Đ Ạ I H Ọ C T H Á I N G U Y Ề N

T R Ư Ờ N G Đ Ạ I H Ọ C N Ô N G L Â M

Đ Ô N Ă N G V Ị N H ( C h ủ b i ê n ) - N G Ô X U Â N B Ì N H

NHÀ XUẤT B Ả N N Ô N G N G H I Ệ P

Đ Ạ I H Ọ C T H Á I N G U Y Ê N

T R Ư Ờ N G Đ Ạ I H Ọ C N Ồ N G L Â M

Đ Ỗ N Ă N G V Ị N H ( C h ủ b i ê n )

N G Ô X U Â N B Ì N H

G I Á O T R Ì N H

C Ô N G N G H Ệ S I N H H Ọ C

Đ A I C Ư Ơ N G

N H À X U Ấ T B Ả N N Ô N G N G H I Ệ P

H À N Ộ I - 2008

M Ở Đ Ầ U

Công nghệ thông tin và công nghệ sinh học (CNSH) là hai lĩnh vực công nghệ ưu tiên phát triển ở hầu hết các quốc gia trên thế giới. Nhiều học giả đã dự báo sức mạnh to lớn của CNSH đối với cải tạo sinh giới, trong đó có bản thân con người. Vai trò của CNSH đối với phát triển kinh tế và y học, đối với an sinh xã hội và hệ sinh thái trên trái đất đang ngày càng mạnh lên cùng với sự tích lũy nhanh chóng của tri thức về các quá

trình sống. Nhiều câu hỏi lớn liên quan đến phát triển công nghệ sinh học đang đặt ra:

Ì. Lịch sử hình thành và phát triển của công nghệ sinh học?

2. Công nghệ sinh học là gì? Công nghệ sinh học bao gồm những ngành khoa học và công nghệ nào?

3. Quan hệ giữa CNSH với các ngành khoa học tự nhiên, khoa học xã hội khác?

4. Các kiến thức cơ bản của công nghệ sinh học?

5. Vai trò khám phá bản chất sự sống và khả năng cải tạo sinh giới của CNSH?

6. Vai trò của công nghệ sinh học đối với phát triển kinh tế- xã hội và ngược lại vai trò của kinh tế- xã hội và chính sách quốc gia dối với phát triển CNSH?

7. Hiện trạng và dự báo phát triển công nghệ sinh học trên thế giới và ỏ nước ta?

8. Định hướng phát triển công nghệ sinh học ở nước ta?

Một trong các nhiệm vụ của quyển sách này là đặt ra những câu hỏi, đồng thời cùng sinh viên và người đọc tìm ra câu trả lời các câu hỏi mang tính tổng quát trên.

Hiện nay, nền kinh tế toàn cẩu đang trải qua những thách thức ngày càng lớn. Đố là

sự phát triển nóng của các nền kinh tế, nhất là ở Trung Quốc, An Độ, Brasiỉ, Nga vá các

nước Đông Nam Á trong đó có Việt Nam, đòi hỏi sự gia tăng khai thác và sử dụng năng

lượng. Khả năng suy kiệt các nguồn than đá, dầu mỏ, khí đốt là nhãn tiền trong khoảng

30 năm tới. Các quốc gia đông dân như Trung Quốc, An Độ, Nga đang dần trở thành

các nên kinh tế lớn với mức tiêu dùng năng lượng và sản xuất khí thải nhà kính tương tự

như Mỹ hiện nay. Tình hình đó có thể đẩy nhanh quá trình khủng khoảng năng lượng và

môi trường toàn cầu, có thể dẫn đến chiến tranh vì những khoảng không gian sinh tồn và

các nguồn năng lượng. Vấn đề môi trường sinh thái trở thành vấn đề tồn tại hay không

tồn tại? Phát triển hay không phát triển? Phát triển phải như thế nào? Giải pháp phát

triển nào được xem là bền vững trên phạm vi toàn cẩu và cho từng quốc gia? Vai trò của

CNSH đến đâu trong giải quyết các vấn đê trên?

Định hướng và xu thế phát triển của công nghệ sinh học trong tương lai phụ thuộc rất nhiêu vào việc trả lời cho các câu hỏi trên đây.

3

Vai trò của CNSH trong giải quyết các vấn dề an sinh xã hội, vấn đề năng lượng tái sinh và sinh thái bền vững là rất to lớn. Các nhà khoa học trẻ và sinh viên trong lĩnh vực sinh học - nông nghiệp, bên cạnh việc phải có những kiến thức chuyên môn sâu, phải có tầm nhìn rộng lớn hơn, bao quát hơn và định hướng tốt hơn trong hoạt động thực tiễn.

Cuốn "Công nghệ sinh học đại cương" nhằm góp phần cung cấp cho học viên các kiến thức cơ bản về CNSH và vai trò của CNSH đối với thực tiễn, đồng thời gợi ý một số các định hướng và giải pháp phát triển của CNSH trong giai đoạn mới.

Giáo trình được phản công viết như sau:

Đỗ Năng Vịnh - Chủ biên, viết các chương từ ỉ đến lo.

Ngô Xuân Bình - tham gia viết các chương lo và l i .

Vì công nghệ sinh học là một lĩnh vực khoa học rộng lớn, đang phát triển và đổi mới hàng ngày nên quyển sách này khó tránh khỏi có thiếu sót, mong bạn đọc góp ý hoàn thiện.

Chúng tôi xin trân trọng cảm ơn.

N h ó m t á c g i ả

4

Chương Ì

K H Á I N I Ệ M , L Ị C H s ử V À B I Ệ N C H Ú N G P H Á T T R I Ể N C Ủ A

C Ô N G N G H Ệ S I N H H Ọ C

1.1. K H Á I N I Ệ M C Ô N G N G H Ệ S I N H H Ọ C V À Q U A N H Ệ C Ủ A C Ô N G N G H Ệ S I N H

H Ọ C V Ớ I C Á C N G À N H K H O A H Ọ C T ự N H I Ê N VÀ XÃ H Ộ I K H Á C

Công nghệ sinh học (CNSH) là tập hợp các n g à n h khoa học - c ô n g nghệ về sự sống,

bao gồm sinh học phân tử, k ỹ thuật gen, công nghệ t ế bào , công nghệ v i sinh, công nghệ

protein và enzym..., n g h i ê n cứu và khai thác các q u á t r ình sinh học, hoạt động sống của

v i sinh vật, t ế bào động và thực vật , cơ thể sống và m ô phỏng các q u á t r ình sinh học ở

quy m ô sản xuấ t c ô n g nghiệp.

H i ệ n nay CNSH bao g ồ m các loạ i công nghệ và kỹ thuật chủ lực n h ư công nghệ

gen, công nghệ v i sinh vật , công nghệ t ế bào , công nghệ enzym, sinh học phân tử, sinh

hoa học, lý sinh học, đ iều kh iển học, sinh t in học, genom học (genomics), protein học

(proteomics), nano sinh học... Tuy vậy , CNSH k h ô n g ch ỉ đơn thuần là khoa học sinh

học, nó là sự kế t hợp giữa các n g u y ê n lý sinh học v ớ i c ô n g nghiệp sinh học.

CNSH là sự kế t hợp giữa các n g u y ê n lý khoa học và công nghệ trong mộ t h ệ thống

trong đó các cơ thể sống, m ô hoặc t ế bào , cơ quan tử, các phân tử hoặc q u á tr ình sống

được khai thác sử dụng vào sản xuấ t ở quy m ô công nghiệp.

M ỗ i tổ hợp sản xuấ t CNSH bao g ồ m trong n ó các y ế u t ố k h á c nhau:

- Các n g u y ê n lý khoa học và công nghệ.

- H ệ thống các th iế t bị hoặc dây chuyền công nghệ (các th iế t bị n g h i ê n cứu khoa

học và k i ể m soát chấ t lượng, các th iế t bị sản xuấ t n h ư các bioreactor, h ệ thống lên men

vi sinh vật , h ệ đ iều k h i ể n tự động) .

- Các hệ thống sống ở các mức đ ộ tổ chức khác nhau từ p h â n tử, cấu t rúc t rên phân

tử, t ế bào quan, t ế bào , m ô , cơ quan, cơ thể sống, quần thể . . . .

- Các q u á t r ình chuyển đ ổ i vật chấ t và năng lượng nhằm tạo ra các sản phẩm mong

muốn (ví dụ," sản xuấ t các chấ t hoạt t ính sinh học như hormon sinh t rưởng, interĩeron,

kháng sinh, insulin) trên quy m ô công nghiệp.

Sự ra đ ờ i và phá t t r iển của CNSH có quan hệ chặ t chẽ v ớ i sự phá t t r iển của nh iều

ngành khoa học và công nghệ khác nhau. Các m ố i quan hệ đ ó được thể h i ệ n ở các sơ đ ồ

1.1 và 1.2.

5

Tích lũy tri thức toán học.vật lý, hoa học,

các khoa học về trái đất, về không gian...

Cuộc cách mạng công nghiệp lần 1,2 và 3: Công nghiệp điện tử,

chế tạo máy, thông tin, tin học, vật liệu...

Tích tụ tri thức và phương tiện nghiên cứu khoa học sinh học và

khoa học tự nhiên khác

Dự báo Công nghệ sinh học

Dự báo

Công nghiệp sinh học Cuộc cách mạng công nghiệp

sinh học the kỷ XXI

Sơ đồ LI. Công nghệ sinh học ra đời và phát triển như một tất yếu lịch sử

Quan h ệ giữa các n g à n h khoa học thể h i ện quan hệ b i ệ n chứng giữa c á c h ì n h thức

vận động k h á c nhau của vật chấ t và quan h ệ giữa v ậ n động x ã h ộ i và p h á t t r i ể n khoa học

công nghệ. H i ể u b iế t được các m ố i quan h ệ logic đ ó , c h ú n g ta m ớ i c ó c ă n cứ đ ể t ổ chức

hệ thống khoa học và x â y dựng các chương t r ình n g h i ê n cứu p h á t t r i ể n p h ù hợp.

V ậ n động sinh học là tổng hoa của nh iều h ình thức vận động k h á c nhau của vậ t chất

và là kế t quả của vận động vật lý, hoa học, vận động vũ trụ n ó i chung. K h i loà i n g ư ờ i có

k h ả n ă n g thao tác d i t ruyền ở mức p h â n tử và trở t h à n h "đấng s á n g tạo m ớ i " t rong sinh

g iớ i thì vận động sinh học c ò n x ả y ra trong m ố i quan h ệ n g à y c à n g chặ t c h ẽ v ớ i vận động xã h ộ i .

V ì t ính chấ t phức tạp của vận động sinh học, n ê n C N S H ch ỉ c ó t h ể h ì n h t h à n h và

phát t r iển k h i các n g à n h khoa học k h á c đã đạ t đ ế n q u á t r ình t ích l ũ y t r i thức và phương

t i ện ở mức " tớ i hạn" n à o đ ó .

CNSH ngày nay đ a n g đứng t rên nền tảng của c á c khoa học tự n h i ê n k h á c nhau và

thành tựu của các cuộc c á c h mạng c ô n g nghiệp.

Do vậy , m ộ t n h à CNSH chắc chắn phả i c ó t r i thức khoa học tự n h i ê n và k i ế n thức

công nghệ. M ộ t quốc gia m u ố n phá t t r iển c ô n g nghiệp CNSH vững chắc phả i k ế t hợp

được sự phát t r iển các khoa học sinh học v ớ i c ô n g nghệ t i n học, đ i ệ n tử, vật l i ệ u m ớ i và

phải có t ầ m nhìn toàn cầu và t ầ m n h ì n quốc gia v ề k inh t ế , sinh thái và m ô i t rường .

1.2. CÁC NGÀNH KHOA HỌC VỀ sự SỐNG VÀ Mối QUAN HỆ BIỆN CHÚNG

M ố i quan h ệ giữa các khoa học v ề sự sống và các n g à n h khoa học tự n h i ê n k h á c v ớ i CNSH được m ô tả vắn tắ t t rên sớ*đồ 1.2. Sơ đ ồ này cũng t hể h i ệ n quan h ệ giữa t r i ế t học

các khoa học xã h ộ i n h ư ch ính trị , l ịch sử, k inh t ế v ớ i khoa học c ô n g nghệ nó i chung và

v ớ i CNSH nói r iêng . Trên sơ đ ồ này , n g à n h khoa học được p h â n t h à n h 3 l o ạ i h ì n h hay 3

thang bậc khác nhau trong m ố i quan h ệ v ớ i thực t i ễ n :

- Các n g à n h khoa học cơ bản;

6

- Các n g à n h khoa học công nghệ: là sản phẩm của khoa học c ơ bản k ế t hợp v ớ i c ô n g

nghiệp và k inh t ế ;

- Các n g à n h khoa học ứng dụng: là sản p h ẩ m của 2 n g à n h t rên , n ó ch ỉ ra l ĩnh vực đ ờ i sống m à trong đ ó các ngành khoa học và c ô n g nghệ được ứng dụng.

Các ngành khoa học về sự sống

Các ngành khoa học cơ bản

Di truyền học Sinh phân tử Sinh hoa học Sinh lý học Toán sinh học Điều khiển học sinh học Genom học Protein học Tế bào học Mô phôi học Sinh thái học Bệnh học Miễn dịch học

Công nghệ sinh học

Các ngành khoa học - công nghệ

Kỹ thuật di truyền

Công nghệ tế

bào

Công nghệ erưym và protein Công nghệ vi sinh Công nghệ lên men Công nghệ vacxin và chế phẩm dược

CNSH úng dụng

Các ngành khoa học công nghệ

1. CNSH y học: - Công nghệ

vacxin và chế

phẩm dược 2. CNSH nong nghiệp: - Công nghệ vi

nhân giống thực vật

- Công nghệ nhân bản động vật

- Công nghệ tạo giống mới

3. CNSH môi trưòng-sinh thái và năng lượng tái sinh

^ Ị Ị

Khoa học -Công nghệ

Công nghệ điện tử Công nghệ lazer Năng lượng nguyên tử Công nghệ vật liệu Tự động hoa Công nghệ chế tạo máy Công nghệ thông tin Công nghệ nano

Các ngành khoa học tự nhiên khác

Các ngành khoa học cơ bản

- Toán học - Vật lý học - Hoa học - Tin học - Thiên văn

học - Các ngành

khoa học về

trái đất.

Sơ đồ 1.2. Quan hệ biện chứng giữa các ngành khoa học công nghệ

Ì

TRIÊT HỌC KHOA HỌC CHÍNH TRỊ VÀ LỊCH s ử KINH TẾ HỌC

ũ

- Thế giói quan: Quan hệ giữa vặt chất và tinh thần, vật chất và vận động, vật chất và năng lượng, tinh thần là một thuộc tính của vật chất có tổ chức cao. Luận về con

người như một sản phẩm của tự nhiên và dự báo vai trò của CNSH đối với tiến hoa của chính con người.

- Phép biện chứng: Các quy luật phổ biến của vận động vật chất.vận động xã hội và tư duy. Tổng hoa các mối quan hệ tương" tác giữa các sự vật và hiện tượng trong vũ trụ. Vận động sinh học và vận động vũ trụ.

- Nhận thức luận: Các phương pháp nhận thức cơ bản. Thực nghiệm khoa học và thực tiễn khách quan là tiêu chuẩn của chân lý. Vai trò của khoa học trong việc phát hiện các quy luật vận động, từ đó giải thích và dự báo phát triển CNSH trên nền dữ liệu hiện có. Quan điểm hệ thống trong xem xét sự vật.

- Các quy luật phát triển xã hội, quan hệ giữa người với nguôi và xã hội loài người với thiên nhiên.

- Quan hệ giữa chế độ xã hội, tính tiền phong của chế độ xã hội và phát triển khoa học công nghệ. Luật pháp và chính sách phát triển tiên tiến quyết định thành tựu phát triển KHCN và giáo dục ỏ các quốc gia.

- Tác động của khoa học công nghệ lên con người: Phương tiện sản xuất và phương tiện sống - môi trường sống - năng suất lao động - các phương tiện nhận thức của con người. CNSH và tác động của nó lên bản thân con người: tiềm

năng trí tuệ và khả năng sáng tạo, sức khoe, tuổi thọ...

- Vai trò quyết định của KHCN đối với việc giải quyết các vấn đề phát triển kinh tế-xã hội.

- Quan điểm lịch sử trong nhận thức luận khoa học.

- Quan hệ giữa kinh tế

và khoa học công nghệ.

- Đòn bẩy kinh tế đối với phát triển khoa học công nghệ.

- Đòn bẩy khoa học công nghệ đối với phát triển kinh tế.

- Dự báo kinh tế, thị trường, dự báo tương lai quy định định hướng phát triển KHCN ở các quốc gia. Dự báo thị trường Nông nghiệp-Y dược, dự báo môi trường sinh thái quy định định hướng nghiên cứu CNSH.

- Dự báo vai trò quyết

định của CNSH đoi với phát triển nông- lâm -ngư nghiệp - y dược và môi trường sinh thái. Chính sách quốc gia về

phát triển CNSH.

1.2.1. C á c n g à n h khoa học cơ b ả n v ề sự sống

- Di truyền học

- Sinh học phân tử

- T ế bào học

- M ô phôi học

- Sinh lý học

- M i ễ n dịch học và các khoa học k h á c

- Sinh thái học

- D i t ruyền học lý thuyết

Sinh hoa học

Bệnh học

Phỏng sinh học

Đ i ề u k h i ể n học sinh học

T o á n sinh học

Genom học

Protein học

Nano sinh học

V v . . .

Các ngành khoa học cơ bản về sự sống m ớ i nhấ t h i ện nay c ó thể nó i là genom học (genomics) bao g ồ m cấu t rúc, tổ chức và chức năng của từng gen, n h ó m gen, h ệ thống

8

gen, các hệ đ iều h à n h gen. R i ê n g genom n g ư ờ i có chứa đ ế n khoảng 30.000 gen khác nhau, m ỗ i gen l ạ i c ó các hệ đ iều hành phức tạp và nh iều ch iều . M ỗ i gen l ạ i chứa trong nó h à n g t răm đ ế n h à n g ngh ìn các nucleotid vớ i các t r ình tự đặc thù. M ỗ i gen và n h ó m gen l ạ i k è m theo n ó hệ đ iều k h i ể n phức tạp trong m ố i quan h ệ v ớ i các giai đ o ạ n phát t r iển khác nhau của t ế bào , của cá thể và m ô i t rường sống. Do t ính phức tạp n h ư vậy nên genomics chắc chắn sẽ phải trở thành một khoa học độc lập. T ư ơ n g tự n h ư vậy sẽ là

protein học, toán sinh học, đ iều k h i ể n học sinh học và nano sinh học... sẽ dần trở thành các n g à n h học c h u y ê n sâu.

1.2.2. C á c n g à n h khoa học c ô n g n g h ệ v ề sự sống - C ô n g n g h ệ s inh học

Sự phát t r iển của các khoa học cơ bản về sự sống đã và sẽ d ẫ n đ ế n sự ra đ ờ i của các n g à n h Khoa học - Công nghệ của CNSH, trong đ ó bao g ồ m :

- K ỹ nghệ d i t ruyền (genetic engineering).

- C ô n g nghệ t ế bào (cell biotechnology).

- C ô n g nghệ enzym và protein (protein and enzym technology).

- C ô n g nghệ v i sinh (microbiotechnology).

- C ô n g nghệ lên men ( íe rmenta t ion technology).

- Công nghệ vacxin và c h ế phẩm dược (vacxin and biopharmaceutical technology) và các khoa học c ô n g nghệ k h á c .

1.2.3. C á c n g à n h c ô n g n g h ệ s inh học ứ n g d ụ n g

Sự phát t r iển của các khoa học - công nghệ sinh học sẽ tạo ra sự b ù n g n ổ của các l ĩnh vực khác nhau của khoa học CNSH ứng dụng, bao g ồ m :

- CNSH y học: c ô n g nghệ vacxin và c h ế phẩm dược, l i ệ u p h á p gen,...

- CNSH N ô n g L â m N g ư nghiệp: c ô n g nghệ v i n h â n g iống thực vật , c ô n g nghệ nhân bản động vật , CNSH tạo g iống m ớ i , CNSH bảo vệ sức khoe và d inh dưỡng cây trồng, vật nuô i .

- CNSH M ô i t rường - Sinh thái

- CNSH và n ăng lượng sinh học

- CNSH và vật l i ệ u m ớ i

1.2.4. C á c n g à n h khoa học c ô n g n g h ệ t ự n h i ê n

Sự phát t r iển của các ngành khoa học tự nh iên n h ư toán học, vật lý học, hoa học, t in học, thiên văn học và các ngành khoa học về trái đấ t đã tạo ra hàng loạt các n g à n h Khoa học - C ô n g nghệ ( K H C N ) tự nhiên như:

- C ô n g nghệ c h ế tạo m á y

- C ô n g nghệ đ iện tử

- C ô n g nghệ lazer

9

- N ă n g lượng n g u y ê n tử

- C ô n g nghệ vật l i ệ u

- T ự động hoa

- Công nghệ thông t in

- C ô n g nghệ nano và nhiều ngành khác

Các ngành K H C N này đã tạo ra các cuộc cách mạng c ô n g nghiệp, l à m b i ế n đ ổ i t ận gốc các phương t i ện sản xuấ t và phương t i ện nhận thức của loài n g ư ờ i , cũng n h ư l à m

thay đ ổ i toàn bộ đ ờ i sống xã h ộ i . C h ú n g tạo ra những c ô n g cụ k h ô n g thể t h i ếu đ ố i v ớ i sự

phát t r iển của các ngành khoa học về sự sống và tạo t i ền đ ề cho sự ra đ ờ i của C N S H ở

cuố i t h ế k ỷ thứ X X .

Do vậy , muốn phát t r iển CNSH phải h iểu rõ nền tảng, các bước đ i l ịch sử k h ô n g thể th iếu được, xu hướng phát t r iển của CNSH trong m ố i quan h ệ b i ệ n chứng v ớ i k i n h t ế -

xã h ộ i . Công nghệ sinh học là quá t r ình tổng hợp và chuyển hoa c á c t r i thức và k ỹ thuật về sự sống thành công nghiệp sinh học. Công nghiệp sinh học là q u á t r ình sản xuấ t hàng loạt , quy m ô lớn các sản phẩm sinh học bao g ồ m các hoạt chấ t sinh học, vậ t l i ệ u sinh học, sinh k h ố i t ế bào động, thực vật và v i sinh vật (công nghiệp lên men), c á c c h ế

phẩm sinh học (kháng sinh, các enzym, protein, peptid hoạt t ính n h ư in te r í e ron , insul in ,

hormon sinh trưởng v.v. . .) , các vacxin và thuốc chữa bệnh và các cơ t hể sống (hàng t r â m t r iệu cây trồng, vật nuôi ) .

Phải nói t hêm rằng sự phát t r iển của K H C N nói chung và CNSH nói r iêng k h ô n g t h ể tách rờ i sự phát t r iển của tư tưởng t r iế t học và ch ính trị . N g à y nay k h ô n g m ộ t khoa học gia chân chính nào có thể đứng ngoà i k inh t ế , ch ính trị và l ịch sử phá t t r i ể n của quốc gia. Khoa học - Công nghệ đã, đang và sẽ là đòn bẩy vĩ đ ạ i nhấ t đ ố i v ớ i văn m i n h n h â n l o ạ i và t i ến bộ của m ỗ i dân tộc. Khoa học - C ô n g nghệ còn là g i ả i p h á p duy nhấ t đ ể cứu vãn nhân loạ i đ ang rơi vào cuộc khủng khoảng môi t rường sinh thái và n ă n g lượng. M ặ t khác , sự phát t r iển của m ỗ i mộ t ngành khoa học công nghệ m ớ i đ ề u cần đ ế n những quyết sách mạnh m ẽ v ớ i tầm nhìn rộng lớn của các lãnh tụ quốc gia.

Sự trì trệ trong phát t r iển khoa học - công nghệ và g i áo dục của m ộ t d â n tộc trước hết thuộc về t rách nh iệm của lãnh đạo cao nhấ t của quốc gia đ ó . T ổ chức h ệ thống, những cơ chế, ch ính sách quản lý khoa học, công nghệ của nước ta h i ệ n nay hế t sức lạc

hậu, th iếu căn cứ khoa học và tầm nhìn chiến lược. Đ ó là n g u y ê n n h â n quan t rọng l à m khoa học nước nhà đang bị hẫng hụt , th iếu t ính k ế thừa, t ính l ịch sử trong sự phá t t r i ể n

đi lên. N ó đang bị th iếu hụ t t ính hệ thống, t ính n ăng động, t ính mục t iêu và đ ịnh hướng chiến lược.

Nước ta và hầu hết các nước đ ang phát t r iển h i ện nay ở châu Á , châu Phi và M ỹ L a

t inh đ ề u n g h è o nàn, lạc hậu do đã đi sau mộ t l ầ n trong cuộc cách mạng c ô n g nghiệp l ầ n thứ nhấ t và lần thứ hai. Do vậy, chúng ta phải tranh thủ cơ h ộ i đ ể k h ô n g tụ t hậu trong cuộc cách mạng công nghiệp sinh học lần này .

10

1.3. L Ị C H SỬ C Ô N G N G H Ệ SINH H Ọ C VÀ V Ấ N Đ Ể B Ả N C H Ấ T C Ủ A s ự SỐNG

1.3.1. T ó m t ắ t c á c g ia i đ o ạ n p h á t t r i ể n của c ô n g n g h ệ s inh học v à c á c sản p h ẩ m

c h í n h của C N S H

a) CNSH đ ã h ình thành và ứng dụng trước k h i c ó khá i n i ệ m CNSH

T ừ thờ i xa xưa , con n g ư ờ i đã b iết :

- Sản xuấ t rượu, bia, các c h ế phẩm sữa, mộ t số l o ạ i nước g i ả i khá t .

- Sản xuấ t các axit và dung m ô i hữu cơ.

- C ô n g nghiệp k h á n g sinh v ớ i các n ồ i lên men hàng t r ăm n g à n lít.

b) Gia i đ o ạ n từ 1960- 1975

- C ô n g nghệ t ế bào thực vật (nuôi cấy m ô ) bắ t đầu sản xuấ t h àng t r i ệu cấy giống sạch bệnh trong đ iều k i ệ n n h â n tạo.

- Sản xuấ t axit amin, axit glutamic, các enzym, k h á n g sinh bằng c ô n g nghiệp lên men sinh k h ố i khổng l ồ . Sản xuấ t các chấ t bổ sung dinh dưỡng cho n g ư ờ i , chăn nuô i , n g u y ê n l i ệ u công nghiệp dược và chấ t tẩy rửa.

c) Gia i đ o ạ n từ sau 1975

- H ì n h thành k ỹ thuật A D N tái tổ hợp, khá i n i ệ m CNSH và c ô n g nghiệp sinh học trở nên phổ b iến .

- Thuốc chữa bệnh và phòng bệnh cho nguô i và gia súc : insulin, in ter íeron, vacxin.. . tạo ra nhờ các k ỹ thuật tái tổ hợp A D N và chuyển gen

- Các chấ t đ i ề u t i ế t sinh t rưởng, phát t r iển và sinh sản cây t rồng, vật nuô i đặc b iệ t là hormon sinh t rưởng và các chấ t hoạt t ính sinh học khác .

- Các bộ kít và phương p h á p chẩn đoán bệnh.

- Cấy t ruyền hợp tử và các k ỹ thuật nhân giống và n h â n bản động vật .

- Chấ t bổ sung thức ăn gia súc: vi tamin, axit amin, sinh k h ố i t ế bào , n ấ m men.

- N h â n giống cây sạch bệnh quy m ô lớn .

1.3.2. N h ữ n g p h á t m i n h c ă n b ả n của n h â n l o ạ i t r o n g l ĩ n h vực s inh học d ẫ n đ ế n sự

ra đ ờ i của C N S H

1.3.2.1. Phát minh ra tê bào, quá trình phân bào và phân hoa cơ quan

- N ă m 1665 Robert Hooke quan sát thấy t ế bào sống d ư ớ i k ính h iển v i và đưa ra khái niệm tê bào "Cell".

- Anton Van Leuvven Hoek (1632-1723), thiết k ế kính h iển v i khuếch đ ạ i được 270 lần, lần đầu tiên quan sát thấy v i khuẩn, t ế bào tinh trùng trong tinh dịch ngườ i và động vật.

- Matthias Schleiden và Theodore Schvvann đề xướng học thuyết cơ bản của sinh học g ọ i là Học thuyết tế bào năm 1838:

l i

+ M ọ i cơ thể sống được cấu tạo bở i mộ t hoặc nh iều t ế bào .

+ T ế b à o là đơn vị cấu t rúc và chức năng cơ bản của cơ thể sống, là h ì n h thức nhỏ

nhấ t của sự sống.

+ T ế bào chỉ được tạo ra từ t ế bào tồn t ạ i trước đ ó .

- Oscar Her twig (1875) chứng minh bằng quan sát t rên k ính h i ể n v i rằng sự thụ thai

là do sự hợp nhấ t của nhân t inh t rùng và nhân trứng.

- Hermann p, Schneider F. A . và Butschli o . đã m ô tả ch ính xác q u á t r ình p h â n chia t ế bào, năm 1883, W i l h e l m Roux lần đầu tiên đã lý g i ả i về sự g i ả m p h â n trong p h â n b à o

g i ảm n h i ễ m ở cơ quan sinh dục.

1.3.2.2. Phát minh sự phát triển của cơ thể sống là kết quả của sự phân hoa của

tê bào

Cuối t h ế k ỷ X V I I và đ ầ u t h ế k ỷ X V I I I , n g ư ờ i ta nghĩ rằng trong t inh t r ùng đ ã chứa đựng toàn bộ ngườ i t rưởng thành d ư ớ i dạng thu nhỏ . Sự phát t r iển được coi n h ư sự p h ó n g đ ạ i đơn g iản cua h ình nhân . Cách h ình thành các con vật từ phô i t rở t h à n h đ ố i tượng tranh luận khoa học trong suốt t h ế k ỷ X V I I I cho đ ế n cuố i t h ế k ỷ X I X . C ó hai t rường

phái đ ố i lập nhau:

Đ ố i vớ i những n g ư ờ i theo thuyết t i ền tạo, con vật m ớ i h ình t h à n h h o à n toàn v ớ i đ ầ y đủ các cơ qụan đã có mặ t ở dạng thu nhỏ trong trứng (hoặc trong t inh t rùng ) , đ ố i v ớ i những n g ư ờ i ủng h ộ thuyết "vi động vật" (khoảng thờ i k ỳ 1651 - 1700). N h à T ự nh iên học Thụy Sĩ Charles Bonnet (1720 - 1793) quan sát được h i ện tượng t r inh sản ở con rệp (trong thí nghiệm, một con rệp cái được cô lập mộ t c á c h cẩn thận sinh ra 95 rệp con m à k h ô n g cần rệp đực), từ đ ó n g ư ờ i ta kế t luận rằng những con vậ t m ớ i đ ã t ồ n t ạ i h o à n ch ỉnh trong trứng của con vật cá i .

Đ ố i vớ i những n g ư ờ i theo thuyết biểu sinh: trứng ban đ ầ u k h ô n g c ó m ộ t d ấ u vế t tổ chức nào và phôi được h ình thành dần dần bằng q u á t r ình x â y dựng c ó sự đ ó n g g ó p "giống" của cả cha và m ẹ . Những n g ư ờ i theo thuyết b iểu sinh n h ư B u f f o n và Maupertuis lưu ý rằng cả cha và m ẹ đều g ó p phần h ình thành con vật m ớ i (sự quan sát con la chứng tỏ đ iều đó ) .

Phát triển phôi và phân hoa tế bào trở thành một khoa học trong đ ó t r ình tự hoạt động của thông t in d i t ruyền và đ iều k h i ể n hoạt hoa của gen trong q u á t r ình phá t t r i ể n cá thể có ý nghĩa quan t rọng. Khoa học về đ iều k h i ể n học sinh học ra đ ờ i sau n à y phá t t r iển song song vớ i các thành tựu về h ệ đ iều hành hoạt hoa của gen.

1.3.2.3. Phát minh quá trình tiến hoa của sinh giới và vật liệu mang thông tín di truyền

N ă m 1859, Charles Darwin - Cha đẻ của học thuyết t i ế n h ó a trong sinh học - đã xuấ t bản cuốn "Nguồn gốc của các loài tạo ra bở i chọn lọc tự nh iên" . Trong đ ó l ầ n đ ầ u t iên đưa ra quan đ i ể m l ịch sử của phát t r iển sinh g iớ i và lý g i ả i sự t i ến hoa của các loài :

- Sự t i ến hóa trong sinh g iớ i đã xảy ra nhờ d i t ruyền, b i ến d ị và chọn lọc tự nh iên .

12

- M ỗ i mộ t loài đ ề u có thể có quan hệ mật th iế t v ớ i các loài k h á c bở i c ù n g c ó m ộ t tổ t iên chung.

T i ế p sau đ ó , Gregor Mendel cha đẻ của d i t ruyền học đã phát h i ệ n các quy luật cơ bản đ ầ u t iên của d i t ruyền:

- Các tính trạng được di truyền từ t h ế h ệ này sang t h ế h ệ kia theo các quy luật thống kê.

- T ính trạng được xác đ ịnh bở i các y ế u t ố d i t ruyền (sau này n g ư ờ i ta g ọ i là gen).

Oskar Hertwing và Edouard Strasburger, trong những n ă m 1880 đã phát h i ện n h â n t ế bào là trung t âm của d i t ruyền. Cho t i êm vật l i ệ u d i t ruyền từ v i khuẩn chết vào v i

khuẩn sống. Chấ t hóa học chưa b iế t (được g ọ i là y ế u t ố G r i f f i t h ) từ mộ t nò i v i khuẩn gây bệnh bị g iết chết đã t h â m nhập vào mộ t nòi v i khuẩn sống k h ô n g có k h ả n ăng gây bệnh. K ế t quả nòi v i khuẩn v ố n k h ô n g có k h ả n ăng gây bệnh này đã được chuyển h ó a thành chủng gây bệnh. Sau này, Osvvald Avery và đồng nghiệp (1944) đã chứng minh được vật l i ệ u d i t ruyền do G r i f f i t h t ìm ra hay "yếu t ố G r i f f i t h " ch ính là m ộ t phân tử axit deoxyribonucleic ( A D N ) .

1.3.2.4. Phát minh vai trò của ADN đối với sự sống

Ba đặc t rưng cơ bản của sự sống là sinh sản, trao đ ổ i chấ t và t i ến hoa. T ính chấ t của A D N quy đ ịnh cả ba đặc t rưng cơ bản này .

James Watson và Francis Crick (1953) phát minh cấu t rúc sợi k é p của A D N . Sợi xoắn kép h ình thành theo đ ịnh luật Watson và Crick, trong đó : mộ t bazơ t rên mộ t sợi A D N luôn luôn tương đồng hoặc bắt cặp v ớ i m ộ t bazơ tương ứng ở sợi kia. Adenin chỉ ghép cặp v ớ i T h y m i n và Cytosin ch ỉ g h é p cặp v ớ i Guanin. H ệ quả của đ ịnh luật ghép cặp này là hai mạch của v ò n g xoắn k é p b ổ sung cho nhau n h ư ch ìa k h ó a và ổ khóa . K h i hai sợi tách rờ i nhau, m ỗ i sợi này l ạ i có thể quyết đ ịnh việc x â y dựng m ộ t mạch m ớ i bổ sung cho n ó d ẫ n đ ế n sự nhân đô i của A D N . N h ư vậy cấu t rúc vậ t lý của phân tử A D N giả i thích một gen có thể tự sao chép ch ính xác như t h ế n à o m ỗ i l ầ n t ế bào phân chia.

- Cũng vào n ă m 1953, G. Gamow cho b iết d i t ruyền t ính t rạng phải thể h i ện qua tổng hợp các protein trong t ế bào .

- Han Gobind Khorana và Marshall Nirenberg (1966 -1967) phát minh m ã d i t ruyền.

Từ đây "đ ịnh luật tương ứng" giữa các n h ó m chập ba nucleotid (triplet hay còn được g ọ i là codons) của A D N và các axit amin của các protein đã được l à m sáng tỏ hoàn toàn. Trong đó :

+ M ô h ình hai sợi xoắn k é p của A D N lý g i ả i k h ả n ăng sinh sản bằng n h â n đô i của A D N là cơ sở lý g i ả i h iện tượng d i t ruyền t ính trạng, sinh sản ở sinh g i ớ i .

+ Trong q u á t r ình sinh sản của phân tử và t ế bào l ạ i xảy ra m ộ t số sai sót d ẫ n đến

đột b iến và tái tổ hợp gen tạo ra t i ền đề cho b iến d ị và t i ến hoa.

1.3.2.5. Tổng họp gen, kỹ thuật ADN tái tổ hợp và thao tác di truyền ở mức phân tử và tê bào

- N ă m 1960, Jacob. F. và Mono J. (g iả i thưởng Nobel n ă m 1964) l ầ n đầu t iên đã phát minh khá i n i ệ m operon. Operon hay n h ó m chức n ă n g là n h ó m các gen l iên quan

13

vớ i nhau theo các chức n ăng h ó a học nhấ t đ ịnh trong mộ t c h u ỗ i c á c phản ứng sinh hóa . Operon g ồ m có :

Các gen cấu trúc (structural genes): quy đ inh cấu t rúc bậc nhấ t hay t r ình tự axit

amin của enzym hoặc protein.

Gen điều chỉnh (regulatory genes): đ iều k h i ể n hoạt hoa của các gen c ấ u t rúc .

Phát minh này m ở ra các ngh iên cứu ngày càng sâu về h ệ đ i ề u h à n h hoạt h ó a của

gen trong t ế bào . Jacob F. và Mono J. cũng đã phá t minh vai t rò của A R N t h ô n g t i n

( m A R N ) trong cơ c h ế hoạt động của gen: gen ( A D N ) quy đ ịnh t r ình tự nucleotid của

A R N thông t in , t i ếp đ ế n tr ình tự nucleotid trong A R N thông t in l ạ i quy đ ịnh t r ình tự axit

amin trong phân tử protein. T ính đặc thù của protein l ạ i quy đ ịnh c ấ u t rúc và m ọ i q u á

tr ình hoa học xảy ra trong cơ thể sống.

N h ư vậy, nhân loạ i đ ã phát minh các công đ o ạ n cơ bản trong d ò n g chảy của t h ô n g

t in d i t ruyền: D N A - A R N - protein.

- N ă m 1967, Arthur Kornberg và cộng sự đã tổng hợp được A D N của m ộ t virus

trong phòng thí nghiệm.

- N ă m 1969, R. Edwards lần đầu tiên thụ thai t hành c ô n g m ộ t t rứng n g ư ờ i t hụ t inh ngoài cơ thể .

- N ă m 1970, Khorana H . G đ ã t hành công tổng hợp n h â n tạo m ộ t gen. C ù n g n ă m

này, Hamiton và Smith đã tách chiết được enzym cắ t g i ớ i hạn ở Haemophilus infỉuenzae

và xác đ ịnh được rằng enzym này ch ỉ cắt A D N ở đ o ạ n c ó t r ình tự nucleotid đặc t hù .

- Paul Berg và cộng sự (1972) là những n g ư ờ i đ ầ u t iên sử dụng enzym cắ t đ ể m ở n h i ễ m sắc thể mạch vòng của E. co l i và cài vào đ ó m ộ t A D N ngoại la i ( A D N của virus

gây bệnh ung thư ở n g ư ờ i ) , tạo ra phân tử A D N tái t ổ hợp đ ầ u t iên . C ô n g t r ình n à y được nhận g i ả i thưởng Nobel n ă m 1980.

- N ă m 1973. S.'Cohen và H . Boyer hoàn ch ỉnh phương p h á p chuyển gen ngoại la i vào các v i khuẩn, m ở đầu thờ i đ ạ i k ỹ thuật d i t ruyền. N h ờ vậy , v iệc n h â n nhanh m ộ t gen

v ớ i số lượng tuy ý c ó thể thực h iện được thông qua chuyển gen v à o v i k h u ẩ n (kỹ thuật này g ọ i là nhân d ò n g gen - gene cloning).

1.3.2.6. Phát minh mới về vai trò của các ARN

Sidney Al tman và Thomas Cech được trao g i ả i Nobel n ă m 1989 do phá t h i ên ra rằng A R N có khả năng hoạt động như mộ t chấ t xúc tác (catalyst) và c á c enzym c ó bản chấ t

A R N được g ọ i các Ribozym. Phát minh này m ở ra quan n i ệ m h o à n toàn m ớ i v ề vai t rò

của A R N . Quan đ i ể m trước đ ó cho rằng A R N ch ỉ đ ó n g vai t rò trung gian giữa A D N và

protein. Các ngh iên cứu sau đó cho thấy A R N có thể tự xúc tác đ ể tự sao c h é p và tổng

hợp các phân tử A R N khác . K h á m phá đ ó đã d ẫ n đ ế n ý tưởng cho rằng A R N là vật l i ệ u d i t ruyền đầu t iên trên trái đấ t . H i ệ n nay khoa học đã khẳng đ ịnh rằng ribosomal R N A xúc tác tạo liên kế t peptid giữa các axit amin trong q u á t r ình dịch m ã . Phá t h i ệ n sau đ ó

14

c ò n cho thấy A R N k h ô n g chỉ như chấ t xúc tác , m à còn đ ó n g vai t rò quan trọng hơn nữa

trong đ iều k h i ể n b iểu h i ện gen:

- M ộ t số lượng lớn các phân tử A R N nhỏ k h ô n g đ ó n g vai trò như m ã d i t ruyền m à liên

kế t vớ i protein đ ể tạo ra các phức hợp g ọ i là ribonucleoprotein. Các ribonucleoprotein ảnh

hưởng trực t iếp lên các quá trình phiên m ã (transcription), dịch m ã (translation), nhân bản

A D N và cấu trúc n h i ễ m sắc thể (ví dụ gây xoắn sợi n h i ễ m sắc thể) .

- Trong những n ă m đầu của thập k ỷ 1980, n g ư ờ i ta đã phát h i ệ n thấy các phân tử

A R N nhỏ (dài khoảng 100 nucleotid, sau này được g ọ i là các A R N đ ố i nghĩa) trong v i

khuẩn Escherichia coli c ó thể b á m vào các t r ình tự tương đồng trong m A R N và ức c h ế

phiên m ã (Mizuno và cs, 1984; Nordstrom và Wagner, 1994). N g à y nay, đã b iế t khoảng

25 t rường hợp tr ình tự A R N đ ố i nghĩa (antisense A R N ) , có k h ả n ă n g t r i ệ t t iêu hoạt hoa

của các m A R N và đ iều t i ế t q u á tr ình dịch m ã trong E.coli (Gottesman, 2004). Sự đ iều

hoa quá tr ình dịch m ã bở i antisense A R N cũng xảy ra trong sinh vật n h â n chuẩn như đã

được minh hoa n ă m 1993 cho thấy vai t rò của antisense A R N quy đ ịnh sự phá t t r iển của

tuyến t rùng Caenorhabditis elegans (Lee và cs, 1993; Wightman và cs, 1993).

H i ệ n tượng gây bấ t hoạt gen bở i A R N đ ố i nghĩa, c ó k ích thước l ớ n sau đ ó đã được

phát h iện ở các cơ t hể sống n h â n thực (antisense A R N ) .

Phát minh gần đ â y nhấ t , được coi là phá t minh l ớ n nhấ t của khoa học cuố i t h ế k ỷ

X X là phát minh vai t rò của các A R N ngắn đ ố i v ớ i đ iều k h i ể n hoạt hoa gen ở các c ơ thể

sống nhân thực. Các A R N ngắn c ó k ích thước vào khoảng 21-27 nucleotids g ọ i là

s i A R N (short R N A ) hoặc m i A R N (micro R N A ) có k h ả n ă n g b á m vào các t r ình tự tương

đồng vớ i nó trên các sợi A R N (có thể là m A R N hoặc A R N của virus, các l o ạ i A R N

thâm nhập vào cơ thể và t ế bào theo các con đường k h á c nhau), l à m cho các sợi A R N

này trở thành sợi k é p ở mộ t đoạn ngắn. Các enzym đặc thù (ch ỉ m ớ i thấy ở các t ế bào

nhân thực) có k h ả n ă n g nhận b iế t các t r ình tự k é p ngắn đ ó và cắt sợi A R N làm đô i , gây

bất hoạt gen.

Sự bất hoạt của gen c ó thể xảy ra ở hai mức đ ộ k h á c nhau: Bấ t hoạt gen ở giai đoạn

phiên m ã (transcriptional gene silencing TGS) do methyl hoa các t r ình tự gen (Matzke

và cs, 1989; Wassenegger và cs, 1994) và sau phiên m ã (post-transcriptional gene

silencing PTGS) (Napoly và cs,1990; Van der K r o l và cs, 1990; Smith và cs,1990; de

Carvalho và cs, 1992; van Blokland và cs, 1994). H i ệ n tượng bấ t hoạt gen sau ph iên m ã

(PTGS) đã được phát h i ện ở thực vật , ở n ấ m men Neurospora carassa, ở tuyến t rùng,

ruổ i d ấ m và nh iều động vật khác , k ể cả con n g ư ờ i . Ha i n h à khoa học M ỹ Andrevv Fire

và Craig M e l l o đã được trao g iả i thưởng Nobel n ă m 2006 do c ó công l ớ n phát minh ra

cơ c h ế gây bấ t hoạt gen bở i các A R N ngắn m à 2 ông g ọ i là A R N i ( A R N i v i ế t tắ t từ t iếng

A n h R N A in te r íe rence) . Công nghệ A R N i h iện nay được các nhà khoa học và công

nghiệp sinh học g ọ i là công nghệ đầy sức mạnh, có k h ả n ăng can th iệp h i ệu quả vào

nhiều l ĩnh vực sinh học, nông nghiệp và y học.

15

1.3.3. M ộ t và i ứ n g d ụ n g của C N S H

- N ă m 1977, hãng Genetech đã tạo ra v i khuẩn b i ến đ ổ i gen sản xuấ t được hormon

n g ư ờ i - somatostatin phục vụ mục đ ích công nghiệp. N ă m 1978 h ã n g n à y l ạ i sản xuấ t

được insulin bằng kỹ thuật tương tự.

- N ă m 1980, hãng Biogen sản xuấ t được in ter íe ron của bạch cầu n g ư ờ i bằng k ỹ thuật d i t ruyền. Inter íeron ở ngườ i là một hợp chấ t th iên nh iên k h á n g virus c ó k h ả n ă n g

làm tăng sức đề k h á n g bệnh ở n g ư ờ i và có t ính k h á n g ung thư.

- N ă m 1984, một trẻ sơ sinh đ ầ u t iên ở p h ò n g thí n g h i ê m của ú c phá t t r i ể n t ừ m ộ t

phôi đã được đ ô n g lạnh nhiều tháng .

- N ă m 1985, n g ư ờ i ta đã thu được kế t quả tuyệt v ờ i k h i đ i ề u trị bệnh ung t hư bằng

inteleukin-2, mộ t protein được sản xuấ t t rên quy m ô c ô n g nghiệp n h ờ c á c v i k h u ẩ n

chuyển gen.

- N ă m 1986, s. Willedson thông báo đã thực h i ện thành c ô n g sự sinh sản v ô t ính của

cừu cái .

- N ă m 1990, lần đầu t iên n g ư ờ i ta đã thực h iện ca đ iều trị bệnh do gen t rên m ộ t bệnh

nhân gái 4 tuổ i bị th iểu năng m i ễ n dịch. Phương p h á p chữa bệnh bằng l i ệ u p h á p gen đã

tỏ ra đầy t r iển vọng v ớ i việc đưa vào các t ế bào của cơ thể n g ư ờ i bệnh m ộ t gen b ình

thường để chữa bệnh do th iếu gen này .

- H i ệ n nay, các chương t r ình ngh iên cứu l ớ n mang t ầ m cỡ t oàn n h â n l o ạ i đ ã ra đ ờ i và đang được t r iển khai, như:

- N ă m 1991, D ự án Quốc t ế về genom n g ư ờ i (human genom project) bắ t đ ầ u được

t r iển khai vớ i mục tiêu đến n ă m 2005 đọc toàn bộ t r ình tự genom của n g ư ờ i v ớ i khoảng

3.000 t r iệu cập nucleotid trong giai đoạn 15 n ă m . N ă m 1994, m ộ t n h ó m n g h i ê n cứu

P h á p ở phòng thí nghiệm Giê -nê- thông (Géné thon) công b ố bản đ ồ đ ầ u t iên về h ệ gen

n g ư ờ i và phổ b iến bản đ ổ đ ó cho toàn t h ế g i ớ i . V à đ ế n n ă m 2004 t rên 21.000 gen ở n g ư ờ i đã được m ã hoa (đọc tr ình tự) ;

- Chương t r ình genom của mộ t số các sinh vật quan trọng;

- Chương t r ình chức n ăng genom (functional genomics) v ớ i sự tham gia của nh iều

phương pháp công nghệ m ớ i như so sánh Genom (comperative genomics), protein học (proteomics), công nghệ nano sinh học...

N h ư vậy, đ ế n cuố i thiên niên k ỷ X X sau công n g u y ê n n h â n l o ạ i chẳng những đ ã xác

đ ịnh được bản chấ t sinh hoa của gen m à còn tách được gen, chuyển n ó từ cơ thể sống

này sang cơ thể sống khác một cách k h á d ễ dàng , đọc được t r ình tự nucleotid của h ệ gen

và đang từng bước k h á m phá chức năng của từng gen, của hệ thống gen và học c á c h đ i ề u

kh iển được hoạt động của chúng . T h ế k ỷ X X I sẽ là t h ế k ỷ của k ỹ thuật d i t ruyền và

CNSH sáng tạo ra những dạng thức sống m ớ i , các th iế t bị vật l i ệ u m ớ i , các p h ư ơ n g thức h iện đ ạ i của y học trị l i ệ u vì l ợ i ích của nhân l oạ i .

16

1.4. K H Á M P H Á B Ả N C H Ấ T C Ủ A s ự S Ố N G VÀ V A I T R Ò C H Ủ Đ Ạ O C Ủ A G E N

T ừ thờ i t i ền sử n h â n l o ạ i đã bị á m ảnh bở i những câu h ỏ i gần n h ư v ĩnh hằng:

1. Sự sống do đ â u m à c ó ?

2. T h ế n à o là sự sống? Chấ t sống khác v ớ i chấ t k h ô n g sống ở c h ỗ n à o ?

3. T ạ i sao sinh g i ớ i l ạ i đa dạng và hài hoa đ ế n n h ư vậy?

4. Y ế u t ố n à o quyết đ ịnh sự t ồ n t ạ i , vận động và phát t r iển của sinh giớ i?

5. Con n g ư ờ i c ó thể cả i tạo sinh g iớ i không và bằng cách nào?

T ấ t cả những câu h ỏ i đ ó gần như không có câu trả l ờ i cho đ ế n k h i phá t h i ện ra gen, phân tử A D N và hoạt t ính sinh học của nó .

Chúng ta có thể phân biệt chất sống và chất không sống bằng 3 đặc tính cơ bản dướ i đây:

- K h ả nâng sinh sản

- K h ả n ăng trao đ ổ i chấ t

- K h ả năng d i t ruyền, b iến d ị và t i ến hoa

Trong đ ó , những thuộc t ính của phân tử A D N quy đ ịnh các đặc t ính căn bản trên đây của cơ thể sống.

1.4.1. Khám phá bản chất của sự sống và khả năng cải tạo sinh giới bằng công nghệ s inh học

Gen và cấu t rúc của gen quy đ ịnh m ọ i đặc t ính của cơ thể sống và t ính đa dạng phong phú của hệ sinh thái . M u ố n cả i tạo sinh g iớ i phải tác động trực t i ếp vào gen.

Sau những phá t m i n h của Mendel và Morgan, n g ư ờ i ta đã khẳng đ ịnh: M ọ i đặc t ính của cơ t hể sống do gen quy đ ịnh. N h ư n g ch ỉ m ã i đ ế n n ă m 1944 n g ư ờ i ta m ớ i x á c đ ịnh được gen c h í n h là các p h â n tử deoxyribonucleic acid ( A D N ) . Đ ế n n ă m 1953, Watson và Cr ick đ ã phá t m i n h cấu t rúc h ình sợi g ồ m hai c h u ỗ i x o ắ n k é p tương đồng của A D N . M ỗ i sợi A D N là mộ t polymer được tạo bở i các t r ình tự sắp x ế p k h á c nhau

của các nucleotid. C ó b ố n l o ạ i deoxyribonucleotid: adenin, guanin, cytosin và t h imin . Cứ ba nucleotid l ạ i tạo ra mộ t tổ hợp chập ba (triplet) hay c ò n g ọ i là đ ơ n v ị m ã d i t ruyền (codon), bốn nucleotid v ớ i tổ hợp chập ba sẽ tạo ra 4 3 = 64 codon k h á c nhau. Chiều dà i của gen t hường rấ t khác nhau. N ế u t ính m ộ t gen trung b ì n h được tạo bở i khoảng 900 nucleotid = 300 codons. Theo lý thuyết v ớ i 64 codon sẽ tạo ra 64.300 các phân tử A D N hay các gen k h á c nhau.

V ớ i 7 nốt nhạc, n h â n loạ i đã tạo ra hàng t r iệu bài ca. V ớ i 32 chữ cái , các nhà văn đã viế t ra hàng t r i ệu cuốn sách. V ớ i 64 codon có thể sáng tạo ra hằng hà sa số các cấu t rúc đa dạng vô c ù n g vô t ận của phân tử A D N . Đ i ề u đ ó g i ả i th ích t ạ i sao t h ế g iớ i sống của ta l ạ i phong phú, đa dạng và tuyệt v ờ i đ ế n như vậy. H à n g t r i ệu các loài sinh vật t rên trái đấ t , t rên n ă m tỷ n g ư ờ i hầu như k h ô n g ai giống hệt ai . H ã y nh ìn k ỹ vào mộ t n g ư ờ i , mộ t n g ư ờ i bạn yêu chẳng hạn, có b iết bao nhiêu m à u sắc, bao nh iêu cấu t rúc , bao nhiêu trí tuệ , n g ô n từ và t â m hồn trong đ ó .

17

N h ư vậy, tấ t cả t ính đa dạng phong phú, tấ t cả những v ẻ đ ẹ p th iên thần của sự sống đ ề u do gen và cấu trúc của gen quy đ ịnh. Trật tự của các nucleotid quy đ ịnh c ấ u t rúc đặc thù của gen. Số lượng đa dạng của gen quy đ ịnh t ính đa dạng của sinh g i ớ i .

1.4.2. Vai trò của gen được thể hiện như thế nào trong tế bào sống?

Cấu trúc đặc thù của gen l ạ i quy đ ịnh cấu t rúc đặc thù của A R N t h ô n g t i n . Đ ế n lượt

A R N thông t in l ạ i quy đ ịnh cấu trúc đặc thù của các protein. M ỗ i codon trong p h â n tử

A D N sẽ thích ứng vớ i một phân tử axit amin trong mạch của protein. T rậ t tự của 64

codon trong A D N sẽ quy đ ịnh trật tự sắp xếp của cạc axit amin ( g ồ m trên 20 axit amin

khác nhau) trong phân tử protein.

N g à y nay n g ư ờ i ta đã xác đ ịnh được tr ình tự cấu t rúc nucleotid của h à n g t r ă m n g à n

gen và t r ình tự axit amin trong p h â n tử của hàng chục n g h ì n protein. Trong số c á c

protein đã được t inh chế, có khoảng 90% protein là các enzym, khoảng 10% protein c ò n

l ạ i là các protein cấu t rúc ( thiết k ế nên các tổ chức m à n g t ế b à o sống và c ơ t h ể sống) và

các chấ t hoạt t ính sinh học khác nhau như các hormon, insulin, c á c in te r íe ron . . . N h ư vậy

tr ình tự axit amin đặc thù l ạ i quy đ ịnh t ính đặc thù của các enzym, trong đ ó m ỗ i mộ t

phản ứng sinh hoa học hoặc m ỗ i bước trong quá t r ình d ẫ n t ruyền đ i ệ n tử trong h ệ thống

m à n g t ế bào đều được quy đ ịnh bở i một enzym hoặc mộ t protein cấu t rúc . H à n g ngh ìn các chuỗ i phản ứng sinh hóa học trong m ỗ i t ế bào đ ề u do các enzym hoặc h ệ thống

enzym quy đ ịnh. Xét cho cùng gen và các sản phẩm trực t i ếp của gen (các protein) quy

đ ịnh m ọ i cấu trúc và q u á tr ình xảy ra trong cơ thể sống.

Gen và hệ thống gen, enzym và hệ thống enzym, protein và các tổ chức sống, tất

cả nằm trong mối quan hệ biện chứng phức tạp giữa chúng với nhau và vói môi

trường sống, trong đó gen là chìa khoa của vận động sinh học.

N ă m 1955, lần đầu t iên trật tự của các nucleotid trong p h â n tử A D N của m ộ t con v i

khuẩn đã được xác đ ịnh g ồ m khoảng 1,8 t r i ệu cặp nucleotid. N g à y nay, n g ư ờ i ta đã

khẳng đ ịnh trong m ỗ i v i khuẩn ( t ế bào t i ền n h â n prokaryote) các gen được sắp x ế p t rên

một sợi A D N k h é p kín. Trong trực khuẩn đường ruột v ớ i k í ch thước khoảng 1 - 2 u m c ó

chứa mộ t sợi A D N c ó đ ộ dài khoảng l m m g ồ m t rên bốn t r i ệu cặp nucleotid hay tương

đương vớ i khoảng trên 3000 gen khác nhau. Trong các sinh vật bậc cao hem, trong t ế b à o

eukaryotes, các gen được sắp xếp theo t rật tự nhấ t đ ịnh t rên sợi n h i ễ m sắc thể . Trong

một t ế bào của n g ư ờ i có chứa khoảng 30.000 gen k h á c nhau.

M ỗ i gen trong t ế bào sống đ ề u được xếp đặ t theo mộ t trật tự đã được quy đ ịnh và

hoạt hoa của n ó được đ iều kh iển mộ t cách ch ính xác . Thay đ ổ i vị t r í của gen, cắ t bớ t gen

hoặc thêm các gen, thậm chí thay đ ổ i v ị trí của ch ỉ m ộ t đ o ạ n ngắn A D N hoặc m ộ t

nucleotid trong sợi A D N của n h i ễ m sắc thể đ ề u có thể d ẫ n đ ế n những b i ến đ ổ i phức tạp

trong cơ thể sống. H i ệ n nay việc chuyển gen vào cơ thể sống c ò n phụ thuộc nh iều v à o

các yếu t ố ngẫu nhiên , nhấ t là đ ịnh vị của gen l ạ t rên n h i ễ m sắc thể . Đ ịnh vị gen k h ô n g

phù hợp cho biểu h iện gen d ẫ n đến h i ệu quả chuyển gen thấp.

18

H i ệ n nay chương t r ình g i ả i m ã hệ gen (genom) và chức n ă n g h ệ gen n g ư ờ i đã và đ a n g là m ộ t chương t r ình nghiên cứu lớn nhấ t t h ế k ỷ v ớ i sự tham gia của các siêu cường k inh tế . Chương t r ình này nhằm vào việc xác đ ịnh cấu t rúc , t r ình tự và chức n ă n g của tấ t

cả c á c gen ở n g ư ờ i .

Với khoảng một triệu các gen khác nhau tồn tại trong tự nhiên, sẽ có thể sáng tạo ra biết bao nhiêu các tái tổ hợp khác nhau của gen trong tế bào và sẽ sáng tạo ra bao nhiêu loài sinh vật mới nữa?

Trong thực t ế lượng các gen trong t ế bào của m ỗ i loài được g iớ i hạn bở i số lượng nh iễm sắc thể nhất đ ịnh vớ i các trình tự khá ngh iêm ngặt của các gen trong m ỗ i n h i ễ m sắc thể . T ạ i sao vậy? Tính hợp lý trong tổ chức và hoạt động của hệ gen là cả một khoa học đầy bí ẩn. Các khoa học như d i t ruyền học, sinh học phân tử đ iều kh iển học sinh học... sẽ

phải lý g iả i các bí ẩn đó . H i ệ n t ạ i chúng ta được b iết m ỗ i một enzym (sản phẩm của gen) cũng chỉ có thể hoạt động trong hệ thống các enzym, bói một sản phẩm sinh hoa thông thường phải do nhiều enzym đồng thờ i tạo ra (ví dụ để tổng hợp ra một axit amin, để phân giả i một phân tử đường .. cần rấ t nhiều enzym - hay h ệ enzym tham gia).

Sự sống nằm trong trật tự cấu trúc và đ iều h à n h phức tạp chặt chẽ v ớ i t ính k ỷ luật và t ính tổ chức n g h i ê m ngặ t . Trong đ ó gen nằm trong q u á t r ình đ iều k h i ể n và tự đ iều kh iển , chẳng hạn gen tổng hợp galactosidase ch ỉ hoạt động k h i t h ê m đường lacto vào m ô i trường nuôi v i khuẩn. K h i đường lacto bị phân g i ả i , các gen hoạt động chậm l ạ i và sau đ ó ngừng hoạt động nếu sản phẩm cuối c ù n g của enzym bị t ích l ũ y đ ế n mức bão hoa hoặc kh i trong m ô i t rường lacto đã bị phân g i ả i h o à n toàn. N h ư vậy gen ch ỉ có thể tổn t ạ i trong những tổ hợp gen hợp lý v ớ i sự k i ể m soát của m ô i t rường sống và tự đ iều chỉnh.

Khả năng sáng tạo ra các tổ hợp gen mới là vô cùng vô tận. Hàng loạt các cơ thể sống chuyển gen mói sẽ được tạo ra. Nhưng quá trình chọn lọc lại vô cùng khắt khe. Tiến hoa

là một quá trình đào thải đầy bi kích để đạt đến sự hoàn mỹ hiện tại của sự sống.

K h ả năng nhân đôi của phân tử A D N , sinh sản và t i ế n hoa - đ ó là đặc t ính cơ bản của sự sống. Chi p h ố i được phân tử A D N nhân l o ạ i sẽ trở t hành "chủ thể" của sự t i ến hoa

sinh học trên trái đấ t . K h ả n ăng nhân đôi của A D N l ạ i quyết đ ịnh k h ả n ăng n h â n đôi của nh iễm sắc thể và k h ả n ăng phân chia của t ế bào . N h ờ vậy m à có hai q u á tr ình sinh sản: sinh sản vô t ính (nhân bản t ế bào hoặc cơ thể sống m ớ i g iống v ớ i t ế bào và cơ thể mẹ ) . Sinh sản hữu t ính có kế t hợp t ế bào sinh sản và genom của hai cá thể b ố và m ẹ . M ộ t t ế

bào v i khuẩn trong đ iều k i ệ n phù hợp sẽ phân chia (nhân đô i ) cứ khoảng 20 phút một lần. Trong một n ồ i lên men v i sinh vật v ớ i quá tr ình lên men k é o dài khoảng 3 ngày = 72 giờ , một t ế bào v i khuẩn có thể được nhân lên theo t ính toán lý thuyết thành 2 2 1 6 t ế bào

m ớ i . N h ờ vậy m à c ó công nghiệp lên men v i sinh vật v ớ i các n ồ i lên men khổng l ồ hàng t r i ệu lít đ ể sản xuấ t thuốc k h á n g sinh, mì ch ính , bia rượu, vacxin tái tổ hợp... M ộ t cây phong lan nuô i cấy trong ống nghiệm cứ m ỗ i t háng c ó thể n h â n lên gấp n ă m lần , mộ t n ă m có t hể n h â n được t rên mộ t t r i ệu cây phong lan con từ mộ t cây ban đầu .

Q u á t r ình n h â n giống như vậy là kế t quả của mộ t k h ả n ă n g có mộ t k h ô n g hai của sinh vật sống - k h ả n ă n g sinh sản của phân tử A D N và t ế bào . N h ư n g ch ỉ mã i đ ế n n ă m

19

1962 đặc t ính t rên đây của t ế bào thực vật m ớ i được ứng dụng l ầ n đ ầ u t iên v à o c ô n g nghiệp nhân giống nhanh in vi tro.

Q u á t r ình nhân đôi của phân tử A D N - tạo ra mộ t p h â n tử con g iống hệt p h â n tử m ẹ ban đầu đ ó là bản chấ t của h iện tượng d i t ruyền. M ặ c d ù vậy , trong q u á t r ình sao c h é p và nhân lên hàng t r iệu lần, k h ô n g thể k h ô n g có sai sót d ẫ n đ ế n sự sai k h á c trong c ấ u t rúc phân tử của gen, hoặc thay đ ổ i sắp xếp của gen t rên sợi A D N và t rên n h i ễ m sắc thể . . . d ẫ n đến h iện tượng b iến d ị . H i ệ n tượng b iến d ị t hông thường x ả y ra ở tần số 10"5 - 10" trong đ iều k i ệ n tự nhiên . Trong đ iều k i ệ n th í nghiệm, k h i c ó tác động của c á c chấ t gây độ t b iến hoặc p h ó n g xạ, hoặc trong nuôi cấy t ế bào t rần k h i m à n g t ế b à o bị p h â n huy, tần số b iến d ị c ó thể lên tớ i 10' 2 hoặc hơn, nghĩa là cứ 100 cá thể m ớ i sẽ x u ấ t h i ệ n có mộ t cá thể b iến d ị . N g à y nay, k h ả n ăng gây độ t b iến đ ể chọn g iống n g à y c à n g c ó t ính đ ịnh hướng và h iệu quả cao. H à n g loạt các chủng v i sinh vật c ô n g nghiệp (sản xuấ t kháng sinh, axit glutamic...), các giống cây trồng m ớ i đã được tạo ra bằng đ ộ t b i ế n . Biến

dị là nền tảng của chọn lọc tự nhiên và tiến hoa của sinh giới.

1.5. CẢI TẠO DI TRUYỀN CÁC cơ THỂ SỐNG TRÊN cơ sở SINH HỌC PHÂN

T Ử VÀ K Ỹ T H U Ậ T G E N

Thiế t k ế được cấu trúc và vị trí k h ô n g gian của gen, đ iều k h i ể n được hoạt hoa của nó , con n g ư ờ i có thể tạo ra hàng t r iệu các hợp chấ t th iên nh iên theo ý muốn , c ả i tạo được sinh g iớ i và sửa chữa được các khuyết tật d i t ruyền ở ch ính bản t hân con n g ư ờ i . N h ư n g CNSH ngày nay m ớ i chỉ đi được những bước đ ầ u t iên trong cuộc t rường chinh c ả i tạo vật chấ t sống. Các phương thức cơ bản trong cả i tạo t hông t in d i t ruyền được t r ình bày t óm tắt dướ i đây:

/ . Thay đổi trình tự nucleotid của gen

- Thay đ ổ i t r ình tự gen cấu t rúc: Tr ình tự nucleotid t rên gen thay đ ổ i sẽ l à m thay đ ổ i t hông t in trên m A R N , d ẫ n đ ế n thay đ ổ i hoạt t ính của enzym và các protein do gen này m ã hoa;

- Thay đ ổ i cấu trúc của gen đ iều hành . Các gen đ iều h à n h thay đ ổ i d ẫ n đ ế n thay đ ổ i q u á tr ình dịch m ã từ các gen cấu trúc d ẫ n đ ế n sự thay đ ổ i sinh tổng hợp protein về

lượng: tăng hoặc g i ảm, thậm ch í l àm ngừng sinh tổng hợp.

2. Thay đổi vị trí của gen trong genom

Thay đ ổ i vị trí của gen trong genom: tái tổ hợp t r ình tự của các gen t rên n h i ễ m sắc thể và trong genom.

- Chuyển gen từ vị trí này sang v ị trí kia trong phạm v i n h i ễ m sắc thể ;

- Chuyển gen giữa các n h i ễ m sắc thể trong cùng m ộ t t ế bào : do trao đ ổ i c h é o (crossing over), d i chuyển của các gen nhảy (transposons).

3. Kiểm soát và thiết kế hệ điều khiển hoạt hoa gen

Thay đ ổ i mức độ hoạt hoa của gen quan t âm, t ính đặc thù về v ị trí k h ô n g gian trong biểu h iện của gen.

20

4. Chuyển gen từ loài này sang loài kia

Đ ư a mộ t đặc t ính d i t ruyền m ớ i từ loài này sang loài kia . V í d ụ gen k h á n g sâu Bt-tox in từ v i khuẩn Bacillus thurigìensis vào thực vật .

5. Lai hữu tính và vô tính tạo ra các tổ hợp gen mới

Dung hợp t ế bào t rần, lai t ế bào chấ t , ngh iên cứu cơ c h ế p h â n tử của ưu t h ế lai để tạo ra các tái tổ hợp hệ gen và genom của b ố và m ẹ ở con la i .

ố. Gây ra đột biến gen và nhiên cứu khả năng gây đột biến theo định hướng

X u ấ t h iện các phương p h á p gây độ t b iến m ớ i rấ t hữu ích cho n g h i ê n cứu chức nâng của gen và đ iều k h i ể n hoạt hoa gen: Đ ộ t b iến bằng cài gen ( A D N insertional mutagenesis), k ích hoạt các gen nhảy (transposons) để tạo ra các đ ộ t b iến đa dạng đồng thờ i d ễ k i ể m soát và nhận b iế t .

Bảng LI. Các kiểu thay đổi vật liệu di truyền và tác động của nó đối vói trao đổi chất và các đặc tính sinh học khác nhau

Các kiểu thay đổi vật liệu di truyền Kết quả nhận được

Thay đổi trình tự nucleotid trong gen cấu trúc (do đột biến, do cài gen lạ vào nhiễm sắc thể, do gen nhảy cài vào nhiễm sắc thể ỏ các vị trí khác nhau trong quá trình phát triển cá thể)

- Thay đổi cấu trúc và chức năng đặc thù của gen: - Thay đổi trình tự sắp xếp của nucleotid trong mARN và trình tự axit amin trong protein. - Thay đổi cấu trúc và gây biến tính protein, làm thay đổi hay làm mất hoạt tính enzym. - Thay đổi quá trình sinh hoa và hình thái của cơ thể sống.

Thay đổi hệ điều khiển của gert Thay đổi mức hoạt hoa, hoặc môi trường hoạt hoa, hoặc các điều kiện hoạt hoa của gen. Hậu quả có thể dẫn đến như sau: - Quá trình nhân bản ADN và sinh tổng hợp mARN không thể kiểm soát được. Dọ vậy, sinh tổng hợp một số protein và các hoạt chất có thể được tăng cường hoặc suy giảm hoặc bị triệt tiêu. - Quá trình phân bào bị mất kiểm soát dẫn đến ung thư.

Thay đổi vị trí của gen trên ADN và nhiễm sắc thể do đứt gãy, đảo đoạn nhiễm sắc thể, dịch chuyển gen, trao đổi chéo.

Không làm biến tính gen, nhưng có thể làm thay đổi hoạt hoa của gen do vị trí không gian của các gen trong sợi ADN thay đổi

Chuyển gen giữa các loài thông qua kỹ thuật ADN tái tổ hợp

- Tạo ra các cơ thể sống biến đổi di truyền (GMO);

- Cơ thể sống có thể tổng hợp được protein, enzym, hoặc các polypeptid mới. - Có thể gây bất hoạt các gen và triệt tiêu các hoạt chất không mong muốn. - Có thể gây đột biến gen do gen chuyển cài vào nhiễm sắc thể một cách ngẫu nhiên.

Ghi chú: (đối với tế bào tiền nhân (procaryote): nhiễm sắc thể là một sợi ADN mạch vòng gồm vài nghìn gen. Đối với tế bào nhân thực (eukaryote): nhiều sợi ADN và gen sắp xếp theo trật tự trên nhiễm sắc thể).

21

1.6. M Ó T SỐ L Ĩ N H v ự c ỨNG D Ụ N G C Ủ A C N S H (Bảng 1.2)

SÍT Lĩnh vực công nghệ và sản phẩm Đặc trưng cơ bản

1 CNSH thực vật

1.1 Công nghệ vi nhân giống: Nhân nhanh các cây trồng có giá trị kinh tế cao bằng công nghệ nuôi cấy tế bào như hoa, cây cảnh, cây ăn quả, cây dược liệu, cây lâm nghiệp nhưtếch..., cây có dầu như cọ dầu...

- Hệ số nhân giống rất cao đặc biệt là nhản giống từ tế bào mỏ sẹo phôi hóa và phôi vô tinh; đáp ứng yêu cầu sản xuất quy mô lớn mà các kỹ thuật thông thường không đáp ứng được. - Nhân nhanh các kiểu gen, hoặc giống ưu việt.

1.2 Làm sạch bệnh: Làm sạch bệnh các vật liệu nhân giống bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (kết hợp với các kĩ thuật làm sạch các tác nhân gây bệnh bằng hoa học hoặc xử lý nhiệt). Kỹ thuật này áp dụng chủ yếu đối với các giống ưu việt sinh sản bằng con đường vô tính như cây ăn quả có múi, dâu tây, nho, khoai tây, mía...

Rất cần đối với nhân giống sạch bệnh và trao đổi nguồn gen.

1.3 Bảo tồn nguồn gen: - Bảo tồn nguồn gen ở nhiệt độ thấp như nitơ lỏng (-196°C) - Hoặc bảo tổn thông qua phương thức sinh trưởng chậm trong môi trường nhân tạo

- Cần trong bảo tồn các cây trồng sinh sản bằng con đường vô tính, các loại cây có củ và cây sinh sản bằng thân rễ...

1.4 Cún phôi: - Cứu phôi trong các kĩ thuật lai xa - Cứu phôi đa bội thể (cứu phôi tam bội thể ỏ cây ăn quả có múi khi lai giữa cây tứ bội và cây nhị bội, cứu phôi tam bội ở các hạt lép, hạt nhỏ...) - Cứu phôi F1 khi lai tạo giữa các giống nho không hạt - Cứu phôi khi nội nhũ của hạt kém phát triển như trong nhân giống phong lan

- Tạo các con lai xa khác loài không có khả năng tạo hạt có sức sống - Tạo giống không hạt (cam quýt, bưỏi, chanh...) - Cứu phôi lai giữa các giống nho không hạt - Nhân nhanh các giống phong lan ưu việt...

1.5 Công nghệ đơn bội: Nhanh chóng tạo ra các dòng thuần, giống thuần chủng ứng dụng trong tạo giống mới và tạo giống ưu thế lai (nuôi cấy bao phấn, hạt phấn, nuôi cấy noãn...)

- Rất hiệu quả đối với giống lúa, ngô, lúa mì, lúa mạch. Đã được ứng dụng rất thành công ở Trung Quốc, Triều Tiên...

1.6 Đột biến tế bào soma:

Chọn tạo các đột biến tế bào soma. Rất hiệu quả trong tạo giống không hạt, dòng bất dục đực, nâng cao khả năng kháng bệnh và các chất diệt cỏ, khả năng chịu hạn, chịu lạnh khả năng sản xuất các hoạt chất sinh học...

- Chọn giống bất dục trong sản xuất hạt lai. - Chọn giống cây ăn quả không hạt (citrus). - Chọn tạo được nhiều giống chuối, mía mới... - Nâng cao chất lượng protein...

1.7 Thao tác di truyền và chuyển gen: - Lai tế bào trần tạo giống đa bội thể: tạo giống tam bội thể không hạt bằng dung hợp giữa tế bào nhị bội và đơn bội, dung hợp các tế bào nhị bội với nhau tạo dòng tứ bội thể... - Tạo giông cây trồng chuyển gen kháng sâu, bệnh kháng chất diệt cỏ, nâng cao chất lượng nông sản, sàn sinh dược chất

Công nghệ mang tính đột phá có thể tạo ra các cuộc cách mạng trong các lĩnh vực sinh học - nông nghiệp và y học

22

STT Lĩnh vực công nghệ và sản phẩm Đặc trưng cơ bản

1.8 Marker phân tử hỗ trợ chọn giống: Chọn giống với sự hỗ trợ của các kỹ thuật sinh học phấn tử (sử dụng các kĩ thuật marker phân tử)

- Giúp cho việc chọn giống ở mức phân tử thông qua các chỉ thị phân tử về các gen

kháng sâu bệnh, gen chất lượng, các đặc tính năng suất...

2 CNSH động vật

2.1 Thụ tinh trong ống nghiệm, thụ tinh nhân tạo, cấy truyền hóp tử hoác phôi

- Nhân nhanh các giống lai tốt.

2.2 Liệu pháp hormon làm tăng số trứng rụng, kết hợp với thụ tinh nhân tạo, cấy truyền hợp tử để nhân giống ưu việt.

- Nhân nhanh các kiểu gen và giống lai ưu việt.

2.3 Tạo động vật chuyển gen để nâng cao sản lượng sữa, thịt, kháng bệnh, sản xuất một số sinh dược quý như protein trong sữa, nước tiểu, máu...

- Các động vật chuyển gen như lợn, gà, chuột, thỏ, bò, cừu, cá...

2.4 Thức ăn bổ sung chăn nuôi (các chất điều tiết sinh

trưởng, kháng sinh chăn nuôi, inteiíeron, vitamines, protein đơn bào...

Nâng cao khả năng kháng bệnh, tăng năng suất, tỷ lệ nạc trong thịt, rút ngắn chu trình chăn nuôi.

3 CNSH Y dược

3.1 Kháng thể đơn dòng/sử dụng trong chẩn đoán bệnh. Ví dụ, các bệnh đường sinh dục, ung thư, các bệnh virus như viêm gan B...

- Sản xuất bằng công nghệ tế bào lai

(hybridoma)

3.2 Mầu dò DNA (DNA probes): dùng trong chẩn đoán bệnh, VD: bệnh kala-aser, bệnh buồn ngủ, sốt rét,...

- Sản xuất bằng công nghệ gen

3.3 Vacxin tái tổ hợp (viêm gan B, vacxin phòng bệnh virus ở gia súc lợn, thỏ, trâu) bò... như lở mồm long móng.

- Sản xuất bằng công nghệ gen

3.4 Các loại thuốc chữa bệnh có giá trị như insulin, interíeron, hormon sinh trưởng người và bò, erythropoietin,...

- Sản xuất chủ yếu bằng các vi khuẩn chuyển gen

3.5 Liệu pháp gen (trị liêu gen) chữa các bênh di truyền. - Đưa các gen bình thường vào cơ thể thay thế

chức năng của các gen bệnh bằng nhiều kỹ thuật khác nhau đang được nghiên cứu cải tiến.

3.6 Sinh con theo giới tính chọn lọc bằng cách tách riêng các tinh trùng mang nhiễm sắc thể X và Y và thụ tinh tế bào trứng bằng 1 loại tinh trùng-

- Có thể dẫn đến mất cân bằng giới tính trong dân số

3.7 Xác định phả hệ hoặc tội phạm, xác định mộ liệt sỹ chưa rõ nguồn gốc thông qua phân tích ADN của họ.

- Xác định chính xác quan hệ họ hàng, dòng tộc bằng phân tích ADN máu, tế bào (tinh

trùng), sợi tóc...

4 CNSH Công nghiệp

4.1 sx các hợp chất hoa học như cồn, axit lactic, axit citric, axit gluconic, aceton, glycerin...

- Sản xuất bởi các vi sinh vật chủ yếu là vi

khuẩn 4.2 sx kháng sinh: penicillin, streptomycin, erythromycin,

mitomycin, cycloheximide... - Sản xuất bởi các loại nấm, actinomycetes, vi khuẩn

4.3 sx các enzym: amilase, protease, lipase... - Sản xuất bôi vi khuẩn, nấm để sử dụng trong công nghiệp tẩy rửa, dệt, thuốc lá, sữa... trong chữa bệnh

23

SÍT Lĩnh vực công nghệ và sản phẩm Đặc trưng cơ bản

4.4 Chế biến một số chất nền thành các hợp chất có giá trị kinh tế và sử dụng cao hơn như sx các hornìón steroids từ sterols, sorbose từ sorbitol...

- Sản xuất bằng các vi sinh vật hoặc băng ki thuật enzym cố định trong các íermenters

4.5 sx các protein đơn bào từ vi khuẩn, nấm men, nấm, tảo, dùng trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi như thức ăn bổ sung.

- Đây là nguồn sinh khối vi sinh giàu protein và axit amin không thay thế...

4.6 Chất đốt, nguyên liệu và nhiên liệu tái sinh như là cồn bioethanol, biogas, biodiesel...

- Sản xuất bằng công nghệ lên men vi sinh vật biogas từ phân chuông và chất thải hữu cơ, từ sinh khói mía đường, sắn, khoai lang, cây có dầu, từ dong tảo biển...

4.7 Thu hồi một số khoáng chất có giá trị như vàng, uranium, titan...

- Sản xuất từ các sinh vật, chủ yếu là vi khuẩn có khả năng hấp thụ và tích lũy một số khoáng chất một cách đặc thù trong mô tế

bào của chúng.

4.8 Cố định enzym để sử dụng nhiều lần trong chế biến một số sản phẩm công nghiệp.

Ưu việt hơn sử dụng cả tế bào vi sinh vật nguyên vẹn trong chế biến các chất hoặc làm sạch môi trường

4.9 Thay đổi cấu trúc bậc nhất của một số protein/erưym bằng công nghệ gen và công nghệ protein làm cho chúng hiệu quả hơn, bền vững hơn với môi trường; thay đổi tính đặc thù của enzym đối với một số cơ chất. Ví dụ thành công trong sản xuất T4 lysozym, trypcin, subtilisin, lactate dehydrogenase,...

- Sử dụng computer để thiết kế protein theo hướng có lợi hơn. Các nhà khoa học đặc biệt quan tâm thay đổi enzym rubisco, một enzym chủ lực trong quang hợp để enzym này có ái lực mạnh hơn với C0 2 và kém ái lực với 0 2

(làm giảm quang hô hấp và tăng quang hợp)

4.10 sx các vi sinh vật hoặc tế bào có khả năng sản sinh các enzym hoặc nhiều hơn các protein hữu ích ỏ quy mô lớn.

Thay đổi hệ điều hành của gen làm tăng cường biểu hiện của các gen mã hoa các protein/enzym hữu ích.

5. CNSH môi trường sinh thái

5.1 Phân giải các chất thải sinh hoạt hữu cơ của con người và chất thải đô thị, xử lý chuồng trại chăn nuôi,...

- Phát triển các chủng vi sinh hoặc hệ vi sinh vật hữu hiệu (EM), hoặc các enzym trong xử lý môi trường.

5.2 Xử lý độc tố môi trường công nghiệp và nông nghiệp (hoa chất độc từ công nghiệp, thuốc trừ sâu bệnh, chất diệt cỏ, dư lượng phân bón trong nguồn nước.)

- Sử dụng các vi sinh vật chuyển gen hoặc các enzym cố định.

5.3 Xử lý các nguồn ô nhiễm từ dầu mỏ và các sản phàm từ dầu mỏ...

- Các chủng Pseudomonas putida

5.4 sx các chế phẩm sinh học kiểm soát sâu bệnh (các loại virus, vi khuẩn, nấm, côn trùng hữu ích để kiểm soát các tác nhân gây bệnh, trừ sâu) Tạo các giống cây trồng kháng sâu bệnh, chất diệt cỏ làm giảm sử dụng thuốc hoa học.

- Giảm thiểu các hoa chất nông nghiệp có hại cho môi trưởng và sức khoe con người. - Sản xuất các thuốc sâu bệnh sinh học, các giống cây trồng kháng sâu bệnh...

5.5 Sản xuất chất dẻo sinh học, dễ tiêu biến sau sử dụng để thay thế chất dẻo tổng hợp hoa học khó phân huy

- Sản xuất chất dẻo từ các sinh vật, các polymer sinh học

5.6 Tăng cường cố định C0 2 từ khí quyển đồng thời tăng giải phóng dưỡng khí 0 2 bằng thảm xanh thực vật và các sinh vật quang hợp

- Nâng cao khả năng quang hợp của cây trổng và thực vật quang hợp biển. - MỞ rộng thảm xanh thực vật và nuôi trồng sinh vật quang hợp biển

24

Chương 2

C Ô N G N G H Ệ T Ê B A O T H Ự C V Ậ T

2.1 . T Ế B À O T I Ề N N H Â N VÀ T Ế B À O N H Â N T H Ự C

Các cơ thể sống có thể là đơn bào hoặc đa bào . T ấ t cả các cơ thể sống c ó cấu trúc t ế

bào được chia l àm 2 n h ó m chính:

- Procaryotes - t ế bào t i ền n h â n

- Eucaryotes - t ế bào n h â n thực

T ế bào t i ền n h â n xuấ t h i ệ n khoảng 3.500 t r i ệu n ă m về trước. Các cơ t hể sống t i ề n

nhân chủ yếu thuộc n h ó m v i khuẩn (bacteria).

T ế bào nhân thực bao g ồ m protests, n ấ m , cây xanh, động vật và n g ư ờ i .

Bảng 2.1. Sự khác nhau cơ bản giữa tế bào tiền nhân và tê bào nhân thụt

Đặc tính Tế bào tiền nhân Tế bào nhân thực Kích thước tế bào

Đường kính trung bình 0,5-5nm (micromet)

- Có dung tích 1000 - 10.000 lần lớn hơn so với tế bào tiền nhân. Đường kính có thể tới 40 um hoặc hơn

Hình dạng Đơn bào hoặc dạng sợi Đơn bào, hình sợi hoặc đa bào

Vật liệu di truyền

Sợi DNA mạch vòng nằm trong tế bao chất, không có nhiễm sắc thể, không có nhân tế bào và hạch nhân (nucleolus).

Sợi ADN liên kết với protein và ARN tạo nên nhiễm sắc thể bên trong nhân te bào, trong nhân tế bào có hạch nhân.

Sinh tổng hợp protein

- Ribosome nhổ hơn (70S) - Không có sự tham gia của endoplăsmic reticulùm - Cảm ứng mạnh với kháng sinh, ví dụ streptomycin, kanamycin

- Ribosome lớn hơn (80S) - Ribosome đính vào hệ thống màng endoplasmic reticulum.

Tiểu bào tử (organeiles)

- Rất ít tiểu bào tử (organelle). - Không có tiểu bào tử có màng hai lớp.

- Rất nhiều tiểu bào tử, các tiểu bào tử được bao bọc bởi màng hai lớp (ví dụ: ty thể, lục lạp, nhẩn tế bào). Nhiều tiếu bào tử được báo bọc bởi một lớp màng (ví dụ: golgi, lysosome, không bào, microbody, endoplasmic reticulum).

Thành tế bào

Màng cứng và có chứa polysaccharid và axit amin. Murein là hợp chất chính tạo độ bền của màng

Thành tế bào thực vật và nấm rất cứng và có chứa các polysaccharid. Celluiose là thành phần cơ bản tạo độ cứng của màng tế bào thực vật, trong khi chitin tạo độ bền của tế bào nấm.

Hô hấp - Xảy ra ở mesosome trong tế bào vi khuẩn, trừ vi khuẩn xanh lục (blue green) hô hấp xảy ra ỏ màng tế bào chất.

Hô hấp hiếu khí xảy ra ở ty thể.

Quang hợp - Không có lục lạp - Quang hợp xảy ra ở màng tế bào.

- Xảy ra ở lục lạp. - Lục lạp có chứa các lớp màng, các màng tạo ra các lamelle, các lamelle xếp lớp tạo thành các hạt gọi là grana

Cố định nitơ Một số tế bào có khả năng cố định nitơ Không có khả năng cố định nitơ

25

2.2. N H Ữ N G Đ Ặ C T R U N G c ơ B Ả N C Ủ A T Ê B À O S Ố N G VÀ C Á C H Ư Ớ N G P H Á T

T R I Ể N C ơ B Ả N C Ủ A C Ô N G N G H Ệ T Ế B À O T H Ự C V Ậ T

Tấ t cả t h ế g iớ i sống đa dạng, phong phú và sinh động tuyệt v ờ i t rên trái đấ t m à chúng ta quan sát thấy đ ề u được xây dựng từ các t ế bào sống. T ế bào sống mang trong nó những khả năng k ỳ d iệu , đ ó là:

2.2.1. Khả năng phân bào và phân hoa

T ế bào sống có khả năng phân chia và phân hoa. T ế bào thực vật có k h ả n â n g phân chia, phàn hoa cơ quan và tái sinh thành cây trong đ iều k i ệ n nuôi cấy in vi t ro . Băng cách biến đ ổ i gen, các nhà khoa học đã k h á m phá hem 100 gen tham gia vào chu k ỳ p h â n chia t ế bào trên cơ sở nghiên cứu ở m ô hình n ấ m men. M ộ t trong số các gen đ ó là cdc28, gen này được g ọ i là gen khở i đầu v i nó k i ể m soát bước quan trọng đ ầ u t iên trong chu k ỳ phân chia t ế bào .

Chu k ỳ t ế bào bao gồm một loạt các sự k i ệ n xảy ra theo t r ình tự nhấ t đ ịnh, trong đ ó sự sinh t rưởng d ẫ n đến sự phân chia một t ế bào thành hai t ế b à o con. N h ữ n g t ế bào

ngừng phân chia sẽ k h ô n g tham gia trong chu tr ình t ế bào nữa. Các giai đ o ạ n của chu trình t ế bào được biểu h iện ở sơ đ ồ bên gồm các pha sau:

G, - s - G 2 - M

Gp Pha sinh t rưởng sau phân bào;

S: Pha nhân đô i A D N ;

G 2 : Pha sinh trưởng t iếp sau kh i A D N đã được nhân đô i ;

M : Pha phân chia nguyên n h i ễ m (mitosis).

Ở giai đoạn này n h i ễ m sắc thể chia đều về hai phía và t iếp theo t ế bào chấ t chia làm 2. Pha M l ạ i được chia làm 4 pha nhỏ gồm prophase, metaphase, anaphãse và telophase.

2.2.1.1. Các gen điêu khiển chu kỳ tê bào

Đ i ề u kh iển chu k ỳ t ế bào là các yếu t ố gây ch ín M P F (maturing promoting factor), bao g ồ m n h ó m protein cyclins và Cdks (cyclin depent kinase). Các protein n à y l àm vai trò k ích hoạt các bước của chu k ỳ t ế bào , tạo ra sự chuyển pha trong chu k ỳ t ế b à o từ G! sang s, hoặc từ G 2 sang M . M ộ t trong các protein đ ó là P53 - protein c ó chức n ăng phong toa chu k ỳ phân bào nếu như A D N bị hư hạ i . N ế u sự hư h ạ i là n g h i ê m trọng, P53 có thể gây ra chết t ế bào . H à m lượng P53 được t ăng lên trong các t ế bào bị hư h ạ i . N h ờ vậy, t ế bào có thờ i gian sửa chữa các sai sót trong k h i P53 phong toa hoặc l à m n g ư n g chu k ỳ phân bào. Đ ộ t b iến xảy ra ở protein P53 là đ ộ t b iến thường x u y ê n nhấ t d ẫ n đ ế n

ung thư. M ộ t ví dụ là h ộ i chứng L i í a u m e n i , k h i P53 có sai sót về d i t ruyền- d ẫ n đ ế n tần số ung thư cao.

M ộ t protein quan trọng khác là P27- mộ t protein có thể gắn v ớ i cyc l in và Cdk l à m ngưng chuyển từ pha G, sang pha s. Ngh iên cứu gần đây cho thấy rằng chẩn đ o á n ung thư phổ i được thực h iện bằng xác đ ịnh h à m lượng P27. K h i P27 g i ả m b á o trước c ó thể

xảy ra ung thư.

26

Ba nhà khoa học g ồ m Timothy Hunt, Paul Nurse, thuộc Quỹ N g h i ê n Cứu Ung Thư

H o à n g Gia A n h và Leland (Lee) Hartwell thuộc Trung T â m N g h i ê n Cứu Ung T h ư Fred

Hutchinson, Seattle, M ỹ , đã nhận được g iả i thưởng Nobel y học n ă m 2001 do những

ngh iên cứu suất sắc về phát minh h ệ đ iều hành quá t r ình phân bào .

Phát minh của h ọ đã cho ta h iểu thêm về những sai sót ở mức phân tử và mức d ư ớ i t ế

bào (su/?- cellular) có thể d ẫ n đ ế n ung thư như t h ế nào .

Hartwell đã phát minh ra các Gen chu kỳ phân chia tế bào (CDC genes - Cell

Divis ion Circle genes) ở n ấ m men Saccharomyces cerevisea. Paul Nurse đã phát minh

các gen chu k ỳ phân chia t ế bào ở một loài n ấ m men khác là Schiiosaccharomyces

pumle. Các gen chu k ỳ phân chia t ế bào CDC m ã hoa các proteins k i ể m soát chu k ỳ

phân bào. Cdk và các cyc l in đã được phát h i ện ở 2 l oạ i n ấ m men trên. M ộ t vài gen m ã

hoa các phân tử Cdk và cyc l in có thể có chức n ăng của genes ung thư (Oncogene, hoặc

phối hợp vớ i các sản phẩm của các gen ức c h ế ung thư (ví dụ P53 và Rb) trong chu k ỳ t ế

bào) .

