CH

H3C R

CH3

(CH2)2COONa

CH3

CH3

nn = 0-6

R = CHHOCH3

CH CH2orフォトフリン（ポルフィマーナトリウム）

PDT薬剤

1PDT薬剤* 3PDT薬剤*

項間交差

レーザー光（可視光）

1O2

3O2

細胞死

PDTのメカニズム

[60/70]フラーレン(C60/70)

特徴：高い 1O2発生効率

問題点：水溶化しない

可視領域の吸収が小さい

10

HeLa細胞を用いた実験

HeLa 細胞

可視光照射（> 350 nm）

24時間静置

HeLa細胞C60 含有リポソーム

位相差像

ヘキスト染色

ヨウ化プロピジウム染色

全細胞を染色 死細胞を染色

細胞致死率

細胞致死率

８５％

11

C60を用いた光線力学治療薬

Chemical Biology で紹介される

C60含有リポソーム

ガン細胞の死滅

OBC誌 2007年 8巻 表紙

新しいガン治療薬

12

C70を用いた光線力学治療薬

Chem.-Asian. J.誌 2009 年 1巻 表紙

13日経産業新聞 2007年3月26日他

C60含有リポソームの吸収スペクトル

LMIC60

長波長であるほど皮膚透過性が高い

光線力学治療法において使用されるレーザー波長は600～700 nm である

しかし、 600～700 nmの吸収がほとんどない

逆に言うと、400 nm 以上の

光の照射ではあまり光毒性がない

Abs

orba

nce

14

光捕集部位と活性部位の分離ー２元系の利用

15

光捕集部位ー活性部位の２元系

２元系にすることによって

１．光捕集部位の選択で皮膚透過性の高い長波長の光を用いることができる？

２．PDTの大きな問題である光線過敏症を解決できる？３．化合物の自由度が広がる － ・レーザー光源の波長にあった光捕集部位

を選択できる

・機能化が容易となる

従来のPDTのメカニズム

PDT薬剤

1PDT薬剤* 3PDT薬剤*

項間交差

レーザー光（可視光）

1O2

3O2

細胞死

ひとつの分子

が光捕集とエ

ネルギー供与

体をまかなっ

ている

光捕集部位ーC60二元系への展開

16

リポソーム

C60 の問題点

可視光領域、特に600～700 nmの吸収が非常に弱い

光捕集部位を導入

可視光領域に吸収を持つ蛍光試薬を利用

3O21O2*

可視光

エネルギー移動

光捕集部位

光捕集部位-C60二元系の可視-紫外吸収と蛍光スペクトル

N+

CH3H3C

(CH CH)2 CHN

CH3H3C

(CH2)17(CH2)17

CH3 CH3ClO 4-

光捕集部位

C60 DiD C60-DiDDiD λmax = 644 nm

200 300 400 500 600 700 800 9000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Abs

orba

nce

Wavelength / nm

吸収スペクトル

C60含有リポソーム

C60-DiD含有リポソーム

DiD含有リポソーム

640 660 680 700 720 740 760Wavelength / nm

DiD含有リポソーム

C60-DiD含有リポソーム

蛍光スペクトル

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HeLa細胞

PBS による洗浄24時間静置

HeLa細胞を用いたPDT活性評価

18

可視光照射（620-740 nm

9 mW cm-2）

培地の交換

25℃，30分照射

C60-DiD含有リポソーム

細胞生存率

/%

LiposomeC 60 DiD

C 60-D

iDLiposo

meC 60 DiD

C 60-D

iD暗所

可視光照射(620 nm以上)

WST-8アッセイ

0

20

40

60

80

100

Cel

lvia

bilit

y/%

120

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0[DiD] / M

既存光線力学治療薬との比較

N+

CH3H3C

(CH CH)2 CHN

CH3H3C

(CH2)17(CH2)17

CH3 CH3ClO 4-

光捕集部位

DiD λmax = 644 nm

細胞生存率ーC60-DiD 含有リポソーム

光照射

19

細胞生存率ーフォトフリン

暗所

0

20

40

60

80

100

120

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0[Porphyrin unit] / M

光照射

暗所

N

NH

NHN

NaOOC(CH2)2 CH3

NaOOC(CH2)2

H3C

R CH3

CHO

CH3

CH3

N

NH

NHN

NaOOC(CH2)2 CH3

H3C

(CH2)2

NaOOC(CH2)2 CH3

CH3

CHO

CO

N

NH

NHN

H3C (CH2)2COONa

H3C

CH

H3C R

CH3

(CH2)2COONa

CH3

CH3

n R = CHHOCH3

CH CH2or

フォトフリン（ポルフィマーナトリウム）

光線力学治療法（PDT）

PDT における光線過敏症の問題

光照射

がん腫瘍

48～72時間後

20

退院光線過敏症：強い光を浴びると残留したPDT薬剤が活性酸素を発生し組織を痛める

１週間程度、暗所にてPDT薬剤の代謝を待つ必要がある

患者にとって大きな負担

１週間暗所

光細胞毒性低

時間

光線過敏症の問題解決への戦略

光

活性酸素

光細胞毒性高

リポソームの崩壊

21

リポソーム崩壊 光捕集部位と活性部位間の距離が遠くなる

エネルギー移動が起こらなくなる

大前提：光捕集部位、活性部位それぞれ単体では光毒性が低い（証明済み）

細胞生存率

/%

LiposomeC 60 DiD

C 60-D

iDLiposo

meC 60 DiD

C 60-D

iD

暗所可視光照射

(620 nm以上)

まとめ 光捕集部位ーC60二元系

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ガン細胞

可視光

リポソーム

1O2*1O2*

細胞死

1O2*

C60 の問題点

可視光領域、特に600～700 nmの吸収が非常に弱い

光捕集部位を導入

可視光領域に吸収を持つ蛍光試薬を利用

3O21O2*

可視光

エネルギー移動

DiD

in vivo における利用に向けて、がん腫瘍に二元系を高効率で運ぶた

めのドラッグキャリヤーが必要

実用化に向けた課題と企業への期待

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実用化に向けた課題

企業への期待

光捕集部位ーC60二元系は

中身（PDT薬剤）のお話し

・当研究室でも検討開始

・市販のドラッグキャリヤーでもよい

・リポソーム以外のドラッグキャリヤー

でもよい

・がん指向性の高いドラッグキャリヤーの提供のお願い

・治験に向けた共同研究

・PDT以外の利用の検討

国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学産官学連携推進本部ＴＥＬ 0743-72-5930ＦＡＸ 0743-72-5194e-mail k-sangaku@ad.naist.jp

知的財産権と問い合わせ先

本技術に関する知的財産権

産学連携の経歴

お問い合わせ先

発明の名称：光線力学的治療に利用可能な脂質膜およびその利用出願番号： PCT/JP2009/059737公開番号： WO/2009/145243出願人 ：国立大学法人奈良先端科学技術大学院大学発明者 ：池田篤志、秋山 元英

共同研究、研究会参加、連携セミナー出展、技術顧問など

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