Hartvvell cũng đã đưa ra n g u y ê n tắc "đ iểm k i ể m soát - checkpoint" rấ t quan trọng

trong nghiên cứu chu k ỳ t ế bào . Nurse cho biết các Cdk đ iều hành các bước của chu k ỳ

t ế bào bằng phản ứng phosphoryl hoa (phosphorylation) hai chiều ở mộ t số proteins (bao

g ồ m cả bản thân các Cdk) bằng thêm hoặc bớ t phân tử phosphate vào protein.

H u n cho b iết cyclins gắn vớ i các phân tử Cdk để tạo ra các tổ hợp Cdk - cyclins

(CDKs), do vậy chúng k h ô n g chỉ đ iều k h i ể n hoạt hoa của Cdk m à còn l àm thuận t i ện

việc lựa chọn t h ê m phosphate vào phân tử protein. CDKs đ ó n g vai t rò đ iều kh iển các

t rạm k i ể m soát quá tr ình phân bào . Các t rạm k i ể m soát k h á c nhau và các gen đ iều kh iển

các t rạm k i ể m soát này đã được phát h i ện ở hai loài n ấ m men và ở các loài nhân thực

bậc cao khác , trong đ ó c ó động vật có vú.

H u n đã phát minh ra các protein cyclins phân g i ả i theo chu k ỳ trong chu k ỳ t ế bào -

Sự phân g iả i của protein được xem là một đặc t ính đ ó n g vai t rò quan trọng k i ể m soát chu

kỳ t ế bào.

H u n cũng đã t ìm thấy cyclins ở các cơ thể sống khác nhau và cho b iế t cyclins là các

protein bảo thủ trong quá tr ình t i ến hoa.

Các CDKs gen đ iều k i ế n quá tr ình chuyển dịch các pha trong chu k ỳ t ế bào như

chuyển pha G 2 sang M ( G 2 / M ) , chuyển pha metaphase sang anaphase, G ị sang s, các sự

k i ệ n l iên quan đ ế n hỏng hóc và chỉnh sửa A D N . Các t rạm k i ể m soát này sẽ k h ô n g cho

phép t ế bào chuyển từ pha n ọ sang pha kia nếu pha trước đ ó chưa hoàn thành.

V í dụ : các gen đứng ở các t rạm k i ể m soát sẽ k h ô n g cho phép t ế bào chuyển sang

giai đoạn M nếu tổng hợp A D N chưa được sửa chữa, hoặc ch ỉ cho p h é p bắt đầu pha

anaphase k h i tấ t cả các n h i ễ m sắc thể (NST) đã nằm trên mặ t phang đường xích đạo của

t ế bào và các kinetochores của NST phải b á m vào sợi thoi vô sắc.

27

2.2.1.2. Chu kỳ tế bào và ứng dụng trong thực tiễn

* Chẩn đ o á n và t i ến t ớ i n g ă n ngừa bệnh ung t hư 9

Những thay đ ổ i trong chu k ỳ t ế bào có thể d ẫ n đ ế n các b i ến động hoặc sự k h ô n g ô n đ ịnh của NST là n g u y ê n nhân gây bệnh ung thư. Các gen m ã hoa các protein ch ìa khoa

trong đ iêu k h i ế n phân bào cũng ch ính là các gen ung thư (oncogenes). C á c sản p h à m cua

Cdk và cyclins gen có thể tương tác v ớ i các sản phẩm của gen k ì m h ã m ung t h ư n h ư gen

P53 (tumor suppressor genes). Đ ộ t b iến gen P53 là n g u y ê n n h â n gây ra t rên 50% t rường

họp ung thư ở n g ư ờ i . Những hỏng hóc ở các gen đ iểu k h i ể n chu t r ình p h â n b à o đ ề u c ó

thể d ẫ n tớ i ung thư. V í dụ , cycl in D I (sản phẩm của mộ t gen ung thư - oncogen) được

b iểu h iện vượt mức bình thường ở trong hầu hết các t rường hợp ung thư p h ổ i . N h ữ n g con

chuột k h ô n g có cycl in D I đã tỏ ra h o à n toàn k h á n g v ớ i ung thư. V i ệ c t h i ếu vắng hoạt

động của các gen m ã hoa các chấ t k ì m h ã m p h â n b à o n h ư P53 và gen Rb

(retinoblastoma) cũng có thể d ẫ n đ ế n ung thư. Gen P53 được g ọ i là n g ư ờ i bảo v ệ của

genom (Guardian hoặc Watchman).

Do vậy việc phát minh ra các gen chủ đạo điều khiển chu kỳ phân bào chắc chắn sẽ

mở ra những triển vọng mới mẻ đổi với chẩn đoán và chữa trị ưng thư.

* Các ứng dụng quan trọng khác

N h ờ ngh iên cứu các quy luật đ iều kh iển phân chia t ế bào n g ư ờ i ta c ó t h ể ứng dụng vào nhiều l ĩnh vực khác nhau của đòi sống:

- N h â n bản t ế bào;

- Sản xuấ t sinh k h ố i t ế bào như protein đơn bào , sinh k h ố i dược l i ệ u ;

- Tạo ra hàng loạt bản copy của mộ t cây ưu v i ệ t hay là n h â n bản cây t rồng quy m ô công nghiệp. Đ â y là nền tảng của C ô n g nghệ v i n h â n g iống (micropropagation);

- K h ả năng phân hoa của t ế bào sinh dưỡng ( t ế bào soma) thành p h ô i trong đ i ề u k i ệ n in vitro là cơ sở khoa học của công nghệ sản xuấ t hạt nhân tạo từ t ế bào .

2.2.2. Khả năng trao đổi chất

T ế bào là nhà m á y sinh học c ó k h ả n ăng sản xuấ t ra h à n g vạn c á c l o ạ i hợp chấ t hữu

cơ khác nhau. K h ả n ăng trao đ ổ i chấ t của t ế bào là cơ sở của c ô n g nghiệp sản x u ấ t các

chấ t hoạt t ính sinh học ứng dụng trong n ô n g nghiệp và y học (bảng 3). V í dụ :

- Nuô i cấy t ế bào n h â n sâm trong bioreactors;

- Sản xuấ t taxol chữa bệnh ung thư bằng nuôi cấy m ô thông đ ỏ ;

- Sản xuấ t vacxin và các dược chấ t quan trọng bằng c ô n g nghệ A D N tái tổ hợp.

H i ệ n nay, một hướng ứng dụng m ớ i của kỹ thuật d i t ruyền đ ang được c h ú ý : đ ó là

canh tác phân tử. Cây trồng hoặc t ế bào trở thành bioreactor đ ể sản xuấ t ra các c h ế p h ẩ m

sinh học khác nhau.

28

Bảng 2.2. Một số các sản phẩm thứ cấp ở thực vật và công dụng

SÍT Chất Công dụng

1 Vinblastine Chữa ung thư 2 Taxol Chữa ung thư 3 Ajmalicine Tăng độ đàn hồi thành mạch 4 Digitalis Chữa rối loạn tim mạch 5 Quinine Chữa sốt rét 6 Codeine Thuốc an thần 7 Jasmine Hương thơm 8 Pyrethrine Thuốc trừ sâu 9 Spearmit Hương vị 10 Artemysilin Chữa sốt rét

2.2.3. T ế b à o là k h o l ưu t r ữ t h ô n g t i n v à là đ ơ n v ị t i ế n hoa

T h ô n g t in d i t ruyền được lưu g i ữ trong các phân tử A D N của t ế bào . Trong các t ế

bào t i ền nhân (prokaryote): n h i ễ m sắc thể là mộ t sợi A D N mạch v ò n g g ồ m vài nghìn gen. Bên cạnh đó , trong các t ế bào t i ền nhân còn có các plasmid là các phân tử A D N mạch vòng nhỏ k h ô n g chứa các gen thiết yếu đ ố i v ớ i trao đ ổ i chấ t của t ế bào . Trong các

t ế bào nhân thực (eukaryote) thông t in d i t ruyền chủ yếu được lưu g i ữ t rên n h i ễ m sắc thể , trong nhân t ế bào . N g o à i ra, ty thể và lục lạp cũng mang gen t rên mộ t phân tử A D N vòng k h é p kín, giống như n h i ễ m sắc thể ở t ế bào t i ền nhân . Số lượng gen trong t ế bào v i

khuẩn là khoảng vài ngh ìn gen trong k h i ở n g ư ờ i có ít nhấ t là 30.000 gen.

2.2.3.1. Tế bào là đơn vị sống nhỏ nhất bảo tồn khả năng tái sinh thành cơ thể hoàn chỉnh

- Những b iến đ ổ i d i t ruyền ở mức t ế bào là cơ sở để tạo ra các cơ thể sống m ớ i l àm t i ền đề phát t r iển công nghệ t ế bào tạo giống.

- T ế bào là vật l i ệ u t i ến hoa, cung cấp vật l i ệ u d i t ruyền m ớ i cho quần thể , quần xã và có khả nâng gây ra những b iến đ ổ i của h ệ sinh thái .

Chuyển gen vào t ế bào sống trong đ iều k i ệ n ống ngh iệm đã tạo ra các cơ thể b iến

đ ổ i d i t ruyền ( G M O - Genic modi f ied organism). V í dụ , gen độc t ố trừ sâu của v i khuẩn Bacillus thuringiensis (gen Bt) đã được chuyển vào t ế bào n g ô nuôi cấy in vitro, từ các t ế

bào mang gen Bt n g ư ờ i ta đã tái sinh thành cây và tạo ra các d ò n g n g ô Bt k h á n g sâu. Các dòng n g ô Bt này có khả năng thụ phấn tự do hoặc lai tạo v ớ i các d ò n g , giống n g ô có ý nghĩa k inh t ế khác để tạo ra vô vàn các giống, dòng mang gen của G M O ban đ ầ u và có thể có những tác động đến h ệ sinh thái {xem chi tiết vềGMO ở chương 3).

2.2.3.2. Tê bào là đơn vị thao tác di truyền và là tiền đê của công cuộc tạo giống

Thao tác d i t ruyền ở mức t ế bào là một b iện p h á p chủ đạo trong tạo giống m ớ i trong tương lai . Thao tác d i t ruyền sẽ bao g ồ m các kỹ thuật d ư ớ i đây :

- K ỹ thuật gen (cài gen, chuyển gen...).

- Đ ộ t b iến , b iến d ị t ế bào soma.

29

- L a i g h é p t ế bào t rần, lai xa, cứu phôi và b iến nạp cơ quan tử ( n h i ễ m sắc t h ể và n ộ i bào quan).

Những t i ề m n ăng của t ế bào thực vật đã được p h â n t ích t rên đ â y cho t hấy những hướng ứng dụng của Công nghệ t ế b à o là rấ t đa dạng và đ a n g được từng bước c h u y ê n hoa vào thực t i ễ n phát t r iển n ô n g nghiệp, y học, cả i th iện m ô i t rường sinh thá i . Tuy theo mục tiêu phát t r iển của nền k inh t ế của m ỗ i quốc gia và nhu cầu của th ị t rường n g ư ờ i ta ngh iên cứu phát t r iển các công nghệ phù hợp.

2.2.4. Tê bào thực vật còn là nhà máy năng lượng mặt trời - nền tảng cho phát triển

C ò n g n g h ệ s inh học xanh và c á c c ô n g n g h ệ sạch

T ế bào thực vật có khả n ăng k ỳ d i ệu : hấp thụ n ăng lượng mặ t t rờ i và tạo ra c á c hợp chấ t hữu cơ. N h ờ vào quá tr ình quang hợp, t rên trái đ ấ t đã tạo ra:

- Khoảng 170 t ỷ tấn các chấ t hữu cơ /năm.

- L ư ơ n g thực và thức ăn k h á c nuô i dưỡng trên 8 t ỷ nguô i , h à n g chục t ỷ đ ộ n g vậ t và v i sinh vật trái đấ t .

- Dưỡng khí : T ừ thán kh í C 0 2 và nước, d ư ớ i ánh sáng mặ t t r ờ i tạo ra c á c chấ t hữu cơ và dưỡng kh í ( 0 2 ) .

- H ấ p thụ thán kh í ( C 0 2 ) : Các giống cây trồng n ă n g suất cao c ó thể h ấ p thu 70 tấn C0 2 /ha . Các cây C4 có k h ả n ăng hấp thụ C 0 2 và k h ả n ă n g quang hợp cao hơn c â y C3.

- Ngoài ra, t ế bào thực vật còn có khả năng phân ly nước thành oxy và hydro nguyên tử ở đ iều k i ện nhiệt độ bình thường. Đ â y có thể là loại nhiên l i ệ u sạch vô giá trong tương lai .

T ó m l ạ i , t ế bào thực vật là n h à m á y n ă n g lượng mặ t t rờ i , chuyển hoa n ă n g lượng á n h sáng thành năng lượng hoa học và tạo ra dưỡng kh í . D o vậy , c á c n g h i ê n cứu t ế b à o thực vật sẽ đ ó n g vai trò quyết đ ịnh đ ố i v ớ i q u á t r ình xây dựng và phục h ồ i c á c nguồn n ă n g lượng sống của trái đấ t .

N g à y nay, công nghệ sinh học n g à y càng c ó t i ề m n â n g t r i thức và p h ư ơ n g t i ệ n c ô n g nghệ để .tác động vào k h ả năng quang hợp của thảm thực vậ t và tham gia v à o q u á t r ình năng lượng và m ô i t rường toàn cầu.

2.3. MỘT SỐ HƯỚNG KHAI THÁC CÁC ĐẶC TRUNG cơ BẢN CỦA TẾ BÀO

T R O N G T Ạ O G I Ố N G

Bở i bản chất của khoa học - công nghệ là khai thác những t i ề m n ă n g th iên n h i ê n vì cuộc sống con n g ư ờ i . C h ú n g ta ngh iên cứu những t i ề m n ăng to l ớ n của t ế b à o sống n h ằ m xác đ ịnh những khả n ăng ứng dụng của các t i ề m n ă n g đ ó . D ư ớ i đ â y ch ỉ g i ớ i t h i ệu m ộ t số ứng dụng trước mắ t trong nông nghiệp để minh hoa.

2.3.1. Xây dựng hệ thông tái sinh nâng cao hiệu quả chuyển gen trong tạo giống

T h à n h công của kỹ thuật gen tạo giống cây trồng phụ thuộc vào ba y ế u t ố c ơ bản như thiết k ế hợp lý gen và hệ đ iều hành của gen, kỹ thuật chuyển và lắp g h é p gen vào vị

30

t r í th ích hợp trong n h i ễ m sắc thể và hệ gen của t ế b à o và phụ thuộc vào h ệ thống nuôi cấy và tái sinh t ế bào thành cây hoàn chỉnh. V ì vậy , sử dụng các g iống có k h ả n ăng tái sinh cao in vitro là cơ sở không thể th iếu của các thao tác chuyển gen.

T h à n h tựu n ổ i bật trong l ĩnh vực này là h ệ thống tái sinh cây lúa từ n u ô i cấy t ế bào

phôi hoa. T h ô n g qua chuyển gen vào h ệ thống t ế b à o c ó k h ả n ă n g tái sinh cao này , vài ngh ìn d ò n g lúa chuyển gen v ớ i các t ính trạng khác nhau đã được tạo ra.

Ở n g ô và mộ t số cây trồng khác , n g ư ờ i ta chưa thể chuyển các gen mong m u ố n vào các d ò n g giống c ó giá trị thương m ạ i mộ t cách trực t i ếp do các g iống này k h ô n g c ó hoặc có khả n ăng tái sinh rấ t y ế u trong nuô i cấy in vitro. V ì vậy , trước hết n g ư ờ i ta chuyển

gen vào hệ thống t ế b à o nuô i cấy tái sinh mạnh. Sau k h i tạo ra cây mang gen m ớ i , n g ư ờ i ta phải thực h i ện p h é p lai ngược (back-cross) để tạo ra d ò n g thuần có giá trị thương m ạ i .

2.3.2. Kỷ thuật đơn bội tạo giống mới và dòng thuần

Giá trị của cây đơn b ộ i trong các ngh iên cứu d i t ruyền và chọn g iống đã được n g ư ờ i ta b iết đ ế n từ lâu. K ể từ k h i Blakeslee (1921) m ô tả cây đơn b ộ i tự nh iên đ ầ u t iên ở Datura stramonium, cây đơn b ộ i tự nh iên đã được t ìm thấy ở rấ t nh iều l o ạ i cây khác

nhau. Tuy vậy các cây đơn b ộ i tự nhiên xuấ t h i ện mộ t cách n g ẫ u nh i ên v ớ i tần suất rấ t thấp không thể đ á p ứng yêu cầu của ngh iên cứu và chọn g iống. L ầ n đ ầ u t iên t rên t h ế

g iớ i , hai nhà khoa học An Đ ộ Guha và Maheshvvari (1967), đã thành c ô n g trong việc tạo ra hàng loạt cây đơn b ộ i từ nuôi cấy bao phấn in vi tro cây cà Datura innoxia. Ngay sau

đó , cây đơn b ộ i đã được tạo ra bằng nuôi cấy bao phấn ở h àng loạt các l o ạ i cây trồng khác . Các nhà khoa học đã t ìm ra các y ế u t ố quan trọng ảnh hưởng đ ế n thành công của quá trình nuôi cấy n h ư ảnh hưởng của k i ể u gen, giai đ o ạ n phát t r iển của hạt phấn và các điều k i ệ n m ô i t rường nuô i cấy.

Ngoà i nuô i cấy bao phấn, các nhà khoa học còn có những thành c ô n g rấ t l ớ n trong việc nuôi cấy noãn chưa thụ t inh, nuô i cấy hạt phấn tách r ờ i . K ỹ thuật tạo cây đơn b ộ i i n vitro thông qua k ích th ích t iểu bào tử hoặc đ ạ i bào tử phát t r iển thành cây trong nuôi cây hạt phấn, noãn cho p h é p nhanh c h ó n g tạo ra hàng loạt cây đem b ộ i phục vụ đắc lực cho mục đ ích nghiên cứu d i t ruyền và tạo giống cây trồng.

Trong kỹ thuật đơn b ộ i , vật l i ệ u ban đầu cho quá t r ình nuô i cấy i n vi tro g ồ m :

- Bao phấn, hạt phấn tách r ờ i , cụm hoa (phương p h á p này thường được áp dụng cho những loài có hoa nhỏ ) .

- Phôi non. K h i lai xa hai loài lúa mạch Hordeum vulgare và H. bulbosum v ớ i nhau,

sau quá trình thụ phấn phôi đơn b ộ i đã được h ình t hành do n h i ễ m sắc thể của H.

bulbosum đã bị loạ i trừ, nhưng n ộ i nhũ của phôi đơn b ộ i đã k h ô n g phá t t r iển . Sử dụng

phương pháp nuôi cấy phôi đã cứu được các phôi này k h ỏ i bị chết và tạo ra hàng loạt cây đơn bộ i (Jensen, 1977).

- T h ụ t inh g i ả . Đ â y là quá t r ình thụ phấn nhưng sau đ ó đã k h ô n g xảy ra sự thụ t inh. M ặ c dù vậy, t ế b à o trứng v ẫ n được kích thích phát t r iển thành cây đơn b ộ i . Hess và

31

Wagner (1974) đã t i ến hành thụ phấn in vi tro giữa Mimulus luteus v ớ i Torenia/ournieri.

K ế t quả h ọ đã tạo được cây đơn b ộ i .

- N o ã n chưa thụ t inh.

Trong số các vật l i ệ u k ể t rên thì bao phấn, hạt phấn tách r ờ i và n o ã n c h ư a thụ t inh là những nguồn n g u y ê n l i ệ u quan trọng và thường được sử dụng hơn cả đ ể tạo c â y đem b ộ i .

K ể từ thành công của Guha và Meheshinari, các cây đơn b ộ i của hơn 247 loài thuộc 88 chi và 34 họ thực hạt k ín đã được tạo ra rư nuôi cấy bao phấn và hạt phấn (Baja j , 1990) trong kh i đ ó thành công của nuôi cấy noãn còn hạn c h ế ở m ộ t số l o ạ i c â y t rồng như đ ạ i mạch, lúa m ỳ , thuốc lá, củ cả i đường, n g ô .

2.3.3. Thụ tinh nhân tạo, nuôi cây và tái sinh tê bào trứng, tê bào họp tử, tế bào nội

n h ũ non t h à n h cây t r o n g đ i ề u k i ệ n i n v i t r o

Quy tr ình thụ t inh k é p ở thực vật: k h i noãn được thụ phấn, t ế b à o phấn hoa c ó m ộ t nhân sinh dưỡng sẽ tạo thành ống phấn. N h â n của mộ t t inh tử I n t rôi theo ống phấn sẽ

thụ t inh vớ i t ế bào trứng I n và tạo ra t ế bào hợp tử 2n. N h â n của t inh tử t hứ 2 sẽ t hụ t inh vớ i t ế bào trung t âm của noãn 2n và sẽ tạo thành t ế bào n ộ i nhũ 3n.

Các nhà khoa học t ạ i V i ệ n Thực vật Đ ạ i cương ở Đức l ầ n đ ầ u t iên thực h i ệ n v iệc thụ t inh nhân tạo cho t ế bào trứng hoàn toàn trong đ iều k i ệ n i n v i t ro và sự p h á t t r i ể n của các sản phẩm sau thụ t inh đã được quan sát thường x u y ê n d ư ớ i k í n h h i ể n v i . T ế b à o t rứng tách rờ i sau kh i thụ t inh đã tạo thành phôi và tái sinh thành c â y h o à n ch ỉnh trong ống nghiệm. T ế bào trung t âm của túi phôi (2n n h i ễ m sắc thể) sau k h i thụ t inh v ớ i n h â n của t ế bào hạt phấn đã tái sinh in vi tro thành n ộ i nhũ tam b ộ i ở c ác cây hoa thảo n h ư lúa m ì , lúa mạch, n g ô và lúa nước... Những thành công này đ a n g m ở ra k h ả n ă n g thao tác d i t ruyền dướ i k ính h iển v i nhằm tạo giống m ớ i , trong đ ó c ó các g iống tam b ộ i ở c ây t rồng.

2.3.4. Công nghệ tế bào tạo giống cây ăn quả không hạt, chất lượng cao và cây lâm ngh iệp ư u t h ế la i t h ô n g qua n u ô i c ấ y n ộ i n h ũ t a m b ộ i

H i ệ n t ạ i có ba phương pháp công nghệ t ế bào đ a n g được á p dụng rộng rãi đ ể tạo giống ưu t h ế lai k h ô n g hạt và giống ưu t h ế lai tam b ộ i thể k h ô n g hạt.

2.3.4.1. Phương pháp nuôi cấy và tái sinh cây từ nội nhũ tam bội

Phương pháp được sử dụng khá phổ b iến trong tạo giống cây ăn quả k h ô n g hạt ở cam quýt bưở i , chuối , t áo tây. . . và tạo giống cây rừng ưu t h ế la i tam b ộ i . P h ư ơ n g p h á p nuôi cấy n ộ i nhũ của hạt non đ ang được ứng dụng v ớ i cây ăn quả c ó m ú i đ ể tạo g iống cam quýt k h ô n g hạt, sạch bệnh.

2.3.4.2. Cứu phôi

H i ệ n tượng quả k h ô n g hạt có thể do phôi sau k h i h ình thành đã k h ô n g được t i ếp tục phát t r iển mà tiêu b iến đ i . H i ệ n tượng này đã được phát h i ện ở c ác giống nho k h ô n g hạt.

Ớ các giống này, hạt non phát t r iển đ ế n giai đoạn nhấ t đ ịnh r ồ i dừng l ạ i và bị t iêu b i ến .

Phương pháp m ớ i tạo giống k h ô n g hạt là lai hai giống k h ô n g hạt v ớ i nhau, hạt la i trước kh i bị teo đi đã được tách ra nuô i cấy in vitro để tái sinh thành cây . Đ â y là k ỹ thuật n u ô i

32

cấy m ô để cứu phôi hạt lai in vitro. T ạ i Israel, trong chương t r ình tạo g iống nho, m ỗ i n ă m lai tạo và nuôi cấy khoảng 30.000 phôi non, tạo ra 30.000 cây con lai F l g iống nho k h ô n g hạt đ ể khảo nghiệm nhằm chọn ra những con la i F l ưu v i ệ t nhấ t . Những con lai ưu v i ệ t sau đ ó sẽ được nhân nhanh bằng phương p h á p vô t ính phục vụ sản xuấ t .

2.3.4.3. Tạo giông đa bội thể4n

Phương p h á p cơ bản để tạo d ò n g tứ b ộ i thể là" xử lý colchicine t ế bào và m ô nh ị b ộ i in v ivo hoặc in vi tro hay bằng phương p h á p dung hợp các t ế b à o t rần nh ị b ộ i v ớ i nhau.

Cây giống đa b ộ i thể 4n sau k h i tạo được bằng x ử lý colchicine sẽ được lai v ớ i giống nhị b ộ i 2n đ ể tạo giống tam b ộ i k h ô n g hạt 3n (cây ăn quả) hoặc là g iống tam b ộ i thể ưu t hế lai có n ăng suất cao (các g iống dâu tằm).

Công nghệ t ế bào đã và sẽ đ ó n g g ó p vai t rò n g à y càng cao trong chọn tạo giống cây trồng. Những t i ến bộ m ớ i đây trong l ĩnh vực nuôi cấy t ế bào và m ô tách r ờ i như hạt phấn, bao phấn, t ế bào trứng và phô i non, n ộ i nhũ tam b ộ i , t ế b à o th ị t lá.. . cho phép công nghệ t ế bào t h â m nhập vào tấ t cả các l ĩnh vực tạo giống k h á c nhau. Đ ó là:

- Tạo giống ưu t h ế la i ;

- Tạo các dạng đ ộ t b iến và b iến đ ổ i gen ( G M O ) ;

- Tạo các dạng tam b ộ i thể ưu t h ế lai k h ô n g hạt ở cây ăn quả và các cây l ấ y lá, l ấ y gổ và l ấ y sợi;

- Tạo d ò n g t ế bào đ ộ t b iến hoặc b iến đ ổ i gen có k h ả n ăng sản sinh các dược chấ t ở quy m ô công nghiệp.

N h i ệ m vụ của các n h à khoa học là lựa chọn các c ô n g nghệ t i ế n t i ến nhấ t áp dụng vào phát t r iển n ô n g nghiệp, bảo vệ m ô i t rường và sức khoe con n g ư ờ i ở nước ta.

2.4. PHÁT MINH RA CÁC ỨNG DỤNG KHÁC NHAU CỦA KỸ THUẬT NUÔI CÂY

M Ô VÀ T Ế B À O

2.4.1. Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo giống sạch bệnh và nhân giống nhanh

- N ă m 1949, Limmasets và Cornuet đ ã phá t h i ệ n rằng virus p h â n b ố k h ô n g đồng nhấ t t rên cây và t hường k h ô n g thấy có virus ở v ù n g đ ỉnh sinh t rưởng.

- N ă m 1952, More l và Mar t in đã tạo ra cây sạch bệnh virus của 6 giống khoai tây từ nuôi cấy đ ỉnh sinh trưởng. Ngày nay, kỹ thuật này vớ i một số cả i t i ến đã trở thành phương pháp loạ i trừ bệnh virus được dùng rộng rãi đ ố i vớ i nhiều loài cây trồng khác nhau.

- N ă m 1952, M o r e l và M a r t i n l ầ n đ ầ u t iên thực h i ệ n v i g h é p i n vi tro t h à n h c ô n g . K ỹ thuật v i g h é p sau đ ó đã được ứng dụng rộng rãi t rong tạo nguồn g iống sạch bệnh virus và tương tự virus ở nh iều cây t rồng n h â n g iống bằng p h ư ơ n g p h á p vô t ính k h á c nhau, đặc b iệ t là tạo g iống cây ăn quả sạch bệnh.

- N ă m 1960, More l đã thực h i ện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng k ỹ thuật nuô i

cấy đ ỉnh sinh t rưởng trong nhân nhanh các loạ i đ ịa lan Cymbidium, m ở đầu công nghiệp v i nhân giống thực vật .

33

2.4.2. K ỷ t h u ậ t n u ô i c ấ y , t á i s inh t ế b à o t r ầ n v à l a i t ế b à o soma

- N ă m 1960, Cocking lần đ ầ u t iên sử dụng enzym p h â n g i ả i t h à n h t ế b à o và đ ã tạo ra số lượng l ớ n t ế b à o t rần. K ỹ thuật này sau đ ó đã được h o à n th i ện đ ể t ách n u ô i t ế b à o t rân ở nh iều cây t rồng k h á c nhau.

- N ă m 1971, Takebe và cs., đã tái sinh được cây từ t ế b à o t rần m ô th ị t lá (mesophill cell) ở thuốc lá.

- N ă m 1972, Carlson và CS-, l ầ n đ ầ u t iên thực h i ệ n lai t ế b à o soma giữa c á c loài , tạo được cây từ dung hợp t ế bào t rần của 2 loài thuốc lá Nicotiana glauca và N. langsdorfii.

- N ă m 1978, Melchers và cs., tạo được cây lai soma "cà chua - thuốc lá" bằng la i xa t ế bào t rần của hai cây này. Đ ế n nay, việc tái sinh cây h o à n ch ỉnh từ t ế b à o t rần hoặc từ lai t ế bào t rần đã thành công ở nh iều loài thực vật .

2.4.3. Kỹ thuật đơn bội và ứng dụng tạo dòng thuần, cố định ưu thế lai

- N ă m 1964, Guha và Maheshwari l ầ n đ ầ u t iên t h à n h c ô n g t rong tạo được c â y đ ơ n b ộ i từ n u ô i cấy bao phấn của cây cà Datura. K ỹ thuật n à y sau đ ó đ ã được n h i ề u t ác g i ả

phá t t r i ể n và ứng dụng rộng rãi trong tạo d ò n g đ ơ n b ộ i ( l x ) , d ò n g thuần nh ị b ộ i k é p (2x) , c ố đ ịnh ưu t h ế la i (nuô i cấy bao phấn hoặc hạt phấn của d ò n g l a i F l đ ể t ạo g iống

thuần mang t ính t rạng ưu t h ế la i ) .

2.4.4. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào dịch lỏng (suspensỉon culture) sử dụng trong sản

x u ấ t c á c c h ấ t hoạ t t í n h s inh học

- N ă m 1959, Tulecke và N icke l l đã thử ngh iệm sản xuấ t sinh k h ố i m ô thực vật quy m ô lớn (134 lít) bằng nuôi cấy ch ìm.

- N ă m 1977, Noguchi và cs., đã nuô i cấy t ế b à o thuốc lá t rong bioreactor dung t ích lớn 20.000 lít.

- N ă m 1978, Tabata và cs., đã nuôi t ế bào cây thuốc ở quy m ô c ô n g nghiệp phục vụ sản xuấ t shikonin. H ọ đ ã chọn lọc được d ò n g t ế b à o cho sản lượng các sản p h ẩ m thứ cấp (shikonin) cao hơn .

- N ă m 1985, Flores và Filner l ầ n đầu t iên sản xuấ t chấ t trao đ ổ i t hứ cấp từ n h â n n u ô i rễ tơ ở Hyoscyamus muticus. Những rễ này sản xuấ t nh iều hoạt chấ t hyoscyamine h ơ n

cây tự nh iên .

H i ệ n nay, c ô n g nghệ n u ô i c ấ y t ế b à o và m ô (ví d ụ , m ô r ễ của n h â n s â m ) t rong các bioreactor dung t ích l ớ n đã được t h ư ơ n g m ạ i hoa ở mức c ô n g ngh iệp đ ể sản x u ấ t sinh dược.

2.4.5. Tạo các biên dị dòng tế bào soma ứng dụng trong chọn tạo giống và xác định

chức n ă n g của c á c gen

N ă m 1981, trên cơ sở quan sát các b iến d ị xảy ra rấ t phổ b i ế n trong nuô i cấy m ô và

t ế bào vớ i phổ b iến d ị và tần số b iến d ị cao, Lark in và Scowcroft đ ã đưa ra thuật ngữ

34

"b iến d ị d ò n g soma" (somaclonal variation) để ch ỉ c ác thay đ ổ i d i t ruyền t ính t rạng xảy

ra do nuô i cấy m ô và t ế bào in vitro. T ừ các d ò n g t ế b à o hoặc cây b i ến d ị d i t ruyền ổn

đ ịnh c ó thể nhân nhanh, tạo ra các d ò n g và giống đ ộ t b i ế n có n â n g suất, h à m lượng hoạt

chấ t hữu ích cao, k h á n g một số các đ iều k i ệ n bấ t l ợ i n h ư bệnh, mặn , hạn,. . .

2.4.6. Công nghệ tế bào ứng dụng trong chuyển gen vào cây trồng

Đ ế n nay các n h à khoa học đã khẳng đ ịnh rằng mức đ ộ thành công của chuyển gen

vào cây trồng phụ thuộc rấ t nh iều vào h ệ thống n u ô i cấy và tái sinh t ế b à o thành cây i n

vitro sau chuyển gen.

- N ă m 1974, Zaenen và cs., đã phát h i ện plasmid T i đ ó n g vai t rò là y ế u t ố gây u

(crown gall) ở cây t rồng.

- Năm 1977, Chilton và cs., đã chuyển thành công T - D N A vào thực vật.

- N ă m 1979, Marton và cs., đã xây dựng quy t r ình chuyển gen vào t ế bào t rần thông

qua Agrobacterium, bằng phương p h á p đồng nuô i cấy t ế bào t rần và Agrobacterỉum.

- N ă m 1982, Krens đã chuyển thành công A D N vào t ế b à o t rần.

- N ă m 1985, Fraley và cs., th iế t k ế vector plasmid T i đã l o ạ i bỏ c ác gen độc gây hạ i

để sử dụng cho việc th iế t k ế vector chuyển gen vào thực vật . C ù n g trong n ă m , Horsch và

cs. đã chuyển gen vào mảnh lá bằng Agrobacterium tumeỷaciens và tái sinh cây chuyển

gen. A n và cs. (1985) đã phát t r iển hệ thống hai vector cho chuyển gen thực vật .

- N ă m 1987, K l e i n và cs. đã sử dụng súng bắn gen (particle gun) mang v i đ ạ n trong

chuyển gen và tái sinh được cây b iểu h iện gen chuyển.

- N ă m 1994, thương m ạ i hoa giống cà chua chuyển gen 'Flavr-Savr'.

2.5. NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT

2.5.1. M ộ t số c á c m ô i t r ư ờ n g cơ b ả n t h ư ờ n g d ù n g t r o n g n u ô i c ấ y m ô

Thành phần hoa học của m ô i t rường đ ó n g vai t rò quyết đ ịnh đ ố i v ớ i thành công của

nuôi cấy t ế bào và m ô thực vật . M ỗ i loài cây , thậm ch í m ỗ i k i ể u gen, các k i ể u nuôi cấy

khác nhau (nuôi cấy m ô sẹo, huyền phù t ế bào , t ế bào t rần, bao phấn, hạt phấn...) có

những đòi h ỏ i k h á c nhau về thành phần m ô i t rường. K h i bắ t đ ầ u nuô i cấy m ô mộ t loài

m ớ i hoặc mộ t giống m ớ i , cần phải lựa chọn cho đ ố i tượng n g h i ê n cứu m ộ t loạ i mô i

t rường cơ bản phù hợp.

Cho đến nay, các nhà khoa học đã tạo ra số lượng rấ t l ớ n các m ô i t rường th ích hợp

vớ i từng đ ố i tượng và mục tiêu ngh iên cứu. M ộ t số m ô i t rường cơ bản thường được sử

dụng trong nuôi cấy m ô và t ế bào thực vật, và thành phần hoa học của c h ú n g được thể h iện ở bảng d ư ớ i đây :

35

Bảng 2.3. Một số môi trường cơ bản thường được sử dạng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật (Đơn vị khối lượng mgỉl)

Thành phần

Murashige & Skoog (1962)

MS

White (1963)

Gamborg (1968)

Bõ

Heller (1953)

Schenk &

Hildebrandt (1972)

Chu & Cs

(1975) N6

Nitsch & Nitsch (1967)

Knop (1865)

KNO3 1.900 80 2.500 - 2.500 2.830 125 250

NH 4N0 3 1.650 - - - - - - -

(NH4)2S04 - - 134 - - r 463 - -

Ca(N03)2.4H20 - 200 - - - 500 1,400

CaCI 2H 20 440 - 150 75 200 166 - -

MgS04.7H20 370 360 250 250 400 185 125 250

KH 2P0 4 170 - - - 400 125 250

NaH2P04 H 20 - 16,5 150 125 - - -

NH 4H 2P0 4 - - - - 300 - - .

FeS0 47H 20 27,8 - 27,8 - 15 27,8 27,8 -

Na2EDTA 37,3 - 37,3 - 20 37,3 37,3 -

KI 0,83 0,75 0,75 0,01 1,0 0,8 - -

H3BO3 6,2 1,5 3 1 5 1,6 10 -

MnS0 44H 20 22,3 5 10 (1 H 20)

0,1 10 3,3 25 -

ZnS0 47H 20 8,6 3 2 1 1 1,5 10 -KCI - 65 - 750 - - 120 CuS04 5H 20 0,025 - 0,025 0,03 0,2 0,025 0,025 -CoCI26H20 0,025 - 0,025 - 0,1 0,025 0,025 -Na 2M 0O 4.2H 20 0,25 - 0,25 - 0,1 0,025 0,25 -Na2S04 - 200 - - - - -NaNOa - - - 600 - - -H 2S0 4 - - - - - - -Fe2(S04)3 - 2,5 - - - - -NiCI2 6H 20 - - - 0,03 - - -AICI3 - - - 0,03 - - -FeCI36H20 - - - 1 - - -FeC 60 6H 7 5H 20 - - - - - - -Sucrose Glucose

30.000 20.000 20.000 20.000 30.000 30.000 -90.000

20.000-30.000- _

Myo-lnositol 100 - 100 - 1.000 100 -Nicotinic Acid 0,5 0,5 1,0 - 0,5 0,5 5 -

Pyridoxine. HCI 0,5 0,1 1,0 • 0,5 ' 0,5 0,5

36

Thành phần

Murashige & Skoog (1962)

MS

VVhite (1963)

Gamborg (1968)

B5

Heller (1953)

Schenk &

Hildebrandt (1972)

Chu & Cs

(1975) N6

Nitsch & Nitsch (1967)

Knop (1865)

Thiamine.HCI 0,1-1 0,1 10 1 5 0,1-10 0,5 •

Glycine 2 3 • 2 2 •

Ca-Pantothenate 1 • " -

Biotin • • • 0,05 -

Cysteine.HCI • 1 - • - -

Folic Acid ~ • • • 0,5 -

Glutamine * • • •

Bảng 2.4. Môi trường MS (Murashige & Skoog 1962) Murashige T. and Skoog F. 1962. A revised mediumỷor rapid growth and bio-assays

with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15, 473-497.

Muối khoáng Nồng độ Nồng độ

Đa lượng (mg/l) Vi lượng (mg/l)

Potasium nitrate (KN03) 1.900 Manganese sulfate (MnS04. 4H 20) 22,3

Ammonium nitrate (NH4N03) 1.650 Boric acid (H3BO3) 6,2

Calcium chloride (CaCI2.H20) 440 Colbalt chloride (CoCI2.6H20) 0,025

Magnesium sulíate (MgS04.7H20) 370 Cupric Sulíate (CuS04.5H20) 0,025

Potassium phosphate (KH2P04) 170 Ferrous sulíate (FeS04.7H20) 27,8

Na2EDTA.2H20 37,2

Potassium lodine (KI) 0,83

Sodium molybdate (Na2Mo04.2H20) 0,25

Zinc Sulíate (ZnS04.7H20) 8,6

Các chất hữu cơ

Myo-inositol 100 Nicotinic acid 0,5

Pyridoxine.HCI 0,5 Thiamine.HCI 0,1

IAA 1-30 mg/l Kinetin 0,04-10 Glycine (recrytallized) 2.0 g/l Edamine 1,0 g/l Sucrose 20 g/l Agar 10 g/l

37

2.5.2. T h à n h p h ầ n hoa học của c á c m ô i t r ư ờ n g n u ô i c ấ y m ô , t ế b à o t h ự c v ậ t

M ô i t rường nuô i cấy m ô và t ế bào thực vật tuy rấ t đ a dạng n h ư n g đ ề u g ồ m m ộ t số thành phần cơ bản sau:

- Các m u ố i k h o á n g đa lượng và v i lượng

- Các vi tamin

- Các amino axit

- Nguồn cácbon : một số các loạ i đường

- Các chấ t đ iều hoa sinh t rưởng

- Các chấ t hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết n ấ m men, d ịch ch iế t khoai t ây , bộ t chuối khô . . .

- Chấ t l àm thay đ ổ i trạng thái m ô i t rường: các l o ạ i thạch (agar).

Tấ t cả các hợp chấ t này đ ề u tham gia vào mộ t hoặc nh iều chức n ă n g trong sự sinh t rưởng và phân hoa của thực vật nuô i cấy in vi tro.

Các nhà khoa học sử dụng các m ô i t rường nuôi cấy rấ t k h á c nhau. V i ệ c lựa chọn môi t rường nuôi cấy vớ i t hành phần hoa học đặc t rưng phụ thuộc vào m ộ t số y ế u t ố :

- Đ ố i tượng cây trổng hoặc m ô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu k h á c nhau v ề t hành

phần m ô i t rường.

- M ụ c đ ích ngh iên cứu hoặc phương thức nuô i cấy k h á c nhau (nuô i cấy tạo m ô sẹo phôi hoa hoặc phôi vô t ính, nuô i cấy t ế bào t rần hoặc dịch lỏng t ế b à o , v i n h â n giống. . . ) .

- Trạng thái mô i t rường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng. . . ) .

- Các m ô i t rường k h o á n g cơ bản được sử dụng nh iều nhấ t trong n u ô i cấy t ế b à o thực vật là M S (Murashige and Skoog, 1962), B5 (Gamborg cs. 1968), Whi t e (1963). (xem bảng thành phần các mô i t rường).

2.5.2.1. Các chất khoáng

Đ ọ i vớ i cây trồng, các chấ t vô cơ đ ó n g vai t rò rấ t quan t rọng. V í dụ , M g là m ộ t phần của phân tử d iệp lục, Ca là thành phần của m à n g t ế bào , N là t hành phần quan t rọng của amino axit, vi tamin, protein và các axit nucleic. Tương tự, Fe, Z n và M o cũng là t hành

phần của một số enzym.

Các môi t rường khác nhau có h à m lượng và thành phần chấ t k h o á n g k h á c nhau, v í dụ thành phần và nồng độ k h o á n g của m ô i t rường Whi te hoặc Knop k h á n g h è o nàn , nhưng l ạ i rấ t giàu ớ mô i t rường M S và B5.

M u ố i k h o á n g là thành phần k h ô n g thể th iếu trong các m ô i t rường nuôi cấy m ô và t ế

bào thực vật:

- M u ố i khoáng là các vật l i ệ u (nguồn N , s, p...) cho sự tổng hợp các chấ t hữu cơ. Nitơ, lưu huỳnh, phospho là các thành phần k h ô n g thể th iếu của các phân tử protein, các axit nucleic và nhiều chấ t hữu cơ khác . Canxi và axit boric được t ìm thấy chủ y ế u ở thành t ế bào , đặc biệt là canxi có nh i ệm vụ quan trọng g iúp ổn đ ịnh m à n g sinh học.

38

- Đ ó n g vai t rò n h ư mộ t thành phần k h ô n g thể t h iếu của nh iều enzym (là các co-

factor): m a g i ê , k ẽ m , sắt... và nhiều nguyên t ố v i lượng là những phần quan trọng của các enzym.

- C á c lon của các m u ố i hoa tan đ ó n g vai t rò quan t rọng ổn đ ịnh á p suất t h ẩ m thấu của m ô i t rường và t ế bào , duy trì t h ế đ i ệ n hoa của thực vậ t . V í dụ , K và c rấ t quan t rọng trong đ i ề u hoa t ính t h ấ m lọc của t ế bào , duy trì đ i ệ n t h ế và tham gia hoạt hoa nh iều enzym.

Trong m ô i t rường, các m u ố i k h o á n g được chia thành các n g u y ê n t ố v i lượng và đa lượng:

- Các n g u y ê n t ố đa lượng g ồ m 6 n g u y ê n tố : M g , Ca, p, s, N và K .

- Các n g u y ê n t ố v i lượng g ồ m : Fe, M n , Zn , Cu, M o , Co, B, ì, N i , C l , A I , . . .

V i ệ c chia thành các n g u y ê n t ố v i lượng và đa lượng chủ y ế u dựa t rên nhu cầu của thực vật đ ố i vớ i các chấ t này . Nhu cầu của thực vật đ ố i v ớ i các n g u y ê n t ố đa lượng là l ớ n

hơn, vớ i nồng đ ộ > 0,5 m M . Các n g u y ê n t ố v i lượng được sử dụng trong m ô i t rường ở

nồng đ ộ < 0,5 m M .

Nhu cầu của cây đ ố i v ớ i n g u y ê n t ố v i lượng là rấ t thấp. Do vậy những n g u y ê n t ố này cũng có mặ t trong m ô i t rường ở các nồng đ ộ tương ứng. H ầ u hết các n g u y ê n t ố v i lượng

sử dụng ở lượng ịimol. M ộ t số n g u y ê n t ố v i lượng có nhu cầu nhỏ hơn có thể thay t h ế d ễ dàng bằng sự l ẫ n tạp n g ẫ u nh iên của c h ú n g trong các t hành phần của m ô i t rường như agar, các chấ t bổ sung n h ư nước dừa, dịch chiết n ấ m men (yeast extract), các m u ố i và nước. T ầ m quan trọng của m ộ t số n g u y ê n t ố v i lượng trong thành phần m ô i t rường còn chưa được h iểu m ộ t c á c h rõ ràng . Co, A I , N i . . . c ó thể c ó l ợ i đ ố i v ớ i thực vật nhưng cũng

có thể là k h ô n g cần thiết . Trong thực t ế , hầu hết các n g u y ê n t ố v i lượng ch ỉ có phần khoáng của m u ố i (cation) là quan trọng, c ò n vai t rò các anion c ó thể là k h ô n g cần thiết .

lon SO^7 d ư thừa trong m ô i t rường và chủ y ế u phát sinh từ c ác m u ố i M g S 0 4 , K 2 S 0 4 .

Nhu cầu của thực vật đối với các nguyên tố đa lượng lớn hơn. Nguyên tố đa lượng có nồng độ cao nhấ t trong các m ô i t rường nuôi cấy m ô và t ế bào thực vật . N h ì n chung cả phần anion và cation của các n g u y ê n t ố đa lượng đ ề u quan t rọng đ ố i v ớ i t ế bào thực vật .

Ví dụ như K N O „ cả K + và N O " là cần thiết . Trong n h ó m các n g u y ê n t ố đa lượng, các

m u ố i có chứa n i tơ chủ yếu ở dạng ka l i nitrat, amonium hoặc canxi nitrat.

Các n g u y ê n t ố đa lượng

+ N i t ơ ( N ) :

T h à n h phần ch ính của hầu hết các m ô i t rường là n i tơ vô cơ d ư ớ i dạng nitrat ( N O " )

hoặc amonium ( N H 4 ) . Các m u ố i được dùng phổ b iến là ka l i nitrat (KNO3), nitrat amon

( N H 4 N 0 3 ) và canxi nitrat ( C a ( N 0 3 ) 2 . 4 H 2 0 ) . Những hợp chấ t n à y cung cấp n i tơ vô cơ cho thực vật đ ể tổng hợp các phân tử chấ t hữu cơ phức tạp.

39

A m o n i u m chủ yếu được d ự trữ ở rễ như nguồn n i tơ hữu cơ. Nitrat c ó t h ể được vận chuyển theo mạch xy lem đ ế n các bộ phận của cây , t ạ i đ ó n ó sẽ tham gia v à o q u á t r ình

đồng hoa nitơ. Nitrat có thể được d ự trữ ở k h ô n g bào và thực h i ệ n chức n ă n g quan t rọng

trong việc đ iều ch ỉnh sự thẩm thấu và cân bằng ion của cây t rổng.

Sự biên đổi nitrat: Nitrat k h ô n g thể sử dụng ngay l ậ p tức đ ể sinh tổng hợp c á c chấ t hữu cơ phức tạp m à trước t iên cần phải được k h ử t h à n h amoniac. Phản ứng d i ễ n ra như sau:

NO" + 8H+ + 8e~ -> NH3 + 2 H20 + OH"

Phản ứng này được thực hiện qua 2 bước nhờ hai enzym: nitrat reductase và nitrit reductase. Trước t iên, nitrat được b iến đ ổ i t hành ni t r i t n h ờ nitrat reductase. T i ế p theo,

nitr i t bị k h ử thành amoniac nhờ enzym ni t r i t reductase. Sự b i ến đ ổ i của nitrat t h à n h ni t r i t d i ễ n ra trong t ế bào chấ t . Trong hầu hết các cây trồng, sự k h ử nitrat c ó thể d i ễ n ra ở cả lá và đ ỉnh chồ i . Sự k h ử nitrat d i ễ n ra ở mức đ ộ n à o phụ thuộc rấ t l ớ n vào các n h â n t ố như: loài, t uổ i cây, nồng đ ộ nitrat. Cụ thể , các loài cây thân g ỗ c ó k h ả n ă n g k h ử nitrat rấ t cao. K h i nồng đ ộ nitrat thấp, sự k h ử hầu n h ư d i ễ n ra ở rễ . Ngược l ạ i , nếu nồng đ ộ nitrat cao thì quá tr ình này d i ễ n ra cả ở lá. Các cation kế t hợp v ớ i nitrat c ó vai t rò quan t rọng trong việc hấp thu nitrat. N ế u cation là K + thì hoạt động của enzym nitrat reductase ở rễ thấp và nitrat sẽ được vận chuyển lên các đ ỉnh chồ i của cây . Trong t rường hợp cation là Ca 2 +

thì sự k h ử ở rễ l ạ i d i ễ n ra mạnh hơn .

Sự k h ử nitr i t thành N H 3 nhờ enzym nitr i t reductase d i ễ n ra trong lá cây , trong đ ó đ iện tử cần th iế t cho phản ứng này được cung cấp từ sự k h ử các hợp chấ t sắt trong h ệ thống quang hợp.

Sự khử nitơ chứa trong các hợp chất: A m o n i u m và amoniac là những chấ t độc đ ố i v ớ i thực vật ngay ở nồng đ ộ thấp. Do đ ó chúng cần được chuyển hoa thật nhanh thành các hợp chấ t phân tử lượng nhỏ có chứa N như: asparagin, arginin, allantoin và betain. Sinh tổng hợp glutamin và glutamat d i ễ n ra cả ở rễ và đ ỉnh c h ồ i là các q u á t r ình c ơ bản trong sự chuyển hoa amonium.

Bên cạnh sự k h ử độc t ính của amonium và amoniac, các hợp chấ t chứa n i tơ p h â n tử lượng thấp còn có một số chức n ăng khác . Chức n ăng quan t rọng nhấ t là cung cấp N trong các l iên kế t hữu cơ và n h ó m - N H 2 được thực vật hấp thụ n h ư nguồn N hữu c ơ cho quá t r ình sinh tổng hợp các amino axit và protein. Các hợp chấ t phân tử lượng nhỏ n à y còn được sử dụng làm chấ t mang cation như M n , Cu đ ể v ận chuyển các cation qua h ệ thống mạch d ẫ n trong cây. Ngoà i ra, c h ú n g còn như mộ t kho d ự trữ n i tơ d ư thừa. Ngược l ạ i vớ i con ngườ i và động vật, thực vật k h ô n g thể bài t i ế t các hợp chấ t n i tơ hữu c ơ n h ư urê nhưng nhờ cơ c h ế này đã cho phép thực vật dự trữ được n i tơ hữu cơ.

+ Phospho (P):

Phospho ở dạng HPO4" được hấp thụ nhờ hệ thống rễ của thực vật và ngược l ạ i v ớ i

nitrat, sunfat, n ó k h ô n g bị khử. N ó có thể có mặ t trong thực vật d ư ớ i dạng p vô c ơ hoặc

40

dạng hợp chấ t este (R-O-P). N ă n g lượng thu được k h i g i ả i p h ó n g mộ t n g u y ê n tử p k h ỏ i các l iên kế t (cao năng lượng) là rấ t quan trọng đ ố i v ớ i quá t r ình trao đ ổ i chấ t của t ế bào .

Axit nucleic: p là một nguyên t ố thiết y ế u trong cấu tạo của A D N và A R N đ ể n ố i các đom phân tử axit ribonucleic để tạo thành đ ạ i phân tử.

Phospholipid: Phospholipid ở m à n g sinh học cũng có chứa mộ t lượng l ớ n p . Trong những phospholipid này, p (qua liên kế t este) tạo nên cầu n ố i giữa diglyxeri t v ớ i mộ t amin, axit amin hoặc một rượu. Phospholipid có mộ t đ ầ u háo nước, phân tử diglyxeri t và

một đầu k ỵ nước có chứa PO^". Cả hai đ ề u có chức n ăng quan t rọng trong việc g i ữ ổn

đ ịnh m à n g t ế bào . M à n g t ế bào bao g ồ m hai lớp phospholipid đơn ghép l ạ i tạo thành lớp m à n g kép l ip id . Đ ầ u ưa nước của lớp phospholipid quay ra ngoà i hướng về phía các phân tử nước trong kh i đuô i k ỵ nước l ạ i quay vào phía trong giữa hai lớp của m à n g t ế bào và

tương tác l ẫ n nhau.

Quá trình chuyển hoa năng lượng: Phospho ở dạng l iên k ế t este cao n ă n g (C-P) rấ t quan trọng đ ố i v ớ i q u á tr ình chuyển hoa n ăng lượng và tổng hợp sinh học ở thực vật . Đ ó n g vai t rò quan trọng hơn nữa là các l iên kế t cao năng giữa hai n g u y ê n tử p như trong phân tử A T P (P-P = 30 kJ). N ă n g lượng g iả i p h ó n g trong suốt q u á tr ình thúy phân glucoza, quá t r ình o x i hoa, phosphoryl hoa hoặc quang hợp được sử dụng để tổng hợp ATP. Ngược l ạ i nâng lượng này k h i cần l ạ i được g iả i p h ó n g ra qua phản ứng thúy phân A T P thành A D P và p vô cơ. V ì vậy A T P được chuyển hoa và tổng hợp m ớ i l iên tục. M ộ t g ă m đ ỉnh rễ đ ang trong giai đoạn trao đ ổ i chấ t mạnh có thể tổng hợp 5g ATP/ngày .

Vùng dự trữ p (phosphat): Trong t ế bào bao g ồ m hai vùng d ự trữ phosphat khác nhau. V ù n g trao đ ổ i , chủ yếu phosphat ở dạng este, nằm trong t ế bào chấ t và ty thể . V ù n g không trao đ ổ i , chủ yếu là dạng p vô cơ, nằm trong k h ô n g bào . N ế u ngừng cung cấp p cho cây , nồng đ ộ p vô cơ trong k h ô n g bào ngay l ập tức sẽ g i ả m trong k h i ở vùng trao đ ổ i tốc đ ộ g i ả m chậm hom nhiều. K h i t âng cường cung cấp p , nồng đ ộ p chứa trong các cơ quan của t ế bào cũng t ăng theo, tuy nhiên kh i tăng quá mức b ình thường tỊiì chỉ có p vô cơ trong k h ô n g bào tăng lên. V ì vậy có thể nó i , p d ư thừa được d ự trữ ở k h ô n g bào dướ i dạng p vô cơ.

Các enzym: p vô cơ cũng có k h ả n ă n g đ iều ch ỉnh tố t trong nh iều q u á t r ình trao đ ổ i chất của thực vật . V ậ y nên sự p h â n b ố p là cần th iế t đ ể đ iều ch ỉnh q u á t r ình trao đ ổ i

chấ t của t ế bào . Ở cà chua, sự g i ả m p vô cơ ở k h ô n g b à o trong t ế b à o chấ t k í ch th ích hoạt t ính của enzym p h o s p h o í r u c t o k i n a s e . Enzym này là enzym quan t rọng trong sự phân g i ả i cơ chấ t của phản ứng thúy p h â n glyco và l à m t ăng sự h ô hấp của t ế b à o trong

q u á t r ình ch ín . Cũng trong t hờ i gian này , sự t h i ếu hụ t p có thể l à m chậm q u á t r ình ch ín của quả.

Trong q u á t r ình tổng hợp t inh bột của lục lạp , p cũng đ ó n g m ộ t vai t rò quan trọng. Ch ỉ v ớ i nồng đ ộ thấp, p vô cơ đã có thể gây ức c h ế q u á t r ình tổng hợp t inh bột . Sở d ĩ

như vậy là do ADP-gluco-pyrophosphorylase, enzym quan t rọng nhấ t trong q u á t r ình tổng hợp t inh bột , bị k ì m h ã m bở i p vô cơ và được k ích th ích nhờ c ác triossephosphat. Vì t hế , sự cân bằng giữa các hợp chấ t có chứa p là rấ t quan t rọng trong đ i ề u hoa tổng

41

hợp t inh bột ở lục lạp . N g o à i ra, p vô cơ cũng tham gia q u á t r ình n à y theo m ộ t con đ ư ờ n g k h á c . Các p h â n tử vận chuyển phosphat ở m à n g t ế bao sẽ mang p v ô c ơ v à o t ế

b à o và các triosephosphat ra n g o à i t ế bào , l à m nồng đ ộ p v ô c ơ trong lục l ạ p t áng , triosephosphat g i ả m . Đ i ề u n à y l ạ i t ác động đ ế n q u á t r ình tổng hợp t i nh bộ t theo c ơ c h ê đ ã t r ình bày ở t rên . Ribuloza biphosphat (RuBP), v ớ i vai t rò n h ư m ộ t chấ t nhận C 0 2 , là hợp chấ t quan t rọng trong sự c ố đ ịnh C 0 2 . Sự tái tổng hợp n à y đ ò i h ỏ i p h ả i c ó c á c triosephosphat. K h i nồng đ ộ p v ô c ơ cao sẽ k í ch th ích g i ả i p h ó n g c á c triosephossphat ra k h ỏ i lục lạp , gây t h i ếu hụ t các chấ t này , do đ ó l à m k ì m h ã m q u á t r ình c ố đ ị n h C 0 2 . N g o à i ra, phospho c ò n quan trọng trong việc đ i ề u k h i ể n hoạt đ ộ n g của n h i ề u enzym

k h á c . N ồ n g đ ộ phospho t ố i ưu cho sự sinh t rưởng của thực vậ t là 0,3 - 0,5 g/kg t rọng lượng k h ô . Sự t h i ếu p l à m c ây chậm l ớ n , lá c ây c ó m à u xanh t h â m do t rong t h ờ i gian bị t h i ếu p, sự p h á t t r i ể n của lá chậm h ơ n sự tổng hợp d i ệp lục t ố n ê n l à m t ă n g nồng đ ộ d i ệp lục t ố trong lá cây .

+ L ư u h u ỳ n h (S):

Lưu huỳnh như SO4" được hấp thụ ở rễ cây v ớ i tốc đ ộ chậm. G i ố n g n h ư nitrat, lưu

huỳnh phải được k h ử trước k h i sử dụng đ ể sinh tổng hợp các hợp chấ t c ó chứa lưu huỳnh như amino axit, protein và enzym. Lưu huỳnh ở dạng chưa k h ử được k ế t hợp trong các sulpholipid và các polysaccharid.

Sự đồng hoa lưu huỳnh: Bước đầu tiên trong q u á t r ình đồng hoa lưu huỳnh là sự

hoạt hoa gốc SO4" nhờ enzym A T P sulfurylase. Phản ứng n à y tạo ra adenosine

phosphosulfate (APS) và p vô cơ. T i ế p theo là hai q u á t r ình hoa học h o à n toàn k h á c nhau. M ộ t q u á t r ình k h ô n g d i ễ n ra sự k h ử lưu huynh m à tạo l iên k ế t v ớ i c á c polysaccharid trong sulpholipid. Trong quả t r ình thứ hai, lưu huỳnh được k h ử t h à n h n h ó m -SH ( n h ó m thiol) và n h ó m su l fury l của APS được vận chuyển t ớ i gluthantione (Glut-SH). Sau đ ó n h ó m -SH được vận chuyển t ớ i cho acetylserine và p h â n t á ch t h à n h acetat và cystein. Cystein là sản phẩm bền đ ầ u t iên trong q u á t r ình đồng hoa và là t i ề n

chấ t của tấ t cả các hợp chấ t hữu cơ c ó chứa lưu huỳnh trong thực vật , v í d ụ như : protein, co-enzym, các hợp chấ t trao đ ổ i chấ t thứ cấp... Q u á t r ình đồng hoa lưu huỳnh chủ y ế u

d i ễ n ra ở lục lạp. K h i t h iếu lưu huỳnh, sinh tổng hợp protein bị k ì m h ã m , lượng d i ệp lục t ố trong lá cây bị g i ả m sút.

Các protein: Lưu huỳnh có mặ t trong các protein có chứa cystein và methionin. Cả hai axit amin này đ ề u là t i ền chấ t của tấ t cả các hợp chấ t c ó chứa lưu huỳnh trong thực vật. Lưu huỳnh, cấu tử hợp thành của nh iều coenzym và các n h ó m prosthetic, c ó chức năng quan trọng trong rấ t nh iều phản ứng ox i hoa khử, được b iểu d i ễ n n h ư sau:

R-SH + HS-R - > R-S-S-R

Gốc R có thể là phần còn l ạ i của phân tử cystein n h ư n g cũng c ó t hể là tr ipeptid gluthatione. Gluthatione tan được trong nước và do đ ó n ó đ ó n g vai t rò n h ư m ộ t h ệ o x i hoa k h ử ở lục lạp và dịch bào . Cầu lưu huỳnh giữa hai p h â n tử cystein rấ t quan t rọng trong cấu trúc bậc ba của phân tử protein và hoạt động của enzym. N h ó m -SH, n h ư đ ã đ ề

42

cập ở t rên c ó trong thành phần của các coenzym và APS, tạo t hành m ộ t phần của n h ó m

chức n ăng trong phân tử enzym.

Các metallothionein: CÁC hợp chấ t phân tử lượng thấp có chứa lưu huỳnh-metallothionein, thường hay được t ìm thấy trong thực vật . H ầ u hết các chấ t này đ ề u c ó

chứa cystein. Đặc biệt , các k i m loạ i như: đồng, cadimi và k ẽ m thường l iên kế t trong

metallothionein. Gần như chắc chắn những phân tử protein nhỏ này tham gia vào sự bài t iế t các ion k i m l oạ i t rên k h i chúng d ư thừa, trước k h i l iên kế t v ớ i n h ó m chức n ă n g -SH

của các enzym.

Lưu huỳnh chưa bị khử: Lưu huỳnh ở dạng chưa bị k h ử là thành phần cấu tạo sulpholipid, là phần tử tạo thành cấu trúc của m à n g sinh học. Lưu huỳnh thường có mặ t ở dạng hợp chấ t este của lưu huỳnh và đường 6 cacbon, ví dụ n h ư glucoza. Sulpholipid có nhiều trên m à n g thylakoid của lục lạp và tham gia vào q u á ư ì n h vận chuyển ion qua m à n g sinh học. H ơ n nữa, sự c ó mặ t của sulpholipid t rên m à n g t ế bào chắc chắn liên quan đến khả năng ch ịu m u ố i của thực vật . M ù i vị đặc t rưng của m ộ t số loài như: hành , t ỏ i chủ yếu c ó l iên quan đ ế n sự có mặ t của các hợp chấ t có chứa lưu huỳnh d ễ b i ến đ ổ i .

+ K a l i ( K ) :

Trong thực vật , K + là mộ t cation có t ính l inh động cao, ở cả mức đ ộ t ế bào cũng như trong quá t r ình vận chuyển qua các khoảng cách dài trong mạch xy lem hoặc mạch libe. Trong tấ t cả các n g u y ê n tố , ka l i là n g u y ê n t ố có mặ t v ớ i nồng đ ộ cao nhấ t , ở t ế bào chấ t từ 100-200 m M , ở lục lạp từ 20-200 m M .

M u ố i ka l i có vai trò quan trọng trong việc đ iều ch ỉnh t ính t h ấ m của t ế bào . Đ ố i v ớ i sự dãn t ế bào cũng như các quá tr ình khác được đ iều ch ỉnh nhờ sức t rương của t ế bào , K +

có vai t rò như mộ t lon trung hoa các lon vô cơ và hữu cơ hoa tan trong dung dịch, đồng thờ i duy trì p H trong khoảng 7 - 8 là p H th ích hợp cho hoạt động của hầu hết các enzym.

Vai trò của K+ đối với các enzym: K + cần th iế t cho hoạt động của nh iều enzym.

Trên 50 enzym của thực vật hoạt động v ớ i sự tham gia của K + hoặc bị k ích th ích bói K + . Sự liên kế t của K + v ớ i enzym gây ra sự thay đ ổ i cấu h ình k h ô n g gian của enzym, do đ ó làm tăng ái lực của enzym v ớ i cơ chấ t . K h i th iếu K + n g ư ờ i ta thấy c ó sự t ăng nồng độ đường hoa tan và các hợp chấ t chứa nitơ, k è m theo sự g i ả m nồng đ ộ t inh bột, chủ y ế u do

vai trò thiết yếu của ka l i đ ố i v ớ i việc đ iều kh iển hoạt động enzym trong q u á t r ình trao

đ ổ i cacbon. Enzym ATPase m à n g t ế bào cũng chịu sự tác động của K + . Ở cây t rưởng thành, K + cần cho quá tr ình tổng hợp protein. K + còn cần th iế t trong q u á t r ình dịch m ã và tổng hợp t R N A ở ribosome. Sự tổng hợp ribuloza biphosphat cacboxilase cũng phụ thuộc rấ t mạnh vào nồng đ ộ K + . Đ â y còn là ion cần th iế t cho hoạt động và tổng hợp enzym nitrat reductase.

Bên cạnh vai t rò trong hoạt động của nhiều enzym, K + c ò n đ iều ch ỉnh sự cân bằng ion và p H của lục lạp trong quang hợp. K + là lon trung hoa quan trọng nhấ t cho sự đưa d ò n g H + qua m à n g thylakoid. lon này cũng có mặ t trong sự tạo thành gradiep p H m à n g t ế bào cần th iế t cho quá trình tổng hợp ATP. Sự t ăng nồng đ ộ K + d ẫ n đ ế n sự t ăng cường quá tr ình quang hợp, h ô hấp và hoạt động của enzym ribuloza biphosphat cacboxilase.

43

Sự dãn của tế bào: Sự t ăng k ích thước của k h ô n g b à o trung t â m ư o n g t ế b à o là một quá t r ình quan trọng trong sự dãn t ế bào . Đ ể h ình thành k h ô n g b à o , đ ầ u t iên là sự tăng k ích thước đủ l ớ n của thành t ế bào , t i ếp theo k h ả n ăng t hẩm thấu của k h ô n g b à o t ăng lên. Đ i ề u này có thể đạt được nhờ sự t ích tụ K + gây ra sự t ăng mạnh v ề t h ể t ích của k h ô n g bào do t ính t hấm. G A 3 và K + dường như có tác dụng h ỗ t rợ nhau trong vai t rò l à m tăng ch iều cao cây .

Sự cân bằng ion: K + c ó vai t rò quan trọng cho việc duy trì c ân bằng lon . N ó trung hoa các anion k é m l inh động trong t ế bào chấ t và rấ t nh iều các anion l i nh động trong mạch xylem, libe và k h ô n g bào . Trong q u á tr ình trao đ ổ i nitrat, K + c ó chức n ă n g chủ y ế u

là vận chuyển ion N O " qua những khoảng cách dài trong mạch x y l e m hoặc d ự t rữ trong

không bào. Sau q u á tr ình k h ử nitrat trong lá cây, lượng K + c ò n l ạ i được sử dụng đ ể tổng hợp các axit hữu cơ trung hoa ion K + . Các m u ố i ka l i của các axit hữu c ơ n h ư k a l i malat được vận chuyển tớ i rễ , sau đ ó K + có thể nhận ion nitrat ở t ế b à o rễ và vận chuyển c h ú n g qua mạch xylem.

+ C a n x i (Ca) :

Ca là thành phần quan trọng của thành t ế bào và m à n g t ế bào . Số lượng l ớ n Ca 2 + gắn trên thành t ế bào đ ó n g vai trò chủ y ế u trong việc củng c ố đ ộ vững chắc cho t h à n h t ế bào

và đ iều hoa cấu trúc m à n g t ế bào . Sự vận chuyển Ca 2 + từ ngoà i qua m à n g v à o t ế bào

chấ t , trong phloem cũng n h ư từ t ế bào này sang t ế bào k h á c là rấ t hạn chế .

lon Ca 2 + tự do có mặ t trong t ế bào ở nồng đ ộ rấ t thấp, khoảng l | i M c ó tác dụng n g ă n chặn sự kế t tủa p vô cơ. Do h à m lượng lon Ca 2 + trong t ế b à o thấp n ê n k h ô n g c ó sự cạnh tranh vớ i lon M g 2 + về v ị trí gắn cation và t ránh l à m bấ t hoạt enzym. l o n Ca 2 + ch ỉ c ó thể d i chuyển qua m à n g t ế bào theo mộ t ch iều (Ca 2 + ch ỉ ra ngoà i t ế b à o được n h ư n g k h ô n g vào được) , do đ ó đ ả m bảo được nồng đ ộ ion Ca 2 + n ộ i b à o thấp. Đặc b iệ t trong các t ế bào

lá, có một lượng l ớ n canxi l iên kế t v ớ i các k h ô n g bào . Canxi cần th iế t cho sự th iế t l ập cân bằng lon nhờ trung hoa các anion hữu cơ và vô cơ. H ầ u n h ư canxi ở dạng l iên k ế t tạo m u ố i ocxalat. M ặ c dù hợp chấ t này k h ó tan nhưng n ó c ó vai t rò duy trì nồng đ ộ lon Ca 2 +

thấp trong lục lạp và t ế bào chấ t . M u ố i canxiocxalat c ò n c ó chức n ă n g đ i ề u ch ỉnh sự thẩm thấu của t ế bào . Canxi có vai t rò quan t rọng trong q u á t r ình n h â n lên của t ế b à o và

rễ . Ngoà i ra sự phát t r iển của ống phấn cũng phụ thuộc vào canxi, đ â y là q u á t r ình được đ ịnh hướng nhờ canxi ngoại bào . I A A tham gia vào quá t r ình vận chuyển canxi . Chấ t ức c h ế auxin như T I B A cũng ức c h ế sự phân phối Ca 2 + trong thực vật l à m xuấ t h i ệ n sự t h i ếu

hụt canxi.

Vai trò của Ca đối với thành tế bào: Pectin là thành phần quan trọng của m à n g l iên kết giữa các b ế bào v ớ i nhau và được phân huy nhờ enzym polygalacturonase. Tuy nhiên , Ca ức c h ế mạnh hoạt động của polygalacturonase. Hoạt động mạnh của enzym này được ghi nhận k h i th iếu Ca. N ế u nồng đ ộ Ca có đủ thì hầu hết các pectin sẽ t ồ n t ạ i dướ i dạng m u ố i canxipectat. N h ờ vậy, thành t ế bào có k h ả n ă n g chống ch ịu tố t đ ố i v ớ i hoạt động phá huy của enzym polygalacturonase. Sự có mặ t của lon Ca 2 + cũng có vai t rò

quan trọng trong việc ngăn chặn sự x â m n h i ễ m n ấ m .

44

l on Ca 2 + có tác động lớn đến sự ổn đ ịnh của m à n g t ế bào . Sự th iếu lon Ca 2 + sẽ l àm

t ăng k h ả n ăng thoát ra ngoài m à n g t ế bào của các hợp chấ t phân tử lượng nhỏ . M à n g t ế

bào c ó thể sẽ bị phân huy hoàn toàn k h i th iếu hụ t n g h i ê m trọng lon Ca 2 + . l on Ca 2 + có khả năng làm ổn đ ịnh m à n g t ế bào thông qua sự tương tác v ớ i các n h ó m phosphat, cacboxil của hợp chấ t phospholipid và protein có mặ t trong m à n g t ế bào .

' Các enzym: K h á c v ớ i m a g i ê là n g u y ê n t ố tham gia v à o q u á t r ình hoạt hoa của rấ t n h i ề u enzym, canxi ch ỉ c ó t ác động lên m ộ t vài enzym như : amilase và ATPase. Canxi chủ y ế u k í c h th í ch c á c enzym m à n g t ế b à o , m à hoạt đ ộ n g của những enzym này được quy đ ịnh n h ờ c ấ u t rúc m à n g . Tuy n h i ê n , lon C a 2 + cũng c ó t ác dụng k ì m h ã m m ộ t số enzym của t ế b à o chấ t . Ca lmodul in t rong t ế b à o c ó k h ả n ă n g hoạt hoa các enzym n h ư phospholipase bằng c á c h tạo t h à n h phức của Ca 2 + - ca lmodul in v ớ i enzym. N g o à i -à, n g ư ờ i ta c ò n cho rằng ca lmodul in c ó vai t rò t rong v iệc v ậ n chuyển ion Ca 2 + t ớ i k h ô n g b à o .

+ M a g i ê ( M g ) :

M g 2 + là mộ t lon rấ t l inh động có khả năng h ình thành phức v ớ i các n h ó m chức năng khác nhau.

Vai trò của Mg2+ đối với quang hợp: M g 2 + là n g u y ê n tử trung t â m trong phân tử chlorophyl của h ệ quang hợp ì và n . Trong phân tử chlorophyl, các photon được hấp thụ tạo ra d ò n g đ i ệ n tử, từ đ ó tạo ra A T P và N A D P H đ ó n g vai t rò quan t rọng đ ố i v ớ i c ố đ ịnh C 0 2 . N ế u M g 2 + có mặ t v ớ i nồng đ ộ t ố i ưu th ì khoảng 10-20% ion M g 2 + trong lá được cố đ ịnh ở lục lạp. Nồng đ ộ cao các ion M g 2 + và K + là cần th iế t để duy trì p H khoảng 6,5 - 7,5 t rong lục lạp và t ế b à o chấ t , t rá i v ớ i ở k h ô n g b à o p H ch ỉ vào khoảng 5 - 6. Trong m ộ t chừng mực n à o đ ó , p H xác đ ịnh cấu t rúc của protein và enzym n ê n n ó ảnh hưởng đ ế n q u á t r ình sinh tổng hợp protein và chức n ă n g của lục l ạp .

Vai trò của Mg2+ đối với hoạt tính của các enzym: M g 2 + là lon cần th iế t cho cấu trúc bậc ba của nh iều phức enzym - cơ chấ t vì n ó tạo ra dạng cấu t rúc k h ô n g gian phù hợp giữa enzym và cơ chấ t . M g 2 + tham gia vào quá tr ình tổng hợp protein v ớ i nh iều cấp độ khác nhau. M g 2 + tạo thành cầu n ố i giữa các d ư ớ i đơn vị của ribosome. K h i th iếu

M g 2 + , các d ư ớ i đơn vị sẽ bị t ách ra và quá t r ình tổng hợp protein bị ngừng l ạ i . Sự hoạt động của các enzym như: A R N polymerase tham gia vào q u á t r ình sinh tổng hợp A R N

đòi h ỏ i phải c ó mặ t M g 2 + , do đ ó th iếu M g 2 + sẽ k ì m h ã m sinh tổng hợp A R N . ở lá cây, 25% protein tổng số nằm trong lục lạp , nếu th iếu M g 2 + thì ngay l ập tức cấu t rúc và chức năng của lục lạp bị ảnh hưởng.

M g 2 + còn quan trọng trong hoạt động của enzym ribulose biphosphat cacboxilase. Đ â y là mộ t enzym phụ thuộc nhiều vào p H và M g 2 + . L i ên kế t của M g 2 + v ớ i enzym làm tăng ái lực v ớ i cơ chấ t C 0 2 và Vmax.

Vai trò của Mg2+ đối với chuyển hoa năng lượng: M g là mộ t chấ t k h ô n g thể th iếu

trong quá t r ình chuyển hoấ năng lượng của thực vật do vai t rò quan trọng của n ó đ ố i v ớ i sinh tổng hợp A T P ( A D P + p vô cơ = ATP) , đặc b iệ t là ở lục l ạp . Trong q u á t r ình này , M g 2 + tạo t h à n h cầu n ố i giữa enzym và A D P . N g o à i ra, M g 2 + còn c ó k h ả n ă n g tạo phức

45

v ớ i A T P . Enzym ATPase v ậ n chuyển các n h ó m phosphoryl cao n ă n g , cung cấp cho protein hoặc đường . M ặ c d ù M g 2 + c ó nh iều chức n ă n g n h ư v ậ y n h ư n g hầu n h ư n ó l ạ i t ồ n t ạ i ở dạng d ự trữ t rong k h ô n g bào . T ạ i đây , n ó đ ó n g vai t r ò n h ư m ộ t i on t rung hoa v ớ i các anion hữu cơ và vô c ơ trong v iệc cân bằng ion .

á c n g u y ê n t ố v i lượng (Fe, B, C l , Co, Cu, M n , M o , Zn.. .)

+ S á t (Fe):

Trong cây , sắt chủ y ế u được gắn v ớ i các phức chấ t . H à m lượng Fe 2 + , Fe 3 + tự do rấ t thấp ( l o - 1 0 raM). H ầ u hết thực vật chỉ hấp thu Fe 2 + . Do đ ó , Fe 3 + cần được k h ử t h à n h Fe 2 +

ở bề mặ t rễ trước k h i n ó được chuyển vào trong t ế b à o chấ t (ch ỉ m ộ t số l o ạ i cỏ l à h ấ p thu sắt chủ y ế u d ư ớ i dạng Fe 3 + ) .

Trong k h i vận chuyển đi xa, qua mạch xy lem của cây , sắt chủ y ế u được d i chuyển d ư ớ i dạng hợp chấ t sắt-cacbonhydrate (ở dạng Fe 3 +-citrate hay dạng phức hợp sắt-

peptid). Chức n ăng ch ính của sắt trọng thực vật là tạo các l iên k ế t sắt.

Các chức n ăng cơ bản nhữ mộ t hệ thống o x i hoa k h ử thuận ngh ịch được b i ể u d i ễ n trong phản ứng d ư ớ i đây:

Fe(H) <-> Fe(m) + e

Các hemoprotein (các protein chứa sắt): Các hemoprotein được b i ế t đ ế n nh i ều nhấ t là các cytochrome, có chứa mộ t phức hệ sắt-porphyrin. Các cytocrome tạo t h à n h m ộ t phần hệ thống o x i hoa trong chuỗ i t ruyền đ iện tử ở lục lạp và ty t h ể của t ế b à o thực vật .

Chức nâng của các cytocrome n h ư chấ t trung gian cho đ i ệ n tử, cần cho q u á t r ình k h ử nitrat thành ni t r i t nhờ enzym nitrat reductase trong q u á t r ình đồng hoa ni tơ.

Trong quá t r ình cố đ ịnh n i tơ ở cây h ọ đậu , các cytocrome là trung gian trong c h u ỗ i t ruyền 'điện tử qua đ ó các đ iện tử được t ruyền đ i để cuố i c ù n g k h ử N 2 t h à n h N H 3 .

Các catalase và peroxidase tham gia vào q u á t r ình quang h ô hấp, t húy p h â n đường và k h ử độc của hydrrogen peroxid, theo cân bằng sau:

2H202 -» catalase -> 2H20 + 02

Hydrogen peroxit được tạo ra trong q u á tr ình k h ử superoxit nhằm trung hoa c á c gốc superoxit. Hydrogen peroxit, đ ế n lượt n ó l ạ i được trung hoa nhờ enzym catalase.

Các peroxidase có rấ t nh iều trong t ế bào thực vật . T h à n h t ế b à o gắn peroxidase x ú c tác cho q u á t r ình t rùng hợp của phenol v ớ i l ign in . R ễ chứa lượng l ớ n peroxit và c ó vai t rò hấp thu sắt của cây . Lượng phenol d ư thừa k h i th iếu sắt sẽ được t i ế t ra ngoà i .

Các protein sắt-lưu huỳnh: N h ó m protein chứa sắt thứ hai là các protein sắt-lưu huỳnh. Sắt được gắn trong n h ó m thiol (-SH) của cystein. Ferr idoxin là protein chứa sắt

lưu huỳnh phổ b iến nhấ t và là chấ t mang trong các phản ứng t ruyền đ i ệ n tử được x ú c tác bở i ni t r i t reductase, sulphat reductase, quá tr ình tổng hợp N A D P * trong quang hợp và k h ử n i tơ được thực h iện nhờ phức hệ nitrogenase. Ba l o ạ i protein sắt - lưu huỳnh k h á c

46

nhau, hoạt động l iên t iếp nhau, đều nằm trong chuỗ i t ruyền đ i ệ n tử của phức h ệ

nitrogenase.

Bên cạnh hai n h ó m này, thực vật còn có những enzym k h á c cổ chứa sắt. N g u y ê n t ố này cần cho các phản ứng ox i hoa k h ử và sự đ ịnh vị của các phức hợp enzym - cơ chấ t .

Sắt rất quan trọng trong sinh tổng hợp chlorophyl: Trong lá xanh 80% sắt nằm trong lục lạp. K h i th iếu sắt, toàn bộ sắt sẽ tập trung ở lá.

Trong lá non, th iếu sắt sẽ d ẫ n đ ế n sự g i ảm nhanh nồng đ ộ chlorophyl do quá tr ình tổng hợp protein bị ngưng l ạ i . Số lượng ribosom cũng g i ả m mạnh.

Thiếu sắt ở rễ k é o theo những thay đ ổ i h ình thái . Sự dài rễ g i ả m nhưng d i ện t ích và số lượng lông rễ t ăng .

+ Bo ( B ) :

Bo được hấp thu bở i rễ và được chuyển tớ i các bộ phận của cây nhờ các xylem. ở các m à n g t ế bào , Bo c ó mặ t chủ y ế u ở dạng l iên kế t este. K h ô n g có bấ t cứ mộ t enzym đã biết nào có chứa hoặc được hoạt hoa bở i Bo.

Có những chỉ d ẫ n cho b iế t Bo có mặ t ở t rên hoặc bên trong các m à n g , c ó thể ảnh hưởng tớ i hoạt động của các enzym liên kế t m à n g . Các chức năng chủ y ế u của Bo là ở ngoại bào, được phát sinh trong quá tr ình hoa g ỗ của thành t ế bào và sự phân hoa xylem.

Thành tế bào: Những liên kế t este đường - Bo là m ộ t phần cấu trúc của các hemicellulose trong thành t ế bào . H ầ u hết Bo trong thực vật t ồn t ạ i ở dạng este trong thành t ế bào của cây . Y ê u cầu về Bo đ ố i v ớ i cây hai lá m ầ m cao hơn so v ớ i cây một lá m ầ m . Có thể g i ả đ ịnh rằng Bo, cũng g iống như canxi, có chức n ăng đ iều hoa quá tr ình

tổng hợp thành t ế bào cũng như ổn đ ịnh các thành phần cựa thành và m à n g t ế bào .

Sự th iếu hụ t Bo ngay lập tức ức c h ế q u á t r ình phát t r iển ch iều dà i của các rễ sơ cấp và thứ cấp. Hơn thế , Bo g ó p phần đ iều hoa q u á tr ình trao đ ổ i phenol và tổng hợp l ign in .

+ Đ ồ n g ( C u ) :

Đồng là một cation hoa trị 2 và được hấp thu vào cây d ư ớ i dạng C u 2 + hay d ư ớ i dạng phức chất của nó . N ế u nồng đ ộ C u 2 + và phức đồng tương đương nhau, cây dường như ưa ion đồng tự do hơn .

Trong xy lem và phloem, đồng hầu như t ồn t ạ i d ư ớ i dạng phức và chủ y ế u là dạng một phức amino axi t -đồng.

Trong t ế bào , đồng chủ y ế u là thành phần của phức h ệ enzym và rấ t quan trọng trong các phản ứng ox i hoa k h ử [(Cu 2 + ) / (Cu + ) ] được thực h iện nhờ những enzym này. Thiếu đồng lập tức d ẫ n đến sự g i ảm hoạt đ ộ của các enzym chứa đồng.

Vai trò của đồng đối với quang hợp: Khoảng 50% đồng trong lục lạp được gắn vớ i plastocyanin, ở giữa chuỗ i t ruyền đ iện tử, giữa quang hệ ì và quang hệ l i , có chứa Ì n g u y ê n tử đồng trên Ì phân tử. Trong t rường hợp th iếu đồng, nồng đ ộ các plastocyanin sẽ bị g i ảm. Cũng g iống như plastocyanin, các plastoquinone đ ó n g vai t rò quan trọng trong t ruyền đ i ệ n tử giữa quang hệ ì và quang hệ l i . K h i đồng bị th iếu , m à n g lục lạp sẽ

47

th iếu 2 protein đ iều hoa chuyển động của các plastoquinone. Đ ể tổng hợp các plastoquinone cần phải có enzym laccase, đây là mộ t enzym chứa đồng và hoạt động của n ó sẽ bị g i ảm ngay k h i th iếu đồng. Do đó , h i ện tượng th iếu đồng nhanh c h ó n g k é o theo h iện tượng g i ả m quang hợp.

Enzym super oxide dismutase: Đồng cùng v ớ i k ẽ m là m ộ t phần của enzym super

oxide dismutase (Cu-Zn.SOD), đ ó n g vai trò quan trọng trong q u á t r ình trung hoa gốc

anion superoxide 0 " hoạt t ính mạnh được tạo thành trong q u á t r ình quang h ô hấp. Bên

cạnh Cu-Zn.SOD, một SOD chứa mangan cũng có trong t ế bào .

SOD hoa g i ả i độc của gốc 0~ hoạt động thành H 2 0 2 và O z , nhờ đ ó bảo v ệ t ế b à o

trước k h ả n ăng phá huy của gốc này. SOD cùng v ớ i catalase phản ứng n h ư sau:

02 + ẽ-> O2 (superoxide)

O2 + O2 + 2H+ -> SOD -> H202

2H202 -> catalase -> 2H20 + 02

Superoxide được g iả i độc nhờ SOD và ngay sau đ ó g i ả i p h ó n g H 2 0 2 t h à n h o x i và nước nhờ catalase.

Các enzym SOD chứa đồng - k ẽ m chủ y ế u được t ì m t h ấ y ở chấ t n ề n stroma của lục l ạp . Trong lá non, 90% SOD tập t rung ở lục l ạ p và ch ỉ c ó 4-5% ở ty t h ể . T h i ế u

đồng sẽ x ả y ra những thay đ ổ i t rong c ấ u t rúc lục l ạ p , đ i ề u n à y t h ể h i ệ n r õ chức n ă n g bảo vệ của đ ồ n g .

Đồng cũng đ ó n g vai trò quan trọng trong chuỗ i t ruyền đ i ệ n tử của ty thể n h ư cytochrome oxidase c ó chứa 2 nguyên tử đồng và 2 n g u y ê n tử sắt.

+ M a n g a n ( M n ) :

Mangan tồn t ạ i trong thực vật ở dạng ion M n 2 + k h ô n g l iên kế t , hoa trị hai và ở dạng này nó được chuyển từ rễ qua mạch xy lem đến các phần k h á c của cây .

N g u y ê n tố này liên kế t chặt v ớ i mộ t số l o ạ i protein chứa k i m l o ạ i (metalloprotein), hoặc như một thành phần cấu trúc của enzym hoặc n h ư m ộ t phần trong hệ o x i hoa k h ử [ M n ( I I ) / M n ( I I I ) ] .

Phản ứng HUI: Mangan có hai chức n ăng quan t rọng trong thực vật . l o n n à y l iên quan đến phản ứng ban đ ầ u được g ọ i là phản ứng H i n của quang h ệ n , trong đ ó nước được phân ly thành ox i và các photon, theo phương t r ình sau:

2H20 -» 02 + 4H+ + 4e-

Có g i ả thiết cho rằng 4 phân tử mangan là thành phần của m ộ t protein, x ú c tác cho quá trình quang phân ly nước. Các electron được g iả i p h ó n g ra t i ếp tục chuyển tớ i m a g i ê chứa trong phức hệ 680, trung t âm của quang hệ l i .

48

Enzym super oxide dismutase: Cho đ ế n nay m ớ i ch ỉ c ó m ộ t vài l o ạ i enzym chứa mangan được phân lập . Enzym có chứa mangan quan trọng nhấ t là M n - S O D (xem phần về đ o n g để b iế t t h ê m t hông t in về SOD). Cũng g iống n h ư đồng, nếu th iếu mangan, sẽ

xảy ra các thay đ ổ i trong cấu trúc của lục lạp, thể h i ện rõ nhấ t ở h ệ thống bảo vệ của

mangan.

+ Coban (Co) :

Coban đ ó n g vai t rò quan trọng trong quá t r ình c ố đ ịnh n i tơ ở rễ cây h ọ đ ậ u . Coban là t hành phần cần th iế t của enzym cobalamin. Co ( IU) là thành phần k i m l o ạ i đ ịnh vị giữa 4 nguyên tử ni tơ trong cấu trúc porphyrin. Ba hệ thống enzym của v i khuẩn Rhizobium được biết tớ i có chứa Co. N g ư ờ i ta thấy rằng có m ố i liên hệ giữa nồng đ ộ Co vớ i sự c ố đ inh nitrogen và sự phát t r iển rễ củ. Co có vai t rò trong quá trình tổng hợp methyonine ở v i khuẩn, tổng hợp ribonucleotid và enzym methymalonyl-coenzym A -mutase, một enzym cần thiết cho sự tổng hợp leghemoglobin.

K h ô n g ai b iết chắc rằng l i ệ u Co có g i ữ vai t rò gì ở thực vật bậc cao hay k h ô n g . Ch ỉ có một enzym phụ thuộc cobalamin đã được b iế t tớ i là leucine -2,3-aminomutase ở khoai tây. Đ ố i v ớ i thực vật bậc thấp, Co là y ế u t ố cần th iế t và c ó m ặ t trong m ộ t số cấu trúc d ư ớ i t ế bào và thylakoid ở lục lạp.

+ M o l y b d e n ( M o ) :

Molybden chủ y ế u t ồn t ạ i ở dạng M 0 O 4 " , mộ t dung dịch giống như nước. Trong

môi trường axit y ế u , lon molybden tuy thuộc vào đ ộ axit có thể nhận Ì hoặc 2 proton

theo phương t r ình sau:

MoO*- -» HMoO; -> H2M0O4

Molybden có khả nâng chuyển vận qua mạch xylem và phloem như lon Mo04~.

Nitrogenase: Một số enzym sử dụng Mo như một co-factor. Hai loại enzym có

molybden được m ô tả nh iều nhấ t là nitrogenase và nitrate reductase.

Nitrogenase l iên quan đ ế n quá t r ình c ố đ ịnh n i tơ trong nốt sần ở rễ cây h ọ đậu nhờ

vi khuẩn Rhizobium:

N2 + 8H+ + 8e~ -> 2NH3 + H2

Molybden l iên quan trực t iếp đ ế n quá tr ình k h ử N 2 . P h â n tử n i tơ được gắn v ớ i nguyên tử molybden trong phức hệ nitrogenase. M ỗ i phân tử n i tơ gắn v ớ i hai n g u y ê n tử molybden m à ch ính c h ú n g l ạ i là mộ t phần của phân tử protein sắt - molybden. Sau quá tr ình hoạt hoa phức hệ enzym nitrogenase sử dụng ATP, phức h ệ sắt - molybden thay

đ ổ i cấu trúc của n ó . Dựa trên sự thay đ ổ i hợp lý này , quá t r ình k h ử N 2 x ẩ y ra.

Nitrate reductase: Nitrate reductase k h ử nitrat t hành ni t r i t trong q u á t r ình đồng hoa

nitơ ở t ế bào thực vật . Nitrate reductase chứa Ì phân tử heme-sắt và 2 n g u y ê n tử molybden. Enzym này xúc tác cho quá tr ình k h ử nitrat t hành ni t r i t . Sự hoạt động của

49

nitrat reductase bị g i ả m mạnh k h i th iếu molybden nhưng c ó t h ể k h ô i phục nhanh c h ó n g

ngay k h i t h ê m molybden vào m ô i t rường.

+ Kẽm (Zn):

K ẽ m được hệ rễ hấp thu d ư ớ i dạng Z n 2 + . Trong mạch x y l e m n ó được chuyển vận d ư ớ i dạng ion Z n 2 + hoặc m u ố i k ẽ m của mộ t axit hữu cơ. N g u y ê n t ố n à y là m ộ t hợp p h â n k i m l o ạ i của m ộ t số enzym. N ó có thể là một co íac to r cấu t rúc cũng n h ư cofactor đ i ề u

hoa của phức hệ enzym.

Các enzym: Thực vật có mộ t số l o ạ i enzym chứa k ẽ m , bao g ồ m cả enzym dehydrogen hoa rượu trong vùng m ô p h â n sinh của cây .

Trong phức hệ enzym SOD, Z n l iên kế t v ớ i Cu thay cho n g u y ê n tử n i tơ t ừ histidine (xem thêm về SOD trong phần đồng) .

Enzym cacbon anhydrase c ố đ ịnh C 0 2 , theo cân bằng sau:

C02 + H20 <-> Heo; + H+

Phản ứng này giúp thực vật có thể dự trữ C02 dưới dạng HCO3 một cách thuận

nghịch. Sau k h i chuyển thành C 0 2 , HCO3 có thể sử dụng l à m c ơ chấ t cho enzym

ribulose biphosphate cacboxilase. Enzym này có 6 t i ể u phần d ư ớ i đ ơ n v ị , m ỗ i t i ể u phần có Ì n g u y ê n tử k ẽ m gắn vào và có thể t ìm thấy trong lục lạp và t ế b à o chấ t .

Tổng hợp protein: K ẽ m rấ t quan trọng trong quá t r ình tổng hợp protein. T h i ế u k ẽ m

gây ảnh hưởng l ớ n đ ế n quá tr ình tổng hợp protein. Sự tập trung ribosom và sự t ích l ũ y

các t i ền chấ t của protein n h ư các amino axit và các amin cũng n h ư hoạt động của A R N polymerase có thể xảy ra nhờ k ẽ m . D ư ớ i đ iều k i ệ n t hông thường , A R N polymerase chứa 2 n g u y ê n tử Z n , tạo ra cấu t rúc đ i ể n h ình của enzym. H ơ n nữa, c ó m ộ t m ố i quan h ệ nghịch tương ứng giữa nồng đ ộ Z n và hoạt động của ARNse . N ồ n g đ ộ Z n thấp sẽ l àm

tăng hoạt động của ARNse.

Tổng hợp IAA: Th i ếu k ẽ m cũng phá hỏng q u á t r ình tổng hợp indol acetic axi t trong

cây (Indol —> Trytophan -> Indol Acetic Ac id ) .

K ẽ m đ ó n g vai t rò quan trọng trong tổng hợp tryptophan, m ộ t t i ề n chấ t của I A A . V í dụ , th iếu k ẽ m trong n g ô có thể thay t h ế bằng c á c h bổ sung tryptophan.

+ C h l o r ( C l ) :

Chlor có ở thực vật dao động từ 70 - 700 m M trong Ì k g t rọng lượng k h ô (2000 -r

20000 mg/kg trọng lượng khô ) . Chlor được hấp thu d ư ớ i dạng c r và rấ t c ơ động trong cây. Chức năng ch ính của ion này là đ iều hoa t h ẩ m thấu và bổ sung các chấ t mang.

Trong lục lạp có chứa h à m lượng chlor lớn . N g ư ờ i ta cho rằng chlor đ ó n g vai t rò hết

sức quan trọng trong quang hợp.

Các lục lạp của rau c h â n v ị t và củ c ả i đ ư ờ n g chứa chlor ở nồng đ ộ x ấ p x ỉ l O O m M n h ư n g trong lá, ch ỉ c ó d ư ớ i l O m M , cho t hấy ưu t h ế r õ r à n g của chlor t ập hợp t rong lục l ạp .

50

Năng lực thẩm thấu: l on C l đ iều hoa sự đ ó n g , m ở k h í khổng. T ình trạng th iếu

chlor l àm kh í khổng m ở mã i , có thể gây t ình trạng m ấ t nước n g h i ê m trọng.

Chlor rấ t quan trọng trong đ iều hoa năng lực t h ẩ m thấu của c á c k h ô n g bào và v ớ i các q u á tr ình liên quan đến sức t rương.

Sự trao đổi nitơ: Chlor hoạt hoa enzym tổng hợp asparagin, mộ t enzym quan trọng trong q u á tr ình trao đ ổ i nitơ. Enzym này chuyển hoa glutamin thành asparagin và axit glutamic. Trong đ iều k i ệ n có c r , tốc đ ộ của phản ứng t ăng lên gấp 7 l ầ n . B ở i thế , chlor

đã thực h iện một chức n ăng quan trọng trong quá t r ình trao đ ổ i n i tơ ở các loài thực vật sử dụng asparagin như chấ t mang.

2.5.2.2. Các vitamin

Tấ t cả các t ế bào được nuô i cấy đ ề u có k h ả n ă n g tổng hợp tấ t cả các l o ạ i v i tamin cơ bản nhưng thường là v ớ i số lượng d ư ớ i mức yêu cầu. Đ ể m ô có sức sinh t rưởng tố t phải bổ sung vào m ô i t rường mộ t hay nh iều l o ạ i v i tamin. Các vi tamin là rấ t cần th iế t cho các

phản ứng sinh hoa.

Các vi tamin sau đây được sử dụng phổ b iến: inositol, thiamine HC1 ( B I ) , pyridoxine

HC1 (Bó), nicotinic axit, trong đ ó vitamin B I là k h ô n g thể t h iếu và được sử dụng trong hầu hết những m ô i t rường nuô i cấy m ô và t ế bào thực vật . Linsmaier và Skoog đã khẳng đ ịnh vitamin B I là cần th iế t cho sự sinh t rưởng của cây sau k h i ngh i ên cứu k ỹ lưỡng về

sự có mặ t của n ó trong m ô i t rường M S . ' C á c tác g i ả k h á c cũng khẳng đ ịnh vai t rò rấ t quan trọng của B I trong nuô i cấy m ô .

Inositol thường được nói đến như là mộ t vi tamin k ích th ích mộ t cách t ích cực đ ố i vớ i sự sinh t rưởng và phá t t r iển của thực vật, mặc dù n ó k h ô n g phải là v i tamin cần th iế t

trong m ọ i t rường hợp. Các vi tamin khác , đặc b iệ t là nicotinic axit (vi tamin B3), canxi pantothenate (vi tamin B5) và biot in cũng được sử dụng đ ể n âng cao sức sinh t rưởng của m ô nuôi cấy.

Anh hưởng của các vitamin lên sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở các loài khác nhau là k h á c nhau hoặc thậm ch í còn có hạ i (gây độc) .

2.5.2.3. Các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô

Nước dừa

Công b ố đ ầ u t iên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy m ô thuộc về Van Overbeek và

cộng sự (Van Overbeek cs, 1941, 1942). Sau đó , tác dụng t ích cực của nước dừa trong môi t rường nuô i cấy m ô , t ế bào thực vật đã được nh iều tác g i ả ghi nhận. Nước dừa đã được xác đ ịnh là rấ t giàu các hợp chấ t hữu cơ, chấ t k h o á n g và chấ t k ích th ích sinh trưởng (George, 1993; George, 1996). Nước dừa đã được sử dụng để k ích th ích phân hóa và nhân nhanh chổ i ở nhiều loài cây. Nước dừa thường được l ấ y từ quả của các giống và cây chọn lọc để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản. Nước dừa được m ộ t số c ô n g ty hoa chấ t bán d ư ớ i dạng đ ó n g chai sau c h ế b iến và bảo quản. T h ô n g thường nước dừa được xử lý để loạ i t rừ các protein, sau đ ó được lọc qua m à n g lọc đ ể k h ử t rùng trước k h i bảo quản

51

lạnh . T ồ n d ư protein trong nước dừa k h ô n g gây ảnh hưởng đ ế n sinh t ruồng của m ô hoặc t ế bào nuô i cấy, n h ư n g c ó t hể d ẫ n t ớ i kế t tủa dung dịch k h i bảo quản l ạnh . Chấ t cặn co thể được lọc bỏ hoặc đ ể lắng d ư ớ i đ á y b ình r ồ i gạn bỏ phần cặn.

Nước dừa thường được sử dụng ở nồng đ ộ từ 5 - 20%.

Bột chuối

Bột chuối k h ô hoặc bột nghiền từ quả chuối xanh được sử dụng trong n u ô i cấy m ô một số cây trồng như phong lan. H à m lượng sử dụng vào khoảng 40g bột khô/1 . Đ ê tranh đ ó n g cục, cầu bổ sung bột vào dung dịch mộ t cách từ từ r ồ i k h u ấ y đ ề u . Nước ch iế t từ khoảng 100 g thịt quả chuối xanh cũng được sử dụng bổ sung v à o m ộ t lít m ô i t rường .

Một số hỗn hợp dinh dưỡng hữu cơ phức tạp khác

Nước cốt c à chua, dịch chiết khoai tây nghiền, dịch chiết mạch nha, d ịch ch iế t n ấ m men (yeast extract), casein thúy phân (casein hydrolysate) cũng được sử dụng đ ê l à m tăng sự phát t r i ể n của m ô sẹo hay c ơ quan n u ô i cấy .

Agar

Đ ố i vớ i nuô i cấy t ĩnh, nếu sử dụng m ô i t rường lỏng, m ô c ó t h ể b ị c h ì m và sẽ chết vì

th iếu ôxy . Đ ể t ránh t ình trạng này , m ô i t rường n u ô i cấy được l à m đặc l ạ i bằng agar -mộ t l o ạ i t inh bột được c h ế từ rong b iển và m ô được cấy t rên bề m ặ t của m ô i t rường. Agar thường được sử dụng ở nồng đ ộ 0,6 đ ế n 1%.

2.5.2.4. Nguồn cacbon (C)

Đường sucrose (saccharose) là nguồn cacbon chủ y ế u và được sử dụng thường x u y ê n trong hầu hết các m ô i t rường nuô i cấy m ô , k ể cả k h i m ẫ u n u ô i cấy là c á c chồ i xanh có khả năng quang hợp. K h i k h ử t rùng , đường sucrose b ị t h ú y p h â n m ộ t phần, thuận l ợ i hơn cho cây hấp thụ . Trong m ộ t số t rường hợp, v í d ụ n u ô i cấy m ô c â y m ộ t lá m ầ m , đường glucose tỏ ra tốt hơn so v ớ i sucrose. M ô thực vậ t c ó k h ả n ă n g hấp thu mộ t số đường khác n h ư maltose, galatose, lactose, mannose, t hậm c h í t inh bột , n h ư n g các loạ i đường này hầu như rấ t ít được sử dụng trong n u ô i cấy t ế bào và m ô thực vậ t .

2.5.2.5. Các chất điêu hoa sinh trưởng

Bên cạnh các chấ t cung cấp dinh dưỡng cho m ô nuôi cấy, v iệc bổ sung m ộ t hoặc nhiều chấ t đ iều hoa sinh t rưởng n h ư auxin, cytokinin và gibberell in là rấ t cần th iế t đ ể kích thích sự sinh t rưởng, phá t t r iển và phân hoa cơ quan, cung cấp sức sống tố t cho m ô và các tổ chức. Tuy vậy , yêu cầu đ ố i v ớ i những chấ t này thay đ ổ i tuy theo loài thực vật , l oạ i m ô , h à m lượng chấ t đ iều hoa sinh t rưởng n ộ i sinh của c h ú n g . Các chấ t đ i ề u hoa sinh

t rưởng thực vật được chia thành các n h ó m ch ính sau đây :

Nhóm các auxin (Bảng 2.5)

Các auxin có thể là auxin tự nh iên hoặc tổng hợp, thường được d ù n g trong n u ô i cấy m ô và t ế bào để k ích thích sự phân bào và sinh t rưởng của m ô sẹo, đặc b iệ t là 2,4-D, tạo phôi vô t ính, tạo rễ , . . .

52

Các auxin liên quan tớ i đ ộ dài của thân, đốt , chồ i ch ính , rễ . . . Đ ố i v ớ i nuô i cấy m ô , auxin đã được sử dụng cho việc phân chia t ế bào và p h â n h ó a rễ . Những auxin d ù n g rộng rãi trong nuô i cấy m ô là I B A (3-indolebutiric axit) , I A A (3-indole acetic axit) , N A A (napthaleneacetic axit) , 2,4-D (2,4-D-Dichlorophenoxiacetic axit) và 2,4,5-T (trichlorophenoxiacetic axit). Trong số các auxin, I B A và N A A chủ y ế u sử dụng cho m ô i t rường ra rễ và phố i hợp v ớ i cytokinin sử dụng cho m ô i t rường ra c h ổ i . 2,4-D và 2,4,5-T rấ t có h iệu quả đ ố i v ớ i m ô i t rường tạo và phá t t r iển callus. A u x i n thường h ò a tan trong etanol hoặc N a O H pha loãng .

Va i t rò của các chấ t thuộc n h ó m auxin được khá i quá t d ư ớ i đây :

- K ích thích phân chia và k é o dài t ế bào .

- Chồi đ ỉnh cung cấp auxin gây ra ức c h ế sinh t rưởng của chồ i bên . Ư u t h ế chồ i đ ỉnh làm ức c h ế sinh t rưởng của chổ i nách . N ế u ngắt bỏ chồ i đ ỉnh sẽ d ẫ n đ ế n sự phát chồ i nách . N ế u thay t h ế vai t rò của chồ i đ ỉnh (đã b ị ngắt bỏ ) bằng mộ t lớp chấ t keo có chứa I A A thì chồi nách v ẫ n bị ức c h ế sinh t rưởng. C ơ c h ế ức c h ế của chồ i đ ỉnh l iên quan đến

một chấ t đ iều hoa sinh t rưởng khác khác là ethylene. A u x i n ( I A A ) k ích th ích chổ i bên sản sinh ra ethylen l àm ức c h ế sinh t rưởng của chồ i đ ỉnh.

- I A A đóng vai t rò k ích th ích sự phân hoa của các m ô d ẫ n (xylem và phloem).

- A u x i n kích th ích sự mọc rễ ở cành g iâm và k ích th ích sự phát sinh chồ i phụ trong nuôi cấy m ô .

- A u x i n có các ảnh hưởng khác nhau đ ố i v ớ i sự rụng lá, quả, sự đ ậ u quả, sự phát t r iển và chín của quả, sự ra hoa trong m ố i quan hệ v ớ i đ iều k i ệ n m ô i t rường.

- Tạo và nhân nhanh m ô sẹo (callus).

- Kích thích tạo chồ i bấ t đ ịnh (ở nồng đ ộ thấp).

- Tạo phôi soma (2,4-D).

Nhóm các cytokinin (Bảng 2.6)

Cytokinin l iên quan tớ i sự phân chia t ế bào , phân hóa chồi . . . Trong m ô i t rường nuôi cấy m ô , cytokinin cần cho sự phân chia t ế bào và phân hóa chồi từ m ô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ . Các loạ i cytokinin thường được dùng là: tenyladenine; kinetin (6-furfurolaminopurine); B A (6-benzylaminopurine); 2-ip (isopentenul-adenine). Cytokinin hoa tan trong dung dịch H a pha loãng.

Chức năng chủ y ế u của các cytokinin được khá i quá t n h ư sau:

- Kích th ích phân chia t ế bào .

- Tạo và n h â n callus. - Kích th ích phát sinh chồ i trong nuôi cấy m ô . - Kích thích phá t sinh chồ i nách và k ì m h ã m ảnh hưởng ưu t h ế của chổ i đ ỉnh. - L à m t ăng d i ện t ích phiến lá do kích thích sự l ớ n lên của t ế bào .

- Có thể l àm t ăng sự m ở của kh í khổng ở một số loài . - Tạo chồ i bấ t đ ịnh (ở nồng độ cao).

- ứ c c h ế sự h ình thành rễ .

- ứ c c h ế sự k é o dài chồ i .

- ứ c c h ế quá tr ình già (hoa vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục.

53

Gibbereỉlin (Bảng 2.7)

Trong số hơn 20 chấ t thuộc n h ó m gibberellin, G A 3 là chấ t được sử dụng nh i ều hem

cả trong thực t i ễ n . G A 3 k ích th ích k é o dài chồ i và nảy m ầ m của p h ô i v ô t ính . So VỚI auxin và cytokin in , gibberellin h i ế m k h i được d ù n g . G A 3 c ó t ính hoa tan trong nước .

Gibberell in có các chức n ăng cơ bản sau:

- Các m ô phân sinh trẻ , đ ang sinh trưởng, các phôi non, t ế b à o đ ầ u rễ , q u ả non, hạt chưa chín hoặc đ a n g nảy m ầ m đ ề u c ó chứa nhiều gibberellic axit .

- K ích thích k é o dài chồ i đ o tăng cường phân bào và k é o dà i t ế bào , v í d ụ k é o dà i thân và đ ò n g lúa sau kh i phun G A 3 , k é o dài đ ố t thân . Các cây lùn t hường b ị t h i ếu

gibberellin.

- Phá ngủ hạt g iống hoặc củ giống, ví dụ phá ngủ khoai tây sau thu hoạch.

- K i ể m soát sự ra hoa của các cây 2 n ă m t u ổ i . N ă m đ ầ u thân m ầ m n ằ m i m , sau m ù a đ ô n g m ầ m hoa k é o dài đố t rấ t nhanh và p h â n hoa hoa.

- ứ c c h ế sự h ình thành rễ bấ t đ inh .

- K ích th ích sinh tổng hợp của a-amylase ở hạt cây ngũ cốc nảy m ầ m , g i ú p t iêu hoa các chấ t d ự trữ trong n ộ i nhũ để nuô i m ầ m cây.

- Các chấ t ức c h ế tổng hợp k ích th ích q u á t r ình tạo củ ( thân củ, t hân h à n h và củ) .

- Kích thích sự nảy m ầ m của phấn hoa và sinh t rưởng của ống phấn .

- Có thể gây tạo quả k h ô n g hạt hoặc l àm tâng k ích thước quả nho k h ô n g hạt.

- Có thể l àm chậm sự hoa già ở lá và quả cây có m ú i .

Abscisic axit (ABA) (Bảng 2.8)

Trong nuôi cấy m ô và t ế bào , A B A có tác dụng tạo phô i v ô t ính , k í ch th í ch sự chú i của phôi , k ích th ích sự phát sinh chồ i ở nh iều loài thực vật . Các tác dụng c ơ bản của A B A là:

- Tham gia vào sự rụng lá, hoa, quả ỏ hầu hết các cây t rồng và gây ra sự nứt quả .

- A B A thường được sản sinh k h i c ó các y ế u t ố ức c h ế c ây t rồng n h ư m ấ t nước và nhiệt đ ộ thấp đ ó n g bâng .

- Tham gia vào sự ngủ ngh ỉ , k é o dài thờ i gian ngủ ngh ỉ và l à m chậm sự nảy m ầ m của hạt.

- ứ c c h ế sự k é o dài thân và được sử dụng để k i ể m soát sự k é o dà i t hân c à n h . G â y ra sự đ ó n g kh í khổng.

Ethylene

Các chức năng cơ bản của ethylene:

- G â y già hoa lá, k ích th ích sự rụng lá và quả.

- L à m chín quả.

- Sinh tổng hợp ethylene được tăng cường k h i quả đ ang chửi , cây đ a n g bị ú n g , lão hoa, tổn thương cơ g iớ i và bị n h i ễ m bệnh.

- Đ i ề u k h i ể n sự ch ín của mộ t số l o ạ i quả.

54

- Ethylene k ì m h ã m sự ra hoa của đa số cây . Tuy vậy , sự ra hoa của xoà i , dứa, mộ t số cây cảnh l ạ i được k ích thích bở i ethylene.

- K í c h th ích n ở hoa, k ích thích sự lão hoa của hoa và lá.

Các bảng d ư ớ i đây m ô tả các đặc t ính cơ bản của các n h ó m chấ t đ iều hoa sinh

t rưởng, c á c h chuẩn bị hoa chấ t và bảo quản của c h ú n g (tham khảo Sigma - A ld r i ch : http://www.sigmaaldrich.com/Area o f Interest/Life Science/

Plant Biotechnology/Tissue Culture Protocols/Growth Regulators.html

Bảng 2.5 Các chất thuộc nhóm Auxin

Tên các chất

Phân tử lượng và tương đương Chuẩn bị dung dịch, bảo quản và sử dụng

Tên các chất Phân tử

lượng

Số ụM = ímg/l

Dung môi Pha loãng

Bảo quản khô

Bảo quản lỏng

Khử trùng

Nồng độ sử dung

(mg/l) p-Chlorophenoxiacetic acid (4-CPA)

186,6 5,36 EtOH - Rĩ 2-8°C CA 0,1-10,0

2,4-Dichlorophenoxi-acetic acid 221 4,53 - - Rĩ 2-8°C CA 0,01-6,0

2,4-Dichlorophenoxi-acetic acid Sodium salt

243 4,12 Nước - Rĩ 2-8°C CA 0,01-6,0

lndole-3-acetic acid Free acid (IAA) 175,2 5,71 EtOH/1 N NaOH

Nước -0°c -0°c CA/F 0,01-3,0

lndole-3-acetic acid Sodium salt 197,2 5,07 Nước Nước 2-8°C -0°c CA/F 0,01-3,0

lndole-3-acetic acid methyl ester 189,2 5,29 - - 2-8°C 2-8°C - -

lndole-3-acetyl-L-aspartic acid 290,3 3,45 0.5N NaOH

Nước -0°c -0°c F 0,01-5,0

lndole-3-butyric acid (IBA) 203,2 4,90 EtOH/1 N NaOH

Nước 2-8°C -0°c CA/F 0,1-10,0

lndole-3-butyric acid Potassium salt (K-IBA)

241,3 4,14 Nước - 2-8°C -0°c CA/F 0,1-10,0

Alpha-Naphthalene-acetic acid Free acid (NAA)

186,2 5,37 IN NaOH Nước Rĩ 2-8°C CA 0,1-10,0

Beta-Naphthoxi-acetic acid Free acid (NOA)

202,2 4,95 IN NaOH Nước Rĩ 2-8°C CA 0,1-10,0

Phenylacetic acid (PAA) 136,2 7,34 EtOH - Rĩ 2-8°C CA/F 0,1-50,0

Picloram 241,5 4,14 DMSO - Rĩ 2-8°C CA 0,01-10,0

2,4,5-Trichlorophenoxi acetic acid (2,4,5-T)

255,5 3,91 EtOH - Rĩ 2-8°C CA 0,01-5,0

2,3,5-Triiodobenzoic acid Free acid

(TI BA) 499,8 2,00 IN NaOH Nước -0°c -0°c F 0,05-5,0

Ký hiệu: CA :Khử trùng cùng với các chất khác trong môi trường.F : Khử trùng bằng lọc qua phin lọc. CA/F: Khử trùng cùng với các thành phần khác của môi trường nhưng có khả năng bị mất hoạt tính ít nhiều, có thể bù đắp bằng cách bổ sung hoặc khử ữùng bằng lọc qua phin lọc.

55

Bảng 2.6. Các chứ thuộc nhóm cytokinin

Tên hóa chất

Phân tử lượng và tương đương

Chuẩn bị dung dịch, bảo quản và sử dụng

Tên hóa chất Phân tử

lượng

Số ụM = img/l

Dung môi Pha loãng

Bảo quản

Bảo quản lỏng

Khử trùng

Nồng độ sử dung

(mg/l)

Adenine Free bazơ 135,1 7,40 1.0 HCI Nước Rĩ 2-8°C CA 50-250

Adenine hemisulíate Hemisulíate salt 184,2 5,43 Nước - Rĩ 2-8°C CA 50-250

6-Benzylaminopurine (BA) 225,3 4,44 IN NaOH Nước Rĩ 2-8°C CA/F 0,1-5,0

6-Benzylaminopurine Hydrochloride 261,7 3,82 Nước - Rĩ 2-8°C CA/F 0,1-5,0

6-Benzylaminopurine (BA hoặc BAP) 225,3 4,44 IN NaOH Nước Rĩ 2-8°C CA/F 0,1-5,0

N-Benzyl-9-(2-

tetrahydropyranyl)adenine (BPA) 309,4 3,23 EtOH - -0°c -0°c CA/F 0,1-5,0

N-(2-Chloro-4-pyridyl)-N'-phenylurea (4-CPPU)

247,7 4,04 DMSO - 2-8°C 2-8°C F 0,001-1,0

6-(gamma,gamma-Dimethylallylamino) purine (2iF^

203,2 4,92 IN NaOH Nước -0°c -0°c CA/F 1,0-30,0

6-(Y, Y-Dimethylallylamino) purine (2ỈP) 203,2 4,92 IN NaOH Nước -0°c -0°c CA/F 1,0-30,0

1,3-Diphenylurea (DPU) 212,3 4,71 DMSO - RT 2-8°C F 0,1-1,0

Kinetin 215,2 4,65 IN NaOH Nước -0°c -0°c CA/F 0,1-5,0

Kinetin 215,2 4,65 IN NaOH Nước -0°c -0°c CA/F 0,1-5,0

Kinetin 215,2 4,65 IN NaOH Nước -0°c -0°c CA/F 0,1-5,0

Kinetin Hydrochloride 251,7 3,97 Nước - -0°c -0°c CA/F 0,1-5,0

1-Phenyl-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl) urea 220,2 4,54 DMSO - Rĩ 2-8°C CA/F 0,001-0,05

Trans-Zeatin Free bazơ 219,2 4,56 IN NaOH Nước -0°c -0°c CA/F 0,01-5,0

Zeatin 219,2 4,56 IN NaOH Nước -0°c -0°c CA/F 0,01-5,0

Trans-Zeatin Hydrochloride 255,7 3,91 Nước - -0°c -0°c CA/F 0,01-5,0

Trans-Zeatin riboside 351,4 2,85 IN NaOH Nước -0°c -0°c F 0,01-5,0

Ký hiệu: CA = coautoclavable (khử trùng cùng với các chất khác trong môi trường). F = íilter sterilize: Khử ưùng bằng lọc qua phin lọc. CA/F: Khử trùng cùng với các thành phần khác cùa môi trường nhưng có khả năng bị mất hoạt tính ít nhiều, có thể bù đắp bằng cách bổ sung hoặc khử trùng bằng lọc qua phin lọc.

56

Bảng 2.7. Nhóm các chá điều hoa sinh trưởng khác

Tên hóa chất

Phân tử lượng và tường đương

Chuẩn bị dung dịch, bảo quản và sử dụng

Tên hóa chất Phân tử lượng

Số ịiM

1mg/l Dung môi Pha

loãng Bảo

quản

Bảo quản lỏng

Khử trùng

Nồng độ sử dung

(mg/l)

C.)-cis,trans-Abscisic acid (ABA)

264,3 3,78 IN NaOH Nước -0°c -0°c CA/F 0,1-10,0

Ancymidol 256,3 3,90 DMSO - 2-8°C -0°c CA/F 1,0-10,0 Chlorocholine chloride (CCC) 158,1 6,33 Nước - Rĩ 2-8°C F úp to 500

3,6-Dichloro-o-anisic acid (Dicamba)

221,0 4,52 EtOH/Nước - 2-8°C 2-8°C F 0,01-10,0

Gibberellic acid (GA3) 346,4 2,89 EtOH - Rĩ 2-8°C CA/F 0,01-5,0

Gibberellic acid Potassium sau (K-GA3)

384,5 2,60 Nước - 2-8°C -0°c CA/F 0,01-5,0

Gibberellin A 4 Free acid (GA4) 332,4 3,01 EtOH - -0°c -0°c F 0,01-5,0 (*.)-Jasmonic acid 210,3 4,76 EtOH - 2-8°C -0°c F 0,01-100,0

Phloroglucinol 126,1 7,93 Nước - Rĩ 2-8°C CA/F > 162

N-(Phosphonomethyl)glycine (GÌyphosate)

169,1 5,91 IN NaOH Nước Rĩ 2-8°C F -

Succinic acid 2,2-dimethylhydrazide

160,2 6,24 Nước - 2-8°C 2-8°C CA/F 0,1-10,0

Ký hiệu: CA = coautoclavable (Khử ưùng cùng với các chất khác trong môi trường). F = filter sterilize: Khử trùng bằng lọc qua phin lọc. CA/F: Khử trùng cùng với các thành phần khác của môi trường nhưng có khả năng bị mất hoạt tính ít

nhiều, có thể bù đắp bằng cách bổ sung hoặc khử trùng bằng lọc qua phin lọc.

Bảng 2.8. Giói thiệu vê nhóm chất điều hoa sinh trưởng chính và chức năng chung của mỗi nhóm trong nuôi cấy mô và tê bào ở thực vật

A Nhóm auxin Chức năng chung của nhóm 1 lndole-3-acetic acid (IAA) - Phân chia tế bào

2 lndole-3-butyric acid (IBA) - Tạo và nhân callus - Tạo rễ bất định (ở nồng độ cao) - Tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp) - Tao phôi soma (2,4-D) - ức chế chồi nách

3 1-naphthaleneacetic acid (NAA)

- Tạo và nhân callus - Tạo rễ bất định (ở nồng độ cao) - Tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp) - Tao phôi soma (2,4-D) - ức chế chồi nách

4 2,4-dichlorophenoxi-acetic acid (2.4D)

- Tạo và nhân callus - Tạo rễ bất định (ở nồng độ cao) - Tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp) - Tao phôi soma (2,4-D) - ức chế chồi nách 5 (2,4,5-T)

- Tạo và nhân callus - Tạo rễ bất định (ở nồng độ cao) - Tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp) - Tao phôi soma (2,4-D) - ức chế chồi nách

6 Picloram 7 Dicamba 8 p-chlorophenoxi-acetic acid (CPA) 9 Phenylacetic acid (PAA)

B Nhóm cytokinin Chức năng chung của nhóm 1 Kinetin - Phân chia tế bào

2 6-Bezylamino-purine (BAP) - Tạo và nhân callus

3 Zeatin (Z)

57

B Nhóm cytokinin Chức năng chung của nhóm 4 Zeatinriboside (ZR) - Kích thích bật chổi nách

- Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) - ức chế sự hình thành rễ - ức chế sự kéo dài chồi - ức chế quá trình già (hoa vàng) ở lá

5 Isopentenyladenosine (iPA) - Kích thích bật chổi nách - Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) - ức chế sự hình thành rễ - ức chế sự kéo dài chồi - ức chế quá trình già (hoa vàng) ở lá

6 Isopentenyladenine (iP)

- Kích thích bật chổi nách - Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) - ức chế sự hình thành rễ - ức chế sự kéo dài chồi - ức chế quá trình già (hoa vàng) ở lá

7 Thidiazuron (TDZ)

- Kích thích bật chổi nách - Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) - ức chế sự hình thành rễ - ức chế sự kéo dài chồi - ức chế quá trình già (hoa vàng) ở lá

8 N-(2-chloro-4-pyridyl)-N-phenylurea (CPPU)

- Kích thích bật chổi nách - Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) - ức chế sự hình thành rễ - ức chế sự kéo dài chồi - ức chế quá trình già (hoa vàng) ở lá

c Nhóm gibberellin Chức năng chung của nhóm

1 Gibberellic acid (GA3) - Kéo dài chổi - Phá ngủ ở hạt giống - ức chế sự hình thành rễ bất định - Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ)

2 Gibberllin 1 (GA,)

- Kéo dài chổi - Phá ngủ ở hạt giống - ức chế sự hình thành rễ bất định - Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ)

3 Gibberellin 4 (GA„)

- Kéo dài chổi - Phá ngủ ở hạt giống - ức chế sự hình thành rễ bất định - Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ) 4 Gibberellin 7 (GA7)

- Kéo dài chổi - Phá ngủ ở hạt giống - ức chế sự hình thành rễ bất định - Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ)

D Nhóm các chất ĐHST khác Chức năng chung của nhóm

1 Ethylene - Gây già hoa lá - Làm chín quả

2 Abscisic acid - Sự chín của thể phôi - Kích thích sự hình thành thân hành và thân củ - Thúc đẩy sự phát triển của tình trạng ngủ

3 Nhóm polyamine - Kích thích sự tự hình thành rễ - Kích thích sự hình thành chồi - Đẩy mạnh sự phát sinh thể phôi

a Putrescin - Kích thích sự tự hình thành rễ - Kích thích sự hình thành chồi - Đẩy mạnh sự phát sinh thể phôi b Spermidine

- Kích thích sự tự hình thành rễ - Kích thích sự hình thành chồi - Đẩy mạnh sự phát sinh thể phôi

c Spermine

- Kích thích sự tự hình thành rễ - Kích thích sự hình thành chồi - Đẩy mạnh sự phát sinh thể phôi

4 Jasmonic acid (Ja) - Kích thích sự hình thành thân củ và thân hành - Đẩy nhanh sự hình thành đỉnh sinh trưỏng. Methyl jasmonate (MeJa) - Kích thích sự hình thành thân củ và thân hành - Đẩy nhanh sự hình thành đỉnh sinh trưỏng.

2.5.3. ứ n g d ụ n g của c ô n g n g h ệ n u ô i c ấ y m ô v à t ế b à o

2.5.3.1. Nhân giống sạch bệnh bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

Nuôi cây đỉnh sinh trưởng nhân giống sạch bệnh

Limmasets và Cornuet (1949) đã phát h i ện rằng, ở c á c cây n h i ễ m bệnh virus, virus phân b ố k h ô n g đồng nhấ t t rên cây và thường k h ô n g thấy c h ú n g ở v ù n g đ ỉnh sinh t rưởng. Phát h i ện đ ó là cơ sở để More l và Mar t in (1952) chứng m i n h g i ả thuyết t rên bằng c á c h tạo được cây sạch bệnh virus từ 6 g iống khoai tây qua nuô i cấy đ ỉnh sinh t rưởng.

N ă m 1960, More l đã thực h i ện bước ngoặt k h i áp dụng thành c ô n g k ỹ thuật n à y trong nhân nhanh các loài địa lan Cymbidium t hông qua protocorm. Sau đ ó , v iệc phá t h iện ra cytokinin và mô i t rường nuô i cấy m ô cả i t i ến (Murashige và Skoog, 1962) đ ã tạo sức sống m ớ i để ứng dụng nuôi cấy đ ỉnh sinh t rưởng trong n h â n g iống t hương m ạ i ở thực vật.

K ế t quả nuôi cấy đ ỉnh sinh t rưởng phụ thuộc vào vật l i ệ u k h ở i đ ầ u , nguồn gốc và k ích thước của m ẫ u . Đ ể đạt được h iệu quả cao, cần l ấ y m ẫ u n u ô i cấy từ c h ồ i đ a n g sinh

trưởng mạnh (Gupta và cs., 1981) hoặc chồi của cây m ớ i g h é p (Jones và cs., 1985). N u ô i cấy đ ỉnh sinh t rưởng cây non d ễ dàng hơn cây trưởng thành , t ỷ l ệ ra rễ trong t rường hợp

58

này đạt 83%, trong k h i v ớ i cây t rưởng thành ch ỉ đạ t 63% (Viei tez và cs, 1985). Đ i ề u

k i ệ n nuô i cấy, thờ i đ i ể m l ấ y m ẫ u cũng ảnh hưởng rấ t l ớ n đ ế n k ế t quả tái sinh cây từ đ ỉnh

sinh t rưởng. M ộ t số loài c ó ưu t h ế chồ i đ ỉnh mạnh, n u ô i cấy đ ỉnh sinh t rưởng từ chồ i

đ ỉnh d ễ d à n g hơn từ chồ i nách , đ ố i v ớ i một số loài k h á c l ạ i thu được k ế t quả ngược l ạ i .

K í c h thước m ẫ u nuô i cấy càng lớn , tỷ l ệ tái sinh và sống sót của m ẫ u c à n g cao, tuy nh i ên m ầ u c à n g nhỏ thì k h ả năng sạch bệnh virus l ạ i cao hơn . D o vậy , k ích thước m ẫ u nuôi cấy cần phải xác đ ịnh bằng thực nghiệm đ ố i v ớ i m ỗ i loài . M ẫ u n u ô i cấy nhỏ nhấ t chỉ c ó c h ó p sinh t rưởng và 2 - 3 m ầ m lá sẽ là lý tưởng đ ể tạo giống sạch bệnh do m ô phân sinh đ ỉnh nằm ở c h ó p đ ỉnh chổ i , là trung t âm hoạt động sinh t rưởng, p h â n hoa và

phát t r iển của thực vật . Ngay d ư ớ i m ô phân sinh này là các m ầ m lá. Đ ô i k h i k ích thước

m ẫ u lớn hơn v ẫ n đ ả m bảo sạch bệnh vừus (Vine và Jones, 1969), song m ộ t số t rường hợp khác l ạ i đòi h ỏ i m ẫ u nhỏ hơn (Hunter và cs, 1984).

Nuô i cấy đ ỉnh sinh t rưởng là kỹ thuật nuô i cấy m ô được ứng dụng rộng rãi nhấ t trong nông nghiệp và nghề l àm vườn vớ i các ưu đ i ể m ch ính sau:

- L o ạ i trừ bệnh virus và tương tự virus.

- Bảo quản quỹ gen i n vi t ro và trao đ ổ i nguồn gen an toàn giữa các quốc gia.

- N h â n nhanh hàng loạt, đồng nhất v ớ i số lượng lớn cây giống từ mộ t cây m ẹ ban đầu.

2.5.3.2. Ghép mắt in vitro

Ghép chồi đỉnh

M ộ t trong các phương p h á p quan t rọng để tạo cây ăn quả có m ú i sạch bệnh là chọn lọc cây con từ phô i vô t ính (phôi có nguồn gốc từ t ế b à o phô i t âm) . Tuy nh iên , những cây này có chu k ỳ sinh t rưởng dài (6-7 n ă m ) trước k h i bước vào giai đoạn sinh sản. Do vậy, h i ện nay v i g h é p là k ỹ thuật tạo cây sạch bệnh được sử dụng thành công ở nhiều

phòng thí ngh iệm. Murashige và cộng sự (1972) d ù n g v i g h é p đ ỉnh sinh t rưởng đ ể tạo vật l i ệ u sạch bệnh ở cây ăn quả có mú i , cây con tái sinh đã sạch các tác n h â n gây bệnh virus và tương tự virus. N ă m 1975, Navarro và cộng sự đã h o à n th i ện quy tr ình v i ghép

chồi đ ỉnh cây có m ú i i n vi tro. Bằng k ỹ thuật này , khoảng 90 l o ạ i cây có m ú i khác nhau được làm sạch bệnh (Navarro và cs, 1988). K ỹ thuật v i g h é p đã l o ạ i trừ được hàng loạt bệnh k h ỏ i nguồn gen cây c ó mú i , ví dụ :

- Virus gây bệnh tristeza, psorosis

- Stubborn spiroplasma

- Exocortis v i ro id

- T á c n h â n gây bệnh chảy g ô m , cristacortis, impietratura

Kỹ thuật vi ghép chồi bao gồm các bước sau:

- Chuẩn bị gốc g h é p trong ống nghiệm: Cây gốc g h é p thường d ù n g trong v i ghép là

Troyer citrange hoặc một vài gốc ghép khác có khả n ăng tương hợp cao v ớ i mắ t ghép.

59

Hạt d ù n g l àm gốc g h é p được gieo trong m ô i t rường lỏng v ô t rùng , đ ể cho c â y nảy m â m trong t ố i 10 - 14 ngày , sau đ ó thực h iện v i ghép .

- Chuẩn bị mắ t ghép trong ống nghiệm: Chọn giống tố t cần phá t t r i ể n sản xuấ t và cây đ ú n g g iống cần nhân . T ừ cây này , chọn l ấ y đ o ạ n cành non b á n h tẻ , k h ù t rùng ro i nuôi cấy in vi tro. K h i thân non bật m ầ m , thao tác tách l ấ y c h ồ i đ ỉnh ( g ồ m đ ỉnh sinh t rưởng và 1-3 m ầ m lá non từ cây m ẹ ) . Thao tác tách chồ i đ ỉnh thường được thực h i ệ n

d ư ớ i k ính h iển v i soi n ổ i vì chồ i đ ỉnh c ó kích thước rấ t nhỏ ( 0 . 1 - 0.2 m i n ) .

- Cấy ghép chồ i đ ỉnh lên đoạn thân non của gốc g h é p trong ống ngh iệm.

- Sau 4-6 tuần nuôi d ư ớ i ánh sáng , chồ i đ ỉnh bật m ầ m và c ó lá thật, chuyển cây g h é p

ra đấ t .

H i ệ n nay phương p h á p v i g h é p chồ i đ ỉnh đ a n g được sử dụng rộng rãi đ ê tạo các

d ò n g Citrus sạch bệnh phục vụ cho nhân giống t hương m ạ i .

Vi ghép kết hợp với xử lý nhiệt hoặc hoa chất

Quy trình:

- Gốc g h é p được chuẩn bị từ hạt nuô i cấy in vi t ro t rên m ô i t rường c ơ b ản M S c ó 1% agar. Troyer citrance thường được d ù n g l àm gốc ghép , c ò n gốc g h é p Etrog citron được

d ù n g để ghép các loạ i chanh.

- Cây giống đã n h i ễ m bệnh d ù n g l àm mắ t g h é p được chuẩn b ị n h ư sau: b ỏ lá, g iữ cây ở nhiệt đ ộ 3 2 ° c từ 12-15 ngày . Sau đ ó , tách đ ỉnh sinh t rưởng k í c h thước 0,1-0,2 m m từ chồ i m ớ i h ình thành và v i g h é p theo k i ể u chữ T l ộ n ngược t rên gốc g h é p .

- Nuô i cây sau v i g h é p t rên m ô i t rường M S có 100 mg/1 myo-inosi to l , đường 4%, thiamin HC1 0,2 mg/1, pyridoxine HC1 lmg/1 , nicotinic lmg /1 , đặc b iệ t sử dụng nồng độ đường sucrose, các vi tamin B cao v ớ i h à m lượng B A , I A A và G A 3 k h á c nhau đ ể kích thích bật chồ i từ đ ỉnh sinh t rưởng v i ghép . T ỷ l ệ v i g h é p t hành c ô n g là 60-70% và cây chuyển ra đấ t đ ã sống x ấ p x ỉ 90%.

Chương t r ình v i g h é p tạo giống sạch bệnh ở cây có m ú i đã được t r iển kha i ở hầu hết

các nước.

2.5.3.3. Công nghiệp nuôi cấy mô thực vật nhân giống sạch bệnh

N h â n giống sạch bệnh bằng nuôi cấy m ô (còn được g ọ i là v i n h â n g iống) đ ã trở thành một trong những phương thức quan trọng nhấ t đ ể n h â n nhanh đ ố i v ớ i nh i ều l o ạ i cây trổng khác nhau. T ừ k h i bắt đầu xuấ t h i ện công nghiệp v i nhân g iống vào đ ầ u những n ă m 70 của t h ế k ỷ X X số lượng các phòng thí ngh iệm v i n h â n giống t hương p h ẩ m đã t ăng lên nhanh c h ó n g . Sự toàn cầu hóa của công nghiệp v i n h â n g iống đã d i ễ n ra rấ t t ích cực trong những n ă m 80 của t h ế k ỷ X X . Sự m ở rộng của c ô n g nghiệp v i n h â n g iống k h ô n g chỉ g ó p phần t ăng năng suất cây trồng m à còn thúc đ ẩ y việc c ô n g nghệ h ó a các

mặ t hàng n ô n g nghiệp.

Các loài cây trồng đ ang được v i nhân giống trên th ị t rường t h ế g i ớ i là:

60

- Các loài hoa, cây cảnh đặc biệt là phong lan, đ ịa lan. Các chi hoa lan được cấy m ô và sử dụng cho hoa cắt, hoa chậu thương phẩm gồm: Dendrobium, Ầrachis, Aranda, Ascocenda, Catleya, Cymbidium, Cypripedium, Oncidium, Mokara, Phalaenopsis, Vanda.

- Các cây dạng hành , g ồ m các loài n h ư L i l i u m , Lay ơn,. . . .

- Các loài cây có củ như gừng, khoai tây.

- Các loài cây ăn quả như chuối , dâu tây, đu đủ , mít . . .

- Các loạ i cây trồng khác như dứa, cây cọ dầu, mía , các l o ạ i cây l âm nghiệp như bạch đàn , keo la i , hông , tếch...

- Các d ò n g b ố m ẹ để sản xuấ t hạt la i k h ó n h â n và g i ữ bằng con đường hữu t ính như các dòng hoa, rau bấ t thụ đực.

Những ưu điểm và nhược điểm của công nghệ vi nhăn giống

Ưu điểm của vi nhân giống

- Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: T ừ một cây ưu v i ệ t bấ t k ỳ đ ề u c ó thể tạo ra một quần thể có độ đồng đ ề u cao v ớ i số lượng k h ô n g hạn chế, phục vụ sản xuấ t thương m ạ i , dù cây đó là d ị hợp về mặ t d i t ruyền.

- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các t rường hợp, công nghệ v i nhân giống đ á p ứng tốc đ ộ n h â n nhanh cao, từ Ì cây trong vòng 1-2 n ă m c ó thể tạo thành hàng t r i ệu cây .

- Sản phẩm cây giống đồng nhất: V i n h â n giống về cơ bản là công nghệ nhân dòng . N ó tạo ra quần thể có đ ộ đồng đ ề u cao dù xuấ t phá t từ c ây m ẹ c ó k i ể u gen d ị hợp hay đồng hợp.

- Tiết kiệm không gian: V ì hệ thống sản xuấ t hoàn toàn trong p h ò n g th í nghiệm, không phụ thuộc vào thờ i t i ế t và các vật l i ệ u khở i đ ầ u có k ích thước nhỏ . M ậ t đ ộ cây tạo ra trên một đơn v ị d i ệ n t ích l ớ n hơn rấ t nh iều so v ớ i sản xuấ t t rên đồng ruộng và trong nhà l ánh theọ phương p h á p t ruyền thống.

- Nâng cao chất lượng cây giống: N u ô i cấy m ô là mộ t phương p h á p hữu h iệu để l o ạ i trừ virus, n ấ m khuẩn k h ỏ i các cây giống đã n h i ễ m bệnh. Cây giống sạch bệnh tạo ra bằng cấy m ô thường t ăng năng suất 15-30% so v ớ i giống gốc.

- Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: CÁC dạng sản phẩm khác nhau có thể tạo ra từ h ệ thống v i nhân, g iống như cây con in vi tro (trong ống nghiệm) hoặc trong bầu đấ t . Các cây giống có thể được bán ở dạng cây , củ b i hay là thân củ.

- Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa d ễ dàng và thuận l ợ i , đồng thờ i cây con tạo ra trong đ iều k i ệ n vô t rùng được xác nhận là sạch bệnh. Do vậy, bảo đ ả m an toàn, đáp ứng các quy đ ịnh về vệ sinh thực vật quốc tế .

- Sản xuất quanh năm: Q u á t r ình sản xuấ t có thể t i ế n h à n h vào bấ t k ỳ thờ i gian nào , không phụ thuộc m ù a vụ .

Nhược điểm của vi nhân giống

- Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong đ iều k i ệ n k ỹ thuật h i ện nay, k h ô n g phải tấ t cả cây t rồng đ ề u được nhân giống thương phẩm bằng v i n h â n giống. N h i ề u cây trồng có giá trị k inh t ế hoặc quý h i ếm v ẫ n chưa thể nhân. nhanh đ ể đ á p ứng nhu cầu thương

61

m ạ i hoặc bảo quản nguồn gen. N h i ề u v ấ n đề lý thuyết l iên quan đ ế n n u ô i c ấ y và tá i sinh t ế bào thực vật i n vi tro v ẫ n chưa được g iả i đ áp .

- Chi phí sản xuất cao: V i n h â n giống đòi h ỏ i nh iều lao động k ỹ thuật t hành thạo. Do đ ó , giá thành sản phẩm còn khá cao so vớ i các phương p h á p t ruyền thống n h ư chiet, g h é p và n h â n g iống bằng hạt.

- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con n u ô i cấy m ô c ó thể sai k h á c v ớ i cây m ẹ ban đ ầ u do h i ện tượng b iến d ị t ế bào soma. K ế t quả là cây con k h ô n g g i ũ

được các đặc t ính q u ý của cây .mẹ . T ỷ l ệ b i ến d ị thường thấp ở giai đ o ạ n đ ầ u n h â n g iông , nhưng sau đ ó c ó ch iều hướng t ăng lên kh i nuô i cấy k é o dài và t ăng h à m lượng c á c chá t k ích thích sinh t rưởng. H i ệ n tượng b iến d ị này cần được lưu ý khắc phục n h ằ m đ ả m bảo sản xuấ t h àng t r i ệu cây giống đồng nhấ t về mặ t d i t ruyền.

2.5.3.4. Sản xuất các chứ hoạt tính sinh học từ thực vật ở quy mô lớn bằng bioreactor

Các chất hoạt tính sinh học từ thực vật

H i ệ n nay, n g ư ờ i ta đã xác đ ịnh vài chục ngh ìn chấ t thứ cấp. C á c chấ t c ó hoạt t ính sinh học ở thực vật thường chia l àm ba n h ó m :

- Các chấ t thứ cấp.

- Các peptid và protein hoạt t ính sinh học.

- Các sản phẩm m ớ i khác .

Va i trò của các chấ t thứ cấp đ ố i v ớ i đ ờ i sống cây t rồng chưa được n g h i ê n cứu kỹ nhưng nói chung chúng thường có vai t rò trong bảo vệ thực vậ t . C á c chấ t n à y được tích l ũy ở k h ô n g bào của t ế bào thực vật . Rấ t nh iều chấ t thứ cấp là nguồn dược l i ệ u c ó giá trị thương m ạ i cao.

N g ư ờ i ta chia các chấ t thứ cấp thành các n h ó m được thể h i ệ n ở bảng sau:

Bảng 2.9. Các chất thứ cấp ở thực vật bậc cao

Dạng sản phẩm thứ cấp Số lượng các chất trong mỗi nhóm Nhóm chết có chứa nitơ: Amin 100 Alkaloid 12.000 Các axit amin không phải protein (NPAAs) 400 Cyanogenic glycoside 100 Glucosinolate 100 Nhóm chất không có chứa nitơ: Monoterpene 1.000 Sesquiterpene 3.000 Diterpene 1.000 Triterpene, steroid, saponin 4.000 Tetraterpene 350 Polyketide 750 Polyacetylene 1.000 Flavonoid 2.000 Phenylpropanoid 500

62

Sản xuất các chất có hoạt tính sinh học từ thực vật bằng nuôi cấy mô

Thực t ế , mộ t số cây dược l i ệ u q u ý rấ t k h ó t rồng hoặc cho h à m lượng chấ t có giá trị* cao trong sinh k h ố i q u á thấp nên các nhà khoa học đ ã n g h i ê n cứu ứng dụng c ô n g nghệ nuôi cấy m ô t ế bào thực vật như mộ t công cụ để sản xuấ t các chấ t hoạt t ính s ính học. C ô n g nghệ này bao g ồ m các bước sau:

- Chọn lọc loài thực vật hoặc giống cây trồng sản xuấ t các chất có giá trị thương mạ i .

- Nuô i cấy t ế bào , m ô hoặc cơ quan tách r ờ i i n vi tro tạo sinh k h ố i t ế bào .

- G â y đ ộ t b iến hoặc chọn d ò n g t ế bào soma có k h ả n ăng tạo sinh k h ố i lớn , c ó h à m lượng hoạt chấ t cao.

- Chiết rút, thu h ồ i các chấ t hoạt t ính từ sinh k h ố i .

Cho đến nay, ch ỉ c ó mộ t số ít các quá tr ình công nghệ được ứng dụng sản xuấ t ở quy m ô pilot công nghiệp.

H ầ u hết các bioreactor trong nuô i cấy t ế bào thực vật được ngh iên cứu cả i t i ến từ các loạ i n ồ i lên men sử dụng trong nuô i cấy t ế bào v i sinh.

Bảng 2.10. Một số loại bioreactor đã được sử dụng trong nuôi cấy tế bào thực vật

Phường thức nuôi cấy Loại bình Quy mô (lít) Bình có trục khuấy-Stirred tank 1- 75.000

Nuôi cấy tế bào dịch lỏng Bình lăn tròn-Rotating drum 2-1.000 Bình thổi khí từ dưới: Air-lift 1-1.500 Bình có trục khuấy-Stirred tank 1-20 Bình có trục khuấy cải tiến-Modified stirred tank 1-14

Nuôi cấy rễ tóc Bình thổi khí từ dưới: Air-lift 1-13 Bình nhỏ giọt-Droplet reactor 2-500 Bình sương mù-Mist reactor 1-35

Nuôi cấy cơ quan và tế bào Bình có trục khuấy-Stirred tank 1-10 phôi hoa Bình thổi khí từ dưới: Air-lift 0,6-6

Bên cạnh việc tăng quy m ô sản xuấ t ( tăng kích thước của bioreactor), v ấ n đ ề đặ t ra là phải chọn d ò n g t ế bào có khả năng tạo sinh k h ố i l ớ n và h à m lượng hoạt chấ t cao trong sinh k h ố i .

Bảng 2.11. Các hoạt chất được sản xuất với hàm lượng cao bởi những dòng tế bào

nuôi cấy chọn lọc (Curtìs, 1999)

Tên hoạt chất Tỷ lệ hoạt chất trong sinh khối khô (%) Anthocyanin Anthraquinone Berberine Jalrorrhizine Rosmarinic axit Shikonin stevioside Theanine(Caffeine antagonist) Vanillin

20 18,7 10,5 10,1 36

21,2 36,4 22,3 8,0

63

Bảng 2.12. Các hoạt chất được sản xuất quy mô lớn bằng bioreactor ở một số loài cây trồng (Wỉldi and Wink, 2001)

Tên hoạt chất Loài cây dược liệu Tác giả sản xuất Anthocyanin Berberine

Euphorbia millii Coptis ịaponica, Thalictrum minus Beta vulgaris

Nippon Paint (Nhật) Mitsui Petrochemical Industries (Nhật)

Betacyanin Echinacea polysaccharid Gingseng saponin Rosmarinic acid Sanguinarine Shikonin

Panax gingseng Coleus blumei Papaver somniỉerum Lithospermum erythrorhizon Taxus breviíolia, T. chinensis, Taxus sp. Vanilla planiíolia

E. purpurea, E. angustiíolia

Nitto Denko (Nhật) Nattermann (Đức) Vipon Research Labs (USA) Mitsui Petrochemical Industries (Nhật) Nippon Oil (Nhật), ESCA genetics (USA), Phýton Catàlytic (USA) ESCAgenetics (USA)

Nippon Shinyaku (Nhật) Diversạ (Đức)

Taxol

Vanilin

Mặc dù các nhà khoa học đã đạt được một số thành công trong sản xuấ t dược chất nhưng công nghệ bioreactor v ẫ n còn phải t iếp tục cả i t i ến để n âng cao n ă n g suất, đơn giản hoa thiết bị để g iảm giá thành sản xuấ t . H i ệ n tạ i bioreactor chỉ được sử dụng đ ể sản xuất các chất có giá trị cao, đắ t t i ền hoặc các hợp chấ t k h ô n g thể sản xuấ t bằng con đường khác . Gần đây một hướng phát t r iển m ớ i g ọ i là canh tác phân tử đ ã được h ình thành, trong đ ó cây trồng được xem như một loạ i bioreactor đ ể sản xuấ t các chấ t q u ý h i ế m . Bước đầu, các gen liên quan đến dược l i ệ u hoặc c h ế phẩm công nghiệp n h ư vacxin, k h á n g thể , enzym... từ ngườ i , động vật, v i sinh vật đã được chuyển vào thực vật , tạo cây t rồng chuyển gen có khả tăng tạo ra sinh dược trên đồng ruộng hoặc trong n h à k ính .

2.5.3.5. Kỹ thuật đơn bội in vitro trong công tác giống cây trồng

K ỹ thuật tạo cây đơn b ộ i i n vi t ro: t hông qua trong n u ô i cấy hạt phấn và n o ã n cho phép tạo ra nhanh c h ó n g hàng loạt cây đơn b ộ i hoặc đơn b ộ i k é p từ c ác t ế b à o sinh dục đực và cái , phục vụ đắc lực cho mục đ í ch n g h i ê n cứu d i t ruyền và tạo g iống c â y trồng.

N ă m 1964, lần đầu t iên t rên t h ế g i ớ i , hai nhà khoa học A n Đ ộ Guha và Maheshwari thành công trong việc tạo cây đơn b ộ i từ nuô i cấy bao phấn in vi t ro cây cà Datura innoxia. Ngay sau đó , cây đơn b ộ i đã được tạo ra bằng n u ô i cấy bao phấn ở h à n g loạt cây trồng khác nhau. Hai phương p h á p cơ bản của k ỹ thuật đ ơ n b ộ i h i ệ n nay là:

- N u ô i cấy bao phấn hay t i ể u bào tử tách r ờ i hay còn g ọ i là phương p h á p t r inh sinh đực trong ống ngh iệm ( in vi tro androgenesis).

- Nuô i cấy t ế bào trứng chưa thụ t inh hay còn g ọ i là phương p h á p t r inh sinh cá i trong ống nghiệm ( in v i tro gynogenesis).

V ậ t l i ệ u ban đầu cho q u á t r ình nuôi cấy in vi tro tạo cây đơn b ộ i thường là:

- Bao phân , hạt phấn tách r ờ i , cụm hoa (phương p h á p này hay được áp dụng cho những loài có hoa nhỏ ) .

64

- Cứu phôi sau lai xa. K h i la i xa giữa hai loài lúa mạch Hordeum vulgare và H. bulbosum, sau q u á t r ình thụ phấn tạo ra nhiều phô i đơn b ộ i do n h i ễ m sắc thể của t ế bào

sinh dục loài H. bulbosum bị loạ i trừ. Do n ộ i nhũ của phôi đơn b ộ i k h ô n g phát t r iển nên n g ư ờ i ta đã phải sử dụng phương p h á p nuôi cấy t ế bào để cứu những phôi này và tạo ra hàng loạt cây đơn b ộ i (Jensen, 1977).

- T h ụ t inh g iả . Đ â y là quá t r ình thụ phấn n h ư n g k h ô n g xảy ra sự thụ t inh. M ặ c dù vậy, t ế bào trứng v ẫ n được kích th ích phát t r iển thành cây đơn b ộ i . Hess và Wagner (1974) đã t i ến hành thụ phấn in vi tro giữa Mimulus luteus v ớ i Torenia ỷournieri và kế t

quả là đã tạo được cây đơn b ộ i .

- Nuô i cấy noãn chưa thụ t inh.

Trong số các vật l i ệ u t rên, bao phấn, hạt phấn tách r ờ i và noãn chưa thụ t inh là những nguồn n g u y ê n l i ệ u quan trọng, được sử dụng phổ b iến hơn để tạo cây đơn b ộ i .

T ạ i Trung Quốc, công nghệ đơn b ộ i đã được t r iển khai có h ệ thống t rên quy m ô lớn và có đ ịnh hướng ch iến lược rõ ràng trong tạo giống m ớ i . H ơ n m ộ t ngh ìn cơ sở nuô i cấy bao phấn đã hoạt động trên toàn quốc từ những n ă m 1970, kế t quả đã tạo được trên 100 giống lúa m ớ i trong mộ t thờ i gian ngắn. Trong đ ó , g iống lúa nước và lúa mì m ớ i tạo ra từ kỹ thuật đơn b ộ i đã m ở rộng sản xuấ t t rên d i ện t ích vài t r i ệu ha. T ạ i T r i ều Tiên , k ỹ thuật nuôi cấy bao phấn đã tạo ra 42 giống lúa m ớ i (Sasson,1993; Jain cs., 1997). Ư u t h ế

của các phương p h á p nuô i cấy này là tấ t cả các cây tạo thành đ ề u có nguồn gốc từ t i ể u bào tử hoặc đ ạ i b à o tử, vì vậy cây con nhận được sẽ là cây đơn b ộ i hoặc cây nh ị b ộ i đồng hợp tử v ớ i các cặp n h i ễ m sắc thể tương đồng hoàn toàn giống nhau (trừ t rường hợp độ t biến). Cây nh ị b ộ i thu được là do q u á t r ình nh ị b ộ i hoa tự nh iên của hạt phấn đơn b ộ i trong nuôi cấy hoặc x ử lý đa b ộ i hoa bằng thực ngh iệm.

2.5.3.6. Kỹ thuật chọn tạo biến dị tế bào soma và khả năng ứng dụng

Biến d ị t ế bào soma - mộ t h iện tượng chung và phổ b i ến xảy ra trong nuôi cấy m ô in vitro. Căn cứ vào quy luật của Vav i lốp , trong những đ iều k i ệ n m ô i t rường giống nhau có thể quan sát thấy c á c b i ến d ị d i t ruyền g iống nhau ở các loài gần nhau về phân l oạ i . Số l i ệ u của hơn 30 n ă m qua cho thấy m ô và t ế bào tách r ờ i , nuô i cấy t rên m ô i t rường nhân tạo là nguồn k h ô n g có g iớ i hạn của các b iến d ị d i t ruyền. La rk in và Scowcroft (1981)

đưa ra khá i n i ệ m b i ến d ị t ế bào soma làm tên g ọ i chung cho các l o ạ i b i ến d ị này .

Nguồn gốc của các biến dị tế bào soma

Những thay đổi di truyền xảy ra trước khi nuôi cấy mô i n vi t ro:

Trong quá t r ình phát t r iển cá thể , phân hoa và già hoa của m ô và t ế bào m ộ t số các thay đ ổ i d i t ruyền đã xảy ra và được t ích l ũ y trong các t ế b à o soma (D'amato, 1985).

N h ờ kỹ thuật nuô i cấy m ô , cây được tái sinh từ t ế bào soma sẽ là các đ ộ t b iến . Các nhà

khoa học đưa ra khá i n i ệ m automutagenesis - tự đ ộ t b iến (đột b i ến xảy ra k h ô n g do các tác nhân từ bên ngoà i gây nên) . De Vries (1901) - n g ư ờ i k h ở i xướng học thuyết về độ t biến cho ràng cây bị đ ộ t b iến do được tái sinh từ hạt già (có nh iều đ ộ t b iến đã t i ề m ẩn từ trước trong hạt g ià) . Ba mươi n ă m sau, Nawacin chứng minh đ ộ t b iến ở hạt già là do các

65

chấ t tham gia q u á tr ình trao đ ổ i chấ t và các sản phẩm cặn bã c ó trong hạt g â y nên . Các chấ t này có thể là: hợp chấ t chứa lưu huỳnh, amin, amino axit, amid, aldehyde, alkloide, phenol, quinone, axit nucleic và các sản phẩm k h á c . N g u y ê n n h â n gây đ ộ t b i ế n có the

do cấu trúc bình thường của hạt và t ế bào bị phá v ỡ - các enzym t i ếp x ú c v ớ i các chấ t và tạo ra sản phẩm đ ộ t b iến .

Tuy theo phương thức nuô i cấy t ế bào soma, n g ư ờ i ta p h â n biệ t c á c l o ạ i b i ế n d ị d ư ớ i đây:

- B iến d ị d ò n g t ế bào m ô sẹo (callusoclonal variation): k h i c ây b i ế n d ị tá i sinh t ừ m ô sẹo (callus).

- B iến d ị d ò n g t ế bào t rần (protoclonal variation)-khi cây b iến d ị tái sinh t ừ t ế bào

t rần.

Ngoà i ra Evans và cộng sự (1984) còn đưa ra khá i n i ệ m "b iến d ị giao tử" (gameto-clonal variation) k h i cây được tái sinh từ các t ế bào sinh dục (gamete). N h ữ n g b i ế n d ị di t ruyền xảy ra và được phá t h i ện trong quá tr ình nuô i cấy i n v i t ro g ọ i chung là đ ộ t b i ến t ế

bào dòng .

Những thay đổi di truyền xảy ra trong quá trình in vitro:

M ộ t nguồn b iến d ị t ế bào soma quan trọng là thay đ ổ i trong b ộ m á y d i t r u y ề n x ả y ra kh i nuôi cấy tạo m ô sẹo và phân hoa cơ quan in vi t ro . Đ ế n nay c á c n h à khoa học đã phát h iện hai nguyên nhân cơ bản d ẫ n đ ế n các b iến d ị (đột b iến) x ả y ra t rong t ế b à o nuô i cấy in vitro:

- T ế bào nuô i chịu tác động trực t i ếp của các chấ t hoa học trong m ô i t rường nuôi cấy.

- Trong đ iều k i ệ n in vitro, các gen d i động (transposon) hay c ò n g ọ i là c á c gen nhảy hoạt động rấ t mạnh, các gen nhảy đã được phá t h i ệ n l ầ n đ ầ u t iên ở n g ô n ă m 1963. N g ư ờ i phát minh ra gen nhảy (transposon) là McClintocr , bà đ ã được g i ả i t hưởng Nobel năm 1983 nhờ phát minh này . Đ ế n nay, khoa học đã x á c đ ịnh được các gen nhảy t ồ n tạ i ở hầu hết các cây trồng. Hoạt động của c h ú n g phụ thuộc v à o k i ể u gen và đ i ề u k i ệ n môi trường. Trong cấy m ô , các gen này d i chuyển t ích cực, n ó c ó thể cài v à o bấ t k ỳ gen nào trên n h i ễ m sắc thể và gây ra tần số đ ộ t b i ến rấ t cao.

Chroqui và Bercetch (1985) cho b iế t auxin gây ra đa b ộ i hoa b ê n trong t ế b à o nuô i cấy (endopolyploidization). Oono (1982) nuô i cấy m ô sẹo từ hạt lúa và tái sinh c â y từ m ô sẹo cho b iết B A P có nồng đ ộ 30 mg/1 tạo ra tần số đ ộ t b i ến l ớ n gấp 50 l ầ n so v ớ i BAP ớ nồng đ ộ 2 mg/L M ứ c đ ộ đ ộ t b iến t ế bào soma lớn đ ế n mức tần số đ ộ t b i ến do các

chấ t độ t b iến gây ra cũng k h ô n g cao hơn (Larkin and Scowcroff, 1981).

Orton (1984) cho b iế t trong thờ i gian nuôi cấy trên m ô i t rường dinh dưỡng h ệ gen của các t ế bào thực vật đã t rả i qua quá tr ình cả i tổ nhanh c h ó n g và đã phá t h i ệ n n h ư n g thay đ ổ i số lượng, cấu trúc n h i ễ m sắc thể , đ ộ t b iến gen. T ầ n số đ ộ t b iến gen nh iều k h i

rấ t cao ( l o 2-10"') t ính theo locus trên cây. Thay đ ổ i d i t ruyền phổ b i ến nhấ t x ả y ra trong t ế bào nuô i cấy là đa b ộ i thể . Sau k h i m ô được nuôi cấy, n h â n t ế bào có t h ể t r ả i qua quá

66

t r ình n ộ i phân (endoreduplication) làm số lượng n h i ễ m sắc thể trong t ế bào t ăng lên gấp đôi hoặc hơn nữa nhưng không x ẩ y ra phân chia t ế bào . K ế t quả số lượng n h i ễ m sắc thể của t ế bào t âng lên. Q u á trình n ộ i phân của n h i ễ m sắc thể trước kh i p h â n bào đã cho p h é p n g ư ờ i ta nhận được cây lưỡng b ộ i đồng hợp (dihaploid) từ hạt phấn đơn b ộ i trong nuôi cấy bao phấn. Phổ rộng các b iến đ ổ i n h i ễ m sắc thể đã được quan sát thấy ở nhiều

loài cây trồng k h á c nhau (Murashige và Nakano, 1967; Sacristan và Melchers, 1960; Sunderland 1973; Nishi và Mitsuoka, 1969). N g h i ê n cứu t ế bào học cho thấy 10% số loài phân hoa cơ quan không k è m theo h iện tượng n ộ i p h â n n h i ễ m sắc thể , 90% số loài phân hoa cơ quan có k è m theo n ộ i phân n h i ễ m sắc thể .

Độ t b iến t ế bào soma xảy ra ở các gen trong t ế bào chấ t đã được chứng minh bằng phương pháp tách A D N ty thể và lục lạp nhờ enzym cắt (Kemble R.T cs, 1984). Đ ộ t biến t ế bào soma đã ứng dụng vào chọn giống h iệu quả ở nh iều cây trồng như mía , khoai

tây, cà chua, thuốc lá, lúa và lúa mì . Ở Petunia đã nhận được giống m ớ i g ọ i là Velevetrose, g iống mía Q47 (Larkin and Scrowroft, 1981).

2.5.3.7. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần (protoplast) và thao tác di truyền ở mức tế bào

Tách nuôi tế bào trần

K h á c vớ i t ế bào v i sinh và t ế bào động vật , t ế b à o thực vật có thành t ế bào cứng được tạo ra bở i nhiều l oạ i polyme khác nhau. T h à n h t ế bào có chức n ăng cơ học, tạo khung xương t ế bào và h ệ m à n g liên kế t giữa các t ế bào v ớ i nhau. T h à n h phần hoa học của t ế

bào rấ t phức tạp. Cellulose là thành phần chủ y ế u của m à n g t ế bào thực vật . Công thức hoa học tổng quát của cellulose là ( C 6 H 1 5 0 5 ) n . Phân tử cellulose có h ình sợi dài , thậm ch í rấ t dài vớ i sự l iên kế t của hàng ngh ìn các phân tử đường đơn v ớ i nhau. Ngoà i cellulose còn có hemicellulose, pectin, l ignin , mộ t số chấ t béo và chấ t k h o á n g , pectin còn đóng vai trò quan trọng liên kế t giữa các t ế bào v ớ i nhau.

T ế bào t rần (protoplast) là t ế bào đã được l o ạ i bỏ m à n g t ế bào (một lớp polyme bao bọc t ế bào) và m à n g l iên kế t giữa các t ế bào . Các enzym đ ó n g vai t rò chủ yếu trong phân huy m à n g t ế bào và tạo ra t ế bào t rần là cellulase và pectinase. T ế b à o sau k h i bị mấ t lớp màng cứng sẽ có dạng h ình cầu d ư ớ i áp suất t hẩm thấu phù hợp của m ô i t rường.

T ế bào t rần có thể được tách ra từ các m ô hoặc cơ quan khác nhau ở cây như lá, rễ , m ô sẹo nuô i cấy in vi tro (hình 5 - tách nuôi t ế bào t rần từ m ô lá cả i dầu).

Ư u t h ế của k ỹ thuật tách và nuôi cấy t ế bào t rần là t ế bào k h ô n g có m à n g cứng, ở trạng thái đơn bào , mậ t đ ộ t ế bào thu được trên Ì đơn v ị thể t ích m ô i t rường có thể rấ t cao (đạt l o 6 t ế bào /1 m i m ô i t rường). T ế bào t rần ở mộ t số cây trồng có k h ả n ăng tái sinh rấ t mạnh, ví dụ t ế bào m ô thịt lá ở thuốc lá, cả i dầu.. . Bằng thao tác d i t ruyền ở t ế bào

t rần có thể d ễ d àng tạo ra các t ế bào b iến đ ổ i gen. T ế bào v ớ i k i ể u gen b iến đ ổ i sẽ được bảo tồn kh i tái sinh t ế bào thành cây hoàn ch ỉnh.

Một số ứng dụng của kỹ thuật tế bào trần

- Lai xa:

N g ư ờ i ta c ó thể d ê dàng lai t ế bào t rần của các cây khác loài v ớ i nhau: khoai tây v ớ i cà chua, cam ba lá v ớ i cam ngọt và tạo ra con lai khác loài .

67

- Lai tế bào chất tạo ra các dòng đồng đẳng bất dục:

Phương p h á p tạo d ò n g đồng đẳng bấ t dục được t ó m tắ t n h ư sau:

- Tạo quần thể t ế bào t rần từ các dòng củng c ố bấ t dục (dòng B t i ề m n ăng ) VỚI te bào chấ t bình thường.

- Tạo quần thể t ế bào t rần từ các dòng bấ t dục đực t ế bào chấ t ( d ò n g CMS) vớ i t ế

bào chấ t bấ t dục.

- Phá n h â n của d ò n g CMS bằng ch iếu xạ hoặc hoa chấ t .

- Dung hợp (hay lai) hai loại t ế bào trần vớ i nhau và tái sinh t ế bào lai thành cây.

- Chọn lọc các cây từ t ế bào lai mang toàn bộ gen n h â n của d ò n g B và t ế b à o chấ t của d ò n g CMS.

Cây chọn lọc bất dục đực sẽ là dòng A đồng đẳng bấ t dục đực của d ò n g B, g iống hệt nhau về gen nhân , d ò n g A chỉ khác dòng B ở t ính trạng bấ t dục đực t ế b à o chấ t . N h â n dòng cây lai thông qua thụ phấn cây này bằng phấn của d ò n g B đ ể tạo ra d ò n g A . D ò n g B t i ề m năng trở thành dòng B củng cố (maintainer) của d ò n g A . P h ư ơ n g p h á p n à y cho phép nhanh chóng tạo ra các d ò n g thuần đồng đẳng bấ t dục phục vụ cho tạo g iống ưu t h ế lai . Nhưng h iện nay kỹ thuật này chưa được ứng dụng v ớ i nh iều c â y k i n h t ế quan

trọng như lúa, ngô. . .

- Chuyển nạp các cơ quan tử:

Trong quá trình dung hợp t ế bào t rần giữa hai loài hoặc hai g iống sẽ x ả y ra chuyển nạp các cơ quan tử (tái tổ hợp t ế bào chấ t ) . Trong t ế bào chấ t ở thực vậ t c ó rấ t nh iều cơ quan tử như lục lạp, ty thể . . . v ớ i nhiều đặc t ính d i t ruyền quan t rọng n h ư k h ả n ă n g kháng bệnh, t ính trạng bất dục hoặc hữu dục, gen quang hợp... L a i t ế b à o chấ t c ó t h ể tạo ra các dòng t ế bào hoặc dòng giống cây trồng có những đặc t ính d i t ruyền t ế b à o chấ t m ớ i .

- Tạo ra các tái tổ hợp mới của ADN:

Trong quá tr ình dung hợp t ế bào có t hể tạo ra các tái t ổ hợp m ớ i của n h i ễ m sắc thể hoặc A D N . Trong quá trình lai t ế bào k h i xử lý bằng p h ó n g xạ , n h i ễ m sắc t h ể của nhân có thể bị đứt gãy một cách ngẫu nhiên , dung hợp t ế b à o t rần c ó thể c ò n tạo ra tái tổ hợp A D N giữa các loài hoặc các đ ộ t b iến gen k h á c nhau.

- ưng dụng trong nghiên cứu cơ bản

T ế bào t rần được ứng dụng đ ể xác đ ịnh chức n ăng của t ế bào chấ t và c ơ quan tử thông qua phân tích con la i t ế bào chấ t .

Thao tác di truyền:

Vì t ế bào t rần k h ô n g có m à n g cứng nên rấ t thuận t i ện cho nh iều thao tác d i t ruyền

khác nhau như chuyển gen hoặc n h i ễ m sắc thể , t iểu bào tử, nhân t ế bào bằng các v i thao tác (vi t iêm vật l i ệ u d i t ruyền vào t ế bào) , xung đ iện. . . Thao tác d i t ruyền t rên t ế b à o t rần ở một số loài có khả năng tái sinh in vi tro mạnh như c ả i dầu, thuốc lá, khoai tây. . . có thể góp phần tạo ra hàng loạt các giống m ớ i chuyển gen trong tương la i .

68

- Dung hợp tế bào trần đề tạo các dạng đa bội thể:

D u n g hợp 2 l o ạ i t ế b à o t rần nh ị b ộ i (2n) c ó t h ể d ễ d à n g t ạo ra c á c t h ể tứ b ộ i (2n + 2n = 4n). Dung hợp t ế bao t rần nh ị b ộ i v ớ i t ế b à o t rần đơn b ộ i tạo ra c á c thể tam

b ộ i (2n + I n = 3n).

Cắt lá trong môi trường PCM, dùng enzym tách tế bào trần

Ly tâm thu được các tế bào trần

Tái sinh callus trên môi trường

Phân chia tế bào Nuôi tế bào trần trong môi trường

Chồi tái sinh C â y c o n in vitro

Hình 2.1. Tách nuôi tế bào trần từ mô lá và tái sinh cây (cải dầu)

69

Chương 3

C ơ S Ở S I N H H Ọ C P H Â N T Ử C Ủ A K Ỹ T H U Ậ T D I T R U Y Ề N

3.1. C Á C N G U Y Ê N L Ý C Â U T R Ú C H O A H Ọ C C Ủ A A D N

N ă m 1953, James Watson và Francis Crick đã công b ố m ô h ình p h â n tử A D N gom

hai sợi xoắn kép , sợi này là tương đồng bổ trợ của sợi kia . M ô h ình đã tạo ra là cơ sơ

khoa học g i ả i th ích được những sự thần k ỳ của các h iện tượng sinh học n h ư k h ả n ăng

sinh sản bằng nhân đô i , khả n ăng d i t ruyền, b iến d ị và t i ến hoa, t ính đa dạng và phong

phú tuyệt vờ i của sinh g i ớ i .

M ỗ i sợi A D N là m ộ t po lymer được tạo bở i bốn p h â n tử deoxyribonucleotid khác

nhau g ọ i tắt là nucleotid đ ó là Adenin ( A ) , Thymin (T) , Guanin (G) và Cytosin (C).

Trình tự của các nucleotid trong sợi A D N quy đ ịnh t ính đa dạng của các gen.

P h â n t ử A D N g ồ m 2 sợi x o ắ n k é p , trong đ ó đ ố i d i ện v ớ i nucleotid A t rên sợi này

luôn là T trên sợi kia và ngược l ạ i và đ ố i d iện vớ i G trên sợi n à y sẽ là c t rên sợi k ia và

ngược l ạ i . Hai nucleotid đ ố i d iện như vậy g ọ i là tương đồng và tạo ra m ộ t cặp nucleotid

(hay một cặp bazơ) (sơ đồ 3.1.). V í dụ như cặp Á T hay cặp CG. Đ ơ n v ị đ o đ ộ l ớ n hoặc

k ính thước của các phân tử A D N được t ính bằng số lượng cặp bazơ, cứ 1000 cặp bazơ sẽ

gọ i là kb (ki lobazơ).

C á c b a z ơ t r o n g c á c nucleot ỉd (Adenỉn và Thymin, Guanin và Cytosirì) c ó k h ả năng

bắt cặp tương đồng vớ i nhau từng đôi mộ t bở i lực l iên k ế t h y đ r ô y ế u . Lực l iên k ế t yếu

này cho phép 2 sợi A D N có thể d ễ d àng tách đô i (trong t rường hợp tổng hợp sợi A D N

mớ i hoặc sao m ã gen). Adenin trên sợi này bắ t cặp hay l iên k ế t v ớ i T h y m i n t rên sợi kia

và ngược l ạ i bở i hai liên kế t hydro. Guanin và Cytosin t rên hai sợi cũng l iên k ế t v ớ i nhau

bằng ba liên kế t hydro. K h ả năng liên kế t từng đô i của các bazơ n h ư t rên đ ã quy đ ịnh

tính đ ố i xứng trong cấu trúc của hai sợi A D N (sơ đ ồ 3.2).

L u ậ t đ ố i x ứ n g n à y t r o n g c ấ u t r ú c p h â n t ử của A D N là phổ b i ến trong sinh g i ớ i .

N ó quy đ ịnh những thuộc t ính quan trọng nhấ t của sự sống: khả năng sinh sản và di truyền.

- Khả năng sinh sản: K h ả n ăng nhân bản của phân tử A D N tạo ra các p h â n tử A D N

mớ i có cấu trúc giống hệt vớ i phân tử A D N m ẹ . D ư ớ i tác động của các enzym, cụ t hể là

enzym helicase làm hai sợi A D N m ở xoắn k é p và tách đô i tạo ra hai sợi k h u ô n . D ư ớ i tác

động của các enzym A D N - polymerase, các nucleotid tự do trong t ế bào sẽ bắt cặp v ớ i

các bazơ tương đồng trên 2 sợi k h u ô n tạo ra sợi A D N k é p m ớ i tương đồng v ớ i sợi k h u ô n

ban đầu . K ế t quả là từ mộ t phân tử A D N xoắn kép tạo hai phân tử A D N giống hệt nhau.

70

Sợi A sợi B

Sơ đồ 3.1. Nguyên lý cấu trúc hai sợi của phân tử của ADN

Sơ đồ 3.2. Liên kết hydro giữa 2 nucleotid tương đồng trong phân tửADN: mỗi nucleotid nằm trên Ì sợi của ADN liên kết với Ì Nucleotid tương đồng trên sợi kia của

phân tửADN. Ký hiệu: T: Thymin, A: Adenin, C: Cỵtosin, G: Guanin.

- Khả năng phân bào: Khả năng nhân đôi của ADN dẫn đến khả năng phân chia của t ế bào . T ừ mộ t t ế bào m ẹ tạo ra hai t ế bào con mang vật l i ệ u d i t ruyền g iống nhau.

M ỗ i p h â n t ử nucleot id g ồ m 3 t i ể u p h ầ n : phân tử bazơ (bazơ) , phân tử đường (deoxyribose) và m ộ t phân tử phosphate. Hai nucleotid t rên c ù n g mộ t sợi A D N liên kế t

vớ i nhau qua cầu phosphate (sơ đ ồ 3.3).

71

H

P h o s p h a t e

c

H

H

/

/ /

H

5*

l i

H

c 4 . H

\ l c 3 .

Liên kết vói phosphat của Ó nucleotid tiếp theo ^

o

[ ỉ c

N

H c r

1 /

I H

N H Bazơ (base)

Đường (deoxyribose)

S ơ í t ô 3.3. Cấu trúc hoa học của phân tửnucleotid

3.2. DÒNG CHẢY CỦA THÔNG TIN DI TRUYỀN

Q u á tr ình chuyển hoa thông t in d i t ruyền g ồ m hai d ò n g chảy d ư ớ i đ â y :

ADN -> ADN

Thông t in d i t ruyền ở p h â n tử A D N m ẹ được sao c h é p l ạ i theo luậ t đ ố i xứng tạo ra hai phân tử A D N m ớ i có cấu t rúc tương tự nhau và g iống hệ t v ớ i p h â n tử A D N m ẹ (nếu

k h ô n g xảy ra độ t b iến) . Đ â y là d ò n g chảy t h ô n g t i n d i t r uyền t ừ t ế b à o m ẹ sang t ế bào

con trong quá tr ình phân b à o và từ t h ế h ệ này sang t h ế h ệ k h á c qua q u á t r ình sinh sản.

ADN -> ARN -> Protein

A x i t deoxyribonucleotid ( A D N ) và axit ribonucleic ( A R N ) là hai l o ạ i po lymer quan trọng của cơ t hể sống. Trong k h i A D N được tạo b ở i b ố n deoxyribonucleotid k h á c nhau: Guanin, Adenin, Cytosin và T h y m i n th ì A R N t h ô n g thường ch ỉ g ồ m m ộ t sợi và được cấu tạo bở i bốn ribonucleotid k h á c nhau v ớ i các bazơ: Adenin , Guanin, Cytosin và Uracin . T h ô n g t in d i t ruyền của tấ t cả các cơ t hể sống t rên t rái đ ấ t đ ề u lưu g i ữ t h ô n g t i n trong phân tử A D N g ồ m hai sợi (trừ mộ t vài loài virus) và q u á t r ình sinh tổng hợp A R N và protein g ọ i là quá t r ình biểu hiện của gen.

ARN -> ADN

Phân tử A D N được h ình t hành từ sợi A R N v ớ i sự x ú c tác của enzym sao c h é p ngược (reverse transcriptase). H i ệ n tượng sao chép ngược x ả y ra trong q u á t r ình sinh sản của một số virus có genom là A R N trong t ế b à o sinh vật chủ.

72

3.3. B I Ể U H I Ệ N C Ủ A G E N

3.3.1. Q u á t r ì n h p h i ê n m ã ( t ranscr ip t ion)

Q u á tr ình sinh tổng hợp A R N trên k h u ô n A D N g ọ i là q u á t r ình phiên m ã (transcription). Trong hai sợi xoắn k é p của A D N ch ỉ có mộ t sợi đ ó n g vai t rò sợi k h u ô n quy đ ịnh tr ình tự cấu trúc của A R N theo n g u y ê n tắc tương đồng bổ trợ. Q u á tr ình phiên m ã d i t ruyền của gen được bắt đ ầ u từ đ ầ u 5' của gen trong vùng promoter cho đ ế n k h i

gặp đ i ể m kế t thúc phiên m ã (termination) ở đ ầ u 3 ' . Q u á t r ình sao m ã được thực h i ện v ớ i sự tham gia của các ARN-polymerase.

Đ ố i vớ i các cơ thể sống n h â n thực, sau k h i kế t thúc phiên m ã , sợi A R N được tổng hợp trong nhân của t ế bào c ò n phải t r ả i qua mộ t q u á t r ình chỉnh sửa:

Phân tử A R N đầu tiên được tổng hợp từ A D N có thể được gọ i là h n A R N (tiếng A n h

heterogeneous nuclear A R N - A R N nhân d ị hình như sơ đ ồ 3.4) hay còn g ọ i là A R N sơ cấp (primary R N A ) hoặc là t iền m A R N . Cấu trúc của t iền A R N gồm các đoạn trình tự được gọ i là exon và intron (các đoạn exon biểu thị bằng ô có dấu chấm đậm) như sơ đ ồ 3.4.

Sau quá t r ình ph iên m ã là quá t r ình ch ỉnh sửa h n A R N :

Q u á trình này xảy ra nhờ A R N splicing (cắt và g h é p nố i ) . Các đoạn A R N được phiên m ã từ introns sẽ b ị cắt đ i , các đoạn được ph iên m ã từ c ác exons được g h é p n ố i l ạ i vớ i nhau và bổ sung t h ê m m ộ t đoạn là m ộ t đoạn đuô i g ồ m 4 phân tử adenin ( A A A A ) . K ế t quả tạo ra phân tử m A R N ( A R N thông t in) . Trong t ế bào n h â n thực, h n A R N được tạo ra trong nhân , sau k h i ch ỉnh sửa tạo thành m A R N và d i chuyển ra ngoà i t ế bào chấ t . Q u á tr ình phiên m ã và dịch m ã được m ô tả ở c ác h ình n h ư d ư ớ i đây (Sơ đ ồ 3.4).

Gen

Genom

ADN L Prnmnter )

Phiên mã

hp. ARN v / \ / l Y \ / \ A Y \ / \ Ằ I A / N

Chỉnh sủa

mARN x A A / 1 AAAA-3'

Protein

Dịch mã

Sơ đồ 3.4. Sơ đồ biểu hiện gen theo Miesỷeld R.L, 1999.

73

Các bước trong quá tr ình dịch m ã và ph iên m ã ở t ế bào t i ề n n h â n ch ỉ g ồ m 2 bước:

- Bước Ì : m A R N được trực t iếp tạo ra từ A D N k h ô n g qua ch ỉnh sửa

- Bước 2: Protein được tổng hợp trên sợi m A R N

C ó 5 đ i ể m khác biệ t cơ bản giữa sinh tổng hợp A D N và A R N n h ư sau:

- Trong phân tử A R N không có T h y m i n thay vào đ ó là Uracin ( U ) , n ê n trong k h i hình thành sợi A R N , đ ố i xứng v ớ i Adenin trên sợi A D N sẽ là Uracin t rên sợi A R N .

- ARN-polymerase hoạt động k h ô n g cần đ i ể m m ồ i primer t rên sợi A D N .

- Tổng hợp A D N liên quan trực t i ếp v ớ i quá tr ình p h â n chia và sinh sản của t ế bào .

K h i lượng A D N trong t ế bào được nhân đô i h iện tượng p h â n chia t ế b à o m ớ i xảy ra. Trong kh i sinh tổng hợp A R N có liên quan trực t iếp đ ế n các quá t r ình trao đ ổ i chấ t cùa t ế bào: tạo ra các protein và enzym k h ở i động các quá t r ình sinh hoa học của t ế b à o .

- Đ i ể m khở i đầu sinh tổng hợp A D N (gọ i là or igin o f replication) k h á c v ớ i đ i ể m khở i đầu sinh tổng hợp A R N .

- Trong khi sinh tổng hợp hai sợi A D N con xảy ra đồng thờ i t rên cả hai sợi của A D N m ẹ . Sinh tổng họp m A R N chỉ được thực h iện trên một sợi A D N của gen, g ọ i là sợi khuôn (template) hay là sợi có nghĩa (sense), sợi còn l ạ i không được m ã hoa (non-sense).

N ế u A R N sẽ được tổng hợp trên một sợi A D N tương đồng v ớ i sợi k h u ô n , n g ư ờ i ta sẽ

nhận được một sợi A R N tương đồng bổ trợ, nhưng nghịch nghĩa (antisense ARN) v ớ i sợi m A R N được tổng hợp từ sợi khuôn . K h i hai sợi A R N nghịch nghĩa gặp nhau, c h ú n g sẽ tạo nên một sợi A R N xoắn kép l àm cho m A R N m ấ t k h ả n ăng sinh tổng hợp protein. N g ư ờ i ta đã ứng dụng đặc t ính này của sinh tổng hợp A R N đ ể tạo ra các gen nghịch nghĩa (antisense gene) nhằm khống c h ế sinh tổng hợp m ộ t enzym hoặc m ộ t hoạt chấ t nào đ ó , ví dụ , các nhà khoa học M ỹ đã ứng dụng n g u y ê n lý gen đ ố i nghĩa đ ể tạo ra giống cà chua chuyển gen có khả năng khống c h ế sinh tổng hợp ethylen đ ể k ì m h ã m quá trình chú i tự nh iên của quả.

N h i ề u copy khác nhau của phân tử A R N được tổng hợp t ừ ch ỉ m ộ t sợi trong p h â n tử A D N . Số lượng copy của A R N được quy đ ịnh bở i tần suất của enzym A R N - polymerase khở i động quá tr ình dịch mã , thể h iện mức đ ộ hoạt hoa của gen.

Ở v i khuẩn, một n h ó m (một dãy) các gen có thể được dịch m ã c ù n g lúc và tạo ra một sợi m A R N dài . Dãy gen này được g ọ i là một operon. Hoạt động của operon cho phép k i ể m soát được một n h ó m gen có cùng chức năng .

3.3.2. Quá trình dịch mã (translation)

Q u á trình tổng hợp protein trên sợi m A R N ở các t ế bào n h â n thực (eukaryote) xảy ra ở t ế bào chất .

Sinh tổng hợp của protein được xảy ra trong t ế bào chấ t của t ế b à o v ớ i sự tham gia của m A R N , ribosome, các t A R N ( A R N vận chuyển), các axit amin tự do, ATP, . . .

Sinh tổng hợp protein là quá trình chuyển hoa thông t in ( m ã d i t ruyền) từ gen thành cấu trúc và chức năng đặc thù của protein. Tr ình tự axit amin của protein là do t r ình tự

74

các nucleotid trong gen quy đ ịnh. A R N thông t in ( m A R N ) c ó chứa các codon, m ỗ i codon g ồ m ba nucleotid g ọ i là triplet (cặp ba). Phân tử A R N vận chuyển ( t A R N ) có cấu t rúc 2 cực: M ộ t đ ầ u của t A R N có đ ính Ì phân tử axit amin, m ộ t đ ầ u kia là Ì bộ ba (triplet) g ọ i là anticodon. M ỗ i mộ t t A R N có mang mộ t axit amin và m ộ t anticodon đặc thù cho n ó . Trong q u á t r ình tổng hợp protein, các anticodon của t A R N sẽ nhận b iế t các

codon tương ứng trên sợi m A R N và t ìm ra vị t r í k h ô n g gian th ích hợp cho n ó t rên m A R N và đồng thờ i cũng là vị trí k h ô n g gian thích hợp hay là t r ình tự th ích hợp của axit amin m à n ó mang theo ở đầu kia của t A R N . Tổng số c ó 64 codon k h á c nhau, trong đ ó c ó 61 codon quy đ ịnh tr ình tự của 20 axit amin, ba codon còn l ạ i được g ọ i là các codon kế t thúc hay là các codon vô nghĩa (không ứng v ớ i mộ t acid amin n à o trong phân tử protein). T ạ i đ i ể m codon vô nghĩa t rên m A R N quá t r ình tổng hợp protein sẽ dừng l ạ i .

3.4. CÁC ENZYM THAM GIA VÀO QUÁ TRÌNH SINH HOA CỦA ADN

Các enzym tham gia vào các q u á tr ình trao đ ổ i chấ t của A D N có ý nghĩa rấ t quan trọng đ ố i v ớ i k ỹ thuật d i t ruyền. Các enzym này được thương m ạ i hoa và được g ọ i là bộ kít các enzym của sinh học p h â n tử (xem chi t i ế t ở chương 4) .

3.5. ĐIỂU KHIỂN BIỂU HIỆN CỦA GEN

Đ i ề u k h i ể n hoạt động của h ệ thống gen là m ộ t trong các b í ẩn l ớ n nhấ t trong tự nh iên và việc k h á m phá ra n ó c ó thể là chìa khoa để m ở ra các b í ẩn khác trong hệ đ iều

kh iển các quá t r ình sinh học.

Cho đ ế n nay n h â n l o ạ i v ẫ n chưa h ề b iế t đ ế n m ộ t hệ thống đ iều k h i ể n n à o l ạ i t inh tế ,

ch ính xác , nhạy bén n h ư các h ệ thống đ iều kh iển trong t ế b à o và cơ thể sống, nhấ t là trong hệ thần k inh trung ương của con n g ư ờ i . Đ ó là những b í mật của tạo hoa tồn t ạ i ngay trong m ỗ i c h ú n g ta m à tr í tuệ n h â n l o ạ i h i ện v ẫ n còn đ ang từng bước ngh iên cứu.

Ngh iên cứu b iểu h i ệ n của gen là n ộ i dung hoạt động cơ bản của chương t r ình chức năng genom. M u ố n t ìm h iểu chức n ăng của mộ t gen cần xác đ ịnh rõ các n ộ i dung sau:

- Các A R N do gen này m ã hoa trong quá t r ình ph iên m ã gen (transcription).

- Protein cấu t rúc , hoặc enzym sản phẩm của gen này tạo ra trong quá t r ình dịch m ã gen (translation).

- Các q u á t r ình đ iều k h i ể n b iểu h iện của gen như t h ế nào : gen n à y được phiên m ã ở l oạ i t ế bào , m ô n à o trong cơ thể và ở vào giai đoạn n à o trong q u á t r ình phát t r iển của cơ thể đ ó , các đ iều k i ệ n m ô i t rường tác động lên b iểu h iện của gen...

- V a i t rò của các promoter hoặc các gen đ iều k h i ể n l iên quan đ ế n b iểu h i ệ n của gen này .

- Các promoters đ ó n g vai trò quyết đ ịnh đ ố i v ớ i b iểu h i ện của gen. H i ệ n nay, hàng loạt các promoter đặc thù đã được phát h iện , ví dụ , promoter đặc thù m ô (tissue specific promoter) quy đ ịnh một gen gắn vớ i promoter đặc thù m ô sẽ ch ỉ b i ể u h i ện k h i n ó nằm ở m ô tương ứng. V í dụ , gen được gắn v ớ i promoter đặc thù hạt sẽ ch ỉ b iểu h i ện trong hạt (seed specific promoter).

75

3.5.1. P h é p b i ệ n chứng t r o n g n g h i ê n cứu h ệ t h ố n g sống v à v ấ n đ ề đ i ề u k h i ể n h o ạ t

hoa của gen

Cái hay nhấ t của t r iế t học duy vật là phép b iện chứng. Quan trọng nhấ t của p h é p

b iện chứng là phân t ích cấu trúc h ệ thống, t ìm ra "gốc" của h ệ thống đ ó và quy luậ t v ậ n

hành của n ó trong các m ố i quan hệ nh iều chiều trong k h ô n g gian, thờ i gian và những

đ iều k i ệ n cụ thể .

Sống có nghĩa là vận động, hệ đ iều hành phải chi phố i sự v ậ n động k h ô n g ngừng đ ó ,

một sự cố xảy ra là tín h iệu để các sự c ố khác bắt đầu hoặc dừng l ạ i . Các tổ chức sống và

các quá trình sinh học luôn luôn tồn t ạ i trong quá t r ình phát t r i ể n l ịch sử của n ó : h ì n h

thành, phát sinh, phá t t r iển và d iệ t vong, trong d ò n g chảy của thờ i gian và k h ô n g gian,

trong sự luân h ổ i giữa phân g i ả i và tổng hợp, giữa b i ến d ị và d i t ruyền , giữa trẻ hoa và

lão hoa, giữa vật chấ t và năng lượng, giữa nhớ và quên , giữa sống và chết. M ỗ i m ộ t n g à y

có hàng vạn t ế bào m ớ i sinh ra và hàng vạn t ế bào chết đ i trong cơ t hể sống. M ỗ i n g à y

có hàng t r iệu sinh l inh m ớ i sinh ra trong kh i hàng t r i ệu các sinh l i nh k h á c bị d i ệ t vong.

Sự chết chưa phải là n g õ cụt. Sự chết ở chỗ này có thể là bắt đ ầ u của sự sinh ở nơ i k h á c .

Sự tăng lên trở thành tín h iệu báo trước sự g i ảm xuống, sự cạn k i ệ t b á o trước bắ t đ ầ u của

sự tạo ra. Đ ó là những xu hướng m à ta c ó thể t ìm thấy trong h ệ đ i ề u h à n h của gen và các

chu tr ình vận động sống. T ính cân bằng, ổn đ ịnh trong các h ệ thống sống v ố n là th iế t

yếu đ ố i v ớ i sự sinh tồn , nhưng sự cân bằng ch ỉ là tương đ ố i và luôn ở t rạng thái c ân bằng

động. V ậ n động sống thật phức tạp b iế t bao. N ó xảy ra trong m ộ t k h ô n g gian và thờ i

.gian rộng lớn , l ạ i rấ t cụ thể trong các đ iều k i ệ n và b ố i cảnh cụ t hể của m ỗ i m ộ t phản ứng

sinh hoa.

Phép b iện chứng trong k h i phân t ích hệ thống phức tạp và ly k ỳ n h ư vậy phả i m ổ x ẻ

nó , t ìm ra các mắ t x ích và các khâu chìa khoa của sự vật , k h ô n g bỏ qua cá i tổng thể và

k h ô n g rơi vào sự vụn vặ t và phiến d i ện . Khoa học h i ệ n nay đ ã t ìm thấy "đầu m ố i " của

vận động sống - một cuộn ch ỉ r ố i nhấ t trong tự nh iên . Đầu mối của vận động sinh học

chính là phân tửADN, đầu nguồn của dòng chảy sự sống.

3.5.2. Tính phức tạp của hệ thống sống

Cấu trúc của hệ thống sống rấ t đ a dạng v ớ i vô vàn các " l inh k i ệ n " l i t i . Các " l inh

k i ệ n " đó l ạ i được cấu trúc từ các phân tử. V í dụ , ở n g ư ờ i có khoảng 30.000 gen, v ớ i số

lượng ngần ấy các phân tử m A R N và khoảng 30.000 các protein đặc thù, b iế t bao nh iêu

t r iệu siêu cấu t rúc, hay các " l inh k i ệ n " khác nhau sẽ được tạo ra từ tổ hợp của các p h â n

tử đó? Do vậy, chúng ta đã thấy những cấu trúc đa dạng v ớ i những thuộc t ính đặc biệ t ,v í

dụ như các giác quan k ỳ d i ệu ở n g ư ờ i . K ỳ d i ệu nhấ t có l ẽ là đô i mắ t . Ch ỉ v ớ i m ộ t lượng

tử của ánh sáng rơi trên mắ t n g ư ờ i đã có thể gây ra xung thần k inh và phản ứng trong

não bộ. Trong k h i các thiết bị t inh v i nhấ t của ngành vật lý h i ện đ ạ i cũng chưa c ó k h ả

76

n ă n g ghi nhận mộ t n ăng lượng nhỏ như vậy . C ó những n g ư ờ i c ó thể đọc được suy nghĩ

của n g ư ờ i khác k h i h ọ ở gần nhau. C ó những n g ư ờ i t hông thạo gần 100 ngoại ngữ .

Những " thiết b ị" hay hệ thống cấu trúc phân tử nào đã tạo ra những thuộc t ính đặc b iệ t

như vậy của vật chấ t sống?

Hệ thống sống có các mức tổ chức và điều khiển khác nhau. T ư ơ n g ứng v ớ i các

mức tổ chức khác nhau của hệ thống sống sẽ là các h ệ tự đ iều ch ỉnh và đ iều k h i ể n th ích

hợp (sơ đ ồ 3.5).

Mức phân tử: Bắ t đầu là cấu trúc phân tử v ớ i hàng vạn các hợp chấ t vô cơ và hữu

cơ, t rong đ ó có :

- Các monomer như các đường đơn , các axit amin, các nucleotid... Sự có mặ t của

m ỗ i monomer trong t ế b à o v ớ i h à m lượng là bao nhiêu, được tổng hợp k h i nào và ở đâu

đ ề u được đ iều ch ỉnh hợp lý.

- Các polymer của sự sống như polysaccharid, các proteins, các l ipids, các phân tử

A R N và A D N . . . Trong đ ó quan trọng nhấ t là gen và đ iều kh iển hoạt hoa của gen.

Mức trên phân tử: T i ế p đ ế n là các tổ chức trên phân tử do tổ hợp của vô số các phân

tử tạo ra như Operon, n h i ễ m sắc thể , hệ thống Cytochrom trong lục lạp (cytochrom là

th iế t bị d ẫ n t ruyền của hàng t r iệu các dòng đ iện tử l i t i trong bộ m á y quang hợp ở thực

vật) hệ thống m à n g của t ế bào. . . Đặc đ i ể m cấu trúc ở mức trên phân tử được quy đ ịnh

bở i cấu t rúc đặc thù của các phân tử do gen xác đ ịnh.

Mức tế bào quan (organell): Trên nữa là các tổ chức n ộ i bào bên trong m ỗ i t ế bào :

nhân t ế bào , ty t hể , lục lạp. . . trong t ế bào chấ t được g ọ i là tế bào quan.

Tế bào sống: Các tổ chức trên đây chưa có thể g ọ i là sống k h i n ó chưa tạo ra t ế bào

vớ i những đặc t rưng độc lập như: khả năng sinh sản bằng nhân đô i , k h ả năng trao đ ổ i

chấ t vớ i m ô i t rường ngoà i . Virus có thể coi là cơ thể sống (có k h ả n ăng sinh sản) ch ỉ k h i

nó được k ý sinh trong t ế b à o chủ.

Trên mức tổ chức tế bào là mô, cơ quan, cơ thể sống, t rên nữa là quần thể , quần xã,

hệ sinh thái , xã h ộ i loài n g ư ờ i trong m ố i tương tác thường x u y ê n về n ăng lượng và vật

l i ệ u v ớ i t h ế g iớ i k h ô n g sống và toàn vũ trụ .

ứ n g v ớ i m ỗ i mức tổ chức chắc chắn phải có các mức đ iều kh iển và tự đ iều kh iển

thích hợp. Các nhà khoa học đã xác đ ịnh được rằng tổ chức sống luôn là tổ chức "tự nó" .

Các phân tử "tự n ó " tái tổ hợp vớ i nhau để tạo ra các tổ chức trên phân tử. "Tự tổ chức"

và "tự đ iều ch ỉnh" đ ó là phương thức vận động tốn ít năng lượng nhấ t trong mộ t hệ

thống phức tạp như vậy .

Đ i ề u đ áng nói ở đây là h ệ đ iều kh iển trong cơ thể sống luôn là hệ tự đ iều chỉnh và

thích ứng một cách tuyệt v ờ i vớ i m ô i trường n ộ i t ạ i và bên ngoà i .

77

Sơ đồ 3.5. Các mức khác nhau trong tổ chức sống từ phân tử đến tế bào

(Theo Nelson. D.L and CoxMM, 2000)

Phân bào và phân hoa tế bào và cơ quan là các thang bậc trong hệ điều hành gen:

N ế u t ế bào l uôn sinh sản bằng n h â n đô i m ộ t c á c h c h í n h x á c , nếu t h ô n g t in d i t ruyền

ở m ọ i t ế bào sống trong cơ thể của c h ú n g ta đ ề u được copy g iống hệt nhau, th ì t ạ i sao từ

một t ế b à o phô i ban đ ầ u , c h ú n g ta l ạ i c ó m ộ t c ơ t h ể sống h o à n ch ỉnh v ớ i những c ơ quan

chức n ă n g k h á c b iệ t và b ổ sung l ẫ n nhau m ộ t c á c h hà i hoa và nh ịp n h à n g n h ư vậy . H ệ

t iêu hoa tạo ra vật l i ệ u và n ă n g lượng cho cơ t hể hoạt động g ồ m miệng , h à m r ă n g , thực

quản, tuyến nước bọt , d ạ dày , gan, mật. . . c ả m giác n g á n ăn k h i no và t h è m ăn k h i t h iếu

chấ t . H ệ h ô hấp v ớ i n h í p t hờ cung cấp oxy t ớ i các mao mạch của hai lá p h ổ i và t ả i t hán

k h í từ cơ t hể ra ngoà i , r ồ i cảm g iác t h iếu hơi l à m ta phả i t h ở sâu và nh ịp t h ở được t ă n g

cường k h i cơ thể vận động mạnh. H ệ tuần h o à n vận t ả i vật l i ệ u , dưỡng k h í đ ế n m ỗ i t ế

b à o sống và vận chuyển chấ t thả i , thán kh í ra ngoà i . H ệ thần k i n h của c h ú n g ta đ i ề u p h ố i

hoạt động sống, những xúc cảm nghệ thuật và t h ẩ m m ỹ , tr í nhớ và k h ả n ă n g s á n g tạo,

t ình yêu . Phân hoa cơ quan tạo ra sự k h á c biệ t và sự thống nhấ t trong toàn c ơ t hể . Đ i ề u

k h i ể n q u á t r ình p h â n hoa của t ế bào là cả mộ t khoa học v ề phá t t r iển cá thể . T í n h thống

nhấ t và t ính " hà i hoa" tuyệt m ỹ trong sự "phân hoa" và p h â n c ô n g chức n â n g b ê n trong

cơ thể sống còn đ a n g n ằ m trong b í mật của hệ đ iều k h i ể n của t ế b à o và cơ thể . Đ i ề u

78

k h i ể n hoạt hoa của gen là một trong các hệ đ iều k h i ể n sinh học lý thú nhấ t đ ang được

n g h i ê n cứu k h á m phá .

Đ ế n nay, các nhà khoa học đã t ìm thấy rấ t nh iều các y ế u t ố đ iều ch ỉnh hoạt hoa của gen, trong đ ó quan t rọng nhấ t là các promoter đặc dụng g ọ i là tissue specific promoter (promoter c h u y ê n hoa m ô ) . Các promoter này ch ỉ cho p h é p mộ t gen b iểu h iện ở mộ t m ô hoặc t ế bào nào đ ó m à k h ô n g b iểu h iện ở các m ô hoặc t ế b à o k h á c . Đ ó là n g u y ê n nhân

cơ bản tạo ra sự phân hoa m ô và cơ quan.

3.5.3. H ệ đ i ề u h à n h gen

H ệ thống gen, hoặc n h ó m gen tham gia vào cùng mộ t chức n ăng nào đ ó của cơ thể

sống, ví dụ các gen tham gia phân g i ả i đường trong t ế bào v i khuẩn E. coli chẳng hạn,

thường được chia l àm hai l o ạ i ch ính:

- Các gen đ iều h à n h hoặc gen đ iều chỉnh

- Các gen cấu trúc là các gen tham gia trực t i ếp vào v iệc m ã hoa các protein đặc thù

Protein cũng được phân loạ i thành:

- Các enzym: chấ t xúc tác của m ọ i phản ứng sinh hoa trong t ế bào

- Các protein là các chấ t k ì m h ã m hoặc ức c h ế b iểu h i ện của gen

- Các protein cấu t rúc: protein cấu trúc tự n ó hoặc kế t hợp v ớ i các polymer sinh học khác là các viên gạch hay là các l inh k i ệ n có cấu trúc đặc thù xây dựng nên các tổ chức trên phân tử và tạo ra các t ế bào quan như lục lạp, ty thể , m à n g t ế bào , v.v...

- Các protein là k h á n g thể tạo ra khả năng m i ễ n dịch đặc thù v ớ i các tác nhân gây bệnh. Các protein tạo ra sức đề k h á n g của cơ thể sống đ ố i v ớ i các đ iều k i ệ n bấ t l ợ i của mô i t rường.

- Các protein là các hormon đ iều t iế t các quá tr ình sinh lý, sinh hoa, lý sinh, thậm chí cảm xúc của cơ thể .

V à có thể có các protein là các chấ t hoạt t ính trí tuệ và trí nhớ . . .

V ớ i các l o ạ i protein như trên, chúng ta có thể d ễ d àng nh ìn thấy vai trò của protein trong đ iều k h i ể n các quá t r ình sinh học (xem chi t i ế t ở chương 6).

Hệ thống điều khiển biểu hiện của gen ở mức độ phiên mã:

- K i ể m soát bắt đ ầ u và kế t thúc sinh tổng hợp A R N .

- K i ể m soát số lượng và chủng loạ i m A R N được tổng hợp trong t ế bào .

Chủng loạ i hay phổ đa dạng của m A R N phụ thuộc vào các yếu t ố ch ính sau:

- T ế bào và m ô cụ thể : M ộ t số m A R N được tổng hợp ra ở m ọ i t ế bào sống, chúng cần cho các q u á t r ình trao đ ổ i chấ t thiết yếu của m ọ i t ế bào .

M ộ t số m A R N c ó t ính đặc thù: chỉ tổng hợp ở m ô hoặc t ế bào nào đ ó , trong giai đoạn phát t r iển ẹụ thể hoặc xuấ t h iện dướ i tác động của các y ế u t ố m ô i t rường xác đ ịnh.

79

Cải biến ARN

Đ â y là q u á t r ình ch ỉ xảy ra ở t ế bào nhân thực. Sau k h i sợi A R N n g u y ê n t h ú y được tổng hợp ra từ A D N , nó sẽ t r ả i qua quá tr ình cả i b iến (cắt bỏ bớ t hoặc b ổ sung t h ê m m ộ t số trình tự nucleotid nhấ t đ ịnh) r ồ i m ớ i tạo ra sợi A R N thuần thục g ọ i là m A R N ( A R N thông t in) .

Điếu khiển sau phiên mã:

- Là quá tr ình đ iều kh iển sinh tổng hợp protein trên sợi m A R N v ớ i sự tham gia của ribosome và nhiều yếu t ố hoa học và sinh học khác . Q u á t r ình n à y quy đ ịnh số lượng protein sẽ được tổng hợp trên A R N thông t in .

- Gần đây , các nhà khoa học đã phát minh mộ t cơ c h ế đ iều k h i ể n m ớ i đ ố i v ớ i hoạt hoa của gen ở t ế bào nhân thực g ọ i là A R N i (Tiếng A n h : R N A in te r í e rence = R N A i ) .

Đ â y là cơ c h ế gây bấ t hoạt gen bở i các sợi A R N ngắn ( s i R N A ) c ó ch iều dà i từ khoảng 21-25 nucleotid. Các sợi A R N ngắn có khả năng bắt cặp v ớ i các A R N c ó c á c đ o ạ n t r ình tự tương đồng vớ i chúng và l àm cho m A R N bị phân huy.

Điêu khiển sau dịch mã:

- Sau kh i protein được tạo ra, chúng có thể còn được t i ếp tục c ả i b i ến . V í d ụ , trong trường hợp protein là các enzym, protein phải được kế t hợp v ớ i các y ế u t ố k h á c n h ư các yếu tố đồng thời (cofactor) hay coeniym để có được chức năng xúc tác hoa học (xem chi t iế t ở chương về enzym).

- Các gen đ iều k h i ể n g i ữ vai t rò đ ó n g hoặc m ở c ác gen c ấ u t rúc : k h i n à o , ở đ âu , trong h o à n cảnh n à o mộ t n h ó m gen sẽ hoạt hoa (sinh tổng hợp A R N ) hay sẽ ngừng hoạt động.

3.5.3.1. Câu trúc hệ điều hành của gen

Operator: là một đoạn của phân tử A D N có k h ả n ăng tương tác v ớ i protein k i ề m c h ế

(repressor), do vậy k i ể m soát sinh tổng hợp A R N thông t in .

Leader ARN: sợi A R N nguyên thúy được tổng hợp ra từ A D N g ồ m hai phần: Phần leader A R N và phần A R N m ã hoa protein. Leader A R N là đ o ạ n A R N được bắ t đ ầ u từ nucleotid đầu tiên và kế t thúc ở đ i ể m bắt đầu xảy ra m ã hoa sinh tổng hợp protein.

Đoạn mã hoa ịgen cấu trúc) của ADN: đoạn gen quy đ ịnh cấu t rúc của protein, có chứa m ã đi t ruyền cho axit amin đầu t iên k é o dài cho đ ế n axit amin cuố i c ù n g của sợi polypeptid.

Promoter: là một đoạn ngắn trên phân tử A D N có k h ả n ăng tương tác v ớ i A R N -polymerase. K h i A R N - polymerase b á m vào promoter, sinh tổng hợp A R N bắ t đ ầ u .

Operon: ở v i khuẩn, có thể có vài gen cùng nằm trên mộ t phân tử A D N và được dịch m ã cùng một lúc, tạo ra một sợi A R N dài . N h ó m các gen đ ó g ọ i là mộ t operon - các gen trong cùng một operon bị k i ể m soát bở i cùng một repressor. Operon được ngh iên cứu đầu tiên là Lac-operon, gen của operon này tham gia vận chuyển và p h â n g i ả i đường lactose (xem sơ đ ồ 3.6).

80

Hướng của quá trình dịch mã 3"" I

lách loài IcừL 0 p

Sơ đồ 3.6. Tổ chức của Lac-Operon ỏ vi khuẩn E.coli

Trong sơ đồ 3.6, Ba gen LacZ, LacY và LacA cùng tham gia phân huy đường lactose, ba gen này xếp theo tr ình tự n ố i t iếp trên sợi A D N và tạo ra L á c - Operon. Lac-Operon tạo ra m ộ t sợi A R N thông t in duy nhấ t . p (Promoter) là đ o ạ n A D N nơi A R N -polymerase b á m vào đ ể bắt đầu dịch mã . Operator (O) là đoạn A D N nơi m à protein k ì m h ã m (repressor) b á m vào đ ể ức chế b iểu h i ện của gen.

Q u á tr ình b iểu h i ện của Lac-Operon bắt đầu như sau:

- Phân tử đường Lactose bán vào chấ t k ì m h ã m (Repressor) và tạo ra tổ hợp phân tử Repressor + Lactose, repressor mấ t khả năng b á m vào operator và L á c - operon được g iả i p h ó n g k h ỏ i chấ t k ì m h ã m .

81

- Enzym A R N - polymerase b á m vào promoter - đ o ạ n k h ở i động của gen và bắt đ ầ u quá t r ình tổng hợp A R N thông t in .

- Sợi A R N thông t in được tổng hợp bắt đầu từ gen z đ ế n gen Y và k ế t t húc ở gen A .

3.5.3.2. Một số phương thức điều khiển hoạt hoa gen

Đ i ề u k h i ể n b i ể u h i ệ n của gen b ằ n g c h ấ t k ì m h ã m (repressor) :

Tổng hợp A R N bị k ìm h ã m bở i một protein g ọ i là repressor. Protein n à y b á m vào operator, một vị trí đặc thù trong phân tư A D N ở đ i ể m bắt đầu của gen do n ó k i ể m soát (xem sơ đ ồ 3.7). K h i các repressor còn bám trên sợi A D N , thì ARN-polymerase chưa thể bắt đầu quá trình sao m ã (sinh tổng hợp A R N thông t in trên k h u ô n A D N ) . Hoạ t hoa của gen do repressor k i ể m soát đã được nghiên cứu rấ t kỹ ở v i khuẩn. V í dụ , q u á t r ình đ iều

khiển hoạt hoa của các gen tham gia vào sinh tổng hợp các enzym phân g i ả i c á c p h â n tử đường: kh i trong môi trường sống của v i khuẩn xuấ t h iện các phân tử đường, đường xâm nhập vào t ế bào, phân tử đường sẽ tương tác vớ i repressor tạo ra m ộ t tổ hợp: repressor + đường. T ổ hợp này làm cho repressor mấ t khả năng b á m vào gen. D o đ ó , các gen tổng hợp các enzym phân g iả i đường được g iả i phóng và bắt đầu hoạt động. Các m A R N sẽ tham gia

vào quá trình tổng hợp ra các enzym phân g iả i đường. K h i các enzym đã p h â n huy hết các

phân tử đường trong môi trường, repressor sẽ k h ô n g còn bị c ác p h â n tử đường b á m dính nữa, repressor sẽ trở l ạ i liên kế t vớ i phân tử A D N ở vùng operator và l à m cho q u á trình tổng hợp m A R N bị dừng l ạ i . N h ư vậy, v i khuẩn sẽ chỉ bắt đ ầ u tổng hợp ra các enzym phân g iả i đường kh i trong môi trường có xuấ t h iện các phân tử đường.

Sơ đồ 3.7. Hệ điều hành gen theo cơ chế kìm hãm

82

Đ i ề u k h i ể n h o ạ t hoa của gen b à n g " t ạ m n g ư n g " s inh t ổ n g h ợ p m A R N :

T ạ m n g ư n g là cơ c h ế k i ể m soát b iểu h iện của gen trong đ ó sinh tổng hợp A R N

thông t in sẽ t ạm ngừng k h i một lượng nhấ t đ ịnh của n ó đ ã được tạo ra. Cơ c h ế t ạm

ngừng hoạt hoa gen đã được ngh iên cứu k ỹ đ ố i v ớ i các gen tham gia vào quá t r ình sinh

tổng hợp axit amin ở v i khuẩn. C h ú n g ta đ ề u biế t các axit amin là thành phần cầu trúc

k h ô n g thể th iếu của protein. Trong t ế bào có đ ế n 20 l o ạ i axit amin khác nhau. H à m

lượng của m ỗ i axit amin trong t ế bào phải g i ữ ở mức cần th iế t cho hoạt động sống của t ế

bào và trong mức cân bằng hợp lý vớ i các amino axit k h á c . Sinh tổng hợp m ỗ i axit amin

đòi h ỏ i t ế bào phải t iêu thụ nguồn nâng lượng và vật l i ệ u k h ô n g nhỏ . Do vậy , việc tổng

hợp từng axit amin trong t ế bào phải được đ iều ch ỉnh hợp lý thông qua đ iều chỉnh hoạt

hoa của gen.

V í dụ , q u á t r ình tạo tryptophan ở v i khuẩn được k i ể m soát bở i tryptophan operon,

A R N - Polymerase bắ t đ ầ u sinh tổng hợp leader - A R N . Đ o ạ n leader - A R N có chứa

thông t in cho tổng hợp m ộ t protein ngắn g ọ i là leader-protein, trong thành phần của nó

có tryptophan.

Bên trong phân tử A R N - leader có một đoạn ngắn g ọ i là attenuator có vai t rò t ích

cực cho việc ngưng hoạt động của operon. K h i tryptophan có d ư trong t ế bào , ribosome

bắt đầu tổng hợp leader protein. K h i leader protein xuấ t h i ện , đ o ạ n attenuator t rên leader

A R N gấp l ạ i bở i l iên k ế t tương đồng bổ t rợ l àm ngưng chuyển động của A R N -

polymerase trên operon.

K ế t quả ch ỉ có m ộ t đ o ạ n A R N leader ngắn được tạo ra. K h i lượng tryptophan trong

t ế bào cạn k i ệ t , tổng hợp leader protein (có chứa tryptophan) sẽ ngưng ở codon

tryptophan. Ribosome dừng ở codon tryptophan của leader- A R N làm cho sợi A R N

leader d u ỗ i ra và q u á t r ình dịch m ã operon t i ếp tục x ẩ y ra. Sợi m A R N thông t in bắt đầu

tạo ra các enzym tham gia vào quá t r ình tổng hợp tryptophan. K ế t quả một lượng

tryptophan m ớ i sẽ được tạo ra ngay sau đ ó . N h ư vậy , k h i trong m ô i t rường có dư

tryptophan các gen tham gia sinh tổng họp chấ t này sẽ ngưng hoạt động.

K i ể m s o á t b i ể u h i ệ n của gen b ằ n g " h o ạ t hoa gen" :

Phương thức đ i ề u k h i ể n này phổ b iến ở các cơ thể bậc cao. Số lượng các gen cùng

tham gia vào một q u á tr ình sống nhấ t đ ịnh trong cơ thể g ọ i là các gen cùng n h ó m chức

năng , các gen trong cùng n h ó m có sự đ iều chỉnh phối hợp hoạt động mộ t cách nhịp

nhàng , đ ú n g thờ i đ i ể m và đ ú n g v ị trí k h ô n g gian cần đến chức n ăng cụ thể của m ỗ i gen.

Ở sinh vật bậc cao, các gen cùng trong một n h ó m chức n ă n g có thể nằm ở các vị trí

khác nhau trong n h i ễ m sắc thể và hoạt hoa của c h ú n g được đ iều chỉnh bở i một vài

protein, các protein này thường là các protein hoạt hoa - hay c ò n g ọ i các yếu t ố k i ể m

soát dịch mã , các protein này sẽ b á m vào promoter ở ph ía trước của vùng sao mã . Các

protein này có t ính đặc thù cao và thường gặp ở một số l o ạ i t ế bào đặc thù, ví dụ : ở t ế

83

bào gan, hoặc thận. Các gen đ iều chỉnh c ó thể nằm rấ t xa các gen c ấ u t rúc . Đ o ạ n gen

tăng cường (enhancers) có thể đ iều ch ỉnh hoạt động của c á c gen n ằ m c á c h n ó h à n g

nghìn nucleotid. Gen t ăng cường là đoạn để một protein đặc thù b á m vào , sau đ ó l ạ i là

chỗ cho các protein khác b á m theo. Trong các t rường hợp n h ư vậy đ o ạ n A D N phả i cuộn

l ạ i tạo ra chỗ l iên kế t các protein. K ế t quả mộ t tổ hợp protein - A D N xuấ t h i ệ n l à m c h ỗ

b á m cho A R N - polymerase bắt đ ầ u sinh tổng hợp sợi A R N m ớ i . N h ư vậy , sinh tổng hợp

A R N từ mộ t gen cần đ ế n hoạt hoa của mộ t n h ó m protein đặc thù , b á m v à o c á c đ o ạ n

A D N đặc thù trên gen đ iều ch ỉnh (sơ đ ồ 3.8).

V ù n g m ã hoa của gen hay là gen cấu trúc

Các đoạn Enhancer t rên Ạ D N : ( A ) các chỗ

B

và (B) là b á m cho các protein đ i ề u ch ỉnh

Protein bám vào đoạn A và protein bám vào đoạn B

B Vùng mã hóa

Đoạn ADN gập lại tạo một cấu trúc đặc thù ADN - Proteỉn

Vùng mã hoa

]

Cấu trúc đặc thù này tạo chỗ bám cho ARN polymerase hoạt động và bắt đầu sinh tổng hợp mARN

Vùng mã hoa

Ị Ị n B Ị

Sơ đồ 3.8. Điều hành gen theo cơ chế "tăng cường - Enhance"

84

L à m thay đ ổ i h o ạ t hoa của gen b ằ n g c á c p h ư ơ n g p h á p d i t r u y ề n :

• Promoter - chìa khoa của gen và hệ thống gen:

Promoter được đ ịnh nghĩa là mộ t đoạn nucleotid ngắn t rên sợi A D N , là nơi enzym A R N - polymerase b á m vào và bắt đầu khở i động sinh tổng hợp A R N . V a i t rò của promoter rấ t giống vớ i vai t rò của một công tắc đ iện : đ ó n g và m ở hoạt động của gen hoặc n h ó m gen. Các gen cấu trúc giống như các b ó n g đèn . C h ú n g ch ỉ phá t sáng k h i đ ó n g mạch đ iện . Promoter quy đ ịnh ở đâu và k h i n à o sẽ xảy ra b iểu h iện của gen, tương tự n h ư đ ó n g hoặc m ở mạch đ iện . Tương ứng v ớ i các protein k h á c nhau hoặc các m ô t ế

bào đặc thù khác nhau có thể có các promoter khác nhau và đặc thù. M ộ t số promoter có b iểu h i ện đặc thù ở các m ô nhấ t đ ịnh. V í dụ , promoter đặc thù ở h ệ rễ sẽ ch ỉ cho phép biểu h i ệ n gen ở rễ ; c ó những promoter cho phép b iểu h i ện gen ở m ọ i nơi , trừ rễ ; promoter đặc thù ở thân , ở hoa, ở hạt w . . . Có những promoter k h ô n g đặc thù cho phép biểu h i ện gen ở m ọ i cơ quan. V i ệ c th iế t k ế gen cấu t rúc k è m v ớ i promoter đặc thù có ý nghĩa thực t i ễ n quan trọng.

• Thiết kê mới các gen điêu khiển:

C h ú n g ta b iết gen ức c h ế hoạt động của ribosome (ribosome inhibitor gen - RIG) , k h i gen này hoạt động thì b ộ m á y sinh tổng hợp protein của t ế bào bị tê l i ệ t . N g ư ờ i ta cũng b iết một số các promoter đặc thù ch ỉ k h ở i động hoạt hoa gen ở c ác m ô nhấ t đ inh. V í dụ promoter đặc thù ở bao phấn hoa (anther specific promoter = AS promoter). Promoter này ch ỉ k h ở i động b iểu h i ện của các gen trong bao phấn. Các n h à khoa học đã thành công trong việc th iế t k ế gen k ì m h ã m ribosome (RIG) l iên k ế t v ớ i promoter hoạt hoa đặc thù ở bao phấn và đã chuyển được gen này vào lúa. Cây lúa mang tổ hợp gen k ìm h ã m ribosome ( R I G gen) và AS promoter v ẫ n có khả n ăng sinh t rưởng và phát t r iển bình thường vì gen ức c h ế hoạt động của ribosome ch ỉ tổng hợp protein k ì m h ã m ribosome trong bao phấn hoa. K h i hoa h ình thành, gen k h ở i động (promoter ASP) trong bao phấn m ớ i bắt đ ầ u hoạt động, kế t quả chấ t ức c h ế hoạt hoa của ribosome được sản sinh và làm cho q u á t r ình tạo ra hạt phấn bị phá vỡ . Cây lúa trở nên bấ t dục đực.

• Tạo đột biến hệ điều khiển gen:

Toàn bộ genom của v i khuẩn E. Col i là một sợi A D N vòng lớn . N ế u được k é o thẳng ra, sợi A D N này sẽ có đ ộ dài gấp 1.000 lần đ ộ dài của ch ính t ế bào . Bản đ ồ gen của E. Coli được chia l à m 100 đơn v ị , bằng phương p h á p gây đ ộ t b i ến , n g ư ờ i ta đã tạo ra thể

độ t b iến ở E.Coli m ấ t k h ả năng đ iều chỉnh sinh tổng hợp của Lac-Operon. Ở đ ộ t b iến

này repressor m ấ t k h ả n ăng b á m vào operator d ẫ n đến t ình t rạng operon này hoạt động

liên tục. Ngay cả k h i trong m ô i t rường hoàn toàn k h ô n g c ó đường nhưng enzym (5-galactozidase v ẫ n được tổng hợp v ớ i h à m lượng rấ t l ớ n gần bằng 100% protein tổng số của cả v i khuẩn.

N h ư vậy , bằng th iế t k ế m ớ i các gen đ iều k h i ể n (promoter), hoặc gây đ ộ t b iến các

gen đ iều kh iển hoạt hoa của hệ gen, n g ư ờ i ta có thể tạo ra những cơ thể sống mấ t khả

năng tự đ iều ch ỉnh trao đ ổ i chấ t và m ấ t khả năng thích nghi v ớ i m ô i t rường. M ộ t số hoạt

85

chấ t của cơ thể sống có thể được sản xuấ t ra v ớ i số lượng theo ý muốn . Các p h ư ơ n g p h á p

này rấ t cần cho một hướng ngh iên cứu ứng dụng m ớ i của sinh học, đ ó là canh tác p h â n

tử (Molecular Farming). N g ư ờ i ta trồng các cây chuyển gen có th iế t k ế h ệ đ i ề u k h i ê n

biểu h iện gen theo ý muốn để sản xuấ t ra mộ t số hoạt chấ t sinh học n h ư sản xuâ t c á c

enzym công nghiệp, dược phẩm.. .

• Điêu khiển hoạt hoa gen theo cơ chếARNi (RNAi)

Đ â y là cơ c h ế đ iều kh iển hoạt hoa gen thông qua sự bắt cặp của các A R N ngắn

( s i A R N có đ ộ dài 21-27 nucleotid) v ớ i các m A R N đ ích (có đoạn t r ình tự tương đồng bổ

trợ vớ i s i A R N ) và làm cho m A R N bị phân huy (bị cắt đô i bở i các enzym cắt g ọ i là Dicer

chỉ có ở các cơ thể sống nhân thực). Cơ c h ế A R N i được 2 n h à khoa học M ỹ , F ừ e và

M i l o công bố n ă m 1998. N ă m 2006, hai nhà khoa học này đ ã được trao g i ả i thưởng

Nobel. Các l ĩnh vực ứng dụng cơ bản của cơ c h ế bấ t hoạt gen A R N i :

- Phá hủy các m A R N thông t in , từ đ ó xác đ ịnh được chức n ă n g của gen.

- Tạo sinh dược hoặc giống m ớ i v ớ i ứng dụng R N A i : Các s i A R N ở v i sinh vậ t nhân

thực hoạt động có khả năng gây bấ t hoạt gen ở các ký sinh gây bệnh n h ư virus, v i khuẩn,

n ấ m , côn trùng, . . . l àm cho chúng bị t iêu d iệ t hoặc m ấ t khả n ăng gây h ạ i . Các A R N ngắn

đang trở thành mộ t sinh dược trị l i ệ u quan trọng đ ố i v ớ i bệnh H I V - A I D và nh iều bệnh

virus khác .

- L à m bấ t hoạt các gen gây độc t ố hoặc làm t ăng chấ t lượng n ô n g sản ( l àm g i ả m các

chấ t béo giàu cholesterol ở cây có dầu, l àm mấ t độc t ố gossypol ở hạt b ô n g t h ô n g qua

gây bấ t hoạt gen tổng hợp gossypol trong hạt, l àm cho hạt b ô n g v ố n g iàu protein c ó thể

trở thành nguồn thức ân cho n g ư ờ i và chăn nuôi ) .

- C ó thể l àm bấ t hoạt các gen tạo hạt để tạo giống k h ô n g hạt họặc hạt nhỏ . . .

N g h i ê n cứu chức n ă n g gen v à n h ó m gen:

Trước kh i công nghệ R N A i được phát minh, các n h à khoa học đ ã ứng dụng các công

nghệ sau đây để xác đ ịnh chức năng của gen hoặc n h ó m gen:

- G â y tạo độ t b iến bằng hóa chấ t hoặc ch iếu xạ , phương p h á p n à y đã được ứng dụng

để phát minh ra hàng loạt các gen ở v i sinh vật và động thực vật , trong đ ó c ó phá t minh

quan trọng của Jacob và Mono về các gen đ iều k h i ể n hoạt h ó a gen ở v i sinh vật .

- Công nghệ cài T - D N A và các gen nhảy vào n h i ễ m sắc thể l àm cho gen đ í ch bị đ ộ t

biến. C ó thể đột b iến bị mấ t đặc t ính ban đầu , từ đ ó xác đ ịnh chức n ă n g gen đ ích .

Tuy vậy, các công nghệ trên có nhược đ i ể m chung là đòi h ỏ i thờ i gian, t ính đặc h i ệu

chưa cao, nhất là t ính ngẫu nh iên của các phương p h á p gây đ ộ t b iến gen bằng các tác

nhân hóa lý và cài gen.

- Công nghệ R N A đ ố i nghĩa (antisense R N A ) làm bấ t hoạt gen đ ích .

86

C ô n g nghệ R N A đ ố i nghĩa (antisense R N A ) là q u á t r ình tạo ra mộ t sợi A R N đ ố i

nghĩa v ớ i sợi m A R N của t ế bào . K h i sợi A R N đ ố i nghĩa tạo ra, n ó sẽ bắt cặp v ớ i sợi

m A R N tương đồng vớ i n ó theo quy luật bắt cặp của 2 sợi có cấu t rúc tương đồng bổ trợ,

tạo ra Ì sợi A R N kép . Do đó , sinh tổng hợp protein t rên sợi m A R N sẽ bị ách l ạ i . Đ i ề u

đ ó xảy ra do Ribosom và các t A R N k h ô n g có khả n ăng b á m vào A R N sợi kép . Tuy vậy,

quá t r ình này k h ô n g phải bao g i ờ cũng làm m ấ t chức n ăng của gen đ ích . Fire và cs

(1998) đã ngh iên cứu t iếp công nghệ A R N đ ố i nghĩa bằng cách c ù n g lúc đưa cả 2 sợi

đồng nghĩa (sense) và đ ố i nghĩa (antisense) v ớ i sợi m A R N đ ích vào tuyến t rùng

c.elegans, kế t quả đã làm tăng khả năng làm bấ t hoạt m A R N đ ích lên 10 lần so vớ i việc

chỉ đưa vào tuyến t rùng Ì trong 2 sợi A R N . Bằng cách t i êm cả 2 sợi A R N (đồng nghĩa

và đ ố i nghĩa) cùng lúc vào tuyến t rùng đã tạo ra mộ t sợi đô i và sợi đô i này đã có ý nghĩa

làm bắt đầu quá t r ình gây bấ t hoạt gen. K ế t quả ngh iên cứu này đã thúc đ ẩ y ngh iên cứu

về R N A i và các enzym cắt (Dicer) .

C á c n h ó m p h â n t ử A R N k h á c nhau có k h ả n ă n g g â y b ấ t h o ạ t gen đ ã đước p h á t

h i ệ n :

Trong t ế bào , l oạ i A R N có nhiều nhấ t là Ribosom A R N ( r A R N ) , t i ếp theo là t A R N

( A R N vận chuyển) và m A R N ( A R N thông t in) . Ngoà i ra n g ư ờ i ta m ớ i phát h iện ra các

A R N sau:

- A R N sợi k é p ( d s A R N = double stranded R N A ) .

- H a i r p i n A R N ( h p A R N - A R N cặp tóc) .

- A R N nhỏ (small in ter íer ing R N A = s iRNA, t iếng V i ệ t s i A R N ) , khoảng 2 1 - 2 5

nucleotid.

- A R N siêu nhỏ (micro R N A , t iếng V i ệ t m i A R N ) , khoảng 2 1 - 2 5 nucleotid.

C á c enzym v à A R N c ó ý nghĩa quan t r ọ n g đ ố i v ớ i g â y b ấ t h o ạ t gen b ằ n g cơ c h ế

A R N i :

Ì / A R N sợi k é p (dsARN): N h ó m A R N này h ình thành do 2 sợi A R N tương đồng

đ ố i nghĩa bắt cặp v ớ i nhau tạo thành (Agrawal và cs, 2003). Các sợi A R N kép dài được

t ìm thấy trong t ế b à o và thường có nguồn gốc từ các gen nhảy (Schramke và Allshire

2004) hoặc là virut (Rovere và cs, 2002) v ớ i sự sản sinh ra sợi A R N kép .

Sợi A R N kép dài được cắt thành các đoạn nhỏ g ọ i là s i A R N . Hamil ton và

Baulcombe (1999) là những ngườ i đầu t iên phân lập được các đ o ạ n ngắn này , chúng có

chiều dài từ 2 1 - 25 cặp bazơ (bp).

2/ A R N cặp tóc (hpARN): A R N cặp tóc là một dạng A R N sợi kép đơn g iản có

nguồn gốc từ mộ t sợi A R N dài có 2 tr ình tự ở đầu sợi tương đồng và có thể bắt cặp vớ i

nhau tạo thành sợi kép , trong kh i phần ở giữa cong l ạ i (tạo ra dạng cặp tóc) (Wesley và

cs, 2001).

87

3/ m i A R N c ó đặc t ính tương tự s i A R N (Bartel 2004; Nelson và cs, 2003). C ả 2 đ ề u

ngắn (trong khoảng 2 1 - 2 5 bp) và được sử dụng đ ể bắ t cặp và p h á hủy sợi m A R N đặc

thù. m i A R N là các A R N n ộ i sinh và là mộ t h ình thức đ i ề u k h i ể n b i ể u h i ệ n m ớ i của gen

trong quá t r ình phát t r iển .

4/ Dicer và RISC

Sợi d s A R N , h p A R N , m i A R N và s i A R N đơn độc k h ô n g thể gây ra bấ t hoạt gen và

phá hủy m A R N , chúng cần c ó sự trợ g iúp của 2 enzym là dicer và RISC đ ể l à m việc này .

Enzym dicer được Bernstein và cs phát minh ra l ầ n đ ầ u ở r u ồ i d ấ m (2001), là m ộ t enzym

phức tạp thuộc n h ó m RNase n i (RNase m f ami ly ) . Enzym này c ó các n h i ệ m vụ rấ t đặc

thù là thực h iện chức năng cắt sợi d s A R N hoặc h p A R N , tạo ra các s i A R N . RISC là m ộ t

hợp phần của bộ m á y R N A i . RISC l ầ n đầu t iên được phá t m i n h ra ở r u ồ i d ấ m bở i

Hammond và cs (2000). RISC được cấu tạo từ protein và A R N . Protein trong phức hợp

có hoạt t ính của ribonuclease enzym v ớ i k h ả năng cắt A R N . RISC mang sợi s i A R N có

sự tương đồng v ớ i m A R N để tạo ra đoạn ghép n ố i k é p giữa s i A R N và m A R N và sau đ ó

cắt đứt m A R N ra l àm hai.

C ơ c h ế A R N Ỉ :

Enzym dicer cắt sợi d s A R N hoặc h p A R N dài thành các đ o ạ n ngắn g ọ i là s i A R N .

Các sợi ngắn sau đ ó được tách thành 2 sợi đơn và mộ t trong 2 sợi đ ã g h é p v à o RISC tạo

thành tổ hợp s iARN-RISC. T ổ hợp này nhằm vào các t r ình tự tương đồng t rên sợi

m A R N . m A R N bị cắt bở i RISC và sau có các enzym endonuclease c ó trong t h à n h phần

của RISK sẽ phá hủy hoàn toàn m A R N .

Cơ chế hoạt động của ARNi (RNAi theo nguyên bản tiếng Anh)

Một sợi RNA kép có chiều dài khoảng vài trăm bp được cắt bởi e'nzym decer

ị

Các sợi siARN kép ngắn từ 21 - 23 bp (Small Intértenng RNA)

ị

Enzym RNA induced silencing complex (RISK) mở xoắn siRNA kép. Sợi siRNA đơn trong tổ hợp RISK bắt cặp với

mARN ỏ đoạn tương đồng với nó và enzym RISK sẽ cắt mARN làm 2

ị

Enzym RNA dependent ARN polymerase (RdRP)

ị

Nhân siARN mới (Theo Hutvagner và Zamore, 2002)

88

C á c A R N n h ỏ v à me thy l h ó a p romoter :

N g o à i cơ c h ế gây bấ t hoạt gen thông qua phân huy m A R N trên đây , quá t r ình làm c â m gen c ó thể xảy ra ở mức gen và được g ọ i là l àm c â m dịch m ã gen Transcriptional Gene Silencing - TGS). H i ệ n tượng này được Wassenegger và cs phát h i ện lần đầu ở thuốc lá n ă m 1994. H ì n h thức làm c â m gen này được g ọ i là methyl hóa A D N d ư ớ i tác động của A R N ( R N A - Directed D N A methylation = R d D M ) ) . Q u á t r ình này xảy ra kh i promoter của gen bị methyl hóa và làm gen m ấ t khả n ăng ph iên m ã (tổng hợp m R N A ) .

3.6. ĐỘT BIẾN GEN

Q u á t r ình n h â n đôi của sợi A D N thường xảy ra mộ t cách ch ính xác , từ mộ t phân tử A D N m ẹ tạo ra hai p h â n tử giống hệt phân tử m ẹ . D o vậy bảo đ ả m k h ả nâng duy trì các đặc t ính d i t ruyền từ t ế bào n ọ sang t ế bào kia và giữa các t h ế h ệ trong quá tr ình t i ến

hoa. Đ ó là t ính "bảo thủ" của gen.

M ặ t k h á c trong q u á t r ình sinh tổng hợp của A D N c ó thể xảy ra những sai sót d ẫ n đ ế n sự thay đ ổ i c ấ u t rúc hay là t r ình tự các nucleotid trong A D N d ẫ n đ ế n h i ệ n tượng độ t b iến - hay c ò n g ọ i là b i ế n d ị . Quan hệ b i ện chứng giữa t ính "d i t ruyền" , t ính "bảo thủ" vớ i khả nặng thay đ ổ i cấu t rúc của n ó , t ính " độ t b i ến" , t ính "b iến d ị" là cơ sở cho sự t i ến hoa.

Những n g u y ê n n h â n của quá t r ình đ ộ t b iến đã được rấ t nhiều tài l i ệ u khẳng đ ịnh, bao gồm:

C á c t á c n h â n v ậ t lý k h á c nhau: p h ó n g xạ, bức xạ của mật t rờ i , tia nhiệt (ảnh hưởng của nhiệt đ ộ cao tác động lên t ế bào) . . .

C á c t á c n h â n hoa học k h á c nhau: các chấ t gây độ t b iến n h â n tạo như: colchicine, thuốc bảo vệ thực vật , các chấ t d iệ t cỏ , hoa chấ t công nghiệp khác . . .

Sự g i à hoa của t ế b à o v à m ô . Trong quá tr ình lão hoa của m ô t ế bào và cơ thể , một số chất độc và các sản phẩm thứ cấp t ích l ũy có thể d ẫ n đ ế n sự sai lệch trong nhân bản A D N . H i ệ n tượng n à y có thể quan h ệ v ớ i t ỷ l ệ mắc bệnh ung thư cao ở n g ư ờ i già, hoặc bố m ẹ lớn t u ổ i sinh con d ị dạng v ớ i t ỷ l ệ cao hơn .

K h i t ế b à o v à m ô t á c h k h ỏ i cơ t h ể sống h o à n ch ỉnh v à được n u ô i c ấ y in vitro

Biến d ị của các t ế bào trong đ iều k i ệ n nuôi cấy g ọ i là b iến d ị t ế bào soma

(somaclonal variation). T ầ n số độ t b iến trong t ế bào nuô i cấy có thể đạt 10' 2- 10"3, cao hơn cả kh i sử dụng mộ t số các tác nhân gây đ ộ t b iến .

N g à y nay, n g ư ờ i ta đang tranh cãi nhiều về nhân bản n g ư ờ i bằng con đường vô t ính hoặc nhân bản t ế b à o n g ư ờ i cho mục đ ích sinh sản. Vì đ ế n nay, con n g ư ờ i v ẫ n chưa thể k i ể m soát được các đ ộ t b iến xảy ra trong quá tr ình nuôi cấy m ô và t ế bào n g ư ờ i ở ngoài cơ thể . Do vậy q u á t r ình nhân bản có thể d ẫ n đến những độ t b iến nguy h i ể m chưa lường trước được.

Sơ đ ồ 3.9 cho ta thấy sự thay đ ổ i trong cấu trúc của A D N c ó thể d ẫ n đ ế n những thay đ ổ i t r ình tự axit amin trong phân tử protein như t h ế nào .

89

Sợi A D N ban đầu (bình thường)

N h â n đôi A D N

C C T G A G G A G

x ả y ra đ ộ t b i ế n

Thay đ ổ i trong A D N

Phân tử bình thường của t h ế hê con

c c T G A G G A G

GGACTCCTC

C C T G g G G A G

G G A C l C C T C

m . A R N bình

thường ị Đ í c h m ã T h ể đ ộ t b i ến

m - A R N

c c U G A G G A G C C U G I G G A G

ị P h i ê n m ã

( ^ P T Õ ^ G I Ù ^ G Ĩ U ^ )

Protein bình thường

Pro G i ũ

T h ể đ ộ t b i ến protein

Sơ đồ 3.9. Đột biến xảy ra trong phân tửprotein (Theo Karl Drỉica,1997)

K h i xảy ra độ t b iến , cặp nucleotid tương đồng A - T trên hai sợi A D N đ ố i xứng c ó thể

được thay bằng cặp G-C, C-G hoặc T - A . Trong thí dụ cụ thể ở sơ đ ổ ư ê n , cặp b azơ A - T

trên sợi A D N bình thường đã bị độ t b iến thành T - A d ẫ n đ ế n m ã d i t ruyền t rên gen và

trên sợi m A R N bị thay đ ổ i , cặp ba G A G trên sợi A R N b ình thường bị thay đ ổ i thành

G U G trên sợi A R N độ t b iến . K ế t quả trong phân tử protein đ ộ t b i ến , V a l i n c h i ế m v ị trí

của Glutamin.

Sự thay t h ế đôi k h i chỉ mộ t axit amin trong protein có thể d ẫ n đ ế n l à m m ấ t chức

năng hoặc thay đ ổ i hoạt t ính của protein hoặc enzym, d ẫ n đ ế n thay đ ổ i trong c ấ u t rúc

hoặc chức năng của t ế bào , cơ thể sống mang các độ t b iến như vậy g ọ i là cá thể đ ộ t b i ến .

N ế u đột b iến làm thay đ ổ i chức nâng của một protein quan trọng, cá thể đ ộ t b i ế n có t hể

bị chết hoặc bị bệnh hoặc b iến dạng. Đô i kh i xảy ra các đ ộ t b iến có l ợ i , l à m cả i th i ện

90

k h ả n ă n g sinh t ồ n và sinh sản của cá thể độ t b iến . N h ư vậy , cá thể đ ộ t b i ến t rở nên có ưu

t h ế h ơ n trong quần thè và mộ t bước t i ến nhỏ đã xảy ra đ ố i v ớ i sự t i ế n hoa.

M ứ c đ ộ ch ính x á c trong quá tr ình nhân đô i của p h â n tử A D N là rấ t đ á n g ngạc nhiên .

Ở v i khuẩn , tần số đ ộ t b iến xảy ra ở mộ t gen chỉ là m ộ t phần t r i ệu , tức là ch ỉ c ó mộ t t ế

b à o đ ộ t b i ến gen đ ó trong tổng số một t r i ệu t ế b à o quan sát . N g à y nay đ ể đ á n h giá tác động g â y đ ộ t b i ến của mộ t tác n h â n hoa học hoặc vậ t lý, ví dụ : thuốc trừ sâu lên quá t r ình đ ộ t b i ến ở cơ t hể sống, n g ư ờ i ta thử tác n h â n đ ó lên v i khuẩn và x á c đ ịnh tần suất độ t b i ến của v i khuẩn .

Trên cơ sở tần suất đ ộ t b iến do thuốc trừ sâu gây ra ở v i khuẩn n g ư ờ i ta có thể d ự báo mức đ ộ nguy h ạ i của thuốc sâu đ ó đ ố i v ớ i con n g ư ờ i và m ô i sinh. Đ ộ t b iến là

n g u y ê n nhân gây ra rấ t nh iều bệnh lý ở con n g ư ờ i , trong đ ó c ó các bệnh ung thư, các trường hợp sinh con d ị dạng. N g h i ê n cứu độ t b iến là m ộ t trong các phương p h á p cơ bản để xác đ ịnh chức n ă n g của gen.

Sợi ADN bình thường

Sốthứtựcác nucleotit 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

TnnhtựnucleotittrongADN - A - A - G - 6 - C - C - A - C - C - A - G - C - C - G - A - G - A - A -

Trinh tự axit amin trong protein — Phe — Arg — Trp — Ser — Ala — Lêu —

Đột biến điểm làm đổi nghĩa của codon:

No.10:A->G I

TrìnhtựNuừongADN —A — A-G—G—C—C—A-C —C —G-G —C-G-C-T-C —T-T-II l i l i l i — l i

Trinh tự axit amin trong protein — Phe — Arg — Trp — Pro — Ma — Lêu •

A ở v ị trí 10, nếu A thay t h ế bằng G, prol in sẽ thay t h ế serine trong phân tử protein. N ế u c ở v ị t r í 8 thay t h ế bằng T, đ ộ t b iến tạo sẽ tạo ra codon vô nghĩa-codon dừng tổng hợp protein (end codon).

No.8:C-»T

Trình tự nucleotit trong ADN - A - A - G - G - C - C - A - T - C - T — C - G - G - C - T - G - A - A -Ị l i l i . l i _ J I U i — —

Trình tự axit amin trong protein — Phe Arg end

91

K h i c thay t h ế bằng T ở vị trí thứ 8, codon tương ứng v ớ i tryptophan bị thay t h ế b ở i

codon vô nghĩa A T C ( U A G trên m A R N ) . Q u á t r ình dịch m ã d i t ruyền b ị ngừng l ạ i , sinh

tổng hợp protein k h ô n g t iếp tục được nữa.

Các tác nhân gây độ t b iến: Báo cáo của T ổ Chức N ă n g lượng n g u y ê n tử quốc t ế

( I A E A - International Atomic Energy Agency, 2006) cho biế t bằng c á c p h ư ơ n g p h á p g â y

độ t b iến thực nghiệm cho đ ế n nay (2006) đã tạo được t rên 2600 giống cây t rồng k h á c

nhau thuộc 180 loài thực vật . Đ a số các giống đ ộ t b iến đã được tạo ra bằng p h ó n g xạ

(chiếm 88% tổng số giống độ t biến) , trong đ ó tia Gamma đ ó n g vai t rò chủ y ế u , tạo ra

khoảng 64% các giống độ t b iến p h ó n g xạ . Các tác nhân hoa học tạo ra khoảng 10% các

giống đ ộ t b iến . Giống lúa đ ộ t b iến mang gen nửa lùn s d l (semidwaft gene s d l là mộ t

gen lặn) là nguồn gen quan trọng trong tạo giống lúa. H ầ u hế t c á c g iống lúa lùn , n ă n g

suất cao, chịu phân bón và t h â m canh mang gen này .

3.7. GENOM VÀ THÔNG TIN DI TRUYỀN

Genom là kho lưu g i ữ t hông t in d i t ruyền khổng l ồ trong m ộ t thể t ích s iêu nhỏ .

N g ư ờ i ta ví genom của cây lúa như mộ t pho sách có 12 chương , m ỗ i c h ư ơ n g là mộ t

n h i ễ m sắc thể . M ỗ i chương chứa hàng ngàn câu chuyện, m ỗ i c âu chuyện được g ọ i là

gen. M ỗ i câu chuyện có rấ t nhiều từ , m ỗ i từ được g ọ i là m ộ t codon. M ỗ i codon được v i ế t

bở i ba chữ cái , m ỗ i chữ cái là mộ t bazơ. Tấ t cả có bốn bazơ k h á c nhau: Adenin , Thymin ,

Cytosin và Guanin, tạo ra 64 từ. Ta hãy tưởng tượng genom của m ỗ i n g ư ờ i g ồ m khoảng

3000 t r i ệu chữ cá i . M ỗ i n g ư ờ i là mộ t kho sách thần k ỳ k h á c b iệ t . Bảy t ỷ n g ư ờ i là bảy tỷ

câu chuyện nh iều k ỳ khác nhau. H ã y c h i ê m ngưỡng sự đa dạng phong p h ú của t h ế g iớ i

này và hưởng thụ n i ề m vui sướng k h ô n g cùng của nhận thức sự sống.

N ă m 1997, Fred Blattner và các cộng sự t ạ i Trường Đ ạ i học Wisconsin đ ã hoàn

thành việc g i ả i m ã tr ình tự nucleotid của mộ t chủng E. co l i K 1 2 k h ô n g gây bệnh g ọ i là

chủng M G 1655. K ế t quả sau 15 n ă m ngh iên cứu hệ gen của E.col i các n h à khoa học đã

phát h iện genom của E.coli có chứa tấ t cả 4.639.221 cặp bazơ. H ệ gen của Baciỉlus

subtilis có chứa 4100 protein v ớ i 4.214.810 cặp bazơ. H ệ gen của v i t rùng lao

Mycobacterium tuberculosỉs có 4000 gen v ớ i tổng số 4.411.529 cặp bazơ, v i k h u ẩ n gây

bệnh dạ dày Helicobacter pylori có t ố i th iểu 1590 protein trong h ệ gen g ồ m 1.667.867

cặp bazơ.

Các phân tích m á y t ính t r ình tự A D N của E.coli x ác đ ịnh được 4288 gene, trong đ ó

88% gen m ã hoa protein và các A R N , 1 1 % gen c ó chức n ăng đ iều k h i ể n , n h ỏ h ơ n 1%

chứa các tr ình tự A D N lặp l ạ i . Khoảng cách trung b ình giữa các gen của E.coli khoảng

120 cặp bazơ. Trong số 4288 gen, chức n ăng cụ thể của 3200 gen đã được xác đ ịnh.

Toàn bộ hệ gen của n ấ m men s. cerevisiae có 12.068.000 cặp b azơ và con số n à y ở

ngườ i là khoảng 3 tỷ cặp bazơ, l ớ n gấp 250 lần genom ở n ấ m men (Bảng 3.1).

92

Bảng 3.1. Số lượng ADN trong các sinh vật

Sinh vật Số cặp bazơ (triệu) Sinh vật

Số cặp bazơ (triệu)

Sinh vật Số cặp bazơ (triệu) Sinh vật Số cặp bazơ

(triệu)

Vi khuẩn 4,7 Gà 1.000

Cây Arabidopsis

70.000 sv 40 (virus) 5,243

Nấm men 15 Người 2.800 Ngô 15.000 ỘX174 5,386

Giun tròn 80 Chuột 3.000 Kỳ nhông 90.000

Ruồi dấm 155 Cây thuốc

lá 4.800 Loa kèn 90.000

Bảng 3.1 cho thấy trong nh iều t rường hợp lượng A D N k h ô n g thể h i ệ n sự tương quan vớ i thang bậc t i ến hoa của sinh g i ớ i .

Tr ình tự A D N ở các sinh vật khác nhau có thể rấ t g iống nhau. Trong thực t ế khoảng

10% các gen của n g ư ờ i tương tự v ớ i gen của r u ồ i d ấ m và giun. Tr ình tự A D N của n g ư ờ i

và t inh t inh giống nhau 99%, 50% gen n g ư ờ i g iống v ớ i thực vật; H à n g t r ăm gen của

ngườ i dường như c ó nguồn gốc từ v i khuẩn. Theo nghĩa rộng genom của n g ư ờ i có mộ t

số đặc đ i ể m như virus. N g u y ê n nhân là do mộ t số quá t r ình sinh học cơ bản ở n g ư ờ i có

thể giống v ớ i v i khuẩn, thực vật và các động vật k h á c . Các hệ gen tham gia quá t r ình

quang hợp và quá t r ình d ị dưỡng tạo năng lượng ở ty thể ở các loài thực vật khác nhau sẽ

rấ t giống nhau.

3.8. PHÁT HIỆN CÁC GEN QUAN TRỌNG LÀM cơ sở CHO TẠO GIỐNG MỚI

C á c p h ư ơ n g p h á p c ă n b ả n h i ệ n nay đ ể p h á t h i ệ n chức n ă n g của gen:

- Phương p h á p la i phân tích k i ể u Mendel .

- Phương p h á p gây tạo đ ộ t b iến làm phá vỡ hoặc thay đ ổ i chức n ă n g của gen.

Dựa trên kế t quả phân tích các cá thể mang đ ộ t b iến (so sánh ở mức phân tử hoặc lai

thể đột b iến v ớ i đ ố i chứng), n g ư ờ i ta có thể xác đ ịnh được tương quan giữa gen và t ính

trạng, gen l ặ n hay t r ộ i , t ính trạng đơn gen hay đa gen, n h ó m l iên kế t của gen hay v ị t r í

của gen trên n h i ễ m sắc thể .

- M ộ t trong các phương pháp h i ệu quả nhấ t h i ện nay để xác đ ịnh chức n ăng của gen

là gây đ ộ t b iến bằng cài gen (xem phần k ỹ thuật gây đ ộ t b i ến bằng cài gen).

- Phương p h á p p h â n tích sự khác biệt d i t ruyền (Chương t r ình so sánh hệ gen -

Comparative Genomics) bằng kỹ thuật sinh học phân tử: V í dụ , sự k h á c b iệ t giữa cá thể

khoe mạnh v ớ i n g ư ờ i bệnh, giữa n g ư ờ i th iểu năng trí tuệ v ớ i n g ư ờ i t hông minh. . .

- So sánh t r ình tự A D N giữa n g ư ờ i v ớ i t inh t inh, giữa n g ư ờ i v ớ i chuột, giữa động vật

v ớ i thực vật. . . để phá t h i ện sự tương đồng và khác biệ t giữa h ệ gen và n h ó m t ính trạng

(Chương t r ình Genom và Chương tr ình chức n ăng của Genom).

93

- So sánh thư v i ện c A D N giữa một cá thể v ớ i đ ố i chứng của n ó , so s á n h t hư v i ệ n c A D N giữa hai giai đoạn phát t r iển khác nhau của cùng mộ t cá thể đ ể phá t h i ệ n chức n ă n g của gen và thờ i đ i ể m biểu h iện của gen trong m ỗ i chu k ỳ phát t r iển của c ơ t hể sống.

- Phương pháp m ớ i nhấ t đ a n g được d ù n g phổ b i ến đ ể n g h i ê n cứu chức n ă n g và b i ể u h iện của gen là A R N i ( t iếng A n h là R N A interference, v i ế t tắ t R N A i ) . N g ư ờ i ta tạo ra các t r ình tự A R N ngắn từ 21 - 25 khoảng nucleotid ở t ế b à o chấ t bằng nh i ều p h ư ơ n g p h á p khác nhau. Các A R N ngắn sẽ bán vào các m A R N của gen đ í ch ( m A R N c ó m ộ t đoạn t r ình tự tương đồng v ớ i A R N ngắn), l àm m A R N bị cắt l à m đ ô i và m ấ t chức n ă n g tổng hợp protein. T h ô n g qua sự m ấ t protein và mộ t vài t ính t rạng k è m theo, n g ư ờ i ta có

thể xác đ ịnh được chức n ăng của gen.

Phá v ỡ chức n ăng của gen đ iều k h i ể n k h ô n g ch ỉ là p h ư ơ n g p h á p n g h i ê n cứu chức năng của gen, m à còn c ó ý nghĩa thực t i ễ n to lớn . P h ư ơ n g p h á p n à y đ ã mang l ạ i cuộc cách mạng đ ố i v ớ i c ô n g nghiệp sinh học sản xuấ t các chấ t hoạt t ính sinh học n h ư k h á n g sinh, vi tamin, axit amin, enzym, các alcaloid và nh iều dược chấ t k h á c . C á t h ể đ ộ t b iến

k h ô n g còn k h ả năng k i ể m soát các q u á tr ình sinh hoa c ó l ợ i cho n ó , ngược l ạ i chúng

phải sản sinh ra các hoạt chấ t c ó l ợ i cho con n g ư ờ i .

Gen đ iều k h i ể n c ó thể được coi là c ộ i nguồn của các d ò n g chảy sinh học c h ă n g ? Từ gen đ iều kh iển c h ú n g ta c ó thể l ầ n ra các mắ t x í ch c ăn bản tạo n ê n p h é p b i ệ n chứng của sự sống c h ă n g ?

P h á t h i ệ n c á c gen quan t r ọ n g t r o n g t ự n h i ê n là cơ sở t ạ o r a c á c c ơ t h ể b i ế n đ ổ i

d i t r u y ề n :

Các phương p h á p sinh học phân tử đã g iúp phá t h i ệ n n g à y c à n g nh i ều c á c gen m ớ i có thể tạo ra cuộc cách mạng trong n ô n g nghiệp (xem chi t i ế t ở c á c c h ư ơ n g sau):

- Phát h i ện các gen bảo v ệ thực vật chống sâu bệnh h ạ i .

- Phát h i ệ n ra các gen k h á n g thuốc d iệ t cỏ và chuyển c á c gen n à y v à o c â y trồng g i ảm chi ph í thuốc d iệ t cỏ và t ăng n ă n g suất.

- Phá t h i ện ra các gen c h ú i sớm: n g ư ờ i ta đã thành c ô n g chuyển gen c h ú i sớm này vào mộ t số cây t rồng k ể cả cây thân g ỗ .

- Phá t h i ện các gen k i ể m soát q u á t r ình chú i và chấ t lượng của quả n h ư c á c gen k ì m

h ã m sinh tổng hợp ethylen: Quả của các giống mang gen k ì m h ã m ch ín c ó t h ể t ồ n t ạ i t rên ruộng lâu hơn , d ễ bảo quản và bảo quản được lâu hơn trong q u á t r ình v ậ n chuyển .

- Phát h iện các gen ch ìa khoa của q u á t r ình quang hợp: 3 gen đ ó n g vai t rò chủ đạo trong chu tr ình quang hợp của cây C4 đã được tách ra và chuyển vào cây C3. N h ờ phá t h i ện này, các nhà khoa học hy vọng tạo được các giống lúa nước c ó thể t ăng n ă n g suất

20 - 50 % so vớ i g iống đ ố i chứng.

Các công ty Nam T r i ề u T iên đã công b ố thành c ô n g chuyển gen quang hợp từ v i khuẩn vào lúa làm t ăng năng suất giống lúa chuyển gen lên 30% so v ớ i đ ố i chứng

(www.whfreeman.com).

94

D ự k i ế n các gen c ăn bản quyết đ ịnh năng suất, chấ t lượng, k h ả n ă n g chống ch ịu sâu bệnh của cây trồng và vật nuôi , các gen sản xuấ t dược chấ t q u ý sẽ được phá t h iện . Các phá t minh này chắc chắn sẽ tạo ra cuộc cách mạng sinh học trong k ỷ n g u y ê n m ớ i này .

3.9. KẾT QUẢ BƯỚC ĐAU TRONG NGHIÊN cứu SINH HỌC PHÂN TỬ PHỤC vụ

N Ô N G N G H I Ệ P Ở N Ư Ớ C T A

Ở V i ệ t Nam, ngh iên cứu sinh học phân tử phục vụ n ô n g nghiệp đã được V i ệ n D i t ruyền N ô n g nghiệp t r iển khai mạnh trên cây lúa. L ầ n đ ầ u t iên ở nước ta, V i ệ n đã tạo được hai d ò n g bấ t dục đực nhân cảm ứng nhiệt đ ộ (TGMS) m ớ i và đã hợp tác v ớ i các nhà khoa học nước ngoà i ngh iên cứu lập bản đ ồ phân tử của hai gen này ( N g u y ễ n V ă n Đồng và cs, 1999; Phạm Ngọc L ư ơ n g và cs, 2002).

Các nhà khoa học V i ệ t Nam cũng đã chứng minh được ở mức đ ộ phân tử rằng gen k i ể m soát t ính trạng T G M S của d ò n g lúa T G M S - V N 1 là m ộ t gen m ớ i , n ằ m trên vai ngắn của n h i ễ m sắc thể số 2 của lúa. N ó k h ô n g giống v ớ i gen t m s l thuộc n h i ễ m sắc thể số 8 do tác g iả Trung Quốc phá t h i ện n ă m 1995 và cũng k h ô n g g iống gen tms3(t) do các tác g iả I R R I phát h i ện n ă m 1997.

Chúng ta cũng đã l ập t r ình tự được ch ỉ th ị phân tử l iên kế t chặ t v ớ i gen tms4(t) (gen k i ể m soát t ính trạng T G M S của d ò n g lúa T G M S - V N 1 ) . Ch ỉ th ị này được lưu g i ữ t ạ i Ngân hàng gen mang m ã số: A F 07954 và xác đ ịnh được t r ình tự ch ỉ th ị l iên kế t gen

TGMS-VN6. .

Phối hợp v ớ i Trung t â m k ỹ thuật gen và CNSH quốc t ế , Cán bộ của V i ệ n đã phân lập được ba gen m ã hoa các men helicase m ở xoắn k é p A D N từ đậu H à Lan v ớ i các tr ình tự mã hoa có độ dài 1,6 kb , 2,2 kb và 2,9 kb. Tr ình tự nucleotid của ba đ o ạ n gen này đã được xác đ ịnh và đ ă n g k ý bản quyền t ạ i N g â n hàng gen t h ế g iớ i v ố i các m ã số tương ứng là Y 17186, A F 271892 và A F 271893 (Phạm X u â n H ộ i và cs, 2001).

V i ệ n đã sử dụng các phương p h á p marker phân tử để x ác đ ịnh v ị trí , chức n ăng của các gen quan t â m t rên n h i ễ m sắc thể ở lúa. Phương p h á p này cho p h é p đ á n h giá nhanh, chính xác sự có mặ t hoặc k h ô n g có mặ t của mộ t gen nào đ ó trong m ộ t cá thể hoặc trong dòng giống cây trồng, vật nuô i hoặc chủng v i sinh vật và được áp dụng trong chọn tạo giống m ớ i vớ i tên g ọ i là K ỹ thuật Sinh học phân tử h ỗ trợ chọn giống.

Bằng kỹ thuật này đã xác đ ịnh được mộ t số gen k h á n g bệnh đạo ôn, bạc lá, rầy nâu, gen kháng sâu và thuốc diệ t cỏ , gen quy đ ịnh hương thơm ở nh iều g iống lúa, từ đ ó đã sử dụng các gen này l à m gen ch ỉ th ị (marker genes) để đ á n h giá nhanh tập đ o à n g iống lúa mớ i . Hàng t răm d ò n g giống lúa đã được đ á n h giá khả n ăng chống ch ịu bệnh đạo ôn, bạc lá... qua các gen ch ỉ th ị . Phương p h á p này còn g iúp xác đ ịnh các gen có giá trị trong con lai F l và các t h ế h ệ t i ếp theo nhằm chọn ra các đặc t ính ở mức phân tử n h ư t ính kháng bệnh đạo ôn, rầy nâu , bạc lá...

Phương p h á p sinh học phân tử đã được v i ệ n sử dụng trong ngh iên cứu bệnh hạ i lúa đạo ôn . Đ ã sử dụng kỹ thuật Pot2-repPCR để xác đ ịnh các chủng n ấ m đạo ôn ở V i ệ t Nam. Qua đ ó , đã xác đ ịnh được 88 chủng đạo ôn ở m i ề n Bắc và m i ề n Trung. Các chủng

95

đạo ôn này đã sử dụng đ ể đ á n h giá độc t ính của c h ú n g và k h ả n ă n g k h á n g của tập đ o à n giống V i ệ t Nam đ ố i v ớ i từng chủng. Đ ã xác đ ịnh được các g iống k h á n g đ ạ o ô n g ồ m :

Ôn; T á m t h ơ m , SH z2, C h i ê m Bắc, T á m xoan, D ự , Bát đ en . Các g iống n à y đ ã được sử dụng lập bản đ ồ gen k h á n g và đã t ìm được ch ỉ th ị p h â n tử l iên k ế t v ớ i gen k h á n g . Các giống lúa k h á n g đạo ôn nói t rên đã được sử dụng l àm vật l i ệ u k h ở i đ ầ u cho la i tạo đ ê đưa gen k h á n g của c h ú n g vào các giống đang được sử dụng trong sản x u ấ t n h ư n g bị l ây n h i ễ m cao. Sau đ ó d ù n g ch ỉ th ị phân tử để chọn các cá thể và d ò n g lúa k h á n g . N h ữ n g d ò n g lúa k h á n g có các đặc t ính tố t k h á c sẽ được đưa vào sản xuấ t .

Bằng phương p h á p tương tự c ó thể quy tụ nh iều gen k h á n g sâu bệnh k h á c nhau vào mộ t giống nhờ sự trợ g iúp của ch ỉ th ị phân tử:

- Các d ò n g lúa quy tụ gen k h á n g đạo ô n đã tạo ra ở c ác g iống sản x u ấ t quan trọng trong nước như CR 203, D T 10, D T 12, D T 13, D T 21 được quy tụ 3 gen k h á n g đạo ôn (Pi -1 , Pi-2, Pi-3).

- Các d ò n g lúa quy tụ gen k h á n g bạc lá: Khang dân , Q5 và m ộ t số d ò n g k h á c mang 3 gen k h á n g bạc lá (Xa-5, Xa-7, Xa-21).

- Các d ò n g lúa quy tụ gen k h á n g rầy nâu: D T 2 1 , DT10, N ế p 415 mang 2 gen kháng

rầy nâu (bph-2, bph-3).

V i ệ n D i t ruyền N ô n g nghiệp đã ngh iên cứu sử dụng k ỹ thuật cà i gen (insertional mutation) vào genom của các chủng n ấ m gây bệnh ở cây ngũ cốc và đ ã tạo được nhiều

chủng n ấ m mấ t khả n ăng gây bệnh. Các gen bị m ấ t t ính trạng do cà i gen ( m ấ t k h ả năng tạo độc t ố quy đ inh k h ả n ă n g gây bệnh của n ấ m ) đã được x á c đ inh .

96

Chương 4

C Ồ N G N G H Ệ A D N T Á I T ổ H Ợ P

4.1 . V I R U S , V I K H U Ẩ N VÀ K H Ả N Ă N G C H U Y Ể N T Ả I V Ậ T L I Ệ U D I T R U Y Ề N

M ộ t số v i khuẩn và virus v ớ i những đặc t rưng cơ bản sau đây đã được sử dụng l àm vectors chuyển gen từ t ế bào sang t ế bào , từ cơ thể sống này sang cơ thể sống khác :

- ở v i khuẩn, plasmid là m ộ t sợi A D N mạch v ò n g có k ích thước nhỏ hơn nhiều so

vớ i A D N n h i ễ m sắc thể của v i khuẩn. Plasmid có thể được n h â n bản một cách độc lập không phụ thuộc vào q u á t r ình n h â n đô i của n h i ễ m sắc thể .

- M ộ t số t ế bào E. co l i c ó mang plasmid vòng ( g ọ i là y ế u t ố g iớ i t ính F hay là sex factor). Y ế u t ố F c ó thể t ồ n t ạ i trong t ế bào ở t rạng thái tự do trong t ế bào chấ t hoặc có thể ở dạng ghép n ố i v ớ i n h i ễ m sắc thể mạch vòng của v i khuẩn.

- Trong quá t r ình t i ếp hợp giữa các v i khuẩn, y ế u t ố F của v i khuẩn c ó thể chuyển từ t ế bào mang F sang t ế k h ô n g mang F.

- Siêu v i khuẩn là m ộ t l o ạ i virus gây bệnh ở v i khuẩn. A D N của siêu v i khuẩn có thể là vector mang A D N từ mộ t v i khuẩn này sang v i khuẩn khác .

- Trong quá t r ình chuyển gen, mộ t đoạn A D N ngoại la i n à o đ ó c ó t hể ghép n ố i v ớ i A D N của siêu v i khuẩn. Sau k h i t ế bào v i khuẩn bị lây n h i ễ m bở i s iêu v i khuẩn, A D N siêu v i khuẩn sẽ t h â m nhập vào t ế b à o m à n ó k ý sinh và mang theo vào v i khuẩn đoạn A D N ngoại la i .

- A D N trong m ô i t rường có thể x â m nhập vào t ế bào v i khuẩn và g h é p n ố i vào NST v i khuẩn làm thay đ ổ i genom v i khuẩn này .

4.1.1. Vi khuẩn

V i khuẩn thuộc n h ó m sinh vật t ế bào t i ền nhân . Trong chu t r ình tuần hoàn vật chấ t và năng lượng của hệ sinh thái , v i khuẩn là mộ t thành phần hết sức quan trọng.

Những đặc t ính cơ bản của v i khuẩn đã được khai thác sử dụng trong rấ t nh iều l ĩnh

vực đ ờ i sống như:

- Công nghiệp sản xuấ t k h á n g sinh, vi tamin, axit amin,...

- Sản xuấ t vacxin tái tổ hợp và các chấ t hoạt t ính sinh học k h á c d ù n g trong y tế .

- C ô n g nghiệp c h ế b iến thực phẩm.

- C ô n g nghiệp v i sinh bảo vệ thực vật .

- Phân bón sinh học.

Do v i khuẩn c ó cấu t rúc genom đơn g iản ch ỉ g ồ m Ì sợi A D N , chu k ỳ sinh sản ngắn, hệ số sinh sản cao và là tác nhân gây bệnh t ruyền n h i ễ m ở n g ư ờ i , động vật , thực vật nên

97

v i khuẩn đã trở thành mộ t đ ố i tượng ngh iên cứu lý tưởng của n g à n h d i t r uyền học và công nghệ sinh học.

N h ờ c ó ngh iên cứu v i khuẩn l ầ n đầu t iên con n g ư ờ i đã phá t h i ệ n ra bản chấ t của vậ t l i ệ u d i t ruyền là A D N , m ã d i t ruyền, các đ ộ t b iến sinh hoa học, h ệ đ i ề u k h i ể n của gen,

kỹ thuật A D N tái tổ hợp.

H i ệ n nay, v i khuẩn Agrobacterium v ẫ n là vector hữu h i ệu nhấ t trong thao tác chuyển gen ở cây trồng. V ì v i khuẩn này mang hai đặc t ính cơ bản c ó l iên quan đ ế n k ỹ thuật gen là khả năng tiếp hợp giữa các tế bào và khả năng hấp thụ ADN m ộ t c á c h k h á d ễ d à n g từ mô i t rường.

Do vậy, h iểu b iế t của chúng ta về các h iện tượng d i t ruyền ở v i k h u ẩ n sẽ là k h ô n g

thể th iếu được trong ngh iên cứu k ỹ thuật gen và c ô n g nghệ sinh học.

4.1.1.1. Hiện tượng tiếp hợp ở vi khuẩn

T i ế p hợp (confugation) là quá t r ình t i ếp cận giữa hai v i k h u ẩ n tương hợp trong đ ó xảy ra sự vận chuyển A D N từ v i khuẩn này sang v i khuẩn kia .

Sự t i ếp hợp xảy ra thông qua m ộ t cấu t rúc của v i khuẩn g ọ i là sợi t i ếp hợp (p i l i ) . T i ế p hợp là h i ện tượng la i chéo đơn g iản xảy ra ở g iớ i v i sinh vậ t . Đ ể n g h i ê n cứu h iện tượng này v i khuẩn E. co l i là mộ t đ ố i tượng lý tưởng.

V i ệ c t iếp hợp và chuyển gen ở E. col i được thực h i ện bở i m ộ t plasmid A D N mạch vòng g ọ i là yếu t ố g iớ i t ính F.

4.1.1.2. Yếu tô'F và khả năng tái tổ họp và vận chuyển vật liệu di truyền giữa các tế bào

Y ế u t ố F được t ìm thấy k h ô n g phải ở m ọ i t ế bào , trong đ ó t ế b à o c ó mang y ế u t ố F g ọ i là F* và t ế bào k h ô n g có y ế u t ố F g ọ i là F . Y ế u t ố F c ó chứa khoảng 100 gen. Các gen này quy đ ịnh một số t ính trạng quan trọng của plasmid, đ ó là:

- Plasmid F có thể tự nhân bản;

- Tế bào F+ có thể tổng hợp yếu tố tiếp hợp (pilus) t rên bề mặ t t ế b à o . Các y ế u t ố t iếp hợp có dạng h ình như một ống nhỏ (có bản chấ t là protein) cho p h é p các t ế b à o ¥*

t iếp n ố i vớ i các t ế bào khác (sự t i ếp hợp).

- Khi 2 loại tế bào tiếp hợp, yếu tố F được nhân bản và plasmid F m ớ i được nhân bản sẽ chuyển từ t ế bào F* sang t ế bào F . Trong q u á t r ình đ ó , t ế b à o F* l u ô n bảo tồn được yếu t ố F. Q u á t r ình t iếp hợp xảy ra nhanh c h ó n g , do vậy plasmid F c ó t h ể lan rộng ra các t ế bào khác trong quần thể .

- Các tế bào F+ bị ức chế tiếp hợp với nhau. Do đ ó , y ế u t ố F k h ô n g được chuyển từ t ế bào F + sang t ế bào F*

- Đô i kh i t ế bào F mang trong genom của n ó mộ t hoặc vài t i ể u phần có k h ả n ă n g d i chuyển g ọ i là các trình tự cài xen ( g ọ i tắ t là phần tử IS - insertion sequence). C á c phần tử IS này là các t iểu phần dịch chuyển của A D N (mobile segment), n ó c ó t h ể d i chuyển từ vị trí này sang vị trí khác bên trong genom của t ế b à o chủ, hoặc từ n h i ễ m sắc thể

98

(NST) này , plasmid này sang NST hoặc plasmid k h á c . Sự t ồ n t ạ i của phần từ IS ở trong plasmid hoặc NST cho p h é p tạo ra các v ị trí ở đ ó k h ả n ă n g xảy ra trao đ ổ i c h é o giữa các đ o ạ n tương đổng (homologous). N h ờ vậy, plasmid A D N c ó thể cài vào NST của v i khuẩn.

K h i xảy ra sự cài đặ t yếu t ố F vào NST, y ế u t ố F c ó thể vận chuyển các gen từ NST của t ế bào chủ sang t ế bào nhận, kế t quả là tạo ra sự chuyển gen kép , các gen của t ế bào

chủ cộng vớ i y ế u t ố F được chuyển sang t ế bào nhận.

Trên thực tế , h i ện tượng y ế u t ố F ghép vào NST ch ỉ xảy ra ở m ộ t tỷ l ệ nhỏ t ế bào

trong quần thể v i khuẩn mang y ế u t ố F. Số ít t ế bào này c ó t hể c ó k h ả n ăng chuyển các allen của NST sang các d ò n g v i khuẩn khác , n g ư ờ i ta c ó thể nhận b iế t được h i ện tượng này và nhờ vậy đã phát h i ện ra h i ệ n tượng tái tổ hợp gen ở v i khuẩn và sự chuyển gen trong q u á tr ình t iếp hợp. N g ư ờ i ta c ó thể p h â n l ập được các t ế b à o ít ỏi trong quần thể có yếu t ố F cài trong NST của t ế b à o và n h â n các t ế bào n à y lên thành Ì quần thể đồng nhấ t có F trong NST. Trong d ò n g t ế bào này , m ỗ i l ầ n t i ếp hợp t ế b à o đ ề u x ả y ra sự chuyển allels của NST c ù n g v ớ i y ế u t ố F sang t ế bào nhận và do đ ó tần suất tái tổ hợp gen ở dòng này cao hơn so v ớ i các quần thể ban đ ầ u . V ì vậy , n g ư ờ i ta g ọ i các d ò n g trong đó yếu t ố F được cài trong NST của v i khuẩn là d ò n g có tần suất tái tổ hợp cao ( H ử - high ữequency o f recombination) đ ể phân biệt c h ú n g v ớ i các quần thể F* thông thường trong đó chỉ có mộ t vài t ế bào là H ử . D ò n g HÍT rấ t h i ệu quả trong việc chuyển các gen markers của NST.

- Y ế u t ố F đã được cài xen vào NST đô i k h i l ạ i tách k h ỏ i NST của d ò n g HÍT và trở nên các plasmid độc lập trong t ế bào chấ t đổng thờ i mang theo n ó là mộ t vài NST của t ế

bào chủ. K h i đ ó plasmid F này được g ọ i là F b i ến t ính (modif ied F) , k ý h i ệu là F . T h ô n g qua t iếp hợp của v i khuẩn, y ế u t ố F được chuyển sang các t ế bào F . N h ư vậy , t ế bào

nhận có thể đồng thờ i mang hai bản copy của cùng một gen, mộ t bản copy ở trong NST của v i khuẩn và mộ t bản copy ở trong y ế u t ố F m à n ó m ớ i nhận được.

N h ư phân t ích ở t rên c h ú n g ta thấy rằng các cơ thể sống, dù là rấ t đơn g iản như các vi khuẩn đã mang trong n ó những k h ả n ăng k ỳ d i ệu :

Một là: sự t i ếp hợp giữa 2 t ế bào hoặc 2 cơ thể sống trong đ ó x ẩ y ra sự trao đ ổ i vật l i ệu d i t ruyền.

Hai là: t ính l inh hoạt và k h ả n ăng cài xen, ghép n ố i , tái tổ hợp, d i chuyển của vật l i ệu d i t ruyền, trong đ ó đặc t ính của y ế u t ố F là mộ t thể h i ện rõ nét . Đ ó là yếu t ố quan trọng của đa dạng sinh học trong t i ến hoa.

4.1.2. Siêu vi khuẩn X (Phage lambda)

Siêu v i khuẩn X (SVK X) có thể mang bên trong vỏ protein của n ó mộ t phân tử A D N

kích thước khoảng 50kb. Đây chính là genom của S V K X. Đ o ạ n giữa của sợi A D N của

S V K X là đoạn k h ô n g nhấ t thiết phải có đ ố i v ớ i tái bản và tái tổ hợp của S V K này . Do vậy, n g ư ờ i ta có thể d ù n g enzym cắt g iớ i hạn để cắt bỏ đoạn giữa này đi và thay vào đ ó một phân tử A D N l ạ có kích thước khoảng 10-15 kb v ớ i những t ính trạng d i t ruyền xác

đ ịnh. K ế t quả tạo ra A D N (genom) tái tổ hợp ở S V K này .

99

Các siêu v i khuẩn được tạo ra theo cách ư ê n c ó t hể sẩn sàng gây l ây n h i ễ m ở VI khuẩn, từ đ ó siêu v i khuẩn mang genom tái tổ hợp được sinh sản gấp nh i ều l ầ n .

4.1.3. Các plasmỉd dùng trong chuyển gen

Ở v i khuẩn, plasmid là mộ t sợi A D N mạch vòng c ó k ích thước nhỏ h ơ n nh i ều so v ớ i A D N n h i ễ m sắc thể của v i khuẩn. Plasmid có thể được n h â n bản m ộ t c á c h độc l ập k h ô n g phụ thuộc vào quá t r ình nhân đô i của n h i ễ m sắc thể . Tuy nh iên , số lượng t iêu bản plasmid trong quần thể v i khuẩn l ạ i hoàn toàn phụ thuộc vào q u á t r ình sinh sản của v i khuẩn. N h ư n g sự phân b ố của plasmid trong quần thể t ế b à o của m ỗ i loà i là k h á ngầu nhiên . M ộ t số t ế bào có thể mang plasmid, m ộ t số k h ô n g c ó , v í d ụ n h ư t rường hợp plasmid F ở E. co l i . Plasmid được sử dụng theo các cách thức k h á c nhau đ ể g h é p v ớ i A D N (các gen) của cơ thể cho (donor) g iúp cho việc n h â n d ò n g A D N n à y và n g h i ê n cứu chức nâng của nó .

M ộ t trong các đặc t rưng quan t rọng của plasmid ở v i k h u ẩ n là m ộ t số c á c plasmid mang các gen k h á n g k h á n g sinh. Trong thờ i k ỳ m ở đ ầ u của k ỹ thuật gen, c á c plasmid mang gen k h á n g k h á n g sinh đã được sự dụng nh iều hơn cả trong k ỹ thuật gen b ở i gen k h á n g k h á n g sinh trong plasmid cho phép n g ư ờ i ta d ễ d à n g tuyển chọn c á c t ế bào

chuyển gen mang gen k h á n g hoặc các plasmid tái tổ hợp gen.

Plasmid có thể tự n h â n bản trong t ế bào v i khuẩn , trong m ỗ i t ế b à o c ó t h ể c ó nhiều

phiên bản plasmid. Đ ô i k h i m ộ t t ế bào có thể mang vài t r ă m plasmid. N h ờ vậy , plasmid thường được d ù n g để g h é p các A D N l ạ (các gen quan t â m ) của cơ t h ể cho và sau đó nhân các A D N này lên hàng t r i ệu l ầ n ( g ọ i là n h â n bản c lone -ADN) .

M ộ t số plasmid tự nh iên đã được các n h à sinh học p h â n tử t h iế t k ế l ạ i và t rở nên các vector rấ t th ích hợp cho ngh iên cứu chuyển gen.

M ộ t số các plasmid sử dụng nh iều trong chuyển gen:

Plasmid pBR232 c ó cấu t rúc đơn g iản, đồng thờ i mang hai gen k h á n g k h á n g sinh

đ ó là Tét® và Amp®. M ỗ i gen đ ề u c ó chứa m ộ t đ i ể m nhận b iế t hoặc đ i ể m p h â n cắt của

một enzym cắt g iớ i hạn nhấ t đ ịnh. M ộ t gen l ạ có thể d ễ d à n g cài vào trong gen Tét® ở đ i ể m phân cắt l àm cho gen này bị đ ộ t b i ến .

Tuy theo enzym cắt m à ta sử dụng, v ị trí cài của gen l ạ vào plasmid c ó thể khác nhau. K ế t quả các t ế bào v i khuẩn k h á n g k h á n g sinh Tetracycline bị đ ộ t b i ế n t rở nên

cảm ứng vớ i kháng sinh này . Quần thể c ác v i khuẩn đ ộ t b iến ở gen Tét® được k ý h i ệ u là

Amp®Tet s (R = resistant, s = sensitive) là quần thể mang A D N tái tổ hợp.

Plasmid pUC: pUC plasmid có mang gen ch ỉ th ị m à u sắc g iúp ta có t h ể d ễ d àng

nhận biết các t ế bào mang plasmid này . Trong plasmid có chứa gen P-Galactosidase

{Lai). N g ư ờ i ta đã cài vào gen Laz m ộ t đoạn A D N ngắn g ọ i là polyl inker (đoạn đ a l iên

kết) hay còn g ọ i là đoạn có nh iều đ i ể m phân cắt của các enzym cắt g i ớ i hạn k h á c nhau.

Trên cơ sở đó , đã t ìm ra 10 l o ạ i enzym cắt khác nhau c ó k h ả n ăng cắt đ o ạ n polyl inker ở các đ i ể m nhận biết đặc thù r iêng cho m ỗ i enzym. Các đ i ể m p h â n cắt này rấ t thuận l ợ i

100

cho cài các A D N l ạ . Trong trường hợp không có cài đặ t gen l ạ , 2 t i ể u phần của protein

được m ã hoa bở i Lai sẽ liên kế t l ạ i tạo ra enzym /?-Galactosidase có chức n ă n g b ình thư­

ờng. Đ ể t hử hoạt t ính của enzym này n g ư ờ i ta sử dụng m ộ t chấ t g ọ i là X-Ga l . N ế u t h ê m

X-Ga l vào m ô i t rường trong đ ó enzym /Ỡ-Galactosidase hoạt hoa b ình thường, enzym

này sẽ p h â n cắt X-Ga l và chuyển n ó thành chấ t m à u xanh. Quần lạc t ế bào sẽ được nhuộm m à u xanh và d ễ dàng phân biệt v ớ i các t ế bào k h á c .

N ế u mộ t gen l ạ được cài vào đ o ạ n polylinker, cấu t rúc của enzym /?-Galactosidase

sẽ bị b iến đ ổ i , kế t quả enzym này mấ t k h ả n ă n g chuyển hoa X-Ga l thành chấ t màu .

Trong t rường hợp này quần lạc t ế bào mang gen l ạ (cài xen trong đ o ạ n polyl inker) sẽ

không có màu . Bằng cách này n g ư ờ i ta có thể chọn ra các quần lạc (colony) m à u trắng

kháng Ampicyl ine (Amp®) mang gen l ạ cho các ngh iên cứu t i ếp theo.

Các nhà khoa học cũng đã th iế t k ế các plasmid mang đồng thờ i gen đ ích (gen quan tâm) và gen chỉ th ị m à u gus đ ể chuyển vào cây trồng. Các m ô hoặc t ế b à o của cá thể nhận gen chuyển sẽ có m à u xanh, d ễ phân biệ t .

Các plasmid mang các đ o ạ n gen l ạ càng l ớ n sẽ càng k h ô n g bền vững. Các đoạn gen dài hơn 20 kb sẽ k h ô n g th ích hợp k h i nhân d ò n g bằng các plasmid vì chúng d ễ dàng tách k h ỏ i plasmid.

4.1.4. Cosmids

Cosmid là những vector được tạo ra nhờ lai g h é p A D N của S V K v ớ i plasmid A D N . Cosmid có thể được n h â n bản theo 2 cách: hoặc là sinh sản n h ư các plasmid hoặc sinh sản như S V K . Tuy nh i ên cosmid có thể mang theo m ộ t đ o ạ n A D N l ạ l ớ n gấp 3 l ầ n genom của SVK.

Q u á tr ình tạo m ộ t cosmid được d i ễ n ra theo tr ình tự sau: trước hết , n g ư ờ i ta cắt bỏ hầu hết A D N của genom S V K ch ỉ g i ữ l ạ i m ộ t đoạn ngắn g ọ i là cos site vì đoạn này cần cho sự tổ hợp tự nh iên của S V K . G h é p cos site v ớ i plasmid đ ể tạo ra m ộ t cosmid. T i ế p

theo dùng các enzym cắt g iớ i hạn có k h ả n ăng tạo ra các đầu đ ính tương đồng ở cosmid và đồng thờ i ở genom của cơ t hể cho thành các đoạn .

Chọn lọc các đ o ạ n A D N c ó k ích thước 35 - 45kb từ cơ thể cho đ ể ghép n ố i v ớ i cosmid A D N nhờ sự trợ g iúp của enzym ligase. Cosmid tái tổ hợp được g h é p v ớ i các t iểu phần khác của siêu v i khuẩn đ ể tạo ra mộ t siêu v i khuẩn tái tổ hợp c ó k h ả n ăng nhân bản t iếp trong E. co l i .

4.1.5. Siêu vi khuẩn đơn sợi

M ộ t siêu v i khuẩn c ó genom ch ỉ là mộ t A D N đơn sợi được g ọ i là s iêu v i khuẩn đơn sợi. Trong quá t r ình lây bệnh ở v i khuẩn, sợi đơn A D N được chuyển hoa thành sợi A D N xoắn k é p giống n h ư A D N genom của các cơ thể sống khác và c ó k h ả n ăng n h â n bản bình thường n h ư các siêu v i khuẩn khác .

l o i

4.2. C Á C E N Z Y M T H A M G I A V À O Q U Á T R Ì N H A D N T Á I T ổ H Ợ P

Các enzym tham gia vào các quá tr ình trao đ ổ i chấ t của A D N c ó ý nghĩa rấ t quan trọng đ ố i vớ i kỹ thuật d i t ruyền. Các enzym này được thương m ạ i hoa và được g ọ i la bọ kít các enzym của sinh học phân tử. Bộ kít này chia làm ba n h ó m cơ bản sau:

- Các enzym cắt g iớ i hạn đặc thù của A D N .

- Ligase và kinase.

- A D N - polymerase và A R N - polymerase

4.2.1. Các enzym cát giới hạn đặc thù của ADN

N ă m 1962, Wemer Arber và cộng sự đã xác đ ịnh được m ộ t enzym n ộ i bào (endonuclease) có khả năng phân cắt A D N của virus gây bệnh ở v i k h u ẩ n n h ư n g k h ô n g phân cắt các A D N của ký chủ.

Đ ế n n ă m 1970, Hamiton và Smith đã tách chiết được enzym cắt g i ớ i hạn ở Haemophilus infỉuenzae và xác đ ịnh được rằng enzym này ch ỉ cắ t A D N ở đ o ạ n c ó trình tự nucleotid đặc thù.

H i ệ n nay, n g ư ờ i ta đã phát h iện được khoảng 1200 các enzym cắt k h á c nhau, trong đ ó khoảng 100 enzym đã được thương m ạ i hoa. Các enzym cắt đã trở t h à n h m ộ t phương t i ện k h ô n g thể th iếu của các kỹ thuật sinh học phân tử:

- Phân cắt A D N và tạo ra các phân đoạn A D N , ở giai đ o ạ n c ó t r ình tự nucleotid đặc thù ở tấ t cả các cơ thể sống.

- Sử dụng để thiết k ế các vectơ chuyển gen.

Các enzym n ộ i bào đ ó n g vai t rò quan trọng trong bảo v ệ v i k h u ẩ n trước sự tấn công của các siêu v i khuẩn. K h i A D N của siêu v i khuẩn t h â m nhập vào t ế b à o v i khuẩn, chúng bị enzym cắt n ộ i bào của v i khuẩn p h â n huy, do vậy , v i khuẩn t r ánh b ị nh iễm bệnh. Các nhà khoa học cũng phát h i ện thấy rằng A D N của các v i k h u ẩ n n à y c ó khả năng " m i ễ n dịch" đ ố i v ớ i các enzym n ộ i bào của ch ính n ó . K h ả n ă n g " m i ễ n d ịch" này có được là do quá t r ình methyl hoa các p h â n tử A D N của v i khuẩn . Các A D N được methyl hoa của v i khuẩn sẽ k h ô n g bị endonuclease phân huy.

K h ả năng " m i ễ n dịch" của v i khuẩn l iên quan v ớ i các hoạt t ính d ư ớ i đ â y của enzym:

- Enzym cắt g i ớ i hạn (restriction endonuclease) cắt A D N sợi k é p ở c ác đ i ể m c ó trình tự đặc thù. Đ i ể m đặc thù t rên A D N là m ộ t đ o ạ n t r ình tự ngắn, x á c đ ịnh của các nucleotid.

- K h i enzym A D N - methylase l àm methyl hoa các bazơ ở ch ính các đ i ể m đặc thù đ ó trong hệ gen của t ế bào chủ, enzym cắt g iớ i hạn (restriction endonuclease) sẽ k h ô n g

thể nhận b iết đ i ể m đặc thù và do vậy sẽ k h ô n g cắt A D N ở các đ i ể m đã được methyl hoa.

Dựa trên sự khác biệt của các enzym cắt ở v i khuẩn n g ư ờ i ta chia ra m ộ t số k i ể u enzym khác nhau. V í dụ , k i ể u l i của enzym cắt g iớ i hạn được sử dụng trong d i t ruyền

p h â n tử bở i c h ú n g có thể nhận b iế t và p h â n cắt A D N in vi t ro trong đ o ạ n đặc thù c ó từ 4-8 nucleotid.

N g ư ờ i ta có thể cắ t m ộ t p h â n tử A D N bấ t k ỳ k h i p h â n tử đ ó c ó c á c đ o ạ n t r ì nh tự nucleot id đặc thù m à enzym cắ t c ó thể nhận b i ế t và k h i A D N k h ô n g b ị m e t h y l hoa

102

( A D N ở t ế b à o n h â n thực và plasmid A D N ở c á c chủng v i k h u ẩ n m ấ t k h ả n ă n g

me thy l hoa).

Sơ đồ 4.1. Sự cắt đặc hiệu của eniym cắt giới hạn

4.2.2. Ligase và kinase

Hai enzym này đóng vai trò quan trọng trong kỹ thuật A D N tái tổ hợp. A D N - ligase xúc tác hình thành liên kế t phosphodiester 5-3' giữa 2 nucleotid trong cùng một sợi trên phân tử A D N . K ế t quả nguyên tử C3 trên phân tử đường deoxyribose của một nucleotid sẽ

liên kết vớ i phân tử C5 trên phân tử đường của nucleotid t iếp theo qua phân tử phosphaíe .

Kinase là enzym làm phosphoryl hoa cơ chấ t bằng tạo l iên kế t đồng hoa trị giữa phosphate của A T P vớ i phân tử cơ chấ t .

4.2.3. ADN - polymerase và ARN - polymerase

Các enzym này tham gia vào quá trình sinh tổng hợp A D N và A R N v ớ i việc sử dụng một sợi A D N k h u ô n (template) và m ồ i (primer) A D N hoặc A R N . Trong kh i việc tổng hợp A R N có thể bắt đ ầ u hoàn toàn m ớ i .

Tổng hợp A D N và A R N bằng enzym trong đ iều k i ệ n i n vi tro có ý nghĩa quan trọng trong sinh học phân tử. V í dụ , nhân các tr ình tự A D N bằng phản ứng chuỗ i polymerase (PCR). Phản ứng PCR cần phải sử dụng A D N - polymerase bền v ớ i nhiệt đ ộ g ọ i là Taq A D N polymerase. Enzym này hoạt hoa t ố i ưu ở nhiệt đ ộ 7 5 ° c . Trong t rường hợp A D N được tổng hợp từ m A R N in vitro vớ i việc sử dụng enzym sao c h é p ngược (reverse transcriptase) sẽ được g ọ i là c A D N .

103

4.3. C Ô N G N G H Ệ A D N T Á I T ổ H Ợ P

4.3 .1 . T h ế n à o là m ộ t A D N t á i t ổ hợp

T ừ A D N tổng số được tách ra k h ỏ i một cơ thể sống, n g ư ờ i ta c ó thể cắ t A D N ra thành nhiều phân đoạn A D N k h á c nhau. Các phân đoạn tách r ờ i n à y c ó thể chứa mộ t hoặc vài gen.

Đ o ạ n A D N này có thể được ghép n ố i v ớ i mộ t A D N vector ( g ọ i là A D N mang), A D N vector mang theo n ó một đoạn A D N m ớ i g ọ i là A D N tái tổ hợp. A D N tái t ổ hợp kế t hợp trong n ó các phân đoạn A D N hoặc các gen c ó nguồn gốc k h á c nhau.

A D N tái tổ hợp hay là vector tái tổ hợp sau đ ó có thể được chuyển vào v i khuẩn. V i khuẩn mang gen mớ i này có thể sinh sản rấ t nhanh tạo thành một quần lạc (colony) - một tập hợp các t ế bào có nguồn gốc từ một t ế bào ban đầu - vớ i hàng t r iệu t ế bào mang gen.

M ộ t colony hay quần lạc t ế bào cùng mang các A D N tái tổ hợp g iống nhau g ọ i là d ò n g A D N . V ì từ A D N tổng số của mộ t t ế bào n g ư ờ i ta c ó thể cắt A D N t h à n h v ô số các phân đoạn A D N khác nhau (có thể lên hàng chục ngh ìn p h â n đ o ạ n A D N ) , do vậy sau k h i chuyển các đoạn gen này vào v i khuẩn thông qua các vector n g ư ờ i ta sẽ nhận được hàng loạt (vô số) các colony (dòng t ế bào) mang các gen k h á c nhau. Bước t i ếp theo là

chọn lọc các d ò n g t ế bào mang các gen quan t â m (gen đặc thù mang m ộ t t ính trạng d i t ruyền xác đ ịnh).

4.3.2. Ý nghĩa của việc tách các gen đặc thù

- Cần cho việc xác đ ịnh tr ình tự nucleotid của gen này .

- Sau k h i t r ình tự của gen đã được xác đ ịnh, c ăn cứ vào m ã d i t ruyền n g ư ờ i ta có thể xác đ ịnh được gen này m ã hoa sinh tổng hợp protein n à o hoặc b ê n trong gen n à y có mấy đoạn intron và v ị trí của intron bên trong gen. N h ờ vậy , x á c đ ịnh được chức n ă n g của gen thông qua việc t ìm ra protein n à o là sản phẩm của gen.

- So sánh t r ình tự A D N của các gen hoặc các al lel k h á c nhau của c ù n g m ộ t gen từ đó t ìm h iểu quá t r ình t i ế n hoa của gen.

- Chức n ăng của gen quan t â m c ó thể ngh i ên cứu bằng c á c h chuyển gen n à y vào t ế

bào hoặc cơ thể sống khác và ngh iên cứu sự thay đ ổ i của t ế b à o hay cơ t hể sống đ ó . N h ờ vậy gen nghiên cứu được b iểu h i ện ở cơ t hể được chuyển gen và chức n ă n g của gen được thể h iện .

4.3.3. Các bước tạo ADN tái tổ hợp

4.3.3.1. Tách chiết ADN

Bước Ì là tách A D N từ t ế b à o hoặc từ cơ thể sống quan t âm và A D N vector. Các phương pháp tách chiết A D N từ c ác nguồn khác nhau cũng k h á c nhau và đ ã được nh iều

tài l i ệ u m ô tả.

A D N tổng số có thể được tách ra từ nhân t ế bào của t ế b à o n h â n thực (eukaryote)

hoặc từ A D N của lục lạp hoặc ty thể , hoặc từ n h i ễ m sắc thể của t ế b à o t i ề n n h â n

(prokaryote). N h i ễ m sắc thể của t ế bào t i ền nhân là một phân tử A D N mạch v ò n g .

104

A D N vector có thể là plasmid mạch vòng của v i khuẩn hoặc là A D N của siêu v i khuẩn , ví d ụ A D N của siêu v i khuẩn X.

4.3.3.2. Phân cắt ADN

P h â n cắ t A D N được thực h i ệ n n h ờ c á c enzym cắ t g i ớ i hạn (restr ict ion enzym). Enzym cắ t g i ớ i hạn do v i k h u ẩ n tạo ra đ ể chống l ạ i sự x â m nhập của c á c s iêu v i khuẩn . C á c enzym cắ t hoạt động n h ư những chiếc k é o cắ t A D N của s iêu v i k h u ẩ n t h à n h n h i ề u đ o ạ n n h ỏ l à m cho n ó m ấ t k h ả n ă n g sinh sản t rong t ế b à o v i k h u ẩ n . Tuy nh iên , c á c enzym cắ t k h ô n g p h â n cắ t A D N ở c á c v ị t r í tuy t h í ch . C h ú n g ch ỉ p h â n cắ t A D N ở c ác v ù n g c ó t r ình tự nucleot id đặc thù m à thô i . D o v ậ y , A D N của c á c t ế b à o

sống từ đơn g i ản ( n h ư virus) đ ế n phức tạp n h ư t ế b à o n g ư ờ i đ ề u c ó chứa m ộ t số các t r ình tự A D N ngắn g ọ i là đ i ể m p h â n cắ t (restr ict ion - enzym target site). Các enzym cắt p h â n cắ t A D N ở c á c đ i ể m p h â n cắ t k h á c nhau tạo ra vô số c á c p h â n đ o ạ n A D N k h á c nhau. Các p h â n đ o ạ n n à y c ó thể được t á ch ra t h à n h những vệ t ( b ă n g ) đặc t rưng trong q u á t r ình đ i ệ n d i .

M ộ t phân tử A D N c ó thể có những đoạn t r ình tự nucleotid đặc thù m à ở t rên đoạn đó hai sợi A D N c ó t r ình tự nucleotid như nhau nhưng chạy ngược ch iều nhau. Những trình tự nucleotid đặc thù n h ư vậy được g ọ i là các palindrom. N h i ề u enzym cắt g iớ i hạn nhận b iết và cắt phân tử A D N ra thành các mảnh nhỏ t ạ i v i trí của palindrom.

V í dụ : Enzym cắt EcoRI (từ E.coli) có thể nhận b iế t cặp tr ình tự g ồ m 6 nucleotid ở bất k ỳ cơ thể sống n à o d ư ớ i đây :

5" - G A A T T C - 3 '

3' - C T T A A G - 5 '

Trình tự này g ọ i là palindrom, v ị trí cắt palindrom này của EcoRI n h ư sau:

5 ' - G A A T T C - 3 ' . _ ^ Tạo ra hai sợi có các đ ầ u đ ính sau

3" - CTTAAG-5'

5' - G A A T T C - 3' và

y _ C X T A - A - - • " G - 5'

Các điểm cắt như trên được gọi là các đầu dính bởi nó dễ dàng bắt cặp với các đoạn A D N khác có các đầu d ính tương đổng. K ế t quả 2 đoạn A D N sẽ g h é p n ố i v ớ i nhau và sự kết n ố i được thực h iện bở i các l iên kế t hydrogen giữa các nucleotid ở 2 sợi đ ố i xứng.

Enzym EcoRI được sử dụng đ ể cắt mộ t plasmid mạch vòng sẽ tạo ra sợi plasmid A D N thẳng v ớ i 2 đ ầ u d ính .

105

Hai đầu d ính này rấ t d ễ kế t n ố i vớ i một đoạn gen ( A D N ) có đ ầ u đ í n h tương đổng v ớ i nó được tách ra từ t ế bào n g ư ờ i hoặc từ bất ky cơ thể sống n à o k h á c . K ế t quả sẽ tạo ra một plasmid mang gen l ạ . Đ â y là một A D N tái tổ hợp.

Phương pháp tạo một plasmid A D N tái tổ hợp trong đ ó plasmid (vector) và sợi A D N ví dụ của n g ư ờ i , được cắt bở i cùng một enzym là EcoRI được m ô tả ở sơ đ ổ 4.2: A D N ngườ i có the tạo ra nhiều mảnh A D N khác nhau vớ i những đau d ính tương đồng v ớ i đầu dinh ở sợi plasmid. K ế t quả ta có thể thu được các plasmid tái tổ hợp k h á c nhau. Trong quá trình ghép n ố i hai sợi A D N , sự liên kế t giữa phân tử đường trên nucleotid n à y vớ i phân tử phosphate của nucleotid khác trên cùng một sợi của A D N tái tổ hợp c â n có sự xúc tác của một enzym đóng vai trò khâu n ố i g ọ i là ADN-l igase .

H i ệ n nay n g ư ờ i ta đã sản xuấ t thương m ạ i hàng t răm các enzym cắt k h á c nhau. M ỗ i enzym cắt nhận biết và cắt một trình tự A D N đặc thù trên sợi A D N (bảng 4.1).

Trong bảng 4 .1 , có thể d ễ dàng nhận b iết một số enzym cắt A D N k h ô n g tạo ra các đầu dính, tạ i vị trí cắt các enzym này sẽ tạo ra các phân đoạn A D N có đâu tù.

Tuy nhiên, các mảnh A D N đầu tù v ẫ n có thể ghép n ố i v ớ i các A D N k h á c để tạo ra các A D N tái tổ hợp.

V i ệ c cắt A D N thành các mảnh nhỏ có thể thực h iện được bằng p h ư ơ n g p h á p cơ g iớ i , trong đó dung dịch A D N được lấc mạnh vớ i sự có mặ t của các mảnh cứng. M ộ t sợi A D N n h i ễ m sắc thể dài có thể bị đứt ra tạo thành các đoạn có đ ầ u tù. Các đ o ạ n này cũng

có thể được nhân lên thành dòng A D N .

Nhiêm sắc thể người Gen interíeron yj

NST và plasmid cùng bị cắt bởi một

enzym cắt V Ghép

^ nối

Gen Interíeron ghép với plasmid

Vi khuẩn hấp thụ plasmid + gen

interíeron

Ghép nôi

Gen interíeron Tách chiết interíeron

Vi khuẩn sinh sản tạo ra ^ các vi khuẩn mang gen mới

Nuôi cấy vi khuẩn sản xuất interteron

Sơ đồ 4.2. Tạo ADN tái tổ hợp sản xuất interỷeron người bằng vi khuẩn

106

G i ả i thích sơ đ ồ 4.2: Các bước tạo v i khuẩn mang gen in ter íe ron tái tổ hợp:

1. Cắt A D N của n h i ễ m sắc thể ngườ i có đoạn mang gen Interferon và A D N của Plasmid bằng cùng một enzym cắt tạo ra các phân đ o ạ n A D N có đầu d ính tương

đổng.

2. Đ o ạ n A D N mang gen Interferon tái tổ hợp v ớ i A D N của Plasmid tạo ra Plasmid tái tổ hợp-mang gen Interferon.

3. Chuyển plasmid tái tổ hợp vào t ế bào v i khuẩn để tạo d ò n g v i khuẩn mang gen

Interferon.

4. Nuô i cấy dòng v i khuẩn mang gen In ter íeron trong b ình nuôi và trong íe rmentor để sản xuấ t In ter íeron thương mai.

Bảng 4.1. Vị trí cắt ADN đặc trưng của một sô enzym giới hạn

T ê n enzym N g u ồ n gốc VỊ t r í cắ t đ ặ c t h ù của A D N

EcoRỈ Escherichia coli ị 5' - G - A - A - T - T - C -

- C - T - T - A - A - G - 5'

t

EcoRII E.coli ị 5' -G-C-C-T-G-G-C-

-C-G-G-A-C-C-G- 5' t

Hindlỉỉ H.influenzae ị 5' -A-A-G-C-T-T-

-T-T-C-G-A-A- 5' t

HaelII H. aegyptius ị 5' -G-G-C-C-

-C-C-G-G- 5'

t

Hpall H.paraỉnfluenzae ị 5' -C-C-G-G-

-G-G-C-C- 5' t

Pstỉ Provìdencia stuartii ị 5' -C-T-G-C-A-G-

-G-A-C-G-T-C- 5' t

107

Smal Serratia marcescens . ị 5' -C-C-C-G-G-G-

-G-G-G-C-C-C- 5'

í

Bám! Bacillus amyỉolique/aciens ị 5' -G-G-A-T-C-C-

-C-C-T-A-G-G- 5' t

Bglỉl B.globiggi ị 5' - A G - A - T - C - T -

- T - C - T - A - G - A - 5'

t

Hindll Haemophilus influenzae ị 5' -G-T-Py-Pu-A-C-

-C-A-Pu-Py-T-G- 5'

t

4.3.3.3. Ghép nối ADN

T h ô n g thường, A D N của cơ thể cho (donor D N A ) và ADN vector được p h â n cắt bở i

cùng một enzym thành nh iều mảnh A D N khác nhau c ó đ ầ u d ính . K h i các mảnh A D N

này được h ỗ n hợp v ớ i nhau trong m ộ t ống nghiệm, c h ú n g sẽ tạo ra các p h â n tử A D N tái

tổ hợp. Vì một enzym cắt c ó thể phân chia A D N của m ộ t cơ thể cho t hành rấ t nh iều các

đoạn khác nhau mang các t r ình tự A D N (hoặc các gen) k h á c nhau. K h i h ỗ n hợp 2 loạ i

A D N , trong dung dịch đã có nh iều sợi plasmid mang đ ầ u d ính tương đồng, n ê n n g ư ờ i ta

có thể thu nhận được rấ t nhiều các plasmid vector tá i tổ hợp mang các gen k h á c nhau

của cơ thể cho.

Chú ý rằng trong quá tr ình g h é p n ố i giữa các đ o ạ n A D N cho (donor) và A D N

plasmid cần có sự tham gia của enzym ligase. Enzym này đ ó n g vai t rò g h é p n ố i l iên kế t

đường - phosphate trên sợi A D N .

4.3.3.4. Nhân nhanh ADN tái tổ hợp

Plasmid A D N tái tổ hợp c ó thể được chuyển m ộ t c á c h k h á d ễ d à n g v à o v i k h u ẩ n .

Trong t ế bào v i khuẩn , các plasmid có thể được n h â n lên nh iều l ầ n . V ì p lasmid tái tổ

hợp mang các A D N của cơ t hể cho, n ê n các A D N n à y sẽ được n h â n bản lên n h i ề u l ầ n

c ù n g v ớ i sự n h â n bản của plasmid mang n ó . K ế t quả trong t ế b à o của v i k h u ẩ n c ó t h ể

có rấ t nh iều plasmid tái tổ hợp. N h ờ t ế b à o v i khuẩn c ó t h ể sinh sản theo cấp số n h â n ,

ch ỉ trong m ộ t thờ i gian ngắn từ m ộ t t ế bào mang plasmid tái t ổ hợp c ó t h ể tạo được

108

quần lạc g ồ m nh iều t ỷ ph iên bản giống nhau của A D N tái t ổ hợp mang đ o ạ n gen quan

t â m của cơ t hể cho.

H i ệ n nay có nhiều l o ạ i vector khác nhau được sử dụng để n h â n d ò n g gen, lựa chọn vector còn phụ thuộc vào kích thước của đ o ạ n A D N l ạ cần n h â n bản nhanh.

N h ư vậy n g ư ờ i ta c ó thể d ù n g các A D N vector có nguồn gốc k h á c nhau ( A D N vector có thể g ọ i là A D N mang hay A D N mang chuyển) để g h é p v ớ i các mảnh A D N mang các gen quan tâm khác nhau của cơ thể cho.

Đ ể t i ện cho việc thao tác chuyển gen, vector mang gen cần có mộ t số tiêu chuẩn chung là:

- K ích thước phải nhỏ .

- Có khả năng tự n h â n bản nh iều l ầ n trong t ế b à o và do đ ó n h â n gen quan t â m (gen lạ) lên nhiều lần .

- Có đ i ể m cắt g iớ i hạn t rên vector thích hợp cho g h é p n ố i v ớ i gen l ạ . N ế u một plasmid chi có mộ t đ i ể m cắt của enzym thì sẽ thuận l ợ i hơn vì ta có thể d ễ dàng hem trong nhận b iết vị trí g h é p n ố i của gen l ạ .

- D ễ dàng xác đ ịnh và phát h iện A D N tái tổ hợp.

4.4. NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CÁC GEN VÀ ÚNG DỤNG KỸ THUẬT ADN TÁI

T Ổ H Ợ P

Ngay sau k h i kỹ thuật A D N tái tổ hợp ra đ ờ i n g ư ờ i ta đã đ ầ u tư ứng dụng kỹ thuật này trong l ĩnh vực y tế . Trong công b ố của U y ban châu  u (1998) cho b iết : "l ĩnh vực sức khoe, thức ăn, k i ể m soát bệnh dịch và bệnh virus và t ế bào là n h à m á y " sẽ là các

hoạt động chìa khoa của khoa học và công nghệ. V i ệ c p h ò n g và chữa trị bệnh đã và sẽ

đóng vai trò thiế t y ế u trong cả i th iện chấ t lượng đ ờ i sống. G i ả m giá c h ă m sóc y t ế là rấ t quan trọng. N g ư ờ i ta t ính rằng Ì đồng E U R O chi cho t iêm chủng c ó thể t i ế t k i ệ m được 21-29 E U R O chữa bệnh. T h i t rường vacxin t h ế g iớ i vào khoảng 3 tỷ E U R / n ă m và tăng trưởng của th ị t rường này khoảng 9,7% n ă m . Các sản phẩm CNSH được d ự k i ế n t ăng 15% n ă m .

Các sản phẩm A D N tái tổ hợp có giá trị trong y t ế là erythropoietin (EPO),

granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), a- In te r íe ron ( a - IFN) , hormon sinh

trưởng n g ư ờ i (human growth hormone (hGH), insulin. . . Gần đây , khoa học đ ang sử dụng công nghệ A R N i để sản xuấ t A R N ngắn có k h ả năng đ iều trị bệnh H I V , k i ể m soát các bệnh virus, bệnh ung thư ở n g ư ờ i .

4.4.1. a-Interferon tái tổ hợp

In ter íe ron là các protein và glycoprotein tự nh iên do t ế b à o sản sinh ra k h i có tác nhân gây bệnh x â m nhập vào cơ thể n g ư ờ i .

a-Interferon có thể do t ế bào bạch cầu (leucocytes) hoặc lymphoblasts n g ư ờ i hoặc

do c ô n g nghệ A D N tái tổ hợp sản xuấ t ra. a-Interferon là protein 19 kDa được sử dụng

109

chữa bệnh đường sinh dục, v i êm gan B m ã n (chronic hepatitis B) , v i ê m gan k h ô n g A và k h ô n g B (non-A, non-B Hepatitis), kaposi sarcoma l iên quan v ớ i A I D . . .

Công nghệ sản xuất: Chủng E. Col i được chuyển gen v ớ i plasmid mang gen a - I F N

ngườ i . Các t ế bào E. Col i chuyển gen sản sinh ra Ct-IFN đã được thu hoạch sau lên men.

Sau đ ó CC-IFN được t inh c h ế v ớ i đ ộ sạch cao vớ i hoạt t ính đặc thù 200 t r i ệ u đ ơ n v ị /mg.

Sản phẩm có khả n ăng thương m ạ i và đạt nâng suất khoảng 15-25 mg/1 m ô i t rường . Gần

đây vớ i sử dụng bioreactor dung t ích 5 lít, trong đ ó m ô i t rường nuô i cấy dung t ích 3,5 lít

đã sản xuấ t được 14 g a - I F N , x ấ p x ỉ 4,0 g/lít. Đ ó là kế t quả á p dụng c ô n g nghệ n u ô i cấy

vớ i mật đ ộ t ế bào cao (high cell density cult ivation- HCDC) , nguồn cacbon duy nhấ t là

glucose và k ích thích sinh tổng hợp a - I F N bằng yếu t ố nhiệ t đ ộ .

4.4.2. Ỵ-Interferon tái tổ hợp người

In ter íeron là những sản phẩm tự vệ của cơ thể . Phản ứng của c ơ t h ể bắ t đ ầ u bằng

việc tổng hợp oe, p và y-Interferon. Ỵ-Interferon do t ế bào c ó nguồn gốc t ừ Thymus t i ế t ra

sau kh i cơ thể bị n h i ễ m bệnh v i khuẩn hay virus. Ỵ-IFN c ó hoạt t ính chống virus, v i

t rùng, ung thư và m i ễ n dịch. Đ â y là protein sử dụng đ ể chữa c á c bệnh v i ê m khớp , viêm

đường sinh dục, v iêm da, ung thư t ế bào thận, b iểu bì , chứng n h i ễ m hắc t ố ác t ính . Phạm

v i sử dụng y - I F N đ ang m ở rộng. T rên 200 gen được đ iều k h i ể n b ở i Ỵ-IFN.

4.4.3. Sản xuất bFGF (Basis FibrobIast Growth Factor)

N ă m 1980, Thomas phát h i ện chấ t bFGF c ó bản chấ t là m ộ t protein do hypophysis

( tuyến yên não) t i ế t ra. Sau đ ó hàng loạt các c ô n g t r ình n g h i ê n cứu về bFGF đ ã ra đờ i .

bFGF ở bò và bFGF n g ư ờ i ch ỉ k h á c nhau 2 axit amin. T ừ n ă m 1986, c á c p h ò n g thí

nghiệm ở nhiều nước t rên t h ế g i ớ i đ ã bắt đ ầ u n g h i ê n cứu k ỹ thuật A D N tái t ổ hợp đ ể sản

xuấ t bFGF d ù n g trong y học và m ỹ phẩm. Gen tổng hợp bFGF được t ách ra từ b ò hoặc

n g ư ờ i đã được th iế t k ế và chuyển vào E. co l i . C h ế p h ẩ m bFGF được sản xuấ t t rên n ồ i lên

men í e rmen to r v ớ i các chủng E. col i mang gen này . M ộ t í e r m e n t o r 50 lít c ó t h ể sản xuấ t

đủ số lượng bFGF cho cả nước Trung Quốc. bFGf là mộ t protein c ấ u t rúc k h á đ ơ n giản,

đơn sợi, sợi ngắn vớ i số lượng 146 axit amin, đơn gen, c ó hoạt t ính sinh học cao đ ố i vớ i

n g ư ờ i và động vật nên có ý nghĩa y học và thương m ạ i lớn . V ì là đơn gen m ã hoa bFGF

nên việc tạo ra sản phẩn A D N tái tổ hợp và chuyển gen vào E. co l i k h á đ ơ n g i ản .

4.4.4. Vacxin tái tổ hợp phòng viêm gan B - Hepatitis B virus

Hepatitis B là m ộ t bệnh dịch nguy h i ể m . Khoảng hai t ỷ n g ư ờ i h i ện nay đ ã n h i ễ m

virus này ở những thờ i đ i ể m n à o đ ó . Có bốn t r i ệu n g ư ờ i bị v i ê m gan cấp và t rên 350

t r iệu mang bệnh m ã n t ính t rên t h ế g i ớ i . Khoảng 15% số n g ư ờ i mang virus m ã n t ính

(chronic carriers) c ó thể bị xơ gan (c iưhos i s gan) và thường d ẫ n đ ế n ung thư. T ổ chức Y

n o

t ế t h ế g i ớ i ( W H O ) kêu g ọ i nhập vacxin cho t iêm chủng m ở rộng. N h ư n g m ộ t số nước

chưa l àm được vì g iá vacxin cao.

Vacx in tái tổ hợp đầu tiên được sản xuấ t n ă m 1986 và bán t rên th ị t rường sau đó .

Công nghệ sản xuất: M ộ t đoạn của A D N dà i 720 cặp nucleotid (HBS) đã được tách ra từ virus gây bệnh v iêm gan B (Hepatitis B virus) đã được gắn v ớ i plasmid PBS+. Đ o ạ n PBS/HBS đã được chọn lọc để thiết k ế vector b iểu h i ện . Đ o ạ n PBS/HBS đã được gắn vào p A O 815 vector n ấ m men có chứa gen Alcoho l oxidase c ả m ứng cao. Th iế t k ế thu được gọi là expression cassette (ÉC) - b ăng b iểu h iện . M ộ t số các nòi của chủng n ấ m men Pichia pastoris GS115 mang từ Ì đ ế n 8 đoạn lặp l ạ i (copy) của b ă n g b iểu h i ện É C đã được tạo ra và b iểu h i ện . N ấ m men chuyển HBS sẽ sản sinh ra k h á n g n g u y ê n HBsAg Lượng HBsAg sản sinh ra phụ thuộc vào số lượng copy của É C trong m ỗ i d ò n g . Đặc đ iểm của vacxin tái tổ hợp là:

Vacxin k h ô n g phải là virus v i êm gan đã bị l àm y ế u m à ch ỉ là mộ t đoạn gen của virus gây bệnh này. K h i t i êm chủng, gen HBS tạo ra từ các nò i n ấ m men tái tổ hợp có thể gây biểu h iện m i ễ n dịch v ớ i virus v iêm gan B. N ă n g suất thu được 50mg/l và sản phẩm vacxin có giá thành thấp. N g h i ê n cứu độc t ính của vacxin tái tổ hợp cho thấy đ ộ an toàn cao.

4.4.5. Kỹ thuật ADN tái tổ hợp sản xuất Kít chẩn đoán bệnh (virus HIV)

Bệnh suy g i ả m m i ễ n dịch (AIDS) do các virus gây ra, chủ y ế u là H I V I và H I V 2 . D ự tính có trên 30 t r i ệu n g ư ờ i bị n h i ễ m H I V và gần 6 t r i ệu n g ư ờ i đã mắc A I D S . Trên 90% số ngườ i bị n h i ễ m bệnh ở các nước đ ang phát t r iển . H i ệ n t ạ i , việc chẩn đ o á n H I V / A I D S gặp k h ó khăn do t h iếu phương t i ện chẩn đ o á n bệnh. H i ệ n nay nh iều công ty và các tổ chức quốc t ế có b á n kí t chẩn đoán đặc thù và rấ t nhạy bằng k ỹ thuật A D N tái tổ hợp để phân tích H I V Ì v à H I V 2 .

Chẩn đoán H I V trong m á u dựa trên k ỹ thuật ELISA t i ế n hành như sau: trong v i l ỗ (microvvells) của m á y E L I S A có chứa peptid tổng hợp của virus hoặc peptid tái tổ hợp của virus m à có k h ả n ă n g k ích th ích phản ứng tạo k h á n g thể (antibody) ở n g ư ờ i bệnh. K h i nhỏ huyết tương vào các v i l ỗ , k h á n g thể (antibody) có trong huyết tương bệnh nhân sẽ phản ứng v ớ i các peptid ở các v i l ỗ . Các k h á n g thể bị gắn v ớ i các peptid sẽ phản ứng vớ i anti-human immunoglobulins và bắt cặp v ớ i một chất chỉ th ị - horseradiss peroxidase (HRP). Mức đ ộ bắt cặp v ớ i HRP thể h iện đ ộ n h i ễ m H I V . Sử dụng các peptid của các loại H I V khác nhau l àm t ăng t ính đặc thù của chẩn đoán . B ộ kít g ồ m các peptid tạo ra bằng kỹ thuật A D N tái tổ hợp có đ ộ nhạy và t ính đặc thù cao.

4.4.6. Chẩn đoán virus viêm gan c (Hepatitis c virus - HCV)

N h i ê m hepatitis c virus thường liên quan tớ i xơ gan và thường đ ẫ n đ ế n ung thư gan. Khoảng 1/2 số n g ư ờ i n h i ễ m virus có thể bị v iêm gan m ã n . D ự đ o á n có 1-2% dân số t h ế

g iớ i bị v iêm n h i ễ m m ã n tính. Bên cạnh dạng m ã n t ính, có dạng v iêm cấp. Chẩn đoán bệnh virus H C V ở các nước đang phát t r iển gặp k h ó khăn do th iếu bộ kít chẩn đoán .

I U

Công nghệ: Chẩn đoán H C V dựa vào k ỹ thuật E L I S A : Peptit của virus H C V được tổng hợp nhờ kỹ thuật A D N tái tổ hợp. Phủ v i l ỗ (microvvells) bằng c á c peptid của virus. Các peptid này gây ra việc tổng hợp kháng thể antibody ở n g ư ờ i . K h á n g thể antibody ở huyết tương sẽ phản ứng v ớ i các peptid trong v i l ỗ . K h á n g n g u y ê n l iên k ế t đ ó l ạ i phản ứng t iếp vớ i anti-human immunoglobi l in và bắt cặp v ớ i chấ t ch ỉ th ị HRP. H R P l iên kế t

cho biết mức đ ộ n h i ễ m H C V . Phương p h á p có đ ộ nhạy và t ính đặc thù cao.

4.5. KỸ THUẬT ADN TÁI Tổ HỢP PHỤC vụ CHUYỂN GEN VÀO CÁC CÂY

T R Ồ N G

Đ ế n n ă m 2006, cây t rổng chuyển gen đã được sản xuấ t t hương m ạ i ở 22 quốc gia, đạt d iện tích toàn cầu 102 t r i ệu ha, t ăng 12 t r i ệu ha so v ớ i n ă m 2005. Đ ậ u tương , ngô, bông và c ả i dầu là 4 cây trồng b iến đ ổ i gen chủ lực, c h i ế m hầu hết d i ệ n t ích cây chuyển gen toàn cầu. Các t ính trạng quan trọng nhấ t ở các giống cây t rồng b i ế n đ ổ i g à n h i ệ n nay là kháng chấ t d iệ t cỏ và gen k h á n g sâu. Các giống mang gen k h á n g virus, n ấ m bệnh và các đ iều k i ệ n bấ t l ợ i k h á c m ớ i ch ỉ được trồng t rên d i ệ n hẹp.

4.6. QUAN ĐIỂM VỀ CÔNG NGHỆ GEN VÀ GIỐNG CÂY TRỔNG CHUYỂN GEN

V ớ i sự ra đ ờ i của c ô n g nghệ gen con n g ư ờ i đã ữở t hành đ ấ n g s á n g tạo m ớ i . M ặ c dù vậy, cho đến nay những sản phẩm do CNSH sáng tạo ra còn rấ t k h i ê m t ố n so v ớ i những sáng tạo của thiên nh iên . Theo V i ệ n sỹ Dobzhanski thì c ó đ ế n 1,0 t r i ệ u loài động vật và 265,5 nghìn loài thực vật khác nhau. M ỗ i loài l ạ i c ò n có vô số những dạng thức t ồ n tại đa dạng nữa. Th iên nhiên đã tạo ra một t h ế g iớ i sống cực k ỳ đ a dạng, trong đ ó c ó những sinh vật hữu ích và những sinh vật gây bệnh hạ i cho con n g ư ờ i và sinh g i ớ i , k ể cả những con n g ư ờ i là kẻ thù của loài n g ư ờ i . Những tác n h â n gây bệnh h ạ i cho m ô i t rường và con ngườ i còn đang t iếp tục h ình thành, ví dụ n h ư các virus m ớ i đ a n g t i ếp tục xuấ t hiện, trong đ ó virus m ớ i nguy h i ể m có thể được tổng hợp, được c ả i b iên ở ngay c á c p h ò n g thí nghiệm. Do vậy, chúng ta lưu ý những đ i ể m sau:

- Những sáng tạo m ớ i của CNSH sẽ ch ỉ là m ộ t bộ phận trong toàn bộ sáng tạo của thiên nhiên, mặc dù h i ệu quả của n ó chưa t hể lường trước được.

- Tài nguyên sinh vật t rên trái đấ t cần phả i được coi là gốc r ễ của sự t ồ n t ạ i loài ngườ i . Những sáng tạo của d i t ruyền học m ớ i cần được xem n h ư cành , n h ư ngọn chứ quyết k h ô n g thể là đ ố i lập v ớ i những sáng tạo trước đ ó của thiên nh iên .

- V i ệ c bảo t ồ n và kha i t h á c hợp lý tà i n g u y ê n sinh vậ t , t rong đ ó c ó c á c n g u ồ n gen hữu ích, phả i là nền tảng vững chắc cho sự n ở hoa k ế t t rá i của c ô n g n g h ệ gen, dựa t rên nền tảng đ ó th ì c á c c ơ t h ể chuyển gen m ớ i mang l ạ i h i ệ u q u ả k i n h t ế và s inh thá i

bền vững .

- Sản phẩm giống của CNSH có thể là những sinh vật hữu ích n h ư n g cũng c ó t hể là những sinh vật gây hạ i , phá vỡ cân bằng sinh thái , những sinh vật gây bệnh d ịch và là vũ

kh í sinh học.

112

- V ì t h ế quan đ i ể m của chúng ta đ ố i v ớ i công n g h ê gen sẽ k h ô n g phải ch ỉ là quan đ i ể m m ộ t ch iều , đơn thuần là dương t ính, m à phải là c á c h n h ì n toàn d i ệ n từ nh iều phía .

- Sự phủ nhận h o à n toàn đ ố i v ớ i các sản p h ẩ m của c ô n g nghệ gen đ a n g th ịnh hành

h i ện nay ở m ộ t số n g ư ờ i , nhấ t là ở châu A u sẽ là k h ô n g c ô n g b ăng , ph iến d i ện , c ó t ính nhấ t thò i .

- N h ư n g những quan đ i ể m thần thánh hoa vai t rò của c ô n g nghệ gen, coi thường công nghệ d i t ruyền t ruyền thống, bấ t chấp các n g h i ê n cứu về an toàn sinh học là k h ô n g thể chấp nhận được.

Con n g ư ờ i đ ang dần trở t hành "Đấng sáng tạo m ớ i " ra những dạng thức sống m ớ i .

V ớ i những thành tựu của k ỹ thuật d i t ruyền con n g u ô i sẽ vượt qua được mộ t số bệnh tật nan y và sẽ t rở n ê n khỏe mạnh hơn , sống lâu hơn , có tr í nhớ và k h ả n ă n g sáng tạo bền

vững hơn.

Trong t h ế k ỷ t hứ X X I n à y CNSH sẽ là m ộ t cơ h ộ i m ớ i đ ố i v ớ i sự phá t t r iển có t ính chất bùng n ổ của n ô n g nghiệp, y học và sự t i ến hoa của ch ính bản thân con n g ư ờ i nếu

như chúng ta t ránh được c á c mặ t t rái của n ó .

4.7. THƯ VIỆN ADN

N h ư trên ta đã p h â n t ích, m u ố n ngh iên cứu genom và chức n ă n g gen của mộ t cơ thể trước t iên nguô i ta phả i t ách A D N tổng số từ t ế bào . Sau đ ó , p h â n đ o ạ n và n h â n d ò n g các phân đoạn khác nhau của genom. K ế t quả n g ư ờ i ta thu được m ộ t bộ sưu tập lớn tấ t cả các dòng A D N của t ế b à o g ọ i là thư v i ệ n A D N ( A D N library)

4.7.1. Phân loại thư viện ADN

Phân loạ i thư b i ện A D N dựa t rên 2 đặc t rưng:

- L o ạ i vector n à o đ ã được sử dụng.

- Nguồn A D N .

Các vector n h â n d ò n g A D N (cloning vector) k h á c nhau mang các p h â n đoạn A D N khác nhau. Do vậy v iệc lựa chọn các vector phụ thuộc vào đ ộ l ớ n của genom. Plasmid và vector siêu v i khuẩn mang lượng A D N nhỏ , c h ú n g thích hợp để n h â n d ò n g các cơ t hể đơn g iản có genom nhỏ . Cosmid c ó k h ả n ă n g g h é p n ố i v ớ i c á c A D N l ớ n hơn , các vector như Y A C S và BACS có t h ể mang theo lượng A D N lớn nhấ t .

T h ư v i ệ n siêu v i khuẩn (phage l ibrary) là m ộ t dịch lỏng siêu v i khuẩn (suspension of phagas). T h ư v i ệ n plasmid hoặc thư v i ệ n cosmid là dịch lỏng v i khuẩn (suspension of bacteria) hoặc m ẫ u v i khuẩn nuôi cấy trong ống ngh iệm hoặc đĩa petri.

Thư viện cADN:

T h ư v i ệ n c A D N ( c A D N library) là tập hợp các phân tử c A D N được tổng hợp từ A R N thông t in v ớ i sự tham gia của enzym sao chép ngược (enzym này được tách ra từ retroviruses).

113

Bước mộ t A R N thông t in được sử dụng l àm sợi k h u ô n đ ể tổng hợp m ộ t A D N đơn sợi. Sau đ ó A D N đơn sợi này l ạ i trở thành k h u ô n cho tổng hợp A D N sợi k é p . V ì c A D N được tổng hợp từ m A R N nên c A D N k h ô n g có chứa các đ o ạ n A D N đ i ề u k h i ể n hoạt hoa gen và các introns. Đ i ề u đ ó có nghĩa rằng c A D N từ cơ thể t ế b à o n h â n thực c ó k h ả n ă n g tổng hợp protein trong t ế bào v i khuẩn.

T h ư v i ện c A D N chỉ g ồ m các gen được b iểu h i ện trong q u á t r ình d ịch m ã từ A D N thành m A R N . m A R N c ó thể chỉ được tổng hợp ở các t ế bào , cơ quan hoặc m ô nhấ t đ ịnh,

ở thờ i đ i ể m xác đ ịnh.

T h ư v i ện này sẽ k h ô n g chứa các gen đ iều k h i ể n hoặc c á c t r ình tự m ã hoa các

introns.

Thư viện genomic:

T h ư v i ệ n genomic chứa tấ t cả các phân đoạn của genom, thư v i ệ n n à y sẽ l ớ n hơn so

v ớ i thư v i ệ n c A D N

V í dụ : T h ư v i ệ n genom có thể được tạo ra bằng n h â n d ò n g gen b ở i s iêu v i khuẩn X

như sau:

- Genom của t ế bào và genom của siêu v i khuẩn được cắt đ o ạ n b ở i c á c enzym cắt và tạo ra vô số các đoạn phân cắt A D N k h á c nhau của genom.

- Các đoạn phân cắt của A D N genom được g h é p n ố i (hay c ó thể g ọ i là la i ) v ớ i A D N

của siêu v i khuẩn có đ ầ u d ính tương đồng nhờ enzym ligase tạo t hành v ô số c á c A D N siêu v i khuẩn lai hay là các vectors mang các đ o ạ n A D N k h á c nhau của genom.

- Các vector (siêu v i khuẩn lai) mang genomic A D N được lây n h i ễ m v à o quần thể vi khuẩn. M ỗ i v i khuẩn sẽ t i ếp nhận mộ t siêu v i khuẩn la i . K ế t quả genom la i của siêu vi khuẩn được nhân bản lên nh iều l ầ n . M ỗ i m ộ t khuẩn lạc v i k h u ẩ n sẽ b ị l ây n h i ễ m bở i Ì siêu v i khuẩn, tạo thành vô số các khuẩn lạc (clones), trong đ ó m ỗ i khuẩn lạc mang theo

Ì d ò n g siêu v i khuẩn la i (mang m ộ t p h â n đ o ạ n của A D N ) đ ã được n h â n bản nh iều lần .

- Tập hợp tấ t cả các quần lạc v i khuẩn mang các d ò n g s iêu v i khuẩn la i k h á c nhau-m ỗ i d ò n g mang theo Ì đ o ạ n A D N genom của t ế bào , tạo t hành tập hợp tấ t cả các dòng siêu v i khuẩn lai mang các đ o ạ n genomic A D N của t ế b à o được g ọ i là m ộ t thư v iện

genomic của t ế bào .

4.7.2. Phương pháp phát hiện dòng mang gen quan tâm

- Chuẩn bị sẵn mộ t đoạn A D N hoặc A R N đã được b iế t là có quan h ệ v ớ i gen quan tâm (gọ i là A D N m ồ i hoặc A R N m ồ i ) .

- Tập hợp siêu v i khuẩn la i được chuyển lên m à n g lọc nitrocellulose và l à m cho protein vỏ của các siêu v i khuẩn bị hoa tan và bị rửa sạch chỉ còn l ạ i A D N lai t rên m à n g

lọc.

- L à m cho các sợi A D N k é p m ở xoắn và thu nhận các A D N đơn sợi ( tách c á c A D N k é p thành các A D N đơn sợi), A D N lai đom sợi này được b á m d ính vào m à n g í i l ter lọc .

114

- M à n g lọc này được nuôi ủ trong dung dịch chứa m ộ t đ o ạ n m ồ i đã được đ á n h dấu

bở i chấ t p h ó n g xạ hoặc chấ t phát quang do nhuộm m à u í l uo re scence (đoạn m ồ i này là

c A D N được n h â n lên từ m ộ t m A R N thông t in) .

- Đ o ạ n m ồ i sẽ bắt cặp hoặc lai v ớ i bấ t k ỳ đoạn A D N n à o trong số các A D N của thư

v iện genom m à c ó t r ình tự tương đồng v ớ i n ó ở t rên m à n g lọc .

- Căn cứ vào vị t r í của A D N lai có p h ó n g xạ t rên m à n g để x ác đ ịnh d ò n g (khuẩn lạc)

mang gán đã bắt cặp v ớ i c A D N m ồ i , chọn lọc khuẩn lạc đ ó và n h â n lên để thu nhận

dòng siêu v i khuẩn mang gen xác đ ịnh mong muốn .

Vì thư v i ệ n genomic A D N có chứa rấ t nh iều (hàng t r ăm đ ế n hàng n g à n các đoạn

A D N khác nhau của t ế bào) . Do vậy , đ ể xác đ ịnh d ò n g mang gen quan t â m trong thư

viện ngườ i ta phải sử dụng các đ o ạ n m ồ i đặc thù. C ó hai l o ạ i m ồ i : l o ạ i m ồ i nhận b iết

A D N và loạ i m ồ i nhận b iế t protein.

4.7.3. Mồi nhận biết ADN

Phương pháp này dựa t rên bản chấ t tự nh iên của m ộ t đoạn t r ình tự A D N đơn sợi cần

tìm k i ế m và ghép n ố i v ớ i mộ t đ o ạ n A D N đơn sợi k h á c có các t r ình tự tương đồng vớ i nó .

M ồ i A D N đơn sợi sẽ bắ t cặp v ớ i đoạn A D N đơn sợi tương đồng v ớ i n ó ở trong thư v i ệ n

genomic A D N . V ì đ o ạ n m ồ i đã được đ á n h dấu bở i chấ t p h ó n g xạ hoặc chấ t m à u phát

quang (Auorescence) n ê n n g ư ờ i ta c ó thể d ễ d àng phá t h i ện ra đ i ể m có phân tử lai t rên

màng như một đ i ể m có p h ó n g x ạ ở t rên autoratiogam.

4.7.4. Tạo ADN mồi (probe)

Nguồn A D N từ đ ó n g ư ờ i ta chọn l àm m ồ i để xác đ ịnh mộ t gen quan t âm có thể là:

- c A D N : c A D N được t á c h ch iế t từ m ô m à ở đ ó gen quan t â m b i ể u h i ệ n : V ì số

lượng m A R N trong m ô r ấ t n h i ề u , do vậy số lượng c A D N và số vector mang c á c

c A D N k h á c nhau cũng c ó t h ể đ a dạng. T u y n h i ê n , ở m ộ t số t ế b à o và m ô đặc thù của

cơ t hể , mộ t vài gen được t ă n g cường b i ể u h i ệ n và c h i ế m số lượng l ớ n m A R N t h ô n g

t in , ví dụ , m A R N sản p h ẩ m của gen P-Globin . D o v ậ y , m ộ t số t ế b à o được coi là

nguồn m A R N tố t nhấ t đ ể tạo c á c c A D N m ồ i t rong t ì m k i ế m c á c gen quan t â m trong

thư v i ệ n genom.

Trong t rường hợp sử dụng c A D N m ồ i đ ể xác đ ịnh mộ t gen trong h ệ gen ta ch ỉ cò thể

xác đ ịnh được v ù n g dịch m ã của gen quan t âm, trong k h i đ ó c A D N k h ô n g thể bắt cặp

vớ i các đ o ạ n đ iều k h i ể n hoặc các đoạn introns của gen này . Do vậy , ta cần t ìm k i ế m

thêm nguồn các A D N m ồ i khác .

- A D N m ồ i có nguồn gốc từ các gen tương đồng tách ra từ c ác cơ thể sống có h ọ

hàng gần vớ i đ ố i - t ư ợ n g nghiên cứu. V í dụ , mộ t gen n à o đ ó được nhân d ò n g từ

ascomycetes của n ấ m Neurospore có thể được sử dụng l àm m ồ i để xác đ ịnh mộ t gen

115

tương đổng ở n ấ m podospora. Phương p h á p này dựa t rên t ính lặp l ạ i hay t ính bảo thủ của

các tr ình tự A D N trong q u á t r ình t i ến hoa. Trong t rường hợp A D N m ồ i và A D N của gen

quan tâm k h ô n g hoàn toàn giống nhau, chúng ta v ẫ n c ó thể c ó các đ o ạ n t r ình tự tương

đồng và v ẫ n có thể lai ghép vớ i nhau.

- A D N m ồ i c ó thể được tạo ra k h i ta đã b iết protein (sản p h ẩ m của gen quan t â m ) và

protein đ ó đã được xác đ ịnh tr ình tự. Dựa trên h iểu b iế t về m ã d i t ruyền ta c ó t h ể dễ

dàng thiết k ế được t r ình tự A D N của gen m ã hoa protein đ ó . Tuy nh iên , m ộ t axi t amin

trong protein có thể tương ứng vớ i vài codon trong gen, do vậy ta c ó thể t h i ế t k ế được

một số tr ình tự A D N khác nhau c ó khả năng m ã hoa cấu t rúc của protein n à y . Đ ể tránh

k h ó khăn này, n g ư ờ i ta tách tr ình tự protein thành những đ o ạ n ngấn h ơ n từ đ ó xác định

trình tự các đoạn m ồ i vớ i số lượng nucleotid nhỏ g ọ i là các oligonucleotids. T ừ m ộ t đoạn

peptid có thể tạo ra mộ t bộ oligonucleotids g ồ m những t r ình tự nucleotid dao động

nhưng có khả n ăng tạo ra cùng mộ t peptid.

4.8. Dự ÁN GENOM NGƯỜI

Dự án Genom được nhiều nước và tổ chức quốc tế tham gia thực hiện. Ở Mỹ Dự án

Genom do B ộ N ă n g lượng (Department o f Energy) và V i ệ n quốc gia v ề sức khoe

(National Insititute o f Healths) đ iều phố i thực h iện .

D ự án bắt đầu t r iển khai từ n ă m 1990, k é o dà i 13 n ă m k ế t t húc vào n ă m 2003 sớm

hơn 2 n ă m so vớ i dự k i ế n ban đầu là 15 n ă m nhờ c ác nguồn đ ầ u tư và t i ế n b ộ m ớ i về kỹ

thuật.

M ụ c t i êu của d ự á n

- Xác đ ịnh tấ t cả các gen của n g ư ờ i v ớ i số lượng khoảng 30.000 gen.

- X á c đ ịnh tr ình tự nucleotids của khoảng 3 t ỷ cặp bazơ trong A D N n g ư ờ i .

- Lưu trữ t hông t in trong d ữ l i ệ u .

- Cả i t i ến các phương p h á p phân t ích d ữ l i ệ u

- Chuyển giao các công nghệ l iên quan cho các c ô n g ty tư nhân .

- G i ả i quyết các v ấ n đề đặ t ra như các n g u y ê n tắc đạo đức, luật p h á p , c á c v ấ n đề xã

h ộ i khác .

4.9. CÁC Dự ÁN NGHIÊN cứu CHỨC NĂNG HỆ GEN (FUNCTIONAL GENOMICS)

VÀ SO S Á N H C H Ứ C N Ă N G H Ệ G E N ( C O M P A R A T I V E G E N O M I C S )

- Tạo ra một tập hợp các d ò n g C-ADN của một cơ thể sống từ đ ó xác đ ịnh t r ình tự

của gen và ngh iên cứu các protein - sản phẩm của gen.

116

- X â y dựng các phương p h á p ngh iên cứu chức n ă n g của các t r ình tự k h ô n g m ã hoa

protein.

- Phá t t r iển c ô n g nghệ khác nhau phân t ích b iểu h i ện gen.

- Cả i th iện các phương pháp gây hàng loạt các đ ộ t b i ến genom, làn m ấ t chức n ăng ,

thay đ ổ i chức n ăng của gen hoặc hệ gen, từ đ ó xác đ ịnh chức n â n g của gen.

- Các công nghệ phân tích protein: đặc biệt là sự ra đ ờ i của th iế t bị proteomics cho

phép phân t ích và phân biệt hàng ngh ìn protein cùng mộ t lúc .

- So sánh genom nguô i v ớ i genom t inh t inh, kh ỉ . . . so sánh genom của n g ư ờ i bệnh v ớ i

ngườ i bình thường, hoặc của n g ư ờ i có những đặc t ính siêu v iệ t (trí nhớ , t u ổ i t họ , đ ộ

thông minh siêu việt . . . ) v ớ i n g ư ờ i b ình thường hoặc v ớ i n g ư ờ i có các đặc t ính đ ố i lập.

Chức năng của các gen và các vùng A D N ở n g ư ờ i có thể được l à m sáng tỏ nhờ ngh iên

cứu t ính đồng nhấ t và sự k h á c biệ t trong hệ gen của các loài sinh vật k h á c nhau so v ớ i

con ngườ i .

- Đ ế n nay sự so sánh này c ó thể thực h i ện được nhờ các n ỗ lực phi thường của nhiều

phòng thí ngh iệm t rên toàn cầu trong việc đọc toàn bộ t r ình tự nucleotid của các hệ

genom sau: v i khuẩn E.coỉi, n ấ m men Saccharomyces cerevisỉae, giun t ròn

Cacnorhabditis elegans, r u ồ i dấm, chuột th í ngh iệm và nh iều cơ t hể sống khác . Sự so

sánh này tạo ra những đ ộ t phá trong ngh iên cứu t i ế n hoa và các con đường trao đ ổ i chất .

117

Chương 5

V I R U S V À C Ô N G N G H Ệ S I N H H Ọ C V I R U S

Virus là một ký sinh phổ b iến ở hầu hết các cơ thể sống từ đơn g iản đ ế n phức tạp. M ọ i cơ thể sống từ v i khuẩn đ ế n cây trồng, vật nuô i và con n g ư ờ i đ ề u c ó t hể b ị l ấ n c ô n g bở i virus. Virus gây ra rấ t nh iều bệnh dịch nguy h i ể m n h ư bệnh l ở m ồ m long m ó n g , bệnh bò đ iên, bệnh c ú m H 5 N 1 , bệnh SARS, bệnh H I V / A I D và nh iều bệnh k h á c . Virus còn là n g u y ê n nhân của một số bệnh t ruyền n h i ễ m nguy h i ể m n h ư virus epstein bar, virus bệnh v iêm gan B (Hepatitis B) , virus v i êm gan c (Hepatitis C). . . d ẫ n đ ế n ung thư.

Ngoài ra, do virus có khả năng cài genom của n ó vào genom của sinh vật chủ và chuyển tả i thông t in d i truyền từ cơ thể sống này sang cơ thể sống khác nên có thể gây ra nhiều biến

dị hay những dạng đột biến không mong muốn. Trong nhũng n ă m gần đây, vừus đã và đang là đ ố i tượng nghiên cứu quan trọng của nhiều lĩnh vực công nghệ sinh học, ư ơ n g số đó , một số virus đã được sử dụng làm vector phục vụ công tác chuyển gen.

5.1. LỊCH SỬ PHÁT HIỆN RA VIRUS

N g ư ờ i ta phá t h iện ra virus nhờ những ngh iên cứu t ìm k i ế m tác n h â n gây bệnh k h ả m lá ở cây thuốc lá. Bệnh này l àm cho cây còi cọc và m à u sắc ph iến lá b ị k h ả m . N ă m 1883, A . Mayer đã phát h iện thấy bệnh khảm thuốc lá là bệnh lây n h i ễ m và cho rằng tác nhân gây bệnh là một loài v i khuẩn rấ t nhỏ bé và k h ô n g thể nh ìn thấy bằng k í n h h i ể n v i . Ô n g ta đã thành công trong gây lây n h i ễ m bệnh n h â n tạo bằng c á c h phun dịch chiết của lá cây bị bệnh lên cây khoe. Quan sát chấ t dịch d ư ớ i k ính h i ể n v i A . Mayer đ ã k h ô n g quan sát thấy tác nhân gây bệnh.

Đ ế n cuố i những n ă m 1880, D . Ivanowsky, một nhà khoa học n g ư ờ i Nga cho rằng bệnh khảm lá thuốc lá gây ra bở i mộ t v i khuẩn rấ t nhỏ bé có k h ả n ăng l ọ t qua m à n g lọc vi khuẩn. Ô n g đã dùng m à n g lọc có khả năng l o ạ i trừ v i khuẩn để lọc chấ t ch iế t từ lá cây bệnh. D ịch chiết thu được qua m à n g lọc v i khuẩn v ẫ n có k h ả n ă n g gây bệnh và được ông g ọ i là độc tố sau lọc .

N ă m 1897 Martinus Beiferinck, một nhà sinh học H à Lan cho thấy bệnh gây ra bở i một cơ thể sống nhỏ và đơn giản hơn v i khuẩn, nhưng l ạ i có k h ả năng sinh sản. Cây khoe sau khi được phun dịch chiết từ cây bệnh đã bị n h i ễ m bệnh, chấ t dịch từ cây m ớ i n h i ễ m bệnh l ạ i có thể gây ra nh iễm bệnh cho các cây khác nữa. Th í nghiệm này đã được lặp l ạ i nhiều t h ế hệ và ngườ i ta thấy rằng tác nhân gây bệnh có thể sinh sản vì tác n h â n này đã không bị loãng hoặc yếu đi kh i chuyển từ cây nọ sang cây kia. Ô n g cũng cho biết :

- K h ô n g thể nuôi cấy tác nhân gây bệnh trên m ô i t rường dinh dưỡng n h â n tạo.

- Tác nhân gây bệnh k h ô n g bị g iết bằng cồn.

- Tác nhân gây bệnh chỉ sinh sản ở t rên cây chủ m à n ó lây n h i ễ m .

118

N ă m 1935, \Vendell M . Stanley, một nhà khoa học M ỹ đ ã kế t t inh được các hạt của tác n h â n gây bệnh m à n g à y nay n g ư ờ i ta g ọ i là virus k h ả m thuốc lá ( T M V - tobaco

mosaic virus).

Trong những n ă m 1950, T M V và các virus k h á c đã được quan sát thấy bằng k ính h iển v i đ iện tử, virus nhỏ nhấ t có đường k ính ch ỉ khoảng 20nm. Hạ t virus được cấu t rúc đơn g iản bở i mộ t sợi axit nucleic nằm trong một lớp vỏ bọc protein.

5.2. ĐẶC ĐIỂM CHUNG TRONG CÂU TRÚC CỦA VIRUS

Genom virus rấ t đơn g iản, có thể là mộ t sợi A D N kép , mộ t sợi A D N đơn , một sợi

A R N kép hoặc mộ t sợi A R N đơn . A D N của virus có thể là phân tử sợi thẳng hoặc sợi

vòng, trong đ ó có thể ch ỉ g ồ m 4 gen hoặc t ố i đa là vài t r ăm gen.

5.2.1. Vỏ bọc của virus (capsid và envelop)

Virus có thể có 2 lớp vỏ , lóp trong gọ i là vỏ capsid, lớp ngoài được gọ i là lớp bao envelop. Capsid là một lớp vỏ protein bọc bên ngoài genom của virus. Cấu trúc của vỏ capsid có thể đa dạng và được tạo bở i các t iểu phần nhỏ gọ i là capsomeres - các t iểu phần này có thể là một hoặc vài loại protein khác nhau. v ỏ envelop là lóp màng phủ ngoài vỏ capsid có vai trò giúp virus lây nh iễm t ế bào. Thành phần cơ bản của vỏ bọc là protein.

5.2.2. Sinh sản virus trong tế bào sinh vật chủ

Virus là một k ý sinh n ộ i bào bắt buộc, ch ỉ có k h ả n ăng b iểu h i ệ n và sinh sản bên trong t ế bào sống. M ỗ i virus có thể có m ộ t hoặc vài sinh vật chủ đặc thù:

- Các virus nhận b iến t ế bào chủ nhờ sự tương tác thuận giữa protein vỏ bên ngoà i của virus và một receptor đặc thù t rên bể mặ t của t ế bào chủ.

- M ộ t vài virus có k h ả năng ký sinh ở nhiều sinh vật chủ, có thể là vài loài sinh vật , ví dụ : virus c ú m gà (bird Au H5N1) và virus dạ i (rabies).

K h ả năng ký sinh của mộ t số virus mang t ính đặc h iệu cao:

- M ộ t vài virus ch ỉ c ó k h ả n ăng lây n h i ễ m ở mộ t loài: v í dụ virus lây n h i ễ m v i khuẩn E.coli.

- M ộ t vài virus ch ỉ có thể k ý sinh ở mộ t l o ạ i m ô ở m ộ t loài : virus gây cảm lạnh ở ngườ i chỉ có thể lây n h i ễ m các t ế bào ở phần trên của đường h ô hấp, virus A I D S ch ỉ có

thể bám vào các receptors đặc thù ở t ế bào bạch cầu.

Chu trình sinh sản và lây n h i ễ m của virus g ồ m 3 bước:

- Genom của virus t h â m nhập vào bên trong t ế bào chủ.

- Virus sử dụng các vật l i ệ u của t ế b à o chủ để nhân bản genom virus và sản xuấ t các protein vỏ virus (capsid và envelop).

- Tái tổ hợp ( lắp ráp) các phân tử nucleic axit (genorri) của virus và các t i ể u phần của vỏ virus (capsomers) để tạo ra các virus m ớ i .

119

5.2.3. C ơ c h ế n h i ễ m b ệ n h v i r u s

V í dụ : T- even phage sử dụng phần đuô i đ ể b á m vào t hành t ế b à o chủ và b ơ m A D N vào t ế bào chủ. K h i genom virus đã vào trong t ế b à o n ó l à m thay đ ổ i c á c c h ư ơ n g t r ình hoạt động của t ế bào chủ và bắt đ ầ u n h â n bản.

Có 3 cách nhãn genom virus:

- A D N - > A D N , nếu genom của virus là A D N sợi kép , A D N virus n h â n bản g iống như A D N của t ế bào , virus sử dụng A D N polymerase của t ế b à o chủ đ ể n h â n bản A D N của n ó .

- A R N - > A R N , t ế bào chủ k h ô n g có enzym đ ể n h â n bản A R N virus, đ a số A R N virus có chứa gen m ã hoa A R N replicase - mộ t enzym sử dụng A R N virus l à m k h u ô n để tổng hợp các A R N tương đổng.

- A R N - A D N - A R N , mộ t vài virus có k h ả n ă n g m ã hoa reverse transcriptase - một enzym tổng hợp A D N từ sợi k h u ô n A R N của virus.

Vỉrus sử dụng các vật liệu của tế bào chủ để sinh sản:

- Các gen của virus sử dụng các enzym, ribosome, t A R N , axit amin , A T P , các nucleotid và các yật l i ệ u k h á c của t ế bào chủ đ ể n h â n bản genom và sản xuấ t c á c protein vỏ vừus.

- Các t iểu phần của virus g ồ m axit nucleic và v ỏ virus được lắp r á p và tạo ra hàng t r ăm đ ế n hàng ngh ìn virus khác nhau phá v ỡ t ế b à o chủ và lây sang t ế b à o k h á c . Các t iểu phần của vừus có thể tự l áp r áp trong ống ngh iệm k h i t rộn A R N và c á c protein v ỏ vớ i nhau đ ể tạo ra m ộ t virus h o à n ch ỉnh.

ARN (genom của virus)

> f

ADN virus

Phiên mã Phiên mã genom

> V

mARN virus ARN của virus trong tế bào vật chủ để tạo ra virus mới

> f

ARN của virus trong tế bào vật chủ để tạo ra virus mới

> f V

Protein của virus > Virus mới

Sơ đồ 5.1. Nhân bản vìrus có genom là ARN trong tế bào vật chủ

120

5.2.4. C h u t r ì n h s inh sản của v i rus k ý s inh ở v i k h u ẩ n

Các virus k ý sinh ở v i khuẩn được g ọ i là bacteriophage, hay v i ế t gọn là phage, t iếng

V i ệ t g ọ i là thực khuẩn hay siêu v i khuẩn (SVK) . C ó 2 k i ể u chu t r ình sinh sản của SVK: lyt ic và lysogèn ic .

5.2.4.1. Chu trình hoại sinh (lytic)

V í dụ , chu tr ình lyt ic ở S V K T4 xảy ra g ồ m các giai đoạn sau:

- S V K T4 b á m vào m à n g t ế bào chủ: T4 nhận b iế t t ế bào chủ nhờ có sự tương đổng giữa protein t rên sợi đuô i của virus và repceptor đặc thù ở m à n g ngoà i của v i khuẩn E.coli.

- Genom thâm nhập vào t ế bào để l ạ i phần vỏ protein của T4 ở bên ngoà i t ế bào .

- Các hydrolytic enzym (enzym thúy phân) phân huy A D N của t ế bào chủ E.coli.

T ế bào chủ bắt đ ầ u sao m ã và phiên m ã genom của virus. M ộ t trong các enzym đầu tiên của virus là enzym phân huy A D N của t ế b à o chủ. A D N của S V K k h ô n g bị ảnh hưởng vì có chứa các cytosine đã b iến đ ổ i và vì vậy A D N virus k h ô n g ch ịu ảnh hưởng bở i enzym thúy phân A D N của t ế bào chủ.

- Virus sử dụng nucleotid (được phân huy từ t ế bào chủ) để n h â n bản genom virus.

- T ế bào chủ sản xuấ t 3 l oạ i protein vỏ và lắp ráp các protein đ ể tạo đuô i phage, sợi đuôi (tail fibers) và đ ầ u virus (polyhedral heads).

- Các t iểu phần của virus tự lắp ráp để tạo hạt virus hoàn ch ỉnh.

- Phân huy t ế bào chủ và g i ả i p h ó n g các hạt virus:

+ Genom của virus sản sinh các lysozyms phân g i ả i m à n g t ế b à o v i khuẩn .

+ Á p lực t h ẩ m thấu l à m phá vỡ t ế b à o và g i ả i p h ó n g ra h à n g t r ă m virus từ m ộ t t ế

bào chủ.

+ Các virus m ớ i có thể lây n h i ễ m các t ế bào chủ lân cận.

Chu k ỳ lyt ic ( lyt ic cycle) k é o dài 20 - 30 phút ở nhiệt đ ộ 3 7 ° c . Trong giai đoạn này mật độ quần thể T4 sẽ t ăng lên hàng t răm lần .

Cơ chế tự vệ của vi khuẩn

- V i khuẩn có thể thay đ ổ i receptor bằng mộ t độ t b iến , nhờ vậy virus k h ô n g thể nhận biết receptor để b á m và gây bệnh.

- Các enzym cắt g iớ i hạn của v i khuẩn nhận b iết và cắt các A D N l ạ , trong đ ó có các A D N của siêu v i khuẩn. Nhưng A D N của ch ính v i khuẩn c ó các thay đ ổ i hoa học do vậy không bị phân huy bở i các enzym cắt của ch ính n ó . Enzym cắt g i ớ i hạn là các enzym tự nhiên của v i khuẩn có khả năng cắt các A D N l ạ , xúc tác cắt A D N thành các mảnh nhỏ .

Trong chu kỳ hoại sinh, vi khuẩn và siêu vỉ khuẩn liên tục cùng tiến hoa

- H ầ u như các v i khuẩn có cơ c h ế chống siêu v i khuẩn c ó h iệu quả.

- Các virus cũng t i ến hoa theo hướng vượt qua các hệ thống tự vệ của t ế bào chủ.

- M ộ t số virus c ó các phương án cùng chung sống v ớ i t ế b à o chủ.

121

5.2.4.2. Chu kỳ tiêm sinh (Lysogenic cycle)

M ộ t số virus có thể cùng chung sống v ớ i t ế bào chủ bằng c á c h cà i genom của c h ú n g

vào genom của t ế bào . Sau k h i cài genom của m ì n h vào genom của t ế b à o chủ , sinh sản

vớ i t ế bào chủ nhưng virus k h ô n g hoạt động cho đ ế n k h i bắt đ ầ u chu k ỳ ly t i c . Các virus

như vậy được g ọ i là các temperate virus và chúng có 2 chu k ỳ sống: Lysogenic và ly t i c .

Phage X (E. Lederberg, 1951) là mộ t ví dụ . Chu k ỳ t i ề m sinh của phage X d i ễ n ra theo tr ình tự sau:

- Phage X gắn vào bề mặ t t ế bào v i khuẩn E. co l i .

- Phage À. t iêm A D N của n ó vào t ế bào chủ.

- A D N của phage có thể bắt đầu chu k ỳ t i ề m sinh hoặc hoạ i sinh ( ly t i c ) .

Trong quá t r ình t i ề m sinh, A D N của phage cài vào m ộ t v ị trí đặc thù n à o đ ó của

nhiên sắc thể v i khuẩn và trở thành t i ền phage (prophase). H ầ u hế t các gen của prophage

ở trạng thái k h ô n g hoạt động. Gen của prophage m ã hoa m ộ t protein k ì m h ã m l à m ức

c h ế hầu hết các gen của prophage. Prophage genom sẽ được n h â n bản lên n h i ề u l ầ n cùng

v ớ i quá t r ình phân chia của t ế bào chủ và có thể t ồ n t ạ i trong t ế b à o chủ n h i ề u t h ế hệ .

Đ ế n mộ t thờ i đ i ể m nhấ t đ ịnh, A D N của phage có thể t ách ra k h ỏ i A D N của t ế b à o chủ

và có thể bắt đ ầ u chu k ỳ hoại sinh.

5.3. MỘT SỐ BỆNH VIRUS NGUY HẠI

Virus gây ra rấ t nh iều bệnh ở n g ư ờ i , động vật , thực vật và k ể cả v i k h u ẩ n . M ộ t số

bệnh virus rấ t thường gặp n h ư c ú m . Đặc đ i ể m quan t rọng của bệnh virus là k h i mắc

bệnh virus, việc chữa bệnh sẽ gặp nh iều k h ó khăn .

D ư ớ i đây c h ú n g ta sẽ tham khảo ba bệnh virus ở n g ư ờ i : bệnh bạ i l i ệ t , c ú m và

H I V / A I D S . Các bệnh này đ ề u có chung mộ t đặc đ i ể m là đ ề u do virus c ó genom là A R N

gây ra.

5.3.1. Virus bại liệt

Bệnh bạ i l i ệ t rấ t ít k h i xảy ra ở các nước phá t t r iển nhờ c ó vacxin, tuy n h i ê n đ â y v ẫ n

là bệnh nguy h i ể m ở các nước đ ang phát t r iển . Virus bạ i l i ệ t x â m nhập vào c ơ t h ể qua

đường miệng do nước uống, thức ăn bị n h i ễ m . Trong t rường hợp c ơ t h ể k h ô n g c ó hệ

m i ễ n dịch mạnh virus sẽ t h â m nhập vào m á u , theo m á u các virus sẽ t ấ n c ô n g c á c t ế bào

thần k inh và hệ thần k inh trung ương . K ế t quả h ệ thần k inh sẽ bị p h á huy d ẫ n đ ế n b ạ i

l i ệ t hoặc chết. Hai l oạ i vacxin k h á c nhau đ ang được sử dụng rộng rãi và đã cứu được

hàng t răm ngàn cuộc sống con n g ư ờ i . Sabin virus là mộ t dạng virus bạ i l i ệ t đ ã được l à m

yếu . Virus Sabin k h ô n g có k h ả n ăng sinh sản trong t ế bào thần k inh do vậy k h ô n g gây

bệnh bại l i ệ t . C h ú n g có k h ả n ăng sinh sản chậm ở ruột và gây ra phản ứng m i ễ n d ịch

mạnh m ẽ ở ngườ i được t iêm phòng . M ộ t vacxin khác được g ọ i là vacxin S A L K . Đ â y là

122

m ộ t c h ế phẩm vacxin từ virus bạ i l i ệ t đã bị g iết chết và k h ô n g c ò n k h ả n ă n g sinh sản ở

cơ thể n g ư ờ i , nhưng c ó khả năng gây m i ễ n dịch.

5.3.2. Virus cúm (Influenza hoặc Flu)

Là virus gây bệnh nguy h iểm ở đường h ô hấp và đ ã l à m chết h à n g t r i ệu n g ư ờ i . Virus c ú m c ó thể lây n h i ễ m n g ư ờ i , lợn , gà, vịt , hả i cẩu và ngựa. V ừ u s c ú m có genom là các phân tử A R N được bao bọc bở i lớp vỏ protein (vỏ capsid) và mộ t lớp m à n g c ó nguồn gốc từ t ế bào sinh vật chủ ( m à n g envelop).

Virus c ú m c ó các spike (cái que hoặc gai) được tạo ra bở i 2 loạ i protein khác nhau của virus g ọ i là Neuraminidase và Haemagglutinin. Spike đ ó n g vai t rò quan trọng trong

lây n h i ễ m t ế bào chủ.

Những thay đ ổ i thường x u y ê n Ương ư ì n h tự axit amin của hai protein v ỏ virus d ẫ n đến sự xuấ t h i ện l iên tục các chủng m ớ i . Các chủng m ớ i c ó thể sinh sản ở các bệnh nhân đã có phản ứng m i ễ n dịch manh đ ố i v ớ i các chủng cũ.

Chủng c ú m m ớ i xuấ t h i ệ n kh i đa số cá thể trong quần thể sinh vật chủ chưa h ình thành hệ m i ễ n dịch k h á n g bệnh một cách h i ệu quả đã gây ra dịch c ú m lây lan nhanh chóng.

5.3.3. Virus gây suy giảm hệ miễn dịch HIV/AIDS

Virus gây suy g i ảm h ệ m i ễ n dịch thuộc n h ó m retrovirus, genom của virus này là A R N . K h i A R N virus t h â m nhập vào t ế bào n ó sẽ được enzym sao c h é p ngược (inverted transcriptase) xúc tác chuyển hoa thành A D N . Đ â y là mộ t dạng c A D N của virus. Phân tử c A D N này c ó thể cài vào n h i ễ m sắc thể của t ế bào chủ tạo ra mộ t dạng t i ền virus t i ề m

sinh (provirus). Provirus có thể nằm yên qua nhiều lần p h â n bào cho đ ế n k h i bắt đầu hoạt động và sinh sản, tạo ra các virus m ớ i .

H I V lây n h i ễ m các t ế bào của h ệ m i ễ n dịch, chủ y ế u lây n h i ễ m các đ ạ i thực bào (macrophage) và t ế b à o CD4 Positive T-cell .

Virus H I V được vận chuyển theo m á u , lây n h i ễ m qua đường m á u và đường sinh dục. Thông thường sẽ có mộ t giai đoạn ố m ngắn, sốt và xuấ t h i ện k h á n g thể chống l ạ i H I V trong m á u . C ó thể phải 6 tháng sau k h i bị n h i ễ m H I V , cơ thể m ớ i có b iểu h iện H I V dương tính qua thử k h á n g thể .

Bệnh A I D S xảy ra kh i cơ thể k h ô n g còn khả n ăng chống l ạ i sự lây n h i ễ m các bệnh vi khuẩn, nấm, virus khác . T i ếp theo virus sẽ n h i ễ m vào các l o ạ i t ế bào khác như hệ thần kinh trung ương và gây ra bệnh thần k inh , mấ t trí. M ộ t vài l o ạ i ung thư cũng liên quan

đến giai đoạn phát t r iển nhấ t đ ịnh của bệnh A I D S .

N g ư ờ i n h i ễ m H I V dương t ính có thể ở trong trạng thái sức khoe b ình thường vài năm sau đó m ớ i xuấ t h iện t r iệu chứng suy g i ảm m i ễ n dịch. Trong giai đoạn chưa b iểu hiện bệnh (có thể từ Ì đến l o năm) , H I V v ẫ n nhân bản trong t ế bào macrophage và t ế

bào CD4 T \ nhưng cơ thể v ẫ n còn khả n ăng thay t h ế tấ t cả các t ế bào chết vì n h i ễ m

123

virus. B iểu h i ện phát bệnh đ ầ u t iên là sự xuấ t h i ện các hạch k h i đ ó t ế b à o C D 4 và t ế b à o

T bị chết hàng loạt và h ệ m i ễ n dịch bắt đ ầ u suy y ế u .

5.4. CÁC CHIÊN LƯỢC cơ BẢN PHÒNG CHỐNG BỆNH VIRUS

D ư ớ i đây là 4 ch iến lược cơ bản của công nghệ sinh học trong p h ò n g chống bệnh virus:

- Sản xuấ t và sử dụng các vacxin t ruyền thống

- Tạo các vacxin tái tổ hợp (recombinant vacxin)

- Tạo ra các A R N đ ố i nghĩa (antisense R N A ) ở cơ thể chủ , k h i virus t h â m nhập vào t ế bào chủ, các A R N đ ố i nghĩa sẽ bắt cặp v ớ i các A R N (sense R N A ) của virus và làm cho virus bấ t hoạt.

- Tạo ra các s i A R N ( A R N ngắn, 2 1 - 2 5 nucleotid) trong t ế b à o chủ , k h i c ó virus tấn công các A R N ngắn sẽ bắt cặp v ớ i các t r ình tụ tương đồng t rên sợi A R N của virus và l àm cho A R N virus bị p h â n huy. Đ â y là mộ t công nghệ m ớ i ra đ ờ i chưa đ ầ y 10 n ă m l ạ i đây , có tác dụng p h ò n g chống bệnh virus rấ t h i ệu quả.

T i ê m vào cơ t hể chủ các t r ình tự A R N sợi k é p hoặc các s i A R N , c á c t r ình tự A R N k é p trong t ế bào n h â n thực c ó thể b ị các enzym Dicer cắt t h à n h c á c s i A R N . C á c s i A R N t h â m nhập vào t ế bào và gây ra bấ t hoạt virus.

Chiến lược sử dụng s i A R N đ ang được ngh iên cứu và ứng dụng đ ể p h ò n g chống các bệnh virus nan y n h ư H I V .

124

Chương 6

P R O T E I N V À C Ô N G N G H Ệ E N Z Y M

6.1. GIỚI THIỆU VẾ PROTEIN

Protein quy đ ịnh hầu hết các đặc t ính của t ế b à o và cơ t hể sống. Do vậy c h ú n g ta có thể nói protein tạo ra các cơ thể sống một cách đặc thù, k h ô n g t rùng lặp và đa dạng. Thành tựu gần đây nhấ t của Chương t r ình genom n g ư ờ i (2003) cho b iế t trong cơ thể ngườ i có chứa khoảng 30.000 gen, nhưng đã từ lâu n g ư ờ i ta ước t ính trong cơ thể n g ư ờ i cũng chứa khoảng 30.000 các l o ạ i protein khác nhau và m ỗ i protein đ ề u có những chức năng r iêng biệt (E.s. Grace, 1997).

Protein được cấu t rúc bở i 20 axit amin khác nhau. M ộ t protein vào loạ i nhỏ nhấ t chẳng hạn như insul in có chứa hơn 50 axit amin trong k h i đ ó thì đa số các protein khác lớn hơn rấ t nhiều (chứa từ vài t răm đ ế n hơn 1000 các axit amin).

T ính đặc thù của protein và enzym do t r ình tự các axit amin trong phân tử protein tạo ra.

Tr ình tự các axit amin trong phân tử protein l ạ i do t r ình tự của nucleotid trong gen quy đ ịnh. Ch ỉ cần thay đ ổ i một axit amin trong cấu t rúc của protein ta có thể tạo ra những thay đ ổ i rấ t l ớ n trong hoạt t ính, thậm chí l à m thay đ ổ i hẳn chức n ăng của protein. Trong cấu trúc của enzym c ó một vùng quy đ ịnh t ính đặc thù của n ó g ọ i là "trung t âm hoạt hóa" . Trung t â m này có thể coi là vùng rấ t nhạy cảm đ ố i v ớ i các độ t b iến . Các độ t biến gen chỉ cần l àm thay đ ổ i ý nghĩa của mộ t codon trên gen có thể d ẫ n đ ế n sự thay t h ế

của một axit amin này bằng một axit amin khác trong "trung t â m hoạt hóa" và có thể dẫn đ ế n thay đ ổ i toàn bộ hoạt t ính hoặc chức n ăng của protein/enzym đ ó .

6.1.1. V a i t r ò của p ro te in

Protein

Protein là enzym Protein cấu trúc Protein là các chất hoạt tính sinh học

/ ị X

Xúc tác toàn bộ quá trình sinh hoa của tế

bào và cơ thể

Tạo ra các cấu trúc trên mức phân tử như nhiễm sắc thể, lục lạp, ty thể, tế bào, mô, cơ quan, prótein vận động ỏ mô cơ và vận chuyển ỏ tế bào máu

- Hocmon sinh trưởng, phát triển; - Các kháng thể và khả năng miễn dịch; - Các chất có hoạt tính sinh học khác (insulin, inteđeron,...)

125

6.1.2. C ấ u t r ú c của p ro te in

Protein là một polymer gồm nhiều monomer (có tên chung là axit amin) tạo thành. M ộ t sợi polymer g ồ m một số axit amin được g ọ i là polypeptid.

Cấu trúc chung của axit amin:

NH2

I

R — c — H

C O O H

Cấu trúc khác nhau của các axit amin là do nhóm R quyết định. Protein được tạo bởi 20 axit amin khác nhau (bảng 6). Các axit amin liên kế t v ớ i nhau bằng cầu n ố i covalent (đồng hoa tr ị) g ọ i là cầu n ố i peptid. Cầu n ố i này được tạo bở i phản ứng hoa học giữa n h ó m cacboxyl (COOH) của axit amin này v ớ i n h ó m amino của axit amin k h á c :

I H — N _

H I

H — N _

c j

— c — ( 1 Ì

Ri li 0

H 1 1

à — c — ( 1 li Ri Ỏ

H H

H I

- N

H I

-N

H

é—C-(OH H 1 li

R 2 o

H ì

-N

H

c—c 1 li R 2 o

OH H ) _ N —

H I

N

H I

c — C - O H I ý

R 3 0

H I

c — C - O H

R 3 Õ

I I H H

I ụ

I H

I H - N - ộ — C - N - ộ — C - N - ẹ — C - O H + 2 H 2 0 — •

ĩ lí ĩ H ĩ ị Rị Ở R 2 Ỏ R 3 Ổ

Kết quả tạo ra mạch peptid dài (protein) gồm axit amin kết nối với nhau tương tự như ở phản ứng trên.

Bảng 6.1. Tên 20 axit amin tạo nên phân tửprotein

Tên axit amin Ký hiệu Tên axit amin Ký hiệu Alanine M a Leucine Lêu Arginine Arg Lysine Lys Asparagine Asn Methionine Mét Aspartic acid Asp Phenylalanine Phe Cysteine Cys Proline Pro Glutamine Gìn Serine Ser Glycine Gly Threonine Thr

Histidine His Tryptophan Trp

Glutamate Giũ Tyrosine Tyr

Isoleucine He Valine Vai

126

Cấu t rúc k h ô n g gian của protein rấ t phức tạp, g ồ m 4 mức c ấ u t rúc k h á c nhau (sơ đ ồ 6.1). M ộ t số k i ể u l iên k ế t yếu h ình thành giữa các n g u y ê n tử trong c ù n g m ộ t sợi polypeptid hoặc giữa các nguyên tử thuộc các sợi polypeptid k h á c nhau tạo ra các cấu trúc k h ô n g gian đặc thù của protein. Các k i ể u l iên kế t y ế u k h á đ a dạng: l iên kế t

hydrogen, l iên kế t t ĩnh đ iện (electrostatic) và l iên kế t Van der Waals.

Cấu trúc bậc một (Prímary structure): Các axit amin kế t n ố i v ớ i nhau thành mộ t sợi polypeptid thẳng g ọ i là cấu trúc bậc một .

Cấu trúc bậc hai (secondary structure): H ì n h thành do lực liên kế t giữa các n g u y ê n tử của các axit amin gần nhau trong sợi polypeptid mạch thẳng tạo thành . Cấu t rúc bậc 2 thường có dạng sợi xoắn (oe He l ix ) .

Cấu trúc bậc 3 (Tetiary structure): Các mạch polypeptid cấu trúc bậc mộ t có thể gấp khúc do các lực l iên k ế t y ế u tạo nên cấu t rúc bậc 3. V í dụ , cấu trúc bậc 3 của phân tử mioglobin.

Cấu trúc bậc 4 (Quaternary structure): Trong m ộ t số các protein, 2 hoặc nh iều hơn sô sợi polypeptid có cấu t rúc bậc 3 l iên kế t l ạ i tạo thành cấu t rúc bấc 4. V í dụ , cấu trúc bậc 4 của phân tử hemoglobin. Cấu trúc bậc 4 c ó thể h ình thành giữa các sợi polypeptid khác nhau hoặc giữa các sợi g iống nhau.

Nhiều protein c ó cấu t rúc chặt chẽ h ình cầu: các enzym và các k h á n g thể là những protein có cấu t rúc h ình cầu quan trọng nhấ t , trong k h i các protein sợi là thành phần cấu trúc quan trọng của m ô cơ và sợi tóc .

Primary structur*

Secondary structurc

Tertiary s trúc tu re

Quatomary structurc

ị ca, 1 1 GI V 1

-ỆE&-

1 ***J 1 | t f Ị h ạ i n ạ n tefÉ

1 ***J 1 | t f Ị h ạ i n ạ n tefÉ

Aminci acid reKÍdues rHelix Poiyp«ptlde chuin AKKembli.-d stibuniu

Sơ đồ 6.1. Cấu trúc không gian của protein (theo Neỉson and Cox, 2000)

Cấu trúc không gian của protein là yếu tố quyết định đối với chức năng của protein trong t ế bào. Cấu t rúc k h ô n g gian của protein được quy đ ịnh bở i t r ình tự axit amin trong cấu trúc bậc mộ t của n ó . Cấu trúc bậc ba và bậc bốn của protein cũng được quy đ ịnh bở i cấu trúc bậc mộ t của các polypeptid tạo nên protein đ ó . Tr ình tự các axit amino cũng

quy đ ịnh vai t rò của gốc R trong các l iên kế t đặc thù của protein này v ớ i các thành phần khác của t ế bào .

6.2. CÔNG NGHỆ ENZYM

Cơ thể sống thực sự là một nhà máy hoa chất khổng lồ nhất mà con người được biết

đến , trong đ ó m ọ i phản ứng hoa học đ ề u được xúc tác bở i các enzym. K h ô n g có enzym và hệ thống enzym chắc chắn sự sống sẽ k h ô n g t ồn t ạ i .

127

Enzym được hệ thống sống sản sinh ra để xúc tác các phản ứng sinh hoa cần cho sự tồn t ạ i của hệ thống sống đ ó . Chấ t xúc tác (catalyst) là các tác n h â n hoa học c ó thể l à m thay đ ổ i tốc đ ộ của mộ t phản ứng hoa học n h ư n g k h ô n g bị b i ế n chấ t hay p h â n huy b ở i các phản ứng m à n ó xúc tác .

Enzym là các protein có khả nâng xúc tác các phản ứng hoa học v ớ i bản chấ t là c á c chất xúc tác sinh học (biocatalysts). Đ ế n nay, n g ư ờ i ta cho b iế t c ó h à n g n g à n enzym các

loạ i , xúc tác các phản ứng sinh hoa đặc thù trong t ế bào . M ộ t số các phản ứng p h â n g i ả i thức ăn thành axit amin, đường và các chấ t béo đơn g iản c ó thể được thực h i ệ n v ớ i sự xúc tác của enzym trong vài phút . N ế u k h ô n g có các enzym tham gia, c á c phản ứng tương tự như trên có thể phải k é o dài vài chục n ă m .

Enzym sau kh i được tách ra k h ỏ i t ế bào sống v ẫ n c ó thể x ú c tác c á c phản ứng hoa học in vitro. K h ả n ăng của các enzym c ó thể bảo t ồ n k h ả n ă n g x ú c tác c á c phản ứng sinh hoa học đã được khai thác trong sản xuấ t công nghiệp và được g ọ i là C ô n g nghệ enzym.

Trong n h ó m protein, enzym c h i ế m v ị trí quan trọng nhấ t cả về số lượng và chấ t lượng. Enzym là các protein đ ó n g vai t rò xúc tác k h ô n g thể t h i ếu được đ ố i v ớ i c á c phản ứng hoa học trong t ế bào . M ỗ i enzym xúc tác một phản ứng đặc thù và m ộ t số enzym chỉ hoạt hoa trong những đ iều k i ệ n m ô i t rường th ích hợp. M ặ c d ù trong m ỗ i t ế b à o đều

có tấ t cả các gen cần th iế t cho sinh tổng hợp tấ t cả các enzym trong c ơ t hể . Tuy nhiên, trong các bào quan khác nhau n h ư ty thể , lục lạp hay trong các m ô k h á c nhau n h ư rễ , lá đ ề u có hệ thống các enzym khác nhau hoạt động.

M ỗ i . enzym được tổng hợp thông qua b iểu h i ện của gen hay h ệ đ i ề u h à n h hoạt hoa của gen/hệ gen trong m ố i quan h ệ tương tác chặt v ớ i các y ế u t ố n ộ i sinh và m ô i trường ngoài như:

- Giai đoạn phát t r iển và phân hoa của t ế bào và m ô trong c ơ t hể đ a b à o .

- Các yếu t ố m ô i t rường.

- Tr ình tự của các quá tr ình sinh hoa xảy ra trong đ ó m ỗ i enzym tham gia c ó v ị trí k h ô n g gian và thờ i gian xác đ ịnh trong t ế bào .

Enzym sẽ được tổng hợp k h i n à o và ở đâu , số lượng nh iều hay ít, t rong đ iều k i ệ n nào enzym này hoặc khác sẽ được tổng hợp - Đ i ề u đ ó được quy đ ịnh b ớ i h ệ đ i ề u hành

của các gen và thể h i ện tính tổ chức trong m ỗ i h ệ thống enzym. D o đ ó , n g h i ê n cứu hệ điều hành sinh tổng hợp các enzym nó i r iêng và protein nói chung sẽ là m ấ u chốt đ ố i vớ i thành công của nhiều l ĩnh vực công nghiệp sinh học.

Tên của một enzym thường được g h é p bở i tên gọi của m ộ t cơ chấ t , hoặc chấ t nền

của enzym đ ó cộng v ớ i n h ó m "ase" ở cuố i . V í dụ , các enzym thúy p h â n protein thành các axit amin được g ọ i là protease hoặc proteinase. Proteinase cũng c ó t hể c ó c á c tên thông dụng khác như: pepsin, trypsin, bromelin.. . Amilase cũng c ó các n h ó m k h á c nhau

như alpha-amylase, beta-amylase, đ ề u là các enzym phân g i ả i t inh bột n h ư n g k h á c nhau ít nhiều trong hoạt hoa hoặc cấu t rúc .

6.2.1. Vai trò sinh hoa học của enzym

Enzym đ ó n g vai t rò quan trọng trong việc phá vỡ các l iên kế t hoa học của c á c chấ t tham gia phản ưng và tạo ra các liên kế t hoa học m ớ i ở các sản phẩm của phản ứng.

128

Enzym l à m tăng nhanh tốc đ ộ của phản ứng bằng việc l à m g i ả m mức n ăng lượng tớ i hạn m à c ơ chấ t phả i đạ t đ ế n để phản ứng có thể xảy ra.

V í dụ : phản ứng phân g iả i đường sucrose (Ci2H22Ou) t hành đường glucose và ữuctose có sự tham gia của một phân tử nước xảy ra n h ư sau:

Phản ứng này g ồ m quá trình phân cắt phân tử sucrose thành 2 phân tử và phân tử nước thành H + và OH" và tạo ra l iên kế t hoa học m ớ i để tạo ra glucose và í ruc tose .

Năng lượng hoạt hoa của phản ứng hoa học:

Năng lượng cần để l àm phá vỡ l iên kế t hoa học của các chấ t tham gia phản ứng hay là năng lượng khở i đầu của phản ứng được g ọ i là n ă n g lượng hoạt hoa. K ý h iệu là E A . Năng lượng hoạt hoa có thể là nhiệt lượng m à các phân tử tham gia phản ứng cần hấp thụ để làm vỡ l iên kế t hoa học của chúng . N ă n g lượng này được l ấ y từ m ô i t rường ngoài có tác dụng làm cho l iên kế t hoa học bên trong các chấ t tham gia phản ứng k h ô n g còn bền vững nữa - đây là đ iều k i ệ n để tạo ra các sản phẩm m ớ i . Sau k h i chấ t m ớ i được tạo ra vớ i các liên kế t hoa học ổn đ ịnh, nàng lượng sẽ được g i ả i p h ó n g ra m ô i t rường. N ế u

năng lượng được g i ả i phóng ra l ớ n hơn so v ớ i n ăng lượng hấp thụ ban đ ầ u ( lớn hơn E A ) thì phản ứng sẽ được g ọ i là phản ứng toa nhiệt .

Quá tr ình chuyển hoa của các chấ t luôn luôn phụ thuộc vào n ă n g lượng tự do chứa trong nó: ở đây năng lượng tự do của 2 chấ t A - B và C- D được k ý h iệu là E | . Sau kh i các chất này hấp thụ nhiệ t lượng từ bên ngoà i sẽ c ó n ă n g lượng tự do cao hơn và đạt

trạng thái nâng lượng E'i ( K ị = E j + E A ) . 0 trạng thái n ăng lượng E'ị c ác chấ t tham gia phản ứng sẽ k é m bền vững hơn , g iàu khả n ăng chuyển hoa hơn . Trạng thái này của các chất được g ọ i là trạng thái chuyển t iếp . Trạng thái n ăng lượng của các sản phẩm tạo thành sau phản ứng A - c và B - D thấp hơn được ký h iệu là E 2 . M ứ c đ ộ chênh lệch năng lượng tự do giữa các chấ t tham gia phản ứng và các sản phẩm sau phản ứng được g ọ i là AG (Sơ đồ 6.2).

C l 2 H 2 2 0 „ + H 2 0 Q H . A + - Q H . A

A ^ ~ B I Trạng thái chuyển tiếp: các chất tham c ,—D I gia phản ứng hấp thu năng lượng Ex

và trở nền kém bền vững.

Năng lượng tự do E' I Chất tham

gia phản ứng A-B / C-D / E|

ị Sản phẩm AG

A - C B-D t

Sơ đồ 6.2. Quá trình chuyển hóa các chất

129

Trong t rường hợp phản ứng là phản ứng toa nhiệ t thì n ă n g lượng A G sẽ là m ộ t số dương . N ă n g lượng E A được g ọ i là g iớ i hạn n ăng lượng. Đ i ể u đ ó c ó nghĩa là c á c chấ t A B và C D chỉ có thể phản ứng v ớ i nhau nếu các chấ t này được hấp thụ m ộ t n ă n g lượng E A

t ố i th iểu để đạt trạng thái n ăng lượng E ' l . Trạng thái n ăng lượng E ' l là t rạng thá i c h u y ê n t iếp kh i các chấ t tham gia phản ứng sẵn sàng chuyển hoa. N ế u n â n g lượng E A q u á l ớ n , có nghĩa là hệ thống phải t i ếp thu nhiều nhiệt lượng hay cần k í ch lên nh iệ t đ ộ cao đê phản ứng có thể xảy ra, có thể sẽ k é o theo sự huy d iệ t của t ế b à o sống. D o vậy , đ ế phản ứng hoa học được xảy ra trong các đ iều k i ệ n nhiệt đ ộ m ô i t rường k h á ổn đ ịnh của c ơ thê

sông cần đến vai t rò của các enzym. Ở đây , enzym có tác dụng l à m g i ả m nhu cầu hấp thụ nhiệt n ăng của các chấ t tham gia phản ứng và k í ch hoạt tốc đ ộ của c á c phản ứng hoa học trong h ệ thống.

Sản p h ẩ m

Sơ đồ 6.3. Năng lượng hoạt hóa của phản ứng hóa học chuyển hóa các chất

Enzym không thể làm thay đổi năng lượng AG (là độ chênh lệch năng lượng tự do

của các chấ t ở đầu và cuố i của q u á t r ình phản ứng). N ó ch ỉ c ó thệ l à m g i ả m nhiệ t năng

m à các chất tham gia phản ứng cần t i ếp thu đ ể phản ứng x ả y ra. T rên đ ổ th ị ta thấy năng

lượng E l c (phản ứng có sự tham gia x ú c tác của enzym) thấp hơn so v ớ i E ' j . N h ư vậy nếu

ta coi E A 1 là g iớ i hạn năng lượng ở phản ứng k h ô n g c ó sự tham gia của enzym và EM là

g iớ i hạn năng lượng của phản ứng có sự tham gia của enzym thì E A 1 sẽ l ớ n h ơ n E A 2 (sơ

đồ 6.3).

T ó m l ạ i , trong quá t r ình phản ứng, enzym + cơ chấ t tạo ra tổ hợp enzym - cơ chứ

làm thay đ ổ i năng lượng của cơ chấ t và g iúp chuyển hoa cơ chấ t thành sản p h ẩ m v ớ i tốc

đ ộ phản ứng tăng. Công thức tổng hợp của phản ứng được xúc tác bở i enzym, trong đ ó E

là enzym, A là cơ chấ t , B là sản phẩm được b iểu h iện như sau:

A + E-> A-E->E + B

130

Enzym c ó thể l àm tăng tốc độ của phản ứng lên h à n g t r i ệu l ầ n . V í dụ , enzym

catalase d ù n g trong công nghiệp dệt, Ì phân tử catalase c ó thể chuyển hoa 5 X l o 6 = 5

t r iệu p h â n tử hydrogen peroxide thành nước và oxy trong m ộ t phút .

M ộ t đặc t rưng quan trọng của enzym là hoạt t ính của n ó . Hoạt t ính của mộ t enzym

được đ o là bằng số phân tử cơ chấ t chuyển hoa thành sản phẩm trong mộ t đơn v ị thờ i gian bở i mộ t phân tử của enzym trong t rường hợp cơ chấ t ở nồng đ ộ bão hoa. Trong đa

số các t rường hợp hoạt t ính đặc thù của enzym được b iểu h i ện bằng ịimol cơ

chấ t /phút /mg của enzym (U/mg protein).

6.2.2. Một số đặc tính quan trọng của enzym

Enzym có một số các thuộc t ính cơ bản d ư ớ i đây :

6.2.2.1. Tính đặc thù của enzym

Emyrn chỉ xúc tác phản ứng với các cơ chất đặc thù:

Enzym có t ính đặc thù rấ t cao, n ó chỉ xúc tác phản ứng sinh hoa nhấ t đ ịnh, hay là m ỗ i enzym chỉ có thể nhận b iết và xúc tác quá t r ình b iến đ ổ i của mộ t hoặc vài cơ chất

nhất đ ịnh.

Tính đặc thù của enzym là do cấu trúc bậc m ộ t và cấu t rúc k h ô n g gian của enzym

quy đ ịnh. N ế u thay đ ổ i cấu t rúc k h ô n g gian của enzym bằng sự thay đ ổ i nồng đ ộ hoặc

độ pH của môi t rường c ó thể l àm cho enzym m ấ t hoạt hoa.

Enzym vớ i t ính đặc thù cao cũng có t hể nhận b iế t sự k h á c nhau của hai cơ chấ t có

cấu trúc rấ t giống nhau.

Enzym có tính đặc thù không gian

M ỗ i enzym có mộ t vị t r í k h ô n g gian xác đ ịnh trong t ế bào , trong m ô hoặc cơ quan.

M ỗ i cơ quan tử trong t ế bào có những enzym và h ệ thống enzym đặc thù th ích hợp v ớ i

chức năng của n ó . V í d ụ các enzym A D N - polymerase, A R N - polymerase ch ỉ hoạt hoa

trong nhân t ế bào hoặc trong n ộ i bào quan có chứa A D N như lục lạp , ty thể .

Enzym có tính đặc thù thời gian

Các enzym được tổng hợp theo tr ình tự thờ i gian trong mộ t chuỗ i phản ứng sinh hoa, trong những thờ i đ i ể m cụ thể của chu k ỳ phân bào và ở thờ i đ i ể m xác đ ịnh trong quá

trình phát t r iển của cá thể . V í dụ , thờ i k ỳ phát dục của t ế bào luôn k è m theo hoạt hoa

của một loạt các gen và các enzym tương ứng m à trong thờ i k ỳ sinh t rưởng trước đ ó chúng k h ô n g hoạt động.

T ính đặc thù về v ị trí không gian và thờ i gian của enzym là y ế u t ố quyết đ ịnh t ính

đặc thù trong phân hoa chức năng của tổ chức sống.

N h ư vậy, sinh tổng hợp của enzym luôn xảy ra ở một thờ i đ i ể m xác đ ịnh và chúng có

thể tồn tạ i trong dịch bào hoặc được đ ính trên hệ thống m à n g của t ế bào ở những vị trí đặc

131

thù. V i ệ c m ô phỏng hệ thống m à n g sinh học trong đ ó c ó sự sắp x ế p t ố i ưu của h ệ thông

enzym có thể sẽ mang l ạ i những độ t phá quan trọng trong n g à n h công nghiệp hoa sinh.

6.2.2.2. Một số các đặc tính quan trọng khác của enzym

- Enzym xúc tác sự b iến đ ổ i hoa học của các cơ chấ t , n h ư n g bản thân enzym k h ô n g

bị tiêu huy trong quá tr ình xúc tác đ ó .

- V ớ i sự có mặ t của enzym, tốc đ ộ của phản ứng hoa học x ả y ra rấ t cao.

- M ộ t lượng enzym nhỏ có thể c h ế b iến mộ t lượng c ơ chấ t l ớ n .

- Enzym có thể hoạt hoa ở c ác đ iều k i ệ n nhiệt đ ộ khác nhau từ 0 - 1 1 0 ° c và ở c á c độ

p H t ừ 2 - 1 4 .

- M ộ t số enzym ch ỉ hoạt hoa trong đ iều k i ệ n có mặ t của c á c y ế u t ố đ ồ n g thờ i

(cofactors). Cofactors có thể là các lon k i m loạ i hoặc là các nucleotid hay v i tamin . . .

- N h ờ t ính đặc thù của enzym, công nghiệp enzym c ó thể tạo ra c á c sản p h ẩ m có

chấ t lượng cao, đ ộ t inh kh iế t cao, ít sản phẩm phụ , do vậy d ễ t inh sạch.

- Enzym có thể được sản xuấ t bở i các v i sinh vật ở quy m ô l ớ n m à k h ô n g cần đến

các thiết bị chịu hoa chấ t .

- Vì enzym là mộ t phân tử protein, n ó c ó thể bị p h â n rã (b iến t ính) ở c á c nồng đ ộ pH

và nhiệt đ ộ nhấ t đ ịnh hoặc do khuấy t rộn mạnh. Trong t rường hợp cần t h iế t đ ể p h â n hủy

enzym n g ư ờ i ta ch ỉ cần t ăng đ ộ p H hay nhiệt đ ộ là đủ . Hoạ t t ính của enzym do vậy rấ t

d ễ đ iều kh iển . Enzym có thể d ễ phân huy do vậy c ó l ợ i cho k i ể m soát m ô i t rường.

6.2.3. Trung tâm hoạt hoa của enzym

Trong phản ứng, cơ chấ t và enzym tạo ra m ộ t tổ hợp enzym + c ơ chấ t . C ơ chấ t được

gắn vào một vùng xác đ ịnh của enzym được g ọ i là trung t â m hoạt hoa n h ờ c á c l iên kết

yếu như liên kế t hydro hoặc liên kế t lon. Sau k h i c ơ chấ t được chuyển hoa thành sản

phẩm, sản phẩm sẽ r ờ i trung t â m hoạt hoa nhường chỗ cho c á c p h â n tử c ơ chấ t m ớ i .

Phản ứng xảy ra nhanh đ ế n mức mộ t phân tử enzym có thể b iến đ ổ i h à n g n g h ì n phân

tử cơ chấ t trong Ì giây. H ầ u hết các phản ứng enzym là 2 ch iều: phản ứng x u ô i và phản

ứng ngược l ạ i . Chiều của phản ứng phụ thuộc rấ t nh iều vào nồng đ ộ tương đ ố i của các cơ chấ t và sản phẩm.

Tương tác giữa "trung t âm hoạt hoa" của enzym và cơ chấ t g iống n h ư tương tác giữa

ổ khoa và chìa khoa, trong đ ó cấu trúc k h ô n g gian của enzym là đặc biệ t quan t rọng,

trong đ ó t r ình tự các axit amin của trung t âm hoạt hoa đ ó n g vai t rò quyết đ ịnh đ ố i v ớ i

t ính đặc h iệu của enzym.

T h ô n g thường các độ t b iến làm thay đ ổ i tr ình tự axit amin trong trung t â m hoạt h ó a

sẽ d ẫ n đ ế n làm m ấ t k h ả n ă n g xúc tác của enzym hoặc làm thay đ ổ i t ính đặc thù của n ó .

Trong kh i đ ó nếu đ ộ t b iến xảy ra ở mạch ngoài của enzym (ở các polypeptid xa trung

132

t â m hoạt hoa) c ó thể gây ra sự thay đ ổ i mức hoạt hoa, hoặc đ i ề u k i ệ n hoạt hoa t ố i ưu,

hoặc đ ộ bền vững của enzym m à không thay đ ổ i chức n ă n g (t ính đặc h iệu) của nó . Do

vậy c ô n g nghệ gen c ó thể tác động làm thay đ ổ i m ộ t số t ính chấ t của enzym.

6.2.4. Các điều kiện hoạt hoa tối ưu của enzym

6.2.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ pH

Enzym có thể hoạt hoa ở các đ iều k i ệ n nhiệt đ ộ k h á c nhau từ 0 - 110 l ) c và ở các đ ộ

pH từ 2-14.

Cấu trúc k h ô n g gian bậc ba của protein rấ t cảm ứng v ớ i đ iều k i ệ n m ô i t rường. H ầ u hết các enzym có hoạt t ính t ố i đa ở nhiệt đ ộ t ố i ưu, nhiệ t đ ộ t ố i ưu thường là nhiệt đ ộ bên trong của t ế bào m à từ đ ó enzym được sản sinh ( đ ố i v ớ i enzym n ộ i bào) . Đ ố i vớ i các enzym ngoại bào (enzym được t ế bào t iế t ra m ô i t rường) nhiệt đ ộ t ố i ưu c ó thể là nhiệt độ môi trường trong đ ó enzym hoạt động. Tốc đ ộ phản ứng t ăng lên c ù n g v ớ i sự tăng của nhiệt đ ộ cho đ ế n k h i đạt đ ế n nhiệt đ ộ t ố i ưu. N h i ệ t đ ộ cao hơn so v ớ i nhiệt t ố i ưu có thể làm cho hoạt t ính của enzym g i ả m nhanh và có thể l àm enzym p h â n rã và mấ t hoạt

tính. ở nhiệt đ ộ thấp phản ứng xảy ra chậm hơn n h ư n g enzym có thể hoạt động dài hơn .

Nhiệt đ ộ t ố i ưu cho hoạt hoa của đa số các enzym ở n g ư ờ i vào khoảng 3 7 ° c , trong khi đó nhiệt độ t ố i un cho hoạt hoa của các enzym ở loài v i khuẩn ưa n ó n g nằm trong khoảng 70-75°C,

M ỗ i enzym có đ ộ p H t ố i ưu, sự t ăng hoặc g i ả m đ ộ p H so v ớ i đ ộ p H t ố i ưu đều làm

giảm hoạt t ính của enzym. M ộ t enzym được đ á n h giá là c ó g iá trị thương m ạ i cao hơn khi nó có khoảng dao động t ố i ưu của p H rộng hơn , nhờ vậy những thay đ ổ i nhỏ của đ ộ pH không làm thay đ ổ i lớn tốc đ ộ của phản ứng. <:

Đ ộ p H t ố i ưu cho hoạt động của đa số các enzym nằm trong khoảng p H = 6 - 8. Tuy nhiên có những ngoại l ệ , v í dụ , pepsin là enzym tiêu hoa trong d ạ dày hoạt động t ố i ưu ở pH = 2, trong kh i enzym tiêu hoa trypsin ở ruột l ạ i th ích nghi v ớ i m ô i t rường k i ề m và

hoạt hoa t ố i ưu k h i p H = 8.

6.2.4.2. Cofactors

Nhiều enzym cần đ ế n sự trợ g iúp của các phân tử k h ô n g phải protein để hoạt động. Các phân tử này được g ọ i là các y ế u t ố đồng thờ i (co íac tors) .

V ề bản chấ t , co íac tors có thể là chấ t vô cơ như lon k i m l o ạ i ( k ẽ m , sắt, đồng...) Cofactors cũng c ó thể là các chấ t hữu cơ (trong t rường hợp này cofactors được g ọ i là coenzym) như các vi tamin hay nucleotid. Các coenzym rấ t cần th iế t cho sự hoạt động xúc tác của enzym.

6.2.4.3. Các chất kìm hãm enzym

M ộ t số các hoa chấ t có khả năng k ì m h ã m hoạt t ính của enzym. N ế u chấ t k ìm h ã m

b á m vào enzym bở i l iên kế t đồng hoa trị thì ức c h ế thường là ức c h ế k h ô n g đảo ngược.

133

Ngược l ạ i , ức c h ế sẽ là đảo ngược nếu sự l iên kế t của chấ t ức c h ế v ớ i enzym là các l iên

kế t yếu . N h i ề u chấ t ức c h ế có cấu t rúc hoa học tương tự v ớ i c ơ chấ t , do v ậ y c h ú n g có thể

cạnh tranh v ớ i cơ chấ t trong liên kế t vớ i trung t â m hoạt hoa. C h ú n g l à m g i ả m hoạt t ính

của enzym. K i ể u ức c h ế như vậy g ọ i là ức chế cạnh tranh.

Trái vớ i ức c h ế cạnh tranh là ức chế không cạnh tranh: CÁC chấ t k ì m h ã m enzym

k h ô n g tương tác trực t i ếp v ớ i trung t âm hoạt hoa được g ọ i là các chấ t k ì m h ã m k h ô n g

cạnh tranh. Các chấ t này thường b á m vào các phần k h á c trong c ấ u t rúc của enzym, làm

cho enzym bị b iến dạng, hoạt t ính của enzym bị suy g i ả m hoặc bị t r i ệ t t iêu . M ộ t số chất

là chấ t độc do chúng c ó t ính chấ t k ì m h ã m hoạt t ính enzym. V í dụ , D D T và parathion ức

c h ế các enzym quan trọng của hệ thần k inh của c ô n t rùng , các chấ t k h á n g sinh diệt

khuẩn vì c h ú n g ức c h ế hoạt động của enzym v i khuẩn.

Cơ c h ế ức c h ế hoạt t ính của enzym tổn t ạ i ngay trong t ế b à o c ơ t h ể sống và đ ó n g vai

trò quan trọng đ ố i v ớ i sự sống.

6.2.4.4. Điều khiển quá trình trao đổi chất thông qua các chất tăng cường hoặc

ức chê enzym

M ộ t phần trong cấu t rúc của enzym, nhưng ở xa trung t â m hoạt hoa của n ó , là

allosteric site. M ộ t số chấ t có thể b á m vào allosteric site và l à m thay đ ổ i hoạt hoa của

enzym theo hướng t ăng cường hoặc ức chế .

Các enzym m à hoạt t ính của c h ú n g được đ iều k h i ể n t h ô n g qua allosteric site được

g ọ i là allosteric enzym. Các enzym này được c ấ u tạo bở i hai hoặc vài mạch polypeptid.

M ỗ i một mạch này l ạ i có thể c ó m ộ t trung t â m hoạt hoa riêng và các allosteric sites

thường nằm ở vùng l iên kế t giữa các mạch polypeptid. Các chấ t t ăng cường hoặc ức chế

enzym k h i b á m vào mộ t trong các allosteric site c ó thể l à m b i ế n dạng c á c đ ơ n v ị cấu

trúc khác của enzym và ảnh hưởng đ ế n hoạt t ính của toàn bộ enzym.

Trong một số t rường hợp chấ t t ăng cường và chấ t k ì m h ã m có cấu t rúc tương tự và

có thể cạnh tranh liên kế t vớ i allosteric site. V í d ụ A T P và A M P , m ộ t enzym c ó thể bị

kìm hãm bở i A T P và được t ăng cường bở i A M P . N ế u nồng đ ộ A T P trong t ế b à o bị thấp

so vớ i nhu cầu sử dụng, chấ t tăng cường là A M P sẽ b á m vào allosteric site đ ể k í ch hoat

enzym chuyển hoa chấ t này theo theo hướng tạo A D P và sau đ ó ATP. N ế u A T P d ư thừa

trong t ế bào, chấ t k ìm h ã m (ATP) sẽ b á m vào allosteric site của enzym và ức c h ế enzym.

6.2.4.5. Điều khiển ngược ựeedback regulation)

Cơ c h ế đ iểu kh iển enzym chuyển hoa A T P và A M P trên đây là m ộ t ví d ụ về đ iều

kh iển ngược. Đ â y là một cơ c h ế đ iều k h i ể n quan trọng và phổ b i ến trong trao đ ổ i chấ t

của t ế bào và cơ thể sống. ú c c h ế ngược là quá tr ình l àm dừng con đường trao đ ổ i chấ t

bằng sản phẩm cuố i của con đường đó .

134

M ộ t ví dụ khác là quá trình tổng hợp isoleucine từ threonine. Q u á t r ình chuyển hoa

từ threonine thành isoleucine qua 5 bước phản ứng trung gian v ớ i sự tham gia của 5

enzym khác nhau, bắt đầu là enzym threonine deaminase. K h i chấ t cuố i cùng của chuỗ i

phản ứng là isoleucine được tạo ra và t ích l ũy trong t ế bào , n ó sẽ b á m vào allosteric site

của enzym threonine deaminase và l àm b iến dạng enzym này . K ế t quả là enzym k h ô n g

còn khả năng chuyển hoa threonine nữa. N h ư vậy , cơ c h ế đ iều k h i ể n ngược g iúp cho t ế

bào t ránh tổng hợp lượng isoleucine d ư thừa.

6.2.5. Nguồn gốc của một số enzym thông dụng

Enzym có thể được tách chiết từ bấ t k ỳ cơ thể sống nào . M ộ t số enzym có nguồn

gốc động vật hoặc thực vật c ó thể c ó ứng dụng trong c ô n g nghiệp, n ô n g nghiệp hoặc y

học (bảng 6.2). Tuy nhiên , các enzym có nguồn gốc v i sinh vật là các enzym được ứng

dụng phổ b iến nhấ t v ớ i quy m ô l ớ n .

6.2.5.1. Một sốenzym có nguồn gốc thực vật

- Amilase là enzym được tách chiết từ hạt nảy m ầ m hoặc củ;

- Bromelin là protease ở cây dứa;

- Papain là mộ t protease của nhựa quả đu đủ;

6.2.5.2. Một sôienzym có nguồn gốc động vật

- Catalase - một enzym ở gan. - Rennet - enzym dịch vị d ạ dày b ò l àm đ ô n g sữa trong c ô n g nghiệp pho mát . - Pepsin - enzym h ệ t iêu hoa trong dạ dày lẹm. - M ộ t số enzym h ệ t iêu hoa từ tuyến tuy của lợn .

Bảng 6.2. Một sốenzym quan trọng có nguồn gốc động, thực vật

TT Enzym Nguồn 1 Enzym động vật

Catalase Liver (Gan) Chymotrypsin Pancreas (Tuyến tuỵ) Lipase Pancreas (Tuyến tuy)

Rennet Abomasum (Dạ cỏ động vật) Trypsin Pancreas (Tuyến tuy)

2 Enzym thực vật Actinidin Quả Kiwi oe- amylase Mạch nha p- amylase Mạch nha Bromelain Nhựa dứa p- Glucanase Mạch nha Ficin Nhựa cây sung (Fig latex) Lipoxygenase Đậu tương Papain Nhưa đu đủ

135

6.2.5.3. Một số enzym có nguồn gốc vi sinh

N ấ m , v i khuẩn là nguồn enzym cơ bản trong công nghiệp enzym. V i sinh vậ t sản

xuấ t một số enzym quan trọng đ ó n g vai t rò p h â n g i ả i c á c đ ạ i p h â n tử n h ư t inh bột ,

cellulose, protein để tạo ra các chấ t đơn g iản hơn được g ọ i là enzym t h ú y p h â n

(hydrolyzing enzym). Các enzym thúy phân g ồ m :

- Amylase: là enzym phân g i ả i t inh bột thành các đường c ó p h â n tử lượng n h ỏ hơn

và các đường đơn hoa tan.

- Protease (hoặc proteinase): phân g i ả i protein t hành axit amin.

- Lipase: phân g i ả i chấ t béo ở động vật và thực vật , dầu b é o t h à n h glycerol và các

axit béo.

- Cellulase (gồm nh iều loạ i ) : p h â n g i ả i các hợp chấ t cellulose phức tạp t h à n h các

phân tử đường.

- Beta - glucanase (hoặc gumase): enzym phân g i ả i glucan hoặc dextr in .

- Pectinase: phân g i ả i pectin và các chấ t cacbohydrat c ó nguồn gốc thực vậ t .

6.3. ỨNG DỤNG CỦA CÔNG NGHỆ ENZYM

Công nghệ enzym bao g ồ m q u á t r ình sản xuấ t , phân l ập , t ách chiế t , t inh sạch, sử

dụng d ư ớ i dạng hoa tan, hoặc c ố đ ịnh, hoặc trong các l o ạ i bioreactor k h á c nhau. Công

nghệ enzym có thể g i ả i quyết những v ấ n đ ề học b ú a của x ã h ộ i n h ư sản x u ấ t thức ăn , tạo

nguồn năng lượng, chẩn đ o á n hoặc chữa bệnh, bảo vệ và c ả i t h i ện m ô i t rường sống,

ngh iên cứu phân lập và th iế t k ế gen... Sự phá t t r iển của c ô n g nghệ enzym gắn l i ề n v ớ i sự

phát t r iển của khoa học sinh hoa, c ô n g nghệ v i sinh và các k ỹ nghệ k h á c . Đặc b iệ t , công

nghệ enzym và công nghệ gen là hai n g à n h khoa học song h à n h , bở i enzym ch ính là sản

phẩm của gen. Thay đ ổ i h ệ thống đ iều k h i ể n hoạt hoa gen hoặc c ấ u t rúc của gen có thể

d ẫ n đến sự thay đ ổ i sinh tổng hợp hoặc hoạt t ính của m ỗ i enzym.

6.3.1. Một sô ứng dụng truyền thống và tình hình phát triển của công nghệ enzym

H à n g ngh ìn n ă m về trước n h â n loạ i đã ứng dụng c ô n g nghệ enzym trong sản xuấ t

bia, bánh mì , pho mát . . . m à chưa ý thức được đ iều đ ó . D ư ớ i đây là mộ t số ứng dụng của

công nghệ enzym trong đ ờ i sống xã h ộ i (Bảng 6.3).

136

Bảng 6.3. Công nghệ enzym truyền thống

TT Hướng ứng dụng Các enzym được sử dụng

1 Các chất tẩy rửa sinh học

Chủ yếu là proteinase sản xuất ngoại bào và các amylase

2 Công nghiệp bánh mì

- Các a- amylase sản sinh từ nấm men, xúc tác phân giải tinh bột của bột mì thành đường. Đường tạo ra có thể được nấm men sử dụng. - Các proteinase dùng trong sản xuất bánh bích quy, làm giảm hàm lượng protein trong bột mì.

3 Công nghiệp rượu bia

Các enzym do lúa mạch sản sinh trong giai đoạn ủ men sản xuất bia có vai trò phân giải tinh bột và protein thành đường đơn, amino axit, các peptid làm thức ăn cho nấm men trong quá trình sản xuất cồn. Các enzym sử dụng rộng rãi trong công nghiệp bia là amỵtase, glucanase, proteinase đóng vai trò phân giải polysaccharid và protein trong mạch nha (malt). Enzym gluconase làm cải thiện khả năng lọc của bia. Enzym amỵloglucosidase làm giảm năng lượng của bia. Enzym proteinase: giúp bảo tồn chất lượng bia trong quá trình bảo quản.

4 Công nghiệp sữa Enzym được sự dụng là rennin (dịch vị) có nguồn gốc từ dạ dày của các động vật non nhai lại như bê, cừu, dê. Rennin sử dụng trong công nghiệp sản xuất pho mát, dùng phân giải protein. Các động vật già không thể sử dụng trong sản xuất pho mát bồi vì với tuổi già hơn thì sự sản sinh của rennin bị giảm đi, thay vào đó là proteinase khác - pepsin không thể sử dụng trong công nghiệp sản xuất pho mát. Trong những năm gần đây, nhu cầu pho mát tăng lên đã dẫn đến thiếu hụt rennin. Do vậy.các enzym được sản xuất bởi các vi sinh vật đang được sử dụng với quỵ mô tăng lên trong chế biến sữa. Đó là lipase, lactase.

5 Công nghiệp tinh bột

Các enzym chủ yếu được sử dụng là amylase, amyloglycosidase và glucoamylase đóng vai trò chuyển hoa tinh bột thành glucose và các nước ngọt syrups khác nhau. Glucose isomerase chuyển hoa glucose thành íructose (syrups có hàm lượng íructose cao được sản xuất từ tinh bột đã làm tăng độ ngọt và làm giảm năng lượng của nước ngọt syrups). Các enzym bất động (immobilised) được sử dụng rộng rãi trong sản xuất syrups giàu íructose ở Mỹ và Nhật. ở châu Âu, việc sử dụng enzym bất động bị hạn chế do nhà

nước bảo vệ nông dân sản xuất củ cải đường.

6 Công nghiệp dệt Các enzym được sử dụng là amylase và các enzym vi khuẩn. Amylase được ứng dụng rộng rãi để phân huy tinh bột trong công nghiệp dệt. Các enzym vi khuẩn đươc sử dung do chúng có khả năng hoạt động ở nhiệt độ cao đến

100-110°c.

7 Công nghiệp da Các enzym được sử dụng là các protease: - Các protease đã được tìm thấy ở chó và chim câu - Trypsin được sản xuất từ các nhà giết mổ gia súc - Protease từ vi sinh vật, pancrease từ lợn và bò.

8 Công nghiệp dược

- Các enzym thường được dùng là trypsin dùng rửa vết thương và vết máu.

- Pancreatic trypsin: dùng trong chữa vết bỏng. - Các enzym sử dụng trong chẩn đoán.

137

Công nghệ enzym bắt đầu phá t t r iển manh vào những n ă m 1950 là k ế t q u ả của:

- Công nghiệp sản xuấ t k h á n g sinh h ình thành và phát t r iển đ ã thúc đ ẩ y c ô n g nghiệp sản xuấ t v i sinh vật ở quy m ô l ớ n v ớ i công nghệ cao. T ừ đ ó n g ư ờ i ta c ó t h ể t á ch ch iế t l ây enzym.

- Cấu trúc và những đặc t ính sinh hoa và lý hoa của nh iều enzym đ ã được n g h i ê n cứu. T ừ đ ó m ở ra việc sản xuấ t và khai thác enzym trên quy m ô c ô n g nghiệp.

- Đ a số các enzym sử dụng trong công nghiệp cọ thể được sản xuấ t bằng m ộ t số loài v i sinh vật .

- V i ệ c sử dụng các enzym ngoà i t ế bào (enzym t ính sạch) đã được chứng m i n h là có nhiều ưu t h ế hơn so v ớ i sử dụng enzym ở t ế bào v i sinh vật n g u y ê n v ẹ n n h ư là m ộ t tác nhân xúc tác (sử dụng t ế bào v i sinh đ ể c h ế biến) .

H ạ n c h ế của việc sử dụng t ế bào v i sinh trong sản xuấ t m ộ t số sản p h ẩ m sinh hoa như sau:

- M ộ t lượng l ớ n chấ t nền (cơ chấ t ) bị chuyển hoa thành sinh k h ố i của t ế b à o v i sinh.

- Trong q u á t r ình sản xuấ t có thể xảy ra các phản ứng phụ và sản p h ẩ m phụ v ô ích.

- Đ i ề u k i ệ n sinh t rưởng của cơ thể v i sinh có thể k h á c b iệ t so v ớ i đ i ề u k i ệ n tạo ra các sản phẩm mong muốn .

- Q u á t r ình t inh c h ế đ ể thu h ồ i sản phẩm có thể gặp k h ó k h ă n .

6.3.2. Khai thác enzym tinh chế hoặc cố định

Những hạn c h ế trên đây của việc sử dụng v i sinh vật n g u y ê n v ẹ n n h ư c á c enzym xúc tác có thể được khắc phục bằng cách sử dụng các enzym đ ã được t inh sạch hoặc các enzym được cố đ inh . Trong tương la i các công nghệ lên men t ruyền thống c ó thể thay t h ế bằng các n ồ i phản ứng v ớ i nh iều l o ạ i enzym c ó k h ả n ă n g b i ế n đ ổ i cơ chấ t v ớ i tốc độ cao, năng suất và t ính đồng nhấ t của sản phẩm cao hơn . H i ệ n nay số lượng và chủng loạ i các enzym t inh kh iế t ngày càng t ăng nhanh t rên th ị t rường, v iệc sử dụng c á c c h ế phẩm enzym tinh sạch phụ thuộc nh iều vào giá c h ế phẩm. M ộ t g ă m enzym t inh k h i ế t c ó thể được bán vớ i giá vài t r âm USD. Trong nh iều n g à n h c ô n g nghiệp c h ế b i ến thực p h ẩ m như rượu bia, nước ngọt, bánh m ì việc sử dụng enzym thô trong c h ế b iến đ ã l à m t ăng đáng kể chấ t lượng sản phẩm, tuy nh iên giá thành sản p h ẩ m ch ỉ t ăng nhẹ . M ộ t k g enzym thô đôi kh i chỉ có giá vài USD.

Enzym ngoại bào (extracellular enzym): H ầ u hết các enzym sử dụng ở quy m ô công nghiệp là các enzym ngoà i t ế bào . Các enzym này được t ế bào sản sinh và t i ế t ra

ngoài t ế bào , xúc tác các phản ứng hoa học ngoà i m ô i t rường giống n h ư các enzym h ệ tiêu hoa của n g ư ờ i và động vật . Các enzym như protease, amilase, cellulase, lipase... đ ã được sản xuấ t bằng công nghệ lên men các v i sinh vật như v i khuẩn, n ấ m men, n ấ m sợi... H ầ u hết các enzym này là enzym thủy phân và có khả n ăng hoạt hoa k h ô n g cần đến các cofactor. Các enzym này được tách ra k h ỏ i các v i sinh vật mộ t cách k h á d ễ d à n g

m à k h ô n g làm vỡ t ế bào .

138

Enzym nội bào (intracellular enzym): M ộ t số enzym n ộ i b à o cũng đ ang được sản xuấ t ở quy m ô công nghiệp như glucooxidase d ù n g trong bảo quản thức ăn , asparaginase d ù n g trong đ iều trị bệnh ung thư, penicil l in acylase d ù n g chuyển hoa chấ t k h á n g sinh.

T h ị t rường enzym công nghiệp trước n ă m 1965 là rấ t nhỏ bé . N h ư n g sau đ ó sản xuấ t enzym t ăng rấ t mạnh do enzym đã được sử dụng trong công nghiệp sản xuấ t chấ t tẩy rửa, c h ế b iến n ô n g sản quy m ô lớn . N g à y nay, chấ t t ẩ y rửa c ó chứa enzym đã được sử

dụng phổ b iến trong gia đ ình.

V i ệ c sử dụng enzym tẩy rửa k h ô n g gây ra ô n h i ễ m m ô i t rường hoặc các phản ứng

phụ đ ố i v ớ i n g ư ờ i sử dụng. ở châu Âu , giặ t nước n ó n g (65-70°C) được sử dụng phổ b iến

trong kh i ở Bắc M ỹ hầu hết m á y g iặ t l àm việc ở nhiệ t đ ộ thấp hơn (55°C). Trong k h i ở Nhật Bản, m á y giặ t l àm việc v ớ i nước lạnh và thờ i gian dài hơn . N g ư ờ i ta ngày càng quan tâm hơn đ ế n các enzym tẩy rửa hoạt động ở nhiệt đ ộ thấp từ 20 - 3 0 ° c . Các enzym chủ yếu dùng trong công nghiệp chấ t tẩy rửa là protease, các enzym như amylase và lipase cũng được sử dụng nh iều hem đ ể l àm sạch t inh bột và chấ t béo . Enzym cellulase sử dụng trong tẩy rửa cũng c ó t hể l àm sạch các sợi v ả i b ô n g nhỏ l àm v ả i m ịn hơn .

Trong công nghiệp t inh bột a- amylase và amyloglucosidase đã thay t h ế hoàn toàn

axit trong sản xuấ t dextrose.

Giá bán của các enzym ngày càng có xu hướng g i ảm nhờ có cả i th iện công nghiệp sản xuấ t . Q u á t r ình sản xuấ t đã l àm t ăng t ính đặc thù và c h u y ê n dụng của các enzym, mức độ t inh sạch và lượng sử dụng ít hơn trong c h ế b i ến nhưng v ẫ n bảo đ ả m được h iệu quả sản xuấ t .

Trong những n ă m 1990, ở t h ế k ỷ trước th ị t rường enzym c ô n g nghiệp dao động từ 650 - 750 t r iệu USD n ă m . Trong đ ó khoảng 80% enzym công nghiệp được sử dụng trong ba ngành sản xuấ t ch ính: c h ế b iến t inh bột (40%), tẩy rửa (30%), công nghiệp sữa (10%). Enzym sử dụng trong n g à n h y dược d ù n g để đ iều trị và chẩn đ o á n bệnh cũng

tăng nhanh, tuy nh iên lượng enzym ch ỉ được sử dụng v ớ i số lượng nhỏ .

Các enzym sử dụng trong công nghiệp thường được sử dụng v ớ i t ỷ l ệ Ì - 2 k g enzym để c h ế b iến khoảng Ì t ấ n chấ t nền. G iá l k g enzym vào khoảng 3 - 2 5 ƯSD/kg , ch iếm

khoảng 10 - 14% giá trị của sản phẩm cuối cùng . Các enzym c ô n g nghiệp thường được đóng gói và bán ở dạng lỏng v ớ i mức đ ộ t inh sạch vừa phải . Trong k h i đ ó các enzym dùng trong chẩn đ o á n thường được sử dụng v ớ i lượng vài mi l igam hoặc microgam vớ i độ sạch cao, giá đ ế n 100.000 USD/kg.

H i ệ n nay, c ô n g nghiệp enzym đang phát t r iển theo các hướng cơ bản:

Enzym công nghiệp: k h ố i lượng lớn , cấp đ ộ t inh sạch c ô n g nghiệp;

Enzym d ù n g trong phân tích, chẩn đoán , trị l i ệ u : quy m ô nhỏ , đ ộ t inh sạch cao.

Emym dùng trong sinh học phân tử và công nghệ gen: Các enzym như các enzym

cắt g iớ i hạn (restriction endonuclease, tag polymerase...) là k h ô n g thể th iếu trong nghiên

cứu CNSH và c ô n g nghệ A D N tái tổ hợp.

139

6.3.3. M ộ t số l ĩ n h vực ứ n g d ụ n g quan t r ọ n g của enzym c ô n g n g h i ệ p

C ô n g nghệ enzym đã đ ó n g g ó p quan trọng trong công nghiệp thực p h ẩ m n h ư bia, bánh mì , l àm rượu vang, sản xuấ t pho mát , các chấ t bột g iặ t , các l o ạ i nước uống n g h è o năng lượng, chuyển hoa và làm sạch chấ t thả i , l àm sạch m ô i t rường đ ấ t và nước. . . sử dụng enzym trong công nghệ gen đ ể tạo giống m ớ i và các dược chấ t .

D ư ớ i đây là một vài ví dụ về ứng dụng của công nghệ enzym trong c ô n g nghiệp :

6.3.3.1. Sản xuất nước ngọt

Các loạ i nước g i ả i khá t syrup thường có chứa ữutose và glucose ở t ỷ l ệ n h ư nhau. Các nước g i ả i khá t g iấu í ruc tose có nhu cầu nh iều hơn so v ớ i glucose t inh sạch, bở i í ruc tose ngọt hơn so vớ i glucose. Do vậy, nếu chuyển hoa được glucose t h à n h íh ic tose thì giá trị thương m ạ i của sản phẩm sẽ tăng lên đ á n g kể .

Công nghệ xử lý bằng enzym là con đường chủ y ế u trong sản xuấ t chấ t ngọt h iện nay, bao g ồ m các loạ i syrup từ đường sucrose và t inh bột có chứa h ỗ n hợp của glucose, maltose, í ruc tose và các đường khác . Syrup giàu fructose từ t inh bột n g ô là chấ t ngọt ch ính ở M ỹ .

Syrup giàu ữuctose được sản xuấ t từ vật l i ệ u t inh bột rẻ t i ề n , trong đ ó sử dụng 4 loạ i enzym tham gia ch ính vào q u á tr ình. M ộ t số các enzym được sử dụng trong sản xuấ t chấ t ngọt:

a-amylase: T h ú y phân các l iên kế t oe-1,4 trong mạch polymer của glucose tạo ra các mạch phân tử ngắn hơn g ọ i là dextrin.

Tiếp theo là các enzym khác n h ư P-amylase, amyloglucosidase, pullulanase và cuối cùng là glucose isomerase.

Tinh bột thu nhận được trong dung dịch nước có chứa khoảng 33% chấ t t inh bột sau

kh i ngô đã được ép l ấ y dầu béo và protein, x ử lý t inh bột bằng oc-amylase- m ộ t enzym có nguồn gốc từ Bacỉllus licheni/ormis.

Công nghiệp chuyển hoa đường trước đây thường ch ỉ sử dụng axit đ ể t húy phân tinh bột và đường sucrose. Tuy nh iên , phương p h á p này c ó h i ệu quả chuyển hoa thấp, tiêu phí nhiều năng lượng, giá thành cao, sản phẩm k é m t inh sạch. N g à y nay, n g ư ờ i ta áp dụng công nghệ enzỵm để chuyển hoa đường khắc phục h o à n toàn nhược đ i ể m của công nghệ cũ. Công nghệ này dựa trên c ố đ ịnh t ế bào n ấ m men trên giá thể v ô c ơ k h ô n g hoa tan vớ i sự tham gia của các enzym đặc thù để chuyển hoa đường thành chấ t ngọt , các chấ t t inh bột được xử lý bằng kế t hợp của các enzym thuộc n h ó m amylo ly t ic tạo ra glucose.

Đường hoa ở nhiệt đ ộ khoảng 6 0 ° c sau Ì - 3 ngày , t inh bột được chuyển hoa t hành các phân tử nhỏ hơn g ọ i là dextrin, sau đ ó các enzym từ n ấ m phân g i ả i dextr in thành glucose syrup. Dung dịch này tuy ngọt nhưng độ ngọt của n ó ch ỉ bằng 1/2 so v ớ i đ ộ ngọt của ữuctose. Chuyển hoa glucose thành í íuc tose bằng enzym glucose isomerase, làm t ăng đ ộ ngọt của nước syrup. Enzym glucose isomerase được sản xuấ t bở i m ộ t số

loài v i sinh vật khác nhau.

140

6.3.3.2. Sử dụng enzym trong công nghiệp dệt

C ó sáu n h ó m enzym khác nhau:

- Oxidoreductase

- Transferase

- Hydrolase

- Lyase

- Isomerase

- Ligase

H ầ u hết các enzym sử dụng trong công nghiệp dệt thuộc n h ó m 3: hydrolase. Công thức hoa học chung v ớ i sự tham gia xúc tác của hydrolase n h ư sau:

A - X + H 2 0 - > X - O H + H A , trong đ ó A và X là hai thành phần của cơ chấ t

Các enzym được sử dụng trong công nghiệp dệt và chất tẩy rửa gồm:

- Amylase: a-amylase, Ị3-amylase, amyloglucosidase, pullulanase.

- Protease

- Cellulase: Endoglucanase, cellobiohydrolase, cellobiase

- Hemicellulase và pectinase (pectinesterase, endo và exopectinase, lyase)

- Lipase

- Catalase

Các enzym trên có thể phân huy một cách nhanh chóng hầu hết các chấ t hữu cơ gây bẩn.

6.4. KỸ THUẬT GEN VÀ KỸ NGHỆ PROTEIN TRONG LĨNH vực CÔNG

N G H I Ệ P E N Z Y M

C ô n g nghệ gen cho p h é p chuyển gen m ã hoa c á c enzym hữu ích từ m ộ t cơ thể

sống sang m ộ t c ơ t h ể sống k h á c . K h i m ộ t enzym được xác đ ịnh là c ó t i ề m n ă n g sử dụng trong c ô n g nghiệp, n g ư ờ i ta t i ế n h à n h t ách và n h â n d ò n g gen của enzym này ,

chuyển gen vào m ộ t v i sinh vật th ích hợp và xây dựng c ô n g nghệ lên men v i sinh này để sản xuấ t sinh k h ố i v i sinh và enzym. Bằng k ỹ thuật gen c ó thể tạo ra các chủng v i

sinh vật đặc thù có k h ả n ăng sản xuấ t enzym ở quy m ô c ô n g nghiệp v ớ i sản lượng và độ t inh sạch cao. Các bước ứng dụng c ô n g nghệ gen trong sản xuấ t enzym được m ô tả bằng sơ đ ồ (trang sau).

M ộ t ví dụ về công nghệ sản xuấ t enzym là sản xuấ t chấ t tẩy rửa lipolase sử dụng để làm sạch các vế t bẩn do chấ t béo . Enzym này l ầ n đầu được phát h i ện ở n ấ m Humicola languinose nhưng v ớ i h à m lượng rấ t thấp k h ô n g đ á p ứng nhu cầu sản xuấ t thương m ạ i .

H ã n g Novo Nordisk A/S đã tách gen m ã hoa lipolase và chuyển gen này vào n ấ m Aspergillus oryzea.

141

Sinh vật có enzym hữu ích

Tách và tinh sạch enzym Tách và tinh sạch mARN

Xác định trình tự axit amin trong enzym

Tạo cADN

Thiết kế và tổng hợp mồi oligonucleotid

Nhân dòng cADN (ở vi khuẩn E.coli)

Xác định gen mã hoa enzym

Thiết kế vector mang gen mã hoa enzym

ị

Chuyển gen vào một vi sinh vật thích hợp cho lên men công nghiệp ví dụ nấm Aspergillus oryzae

Sản xuất enzym công nghiệp

Chủng n ấ m chuyển gen đã cho sản lượng enzym cao trong đ i ề u k i ệ n sản xuấ t công

nghiệp. Enzym sản xuấ t đã tỏ ra rấ t h i ệu quả trong tẩy rửa ở c ác đ iều k i ệ n k h á c nhau, ổn

đ ịnh và bền vững ở các nhiệt đ ộ và đ ộ p H dao động trong q u á t r ình g iặ t bằng m á y . Bên

cạnh đó , lipolase còn chống chịu được v ớ i hoạt t ính thúy p h â n protein của protease dùng

trong cùng mộ t quá tr ình tẩy rửa.

V i ệ c cả i t i ến các enzym nhằm làm tăng/hoặc thay đ ổ i khả nâng xúc tác hoa học của

enzym đã được thực h i ện l iên tục. Trước đây , đ ể c ả i th iện enzym, n g ư ờ i ta chủ y ế u đã

thực h iện các chương t r ình gày đ ộ t b i ến . N g à y nay, k ỹ thuật d i t ruyền, c ô n g nghệ

protein đã được ứng dụng đ ể l àm thay đ ổ i sinh tổng họp, cấu t rúc phân tử, hoạt t ính của

enzym và đ ộ bền của các enzym này trong những đ iều k i ệ n sản xuấ t .

Mục tiêu ứng dụng của kỹ thuật gen làm cải tiến enzym gồm:

- L à m t ăng hoạt t ính của enzym.

142

- L à m tăng đ ộ bền của enzym và làm n ó c ó thể th ích nghi v ớ i các đ iều k i ệ n mô i

t rường thay đ ổ i .

- L à m thay đ ổ i đ ộ p H và nhiệt đ ộ t ố i ưu trong hoạt hoa của enzym.

- L à m thay đ ổ i t ính đặc thù của một enzym, l à m cho enzym này có thể xúc tác chuyển hoa các cơ chấ t khác nhau.

Kỹ thuật gen có thể tác động lên enzym theo các hướng sau:

- N g h i ê n cứu chức năng của enzym và các đơn vị cấu t rúc nên nó : Thay đ ổ i m ã d i t ruyền bằng gây độ t b iến ở gen m ã hoa enzym và sau đ ó chuyển gen đã thay đ ổ i vàọ m ộ t v i sinh vật thích hợp để sản xuấ t và phân t ích enzym đã bị đ ộ t b i ến . Đ ộ t b i ến được thực hiện ở những vùng nhấ t đ ịnh của enzym g iúp ta h iểu b iế t t h ê m về chức n ăng và cấu trúc của enzym, cũng như tương tác của n ó v ớ i chấ t nền đặc thù.

- Nâng cao hoạt t ính hoặc đ ộ bền của enzym: Thay đ ổ i cấu trúc tự nh iên của một enzym bằng kỹ thuật gen. Đ â y là mộ t t i ến bộ của kỹ thuật gen và công nghệ protein đã được ứng dụng thành công ở enzym phospholipase A 2 , enzym này đã được l àm thay đ ổ i cấu trúc và trở nên chống ch ịu được m ô i t rường axit nồng đ ộ cao.

Các yếu tố tác động lên hoạt tính và độ bền của các enzym:

- Đ ộ p H của m ô i t rường có ảnh hưởng sâu sắc tớ i hoạt t ính của các enzym. Đ ộ p H t ố i ưu đ ố i v ớ i hoạt t ính của m ỗ i enzym là khác nhau. Hoạt t ính xúc tác của các enzym từ chủng v i sinh đạt t ố i ưu ở c ác đ ộ p H từ 4 - 7,5.

- Nh iệ t đ ộ là m ộ t y ế u t ố quan trọng khác đ ố i v ớ i hoạt t ính và đ ộ bền của enzym, các enzym khác nhau c ó nhiệ t đ ộ hoạt hoa t ố i ưu k h á c nhau. H ầ u hết các enzym thúy phân có nồng đ ộ hoạt hoa t ố i ưu giao động từ 37- 6 0 ° c .

- Thay đ ổ i h ệ đ i ề u h à n h sinh tổng hợp enzym: ví dụ , gây đ ộ t b i ến gen đ iều chỉnh sinh tổng hợp enzym có thể l àm t ăng q u á t r ình sản sinh enzym của t ế bào sống lên rấ t nhiều lần .

143

Chương 7

C Ô N G N G H Ệ S I N H H Ọ C V I S I N H

7.1. S ơ L Ư Ợ C V Ề L Ị C H s ử H Ì N H T H À N H C Ô N G N G H Ệ V I S I N H

Con n g ư ờ i đã ứng dụng v i sinh vật trong sản xuấ t rượu, b á n h m ỹ , bia và c h ế b iến

thực phẩm.. . từ h àng ngh ìn n ă m về trước. Tuy vậy, khoa học về c ô n g nghiệp v i sinh ch ỉ bất đầu khoảng 150 n ă m trước. Lecuvenhoek là n g ư ờ i đ ầ u t iên quan sát t h ấ y v i sinh vật vào khoảng n ă m 1677. Schwan (1837) phát h i ện thấy vai t rò của n ấ m men trong sản xuấ t rượu và việc bổ sung n ấ m men đã l àm thúc đ ẩ y nhanh q u á t r ình lên men. N ă m 1857, Pasteur đã công b ố kế t quả ngh iên cứu lên men sản xuấ t axit lactic. N ă m 1857 có thể được coi là n ă m ra đ ờ i cơ sở khoa học của v i sinh c ô n g nghiệp. N ă m 1860, Pasteur đã thông báo môi t rường nhân tạo đ ầ u t iên cho nuô i cấy v i sinh vật và sử dụng môi trường này cho ngh iên cứu lên men rượu. N ă m sau đ ó , t hông qua n g h i ê n cứu sinh t rưởng và sinh lý của n ấ m men trong sản xuấ t rượu, ô n g đã cho thấy vai t rò của 0 2 t rong quá trình lên men. N ă m 1878, Lister đã xây dựng thành c ô n g p h ư ơ n g p h á p pha l oãng để phân lập các chủng v i sinh vật thuần chủng (lên men axit lactic). Sau đ ó Robert Koch (năm 1881) đã hoàn th iện k ỹ thuật phân lập và n h â n d ò n g v i sinh vậ t t rên m ô i trường thạch cứng. N ă m 1897, Buchner đã chứng minh rằng q u á t r ình lên men c ó thể xảy ra trong môi t rường k h ô n g có t ế bào m à chỉ có dịch n ấ m men. Theo ô n g các enzym protein đã là tác nhân trực t iếp của sự lên men rượu. N ă m 1917, D'Herelle đã m ô tả m ộ t loạ i ký sinh của v i khuẩn và đặ t tên cho n ó là Bacteriophage. Bacteriophage đã luôn luôn đe doa v i khuẩn và actinomycetes sử dụng trong quá t r ình lên men.

Năm 1929, Alexander Reming đã phát minh ra Penicillin do n ấ m pencilỉium sản sinh ra có tính kháng vi khuẩn rất mạnh và cho thấy chất này ít độc t ố vớ i ngườ i và động vật. Phát minh đó đã dẫn đến các nghiên cứu tìm k i ế m kháng sinh quy m ô lớn trong thờ i gian đ ạ i chiến

thế giói n . Kế t quả một loạt các kháng sinh mớ i như Streptomycin, Chloramphenicol, Tetracyclin, v.v... đã được tìm ra. Sau đó các kỹ thuật gây đột biến đã tạo ra hàng loạt các chủng vi sinh vát cổ hiệu quả rất cao trong sản xuất kháng sinh công nghiệp.

7.2. VAI TRÒ CỦA VI SINH VẬT TRONG Tự NHIÊN VÀ ÚNG DỤNG CỦA VI

S I N H V Ậ T

Các loài v i sinh vật bao g ồ m n ấ m , v i khuẩn, virus đ ó n g vai t rò rấ t quan t rọng trong chu trình chuyển hoa vật chấ t và n ăng lượng trên trái đấ t .

N h ư chúng ta đã b iết quang hợp t rên trái đ ấ t h àng n ă m sản sinh ra m ộ t lượng sinh k h ố i các chấ t hữu cơ khổng l ồ . V i ệ c c h ế b i ến sinh k h ố i khổng l ồ đ ó thành vậ t l i ệ u và năng lượng sẽ là nh i ệm vụ quan trọng của công nghệ v i sinh và c ô n g nghệ enzym trong tương lai .

Trong thiên nhiên , các v i sinh vật có thể phân g i ả i tấ t cả các nguồn chấ t hữu c ơ ở dạng các polymer sinh học thành các chấ t đơn g iản hơn như đường đơn , axit amin , c á c nucleotid, các axit hữu cơ, các l o ạ i kh í như C 0 2 , chấ t đố t như k h í metan, cồn , các chấ t k h o á n g d ễ t iêu.

144

Các v i sinh vật c ò n là các tác nhân gây bệnh nguy h i ể m ở n g ư ờ i , cây trồng và vật nuô i .

Vai trò của vi sinh vật ứng dụng có thể tóm tắt như sau:

Các sản phẩm hữu cơ qua c h ế biến bằng công nghệ v i sinh hoặc c ô n g nghệ enzym có thể sử dụng l àm thức ăn, nước uống, dược l i ệ u , nguồn n ă n g lượng sinh học, phân bón và thuốc bảo vệ thực vật sinh học.

- Chuyển hoa các chất hữu cơ thành các l oạ i hoa chấ t d ù n g trong c ô n g nghiệp thực phẩm, y tế , công nghệ vật l i ệ u , năng lượng sinh học...

- Sản xuấ t các loạ i thuốc bỊío vệ cây trồng và vật nuô i .

- Sản xuấ t các loạ i phân bón sinh học và thức ân c h ă n nuô i .

- X ử lý ô n h i ễ m m ô i t rường: Các chấ t thả i của hệ thống c ô n g nghiệp, chấ t thả i sinh hoạt của con n g ư ờ i và phân hữu cơ do h ệ thống c h ă n nuô i có thể được các l o ạ i v i sinh vật phân huy thành phân b ó n và n ăng lượng như kh í metan.

- C h ế biến nông sản: Các sản phẩm n ô n g nghiệp như sắn, đường, các phụ l i ệ u hữu cơ sản xuấ t quy m ô l ớ n c ó thể c h ế b iến bằng hệ thống c ô n g nghiệp v i sinh thành các dược chất, nguồn năng lượng sinh học sạch như cồn, ethanol, butanol, kh í metan...

Bảng 7.1. Một số sản phẩm của công nghiệp vi sinh

l i Phân loại sản phẩm Tên cụ thể của các sản phẩm 1 Amino axit nhưL- Glutamic, L- Lysine,... 2 Kháng sinh như penicillin, streptomycin, tetracyclin, 3 Nước uống có cồn rượu vang, bia, rượu, cồn chưng cất. 4 Enzym Amilase, protease, pectinase, invertase, cellulase... 5 Chất dẻo phân giải sinh học p- polyhydroxybutyrate,... 6 Chất gia vị Monosodium glutamate, nucleotids 7 Khí gas C0 2, H 2, khí metan,... 8 Axít hữu cơ Lactic, citric, acetic, butyric, íumaric. 9 Dung môi hữu cơ Acetone, ethanol, butanol,... 10 Vitamin B 1 2 , riboílavin, vitamin A,... 11 Các chất hoạt tính sinh học steroid, gibberellin,... 12 Protein tái tổ hợp Insulin, interíeron, vacxin... 13 Thực phẩm Pho mát, sữa chua, bánh mỹ...

Các co chất cho tổng hợp hoa học 14 Sinh khối tế bào - Nấm men thức ăn và chăn nuôi, protein đơn bào.

- Phân bón sinh học, thuốc sâu vi sinh, mycorrhyzae, tác nhân xử lý môi trường. - Vaccine: vacxin từ virut và vi khuẩn.

15 Các hoạt động sinh học khác - Chuyển hoa cơ chất sản xuất hoa học: steroid, kháng sinh, D- SorbitoL - Xử lý phân huỷ chất thải từ môi trường nông nghiệp, công nghiệp và sinh hoạt, phân huy các chất độc hại ỏ môi trường như thuốc sâu, thuốc diệt cỏ, dầu mỏ...

145

7.3. C Ô N G N G H I Ệ P L Ê N M E N V I S I N H V Ậ T

7.3.1. V ậ t l i ệ u của c ô n g n g h i ệ p v i s inh

Quang hợp cung cấp toàn bộ vật l i ệ u và năng lượng cho t ồ n t ạ i của sự sống t rên trái đấ t . Theo M i n E. Smith (1996) quang hợp tạo ra sinh k h ố i v ớ i ước t ính khoảng 120 t ỷ tấn chấ t k h ô trên mặ t đấ t và 50 tỷ tấn từ đ ạ i dương , trong đ ó lignocellulose c h i ế m

khoảng 50%. Khoảng 44% sinh k h ố i trên trái đấ t do rừng tạo ra, trong k h i đ ó tổng sinh k h ố i cây trồng n ô n g nghiệp cung cấp lương thực nuô i dưỡng cả n h â n l o ạ i t ính ra chỉ ch iếm khoảng 6% tổng sinh k h ố i của trái đấ t . T h ế g iớ i hữu cơ do quang hợp tạo ra là nguồn vật l i ệ u vô tận của c ô n g nghiệp v i sinh. Tuy nh iên , c á c chấ t hữu c ơ và sinh k h ố i đ ó thường tồn t ạ i ở các dạng thức khác nhau (như sinh k h ố i xanh, sinh k h ố i h ó a gỗ . . . ) và khá phân tán, k h ó thu gom trong k h i c ô n g nghệ c h ế b iến c ò n đ a n g ư ê n đ ư ờ n g p h á t t r iển.

Sản lượng các sản phẩm n ô n g nghiệp và l â m nghiệp h à n g n ă m g ồ m ngũ cốc, đường, cá , t inh bột thô và c h ế b iến , vật l i ệ u g ỗ , hoa chấ t . . . được thể h i ệ n ở bảng 7.2 cho thấy nhiều sản phẩm khác nhau của quang hợp đ ế n nay v ẫ n chưa được sử dụng, nhấ t là các chấ t thả i n ô n g nghiệp.

Sinh k h ố i của n ô n g nghiệp, thúy sản và rừng là t i ề m n ă n g k i n h t ế to l ớ n của nhiều

quốc gia, nhấ t là các nước ở khu vực nhiệt đ ớ i và cận nhiệ t đ ớ i . Tuy nh iên , những sinh k h ố i t i ề m tàng đ ó còn chưa được khai thác vì t h i ếu các p h ư ơ n g t i ệ n c ô n g nghệ .

Bảng 7.2. Sản lượng một số sản phẩm nông nghiệp hàng năm (Theo FAO)

Chủng loại Sản phẩm Sản lượng (Tấn/năm)

1. Nông sản Ngũ cốc Dao đông 1,8 -1,9 tỷ tấn năm (FAO, 2004)

1. Nông sản

Đường 144,2 triệu tấn niên vụ 2005/2006

1. Nông sản

Sắn 208,0 triệu tấn (2006)

1. Nông sản

Cá 130,2 triệu tấn, trong đó 37,9 triệu tấn cá nước ngọt (năm 2001) (FAO, 2004)

2. Vật liệu Gỗ tròn (không kể gỗ làm củi, đốt) 1,5 tỷ m 3 2. Vật liệu

Giấy 328,1 triệu tấn (năm 2003)

3. Hoa chất Các loại dầu thực vật 387,7 triêu tấn năm 2004/2005 FAO 20Ỏ5

3. Hoa chất

Cao su tự nhiên 9,7 triệu tấn (2006)

Các sản phẩm quang hợp trong q u á k h ứ g ồ m dầu m ỏ , k h í đố t , than đ á đ ó n g vai t rò

sống còn đ ố i vớ i hệ thống c ô n g nghiệp và văn minh nhân l o ạ i . Tuy nh iên , ch ỉ c ác nước

công nghiệp đ ó n g vai trò chủ đạo trong khai thác và sử dụng các nguồn n ă n g lượng hữu

cơ này. M ỹ chỉ ch i ếm 6% dân số, Tây  u ch iếm 8% dân số toàn cầu n h ư n g M ỹ sử dụng

tớ i 3 1 % , Tây  u sử dụng 20% sản lượng dầu kh í toàn t h ế g i ớ i .

146

D ự k i ế n than đá còn đ ủ khai thác trong vài t r ăm n ă m , n h ư n g dầu m ỏ và k h í đ ố t có thể cạn k i ệ t trong t h ế k ỷ X X I . Do vậy, năng lượng sinh k h ố i do quang hợp có thể t rở t hành nguồn n ăng lượng quan trọng của công nghiệp trong tương la i .

H i ệ n nay, nâng lượng do quang hợp tích l ũ y h à n g n ă m l ớ n hem gấp khoảng trên l o lần so toàn bộ năng lượng do nhân loạ i sử dụng. Tuy nh iên việc khai thác sinh k h ố i do quang hợp bị hạn c h ế do một số nguyên nhân , trong đ ó g iá dầu k h í còn thấp, sự đ a dạng của các nguồn sinh k h ố i thô k h ó sử dụng, t ính chấ t phân tán và mức đ ộ đ ậ m đặc thấp của n ăng lượng sinh k h ố i thô. T ừ sinh k h ố i nhân loạ i đã và có thể c h ế b iến thành nhiều

nguồn năng lượng và vật l i ệ u khác nhau như kh í đ ố t (kh í sinh học, metal, cồn từ nước mía và lên men cellulose, các loạ i dầu béo , than củ i , phân b ó n hữu cơ và các l o ạ i thức ăn bổ sung đ ạ m từ t ế bào đơn. . .

Các vật liệu thô tự nhiên:

Các vật l i ệ u thô tự nh iên có nguồn gốc từ n ô n g nghiệp, công nghiệp c h ế b iến và l âm nghiệp. Các vật l i ệ u này chủ yếu là các hợp chấ t của hydro và cacbon (cacbonhydrates) vớ i mức đ ộ cấu trúc hoa học phức tạp khác nhau g ồ m đường, t inh bột, hemicellulose, cellulose, l ignin . Các sản phẩm phụ , p h ế thả i n ô n g l â m nghiệp n h ư thân lá các l oạ i ngũ

cốc, lõi ngô , vỏ cà phê , ca cao, x ơ dừa, vỏ và lá hoa quả, bông. . .

Các loạ i vật l i ệ u thô chứa đường như mía , củ cả i đường là các vật l i ệ u rấ t quan trọng của công nghệ sinh học c h ế b iến . Brazil đã sử dụng mía đường để sản xuấ t năng lượng cồn quy m ô lớn .

Các loạ i vật l i ệ u chứa t inh bột như các l o ạ i hạt ngũ cốc, các l o ạ i củ (khoai tây, khoai lang, sắn...). Nhược đ i ể m của vật l i ệ u chứa t inh bột này trong c h ế b i ến là yêu cầu đường hoa tinh bột, chuyển hoa t inh bột thành đường đơn (monosaccharid) và oligosaccharid trước kh i lên men. H i ê n t ạ i , nh iều quy tr ình công nghệ sinh học c h ế b iến t inh bột đã đ-ược phát t r iển, trong đ ó c ó sản xuấ t nh iên l i ệ u .

Các loạ i cellulose từ n ô n g l âm nghiệp chắc chắn sẽ phải là vật l i ệ u quan trọng của công nghiệp công nghệ sinh học để sản xuấ t nh iên l i ệ u , vật l i ệ u và hoa chấ t . Tuy nhiên, cellulose là một hoa chấ t phức tạp và có l iên kế t chặt chẽ v ớ i l i gn in tạo ra lignocellulose là thành phần cơ bản của g ỗ - lignocellulose là nguồn vật l i ệ u tái sinh l ớ n nhấ t . Đ ể phân giả i được loạ i vật l i ệ u cứng này trước k h i sử dụng chúng cho công nghiệp v i sinh đòi h ỏ i chi phí nhiều năng lượng. Cellulose n g u y ê n chấ t có thể bị phân g i ả i bằng hoa chấ t và enzym trong quá t r ình thúy phân để tạo rá các loạ i đường hoa tan. Đường hoa tan này có thể sử dụng làm vật l i ệ u cho nhiều quá t r ình công nghệ c h ế b iến đ ể sản xuấ t etanol, butanol, aceton, metan, đ ạ m đơn bào và nhiều sản phẩm k h á c . C ô n g nghệ c h ế b iến

cellulose và lignocellulose đã được ngh iên cứu ở rấ t nh iều p h ò n g thí nghiệm trên t h ế

g iớ i . Những k h ó k h ă n về kỹ thuật của công nghiệp c h ế b iến ch ỉ còn là v ấ n đề thờ i gian.

H i ệ n nay t rên bề mặ t t rái đ ấ t khoảng 3,3 X l o 1 4 k g C 0 2 được c ố đ ịnh m ỗ i n ă m và khoảng 6% của sinh k h ố i đ ó sẽ là ce l lu íose tương đ ư ơ n g v ớ i 22 t ỷ t â n / n ă m . T í n h ra t rên phạm v i toàn cầu cây trồng sản xuấ t ra khoang 24 t ấ n cellulốse t rên đ ầ u n g ư ờ i m ỗ i n ă m . N g ư ờ i ta cho rằng cellulose sẽ t rở t hành nguồn vậ t l i ệ u chủ lực của c ô n g nghiệp sinh học.

147

Các sản phẩm phụ của nông nghiệp:

C ô n g nghiệp CNSH sẽ sử dụng dụng nh iều sản phẩm n ô n g nghiệp n h ư đường , t inh bột , dầu béo. . . như là cơ chấ t đ ể c h ế b iến . Các chấ t thả i n ô n g nghiệp được khai thác và sử dụng chưa nh iều và h iện là đ ố i tượng ngh iên cứu. Các p h ế t hả i n ô n g l â m nghiệp g ô m nhiều l oạ i n h ư thân lá cây ngũ cốc, rau hoa quả c ò n l ạ i sau k h i thu hoạch, chấ t p h ế t hả i đậu tương, sơ vỏ quả dừa, t rấu, lõi n g ô , bã hạt cà phê , b ã mía , g ỉ đường , p h ế t h ả i l âm nghiệp n h ư m ù n cưa, c à n h lá sau k h i thu gỗ . . . M ụ c t iêu quan t rọng của C N S H là phải nâng cao quản lý và sử dụng chấ t thả i để chuyển hoa c h ú n g t h à n h c á c sản p h ẩ m phụ thu đồng thòi t ránh gây ô n h i ễ m m ô i t rường.

7.3.2. Chủng giống vi sinh công nghiệp

T h à n h c ô n g của q u á t r ình lên men công nghiệp phụ thuộc chủ y ế u v à o chủng giống v i sinh chọn lọc . M ộ t chủng giống v i sinh công nghiệp phả i c ó c á c đặc t ính c ơ bản sau:

Ì . Phải thuần nhấ t (gồm các cá thể hoàn toàn g iống nhau)

2. Phải sạch bệnh (không bị n h i ễ m thực khuẩn thể phage)

3. Phải ổn đ ịnh v ề d i t ruyền: Các chủng c ô n g nghiệp t hường được tạo ra từ các chủng dạ i bằng gây đ ộ t b i ến hoặc chuyển gen (trong t rường hợp sản x u ấ t vacxin tái tổ hợp, hoặc sinh dược) . Trong đ iều k i ệ n sản xuấ t ở c ác chủng n à y d ễ x ả y ra c á c đ ộ t b iến

ngược (đột b i ến chuyển chủng sản xuấ t t hành chủng dạ i ) v ớ i tần số đ ộ t b i ế n cao ở các chủng k é m ổn đ ịnh về d i t ruyền. M ặ t k h á c , ngay cả ở c ác chủng c ó đ ộ ổn đ i n h d i t ruyền

cao thì đ ộ t b iến ngược v ẫ n cứ x ả y ra n h ư m ộ t tấ t y ế u . D o vậy , v iệc t uyển chọn, bảo tồn

và cả i t i ến g iống phải là việc thường x u y ê n . Ở đây , vai t rò của c á c n h à d i t ruyền và sinh

hoa v i sinh là rấ t quan trọng.

4. Chủng giống phải c ó k h ả n ă n g sản sinh cả 2 l o ạ i t ế b à o ( t ế b à o sinh dưỡng -vegetative và t ế b à o b à o tử - spore). Các loài ch ỉ c ó k h ả n ă n g sản sinh t ế b à o dạng sợi -mycel l ium rấ t ít được sử dụng trong q u á t r ình lên men c ô n g nghiệp.

5. Chủng giống phải sinh t rưởng mạnh m ẽ sau giai đ o ạ n ủ g iống .

6. Chủng giống ch ỉ sản xuấ t sản phẩm có giá tr ị , k h ô n g sản sinh c á c sản phẩm phụ có độc t ính.

7. Sản phẩm của chủng giống phả i được sản xuấ t trong thờ i gian ngắn, khoảng 72 giờ .

8. Chủng giống có thể bảo quản được lâu đ ể sử dụng trong nh iều chu k ỳ sản xuấ t .

9. K h ả n ăng lây n h i ễ m phả i thấp nhấ t trong đ iều k i ệ n sản xuấ t t ố i ưu

7.3.3. Lên men công nghiệp

C ô n g nghiệp lên men là q u á t r ình chuyển hoa các chấ t hữu cơ, chủ y ế u là c á c vật l i ệ u của các n g à n h n ô n g l â m nghiệp và thúy sản vớ i sự tham gia của c á c v i sinh vật thành thức ân n h ư pho má t , sữa chua, nước m ắ m , tương, x ì dầu, nước g i ả i k h á t các l o ạ i , rượu bia, k h á n g sinh, sinh dược... M ộ t số sản phẩm của công nghệ lên men được l i ệ t k ê ớ bảng 7.2.

148

Bảng 7.2. Các sản phẩm của công nghiệp lên men

Ngành nghề Tên sản phẩm

Hoa hữu cơ Ethanol butanol, aceton, các axit hữu cơ (axit citric, lactic...), các enzym, chất thơm và polysaccharid.

Các sinh dược Kháng sinh, kít chẩn đoán(enzym, kháng thể đơn dòng), chất ức chế

enzym, vacxin, steroid.

Năng lượng Bioethanol, biometanol, khí mê tan, sinh khối.

Thức ăn Các sản phẩm sữa, nước uống, men bánh mì, chất bổ sung vào thức ăn, antioxidant, chất màu thực phẩm, nước chấm, các loại nấm ăn và nấm dược liệu, các loại vitamin và axit amin, các loại nước syrup giàu glucose và íructose.

Các sản phẩm cho nông nghiệp

Các chất hoạt tính sinh học là protein, thức ăn chăn nuôi, vacxin gia súc, gia cầm, các chất bổ sung cho thức ăn chăn nuôi, các hormon sinh trưởng, phân bón, thuốc sâu bệnh vi sinh, nấm cộng sinh rễ cây mycorrhizal...

Bên cạnh các sản phẩm thức ăn , nước uống, c ô n g nghiệp lên men hướng vào sản xuấ t ngày càng nh iều các sản phẩm khác :

- Sản xuấ t mộ t số các chấ t sơ cấp: axit acetic, axit lactic, glycerol, aceton, butyl alcohol, các acid hữu cơ, axit amin, vi tamin, polysaccharid...

- Sản xuấ t các chấ t thứ cấp (các chấ t k h ô n g có chức n ăng rõ ràng trong trao đ ổ i chấ t của cơ thể sống sản sinh ra nó) : penici ỉ l in, streptomycin, cephalosporin, gibberellin...

- Sản xuấ t các enzym và sinh dược quan trọng trong công nghiệp và đ ờ i sống như các enzym ngoại bào (amilase, pectinase, protease) các enzym n ộ i bào (invertase, asparaginase), các enzym cắt g iớ i hạn, in ter íeron, insulin, hormon sinh t rưởng.. .

- Các sản phẩm của công nghệ lên men sẽ n g à y càng nh iều và g iá trị th ị t rường của chúng sẽ ngày c à n g l ớ n . N h i ề u hoạt chấ t k h ô n g thể sản xuấ t bằng con đường hoa học mà đòi h ỏ i quy t r ình c ô n g nghệ sinh học v ớ i việc sử dụng hệ thống th iế t bị bioreators.

Bioreator trong c ô n g nghiệp nuô i cấy đã được ngh iên cứu t ố i ưu cho sự sinh t rưởng của sinh k h ố i và sau đ ó cơ thể sống thực h iện việc b iến đ ổ i hoa học để sản xuấ t sản phẩm cuối cùng (ví dụ k h á n g sinh, enzym hoặc axit amin...) hoặc phân huy mộ t số hợp chất để l àm sạch m ô i t rường). Rấ t nh iều sản phẩm quan trọng như 1 k h á n g sinh, vi tamin được sản xuấ t v ớ i c ô n g nghệ v i sinh t ố i ưu.

7.4. MỘT SỐ NGUYÊN LÝ TRONG SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT

Sinh t rưởng của v i sinh vật được b iểu h i ện ở sinh k h ố i hoặc số t ế bào v i sinh sản sinh ra trong m ộ t đơn v ị thờ i gian. Tốc đ ộ sinh t rưởng của v i sinh vật phụ thuộc vào một số yếu t ố ch ính sau:

- Đặc đ i ể m d i t ruyền của các chủng v i sinh. Đặc đ i ể m này c ó thể được cả i tạo bằng đ ộ t b iến thực ngh iệm và kỹ thuật gen.

- Cung cấp đ ủ các chấ t dinh dưỡng cần th iế t cho t ế bào .

- Các yếu t ố m ô i t rường như đ ộ p H , nhiệt độ , đ ộ thông khí . . .

149

- R ú t k ịp t hờ i c á c chấ t cặn bã hoặc độc tố , hoặc sản p h ẩ m ra k h ỏ i m ô i t r ư ờ n g n u ô i cấy .

Sinh k h ố i và thành phần của sinh k h ố i c ó thể đ o đạc bằng các p h ư ơ n g t i ệ n n h ư th iế t

bị đ o mật đ ộ t ế bào , h à m lượng A D N hoặc protein, k h ố i lượng tươi, k h ố i lượng khô . . . M ộ t chỉ số quan trọng để đ á n h giá sinh trưởng của v i sinh là thờ i gian t ă n g gấp đ ô i sinh k h ố i hoặc là thờ i gian cần đ ể số t ế bào tâng lên gấp đô i . Ch ỉ số n à y phụ thuộc v à o nh iều

yếu tố , trong đ ó có k ích thước và t ính phức tạp của t ế bào . T h ờ i gian n à y k h á c nhau ở các sinh vật khác nhau: ở v i khuẩn là 0,25 - 1 h, ở n ấ m men Ì - 2 h, ở n ấ m mốc 2 - 6,5 h, ở t ế bào thực vật 20 - 70 h và ở động vật 15 - 48 h.

Trên thực tế, hầu như k h ô n g t ồn t ạ i yếu t ố sinh t rưởng t ố i ưu l iên tục. D o vậy , sự sinh t rưởng của t ế bào sẽ phụ thuộc vào các y ế u t ố hạn chế , ví d ụ đ i ề u k i ệ n d inh dưỡng, sẽ làm cho sinh t rưởng bị ức c h ế hoặc ngừng l ạ i .

Nuô i trồng v i sinh vật trong các n ổ i lên men (bioreactor) được t i ế n h à n h theo 4

cách: Đ ó là nuô i cấy từng đạ t (batch culture), nuô i cấy bán l iên tục, n u ô i cấy l iên tục và nuôi cấy t ĩnh. Nuô i cấy bioreactor có thể là nuô i t ĩnh hoặc k h u ấ y t rộn , n u ô i c ấ y y ế m khí

hoặc có oxy, nuô i cấy lỏng, bán lỏng hoặc t rên giá thể cứng. V i sinh vậ t c ó t h ể được tự do hoặc bị gắn cố đ ịnh vào bề mặ t của các m à n g .

7.4.1. Nuôi cấy từng đạt (batch culture)

Trong nuôi cấy batch, dung t ích m ô i t rường được c ố đ ịnh, trong q u á t r ình sinh trưởng các chấ t d inh dưỡng bị hấp thu, sản phẩm g ồ m sinh k h ố i hoặc c á c sinh chấ t được tích l ũy . M ô i t rường dinh dưỡng do vậy sẽ thay đ ổ i l iên tục và sẽ tác động v à o q u á trình trao đ ổ i chất của t ế bào . Cuố i cùng sinh t rưởng sẽ dừng l ạ i do cạn k i ệ t d inh dưỡng, do tích l ũy độc t ố và chấ t thả i , do mật đ ộ t ế bào q u á cao. Các pha sinh t rưởng trong nuôi cấy batch g ồ m pha lag - là giai đ o ạ n chưa thấy có b iểu h i ệ n thay đ ổ i trong sinh trưởng, đây là giai đoạn th ích ứng và chuẩn b ị . T i ế p theo là pha t ăng chuyển t i ếp (transient

acceleration), t i ếp đến là pha t âng trưởng nhanh theo cấp số n h â n (exponental). Sau đ ó v i sinh vật t rả i qua giai đoạn sinh t rưởng chậm l ạ i ở pha t ăng chậm l ạ i (deceleration), t iếp

đ ế n pha ổn đ ịnh (stationary) và cuố i cùng là pha k ế t thúc ) . Trong nuô i cấy batch, công nghiệp hầu hết q u á tr ình lên men sản xuấ t sẽ dừng l ạ i trước k h i bắt đ ầ u pha chết , vì kh i

đ ó sẽ xảy ra suy g i ả m trao đ ổ i chấ t và thúy phân t ế bào . Q u á t r ình sản xuấ t sinh k h ố i sau kh i đạt t ố i ưu, t ế bào sẽ thực h i ện chuyển hoa đ ể tạo sản phẩm cuối c ù n g (ví d ụ trong sản xuấ t axit amin, enzym) hoặc phân g i ả i các chấ t ô n h i ễ m trong x ử lý m ô i t rường. Nhiều sản phẩm quan trọng như k h á n g sinh được tạo ra t ố i ưu trong giai đ o ạ n pha ổn đ ịnh trong nuôi cấy batch.

Tuy nhiên, có những phương p h á p k é o dài nuô i cấy batch nhằm tâng n ă n g suất sản phẩm bằng cách t h ê m cơ chấ t vào m ô i t rường:

- T h ê m các thành phần dinh dưỡng đ ậ m đặc vào m ô i t rường mộ t c á c h từ từ v í d ụ t hêm các chấ t cacbonhydrate và do đ ó tăng k h ố i lượng nuôi t rồng. Phương p h á p n à y đã được sử dụng trong sản xuấ t công nghiệp n ấ m men bánh m ỹ .

150

- T h ê m dinh dưỡng vào môi trường đồng thờ i rút bớ t m ộ t thể t ích tương đương m ô i t rường đã được sử dụng. Phương pháp này dùng trong nuô i cấy t ế b à o động vật .

7.4.2. Phương pháp nuôi cấy liên tục

K h á c vớ i nuô i cấy batch như trên, nuôi cấy l iên tục cho p h é p sinh k h ố i sinh t rưởng ở

mức khá t hăng bằng v ớ i rấ t ít dao động về dinh dưỡng, các hoạt chấ t , số lượng t ế b à o và

sinh k h ố i . Phương p h á p này thực h i ện bằng c á c h t h ê m chấ t d inh d ư ỡ n g m ớ i vào m ô i

t rường ở giai đ o ạ n phát t r iển mạnh nhấ t (exponental phase) k è m theo rút bớ t m ô i

t rường và t ế bào nuô i . Phương p h á p nuô i cấy l iên tục cho p h é p c á c cơ t hể sống sinh

t rưởng trong đ i ề u k i ệ n ổn đ ịnh trong m ộ t m ô i t rường k h ô n g thay đ ổ i , t rong đ ó tỷ l ệ

tâng sinh k h ố i và m ô i t rường ổn đ ịnh. T rường hợp này m ô i t rường m ớ i được đưa vào

bioreactor v ớ i tốc đ ộ ổn đ ịnh và sự rút ra các sản p h ẩ m cũng được thực h i ệ n v ớ i tốc đ ộ

tương tự (môi t rường đã sử dụng, các p h ế l i ệ u và cơ thể sống) l à m cho thể t ích của m ô i

trường nuôi cấy trong bioreator k h ô n g thay đ ổ i . Các y ế u t ố m ô i t rường n h ư đ ộ p H ,

nồng đ ộ các chấ t d inh dưỡng và các chấ t trao đ ổ i (metabolites) được g i ữ ổn đ ịnh trong

nuôi cấy liên tục. Trong sản xuấ t công nghiệp, phương p h á p nuô i cấy liên tục được ứng

dụng không nhiều , chủ y ế u đ ể sản xuấ t protein đơn bào và etanol hoặc trong xử lý chấ t thải mô i t rường.

7.4.3. Thiết bị Bioreator/Fermenter

7.4.3.1. Yêu cầu đối với hệ thống thiết bị lên men (bioreactorlfermenter)

- Tạo đ iều k i ệ n t ố i ưu cho sinh trưởng và trao đ ổ i chấ t ở t ế b à o nuô i nhằm đạt đ ế n

năng suất t ố i đa của sản phẩm mong muốn .

- Bảo đ ả m hệ thống bioreator k h ô n g bị lây n h i ễ m các v i sinh vật k h ô n g mong muốn.

- Tránh các nòi v i sinh (nhấ t là các v i sinh vật chuyển gen) thoát ra m ô i t rường ngoài .

Có 2 loạ i Bioreator k h á c nhau v ớ i các yêu cầu cách ly khác nhau:

- H ệ thống nuô i cấy k h ô n g tuyệt đ ố i vô t rùng (non aseptic system) trong đ ó k h ô n g

đòi h ỏ i đ ộ thuần chủng tuyệt đ ố i của chủng nuôi H ệ thống này được sử dụng trong sản xuấ t bia.

- H ệ thống vô t rùng tuyệt đ ố i là cần th iế t cho sản xuấ t kháng sinh, vitamin,

polysacharid, vacxin và các sinh dược khác . . .

Những n g u y ê n lý cấu trúc cơ bản của Bioreactor hầu n h ư k h ô n g thay đ ổ i nhiều

trong m ấ y chục n ă m qua. Tuy vậy, nhiều c ả i t i ến kỹ thuật m ớ i đã được áp dụng để t ố i ưu hoa quá t r ình sản xuấ t v ớ i những yêu cầu chủ yếu sau:

- C á c chủng v i sinh phải tương đ ố i ổn đ ịnh về mặ t d i t ruyền và g iống phải luôn được tuyển chọn chống thoái hoa.

151

- Bảo đ ả m đ ộ đổng đ ề u tuyệt đ ố i của m ô i t rường nuô i cấy b ê n trong bioreator. V i sinh vật nuô i cấy được cung cấp các chấ t d inh dưỡng và oxy đ ế n từng t ế b à o , c á c sản phẩm phụ như nhiệt , C 0 2 , các chấ t cặn bã được thả i l oạ i nhanh.

- Nồng đ ộ các chấ t d inh dưỡng cũng cần được ổn đ ịnh, nồng đ ộ thấp l à m g i ả m tốc đ ộ sinh t rưởng của v i sinh, nồng đ ộ cao có thể sẽ gây độc . Các ch ỉ số của m ô i t rường cân phải g i ữ ở trong khoảng t ố i ưu và đồng nhấ t cho m ọ i t ế b à o bên trong h ệ thống. Đ â y là đ iều rấ t k h ó thực h iện trong hệ thống lớn và l àm cho các hệ thống sản xuấ t t rở n ê n k é m hiệu quả. Do vậy, hệ thống sản xuấ t bằng công nghệ lên men h i ệ n đ ạ i đòi h ỏ i phả i c ó sự hợp tác chặt chẽ giữa các k ỹ sư công nghệ, k ỹ sư hoa học, c á c n h à c ô n g nghệ v i sinh và d i t ruyền chọn giống.

Quy tr ình lên men c ó thể g ồ m nhiều pha khác nhau: trong đ ó c ó pha k h í (gas phase) g ồ m N 2 , CO z , 0 2 , mộ t hay nh iều pha lỏng (môi t rường nước và c ơ chấ t lỏng) , pha cứng (các v i sinh vật t rên các giá thể cứng). Tấ t cả các pha phả i p h ố i hợp chặ t c h ẽ v ớ i nhau để thúc đ ẩ y nhanh q u á t r ình sản xuấ t và thả i l o ạ i nhiệ t d ư thừa. Trong h ệ thống bioreactor hoàn chỉnh, tấ t cả các t iểu phần trong hệ thống phải được t rộn đ ề u và đồng nhấ t .

7.4.3.2. Các điều kiện nuôi cấy trong Bioreactor

- Phải t ránh được n h i ễ m các v i sinh vật k h ô n g cần th iế t .

- Dung t ích b ình nuô i phải ổn đ ịnh (không có sự d ò rỉ hoặc bay hơ i ) .

- Lượng oxy hoa tan phải g i ữ ở t rên mức t h o á n g k h í cho p h é p và n u ô i c ấ y khuấy đ ố i v ớ i v i sinh ưu khí .

- Các ch ỉ số m ô i t rường n h ư nồng đ ộ , đ ộ p H phải được k i ể m soát chặ t chẽ và các

thành phần m ô i t rường phải t rộn đ ề u .

- Các vật l i ệ u c h ế tạo Bioreactor, các th iế t b ị k i ể m soát m ô i t rường phả i ổn đ ịnh và ch ính xác .

V ấ n đề ngh iên cứu đặ t ra là phả i xác đ inh được m ô i t rường t ố i ưu trong một hệ thống sản xuấ t và l iên tục k i ể m soát được m ô i t rường m ộ t c á c h tự động . Các thông số môi t rường được thông báo , ghi nhận và x ử lý thường x u y ê n . H ệ thống m á y tính, các sensors (đầu cảm ứng) bên trong có k h ả n ă n g thu nhận và b á o v ề trung t â m đ iều khiển các chỉ số m ô i t rường chuẩn đ ể đ iều ch ỉnh k ịp thờ i . C ô n g nghệ v i đ iện tử và v i t ính đã được áp dụng sâu rộng trong c ô n g nghiệp lên men h i ệ n đ ạ i .

7.4.4. Quy mô của công nghệ lên men

Cống nghệ lên men v i sinh vật đ ó n g vai t rò vô cùng quan trọng đối" v ớ i nh iều ngành

k inh t ế khác nhau n h ư c h ế b i ế n thực phẩm, x ử lý chấ t thả i m ô i t rường, sản xuấ t thuốc sâu bệnh sinh học, phân b ó n sinh học và phân bón v i sinh, c h ế tạo sinh dược. . . Tuy nhiên , để đ á p ứng được các yêu cầu của sản xuấ t công nghiệp, quy m ô n g h i ê n cứu cần được m ở rộng để xác đ ịnh các thông số k ỹ thuật mộ t cách ch ính xác trước k h i chuyển giao công nghệ cho sản xuấ t công nghiệp.

Công nghiệp lên men thường g ồ m 3 giai đoạn t r iển khai cơ bản sau:

152

Giai đoạn phòng thí nghiệm: chọn giống, nhân g iống v ớ i v iệc sử dụng các th iế t bị c ô n g nghệ đơn g iản n h ư đĩa petry, b ình tam giác và nuô i cấy v i sinh được thực h i ện t rên

các m ô i t rường thạch hoặc nuôi cấy lỏng lắc.

Giai đoạn Pilot: Giai đoạn này thường được t r iển khai ở c ác Bioreactor c ó dung t ích

từ vài lít đ ế n vài ngh ìn lít tùy theo quy m ô ứng dụng của từng l o ạ i sản phẩm. ở giai đoạn này, các đ iểu k i ệ n m ô i t rường t ố i ưu cho sinh t rưởng của v i sinh vật và sản xuấ t các hoạt

chấ t mong m u ố n được xác đ ịnh.

Quy t r ình c ô n g nghệ giai đoạn này có thể được xem là quy t r ình b á n c ô n g nghiệp. Đ â y là gia i đ o ạ n c ô n g nghệ hoa v ớ i sự h ì n h t hành h ệ thống t h iế t bị c ô n g nghệ từ sản xuấ t sinh k h ố i đ ế n thu h ồ i , t inh c h ế sản phẩm. Gia i đ o ạ n n à y cần đ ế n sự k ế t hợp của các c h u y ê n gia đa n g à n h n h ư d i t ruyền , sinh hoa, k ỹ sư c ô n g nghệ c ơ kh í , đ i ệ n tử và hoa chấ t .

Giai đoạn pi lot còn là giai đoạn sản xuấ t thử hết sức cần th iết , trong đ ó các nhà khoa học và nhà k inh doanh có thể t ính toán được k h á ch ính xác các thông số đ ầ u vào và đầu ra của hệ thống lên men nhằm đưa ra quyết đ ịnh đ ầ u tư ở giai đ o ạ n sau.

Giai đoạn sản xuất công nghiệp: Quy tr ình bán công nghiệp được tạo ra ở giai đoạn pilot sẽ được chuyển giao cho sản xuấ t công nghiệp. Đ â y là giai đ o ạ n k inh doanh sản xuấ t . Các hệ thống lên men ở giai đoạn này c ó thể đạt quy m ô từ vài chục, vài t râm lít đ ố i v ớ i sản xuấ t mộ t số các c h ế phẩm sinh dược bằng k ỹ thuật A D N tái tổ hợp đến

các hệ thống hàng t r i ệu lít n h ư trong công nghiệp sản xuấ t bột ngọt, protein đơn bào. . .

ở nước ta do đ i ề u k i ệ n k i n h t ế eo hẹp và do nhận thức c h ư a đ ú n g v ề vai t rò của d i t r uyền chọn g i ố n g v i sinh và t ầ m quan t rọng của g ia i đ o ạ n p i lo t đ ố i v ớ i c ô n g nghiệp v i sinh, cho n ê n v iệc đ ầ u tư n g h i ê n cứu ở g ia i đ o ạ n p i lo t q u á y ế u . Đ ó là n g u y ê n n h â n tụ t hậu của n g à n h c ô n g ngh iệp v i sinh ở nước ta so v ớ i c á c nước trong khu vực và t r ên t h ế g i ớ i .

153

Chương 8

C Ô N G N G H Ệ S I N H H Ọ C Y D ư ợ c V À C H Ă N N U Ô I

Trước kh i t ìm ra k h á n g sinh và các vacxin phòng bệnh, n h â n l o ạ i l uôn bị đ e doa bở i nạn chết yểu do bệnh dịch. T ỷ l ệ chết sơ sinh là khoảng 25%, chết ở t u ổ i t h i ếu niên

25%, chỉ khoảng 2% dân số đạt đ ế n t uổ i thọ 65 t u ổ i hoặc hơn . C ù n g v ớ i sự phá t t r iển của khoa học c ô n g nghệ, đ iều k i ệ n vệ sinh và mức sống của n g ư ờ i d â n được n â n g cao, các bệnh t ruyền n h i ễ m hầu như đã được dập tắt ở c ác nước phá t t r iển (ngoại t rừ đ ạ i dịch H I V ) . Tuy nh iên ở các nước đ ang phát t r iển , mức sống n g h è o k h ổ cộng v ớ i t h i ếu thuốc phòng chữa bệnh nhấ t là các vacxin và kháng sinh, tỷ lệ người mắc bệnh dịch vẫn còn cao như sốt rét, lao phổi, các bệnh đường ruột, viêm não...

N h ư vậy h i ện nay nhân loạ i v ẫ n phải đ ố i mặ t v ớ i các nguy cơ d ư ớ i đây :

- Các bệnh t ruyền n h i ễ m do n ấ m , v i khuẩn, virus gây ra, trong đ ó nguy c ơ v i trùng kháng thuốc chữa bệnh ngày càng cao. M ộ t số bệnh virus m ớ i xuấ t h i ệ n n h ư H I V , Hebolla, SARS chưa rõ n g u y ê n n h â n và chưa c ó k h á n g sinh p h ò n g ngừa. M ộ t số tác nhân gây bệnh b iến đ ổ i nhanh chóng rấ t k h ó c ó b i ện p h á p trị l i ệ u k ịp thờ i . V ớ i sự xuấ t h iện của k ỹ thuật gen, mộ t số các v i sinh vật nhấ t là các virus c ó t h ể được t h iế t kế t khá

d ễ dàng trong các phòng thí ngh iệm và có thể được p h ó n g th ích vào m ô i t rường một cách vô t ình hoặc có dụng tâm. K h ả năng chiến tranh v i t rùng "vũ k h í sinh học" hoặc "khủng b ố sinh học" chưa được loạ i trừ .

- Các bệnh bẩm sinh hoặc d i t ruyền do các tác n h â n đ ộ t b i ến t ích l ũ y ngày càng

nhiều trong mô i t rường sống: ô n h i ễ m hoa học m ô i t rường và thực phẩm, thủng tầng ozôn và cường đ ộ bức xạ tia cực t ím của mặ t t rờ i t ăng . T ình trạng xuống cấp của môi trường tăng song hành v ớ i sự phát t r iển của công nghiệp và đ ô th ị đ a n g đ e doa t ính ổn đ ịnh d i t ruyền của hệ gen của con n g ư ờ i và đ a dạng sinh học. Các bệnh ung thư, t im mạch, béo phì , alzheimer (mấ t t r í nhớ). . . V ẫ n là sức ép thường x u y ê n đ ố i v ớ i xã h ộ i loài ngườ i và là những bài toán hóc búa nhấ t của C ô n g nghệ sinh học.

- Cùng vớ i việc cả i th iện đ iều k i ệ n sống và vệ sinh, t u ổ i t h ọ của d â n số đạ t cao, tỷ l ệ ngườ i cao tuổ i ngày càng tăng lên nhấ t là ở c ác nước g i ấ u như Nhấ t bản, T â y âu , M ỹ . Các bệnh lão khoa nhấ t là suy g i ảm trí nhớ ở n g ư ờ i già là mộ t th ị t rường n g à y c à n g lớn của Công nghệ sinh học.

Trước t ình h ình đ ó công nghệ sinh học y học được đầu tư phát t r iển n g à y c à n g mạnh và trở thành một hướng đ ầ u tư siêu l ợ i nhuận của nhiều Công ty siêu quốc gia. Các c h ế

phẩm m ớ i dựa trên công nghệ sinh học xuấ t h iện gần như hàng n g à y t rên th ị t rường. Trong đó gồm:

- Các c h ế phẩm chữa bệnh (hormon, các kháng sinh, các protein hoạt t ính k h á c

nhau....).

154

- Chẩn đ o á n sớm các bệnh d i t ruyền.

- Vacx in .

- Chẩn đ o á n m i ễ n dịch và thử A D N xác đ ịnh tác n h â n g â y bệnh.

- Chẩn trị bằng l i ệ u pháp gen.

8.1. DƯỢC CHẤT VÀ DƯỢC CHẤT SINH HỌC (Pharmaceuticals and Biopharmaceutiacal)

Dược chất có thể được tổng hợp trực tiếp bằng con đường hoa học hoặc được tạo ra từ các quá tr ình sinh học.

8.1.1. Kháng sinh (antibỉotics)

Phát minh vĩ đ ạ i của Alexander Fleming n ă m 1928 v ớ i việc t ìm ra mộ t loài n ấ m có khả nâng sinh ra k h á n g sinh c ó tên là Penicillium notatum đã m ở m à n mộ t k ỷ n g u y ê n mớ i của y học, trong đ ó các bệnh t ruyền n h i ễ m do v i khuẩn đã dần dần được k i ể m soát.

Thuốc kháng sinh là các hợp chấ t k h á n g v i t rùng được sản sinh ra bở i các v i sinh vật được sử dụng trong chữa bệnh hoặc k i ể m soát m ô i t rường lây n h i ễ m bệnh dịch. Trên 4000 loạ i hợp chấ t k h á n g sinh đã được khoa học phân lập , khoảng 50 chấ t đã được thương m ạ i hoa t rên quy m ô l ớ n (bảng 8.1). M ộ t số hợp chấ t k h á n g sinh k h ô n g được sử dụng thương m ạ i do độc t ính của c h ú n g đ ố i v ớ i con n g ư ờ i , động vật , hoặc giá thành sản xuấ t quá cao.

K h á n g sinh được bắt đ ầ u sử dụng rộng rãi trong chữa bệnh từ khoảng n ă m 1945 vớ i sự ra đ ờ i của công nghiệp penici l l in . T ừ đ ó chủng loạ i thuốc k h á n g sinh, phổ tác dụng của thuốc k h á n g sinh ngày càng được m ở rộng trong chữa bệnh cho n g ư ờ i và động vật. Ngoài ra, một số k h á n g sinh có thể g iúp t ăng t rọng vật nuô i và gia cầm, k i ể m soát bệnh cây trồng và phòng trừ côn t rùng gây hạ i .

Bảng 8.1. Các họp chất kháng sinh

Hợp chất kháng sinh Vi sinh vát sản sinh ra Phạm vi hoạt động Antinomycin D streptomyces sp. Chống ung thư Bacitracin Bacillus sọ. Chống vi khuẩn Bleomycin Streptomyces sọ. Chống ung thư Cephalosporin Acremonium sọ. Chống vi khuẩn Chloramphenicol Cephalosporium sọ. Chống vi khuẩn Daunorubicin streptomyces sọ. Chống động vật nguyên sinh Fumagillin Aspergillus sọ. Bệnh do amip gây nên Griseoíulvin Penicillium sọ. Chống nấm Mitomycin c streptomyces sọ. Chống ung thư Natamycin streptomyces sọ. Bảo quản thực phẩm Nisin streptoccocus sọ. Bảo quản thực phẩm Penicillin G Penicillium sọ. Chống vi khuẩn Riíamycin Nocardia sọ. Chống lao streptomycin streptomyces sọ. Chống vi khuẩn Tetracylin Streptomyces sọ. Chống vi khuẩn, chống amip

155

M ộ t số k h á n g sinh phổ rộng như Chloramphenicol và Tetracyclin c ó t h ể k i ể m soá t nhiều v i sinh vật khác nhau n h ư Rickettsia, Chlamidia, Mycoplasma. Ngược l ạ i m ộ t so k h á n g sinh khác thuộc n h ó m phổ hẹp n h ư Steptomycin và Penici l l in ch ỉ chống được vài loài v i sinh vật . H ầ u hết k h á n g sinh có nguồn gốc từ Actinomycetes và n ấ m mốc .

Sản xuấ t k h á n g sinh mang l ạ i l ợ i nhuận cao cho c ô n g nghiệp dược y t ế . T h ị t rường kháng sinh toàn cầu đạt trên 10 tỷ USD hàng n ă m và là n g à n h c ó h i ệu quả cao trong th ị t rường dược nói chung khoảng 200 tỷ USD. V í dụ , n ă m 1992 ch ỉ t i êng Cephalosporin (chế phẩm từ Cephalosporin c và Penici l l in G hoặc V ) đã có doanh thu 8,3 t ỷ USD.

H ầ u hết các chủng giống sử dụng trong công nghiệp k h á n g sinh đ ã được tạo ra bằng các phương p h á p gây độ t b iến . T ừ các chủng dạ i n g ư ờ i ta c ó thể tạo ra c á c đ ộ t b i ế n có

khả năng sản sinh k h á n g sinh t ăng lên hàng n g à n l ầ n . Các p h ư ơ n g p h á p của c ô n g nghệ sinh học như la i t ế bào t rần, chuyển gen đ ang tham gia tạo ra các chủng g iống c ó hiệu quả cao hơn , bền vững hơn , hoạt chấ t k h á n g sinh m ớ i hơn . C ô n g nghệ lên men cũng liên

tục được cả i t i ến d ẫ n đ ế n việc g i ảm giá thành thuốc k h á n g sinh. Tuy n h i ê n , do công nghiệp k h á n g sinh là mộ t n g à n h sản xuấ t dựa t rên sinh vật sống và c ô n g nghệ lên men, công nghệ hoa học h iện đ ạ i nên nh iều nước n g h è o trong đ ó c ó nước ta v ẫ n phả i phụ thuộc hoàn toàn vào nhập n ộ i k h á n g sinh từ nước ngoà i .

Khả năng nhởn thuốc của các vi sinh vật gây bệnh là phổ biến d ẫ n đ ế n những đòi h ỏ i đ ổ i mớ i thường x u y ê n của n g à n h công nghiệp k h á n g sinh, k h ả n â n g k h á n g thuốc của v i khuẩn t ăng lên do độ t b iến d i t ruyền có thể chuyển từ loài v i k h u ẩ n n à y sang loài khác . V í dụ , bệnh Gonorrhoea (A.venereal disease) k h á n g v ớ i penic i l l in là do c á c yếu tố d i t ruyền plasmid có thể d ễ d àng chuyển từ v i khuẩn sang v i k h u ẩ n qua t i ếp hợp một cách d ễ dàng . H i ệ n tượng v i t rùng k h á n g thuốc ư ở t hành m ộ t v ấ n đ ề x ã h ộ i l ớ n đ ố i vớ i một số bệnh dịch như lao phổ i .

Thị trường kháng sinh trong chăn nuôi và bảo quẩn thức ăn cũng khá lớn: Bổ sung một lượng nhỏ k h á n g sinh (như bacitracin, chlortetracyclin, procain, penici l l in) vào thức ăn của động vật nuô i , gia cầm d ẫ n đ ế n sự c ả i t h i ện đ á n g k ể trong sản xuấ t : con vật khoe hơn, sinh trưởng nhanh hơn , rút ngắn thờ i gian chân nuô i . Tuy nh iên , m ộ t số ý k iến

cho rằng việc t h ê m k h á n g sinh vào thức ăn có t hể d ẫ n đ ế n v iệc ra đ ờ i và lan rộng của các chủng nhờn k h á n g sinh, ví d ụ các v i khuẩn nguy h i ể m Salmonella trong phân động vật , hoặc tồn d ư k h á n g sinh trong thức ăn. Các b i ện p h á p khắc phục t ính t rạng này đang được đặ t ra v ớ i việc ngh iên cứu các k h á n g sinh đặc thù cho vật nuô i bổ sung v à o thức ăn thay t h ế cho các k h á n g sinh d ù n g để chữa bệnh cho n g ư ờ i .

Do vậy, m ộ t số k h á n g sinh yếu , ít h i ệu quả chữa bệnh cho n g ư ờ i v ẫ n đ a n g được dùng trong dinh dưỡng vật nuô i .

8.1.2. Vacxin và kháng thể đơn dòng

8.1.2.1. Kháng nguyên và kháng thể

K h i một hợp chấ t l ạ hoặc mộ t l o ạ i v i sinh vật, ký sinh l ạ thâm nhập vào c ơ t h ể n g ư ờ i hoặc động vật , cơ thể sẽ có một phản ứng dây chuyền nhằm cô lập , vô h i ệu hoa, đ à o thả i

156

hoặc t r iệ t t iêu vật l ạ đ ó . M ộ t số những sản phẩm của phản ứng d â y chuyền n à y có thể t ồn d ư trong c ơ t hể sống lâu dài , cho phép n ó có k h ả n ă n g m i ễ n dịch h o à n toàn hoặc từng phần đ ố i v ớ i l oạ i v i sinh vật đã thâm nhập. Phản ứng m i ễ n dịch của cơ t hể c ó bản

chấ t p h â n tử.

Trong quá tr ình gây bệnh, các v i sinh vật t h â m nhập vào cơ t hể sống, t rên m à n g của các tác n h â n gây bệnh thường có các phân tử đặc thù g ọ i là k h á n g n g u y ê n . Các k h á n g nguyên (antigens) thường là các protein, hoặc protein liên kế t v ớ i các p h â n tử đường, các polysaccharid... các k h á n g nguyên là các tác nhân l àm k ích động phản ứng bảo vệ của cơ thể sổng tạo ra các kháng thể (antibodies). K h á n g thể do các t ế b à o đặc thù tạo ra. C ơ thể n g ư ờ i và động vật có thể tạo ra số lượng rấ t l ớ n các k h á n g thể . Các t ế b à o sản sinh kháng thể có thể nhận biết các kháng nguyên khác nhau và sản sinh ra các k h á n g thể tương ứng nhằm làm vô h iệu hoa và t r iệ t t iêu sinh vật l ạ và các họp chấ t t h â m nhập.

K h á n g thể do các t ế bào đặc b iệ t t rên khắp cơ thể sản sinh ra, các loài động vật và con ngườ i có thể sản xuấ t ra số lượng lớn đ ế n mức k h ó h ình dung được các loạ i k h á n g thể khác nhau. Các t ế bào sản xuấ t kháng thể nhận b iế t các k h á n g n g u y ê n và sản xuấ t ra các kháng thể đặc thù để trung hoa, l oạ i trừ các chấ t (kháng n g u y ê n ) ngoại nhập. M ộ t động vật có thể sản xuấ t ra đủ số lượng và chủng loạ i k h á n g n g u y ê n đ ể chống l ạ i sự tấn công của vô số các v i sinh vật từ m ô i t rường, đồng thờ i n ó còn sản sinh ra k h á n g thể để chống chọi l ạ i số lượng nh iều vô kể các loạ i hoa chấ t từ m ô i t rường t h â m nhập vào cơ thể động vật . T ó m l ạ i , cơ thể n g ư ờ i và động vật có thể sản sinh ra k h á n g thể đ ể b á m vào và làm bấ t hoạt hầu n h ư tấ t cả các phân tử l ạ từ bên ngoà i đ ộ t nhập vào cơ thể . Tuy nhiên, nhiều k h i cơ thể sống tỏ ra bấ t lực trước sự tấn công của các v i sinh vật và các độc tố từ mô i t rường ngoà i . Trong t rường hợp đó , v i sinh vật có thể nhân nhanh và gây bệnh cho cơ thể ở các mức đ ộ khác nhau, thậm chí l àm chết sinh vật chủ.

8.1.2.2. Vacxin

K h ả năng các vacxin l àm xuấ t h i ện các k h á n g thể và k ích hoạt các phản ứng tự vệ của sinh vật chủ đã được ngh iên cứu từ lâu. Vacxin là các c h ế phẩn từ các v i sinh vật đã chết, hoặc từng phần của v i sinh vật, hoặc v i sinh vật đã bị l àm y ế u đ i , đã bị l àm bấ t hoạt... có k h ả n ăng gây ra các phản ứng tự vệ của cơ thể t hông qua k ích hoạt hệ thống tạo m i ễ n dịch đ ố i v ớ i bệnh dịch. N h ờ vậy cơ thể sống có thể k h á n g l ạ i tác nhân gây bệnh sau k h i đã được t i êm chủng vacxin.

M ụ c tiêu ngh iên cứu vacxin là xác đ ịnh và m ô tả đặc t rưng m ỗ i k h á n g n g u y ê n đặc thù của tác nhân gây bệnh có thể gây ra phản ứng tự vệ ở cơ thể chủ, đồng thờ i xác đ ịnh các bước, các thành phần của phản ứng m i ễ n dịch d ẫ n đ ế n khả n ăng tự vệ của cơ thể . H i ệ n nay con n g ư ờ i đã sản xuấ t được nhiều l oạ i vacxin khác nhau cho việc t iêm chủng. N h ờ vậy , nh iều l oạ i bệnh dịch nguy h i ể m trước đây hầu n h ư đã bị l oạ i t rừ ra k h ỏ i đ ờ i sống xã h ộ i .

Tuy nh iên mức đ ộ thành công và thờ i gian bảo tồn của phản ứng tự vệ sau t iêm chủng l ạ i phụ thuộc nhiều vào chủng loạ i vacxin. V í dụ , nhờ t i êm chủng vacxin, bệnh bại l i ệ t (polyomyeli t ic) hầu như đã được loạ i trừ hoàn toàn trên phạm v i quốc*tế. N h ư n g

157

các vacxin như vacxin p h ò n g bệnh thương hàn và dịch tả chưa đ á p ứng y ê u cầu , c h ư a c ó vacxin h i ệu quả cho mộ t số bệnh phổ b iến n h ư bệnh l ậ u , giang mai , sốt rét và n h i ê u bệnh khác . Vacx in p h ò n g các bệnh n h ư H I V tuy đã được đ ầ u tư nh iều n h ư n g c h ư a t h à n h công . Đ ố i vớ i mộ t số bệnh virus m ớ i xuấ t h i ện n h ư bệnh SARS, bệnh virus Hebola... việc ngh iên cứu vacxin m ớ i chỉ là bước đầu .

Sản xuấ t vacxin rấ t t ốn k é m , mặc dù quy m ô k h ô n g l ớ n n h ư n g đò i h ỏ i sự phá t t r iển đồng thờ i của nh iều l o ạ i công nghệ khác nhau. N g h i ê n cứu virus c à n g phức tạp hơn vì virus gây bệnh ch ỉ có thể nhân bằng nuô i cấy t ế b à o n g ư ờ i hoặc động vật .

Sản xuấ t vacxin p h ò n g bệnh cho n g ư ờ i và động vật có th ị t rường rấ t l ớ n .

H i ệ n nay, nh iều l o ạ i vacxin t h ế h ệ m ớ i - Vacx in tái t ổ hợp đ ã được sản x u ấ t như vacxin p h ò n g virus c ú m , vacxin bạ i l i ệ t , v iêm gan B, herpes virus...

8.1.2.3. Vacxin tái tổ hợp

Bên canh các vacxin t ruyền thống, các n h à khoa học ứng dụng C N S H đ ể tạo ra các vacxin tái tổ hợp. V í dụ vacxin an toàn và h iệu quả trong n g ă n ngừa bệnh g i ả d ạ i ở lợn (swine pseudorabies). Ư u v i ệ t của vacxin này và c á c vacxin k h á c được tạo ra bở i kỹ thuật A D N tái tổ hợp là n g ư ờ i ta ch ỉ sử dụng m ộ t phần rấ t n h ỏ genom của c á c tác nhân gây bệnh. Trong k h i đ ó vacxin t ruyền thống là các tác n h â n g â y bệnh đ ã chết hoặc đã được làm yếu đ i . Trong trường họp đ ó , đô i k h i các tác n h â n gây bệnh trong vacxin còn sống sót và còn g i ữ khả năng phục h ồ i và trở l ạ i gây bệnh. M ặ t k h á c , m ộ t số c á c vacxin t ruyền thống có thể được c h ế tạo v ớ i chi ph í thờ i gian đ ế n 20 - 30 n ă m hoặc h ơ n . Đ ó là một trong các n g u y ê n nhân c h ú n g ta k h ô n g c ó đ ủ vacxin cho nh iều bệnh động vật .

V ớ i vacxin tái tổ hợp, các gen gây bệnh ở tác n h â n gây bệnh sẽ k h ô n g được tham gia vào thành phần vacxin tái tổ hợp. Do vậy , vacxin tá i tổ hợp c ó 2 ưu v i ệ t :

- Tạo ra m i ễ n dịch nhưng k h ô n g gây ra bệnh.

- Các vacxin này được sản xuấ t ra mộ t cách nhanh c h ó n g h ơ n v ớ i c ô n g nghệ đơn giản và an toàn hơn.

Vacxin tái tổ hợp ngừa bệnh lở mồm long móng (Foot and mouth disease):

Bệnh gây ra bở i mộ t l o ạ i virus rấ t d ễ lây n h i ễ m ở b ò , cừu và các động vậ t khác . Bệnh này đã bị l oạ i trừ ở Bắc M ỹ , nhưng v ẫ n đ a n g gây t ổ n thấ t l ớ n ở nh iều nước đang phát t r iển. Vacxin t ruyền thống đã được sản xuấ t từ c ác virus đã bị l àm y ế u . Tuy nhiên

các virus này có thể phục h ồ i và đã gây bệnh ở mộ t số t rường hợp ở Châu  u . Vacx in l ở m ồ m long m ó n g tái tổ hợp đã l o ạ i trừ k h ả n ă n g lây bệnh và k h ô n g phả i bảo quản ở nhiệt đ ộ thấp, nhờ vậy rấ t d ễ sử dụng ở các nước n g h è o .

Ngoà i hai vacxin tái tổ hợp đã và đ ang được sử dụng để phòng bệnh g i ả dạ i ở l ợ n và bệnh l ở m ồ m long m ó n g , n g ư ờ i ta đ ang ngh iên cứu c h ế tạo hàng chục l o ạ i vacxin chăn nuôi khác cho p h ò n g bệnh t iêu chảy và các bệnh đường h ô hấp. M ộ t vài l o ạ i vacxin c ó thể được t iêm vào trứng l àm cho gà con được m i ễ n dịch trước k h i nở . N g o à i các vacxin chống bệnh v i khuẩn và virus, h i ện nay các nhà khoa học đã phát t r iển cả các vacxin

chống ký sinh t rùng, ở New Zealand và ú c nông dân phải huy bỏ thịt các con cừu đã

158

n h i ễ m k ý sinh sán lá mí t (Tapevvorm). Các vacxin m ớ i c ó thể g i ả m th iệ t h ạ i cho n g ư ờ i

nuô i cừu hàng t r i ệu đ ô la m ỗ i n ă m .

8.1.3. Kháng thể đơn dòng

T r ê n t h ế g i ớ i th ị t rường k h á n g t h ể đơn d ò n g đ ạ t khoảng 7,0 t ỷ U S D n ă m 2003. K h á n g t h ể là c á c protein của hệ m i ễ n d ịch ở n g ư ờ i hoặc đ ộ n g v ậ t sản sinh ra đ ể phản ứng l ạ i sự t h â m nhập của c á c v i k h u ẩ n , virus, k ý sinh t r ù n g k h á c nhau. M ỗ i m ộ t l o ạ i k h á n g thể đ í n h k ế t m ộ t c á c h đặc thù v ớ i bộ phận đặc t r ư n g của m ộ t k ẻ t h â m nhập xác đ ịnh.

N h ờ t ính đặc thù cao, k h á n g thể đơn d ò n g được ứng dụng rấ t rộng rãi trong các l ĩnh

vực chẩn đoán đòi h ỏ i t ính đặc h iệu cao để phá t h i ện và xác đ ịnh nồng đ ộ của các protein hoa tan và các ch ỉ th ị phân tử trên bề mặ t t ế bào l ạ . L ĩ n h vực ứng dụng phổ b iến

là trong t ruyền m á u , huyết học, m ô phôi , v i sinh vật học và hoa sinh chữa bệnh cũng như các l ĩnh vực khác ngoà i n g à n h y dược.

K h á n g thể đơn d ò n g cũng d ù n g trong chữa bệnh ung thư, đ ó là các l oạ i thuốc độc chỉ tương tác v ớ i các t ế b à o bệnh ở vùng có k h ố i u.

K h á n g thể đơn d ò n g c ò n d ù n g trong chẩn đ o á n các sản phẩm in vi tro k h ô n g đòi h ỏ i các đ iều k i ệ n an toàn đặc b iệ t , v í dụ như:

- Chẩn đ o á n bệnh đường sinh dục (hoa l i ễ u ) , bệnh v iêm gan B, các bệnh do v i khuẩn.

- K h á n g thể đơn d ò n g cũng được sử dụng trong thử để . phá t .h iện phô i thai ở n g ư ờ i .

Các nhà khoa học tạo ra các kháng thể đơn dòng bằng dung hợp hai l o ạ i t ế bào . M ộ t là các t ế bào h ệ m i ễ n dịch có thể sản sinh k h á n g thể có k h ả n ăng đ ính k ế t v ớ i phần đặc trưng của tác n h â n gây bệnh hoặc các phân tử l ạ , thứ hai là t ế bào ung thư. T ế bào tạo được do dung hợp hai l o ạ i t ế bào trên t iếp thu được t ính trạng d i t ruyền của t ế b à o h ệ m i ễ n dịch có k h ả n ă n g sản sinh k h á n g thể và k h ả năng phân bào bấ t đ ịnh của t ế bào ung

thư. T ế bào lai được g ọ i là hybridoma hoạt động như mộ t x í nghiệp k h á n g thể . Các kháng thể được g ọ i là đơn d ò n g (monoclonal) bở i chúng được sản sinh ra bở i các d ò n g giống hệt nhau của t ế bào lai (hybridoma)

Tấ t cả các k h á n g thể này sẽ chỉ đ ính kế t v ớ i một cấu t rúc p h â n tử xác đ ịnh trên bề

mặ t của v i t rùng gây bệnh xác đ ịnh nào đó .

Th ị t rường k h á n g thể đơn d ò n g

K h á n g thể đơn d ò n g có nhiều ứng dụng khác nhau:

- Chẩn đ o á n và chữa trị ung thư;

- Chẩn đoán phá t h i ện phôi thai ở n g ư ờ i ;

- Chẩn đ o á n các bệnh t ruyền n h i ễ m khác nhau: các bệnh lây t ruyền theo đường sinh dục như bệnh hoa l i ễ u , bệnh v iêm gan B, các bệnh t ruyền n h i ễ m k h á c ;

- N g ă n ngừa sự đ à o thả i trong ghép cơ quan;

159

- L à m sạch các sản phẩm công nghiệp;

- Phát h iện các vết phân tử (ở nồng đ ộ thấp) trong thức ân , n ô n g nghiệp và c ô n g nghiệp.

8.1.4. Một số sinh dược chữa bệnh tạo được từ kỹ nghệ gen

Insulin: H à n g t r i ệu n g ư ờ i t rên t h ế g iớ i mắc bệnh đá i đ ư ờ n g phải b ổ sung thuốc insulin. Trước đây , insulin chữa bệnh thường được tách chiết từ lợn và b ò . Trong quá tr ình chữa bệnh đã xảy ra mộ t số phản ứng phụ có thể do trong c h ế p h ẩ m insul in từ động vật có chứa tạp chấ t nào đ ó . H i ệ n nay insulin n g ư ờ i hoàn toàn được sản x u ấ t bằng công nghệ v i sinh v ớ i số lượng sản xuấ t ra k h ô n g hạn c h ế và t ránh được các phản ứng phụ .

Somatostatìn: là một hormon sinh t rưởng c ó bản chấ t protein. Chấ t n à y rấ t k h ó được tách chiết từ động vật, v í dụ từ khoảng nửa t r i ệu bộ n ã o cừu m ớ i có t h ể sản x u ấ t được 0,005 g ăm chấ t somatostatin sạch. Bằng chuyển gen m ã hoa somatostatin từ n g ư ờ i vào v i khuẩn, một lượng hormon tương tự như trên có thể được sản xuấ t trong m ộ t n ồ i lên men v i khuẩn có dung tích m ô i t rường khoảng 9 lít.

Cứ 5000 em bé l ạ i có mộ t em bé bị h ộ i chứng lùn do t h iếu hormon. D o vậy , hormon tái tổ hợp ra đ ờ i mang l ạ i l ợ i ích l ớ n lao cho các em. T h ị t rường somatostatin đạ t khoảng 100 t r iệu U S D / n ă m . Ngoà i ra, hormon này còn được ứng dụng đ ể t ăng cường h ệ cơ bắp ở n g ư ờ i b ình thường và l àm tăng năng lực ở n g ư ờ i già.

Các Interferon: In ter íeron được hai nhà khoa học n g ư ờ i A n h phá t m i n h n ă m 1957 ở ngườ i có tác dụng t ăng sức đề k h á n g của n g ư ờ i đ ố i v ớ i bệnh virus. In te r í e ron n g ư ờ i là một glycoprotein có khả nâng t ăng cường đề k h á n g đ ố i v ớ i các bệnh virus và k ì m h ã m bệnh ung thư. H i ệ n t ạ i n g ư ờ i ta đã t ìm thấy nh iều l o ạ i interferon khác nhau ở các loài động vật khác nhau. Interferon n g ư ờ i khác interferon chuột. Các m ô k h á c nhau của cùng một loài cũng có k h ả năng sản sinh các interferon k h á c nhau.

Trước đây , ở Phần Lan n g ư ờ i ta đã sản xuấ t ra in te r íe ron từ t ế b à o bạch cầu máu (leukocytes) v ớ i lượng sản xuấ t ra rấ t hạn chế. H i ệ n nay, c ó hai p h ư ơ n g p h á p sản xuấ t in ter íeron đ ang được sử dụng:

- Interferon sản xuấ t bằng t ế bào sợi ( í ibroblas ts) n g ư ờ i và được coi là nguồn sinh dược an toàn nhấ t . '

- In ter íeron tái tổ hợp thông qua chuyển gen m ã hoa interferon từ f ĩbroblast n g ư ờ i sang v i khuẩn.

Lymphokines: Đ â y là các protein do t ế bào m á u lympho (một l o ạ i t ế b à o trong hệ thống m i ễ n dịch ở ngườ i ) và được xem là rấ t quan trọng đ ố i v ớ i các phản ứng tự vệ của cơ thể . Các chấ t này c ó k h ả n ăng bảo tồn và l àm t ăng cường k h ả n ăng của h ệ thống m i ễ n dịch chống l ạ i các bệnh t ruyền n h i ễ m và bệnh ung thư. Interleukin-2 là m ộ t lymphokines quan trọng được sản xuấ t bằng công nghệ A D N tái tổ hợp v ớ i lượng k h ô n g hạn chế.

H i ệ n nay, hầu hết các sinh dược từ công nghệ A D N được sản xuấ t bở i c á c t ế bào

động vật chuyển gen hoặc các v i sinh vật chuyển gen.

160

G ầ n đây , nh iều vật nuô i và cây trồng đã được cấy t ruyền gen của n g ư ờ i . Các cơ thể sống chuyển gen n h ư vậy đ ang được nghiên cứu sử dụng n h ư là các Bioreactors trong

sản xuấ t dược chấ t .

N g o à i ra, m ộ t số sinh dược chữa bệnh tạo ra bằng k ỹ thuật gen được m ô tả ở bảng 8.2.

Bảng 8.2. Một số sinh dược được phép sử dụng trong chữa trị bệnh

TT Tên sinh dược Lĩnh vực chữa trị chủ yếu Năm thương mại hóa 1 Insulin Bệnh đái đường 1982 2 Hormon sinh trưỏng Sinh trưởng kém 1985 3 a. Interteron Bệnh ung thư, các bệnh do

nhiễm virus 1985

4 Anti -T- cell Ghép cơ quan 1986 5 Hepatitis B vacxin - Vacxin viêm gan B Ngăn ngừa bệnh viêm gan B 1986 6 Tissue plasminogen activator Bệnh tim mạch 1987 7 Erythropoietin Bệnh thiếu máu 1988

8 lnterleukin-2 Bệnh ung thư 1989

8.2. C Á C SẢN P H Ẩ M S I N H D Ư Ợ C P H Ụ C v ụ C H Ă N N U Ô I

Bệnh vật nuô i cho đ ế n nay v ẫ n là những v ấ n đề nan g i ả i đặ t ra cho loài n g ư ờ i . Các bệnh như bệnh bò đ i ên ở Châu âu, bệnh l ở m ồ m long m ó n g ở gia súc , bệnh c ú m gà đ ang

lan rộng ở Châu Á đ a n g gây lo lắng cho toàn xã h ộ i . Đặc b iệ t nguy h i ể m là các bệnh này

có thể lây n h i ễ m sang n g ư ờ i , trong k h i tác nhân gây bệnh thường c ó những thay đ ổ i d i t ruyền k h ó k i ể m soát .

Theo b á o c á o của V ã n phòng đánh giá công nghệ của Quốc h ộ i M ỹ (Congress of f ice of technology assessment) m ỗ i n ă m ngành năng lượng nước này phải t ố n khoảng 17 tỷ đ ô la chi ph í cho các bệnh vật nuô i .

Các nhà khoa học đã ngh iên cứu để tạo ra hàng loạt các sản phẩm CNSH đ ể chẩn đoán, đ iều trị, n g ă n ngừa bệnh ở động vật . L ĩ n h vực m à CNSH đã c ó ứng dụng sâu rộng

là chẩn đ o á n bệnh.

8.2.1. Chẩn đoán bệnh bằng kháng thể đơn dòng

M ộ t số bệnh ở động vật rấ t k h ó chẩn đoán , bác sỹ thú y phải chờ vài g i ờ đ ế n vài

ngày m ớ i có kế t quả khẳng đ ịnh bệnh từ các phòng thí ngh iệm. Trong k h i chờ đ ợ i họ thường dừng chữa bệnh hoặc đưa ra các b iện p h á p có thể k h ô n g chắc chắn. Sử dụng CNSH, n g ư ờ i ta c ó thể thực h iện việc chẩn đoán nhanh, ch ính xác đ ố i v ớ i nh iều bệnh phổ b iến ở vật nuô i . Trong mộ t số t rường hợp bác sĩ có thể chẩn đ o á n bệnh ngay ở trang t rạ i và có l i ệ u p h á p chữa trị k ịp thờ i , ch ính xác ngay lập tức. N h i ề u chẩn đ o á n l oạ i này được thực h i ện bở i sử dụng các kháng thể đơn d ò n g . M ộ t trong các ứng dụng của kỹ thuật đơn d ò n g là chẩn đoán bệnh Brucellosis - bệnh do v i khuẩn ở b ò sữa. V i khuẩn gây

161

bệnh này thường gây ra h iện tượng sẩy thai và bệnh này c ó t h ể l ây n h i ễ m sang n g ư ờ i nông dân hoặc những ai uống sữa của con bò n h i ễ m bệnh. Vacx in c ó t h ể bảo v ệ động

vật chửa k h ỏ i sẩy thai nhưng những con bò được t i ệ m chủng vacxin c ó t h ể t rở t h à n h những vật mang m ầ m bệnh.

K ỹ thuật chẩn đoán k inh đ iển không thể phân biệt được sự khác nhau giữa v i t rùng gây bệnh và Vacxin được tạo ra từ v i t rùng. Do vậy, những chẩn đ o á n này k h ô n g thể g iúp ngườ i nông dân xác đ ịnh con vật nào mang bệnh và con nào k h ô n g . Ngược l ạ i , chẩn đoán bằng kháng thể đơn dòng đặc thù đến mức n ó cố thể phân b iệ t được con vật n à o mang v i khuẩn gây bệnh và con nào chỉ mang vacxin. N h ờ vậy ngườ i n ô n g dân c ó thể c á c h ly các động vật mang nguồn gây bệnh ra k h ỏ i đàn để t ránh phát dịch. Chẩn đoán k h ô n g ch ỉ phát h iện bênh, kỹ thuật đơn dòng phát h iện sự mang thai ở động vật mộ t cách d ễ d àng đ ến

mức ngườ i nông dân có thể đọc được kế t quả chẩn đoán ngay ở n ô n g t rạ i .

K h á n g thể đơn d ò n g cũng đã được sử dụng đ ể chẩn đ o á n bệnh ỉa chảy ở l ợ n và bê

con. ỉa chảy là bệnh v i khuẩn ở con vậ t m ớ i sinh gây t iêu chảy. R ấ t nh iều con vậ t n h i ễ m bệnh bị chết do m ấ t nước.

Bằng cách chẩn đ o á n bệnh nhanh, ch ính xác c h ơ p h é p tổ chức đ iều trị k ịp thờ i . Chữa trị t iêu chảy ở bê cũng dựa t rên k h á n g thể đơn d ò n g . Các k h á n g thệ n à y sẽ bọc l ấ y các v i khuẩn, cản trở chúng gây bệnh. .LJ MAỉUíi moi orỉ'j HI ìtỳh IM9 (teo '-'Ù ÍÌẺV ynủrín Hi HỒV Vi;!' íiồb Oỉio ''ỏun tà'/ (iỉtởH 8.2.2. K ỹ t h u ậ t gen c h ẩ n t r ị b ệ n h

M ộ t số chẩn trị bệnh ở động vật được thực h i ện dựa t rên c ô n g nghệ A D N tái t ổ hợp. K ỹ thuật d i t ruyền cho phép các nhà khoa học chuyển mộ t hoặc vài gen m ớ i v à o động vật, cây trồng hoặc t ế bào v i sinh vật . Các gen này tạo ra các protein c ó k h ả n ă n g đ ề

k h á n g hoặc chữa trị bệnh. Do vậy , v i sinh vật , t ế bào động vật hoặc thực vật c ó thể trở thành các x í nghiệp m i n i sản sinh ra m ộ t số lượng l ớ n các protein đ i ề u trị bệnh.

V í dụ đ iển h ình là sản xuấ t in ter íeron và interleukin-2 là các protein chống virus. Các nhà thú y đã c ó phương t i ệ n chống bệnh v i khuẩn, n h ư n g c ó rấ t ít thuốc chữa bệnh virus. Các chấ t in te r íe ron và interleukin-2 k h ô n g ch ỉ d iệ t vừus m ộ t c á c h trực t i ếp m à

còn kích hoạt h ệ m i ễ n dịch của động vật , t ăng cường k h ả n ăng h ệ m i ễ n dịch chống l ạ i bệnh.

Các in ter íeron và interleukin-2 đã được sử dụng đ ể chống bệnh sốt do vận chuyển (shipping fever) - mộ t bệnh ở b ò sữa do một số virus lây n h i ễ m c ù n g lúc gây ra. M ặ c dù hệ m i ễ n dịch g i ữ các virus trong vòng k i ể m soát , nhưng sự b ù n g phá t của bệnh n à y x ả y ra bở i các ức c h ế trong quá t r ình vận chuyển động vật đến nơi chăn t hả hoặc th ị t rường. Bệnh sốt do vận chuyển gây tổn thấ t cho công nghiệp chăn nuô i b ò khoảng t rên 250 t r iệu ƯSD/nãm.

T i ê m in ter íeron hoặc interleukin-2 trước k h í vận chuyển c ó thể l à m k ích hoạt hệ m i ễ n dịch và ngăn cản bệnh sốt k h i vận chuyển.

Bên cạnh việc tạo ra các protein chẩn đ o á n và chữa trị bệnh, các n h à khoa học ứng dụng CNSH để tạo ra các vacxin tái tổ hợp như vacxin ngừa bệnh l ở m ồ m long m ó n g .

162

8.2.3. C á c l o ạ i p ro te in t ă n g t r ư ở n g phục v ụ c h ă n n u ô i

M ộ t loạ i protein tự nh iên Somatọtropin hay là các hormon sinh t rưởng có thể g iúp cho động vật nuôi chuyển hoa thức ăn thành thịt nạc và sữa. Sử dụng k ỹ thuật gen các nhà khoa học đã tạo ra chủng v i khuẩn có khả n ăng sản xuấ t somato t rop ín ở quy m ô công nghiệp. Thêm, mộ t lượng rấ t nhỏ chấ t này vào thức ăn làiĩỊ t ăng đ á n g k ể h i ệu quả chuyển hoa thức ân, t i ế t k i ệ m được chi phí , Somatotropin (PST) l ợ n c ó thể t ăng chấ t lượng thịt làm thức ăn cho con n g ư ờ i . PST nâng kế t quả thức ăn lên 15 - 20% đ ố i v ớ i lợn, l àm g iảm mỡ . L ạ n được nuôi bổ sung PST có t ỷ l ệ nạc cao, g i ả m m ỡ và cholesterol, có l ợ i cho sức khoe n g ư ờ i t iêu đ ù n g .

M ộ t protein t ăng trưởng k h á c là bovine somatotropin (BST) được sử dụng trong chăn nuôi bò sữa, l àm g iảm chi phí chăn nuôi của nông dân . T h ề m lượng nhỏ BST vào thức ăn đã làm tăng sản lượng sữa lên • 10-20%, d ẫ n đ ế n chi ph í thức ăn g i ả m .

Các thí nghiệm đ á n h giá dư lượng PST v à BST trong thịt và sữa của các động vật được nuôi bổ sung bằng 2 chấ t này cho thấy h à m lượng PST và BST ở động vật th í nghiệm không cao hơn so v ớ i đ ố i chửng. Gác thừ ngh iệm k h á c chỉ ra rằng các protein này không ảnh hưởng đ ế n cơ thể con n g ư ờ i . M ộ t protcin phục vụ chăn nuô i k h á c là yếu

tố tăng sinh hormon sinh trưởng (growth hormon releasing íac tor - GHRF) , yếu t ố GHRF làm t ăng h à m lượng hormon sinh t rưởng ở động vật nuôi* ' í=" • :."r'

in 3 ẻiỉ nè oi) ri ị oẽv pn Lí 3 Ị

8.3. Đ Ộ N G V Ậ T C H U Y Ể N G E N SẢN X U Ấ T S I N H D Ư Ợ C VÀ H O A C H Á T T R O N G

SỮA

l ! j Đ ộ n g vật chuyển gen c ó thể sư dụng như Bioreactor đ ể sản xuấ t m ộ t số các prồtein tái tổ hợp d ù n g trong y học hoặc công nghiệp. Gác eon cừu, đê , l ợ n và b ò chuyển gen đã được tạo ra bằng phương pháp v i thao tác t iêm A D N (gen đích) vào t ế bào trứng đã thụ tinh (cải t i ến các phương pháp chuyển gen chuẩn đã được ngh iên cứu hoàn th iện trong phòng thí nghiệm đ ố i v ớ i chuột). ]

Thành công nhấ t là phương p h á p chuyển gen vào các động vật cho sữa. Sữa được sản sinh h à n g ngày và sản xuấ t lượng l ớ n các protein tái tổ hợp n h ư c á c enzym, kháng thể đơn d ò n g , protein cấu t rúc, w . . . Đặc t h ù của phương p h á p này là sử dụng promoter đặc thù tuyến sữa đ ể đ iều kh iển gen chuyển chỉ b iểu h i ện ở tuyến sữa của động vật chuyển gen. Chuyển gen vào các động vật nhai l ạ i nhỏ có tỷ l ệ thành công cao gấp 4 lần so vớ i chuyển gen vào b ò . Do vậy , chuyển gen vào dê và cừu cho k ế t quả thực t ế cao.

Dê chuyển gen sản sinh protein sợi tơ nhện có độ bền và đ ộ đ à n h ồ i cao hơn so v ớ i nhiều l oạ i sợi k h á c và được g ọ i là "sợi t hép" . Protein sợi tơ nhện có thể sử dụng l à m sợi tự tan d ù n g trong p h ẫ u thuật và các l o ạ i sợi n h â n tạo c ó đ ộ bền cao. Cừu và d ê chuyển gen c ò n sản xuấ t nhiều dược chấ t quan trong khác trong sữa như Ant i thrombin I U ngườ i , Alpha- l -ant i t rypsin , Tissue plasminogen activator, k h á n g n g u y ê n v i ê m gan, các kháng thể đơn d ò n g đ ể sản xuấ t vacxin sốt rét,... L ợ n chuyển gen m ã hoa enzym phytase có khả n ăng sản sinh enzym này trong tuyến nước bọt lợn và g iúp lợn có khả năng tiêu hoa hoàn toàn phospho trong các hợp chấ t phytate (Phytase là enzym thúy phân phytate thành inositol và phosphate). L ợ n chuyển gen đã có khả năng siêu b iểu

163

h iện sinh tổng hợp protein b ò alpha-Lactalbumin, n â n g cao k h ả n ă n g sản x u ấ t sữa n h ờ vậy l àm t ăng t rọng đàn l ợ n con nhanh hơn . M ộ t số protein tái t ổ hợp đ ã được sản x u ấ t trong sữa của m ộ t số động vậ t nuô i (Bảng 8.3):

Bổng 8.3. Một sốprotein có tác dụng chữa bệnh được sản xuất từ sữa của động vật chuyển gen

Các protein sản phẩm của gen người Tác dụng dược lý

Promoter đặc hiệu tuyến sữa

Động vật chuyển gen

Factor IX (Yếu tố IX) Protein làm đông máu để chữa bệnh hemophilia B (Haemophilia)- Máu không đông ỏ người bị đột biến gen yếu tố IX (gene tactõr IX)

b-lactoglobin cừu Cừu

Alpha-1-antitrypsin Protein làm ức chế protease dùng chữa bệnh Khí thũng (emphysema) và bệnh Sơ nang (cystic íibrosis)

b-lactoglobin cừu Cừu

Antithrombin IM Chữa trị bệnh thiếu hụt chất đông máu và sử dụng trong mổ tim (mổ phanh)

casein bò Dê

Tissue plasminogen activator

Làm hoa tan cục máu đông để chữa bệnh đau tim cấp

Acidic protein sữa chuột

Dê

Lactoíerrin Một protein vận chuyển sắt dùng bổ sung vào thức ăn tre em

a-S-casein bò Bò

Protein c Chất chống đông tụ dùng chữa bệnh hemophilia và dùng trong phẫu thuật

Aciditic protein sữa chuột

Lợn

Tuy vậy , phải nó i t h ê m rằng cho đ ế n nay ch ỉ c ó rấ t ít protein tá i tổ hợp do động vật chuyển gen sản xuấ t được p h ê duyệt cho n g ư ờ i sử dụng.

8.4. L I Ệ U P H Á P G E N

L i ệ u p h á p gen là k ỹ thuật chuyển các gen chức n ă n g v à o t ế b à o của m ộ t c ơ t h ể sống th iếu hụ t chức n ă n g đ ó . C ó hai h ình thức chuyển gen c ó thể c ó :

- L i ệ u p h á p gen ở t ế b à o sinh dục: Chuyển gen vào t ế b à o m ầ m sinh dục (germ cell gene therapy): trong t rường hợp n à y t ế b à o sinh dục của cơ t hể sống t h i ếu hụ t chức n ăng có thể được chuyển gen chức n ăng và l àm thay đ ổ i h ệ gen của t ế b à o sinh dục. D o vậy , các b i ến đ ổ i gen có thể d i t ruyền cho t h ế h ệ sau.

- L i ệ u p h á p gen ở t ế bào sinh dưỡng: Chuyển gen vào t ế b à o sinh d ư ỡ n g (somatic cell gene therapy). T ế bào sinh dưỡng t i ếp nhận gen chức n ă n g m ớ i m à cơ t h ể b ị t h iếu

hụt , nhưng gen m ớ i sẽ k h ô n g được d i t ruyền sang t h ế h ệ sau.

H ầ u hết các gen có t r iển vọng được chẩn trị bằng l i ệ u p h á p gen là c á c đ ơ n gen ở c ơ thể bị hỏng hóc do đ ộ t b i ến , ví dụ bệnh x ơ nang (cystic f ibrosis) , bệnh m á u k h ó đ ô n g (haemophillia). Chẩn trị các bệnh đa gen hoặc đa y ế u t ố bằng l i ệ u p h á p gen chắc sẽ k h ó

khăn hơn, ví dụ bệnh parkinson (run tay), ung thư.

Phương p h á p trị l i ệ u là cài các gen b ình thường vào genom của n g ư ờ i bệnh đ ể thay t h ế gen hỏng hóc . Đ ể l àm việc này n g ư ờ i ta phải th iế t k ế gen bằng lắp r áp gen chức n ă n g vào một vector chuyển gen. Vector này thường l ấ y từ genom của m ộ t số virus. Genom

164

virus sau k h i đã được loạ i trừ các gen gây bệnh, k h ô n g c ò n k h ả n ă n g g â y bệnh nữa và thay vào đ ó là gen b ình thường (gen chức năng) n g ư ờ i . Vector được chuyển vào các m ô hoặc t ế bào của cơ thể bệnh nhân , ví dụ t ế bào gan hoặc phổ i chẳng hạn. Vector sẽ cài

gen vào genom của cơ thể nhận.

Các virus thường được sử dụng l àm vector (sau k h i đ ã được l o ạ i trừ c ác gen gây bệnh) là:

- Các Retrovirus: đây là mộ t n h ó m virus có thể tạo ra nh iều bản copy g ồ m các phân tử A D N sợi k é p được tổng hợp từ A R N genom của virus. Genom của virus c ó thể được cài vào n h i ễ m sắc thể của t ế bào chủ. Virus H I V thuộc n h ó m này .

- Các Adenovirus: Các virus thuộc n h ó m này c ó genom là A D N sợi kép , gây mộ t số bệnh đường hô hấp, đường ruột , đau mắ t ở n g ư ờ i .

- Các Adenoassociated virus: N h ó m này g ồ m k h ô n g nh iều virus có genom ch ỉ g ồ m một sợi A D N , có thể cài vật l i ệ u d i t ruyền của n ò vào m ộ t vùng đặc t rưng trong n h i ễ m sắc thể số 19.

- Herpes simplex virus: N h ó m virus v ớ i A D N sợi k é p lây n h i ễ m t ế bào neuron thần kinh.

Tuy vậy, các vector l o ạ i này bị hạn c h ế khai thác do yêu cầu an toàn sinh học.

Bên cạnh đ ó là phương p h á p chuyển trực t i ếp A D N chữa bệnh vào t ế bào k h ô n g dùng đến vector. Tuy nh iên phương p h á p này cần mộ t lượng A D N l ớ n và ch ỉ được thao tác vớ i các m ô t ế bào xác đ ịnh. N g o à i ra còn mộ t số phương p h á p chuyển gen khác không dùng đến virus l à m vector.

Các nhà khoa học đ ang ngh iên cứu chuyển n h i ễ m sắc thể n h â n tạo ở n g ư ờ i được g ọ i là NST số 47 vào t ế bào quan t âm vớ i hy vọng NST này sẽ t ồn t ạ i độc lập song song v ớ i nh iễm sắc thể số 46 và k h ô n g gây ra đ ộ t b iến gen. NST n h â n tạo sẽ mang được nhiều

gen và có thể sẽ k h ô n g bị h ệ m i ễ n dịch của cơ thể đào thả i .

Tuy nhiên công nghệ trị l i ệ u gen cho đ ế n nay v ẫ n chưa được phê chuẩn ứng dụng vì các nguyên nhân :

- Các phản ứng phụ có thể xảy ra đ ố i vớ i ngườ i bệnh do các sản phẩm từ vector sinh ra.

- Vector có thể cà i vào các v ị trí k h ô n g mong muốn trong hệ gen và do vậy c ó thể gây ra các độ t b i ến gen.

M ộ t số t rường hợp bệnh nhân đã bị chết sau k h i được trị l i ệ u gen, cái chết có thể gây ra do phản ứng mạnh của h ệ m i ễ n dịch đ ố i v ớ i vector mang gen là adenovirus.

Bên cạnh đ ó trị l i ệ u gen còn phải vượt qua nhiều trở ngạ i trước k h i đ i vào cuộc sống, đ ó là:

- T ế bào t i ếp nhận gen thường k h ô n g tồn t ạ i được lâu và gen bị đ à o thả i sớm trong quá tr ình phân bào . D o vậy, bệnh n h â n buộc phải trị l i ệ u nh iều l ầ n .

- H ệ m i ễ n dịch của t ế bào luôn t ìm cách đ à o thả i các vật l ạ , trong đ ó c ó vector mang gen.

- Chuyển gen v ớ i vector là virus có thể gây độc, d ị ứng, bệnh nhân lo lắng virus có thể phục h ồ i và gây bệnh.

165

- Các bệnh do đa gen quy đ ịnh như bệnh Alzhemer, bệnh t i m , bệnh t i ể u đường. . . do nhiều gen gây ra chưa có khả n ăng trị l i ệ u trong giai đ o ạ n h i ệ n nay.

8.5. NHÂN GIỐNG ĐỘNG VẬT Ưu THẾ LAI VÀ NHÂN BẢN ĐỘNG VẬT

T R Ư Ở N G T H À N H

a. Thụ tinh nhãn tạo

T h ụ t inh n h â n tạo là p h ư ơ n g p h á p CNSH được sử dụng n h i ề u nhấ t t rong n h â n g iống và cả i t h i ện chấ t lượng đ à n gia súc . Số lượng vật n u ô i sinh sản bằng t h ụ t inh n h â n tạo t rên t h ẻ g i ớ i rấ t l ớ n chứng tỏ h i ệ u quả k i n h t ế to l ớ n của p h ư ơ n g p h á p n à y . Theo tài l i ệ u của F A O (State o f food and Ảgricul ture , 2003-2004), t rong n ă m 1998 đã có t rên 100 t r i ệ u con t râu b ò , chủ y ế u là b ò sữa, 40 t r i ệ u con l ợ n , 3,3 t r i ệ u con cừu và 0,5 t r i ệ u con d ê đã được n h â n g iống bằng thụ t inh n h â n tạo . H i ệ u q u ả k i n h t ế mang l ạ i rấ t cao đ ố i v ớ i c á c l o ạ i động vật c ó sừng, nhấ t là đ ố i vó i b ò sữa do t i nh d ịch của các động vật c ó sừng d ễ bảo quản l ạnh sâu hơn t inh d ịch của c á c đ ộ n g v ậ t k h á c . T r u y ề n

t inh n h â n tạo cho b ò là m ộ t cuộc c á c h mạng trong nghệ c h ă n n u ô i . T ừ m ộ t con b ò đực xuấ t sắc, n g ư ờ i ta c ó t h ể thu được 100.000 l i ề u t inh d ịch m ỗ i n ă m , phục v ụ cho việc thụ t inh n h â n tạo cho h à n g loạt b ò cá i ở những nơi xa x ô i . P h ư ơ n g p h á p n à y cũng đã được áp dụng k h á rộng rãi ở nước ta, cho p h é p tạo ra đ à n b ò l a i cho sữa c ó n ă n g suất sữa cao hơn b ò sữa đ ịa p h ư ơ n g đ ế n 10 l ầ n . Bò la i F l cho th ị t tạo được t ừ t i nh đ ô n g l ạnh của đực g iống ô n đ ớ i v ớ i b ò cá i V i ệ t N a m đ ã cho t ă n g t rọng 700 g / n g à y so v ớ i b ò đ ịa p h ư ơ n g ch ỉ t ăng được 200 g /ngày . Tuy vậy , cho đ ế n nay m ớ i ch ỉ c ó khoảng 10% b ò cá i của nước ta được p h ố i g iống n h â n tạo (Theo Đ i n h V ă n C ả i và N g u y ễ n Ngọc T ấ n , 2007).

b. Cấy truyền hợp tử và phôi

K h á c v ớ i phương p h á p thụ t inh n h â n tạo cho p h é p khai t hác t ố i đ a k h ả n ă n g cho t inh của con đực xuấ t sắc và đặc t ính ưu t h ế lai từ đ à n con của con đực n à y v ớ i nh iều b ò cái

khác nhau. Phương p h á p cấy t r u y ề n phô i và hợp tử cho p h é p khai t hác k h ả n ă n g nhân giống t ố i đa từ mộ t con b ò cái suất sắc. Bằng sử dụng hormon k h á c nhau n g ư ờ i ta k ích hoạt để mộ t b ò cái xuấ t sắc rụng nh iều trứng nhấ t . Trứng được thu h ồ i , bảo quản và thụ t inh in v i tro để tạo phô i . Các phô i thu được sẽ được cấy vào d ạ con của c á c con vậ t mang thai để sinh sản.

Cấy t ruyền hợp tử và phôi non là một phương pháp quan t rọng đ ể n h â n nhanh các giống ưu v iệ t . N ă m 2001, đã có 450.000 con vật được sinh sản từ cấy t ruyền phô i , trong đó chủ yếu là b ò sữa. Đ a số các con đực xuấ t sắc sử dụng trong thụ t inh n h â n tạo (cung cấp tinh) được nhân giống từ cấy t ruyền phôi . Tuy vậy, phương p h á p cấy t ruyền phô i m ớ i được áp dụng nhiều ở Bắc M ỹ , Châu A u và Nhật Bản. Các nước đ ang phát t r iển c ó thể sử dụng phương pháp nhập phôi đông lanh để cả i tạo đàn gia súc, thay vì nhập động vật sống.

c. Nhân bản động vật

L à m t h ế nào để nhân bản được con vật nuô i xuấ t sắc đ a n g ở t u ổ i t rưởng thành , v í d ụ nhân được nhiều con bò đực giống v ớ i các đặc t ính d i t ruyền g iống hệt v ớ i m ộ t con đực giống quý h i ế m nhập n ộ i ?

Các nhà khoa học A n h , lan W i l m u t và Kei th Campbell ở V i ệ n Rosl in và m ộ t c ô n g ty CNSH thuộc thành phố Edinburgh, đã nhân bản thành c ô n g động vật t rưởng thành

166

đầu tiên trên t h ế g iớ i . Đ ó là chú cừu mang tên " D o l l y " ( tên m ộ t ca sỹ được h ọ yêu thích là Do l ly Parton) K ế t quả thành công đã được các nhà khoa học t rên đây công b ố trên tạp ch í Sciẽnce n ă m 1997 (Science 1997 Đ é c 19, vo i . 278:2130-3). T h à n h công này đã m ở ra một k ỷ nguyên m ớ i trong nhân giống và sinh sản động vật . Các động vật ưu tú có thể được nhân bản thành nhiều cá thể g iống hệt nhau và giống hệt v ớ i động vật ban đầu . Phương pháp nhân bản cừu " D o l l y " được m ô ta ở sơ đ ồ 8.1.

T ế bào trứng được l ấ y từ con cừu cái có tên là "Cừu cái mặ t đen Scottish (Scottish Blackíace ewe). Nhân của trứng non được hút ra bằng v i thao tác d ư ớ i k ính h iển v i . T ế

bào lưỡng bộ i được tách từ tuyến vú^của mộ t con cừu cá i truồng thành mang thai 6 tuổ i có tên là Finn Dorset. Bằng phương pháp xung đ iện n g ư ờ i ta đã dung hợp nhân t ế bào

của Finn Dorset vớ i t ế bào trứng đã hút nhân của cừu cái mặ t đen . Sau đ ó t ế bào trứng chuyển nhân đã được k ích hoạt cho phân bào để tạo ra các phôi non đa bào in vitro (sau 6 ngày cấy nhân) . Các phôi non thu được đã được cấy t ruyền vào buồng trứng của 13 con cừu. K ế t quả đã nhận được mộ t con vật n h â n bản đầu tiên trên t h ế giói từ một con vật đã trưởng thành, đ ó là chú cừu Dol ly . Chú cừu Do l ly mang các đặc t ính d i t ruyền

giống hệt vớ i con cừu Finn Dorset.

Hai n ăm sau, n ă m 1998 các nhà khoa học Nhật đã nhân bản thành công bò . N ă m 2000, lợn đã được n h â n bản. N ă m 2002, đ ạ i học Texas đã n h â n bản thành công m è o và các chú m è o này đã sinh đ ẻ được 3 chú m è o con hoàn toàn b ình thường. Ngựa cái nhân bản vô tính đầu t iên ra đ ờ i n ă m 2003. Đ ế n nay hàng t răm động vật n h â n bản đã ra đ ờ i từ kỹ thuật t ruyền nhân từ con vật t rưởng thành.

Phương pháp n h â n bản trên đây được g ọ i n h â n d ò n g nhân t ế bào (Nuclear cloning).

Nó cho phép tạo ra các động vật đồng nhấ t về d i t ruyền v ớ i t ế bào và con vật cho nhân trưởng thành. Tuy vậy , phương p h á p này còn ít h i ệu quả, ví dụ , ch ỉ khoảng 6% phôi cấy truyền có khả n ăng sinh ra con vật nhân bản khoe mạnh, sống lâu. H ầ u hết các phôi bị chết ngay trong quá t r ình thai nghén hoặc trong k h i sinh hoặc sau từ k h i sinh cho đến

tuổ i trưởng thành. N h i ề u phô i bị chết do nhau thai k h ô n g phát t r iển hoặc chức năng của nhau thai k h ô n g b ình thường. M ộ t số con vật nhân bản có b iểu h i ện lão hoa sớm như cừu Dol ly , có thể do mộ t vài các "t ín h iệu lão hoa" đã được t ruyền từ động vật t rưởng thành. M ộ t số con vật nhân bản tỏ ra k h ô n g b ình thường có thể do các b iến đ ổ i d i t ruyền

xảy ra ở nhân trong quá tr ình phân hoa của m ô và t ế bào động vật hoặc do quy trình nhân bản chưa hoàn th iện . M ặ t khác , k h ô n g phải t ế bào n à o của con vật t rưởng thành cũng có thể l à m nguồn vật l i ệ u cung cấp nhân cho nhân bản.

Sơ đ ồ 8.2 m ô tả phương p h á p t ruyền nhân cả i t i ến , cách l àm n h ư sau: T ế bào trứng và t ế bào nh ị b ộ i cho nhân đ ề u được quan sát dướ i k ính h iển v i chuyên dụng, g ọ i là k ính vi thao tác. T ế b à o trứng được đ ịnh vị trên đầu một ống hút bằng m ộ t lực hút chân không nhẹ . Sau đó , đ ó n h â n đơn b ộ i của t ế bào trứng được hút ra bằng mộ t k i m t i êm nhỏ . Đồng thờ i , vớ i một k i m v i thao tác nhỏ khác , n g ư ờ i ta cũng hút nhân của t ế bào sinh dưỡng nh ị bội và sau đ ó t i êm n h â n t ế bào nh ị b ộ i này váo t ế bào trứng đã được hút nhân . T ế bào

trứng cấy t ruyền n h â n được nuôi cấy in vitro trong vài ngày cho đ ế n k h i n ó phát t r iển thành phôi non đ a t ế bào . Cầy phôi vào buồng trứng của con cái mang thai để cho phôi phát t r iển t iếp . Phương pháp v i thao tác như vậy ngày càng được ngh iên cứu hoàn th iện và đang được d ù n g k h á phổ b iến trong nhân bản và chuyển gen ở động vật . Trong t rường hợp chuyển gen, n g ư ờ i ta d ù n g k i m v i thao tác để b ơ m A D N (gen) vào t i ền nhân của t ế

bào trứng.

167

Cừu cái mật đen Scôt-len

Cấy vào tử cung

hách tế bào trứng ệtừ buồng trứng

.oại bỏ nhân đơn bội ang vi thao tác dưới inh hiển vi

Nuôi trong 6 ngày

Nuôi trong ,6 ngày

Cừu cái Donet Phần Lan

Cừu cái Donet Phần Lan Tách các tế bào

sinh dưỡng (2n) từ tuyến sưa

Giữ ở trạng thái không hoạt động bằng cách nuôi trong huyết thanh

Ỉ Dung hợp màng tế bào

bằng xung điện

* . . * Dolly

Sơ đồ 8.1. Phương pháp nhân bản cừu Dolly do lan Wiỉmut phát triển (theo Miesfeld R.L.1999)

Tiêm nhân lấy từ tế bào sinh dưỡng vào tế bào trứng (đã loại bỏ nhân)

Hoạt hóa noãn bào và nuôi cấy phôi

(trong điều kiện in vitro)

Ì

Chuyển phôi vào con cái chõ mang thai

Sơ đồ 8.2. Phương pháp vi thao tác ứng dụng cho truyền nhân phục vụ nhân bản và chuyển gen "Honoluỉu technique (Theo Mies/eld R.L.Ỉ999)

169

Chương 9

K Ỹ T H U Ậ T D I T R U Y Ề N K I Ể M S O Á T S Â U B Ệ N H

Sử dụng thuốc trừ sâu hoa học để bảo vệ các cây t rồng đ a n g c ó xu hướng gia t ăng đặc biệt ở các nước đ ang phát t r iển . Sử dụng thuốc t rừ sâu hoa học gia t ăng là m ộ t trong những n g u y ê n nhân gây ô n h i ễ m môi t rường n g h i ê m trọng. C h í n h phủ M ỹ và nh iều

nước khác đã đề ra mục t iêu sẽ thay t h ế thuốc trừ sâu hoa học bằng thuốc t rừ sâu sinh học và các b iện p h á p k i ể m tra sinh học khác . Các ngh iên cứu về k i ể m tra sâu bệnh ở cây trồng tập trung vào hai hướng ch ính là tạo ra thuốc trừ sâu sinh học và c á c cây chuyển gen vớ i các gen k h á n g sâu bệnh.

9.1. CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN KHÁNG SÂU BỆNH

N g ư ờ i ta phá t h iện ra mộ t số gen có l iên quan đ ế n t ính k h á n g c ô n t rùng , tuyến

t rùng, n ấ m và virus gây bệnh.

Các gen liên quan đến k h á n g côn t rùng g ồ m có :

- Các gen Bt- toxin

- Các gen k ì m h ã m protease

- Các gen tổng hợp các chấ t k ì m h ã m amylase

- Các gen tổng hợp lectin

- Các gen tổng hợp các chấ t trao đ ổ i thứ cấp có hoạt t ính g iế t c ô n t rùng ;

- Các gen m ã cho các độc t ố đặc h iệu v ớ i c ô n t rùng

Các gen m ã cho các protein có l iên quan đ ế n cơ c h ế bảo vệ tự nh i ên của cây v ớ i nấm bệnh gồm:

- Các gen k h á n g n ấ m (gen-R) ở cây t rồng

- Các gen tổng hợp protein k h á n g n ấ m ở cây trồng

- Các gen k i ể m tra sự trao đ ổ i chấ t thứ cấp ở cây trồng

Các gen có liên quan đ ế n k h á n g virus có nguồn gốc từ các cây hoặc từ c á c virus g ồ m có:

- Các gen kháng virus ở cây trồng

- Các gen tổng hợp protein vỏ virus

- Các gen m ã cho protein có liên quan đến sự d i chuyển của virus;

- Các gen m ã cho protein có liên quan đến nhân bản virus (Replicase gene)

Các gen liên quan đ ế n k h á n g tuyến t rùng g ồ m có:

170

- Các gen m ã cho các protein phá huy các chức n ăng sinh lý hoặc trao đ ổ i chấ t cần

th iế t bằng sử dụng các cấu trúc antisense.

- Các chấ t độc trong t ế bào để phá huy t ế b à o tuyến t rùng k h i c h ú n g ăn . Đ ó là các gen tổng hợp lectin và các protein k ìm h ã m các enzym k h á c .

9.2. Cơ CHẾ TÁC DỰNG CỦA CÁC GEN KHÁNG CÔN TRÙNG VÀ MỘT số

T H A N H T ự u Đ Ạ T Đ ư ợ c T R O N G B I Ế N NẠP C Á C G E N N À Y ở C Â Y T R Ổ N G

9.2.1. Cơ chế tác dụng

a. Các gen Bí- toxin

Cho tớ i nay ngườ i ta đã b iết được hơn 50 l oạ i protein khác nhau c ó nguồn gốc từ v i

khuẩn Bacillus thugiensis (Bt) c ó liên quan đ ế n k h á n g côn t rùng . Các độc t ố ngoại bào

này của v i khuẩn là các protein đơn g iản, được m ã bở i các đơn gen. Các độc t ố này thường có h iệu ứng gây độc cao và có tác dụng đặc h i ệu v ớ i từng loạ i côn t rùng.

b. Các chất kìm hãm protease

N h i ề u cây c ó chứa protein như chấ t k ì m h ã m trypsin và chymotrypsin. T á c dụng của các chấ t này trong cờ t hể động vật nó i chung và côn t rùng nói r iêng là k ì m h ã m các enzym thúy phân c ó vai t rò trong tiêu hoa của côn t rùng d ẫ n đ ế n th iếu hụ t một số axit amin cần thiết cho sinh t rưởng của côn t rùng và làm m ấ t cân bằng nước d ẫ n đến cái chết

của chúng. Các chấ t này cũng có ảnh hưởng tớ i sự l ộ t xác của c ô n t rùng . Các chấ t k ìm

hãm protease được tách ra từ thực vật và được chia ra l àm 4 n h ó m ch ính là n h ó m serine, cysteine, netanollo và axit aspartic. C h ú n g hoạt động như là chấ t k ì m h ã m cạnh tranh liên kế t vớ i các trung t âm hoạt hoa của từng protease r iêng biệ t và do đ ó chúng có tác dụng đặc h iệu v ớ i từng protease đặc thù.

c. Các gen mã cho các ỉectin

Lectin là các protein liên kế t v ớ i cacbohydrat. C h ú n g l iên kế t v ớ i phân tử đường nằm trên glycoprotein, glycol ipi t và polysacharit.

Lectin được phân loạ i bằng khả nâng của chúng liên kế t đặc h i ệu v ớ i các phân tử như mannose, hoặc N-acetylglucosamine. Lectin có mặ t trong cây và gây độc đ ố i v ớ i virus, v i khuẩn, n ấ m , côn t rùng và động vật .

ả. Các gen mã các protein có tác dụng kìm hãm tổng hợp amylase

Các chấ t k ì m h ã m amylase cũng được phát h iện thấy phổ b i ến trong cây như là các

chất k ìm h ã m protease. Chúng có tác dụng phá huy các enzym tiêu hoa của côn t rùng.

Chúng được phá t h i ện thấy có tác dụng g iết côn t rùng trong in vi tro và trong cây .

e. Các gen có vai trò trong tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp

Các cây chứa các chấ t gây độc vớ i côn t rùng vớ i l i ề u lượng khác nhau, phụ thuộc vào các loài c ô n t rùng gây hạ i . Có hai hướng nghiên cứu khác nhau làm thay đ ổ i sự trao

171

đ ổ i chấ t của cây trồng đ ể l à m cho cây trồng tạo rà đ ủ số lượng các chấ t n à y đ ể bảo vệ

ch ính n ó k h i côn t rùng tấn công .

Hướng thứ nhấ t là l à m t ăng cường các chấ t có hoạt t ính k h á n g c ô n t r ù n g trong cây bằng tăng cường b iểu h i ện của các gen m ã cho n ó hoặc l à m g i ả m sự p h â n huy các chấ t này ở trong cây . Sử dụng các promoter đặc h iệu v ớ i m ô sẽ cho p h é p b iểu th ị của m ộ t gen nào đ ó t ạ i m ô mong muốn .

Hướng thứ hai là đưa các gen l ạ vào cây đ ể c h ú n g c ó thể tạo ra c á c chấ t độc m ớ i qua việc tạo ra con đường sinh tổng hợp m ớ i .

/ . Các gen mã cho các độc tố khác đặc hiệu với côn trùng

N g ư ờ i ta đã ngh iên cứu và tách được các gen này từ cơ t hể thực vậ t k h á c nhau và sử dụng chúng đ ể b iến nạp vào các cây trồng k h á c nhau.

9.2.2. Một sỏ thành tựu đạt được

a. Các gen mã cho ngoại độc tố Bí

Biến nạp các cây trồng t rên cơ sở các gen m ã cho c á c ngoại độc t ố Bt đ a n g được ngh iên cứu mạnh m ẽ .

- T h à n h tựu ở cây bông :

Cây bông được b iến nạp gen Bt- tox in m ã cho độc t ố Bt đ ã được t rồng ở qu i m ô l ớ n

t ạ i M ỹ , Úc , để k i ể m soát sâu hạ i bông . H ạ t cây b ô n g được b i ế n nạp gen đã thu được n ă m 1995 ở M ỹ và đưa ra trồng n ăm 1996 bở i công ty Delta và Pineland. N ă m 1996, 720.000ha bông chuyển gen đã được trồng ở M ỹ v ớ i n ăng suất b ô n g t ăng lên 8 -10%. Đ ẹ n n ă m 2005, d i ện t ích trồng bông mang gen Bt toàn cầu đạt 5,0 t r i ệu hecta.

- T h à n h tựu ở cây n g ô :

Cây n g ô chuyển gen Bt k h á n g sâu đục thân được c ô n g b ố t ạ i M ỹ n ă m 1995. N ă m 1996 ch ỉ riêng ở M ỹ đã có 180.000ha được trồng n g ô chuyển gen k h á n g sâu đục thân, ch iếm 0 ,61% tổng d i ện t ích n g ô của cả nước. N ă m 1997 đ ã c ó 9 g iống n g ô chuyển gen được đưa ra t rồng. Đ e n n ă m 2005, d i ện t ích t rồng n g ô mang gen Bt toàn cầu đạ t 11,3 t r i ệu hecta.

- Thành tựu ở khoai tây:

Cây khoai tây chuyển gen k h á n g bọ cánh cứng thu được l ầ n đ ầ u t iên t ạ i M ỹ n ă m 1995 và ở Canada n ă m 1996. H i ệ n nay c h ú n g được trồng t ạ i M ỹ và Canada.

- Thành tựu ở cây lúa:

Khoảng 100 loài côn t rùng tấn công lúa trong đ ó có 40 loài được coi là p h á hoạ i ch ính . Sự tổn thấ t về n ăng suất do côn t rùng gây hạ i lên tớ i 10-30% tổng n ă n g suất. T ừ năm 1989 các nhà khoa học Trung Quốc đa t i ế n hành b iến nạp gen Bt ở lúa . G ầ n đ â y các nhà nghiên cứu ở V i ệ n C ô n g nghệ liên bang T h ú y Sĩ đã b iến nạp t hành c ô n g và tạo ra các cây lúa chuyển gen k h á n g sâu đục thân và sâu gây sọc lá lúa {Chiu sp.). Các

nghiên cứu khác từ nh iều nước như Philippin, Ấn Đ ộ . . . cũng tạo ra được c á c cây lúa chuyển gen Bt có k h ả năng g iế t chết 100% sâu đục thân.

172

b. Gen vip3A (a)

Ngoà i gen Bt n g ư ờ i ta cũng đ ã t ìm ra được gen vip3A(a) m ã cho protein c ó 791 axit amin v ớ i trọng lượng 88,5 kDa. Protein này c ó hoạt t ính g iế t c ô n t rùng Agrotisesilon

trong bộ Lepìdopteran.

c. Các gen sản sinh các yếu tố kìm hãm protease

Lĩnh vực này được ngh iên cứu mạnh m ẽ t ạ i đ ạ i học Durham (Anh) . N g ư ờ i ta đã tách ra được gen k ìm h ã m trypsin (cpTI) từ đậu hoa lan, gen PoT(II) từ khoai tây, gen O C - I từ lúa, gen c u từ đậu tương, gen NaPI từ thuốc lá có khả n ăng k ì m h ã m enzym ở côn t rùng và sử dụng chúng để b iến nạp tạo cây k h á n g sâu ở các cây t rồng sau:

- Thuốc lá k h á n g sâu Heliothis viressceus

- Khoai tây, cà chua k h á n g sâu Lacanobita olerceus

- Lúa kháng sâu đục thân (Sesami ineỷareuss và Chilo suppresssaỉis)

- Dâu tây k h á n g Oỉiorhỵncus sulcatus

- Rau d iếp k h á n g Teloggryllus commodus

- Cả i dầu k h á n g Coleopteraus sp.

ả. Các gen tổng hợp lectin

Đ ã từ lâu n g ư ờ i ta đ ã b iế t cây có thể tạo ra các lectin c ó vai t rò bảo vệ rấ t c ó h iệu quả. Lect in l iên k ế t v ớ i glycoprotein ở trong ống tiêu hóa của c ô n t rùng và động vật gây ra các tác hạ i về sinh t rưởng và sức khoe của động vật . L i ề u lượng và thành phần gây độc của lectin đ ố i v ớ i cơ thể là khác nhau và phụ thuộc vào k h ả n ă n g l iên kế t của lectin vớ i glycoprotein của thành ống tiêu hoa và các đ iều k i ệ n bên trong ống t iêu hoa của côn trùng và động vật .

Các gen tổng hợp lectin tách ra từ cây đậu được sử dụng đ ể b iến nạp vào thuốc lá. Các gen khác n h ư GNP, P H A đang được ngh iên cứu đ ể chuyển vào các đ ố i tượng cây trồng khác nhau.

e. Các gen tổng hợp các chất kìm hãm amylase

Các chấ t k ì m h ã m amylase có mặ t ở trong nhiều loài cây , c h ú n g có tác dụng g iế t

chết côn t rùng . N g ư ờ i ta đã tách ra được các gen này từ cây đ ậ u P h á p và chuyển chúng vào cây khoai tây, thuốc lá, đậu tương và đã phát h iện thấy c h ú n g có hoạt t ính kháng côn t rùng.

/ . Các gen mã cho tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp khác

Các gen m ã cho các enzym như cholesterol oxidase đã được sử dụng để b iến nạp vào một số cây trồng để n âng cao khả năng kháng côn t rùng. Các chấ t độc do gen tạo ra có ảnh hưởng đ ế n ống tiêu hoa của côn t rùng d ẫ n đến ngưng trệ q u á tr ình dinh dưỡng và do đ ó c ô n t rùng bị chết.

Đ ể đưa c á c gen m ã cho các chấ t trao đ ổ i thứ cấp đặc h i ệu v ớ i c ô n t r ùng , n g ư ờ i ta phả i n g h i ê n cứu bản chấ t hoa học, con đường sinh tổng hợp và nồng đ ộ g â y độc của

173

chấ t thứ cấp đ ó . Các chấ t trao đ ổ i t hứ cấp gây độc đặc h i ệ u v ớ i c ô n t r ù n g , n h ư n g ít g â y hạ i đ ế n động vật có x ư ơ n g sống. Các gen đ ó n g vai t rò trong sinh tổng hợp c á c chấ t trao đ ổ i thứ cấp đ a n g được n g h i ê n cứu để b i ế n nạp v à o c â y t rồng n h ằ m tạo g i ố n g k h á n g c ô n t rùng .

.ỉ\vy\uioobKVjJL õd 2HOM 9.2.3. C ơ c h ê t á c d ụ n g của c á c gen k h á n g t u y ế n t r ù n g v à m ộ t số t h à n h t ự u đ ạ t đ ư ợ c

t r o n g b i ế n n ạ p c á c gen n à y ở c á c c â y t r ồ n g

Tuyến t rùng là những sinh vật có k h ả n ă n g k í sinh ở thực vật . Chi p h í thuốc bao vệ thực vật để k i ể m soát tuyến t rùng t rên th ị t rường t h ế g iớ i vào khoảng 5,8 t ỷ Ư S D / n ă m . Tổng thiệt hạ i toàn cầu do tuyến t rùng ước t ính vào khoảng 100 t ỷ Ư S D / n ă m , bao g ồ m chi phí thuốc p h ò n g trừ và thấ t thu n ă n g suất (Sasser & Freckman, 1987). M ộ t số protein có thể được sử dụng có h iệu quả để chống l ạ i c ô n t rùng n h ư là c á c chấ t k ì m h ã m protease ở tuyến t rùng (Protease Inhibitors, c p l l , lectin G N A , . . . ) . N g ư ờ i ta đ a n g chuyển các gen k h á n g vào các cây trồng đ ể tạo ra cây chuyển gen k h á n g t uyến t rùng . Các công ty đang mong đ ợ i tạo ra được các cây ngũ cốc, cây rau, củ c ả i đường chuyển gen vào n ă m 2002.

N g ư ờ i ta cũng sử dụng gen m ã cho các k h á n g t h ể để n â n g cao k h ả n ă n g k h á n g tuyến

t rùng, cũng như sử dụng các gen m ã cho các protein l à m r ố i loạn c á c chức n ă n g trao đ ổ i chấ t và các chức năng sinh lý cần th iế t bằng sử dụng các cấu t rúc antisense hoặc các gen m ã cho tổng hợp các sản phẩm gây độc cho t ế bào và phá huy t ế b à o tuyến t r ùng k h i n ó

x â m nhập. Các gen có liên quan đ ế n k h á n g tuyến t rùng bao g ồ m : cấc gen tổng hợp leetin, các protein k ì m h ã m các enzym khác và các ngoại độc t ố Bt đặc h i ệ u v ớ i c ô n t rùng. N ă m 2007, các nhà khoa học đã th iế t k ế thành c ô n g R N A i gán c ó k h ả n ă n g sinh ra các A R N ngắn ( s iRNA) có khả n ăng gây bấ t hoạt m ộ t số gen chức n ă n g của tuyến

t rùng và tiêu d iệ t chúng . ' -Jệv snỏb Ế f a n ú u

9.2.4. C ơ c h ế t á c d ụ n g của c á c gen k h á n g n ấ m v à m ộ t sô t h à n h t ự u đ ạ t đ ư ợ c t r o n g

b i ế n n ạ p c á c gen n à y ở c á c c â y t r ồ n g

Khoảng 10% cây bông của t h ế g iớ i sẽ bị m ấ t đi nếu k h ô n g c ó các chấ t đ ể k i ể m tra bệnh có h iệu quả. Th iệ t hạ i thậm trí c ò n cao h ơ n ở n g ô (12%), lúa m ỹ và lúa mạch (16%), lúa (20%), khoai tây (24%), cà phê (26%). Chi ph í đ ể k i ể m soát bệnh được ước t ính vào khoảng 6000 t r iệu Ư S D n ă m , tương ứng v ớ i 20% tổng chi ph í bảo vệ thực vật . Các gen k h á n g bệnh đang được ngh iên cứu và sử dụng để chuyển vào các g iống cây trồng. Các gen này l iên quan đ ế n các cơ c h ế bảo vệ tự nh iên của cây chủ v ớ i bệnh:

I - Các gen kháng n ấ m (gen-R).

- Các gen tổng hợp protein k h á n g n ấ m .

- Các gen k i ể m tra trao đ ổ i chấ t thứ cấp.

a. Các gen kháng nấm

Tính kháng n ấ m bệnh của cây v ớ i tác nhân gây bệnh được xác đ ịnh bằng tương t ác gen đ ố i gen (gen k h á n g ở trong cây chủ và tương ứng là gen gây bệnh ( A v r ) ở tác n h â n

174

•ííìũJ s i rón o^ l IM!' Vj\'«ú)H'r Í\\'A ĩĩĩí'ĩ 'tí -"-lì • ••• ..: ị, • gậy bệnh. M ố i quan hệ g ọ i đ ổ i gen m ô tả quá t r ình nhận b iế t đòi h ỏ i dấu h iệu c ó nguổn gốc từ tác nhân gây bệnh (yếu t ố gây n h i ễ m - elicitor) và m ộ t h ệ thống thụ c ảm dấu h i ệu tương ứng ở trong cây . Gen A v r m ã cho y ế u t ố gây n h i ễ m elicitor trong k h i đ ó gen k h á n g m ã cho thụ c ảm nhận b iế t tương ứng.

mọ M o g è n là mộ t trong số các công ty đã k h á m phá ra phản ứng gen đ ố i gen bằng tác nhân gây n h i ễ m Avr -9 từ n ấ m Cladosporium ỷulvum và gen k h á n g tương ứng cf-9 ở cà chua bằng sử dụng p íomote r đặc h i ệu . ,

b. Các gen mã cho protein có tác dụng kháng nấm ' • '•' 1

T r o n g cây có nhiều l oạ i protein có l iên quan đ ế n k h á n g n ấ m . C ơ c h ế k h á n g n ấ m có thể tạo ra các phytoalecxin t ạ i chỗ tổn thương để g iết chết t ế b à o n ấ m x â m nhập hoặc tạo ra các enzỵm thụy phân t ạ i chỗ n h i ễ m đ ể thúy phân t ế bào n ấ m k h i c h ú n g x â m nhập.

N g ư ờ i ta đã và đ ang ngh iên cứu để b iến nạp các gen k h á n g n ấ m vào khoai tây, cà chua và một số cây trồng khác và đã thu được các cây chuyển gen k h á n g n ấ m .

Các gen m ã hoa các protein kháng n ấ m , ví dụ :

a. Các protein - enzym như chitinase, 1,3 glucanase âv ocd QBnCTnOid 'ìho ÍKOS /xin Jũìiỉ 'VÚ-Í • \\'.'.'ị\"Ỳ: •:>•' V• • • • • Ị •..

n Cơ sở của sự k h á n g n ấ m là rấ t phức tạp. Chit in và 1,3 glucan là các cấu thành ch ính của thành t ế bào n ấ m . Chitinase và glucanase là 2 enzym có k h ả n ăng thúy phân m à n g t ế

bào nấm và có tác dụng k i ề m c h ế mạnh m ẽ sự x â m n h i ễ m của n ấ m gây bệnh. Hai loạ i enzym này đước tạo ra ở trong và ngoà i t ế bào . N g ư ờ i ta chuyển các gen sinh tổng hợp 2 enzym nạy vào các cây trồng khác nhau. Công ty Mogen đã tách được các gen này từ thuốc lá và đã đưa c h ú n g vào cà chua và nhận được các cây cà chua b i ến nạp gen c ó khả năng kháng rấ t cao v ớ i n ấ m Fusarium cercospora sọ, Esyiphe sp.

b. Các protein thionin, deỷensin và protein gây bất hoạt ribosom và các protein kháng nấm khác

Thionin có phổ b iến ở trong hạt, có hoạt t ính k h á n g cao v ớ i v i sinh vật khác nhau. Thionin là các protein có trọng lượng phân tử thấp giàu cystein. Thionin cũng có khả năng gây độc cho thú. Thionin thường liên kế t vớ i albumin 2S và chấ t k ì m h ã m trypsin. Vì vậy, để có h iệu quả k h á n g cao n g ư ờ i ta mong muốn đưa cả 2 gen m ã cho 2 dạng protein này vào c ù n g mộ t cơ thể . . .

Thionin có phổ k h á n g khuẩn và kháng bệnh rấ t rộng. N ó t ồ n t ạ i ở t rạng thái k h ô n g hoạt động nếu k h ô n g có tác nhân gây bệnh x â m nhập.

Defenin có hoạt t ính k h á n h nấm, có trọng lượng phân tử thấp (5kDa) có nhiều ở trong hạt ngũ cốc, khoai tây. Các gen m ã cho các protein này đã được phân lập và sử dụng để b iến nập vào cây cả i dầu. Các cây cả i dầu b iến nạp gen này cũng tỏ ra kháng cao vớ i n ấ m đen Phomaligans. N g ư ờ i ta đã nhận được cây thuốc lá chứa defensin có nguồn gốc từ Rhaphanus sativus có tác dụng kháng n ấ m Alternaria longiper.

• Các protein gây bấ t hoạt ribosom k h ô n g ảnh hưởng đ ế n ribosom của cây chủ, nhưng l ạ i ít nhiều ảnh hưởng đ ế n ribosom của các loài khác . N g ư ờ i ta đã thu được cây thuốc lá chuyển gen ức c h ế ribosom (gen RIP - Ribosome inhibitor protein gene) có nguồn gốc

175

từ cây lúa. Cây chuyển gen c ó k h ả n ăng k h á n g n ấ m Rhizotonia solani. N g ư ờ i ta cũng

chuyển đồng thờ i cả gen RIP và gen tổng hợp chitinase đ ể n â n g cao hoạt t ính k h á n g n ấ m của cây .

c. Các gen kiểm tra trao đổi chất thứ cấp

Hai hướng ngh iên cứu được sử dụng để t ăng cường k h ả n ă n g k h á n g n ấ m t h ô n g qua các chấ t trao đ ổ i thứ cấp là:

- Đưa gen ngoại lai vào cây để tổng hợp các chấ t trao đ ổ i thứ cấp hoặc đ ể t ăng cường con đường tổng hợp chấ t thứ cấp đã tồn t ạ i trong cây .

- Chuyển gen m ã cho các ẹnzym đ iều hoa l iên quan đ ế n c á c phản ứng ban đ ầ u trong con đường sinh tổng hợp chấ t thứ cấp.

9.2.5. Các gen kháng virus và một số thành tựu đạt được trong biến nạp các gen

n à y ở c á c c â y t r ồ n g

ở cây t rồng 3 ch iến lược p h ò n g chống bệnh virus c ơ bản sau đ â y đ a n g được ngh iên cứu sử dụng:

a. Phòng chống các môi giới truyền bệnh: ch iến lược n à y g ồ m c á c b i ệ n p h á p bảo vệ thực vật, thường phải sử dụng nh iều thuốc bảo vệ thực vật rấ t t ố n k é m , g â y ô n h i ễ m m ô i t rường. K h i bệnh đã b ù n g phát rấ t k h ó k i ể m soát .

b. Tạo các giống kháng bệnh từ các gen kháng virus có sẵn ở cây trồng

Ở một số giống cây trồng có các gen k h á n g tự nh iên , đặc h i ệ u v ớ i m ộ t số n ò i virus gây bệnh. Các sản phẩm của các gen này nhận b iế t tác n h â n x â m nhập và tạo ra phản ứng làm chết virus x â m nhập. M ộ t số gen k h á n g đ ã được b iế t n h ư gen N t ừ thuốc lá đã được tách dòng và nhân bản, gen Tm-2 từ cà chua k h á n g virus gây bệnh k h ả m cà chua và gen Rx từ khoai tây k h á n g virus ở khoai tây. Tuy vậy , ch iến lược n à y gặp rấ t nh iều

k h ó khăn do th iếu nguồn gen k h á n g bệnh. Do vậy , c ô n g nghệ tạo g iống t ruyền thống hầu như đang bó tay trong tạo giống k h á n g mộ t số virus nguy h i ể m ở c à chua, khoai tây, đu đủ (Sanford and Johnston,1985).

c. Sử dụng các gen kháng virus từ chính các virus gây bệnh

Đ â y là phương pháp sử dụng gen nguyên vẹn hoặc mộ t phần gen của virus đ ể chuyển vào cây trồng nhằm tạo giống kháng virus (Saníòrd and Johnston,1985; Praveen et ai., 2004). Các loạ i gen sau đây của virus đã được sử dụng tạo cây chuyển gen k h á n g virus:

+ Gen vỏ protein của virus:

N g ư ờ i ta đã tạo ra được các cây cà chua, cây lúa, đu đủ, . . . chuyển gen k h á n g vừus thông qua chuyển gen vỏ protein của virus.

+ Chuyển gen replicase của virus vào cây trồng:

B iểu th ị của gen m ã cho mộ t phần hay tấ t cả protein replicase ở cây chuyển gen c ó liên quan đ ế n sự k h á n g cao v ớ i virus. N g ư ờ i ta đã b i ến nạp các gen m ã cho c á c replicase khác nhau từ virus vào cây trồng để tạo ra các cây k h á n g virus.

176

+ Chuyển các gen mã cho protein trợ g iúp d i chuyển:

H ầ u hết các virus thực vật chứa protein hoặc peptid cần th iế t cho d i chuyển các virus mớ i tạo ra từ một t ế bào nh iễm tớ i vùng t ế b à o l ậ n cận chưa bị n h i ễ m . H i ệ u quả d i chuyên của virus có liên quan đến khả năng lây n h i ễ m của virus. Sự d i chuyển của virus từ t ế bào này tớ i t ế bào khác qua cầu sinh chấ t . Tuy nh iên cầu sinh chấ t thường quá nhỏ so vớ i virus do đ ó virus thường phải tạo ra các protein trợ g iúp cho d i chuyển và vận chuyển qua cầu sinh chất. Chuyển các gen m ã hoá protein trợ g iúp d i chuyển của virus vào cây trồng cũng là một hướng ngh iên cứu tạo g iống k h á n g virus.

d. Sử dụng công nghệ gen đối nghĩa (antisense gene):

Cây chuyển gen tạo ra các antisense A R N có k h ả n ă n g bắt cặp vớ i A R N của virus và làm bất hoạt virus xâm nhập (Praveen et ai., 2005). N g ư ờ i ta đã b iến nạp thành công các cây khoai tây, cà chua, thuốc lá... kháng virus bằng các gen m ã cho A R N antisense.

e. Sử dụng công nghệ ARNỈ gây bất hoạt gen

Gần đây, các nhà khoa học cho thấy c ô n g nghệ R N A i gây bấ t hoạt gen tỏ ra có hiệu quả cao hơn nhiều so vớ i hai phương p h á p t rên đây (Waterhouse et ai., 1998; Waterhouse et ai., 1999; Wang et ai., 2000). N g ư ờ i ta chuyển các gen g ọ i là A R N i gen vào cây trồng. Cây mang gen A R N i có khả tạo ra các đ o ạ n A R N ngắn có đ ộ dài vào khoảng 2 1 -25 nucleotid, có khả nâng bắt cặp v ớ i A R N của virus và gây bấ t hoạt gen virus. Ngườ i ta đã tạo được một số giống m ớ i kháng bệnh virus bằng công nghệ m ớ i này .

9.3. THÀNH Tựu SẢN XUẤT MỘT số CÁC GIỐNG CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN

K H Á N G SÂU B Ệ N H

Đến năm 2006, cây trồng chuyển gen đã được sản xuấ t thương m ạ i ở 22 quốc gia, đạt d iện tích toàn cầu 102,0 t r i ệu hecta. Các t ính trạng quan trọng nhấ t ở các giống cây trồng biến đ ổ i gen h iện nay là gen k h á n g chấ t d i ệ t cỏ . T ính trạng k h á n g sâu ch iếm vị trí thứ 2, chủ yếu là các giống mang gen Bt (Bí tox in gene). N ă m 1996 giống kháng sâu được trồng trên d iện tích 1,1 t r iệu hecta, đ ế n n ă m 2006 đã lên đ ế n 19,0 t r i ệu hecta. D i ệ n

tích cây chuyển gen ở Trung Quốc và An Đ ộ t ăng mạnh m ấ y n ă m gần đây vớ i cây trồng chủ lực là bông kháng sâu. Các cây trồng b i ến đ ổ i gen khác như đu đủ và củ cải đường mang gen kháng virus m ớ i chỉ được trồng t rên d i ện hẹp. Khoai tây và cà chua chuyển gen kháng bệnh virus tốt nhưng việc thương m ạ i hoa cũng gặp k h ó khăn do ngườ i tiêu dùng chưa chấp nhận. Các giống mang gen k h á n g virus mặc dù đã được thương m ạ i hoa từ năm 1996 nhưng suốt 10 n ă m qua d iện t ích hầu như k h ô n g tăng và chỉ dừng ở dướ i 0,1 tr iệu hecta trong tổng số d iện t ích cây b iến đ ổ i gen toàn cầu n ă m 2006 là 102,0 t r iệu hecta ( ISAAA, 2007).

177

Chương 10

C Ô N G N G H Ệ S I N H H Ọ C P H Ụ C v ụ T R Ổ N G T R Ọ T

10.1. T Ẩ M Q U A N T R Ọ N G C Ủ A N G À N H T R Ồ N G T R Ọ T

H à n g n ă m sản phẩm quang hợp của thực vật đạt khoảng 120.000 t r i ệ u t ấ n t rên mặ t đấ t và 50.000 t r i ệu tấn d ư ớ i đ ạ i dương , trong đ ó 44% sinh k h ố i do cây rừng tạo ra.

Sinh k h ố i do các cây n ô n g nghiệp tạo ra chỉ ch i ếm 6% và là nền tảng cho sự sinh tồn của xã h ộ i loài n g ư ờ i , v ớ i t rên 3.025 t r i ệu tấn lương thực, thực p h ẩ m được tạo ra hàng n ă m . N g o à i ra, n g u y ê n l i ệ u g ỗ (khoảng 1.600 t r i ệu tấn) , ván é p (35 t ỷ Ư S D ) , g iấy (khoảng trên 20 t r i ệu tấn) , củ i đun , dầu thực vật , hoa chấ t , h ư ơ n g l i ệ u , dược l i ệ u , cao su

tự nhiên , hoa và cây cảnh, n ăng lượng sinh học, dưỡng khí . . . cũng được xem là các sản

phẩm căn bản của n g à n h trồng t rọt .

Đ ố i v ớ i nước ta, n g à n h trồng t rọ t đ ó n g vai t rò quyết đ ịnh đ ố i v ớ i an n inh lương thực

và ổn đ ịnh xã h ộ i . N ă m 2007, tổng sản phẩm n ô n g l â m n g ư theo giá thực t ế đạ t 231.282 tỷ đồng, ch i ếm 20,23% GDP, trong đ ó n g à n h t rồng t rọ t đ ó n g g ó p khoảng 76%, chăn nuôi đ ó n g g ó p 24% cơ cấu thu nhập n ô n g nghiệp. Tổng sản lượng lương thực c â y c ó hạt

đạt gần 40,0 t r i ệu tấn , trong đ ó lúa đạt 35,87 t r i ệu tấn , n g ô 4,1 t r i ệ u t ấ n . Sản lượng cây công nghiệp: lạc 505.000 tấn , m ía 14,7 t r i ệu tấn , đ ậ u tương 275.500 t ấ n , h ồ t iêu 90.300

tấn , đ iều nhân 301.900 tấn , cao su 601.700 tấn .

Giá trị chăn nuôi đ ó n g g ó p 24% cơ cấu n ô n g nghiệp. Bò: 6,73 t r i ệ u con, t râu: 3 t r iệu

con ( tăng 2,6%), gia cầm: 226 t r iệu con ( tăng 5,3%), lợn : 22,6 t r i ệu con ( g i ả m 1,1%). Sản lượng thịt hơi các l oạ i : 3,83 t r i ệu tấn ( tăng 12,56%). G i á trị t húy sản t ă n g 1 1 % vớ i

sản lượng 4,15 t r i ệu tấn ( tăng 11,5%). H i ệ n nay n g à n h c h ă n n u ô i c ò n phụ thuộc nhiều

vào nhập khẩu thức ăn, vacxin và thuốc thú y (khoảng gần 1,0 t ỷ USD n ă m ) . V a i t rò của ngành trồng t rọt đ ố i v ớ i phá t t r iển thức ân chăn nuô i c ò n rấ t l ớ n .

N ă m 2007, tổng k i m ngạch xuấ t khẩu của n g à n h n ô n g l â m nghiệp đạ t gần 12,6 tỷ USD, ch iếm 25% tổng k i m ngạch xuấ t k h ẩ u của cả nước. Trong đ ó , n ô n g l â m sản đ ó n g góp 8,7 tỷ USD, thúy sản: 3,8 tỷ USD. X u ấ t k h ẩ u gạo đạt 1,46 tỷ USD, v ớ i 4,5 t r i ệ u tân tăng 13,9% về giá trị, g i ảm 3 , 1 % về số lượng. X u ấ t khẩu rau quả đạt 299 t r i ệ u USD. Cà phê : 972.165 tấn , thu k i m ngạch Ì ,467 tỷ USD.

10.2. CÁC CHUYÊN NGÀNH CNSH PHỤC vụ TRỔNG TRỌT

C ô n g nghệ sinh học (CNSH) phục vụ t rồng t rọt là mộ t khá i n i ệ m rộng bao g ồ m tấ t cả các CNSH phục vụ đầu vào và đầu ra của n g à n h trồng t rọt . Sự phá t t r iển của n g à n h trổng trọt , do đó , sẽ phụ thuộc vào mức đ ộ phát t r iển đồng bộ của các c ô n g nghệ sinh học thích ứng.

178

Bảng 10.1. Các yếu tố đầu vào, đầu ra của ngành trồng trọt và các inh vực ứng dụng của CNSH trồng trọt

Các yếu tố của ngành trổng trọt

Yếu tố đầu vào Hạt giống Yếu tố đầu vào Cây giống

Yếu tố đầu vào

Phân bón

Yếu tố đầu vào

Thuốc trừ sâu bệnh

Yếu tố đầu vào

Các yếu tố môi trường (đất đai, vi sinh vật đất), tác nhân gây bệnh, sinh vật gây hại khác như chuột, côn trùng...

Yếu tố đầu ra Lương thực, thực phẩm và thức ăn chăn nuôi Yếu tố đầu ra Vật liệu (vật liệu xây dựng, giấy, hoa chất...)

Yếu tố đầu ra

Nhiên liệu (củi, khí đốt,..)

Yếu tố đầu ra

Dược liệu và các hoa dược

Các CNSH phục vụ trồng trọt CNSH phục vụ đầu vào CNSH tạo giống cây trồng mới (công nghệ gen, công nghệ tế bào) CNSH phục vụ đầu vào

Công nghệ tế bào nhân giống nhanh và sạch bệnh CNSH phục vụ đầu vào

Công nghệ thuốc trừ sâu bệnh sinh học và phòng trừ tổng hợp (tạo ra, nhân nhanh và thả các thiên địch)

CNSH phục vụ đầu vào

Công nghệ sản xuất phân bón sinh học

CNSH phục vụ đầu vào

CNSH chẩn đoán bệnh thực vật

CNSH phục vụ đầu vào

Công nghệ vi sinh vật đất CNSH phục vụ đầu ra CNSH chế biến nông sản và thức ăn chăn nuôi (Công nghệ vi sinh và

enzym) CNSH phục vụ đầu ra

Các công nghệ sinh học tạo nguồn năng lượng sinh học (khí metan, cồn, biodiesel...)

CNSH phục vụ đầu ra

Công nghệ sinh học chế biến dược liệu

10.2.1. C ô n g nghệ gen v à c ô n g n g h ệ t ế b à o t ạ o g iống c â y t r ồ n g

a. Thành tựu của kỹ thuật di truyền tạo giống cây trồng

Những giống cây trồng m ớ i tạo ra bằng c ô n g nghệ gen thường được g ọ i tắt là G M O (cơ thể sống b iến đ ổ i d i t ruyền: Geneticalỉy M o d i f i e d Organism - G M O ) .

Năm 1996 được coi là n ă m k h ở i đ ầ u của k ỷ n g u y ê n phát t r iển sản xuấ t các giống

cây trồng biến đ ổ i gen, k h i giống cây trồng chuyển gen đ ầ u t iên được thương m ạ i hoa ở M ỹ . Diện tích canh tác các cây trồng chuyển gen l iên tục t ăng t rưởng trong 10 n ăm qua.

Đến năm 2006, cây trồng chuyển gen đã được sản xuấ t thương m ạ i ở 22 quốc gia, đạt

diện tích toàn cầu 102 t r iệu hecta, tăng 12 t r i ệu hecta so v ớ i n ă m 2005. Nước có diện tích cây chuyển gen lớn nhất là M ỹ , t iếp đ ế n là các nước Argentina, Brasil và Canada.

Diện tích cây chuyển gen ở Trung Quốc và Ấn Đ ộ cũng t ăng mạnh vớ i cây trồng chủ lực

là bông kháng sâu. Châu Âu rấ t thận trọng quan sát sự phát t r iển của cây trồng chuyển gen, g iữ lập trường phản đ ố i thương m ạ i hoa cây trồng b i ến đ ổ i gen. Do vậy, ngườ i ta

mớ i chỉ thấy một số đ iểm trồng thử nghiệm cây trổng b iến đ ổ i gen ở Châu Âu . Ngoại l ệ ,

179

Tây Ban Nha là nước châu  u duy nhấ t c ó d i ện t ích cây b i ến đ ổ i gen t h ư ơ n g m ạ i t rên 66.000 ha vào n ă m 2006.

Đ ậ u tương, n g ô , b ô n g và c ả i dầu là 4 cây t rồng b i ến đ ổ i gen chủ lực, c h i ế m hầu hế t

d iện t ích cây chuyển gen toàn cầu. Các cây t rồng b i ến đ ổ i gen k h á c n h ư đ u đ ủ , cà chua, khoai tây, củ cả i đường mang các gen k h á n g virus m ớ i ch ỉ được t rồng t r ên d i ệ n hẹp do n g ư ờ i t iêu d ù n g chưa chấp nhận.

V ề đặc t ính sinh học, các giống cây G M O sản xuấ t t rên t h ế g i ớ i được chia l à m các n h ó m sau:

- Giống G M O k h á n g thuốc d iệ t cỏ

- Giống G M O k h á n g sâu

- Giống G M O k h á n g virus

- Giống G M O k h á n g bệnh n ấ m

- Giống G M O c ả i th iện chấ t lượng sản phẩm

- Giống G M O cả i th iện t ính trạng n ô n g nghiệp và t ính t rạng k h á c

Các t ính trạng quan trọng nhấ t ở các giống cây t rổng b i ế n đ ổ i gen h i ệ n nay là gen k h á n g chấ t d iệ t cỏ , n ă m 1996 g iống k h á n g chấ t d i ệ t cỏ m ớ i được trồng t rên d i ệ n t ích 0,6 t r i ệu hecta, đ ế n n ă m 2006 lên đ ế n 69,9 t r i ệu hecta. T ính t rạng k h á n g sâu c h i ế m v ị trí thứ 2, chủ yếu là gen Bt (Bt tox in gene), n ă m 1996 g iống k h á n g sâu được t rồng t rên d iện tích 1,1 t r i ệu hecta, đ ế n n ă m 2006 lên đ ế n 19,0 t r i ệu hecta. Các g iống c â y t rồng mang đồng thờ i hai gen k h á n g sâu và k h á n g thuốc d iệ t cỏ n ă m 1997 m ớ i được t rổng trên d iện t ích nhỏ hơn 0,1 t r i ệu hecta, đ ế n n ă m 2006 tăng lên 13,1 t r i ệ u hecta. C á c g iống mang gen k h á n g virus mặc d ù đã được thương m ạ i hoa từ n ă m 1996 n h ư n g suốt l o n ă m qua d iện tích hầu như k h ô n g tăng và ch ỉ dừng ở d ư ớ i 0,1 t r i ệu hecta trong tổng số d i ệ n tích cây b iến đ ổ i gen toàn cầu n ă m 2006 là 102,0 t r i ệu hecta ( I S A A A , 2007).

Các giống cây trồng b iến đ ổ i gen đ i vào sản xuấ t nhanh n h ư vậy là n h ờ t ăng năng suất đồng thờ i g i ảm chi ph í sản xuấ t t rên m ộ t đơn v ị d i ệ n t ích , v í dụ :

- G i ả m chi do trồng các giống đậu tương k h á n g chấ t d i ệ t cỏ (Roundup ready soya) n ă m 1998: 30 USD/ha (g iảm 40% chấ t d iệ t co).

- G i ả m chi ph í do trồng các giống b ô n g Bt của Novartis n ă m 1997: 42 Ư S D / h a .

- G i ả m chi ph í do sử dụng giống b ô n g chuyển gen n ă m 1998: 133 U S D / n ă m .

M ộ t số nước A S E A N như Thá i Lan, Phil ippin, Malaysia cũng đã tham gia v à o l ĩnh

vực ngh iên cứu và thương m ạ i mộ t số cây t rổng b iến đ ổ i gen.

Ớ V i ệ t Nam, ngh iên cứu tạo giống cây trồng b iến đ ổ i gen c ò n ở mức k h á sơ khai do một số các yếu t ố hạn c h ế sau:

- Cơ sở sinh học phân tử của tạo giống cây t rổng b iến đ ổ i gen còn y ế u : c h ư a p h â n lập, cả i b iến và thiế t k ế được các gen có giá trị . Các vector mang gen tuy được th iế t k ế

nhưng chưa được đ á n h giá b iểu h iện ở các cây chuyển gen. D ơ vậy , c ó thể nó i rằng c h ú n g ta hầu như chưa có được các gen được th iế t k ế hợp lý.

180

- Quy trình tái sinh cây từ t ế bào nuôi cấy i n v i t ro ở các đ ố i tượng cây chuyển gen còn chưa tốt h iệu quả tái sinh chưa cao, trong k h i đ ó các n h à khoa học quốc t ế đã khẳng định vai trò quyết đ ịnh đ ố i vớ i thành công trong chuyển gen phụ thuộc vào hệ thống tái sính của t ế bào, m ô và k i ể u gen của cây trổng trong đ iều k i ệ n n u ô i cấy in vitro.

Đ ể tạo ra thành công trong ứng dụng k ỹ thuật chuyển gen ở cây trồng, vấn đề số

một đặ t ra là phải:

- Xây dựng được cơ sở sinh học phân tử và c ô n g nghệ t ế bào của công nghệ gen. Chúng ta phải có trong tay một tài n g u y ê n d i t ruyền phong phú g ồ m nhiều gen có giá trị, phân lập và thiết k ế được nhiều gen, nhiều vector chuyển gen trên cơ sở h iểu biết sâu về

hệ điều hành hoạt hoa của từng gen hoặc n h ó m gen. Đ ồ n g thờ i chúng ta phải có trong tay các hệ thống nuôi cấy t ế bào c ó k h ả năng tái sinh cây cao để nâng cao h iệu quả của

thao tác chuyển gen.

- Xây dựng được phương pháp chuyển gen h i ệu quả cao, tạo được nhiều cây chuyển gen vớ i các vị trí cài gen khác nhau trên n h i ễ m sắc thể của cây chủ. T ừ đ ó chọn được các cây chuyển gen có hoạt hoa t ố i ưu của gen chuyển.

- Phối hợp tốt giữa công nghệ gen v ớ i chọn g iống t ruyền thống.

K i n h nghiệm trên t h ế g iớ i cho thấy các gen k i n h t ế quan trọng như gen kháng sâu, kháng chất d iệt cỏ chỉ có giá trị k h i n ó được chuyển vào các giống cây trồng tốt nhất. Ngườ i ta cho rằng Monsanto đã phải bỏ ra khoảng 5,5 t ỷ USD để mua bản quyền sử dụng các giống cây trồng tốt nhấ t (ngô , đậu tương, bông , cả i dầu...) của các công ty giống khác nhau. Trong k h i đó chỉ t ốn khoảng 450,0 t r i ệu USD trong 15 n ă m để nghiên cứu chuyển gen thành công vào các giống cây đ ó . Ta có thể ví thành công của công nghệ d i truyền chọn giống t ruyền thống của nhân l o ạ i trong suốt t h ế k ỷ X X là rấ t lớn, nó đã tạo ra các giống cây trồng ưu v i ệ t n h ư các k i m tự tháp cao ngấ t . Bản thân các giống này đã chiếm d iện tích canh tác áp đảo t rên t h ế g i ớ i trước k h i được chuyển gen. Các gen được CNSH hiện đ ạ i tạo ra (như gen k h á n g sâu, k h á n g d iệ t cỏ , k h á n g bệnh k h á c . ) có thể ví như các ngôi sao sáng, n ó chỉ có giá trị toa sáng k h i được đặ t t rên nền các k i m tự tháp cao ngất kia. N ế u những gen có giá trị ch ỉ được chuyển vào các giống vớ i nền tảng di truyền năng suất và chấ t lượng thấp k é m , c h ú n g sẽ k h ó m à toa sáng được. Cho nên không thể nói , như nhiều nhà quảng cáo cho kỹ thuật gen v ẫ n hay nói bấy lâu: Giống cây trồng biến đ ổ i gen ch iếm d iện t ích nh iều t r i ệu hecta, r ồ i 102,0 t r iệu hecta. Phải chăng thành tựu đó chỉ do kỹ thuật gen tạo ra, tuyệt nh iên là k h ô n g . Đ ó là sự kế t hợp tuyệt vờ i giữa đ ỉnh cao của d i t ruyền tạo giống t ruyền thống và kỹ thuật gen. Do vậy, các nhà hoạch đ ịnh chính sách cũng n h ư các nhà khoa học cần có tư duy lịch sử và hệ thống đ ố i vớ i thành tựu của k ỹ thuật gen đ ể xác đ ịnh bước đi và tổ chức hệ thống tốt nhất cho sự phát t r iển bền vững của k ỹ thuật này ở nước ta, trong đ ó sự kế t hợp nhuần nhuyên giữa kỹ thuật gen và d i t ruyền chọn giống t ruyền thống là cần thiết .

b. Công nghệ tếbào tạo giống cây trồng mới

Các quy trình công nghệ t ế b à o m ớ i hứa hẹn cuộc cách mạng trong l ĩnh vực tạo giống

181

Xây dựng hệ thống tái sinh hiệu quả cao phục vụ cho công nghệ gen:

H i ệ u quả tạo g iông bằng công nghệ gen phụ thuộc rấ t nh iều v à o sự phá t t r i ền cua

các quy trình tái sinh t ế bào chuyển gen thành cây . T h à n h tựu n ổ i bật trong l ĩnh vực n à y là hệ thống tái sinh cây lúa từ nuô i cấy t ế bào phô i hoa. T h ô n g qua chuyển gen vào hệ thống t ế bào có k h ả nâng tái sinh cao này , vài ngh ìn d ò n g lúa chuyển gen v ớ i c á c t ính trạng khác nhau đã nhận được. Các tác g iả đã g ọ i quy t r ình c ô n g nghệ n à y là quy t r ình sản xuấ t cây lúa chuyển gen quy m ô lớn .

Công nghệ đơn bội in vitro và quy trình tái sinh cây từ nuôi cấy in vitro các hạt phấn tách rời ở cây hoa thảo:

Trung Quốc là nước t r iển khai công nghệ đơn b ộ i trong tạo g iống quy m ô l ớ n , bài bản và có đ ịnh hướng chiến lược rõ ràng nhấ t . T rên mộ t n g h ì n c ơ sở n u ô i c ấ y bao phấn đã hoạt động trên toàn quốc từ những n ă m 1970. K ế t quả đã tạo ra t rên 100 g iống lúa m ớ i trong mộ t thờ i gian ngắn. Các giống lúa nước và lúa m ì m ớ i tạo ra từ k ỹ thuật đơn b ộ i đã được m ở rộng trong sản xuấ t t rên d i ện t ích vài t r i ệu ha. T ạ i T r i ề u T i ên k ỹ thuật nuôi cấy bao phấn đã tạo ra 42 giống lúa m ớ i .

ở V i ệ t Nam, V i ệ n D i t ruyền N ô n g nghiệp đã tạo được h à n g t r ă m d ò n g thuần bằng nuôi cấy bao phấn hạt la i , trong đ ó c ó nh iều g iống đ ang khảo ngh i ệm c ó t i ề m n ă n g năng suất và chấ t lượng cao. Khoảng 30 d ò n g bấ t dục đực n h â n (TGMS) m ớ i , m ộ t số d ò n g B t i ề m n ăng nhuỵ cái cao đã tạo và đ a n g được thử k h ả n ă n g p h ố i hợp và sản xuấ t hạt lai . K ỹ thuật đơn b ộ i i n vi tro cũng đ a n g được ứng dụng trong chọn g iống ở V i ệ n lúa Đồng bằng Sông Cửu Long, V i ệ n C ô n g nghệ sinh học...

Thành tựu nuôi cấy m ô mang l ạ i nhiều t r iển vọng đ ố i v ớ i chọn tạo giống lúa có l ẽ là

quy trình tái sinh cây lúa từ nuôi cấy hạt phấn tách r ờ i ở cả hai dạng lúa nước Japonica và Indica do Raina và M a n công b ố n ă m 1998. Trên 500 phôi đã được tái sinh từ khoảng 80.000 hạt phấn nuôi cấy trong Ì đĩa petri đường l á n h 3,5 em. Rấ t nhiều cây xanh đã được tái sinh từ hạt phấn. Đ â y là một t i ến bộ k ỹ thuật đặc biệt quan trọng ở cây ngũ cốc, có thể m ở ra t r iển vọng m ớ i trong chọn tạo giống lúa bằng k ỹ thuật đơn b ộ i và k ỹ thuật gen. Theo lý thuyết, từ một cặp lúa lai F l có thể tạo ra 4096 các k i ể u gen đồng hợp tử khác nhau tái sinh từ hạt phấn in vi t ro ( Đ ỗ N ă n g V ịnh và Phan Phải, 1996). K ỹ thuật nuô i cấy hạt phấn tách rờ i hứa hẹn có thể tạo ra vô số các nguồn gen đa dạng cho chọn giống.

Thành công trong việc thụ tỉnh nhân tạo và nuôi cấy tế bào trứng, tế bào hợp tử, tế bào nội nhũ thành cây trong điều kiện in vitro:

Quy tr ình thụ t inh k é p ở thực vật l ầ n đầu t iên đã được thực h i ện in v i t ro và sự phát t r iển của các sản phẩm sau thụ t inh đã được quan sát thường x u y ê n d ư ớ i k í n h h i ể n v i . T ế

bào trứng sau k h i thụ t inh nhân tạo hoặc thụ t inh in vivo vớ i nhân của t ế b à o hạt phấn đã tạo thành hợp tử 2n và có k h ả n ăng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong ống ngh i ệm. T ế

bào trung t âm của túi phôi (2n n h i ễ m sắc thể) sau kh i thụ t inh v ớ i n h â n của t ế b à o hạt phấn đã tái sinh thành n ộ i nhũ tam b ộ i ở các cây hoa thảo như lúa m ì , lúa mạch, n g ô và lúa nước. Những thành công này đ ang m ở ra t r iển vọng m ớ i trong tạo g iống t h ô n g qua các thao tác d i t ruyền d ư ớ i k ính h iển v i và tạo giống tam b ộ i ở cây trồng.

182

Tạo cây cây ân quả không hạt và cây l âm nghiệp n ă n g suất cao thông qua nuôi cấy

nộ i nhũ tam bộ i

M ộ t số thành công của hướng ngh iên cứu này tổng kế t ở bảng 10.2 d ư ớ i đây:

Bảng 10.2. Phương pháp tạo giống tam bội ở một số cây trồng

Cây trổng Phương pháp nuôi cấy Kết quả

Cây rừng: - Acacia nilotica - Populus tremuloides

Nội nhũ hạt non Cây tam bội có năng suất và chất lượng giấy tốt hơn.

Cây ăn quả (táo tây, cây có múi, Kiwi,...) Nội nhũ hạt non Cây tam bội không hạt ở hàng loạt giống cây ăn qua

c. Công nghệ tế bào nhân nhanh giống cây trồng

Các thành tựu mới trong công nghệ tế bào nhân nhanh giống cây trồng:

K ỹ thuật nuôi cấy m ô đã được trên 600 công ty lớn trên t h ế g iớ i áp dụng để nhân khoảng 500 t r iệu cây g iống /năm ở các giống cây trồng khác nhau. D ự k i ế n th ị trường cây giống nhân bằng kỹ thuật cấy m ô vào khoảng 15 tỷ U S D / n ă m và tốc đ ộ tăng trưởng hàng năm của th ị t rường là vào khoảng 15%.

ơ nước ta, công nghệ nuôi cấy m ô t ế b à o phục vụ n h â n giống cây trồng đã được triển khai trên 20 n ă m nay. N h â n g iống thương m ạ i quy m ô l ớ n đã đạt được ở một số cây trồng như nhân nhanh g iống chuối (khoảng 2,0 t r i ệu c ây /năm) , nhân nhanh giống khoai tây sạch bệnh, nhân nhanh các giống mía m ớ i nhập n ộ i n ăng suất cao, nhân nhanh các dòng bạch đàn chọn lọc và keo lai đạt c ô n g suất 3,0 t r i ệu cây /nãm. Công nghệ nhân giống cũng được áp dụng trên nhiều cây trổng khác nhau n h ư dứa, dứa sợi, cà phê, tách, hông, các cây thuốc quý , các loài lan và cây hoa, cây cảnh, cây ăn quả... V i ệ c thương mại hoa các quy tr ình công nghệ trên đây là ch ìa khoa quan trọng để m ở ra sự bùng n ổ ứng dụng công nghiệp v i nhân giống ở nước ta trong những n ă m t ớ i .

Tuy nhiên, những thành tựu đạt được t rên đây chủ y ế u v ẫ n dựa vào các phương pháp nuôi cấy m ô t ruyền thống, trong đ ó cây hoàn chỉnh được tái sinh trong ống nghiệm, bình tam giác, đĩa petri có nút k ín . Phương p h á p t ruyền thống đã tỏ ra có nhiều hạn c h ế và

không đủ đáp ứng các nhu cầu của sản xuấ t . Do vậy, đã có rấ t nh iều ngh iên cứu nhằm tăng cường hệ số nhân , nâng cao chấ t lượng cây giống và tự động hoa quá trình nhân giống vô t ính thông qua sử dụng các phương thức nhân giống m ớ i , các chấ t hoạt t ính sinh học mớ i , các thiết bị m ớ i tương tự như các n ồ i lên men v i sinh (bioreactor).

Những cải thiện quan trọng trong công nghệ nhân giống bằng cấy mô:

Chế tạo các dụng cụ và thiết bị nuôi cấy mới, cải thiện điều kiện môi trường tăng nhanh hệ số nhân và chất lượng cây giống in vitro

- Tăng cường trao đ ổ i k h ô n g k h í giữa bình nuôi và m ô i t rường ngoài :

+ Tăng h à m lượng C 0 2 và cường đ ộ ch iếu sáng ở mức t ố i ưu trong b ình nuôi nhằm tăng cường quang hợp của cây in vitro.

183

+ G i ả m h à m lượng etylen và độc tố . Các chấ t này thường được t ích l ũ y trong b ình

nuôi k ín d ẫ n đến ức c h ế sinh t rưởng của t ế bào và cầy i n vi tro.

+ G i ả m h à m lượng oxy trong bình nuôi xuống khoảng 10%.

- G i ả m đ ộ ẩm tương đ ố i trong b ình nuôi từ 95-100% xuống khoảng 85-90%.

- T ố i ưu hoa cường đ ộ và thờ i gian ch iếu sáng cũng n h ư tần số á n h s á n g .

V i ệ c cả i th iện c h ế đ ộ dưỡng k h í trong b ình nuôi c ó thể đạt được t h ô n g qua sử dụng m à n g lọc t hông kh í (mil l ipore í i l ter) , hoặc b ình nuôi cấy được c h ế tạo bằng vật l i ệ u thoáng kh í kế t hợp v ớ i t ăng áp lực kh í C 0 2 trong p h ò n g nuô i , hoặc bằng b ơ m k h í chủ động vào b ình nuôi . Phương p h á p nuôi cấy thoáng k h í đơn g i ản và d ễ á p dụng nhấ t là

thay nắp b ình nuôi bằng m à n g t hông kh í l ỗ nhỏ (0,02 um) . Bằng việc sử dụng l o ạ i m à n g này làm nắp và quan sát thấy t ính ưu v i ệ t của nuôi cấy t h o á n g kh í . Ch ỉ sau 2 tuần nuôi cấy số lượng chồ i đu đủ có k ích thước l ớ n hơn hoặc bằng 0,5 em đ ã t ă n g l ên 4 1 % , số lượng lá t ăng lên 17% so v ớ i nuô i cấy trong b ình có nút k ín . K h ô n g thấy c ó h i ệ n tượng tích lũy etylen trong b ình nuô i t h o á n g kh í trong đ iều k i ệ n n u ô i cấy n à y .

Sử dụng ánh sáng tự nhiên thay thế chiếu sáng nhân tạo chẳng những giảm chi phí năng lượng mà còn làm tăng hệ số nhân giống và chất lượng cây giống.

Phương pháp nuôi cây thấm dung dịch lỏng của môi trường theo chu kỳ làm tăng dáng kể hệ số nhân giống và chất lượng cây giống cấy mô.

Phương p h á p dựa t rên cơ sở b ơ m dung dịch lỏng t h ấ m ướ t m ô n u ô i cấy k ế t hợp thông kh í và sau đ ó l ạ i rú t dung dịch đi theo chu k ỳ .

Kích thích quá trình ra hoa trong điều kiện nuôi cấy in vitro.

V í dụ , tre là cây thân g ỗ quan trọng ỏ châu Á v ớ i t rên 500 loài tre k h á c nhau. Mặc

dù vậy tre hầu như chỉ ra hoa ở đ ộ t u ổ i từ 12 - 120 t u ổ i . Các n h à khoa học Ân Đ ộ và Đài Loan đã thành công trong việc l àm cây tre cấy m ô ra hoa k ế t hạt b ình t hường trong ống nghiệm chỉ sau 3 - 6 tháng nuô i cấy. T h à n h c ô n g này m ở ra m ộ t cuộc c á c h mạng trong chọn giống và nhân giống tre la i ngay trong ống ngh iệm và đ a n g được á p dụng rộng rãi vớ i quy m ô lớn ở nhiều nước.

ứng dụng các chất có hoạt tính sinh học mái

Thidiazuron là mộ t chấ t có hoạt t ính tương tự v ớ i n h ó m cytokin in n h ư n g c ó tác dụng cực mạnh đ ố i v ớ i mộ t số cây thân g ỗ k h ó nhân giống. K ế t quả ứng dụng chấ t n à y đã d ẫ n đến khả năng nhân g iống nhanh đ ố i v ớ i h àng loạt cây l âm nghiệp và cây t hân g ỗ ăn quả. V i ệ c phát h iện và ứng dụng Thidiazuron có thể tạo ra mộ t cuộc c á c h mạng m ớ i trong nhân giống cây thân gỗ .

Nhân giống hàng loạt bằng Bioreactor và hạt nhân tạo là thành tựu nổi bật của công nghệ tế bào trong công nghiệp nhân giống:

Hơn 200 loài cây t rồng đã được nhân giống bằng phô i vô t ính. Phô i v ô t ính sau k h i làm khô có thể bảo quản được lâu dài và cho nảy m ầ m vào m ù a xuân . T ừ p h ô i v ô t ính c ó thể tạo hạt nhân tạo. Hạ t nhân tạo thu được có thể gieo bằng m á y gieo hạt. H a i n h à khoa học Nhật Bản Takayama và Misawa là những n g ư ờ i đầu t iên t hông b á o sử dụng bioreactor vào nhân giống thực vật . K ỹ thuật nhân giống này sau đ ó đã được á p dụng

184

cho hàng loạt cây trồng khác như nhân nhanh Liỉium, Dioscorea, Asparagus, Amorphophalus, Colocasia, Hippeastrum, Giadioỉus, Anthurium, Dieffenbachia, Spathiphýllum, Pinellia trong các bioreactor dung t ích từ 10 - 20 lít. Ngoà i phôi vô tính, có thể nhân nhanh chổ i , củ, thân ngầm... bằng Bioreactor. Bảng 10.2 tổng kế t một số thành tựu nhân giống bằng bioreactor n h ư n h â n g iống cỏ ngọt v ớ i công suất nhân giống khổng l ổ , khoảng 200.000 chồi cây trong mộ t Bioreactor 500 lít hoặc nhân giống cà phê tạo được 600.000 phôi vô tính từ Ì g ă m sinh k h ố i ban đ ầ u v ớ i tỷ l ệ tái sinh cây từ phôi vo tính đạt 47%.

Có thể nói rằng phương pháp nhân g iống bằng Bioreactor có khả năng tạo ra số lượng cây giống nhiều vô hạn từ một cây ban đ ầ u tuy theo nhu cầu của thực t i ễ n trong tương lai.

Bảng 10.3. Nhân giống công nghiệp một số cây trồng sử dụng Bioreactor

Loại cây Phương pháp nuôi cấy Kết quả Tài liệu tham khảo

Khoai tây 8 lít Bioreactor Sản xuất nhân giống hàng loạt chổi, sau đó là củ bi

Akita and Takayama 1988

Cà rốt 8 lít Bioreactor Tạo được 50 vạn phôi vô tính, 40.000 hạt nhân tạo, 52% số hạt nhân tạo đã nảy mầm thành cây trong 1 tháng.

Onishiet ai 1994

Cỏ ngọt stevia rebaudiana

500 lít Bioreactor chứa 300 lít môi trường.

Thu được 64,6 kg chồi tươi từ 460 g sinh khối ban đầu. Sản xuất 1 lần 200.000 cây đưa ra đất.

Takaỵama and Akita 1994

Cây lá nhọn (Coniíers)

Phôi vô tính có các chất dự trữ như chất béo và protein tương tự như phôi hạt bình thường

Phôi vô tính sau khi làm khô có thể bảo quản được lâu dài và cho nảy mầm vào mùa xuân - Cây tái sinh từ phôi vô tính với độ đồng đều cao, được sản xuất hàng loạt phục vụ cho trổng rừng

Attree and Fowke,1993

Cây dứa 10 lít Bioreactor Nhân giống dứa quy mô lớn đáp ứng nhu cầu 15 triệu cây/năm

Anomynous 1995.

Cà phê c. canephora arabusta

Bioreactor - Tạo được 600.000 phôi vô tính với tỷ lệ phôi tái sinh thành cây là 47% từ 1 găm sinh khối ban đầu.

Ducosetal 1993

Công nghệ nuôi cấy m ô và t ế bào đã được h ình thành và phát t r iển ở V i ệ t nam trên 20 năm nay. M ộ t số quy trình công nghệ đã được áp dụng vào sản xuấ t lớn . Q u á trình mở rộng, sản xuấ t thử dạng Pilot và thương m ạ i hoa công nghệ cần được đẩy mạnh trong những n ăm tớ i .

10.2.2. N h ữ n g t h à n h t ự u n ổ i b ậ t n h ấ t t r o n g l ĩ n h vực t ạ o g i ô n g v à va i t r ò của n ó đôi vớ i n g à n h t r ồ n g t r ọ t

ũ. Cuộc cách mạng xanh lần thứ nhất và sản xuất lúa gạo

Cơ sở d i t ruyền của cuộc cách mạng xanh là sử dụng các gen lùn để tạo ra các giống lúa mì và lúa gạo lùn và nửa lùn có t i ề m n ăng năng suất cao. N g ư ờ i m ở ra k ỷ nguyên sử

185

dụng gen lùn vào tạo giống là N. borỉaug (G iả i thưởng Nobel) . Borlaug đ ã tạo ra hàng loạt các giống lúa m ỹ cao sản bằng lai tạo giữa giống lúa m ỹ lùn N o ã n 10 (nguồn gốc Nhật Bản) vớ i các giống lúa m ỳ khác .

V i ệ n lúa Quốc t ế I R R I đã đ ó n g vai t rò chủ đạo trong tạo g iống lúa gạo m ớ i k i ể u nửa lùn. N ổ i bật nhấ t là giống lúa IR8 do I R R I tạo ra do lai giữa g iống Peta nguồn gốc từ Indonesia và giống lúa lùn Đà i Loan Đ ề Cước Ô T iêm. Giống IR8 c ó n ă n g suất cao, thích nghi vớ i nh iều vùng t rồng lúa trên t h ế g i ớ i . T ạ i Phi l ippin n ă n g suất g iống lúa địa phương tốt nhấ t chỉ đạt 40 tạ/ha/vụ, trong k h i các giống lúa nửa lùn của I R R I đ ã cho năng suất gấp 2.

Các công tr ình tạo giống dựa trên gen lùn của Borlaug ở Bắc M ỹ của V i ệ n lúa Quốc

t ế I R R I ở Phil ippin và các nhà tạo giống của các nước đặc b iệ t là Ấn Đ ộ đ ã là y ế u t ố

quyết đ ịnh sự ra đ ờ i của cuộc cách mạng xanh l ầ n ì v ớ i n ă n g suất n ô n g sản t rên m ộ t đơn vị d iện t ích tăng gấp 2 lần .

H ầ u hết các g iống lúa trồng trong sản xuấ t ở nước ta từ những n ă m 1970 đ ế n nay,

dù là g iống tạo ra trong nước hay nhập và chọn lọc từ g iống nước n g o à i đ ề u được tạo ra dựa trên các nguồn gen lùn và nửa lùn và là sản p h ẩ m của cuộc " c á c h mạng xanh" lần ì vớ i năng suất cao hơn hẳn các giống lúa t ruyền thống. N h ờ vậy , h à n g loạ t các Hợp tác xã nông nghiệp đã đạt n ăng suất 5,0 tấn/ha trong thờ i chống M ỹ và h i ệ n nay đạt 10,0 tấn/ha. T ỷ l ệ giống lúa tham gia vào sản xuấ t xuấ t khẩu do c á c V i ệ n n g h i ê n cứu trong nước tạo ra ngày càng t ăng . Theo đ á n h giá của các n h à khoa học, y ế u t ố g iống và kỹ thuật canh tác , bảo vệ thực vật đ ó n g g ó p ít nhấ t là l o - 15% trong tổng sản lượng lúa gạo cả nước. Đ ó n g g ó p của khoa học trong 1,0 tỷ USD gạo xuấ t k h ẩ u ước t ính 10%, tương đương v ớ i khoảng 100 t r iệu USD và 10% của 31 t r i ệu t ấ n thóc n ă m 1999 là khoảng trên 3 t r iệu tấn thóc , tương đương v ớ i khoảng 450 t r i ệu U S D / n ă m . M ứ c đ ó n g g ó p của khoa học công nghệ n ô n g nghiệp nước ta h i ện m ớ i ch ỉ tập trung vào cây lúa. Trong tương lai hiệu quả đ ó n g g ó p của khoa học sẽ còn t ăng lên hơn nữa nếu được khai t hác đ ú n g hướng và đầu tư đúng mức. Giá gạo xuấ t k h ẩ u của ta h i ệ n đ a n g ở mức thấp, do vậy l ợ i nhuận từ xuấ t khẩu gạo còn là vấn đề . V a i t rò có t ính quyết đ ịnh của khoa học đ ố i v ớ i x u ấ t khẩu gạo thờ i gian tớ i là nhanh chóng tạo ra các g iống n ăng suất, chấ t lượng cao, g iá thành sản xuấ t thấp đủ sức cạnh tranh trên th ị t rường.

Những nhược đ i ể m của cuộc cách mạng xanh l ầ n ì:

- Giống nửa lùn đòi h ỏ i t h â m canh cao, sử dụng nh iều p h â n b ó n và nước tưói .

- M ẫ n cảm sâu bệnh đã d ẫ n đ ế n chi ph í sử dụng thuốc B V T V cao và ô n h i ễ m m ô i trường.

Theo TS. Gurder Khush, nhà tạo giống lúa n ổ i t iếng I R R I : N ă n g suất lúa lùn đạ t t ố i đa ớ đ iều k i ệ n lý tưởng là 9 - 10 tấn/ha/vụ . Trên t h ế g iớ i n ă n g suất lúa trung b ì n h đạt 5 tấn/ha ở vùng có nước tướ i chủ động và 3,6 tấn/ha ở các vùng k h á c . Trong k h i , theo d ự đoán năm 2025 dân số t h ế g iớ i là 8,5 tỷ n g ư ờ i , khoảng 5 t ỷ n g ư ờ i sống n h ờ lúa gạo.

Nhân loai cần đến những phát minh và sáng c h ế m ớ i .

186

Các tiền đề cho cuộc cách mạng mới trong nghề trồng lúa:

Cách mạng xanh mớ i phải khắc phục được các nhược đ i ể m của cuộc cách mạng

xanh lần ì đã nêu ở trên.

Ba tiến bộ khoa học di truyền của nghề trồng lúa:

Tiến bộ về lúa lai: Từ thờ i t i ền sử cho đ ế n trước k h i các nhà khoa học Trung Quốc tạo ra hàng loạt các giống lúa la i , lúa trồng v ố n là cây tự thụ phấn khá ngh iêm ngặt. Cải biên d i t ruyền giống lúa từ các giống tự thụ thành các giống thích nghi vớ i thụ phấn chéo là một trong các thành tựu vĩ đ ạ i nhấ t của d i t ruyền học và chọn giống trong nửa sau của t h ế k ỷ X X . Các gen mớ i được đưa vào các g iống lúa trồng là:

- Gen bất dục đực t ế bào chấ t (CMS).

- Gen nhuỵ cái cao và vỏ t rấu m ở rộng.

- Gen bất dục đực n h â n cảm ứng v ớ i nhiệt đ ộ và chu k ỳ quang (TGMS) và TG-PGMS.

Nhờ sự phối hợp của các gen này n g ư ờ i ta có thể sản xuấ t được hạt giống lúa lai F l . Kết quả vào n ăm 1997, d iện t ích trồng các giống lúa lai của Trung Quốc đạt 17,5 t r iệu hecta, chiếm 50% d iện tích trồng lúa của nước này . N ă n g suất lúa lai tăng trung bình khoảng 1,5 tấn/ha. Sản lượng lúa tăng nhờ g iống lúa lai F l ở Trung Quốc dự tính vào khoảng 26 t r iệu tấn n ă m 1997. N h ờ những t i ế n bộ về g iống sản lượng lúa của Trung Quốc tăng từ 129 t r i ệu tấn (1975) lên 200 t r i ệu tấn (1994).

Tr iển vọng tăng năng suất nhờ sản xuấ t lúa la i còn rấ t lớn . N h i ề u cặp lai cho năng suất cao hơn năng suất của giống lúa thuần tố t nhấ t vào 'khoảng 40 - 50% và thích ứng rộng hơn vớ i vùng sinh thái . N ă n g suất lúa la i có thể đạt 12 tấn/ha hoặc hơn nữa (Virmani , 1994).

Thiết kế di truyền của các giống siêu lúa:

Các nhà d i t ruyền và chọn giống lúa ở I R R I đã đưa ra m ô h ình giống siêu lúa vớ i các mục tiêu:

- Năng suất đạt trên 12 tấn/ha.

- Sinh k h ố i khô : 22 tấn/ha, tỷ l ệ t hóc / rơm rạ: 60/40.

- Mang các gen chống chịu vớ i sâu bệnh.

- Nâng suất hạt của giống siêu lúa sẽ tăng khoảng 25%.

Sau quá trình lai tạo và chọn giống, các nhà khoa học I R R I thông báo đã tạo được giống siêu lúa vớ i năng suất tăng 25% so v ớ i giống có nâng suất cao nhất đã được tạo ra trước đây ( l o tấn/ha/vụ). H i ệ n t ạ i chưa có mộ t minh chứng nào cho thấy siêu lúa có ưu việt hơn hẳn các giống nửa lùn về chi ph í sản xuấ t /1 đon vị sản lượng.

Chọn tạo các giống lúa chuyển gen và chọn giống nhờ chỉ thị phân tử:

Trên nền các giống lúa cao sản và các giống lúa chấ t lượng cao đã tạo ra trên t h ế

g iớ i , các nhà khoa học đưa thêm vào giống lúa những gen m ớ i như gen độc tố trừ sâu (gen Bt), gen chống chịu bệnh bạc lá, gen chống chịu chấ t d iệ t cỏ... Các nhà khoa học

187

Trung Quốc, I R R I , T h ú y Sỹ đã thông báo về việc tạo ra các g iống lúa mang gen Bt c ó khả năng k h á n g sâu rấ t mạnh, nhấ t là sâu đục thân . Sâu ăn phả i các c â y lúa mang gen Bt đã bị chét 100%.

c. Phát hiện ra các gen mới có thể tạo ra cuộc cách mạng trong nông nghiệp

Phát hiện các gen bảo vệ thực vật chống sáu bệnh hại: H i ệ n nay đ ã phá t h i ệ n ra nhiều chủng v i khuẩn Bt khác nhau mang các gen tổng hợp các độc t ố c ó k h ả n ă n g tiêu diệ t các loạ i sâu, rệp, m u ỗ i k h á c nhau. Các gen này đã được tách ra từ v i k h u ẩ n Bt, các protein độc t ố sản phẩm của các gen này đã được thí ngh iệm và đ ã chứng tỏ k h ả n ăng diệ t được nhiều l oạ i côn t rùng. Các chủng v i khuẩn Bt mang độc t ố d iệ t m u ỗ i đ ã được

sản xuấ t công nghiệp.

Phát hiện ra các gen chín sớm tạo giống ngắn ngày.

Phát hiện các gen kìm hãm quá trình chín của quả, c á c gen k ì m h ã m sinh tổng hợp ethylen. N h i ề u l oạ i quả như cà chua, chuối . . . sẽ chuyển từ xanh sang c h ú i n h ờ có quá trình sinh tổng hợp ethylen. Các giống mang gen k ì m h ã m ch ín c ó thể t ồ n t ạ i t rên ruộng lâu hơn, d ễ bảo quản và bảo quản được lâu hơn trong q u á t r ình vận chuyển.

H i ệ n nay, nhờ có đầu tư rấ t lớn của chương t r ình genom thực vật , n g ư ờ i ta đã xác đ ịnh được khoảng 130.000 gen từ 19 loài cây trồng k h á c nhau. L ú a là cây lương thực

chủ yếu của châu Á. Th ị t rường lúa gạo r iêng của Trung Quốc d ự t ính vào khoảng 45 t ỷ USD n ă m . D ự án quốc t ế xác đ ịnh tr ình tự genom lúa đã được thực h i ệ n 4 n ă m và sẽ

được t iếp tục đến n ă m 2004. Các chương t r ình genom n g ô , đ ậ u tương , lúa m ỹ , cà chua... cũng đang được các công ty siêu quốc gia và các cường quốc k i n h t ế thực h i ệ n . D ự k i ế n

các gen chìa khoa quan trọng đ ố i v ớ i năng suất, chấ t lượng, k h ả n ă n g chống ch ịu sâu bệnh của cây trồng sẽ được phát h iện cùng vớ i t r ình tự nucleotid và cấu t rúc chức n ăng của gen trong genom. Chương tr ình xác đ ịnh tr ình tự và cấu t rúc genom cây t rồng chắc chắn sẽ tạo ra cuộc cách mạng sinh học trong k ỷ n g u y ê n m ớ i này .

ả. Khai thác'hiện tượng ưu thế lai

XÁI t h ế lai phải là một trong các thành tựu ứng dụng cơ bản nhấ t của d i t ruyền chọn giống và là một t i ề m năng phát t r iển của n ô n g nghiệp nước ta. K h a i thác t r iệ t đ ể đặc t ính di t ruyền ưu t h ế lai là mộ t trong các b iện p h á p cơ bản nhấ t đ ể t ăng t rưởng n ô n g nghiệp và nâng cao khả năng cạnh tranh của n ô n g sản V i ệ t Nam.

Các giông cây trồng ưu thế lai:

Ưu t h ế lai là h iện tượng d i t ruyền phổ b iến t ồ n t ạ i ở hầu hế t các loài động thực vật , thậm chí cả v i sinh vật. Ư u t h ế lai b iểu h iện thông qua rấ t nh iều các ch ỉ số, ví d ụ như: sự tăng năng suất, sức sống, khả n ăng chống chịu, những ưu t h ế v ề sinh t rưởng phá t t r iển khác so vớ i giống b ố m ẹ . H i ệ n tượng ưu t h ế được phát h i ệ n vào t h ế k ỷ X I X và đ ã được ứng dụng rấ t h iệu quả đ ố i v ớ i các ngành trồng t rọt và c h ă n nuô i . G iống la i , m ộ t t i ề m

năng cần tận dụng tr iệ t để trong phát t r iển nông nghiệp.

D ư ớ i đây chúng tôi chỉ nêu mộ t vài ví dụ :

188

Ngô lai

V í d ụ đ iển h ình nhấ t về sự thành công trong ứng dụng ưu t h ế con lai F l trong n ô n g nghiệp là n g ô lai . T ạ i nước M ỹ , năng suất n g ô lai vượt t rên các giống n g ô t ruyền thống từ Ì ,0 tấn đ ế n 6,0 tấn/ha/vụ, vớ i sản lượng trung b ình là 2,0 tấn/ha. N g ư ờ i ta đã t ính vai t rò của các y ế u t ố khác nhau đ ó n g g ó p vào sự t ăng năng suất cây trồng và đã khẳng đ ịnh rằng g iống lai đóng g ó p 60% và công nghệ canh tác đ ó n g g ó p 40% vào mức t ăng năng suất n g ô .

T i ề m năng d i t ruyền năng suất n g ô lai đã đạt 23 -24 tấn/ha, nhưng thông thường chỉ khoảng 60% t i ề m năng d i t ruyền của giống được khai thác trong sản xuấ t . N h ờ những thành tựu d i t ruyền chọn giống n g ô lai trên t h ế g iớ i sản lượng n g ô toàn cầu đạt đ ế n 603

t r iệu tấn trong thờ i vụ 1998/1999, trong đ ó r iêng nước M ỹ đã ch iếm 247,9 t r i ệu tấn . N h ờ có giống n g ô lai n ăng suất cao và quá tr ình cơ g iớ i hoa, hoa học hoa sản xuấ t nên giá thành sản xuấ t n g ô t rên t h ế g i ớ i xuống thấp mộ t cách đ áng k inh ngạc. G iá bán n g ô hạt t ạ i Chicago ch ỉ là 84ƯSD/ tấn , thấp hơn hẳn giá n g ô ở V i ệ t Nam (Thờ i Báo K i n h t ế V i ệ t Nam số 29 ngày 8 tháng 3 n ă m 2000). N h ờ những thành tựu d i t ruyền chọn giống n g ô lai , các công ty giống khổng l ồ trên t h ế g iớ i đặc biệt là Pioneer ( M ỹ ) đã b ộ i thu và trở thành công ty g iống h à n g đ ầ u t h ế g iớ i vớ i doanh thu 1,6 tỷ Ư S D n ă m 1997.

Sản xuấ t n g ô la i ở V i ệ t Nam tăng rấ t mạnh trong những n ă m gần đây . V a i trò hàng đầu đ ố i v ớ i sản xuấ t n g ô la i là chọn lọc các dòng b ố m ẹ thuần c ó khả n ăng kế t .hợp cao. H i ệ n nay giống n g ô la i L V N 10 có năng suất cao, thích nghi rộng đ ang được trồng trên khắp đấ t nước. N ă n g suất của giống n g ô này t ăng gấp 3, thậih ch í gấp 4 lần năng suất ngô trung b ình của n ă m 1990, là n ă m cả nước chưa trồng n g ô la i .

Lúa lai

Nói chung lúa la i cho năng suất cao hơn lúa thuần từ 20-30%. So sánh năng suất lúa lai vớ i các giống lúa thuần ở Trung Quốc từ n ă m 1981-1990 cho thấy năng suất của giống lai tăng từ 29-45% sò v ớ i giống lúa thuần. Cuộc chạy đua t ìm k i ế m các cặp lúa lai mớ i năng suất, chấ t lượng cao, thích nghi rộng và chống chịu bệnh sâu bệnh đ ang d i ễ n

ra ở Trung Quốc, An Đ ộ , và nhiều nước khác . Trung quốc là nước trồng lúa lai sớm nhấ t , tạo ra một độ t phá l ớ n trong l ĩnh vực nông nghiệp v ớ i d i ện tích 17,5 t r i ệu hecta n ă m 1997. D i ệ n t ích lúa lai của nước ta đạt x ấ p x ỉ 200.000 ha n ă m 1999 và d ự k i ế n t ăng sản lượng thóc lên khoảng 300.000 tấn thóc ( tương đương v ớ i khoảng 300 - 450 tỷ đồng) .

Rau quả lai

H i ệ n tượng ưu t h ế lai đã được ứng dụng t r iệ t để tuyệt đ ố i ở các nước công nghiệp phát t r iển đ ố i vớ i hầu hết các g iống rau quả như cà chua, dưa chuột, bắp cả i , hành tây, cà rốt. . . Các giống b ố m ẹ d ù n g trong sản xuấ t rau quả lai đ ề u được đ ăng k ý độc quyền tác

g iả và các công ty giống siêu quốc gia g i ữ vai trò chủ đạo trong việc sản xuấ t thương m ạ i các giống lai . Q u á tr ình khai thác đặc t ính ưu t h ế lai ở rau quả đàng d i ễ n ra ở các

nước phát t r iển. Ở V i ệ t Nam, ta phải nhập khẩu hầu hết các g iống rau quả la i . Các giống rau quả không hạt đ ề u là các g iống tam b ộ i thể hoặc giống mang gen đặc t ính d i t ruyền

trinh sản (có thể tạo quả m à k h ô n g tạo hạt) như cam quýt , dưa hấu , nho...

189

Hiện tượng ưu thế lai ở các cây trồng có khả năng nhân nhanh bằng con đường vô tính cho phép ứng dụng CNSH nhân giống nhanh:

M ộ t ví dụ đ iển h ình là cây mía : N g ư ờ i ta lai tạo các g iống m í a v ớ i nhau đ ể t ìm ra giống lai có t i ề m năng năng suất cao, một số giống la i đạt n ăng suất t rên 200,0 tấn/ha, như ở Hawai i b ình q u â n thu hoạch 11,9 tấn đ ư ờ n g / h a / n ã m , c ó k h i đạ t 24,2 tấn đường /ha /năm. H i ệ u suất thu h ổ i đường trên mía ở Australia đạ t vào l o ạ i cao nhấ t t h ế

g iớ i vớ i tỷ l ệ mía /đường khoảng 1/7-8, thậm chí là 1/6. M ộ t số g iống c ó h à m lượng đường trên 17% trọng lượng mía cây .

Sau kh i tạo ra giống mía m ớ i n g ư ờ i ta nhân giống nhanh bằng n u ô i cấy m ô , ví dụ , ch ỉ sau 4 n ă m t ỉnh Quảng Tây , Trung Quốc đã nhân được 33.000 ha g iống m í a m ớ i Q u ế

Đường 11 bằng cấy m ô (sản xuấ t 2,0 tỷ cây) , trong k h i bằng phương p h á p t ruyền thống phải mấ t 10 n ă m m ớ i nhân được d i ện tích tương tự. Ch ỉ v ớ i Ì ngọn m í a g iống K84-200 nhập n ộ i từ Thá i Lan, v ớ i quy t r ình công nghệ cấy m ô của V i ệ n D i t ruyền N ô n g nghiệp, Công ty đ ư ờ n g H i ệ p Hoa, Long A n đã nhân giống đủ trồng cho 5330 ha m í a g iống mớ i ( tương đương vớ i 300 t r iệu cây giống) . Giống K84-200 c ó h à m lượng đ ư ờ n g và năng suất cao hơn hẳn các giống cũ, đồng thờ i l ạ i th ích hợp v ớ i v ù n g đ ấ t p h è n m ặ n của M i ề n

Tây Nam bộ. í;5 ỉ ' !

H i ệ n tượng ưu t h ế lai cũng rấ t phổ b iến ở cây thân g ỗ lưu n iên n h ư cây c ô n g nghiệp chè , cà phê , cao su, cây lâm nghiệp. Trung tâm giống l âm nghiệp- V i ệ n Khoa học L â m nghiệp V i ệ t Nam đã chọn được các d ò n g bạch đàn ưu t h ế la i , g iống keo lai c ó n ă n g suất cao thay t h ế các giống cây l âm nghiệp nhập n ộ i . Các giống c h è m ớ i , b ô n g m ớ i nhập vào nước ta hầu hết là g iống ưu t h ế la i .

10.2.3. Công nghệ sinh học bảo vệ thực vật phục vụ trồng trọt

Các kỹ thuật công nghệ sinh học bảo vệ thực vật cơ bản bao g ồ m :

- CNSH tạo giống chống ch ịu sâu bệnh và các đ iều k i ệ n th iên nh i ên bấ t l ợ i (xem chi t iế t chương 9) o rh oe

- CNSH v i sinh và sinh hoa chọn tạo và sản xuấ t c h ế p h ẩ m v i sinh B V T V

- Các công nghệ sinh hoa học khác , . .ĩ . ' I ,'iỤn J iou 1 '

- Chấn đoán bệnh iĩ\li\ í u ìr")íì u s í l i .... * Ì ri ... lì Ị í 3 ị Ị i Ì Í

a. Chủng loại chế phẩm sinh học BVTV C h ế phẩm v i khuẩn bao gồm:

- Các c h ế phẩm từ v i khuẩn như Bt (Bacỉỉlus thuringiensis) t rừ sâu, m u ỗ i . . .

- Các c h ế phẩm từ v i khuẩn huỳnh quang Pseudomonas /ỉuorescent t rừ n ấ m và v i sinh vật hạ i cây trong đấ t .

- Các c h ế phẩm trừ chuột: B ả d iệ t chuột sinh học từ v i khuẩn Samonella enteritidis.

- C h ế phẩm từ virus: V í dụ NPV trừ sâu xanh, sâu khoang, sâu keo da l áng , sâu hạ i bông , đay và cây m à u .

- C h ế phẩm từ nấm: Ví dụ , Beauveria và Metarhiiium trừ sâu r ó m thông , t rừ c à o c à o hạ i luồng và cây rừng. Trichoderma trừ bệnh k h ô vằn hạ i lúa n g ô , trừ bệnh l ở cổ rễ h ạ i rau màu .

190

Tình hình sản xuất và thị trường sử dụng thuốc bảo vệ thực vật:

D ự tính thiệt hạ i sản xuấ t gây ra do côn t rùng là 14% tổng sản lượng toàn cầu, do bệnh 12% do cỏ dạ i 10% và tổng thiệt hạ i vào khoảng 36%. Th ị t rường các sản phẩm bảo vệ thực vật toàn cầu năm 1996 là 31,25 tỷ Ư S D , trong đ ó thuốc diệ t cỏ ch iếm 48%,

côn t rùng 28%, thuốc trừ nấm 19%, k ích thích sinh t rưởng 4% và hạt giống chuyển gen

kháng sâu bệnh gần 1%. Th ị trường chấ t d iệ t cỏ là quan trọng nhấ t ở Bắc M ỹ , châu Âu và các nước công nghiệp phát t r iển, trong k h i thuốc trừ sâu l ạ i là quan trọng nhất ở các nước đang phát t r iển. Thuốc bảo vệ thực vật toàn cầu được sử dụng chủ yếu ở các nước công nghiệp phương Bắc, ch iếm 72% (22,6 t ỷ USD), các nước đ ang phát t r iển chỉ sử dụng 28%. v ề cây trồng thì rau quả sử dụng nhiều thuốc bảo vệ thực vật nhấ t khoảng 25%. V ớ i sự phát t r iển của CNSH việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật được thay t h ế một phần bằng những giống chuyển gen kháng sâu bệnh. N ă m 1997 đã có 4 t r iệu hecta các giống chuyển gen k h á n g sâu, 6,9 t r iệu hecta các giống chuyển gen k h á n g chấ t d iệ t cỏ đã được trồng thương m ạ i .

Những vấn đề môi trường do thuốc BVTV hoa học gây ra:

Theo thông b á o của U y ban K i n h t ế và X ã h ộ i L iên hợp quốc khu vực châu A , Thái Bình Dương cho b iế t m ỗ i n ă m trên toàn t h ế g iớ i có khoảng 400.000 - 2.000.000 ngườ i nông dân bị n h i ễ m độc và có khoảng 20.000- 40.000 n g ư ờ i đã bị chết bở i thuốc trừ sâu.

Thuốc sinh học, vi sinh BVTV và giải pháp môi trường:

Th ị t rường thuốc t rừ sâu bệnh sinh học Biopesticide ở châu  u n ă m 2000 vào khoảng 130,3 t r iệu Mark Đức, v ớ i mức t ăng b ình quân n ă m vào khoảng 15%.

Thuốc trừ sâu sinh học phổ b iến nhấ t h i ện nay là Bt. Các c h ế phẩm có nguồn gốc từ vi khuẩn Bt đã được đưa ra th ị t rường cách đây hơn 30 n ă m . H i ệ n t ạ i , có hơn 100 chế

phẩm thuốc trừ sâu Bt được lưu hành trên th ị t rường, hầu hết các c h ế phẩm này dựa vào các chủng phân lập trong tự nhiên.

Các chế phẩm Bí được chìa ra thành các loại

- C h ế phẩm thuốc trừ sâu Bt t ruyền thống, được sử dụng rộng rãi nhấ t là H D 1 , thuộc loài Bí kurstaki có phổ t rừ sâu rộng trên cây cảnh, cây rau, cây trồng cạn và cây rừng. Chủng H D Ì tạo ra 4 loạ i protein độc t ố đ ố i v ớ i sâu Cry là Cry lA(a) , Cry lA(b ) , CryIA(c) , và C r y l I A .

- M ộ t trong số các sản phẩm có nguồn gốc từ Bí kurstaki có tên là Javelin chứa protein Cry l , C r y l l có hoạt t ính chống các loài côn t rùng Sprodoptera.

- C h ế phẩm c ó nguồn gốc từ Bí morrisoni chứa các protein C r y l I I A gây độc đ ố i v ớ i côn t rùng bộ Coleoptera.

- Các protein C r y l V A , C r y l V B , C r y l V D và CryA có k h ả n ăng g iết m u ỗ i có nguồn gốc từ Bí israelensis.

Các kỹ thuật CNSH tạo chế phẩm BVTV mới và tạo giống mới mang gen độc tố của Bí

- Các chủng Bt chọn lọc theo phương pháp t ruyền thống.

191

- Các chủng Bt tái tổ hợp, trong đ ó các plasmid mang c á c gen độc t ố Cry k h á c nhau từ 2 hoặc nh iều chủng Bt khác nhau được đưa vào trong m ộ t chủng, do vậy thuốc Bt l o ạ i này có phổ d iệ t côn t rùng rộng hơn .

- V i khuẩn tái tổ hợp: Các gen độc t ố khác nhau của Bt được chuyển v à o m ộ t chủng v i khuẩn k h á c , ví dụ v i khuẩn phát quang (Pseudomonasýĩuorescent) n h ằ m tạo ra chủng có phổ B V T V rộng.

- Các cây chuyển gen ( G M O ) mang gen k h á n g sâu của Bt.

V í dụ sử dụng Bacillus thuringiensis t rên các cây rau ở ú c

Rau mang l ạ i giá trị khoảng 1,5 t ỷ đ ô la hàng n ă m ở ú c cho khoảng 10.000 n g ư ờ i trồng rau trên d i ện tích trên 100.000 ha.

Thuốc trừ sâu Bt chỉ ch i ếm 1% th ị t rường thuốc trừ sâu sử dụng trong nghề làm

vườn n ă m 1990, trong đ ó chỉ c ó 25 % sử dụng cho rau. T h ị t rường thuốc Bt ở ú c d ự k i ế n

khoảng 54 tấn , nhưng trong n ă m 1992 th ị t rường m ó i ch ỉ đạ t t rên 5 t ấ n

Các côn t rùng quan trọng gây hạ i cho khoai tây, cà chua, đ ậ u , n g ô ngọt , v.v được ngh iên cứu (Bảng 10.3). Các c h ế phẩm thuốc trừ sâu Bt được sử dụng ở úc c á c h đây khoảng 20 n ă m , nhưng sử dụng ở các cây rau còn rấ t ít. Ch ỉ trong vài n ă m gần đ â y thuốc trừ sâu Bt m ớ i được sử dụng nh iều hơn .

Hai loài sâu quan t rọng gây hạ i rau là Helicoverpa armigera và Plutella xylostella rấ t k h ó k i ể m tra bằng thuốc trừ sâu hoa học. N ế u sử dụng nh iều thuốc t rừ sâu hoa học có phổ rộng sẽ tạo ra ô n h i ễ m m ô i t rường. V ì l ẽ đ ó n g ư ờ i t rồng rau m u ố n sử dụng c á c thuốc trừ sâu Bt k h ô n g gây hạ i cho m ô i t rường, rẻ t i ền , n h ư n g l ạ i cho h i ệ u quả tác dụng cao.

Bảng 10.4. Các côn trùng gây hại chính ở các cây rau quan trọng

Cây trồng Côn trùng

Cây trồng Tên khoa học Tên chung

Khoai tây Phthorimaea operculella (Zeller), Macrosiphum euphosiphum euphorbiae (Thomas), Myzus persiae (Sulser), Tetraanychus sọ.

Nhậy khoai tây, rệp khoai tây, rệp xanh, nhện.

Cà chua Helicoverpa.sp, Aculops lycopersici (Masse), Thrips tabaci Lindeman, Phthorimaea operculella (Zeller)

Budvvorm, nhện đỏ, châu chấu, nhậy khoai tây.

Cây cải Plutella xylostella (Linnaeus), Artogeia rapae (Linnaeus), Brevicoryne brassiae (Linnaeus), Myzus persicaệ (Sulxer), Crocidolomia binotalis Zeller, Hellula hydralis Guenee.

Sâu tơ, Bướm trắng bắp cài, rệp bắp cải, rệp xanh, bướm, ấu trùng hại lõi bắp cải.

Đậu Tetranychus urticae Koch, Tetranychus ludeni Zacher, Helicoverpa spp., Chrysodeixis spp., Maruca testularis (Geyer)

Nhện, sâu đục thân đậu.

Ể ẵ j bí Aphid gossypii Glover, Dacus cucumis French, Aulacophora spp., Tetranychus spp., Epilachna cucurbitae Richards.

Rệp bông, ruồi đục quả bầu bí, bọ cánh cứng hại bí đỏ, rệp, bọ rùa.

Ngô ngọt Helicoverpa armigera (Hubner), Mythimna spp. Com earvvorn, armyworm

192

10.2.4. C ô n g n g h ệ p h â n h ữ u cơ ví s inh v à s inh học p h ụ c v ụ t r ồ n g t r ọ t

Ảnh hưởng của phân bón hoa học và vấn đề sức khoe và môi trường sinh thái:

Theo ước tính khoảng 50% lượng phân đ ạ m , 40-75% lượng phân kal i và 5-25% lượng phân lân bón cho đấ t nông nghiệp c ò n t ồ n t ạ i t rên bề mặ t đ ấ t hoặc tầng nước ngầm. V i ệ c sử dụng lâu dài phân hoa học c ó thể l à m g i ả m đ ộ m à u m ỡ của đấ t , suy g iảm hàm lượng chấ t hữu cơ trong đấ t , l àm cho cấu t rúc đ ấ t bị kế t chặt d ẫ n đ ế n làm g iảm sự hoạt động của bộ rễ , g iảm khả năng hút đ ạ m của cây .

K i m loạ i nặng, nhất là Cadimi và một số k i m l o ạ i độc k h á c c ó trong phân hoa học có thể được tích lũy trong đ ấ t và trong cây t rồng v ớ i số lượng l ớ n nguy h i ể m . Những nghiên cứu gần đây đã ch ỉ ra rằng phân b ó n tổng hợp và ô n h i ễ m k h ô n g kh í cổng nghiệp là hai nguồn tạo ra cadimi quan trọng nhấ t t rên các v ù n g đ ấ t canh tác .

Phân hoa học c ò n l àm t ăng h à m lượng nước trong n ô n g sản phẩm. Đ ộ ẩm trong sản phẩm cao gây k h ó k h ă n trong bảo quản, quả d ễ bị b i ến dạng. Ha i ngh iên cứu gần đây của V i ệ n nghiên cứu phát t r iển (Trường Đ ạ i học Sussex) và Chương t r ình môi trường Liên hợp quốc khẳng đ ịnh: sự t h ố i , sự hư hỏng của n ô n g sản phẩm trong quá trình bảo quản phần lớn do h à m lượng nước quá cao.

0 nh iễm đ ạ m cũng c ó thể đ e doa đ ế n sức khoe con n g ư ờ i . K h i con n g ư ờ i ăn những sản phẩm chứa nitrat, nitrat sẽ kế t hợp v ớ i các amin đ ể tạo ra nitrosamin, đây là chất đã được k i ể m ư a và chứng minh là hợp chấ t c ó xianua gây ung t hư (carcinogenic).

M ộ t nghiên cứu ở ú c cho thấy; những đứa trẻ được sinh ra từ những n g ư ờ i m ẹ uống nước có chứa 5 - 1 5 mg/1 nitrat có khả nâng bị khuyết tật cao gấp 3 l ầ n so v ớ i những đứa trẻ được sinh ra từ n g ư ờ i m ẹ uống nước có chứa ít nitrat. V i ệ c sử dụng nitrogen h à m lượng cao cũng liên quan đ ế n nhiều bệnh như ung thư bộ m á y t iêu hoa.

Khái niệm về phân bón sinh học, phân hữu cơ vi sinh:

Các loạ i c h ế phẩm sinh học c ó khả n ăng cung cấp dinh dưỡng cho sinh t rưởng và phát t r iển của cây t rồng, l àm t ăng đ ộ phì của đ ấ t c ó nguồn gốc là c ơ thể sống (vi sinh, tảo...) hoặc từ sinh k h ố i (phân hữu cơ ủ. . . ) có thể được g ọ i là p h â n b ó n sinh học. Phân bón sinh học có chứa các chủng v i sinh vật hoặc tập hợp v i sinh hữu ích được g ọ i là phân hữu cơ v i sinh.

Các sản phẩm n ô n g nghiệp được sản xuấ t dựa t rên sử dụng phân bón sinh học và thuốc bảo vệ vật nuô i - cây trồng sinh học, k h ô n g d ù n g các chấ t hoa học' tổng hợp được gọi là sản phẩm n ô n g nghiệp hữu cơ.

Trong những n ă m gần đây , các l o ạ i phân bón sinh học, v i sinh vật đ ang được nghiên cứu và sử dụng t rên t h ế g iớ i :

- Phân v i sinh vật cố đ ịnh n i tơ (v i khuẩn và tảo lam cố đ ịnh đ ạ m ) ;

- Phân v i sinh vật phân g i ả i lân;

- C h ế phẩm n ấ m rễ (Micorhiza, Endomicorhiza...);

- P h â n hữu c ơ ủ hoặc lên men theo các phương thức khác nhau.

193

Tuy theo đ iều k i ệ n tự nh iên và canh tác , p h â n b ó n v i sinh vậ t c ó t h ể bao g ồ m từ m ộ t đ ế n nhiều chủng, thậm ch í h à n g t râm chủng tạo ra hệ sinh thái v i sinh vậ t hữu ích cho cây t rồng và đấ t canh tác

Tiềm năng phát triển công nghiệp phân bón hữu cơ vi sinh:

Nguồn cơ chấ t quan trọng nhấ t cho công nghiệp phân b ó n v i sinh hữu c ơ bao g ồ m :

Rác thải

H à n g ngày các thành phố l ớ n của V i ệ t Nam thả i ra khoảng 9.100 m 3 r ác . Trong k h i mức đ ộ đ ô th ị hoa và mức sống của nhân d â n ngày càng cao, lượng rác t h ả i c à n g lớn , lượng rác hàng n ă m ở thành phố H ồ Chí M i n h t ăng trung b ình khoảng 20%, trong k h i đ ó lượng rác ở các thành phố l ớ n trên t h ế g iớ i t ăng trung b ình d ư ớ i 7%.

Phế thả i đ ô th ị ở nước ta giàu hữu cơ (55-60%), p h ế thả i phi hữu c ơ ( k i m l o ạ i , thúy t inh, rác xây dựng...) ch i ếm khoảng 12-15%. Cơ cấu thành phần cơ học t r ên đ â y của phế

thả i đ ô th ị V i ệ t Nam thay đ ổ i theo vùng , thờ i gian, mức sống của cộng đ ồ n g . Ở c á c nước phát t r iển, do t r ình đ ộ cao của công nghiệp c h ế b iến nên t ỷ l ệ hữu cơ trong rác t hả i sinh hoạt thường ch ỉ ch i ếm 35-40%.

T h à n h phần hóa học của rác thả i sinh hoạt chủ y ế u là c , H , o , N , s v à các chấ t tro. Đặc đ i ể m chung của p h ế thả i hữu c ơ là t ỷ l ệ xenluloza và l i g n i n cao, t h ô n g thường ch iếm 40-50%, có nhiều t rường hợp đ ế n 70-80%.

Phế thải nông nghiệp:

V i ệ t Nam là một nước n ô n g nghiệp v ớ i 80% d â n số sống bằng nghề n ô n g do vậy phế thải nông nghiệp sau thu hoạch là rấ t l ớ n và rấ t th ích hợp cho v iệc l à m p h â n ủ. Phế

thải nông nghiệp bao g ồ m rơm rạ, lá cây , cây và vỏ lạc đ ậ u đ ỗ , v ỏ t rấu , lõi thân n g ô , xơ dừa, vỏ quả cà phê. . .

Phế thải công nghiệp:

- Phế l i ệ u đ ồ hộp rau quả (như vỏ , lõi dứa, vỏ chuối , xoà i , cam quý t , dừa...), bã sắn, khoai...

- Phế l i ệ u công nghiệp mía đường, c h ế b iến cà phê , c h ế b i ến g ỗ (rễ c ây , m ù n cưa, g ỗ vụn).. .

Đặc biệt h iện nay nước ta rấ t g iàu p h ế thả i c ô n g nghiệp đường (bã m í a , rỉ đường , cà phê (vỏ quả) và m ù n cưa, g ỗ vụn.

Các nguồn than mùn và phân xanh phong phú:

Căn cứ vào nguồn cơ chấ t phong phú nêu trên nước ta có thể phá t t r iển c ô n g nghiệp chế biến phân hữu cơ v i sinh ở các quy m ô khác nhau và ở các vùng l à n h t ế k h á c nhau

trong nước.

10.2.5. CNSH và nền nông nghiệp hữu cơ

K ế t quả của việc phát t r iển tổng hợp 3 hướng CNSH là giống k h á n g sâu bệnh, p h â n bón sinh học và thuốc trừ sâu bệnh sinh học Ương sản xuấ t n ô n g nghiệp sẽ d ẩ n đ ế n nền

194

sản xuấ t nông nghiệp hữu cơ, g iảm t ố i đa việc sử dụng phân b ó n và thuốc trừ sâu bệnh

hoa học.

H i ệ n nay trên t h ế g iớ i , nhu cầu tiêu thụ sản phẩm n ô n g nghiệp hữu cơ ngày càng tăng. Mặc dù giá các sản phẩm này rấ t cao. T iêu thụ c ác sản phẩm nông nghệp hữu cơ ở M ỹ từ n ă m 1990 tâng khoảng 20% m ỗ i n ă m và đạ t mức 3,3 t ỷ USD trong n ă m 1996.

Các sản phẩm sữa hữu cơ tăng trên 100% n ă m .

Ở V i ệ t nam, nhu cầu sử dụng rau quả sạch ở nước ta cũng đ ang tăng nhanh. H i ệ n nay rau trên thị trường rấ t rẻ nhưng n g ư ờ i t iêu d ù n g ở các thành phố lớn hầu như bị đói rau khá ngh iêm trọng vì sợ k h ô n g d á m ăn rau xanh.

Nhiều nước đã tổ chức chương t r ình n ô n g nghiệp hữu cơ. H i ệ p h ộ i quốc t ế về hoạt động nông nghiệp hữu cơ ( I F O A M ) đã được thành lập . H i ệ p h ộ i này cấp chứng chỉ quốc t ế cho những sản phẩm hữu cơ, h i ện nay c ó hơn 80 tổ chức thành viên ở hơn 30 nước. M ộ t trong các H ộ i viên của I F O A M là Cal i íornia Cer t i í ied Organic Farmers (CCOF), có trụ sở t ạ i California - mộ t trong những vùng n ô n g nghiệp ch ính của t h ế g i ớ i . Sản xuấ t sản phẩm nông nghiệp hữu cơ ở Cal i íornia trong v ò n g 5 n ă m qua đã t ăng khoảng 25% m ỗ i năm, trong kh i tổng số d i ện t ích được cấp chứng chỉ là sản xuấ t sản phẩm hữu cơ ở Caliíòrnia tăng gấp đôi trong khoảng 2 n ă m 1988-1990. T rào lưu m ớ i sử dụng các chất hữu cơ để trồng rau ở úc đ ang phát t r iển mạnh. Trong n ă m 1990 c ó tớ i 189 các công ty sản xuấ t 'Rau hữu cơ" . Cả i bắp, cà rố t , rau d iếp, hành , cà chua, cả i tía... được trồng bằng phân bón sinh học và sử dụng c h ế phẩm Bt để k i ể m tra côn t rùng gây hạ i . Sản phẩm nông nghiệp hữu cơ chẳng những k h ô n g mang các d ư lượng hoa chấ t độc nguy hạ i mà còn có giá trị dinh dưỡng cao.

Đ ố i vớ i nước ta, m ộ t nước đấ t hẹp n g ư ờ i đ ô n g , giá lao động rẻ , có t ruyền thống dùng phân hữu cơ, việc sản xuấ t rau quả hữu cơ (không d ù n g hoặc rấ t hạn c h ế dùng

phân bón và thuốc sâu bệnh hoa học) xuấ t khẩu là mộ t g i ả i p h á p k inh t ế quan trọng và khả thi nhất để n âng cao thu nhập của n ô n g dân , đặc b iệ t ở vùng đổng bằng sông Hồng.

10.3. MỘT SỐ VẤN ĐỂ ĐẶT RA Đối VỚI NGÀNH TRỔNG TRỌT VÀ VAI TRÒ

C Ủ A C Ô N G N G H Ệ S I N H H Ọ C ở N Ư Ớ C T A

H i ệ n nay nước ta có khoảng 8,0 t r i ệu heca đ ấ t sản xuấ t n ô n g nghiệp, trong đ ó gần 6,8 t r iệu heca là đấ t t rồng lúa. D i ệ n t ích nông nghiệp t ính b ình quân đầu n g ư ờ i h iện t ạ i chỉ đạt 0,1 ha và đ a n g có huống g i ảm dần do tăng dân số và mấ t đ ấ t xây dựng. T h ê m vào đó đấ t đai có hướng n g h è o k i ệ t đi và dần trở nên chua, t ình h ình sâu bệnh và thờ i t iế t

có nhiều b iểu h i ện phức tạp. Trong b ố i cảnh đó , việc nâng cao thu nhập của n g ư ờ i nông dân trên một đơn v ị canh tác là rấ t quan trọng.

10.3.1. Những thách thức lớn ở các vùng sản xuất nông nghiệp nước ta và một số

g i ả i p h á p c ô n g n g h ệ

Những thành tựu và t h ế mạnh của nền nông nghiệp nước ta là rấ t lớn , nhưng k h ó khăn k h ô n g phải là ít (Bảng 10.5).

195

Bảng 10.5. Vấn đề nông nghiệp và giải pháp công nghệ

vấn đề nông nghiệp Giải pháp công nghệ sinh học

1. Vùng đồng bằng sông Hồng: Đất hẹp người đông, bình quân diện tích đấưngười thấp, thu nhập/người thấp, tỳ lệ thất nghiệp cao, trình độ văn hoa nói chung tương đối cao so vối cả nước, giao thông thuận lợi

Áp dụng nông nghiệp công nghệ cao:

- Giống rau hoa quả cao cấp; - F1 hoa toàn bộ giống rau, quả ngắn ngày và ngô, lúa; - Kỹ thuật nông nghiệp hữu cơ (dùng phân bón hữu cờ, không dùng hoặc hạn chế sử dụng thuốc hoa học); - Xuất khẩu rau cao cấp. Thu về phải đạt 4,0 tỷ USD/năm trong tương lai (đến 2015).

2. Vùng núi, Tây nguyên, Đông Nam bộ: - Đất rộng, độ phì của đất khá, người thưa. - Thiếu giống tốt, thiếu công nghệ và vốn sản xuất

- Tuyển chọn và sản xuất cây giống quy mô lớn bằng công nghệ tế bào đối với các cây công nghiệp như cà phê, mía, sắn; - Mỏ rộng sản xuất quy mô trang trại lớn phải kết hợp với phòng trừ dịch bệnh như bệnh nấm, bệnh tuyến trùng, bệnh virus ỏ các cây công nghiệp như cà phê, tiêu, mía,... - Sản xuất phân bón sinh học từ phế thải nông nghiệp và công nghiệp chế biến xuất khẩu; - Chống thoái hoa và rửa trôi đất trồng trọt.

3. Vùng lúa đồng bằng sông cửu long, đổng bằng sông Hổng

- Thiếu giống chất lượng

- Sử dụng quá nhiều phân đạm, thuốc trừ sâu

- Độc canh lúa và ít luân canh, côn trùng và bệnh dịch nhiều, nhất là bệnh virus lúa

- Giống lúa chất lượng cao xuất khẩu; - Giống chống chịu sâu bệnh, chất lượng ngon, đòi hỏi thâm canh thấp và thuốc hoa học ít hơn; - Phá thế độc canh cây lúa.

4. Miền Trung và ven biển duyên hải

- Đất đai canh tác kém màu mỡ.

- Thiếu giống và cơ cấu giống phù hợp.

- Tăng độ phì đất bằng các biện pháp sinh học; - Bộ giống phù hợp, nhất là cây công nghiệp và ăn quả và hệ thống nhân giống

10.3.2. C N S H t r ồ n g t r ọ t t h a m gia v à o m ộ t số c h ư ơ n g t r ì n h k i n h t ế x ã h ộ i l ớ n

T ó m l ạ i , CNSH phục vụ t rồng t rọ t là m ộ t tổng hoa của nh iều n g à n h khoa học - công nghệ. Sự phát t r iển đồng bộ các n g à n h khoa học c ô n g nghệ c ó l iên quan và v iệc quy hoạch các khu công nghiệp l iên hoàn t rồng trọt , c h ế b iến , bảo quản, xuấ t k h ẩ u là rấ t cần thiết . N h à nước cần phải tỏ rõ vai t rò quy hoạch, tổ chức, đ ịnh hướng , x â y dựng k ế

hoạch phát t r iển tổng thể , phá t t r iển vùng , vùng th ị t rường, c ó ch ính sách k h u y ế n k h í c h

ưu tiên công nghệ m ớ i , công nghệ sạch, bảo h i ể m r ủ i ro... đ ể k ê u g ọ i đ ầ u tư v ố n , k ỹ thuật của m ọ i tầng lớp xã h ộ i trong nước và các tổ chức nước ngoà i . Trước m ắ t cần quy hoạch phát t r iển các V i ệ n và p h ò n g thí nghiệm đầu m ố i của n g à n h này và quy hoạch khu Công nghiệp CNSH trồng t rọt , đồng thờ i t r iển khai một số các d ự án cụ t h ể đ ể rút kinh nghiệm.

196

Tên chương trinh Nội dung và mục tiêu ứng dụng CNSH Công nghệ áp dụng

1. Chương trình xuảt khẩu lúa gạo

Xuất khẩu 4-5 triệu tấn gạo/năm. Nâng giá xuất khau 1 tấn gạo lên trên 300USD/tấn đen 500USD/tấn bằng giống chất lượng cao. Giảm giá thành sản xuất bằng biện pháp giống

CNSH tạo giống

2. Chương trinh phát triển điển trang, sản xuất chế biến xuất khẩu quy mô lớn

Giống cây ăn quả sạch bệnh, cây công nghiệp và cây đặc sản khác và hình thành các vùng quy mô lớn (từ 4.000 - vài chục ngàn hecta)

- Công nghệ tế bào nhân giống sạch bệnh - Phân bón, thuốc trừ sâu sinh học - Công nghệ chế biến và

bảo quản.

3. Chương trình mía đường - Nhân nhanh giống mía mới bằng nuôi cấy mô. Thực hiện sau 5 năm thay thế giống mới cao sản trên toàn bộ diện tích trồng mía.

-Công nghệ tế bào nhân giống nhanh. - Công nghệ vi sinh chế

biến phụ phẩm mía đường

4. Chương trình trổng rừng - Nhân hàng chục triệu cây giống lâm nghiệp và ăn quả thân gỗ chất lượng cao (Keo lai, bạch đàn, tre trúc, tếch,...cây dược liệu) - Phân bón vi sinh và Endomicorrhiza

- Công nghệ tế bào nhân giống ưu việt. - Công nghệ vi sinh đất.

5. Chương trình rau, hoa, quả xuất khẩu và nông nghiệp hữu cơ.

- Nhân giống rau, hoa, quả cao cấp - Phân bón và thuốc phòng trừ sâu bệnh vi sinh - Kiểm tra chất lượng (vi trùng và ký sinh trùng, dinh dưỡng)

- Công nghệ sản xuất hạt lai - Công nghệ phân bón, thuốc sâu sinh học, chẩn đoán bệnh và ký sinh trùng

6. Chương trình xoa đói, giảm nghèo ở các xã nghèo miền núi

- Nhân giống hàng loạt cung úng cho dào. - Bảo đảm người nghèo cũng có giống và kỹ thuật tốt.

Công nghệ vườn ươm nhân giống

197

Chương l i

C Ô N G N G H Ệ S I N H H Ọ C V A V Ấ N Đ Ể M Ồ I T R Ư Ờ N G

S I N H T H Á I V À N Ă N G L Ư Ợ N G

11.1. Ô NHIỄM HOA HỌC MÔI TRƯỜNG SỐNG VÀ BỆNH LÝ

H ơ n 100.000 các hợp chấ t hoa học được sản xuấ t h àng n ă m t rên t h ế g i ớ i .

Trong " Báo c á o về các chấ t gây ung thư " của " V i ệ n Quốc gia v ề c á c khoa học môi t rường sức khoe" n ă m 2004 (National Institute o f Environmental Health Sciences, M ỹ ) , Ợĩttp:llwww.medicinenet.comlscriptlmainlart.asp?articlekey=13276&page=2) ngườ i

ta đã thống kê được 246 tác n h â n gây ung thư k h á c nhau. Số lượng c á c chấ t hoa học thải vào môi t rường và các virus gây ung thư c ó xu hướng n g à y c à n g t ăng . N ă m 1978, Báo cáo của Chủ tịch h ộ i đồng Chấ t lượng m ô i t rường ở M ỹ cho b iế t hầu hế t c á c n h à khoa

học nhất trí rằng 70 - 90% tấ t cả các t rường hợp ung thư được gây ra b ở i c á c y ế u t ố môi trường và về lý thuyết là c ó t hể ngăn chặn. Tuy vậy , ô n h i ễ m hoa học ở M ỹ k h ô n g hề

giảm m à còn được coi là n g u y ê n n h â n gây ra "dịch bệnh ung thư", g â y tai hoa cho khoảng 3/4 gia đ ình ở nước này . T ỷ l ệ n g ư ờ i bị mắc bệnh ung t hư n ă m 1900 ở M ỹ mớ i vào khoảng 3%. Đ ế n nay, khoảng 1/3 n g ư ờ i d â n M ỹ bị mắc ung thư, l à m chết khoảng 520.000 n g ư ờ i m ỗ i n ă m .

Trong số các chấ t gây ung thư phải k ể đ ế n các hoa chấ t bảo v ệ thực vậ t . H i ệ n có khoảng 400 loạ i thuốc hoa học B V T V , trong số đ ó c ó đ ế n vài t r ăm chấ t được xem là tác nhân gây ung thư. Theo EPA (Environment Protection Agency, M ỹ ) khoảng 1/3 các chất hoạt t ính trong thuốc B V T V là độc hạ i và 1/4 trong số đ ó là tác n h â n gây ung thư. Nh iều

tác nhân gây ung thư được lưu trữ trong cơ thể n g ư ờ i , ở trong c á c m ô và t ế b à o , nhấ t là t ế

bào m ô mỡ . K h i lượng các chấ t này được t ích l ũ y đ ế n mức nhấ t đ ịnh và ở t rong khoảng thờ i gian nhấ t đ ịnh, c h ú n g sẽ gây ung thư. M ộ t số hoa chấ t k h á c k h ô n g thuộc l o ạ i gây ung thư, nhưng l ạ i l àm t ăng hoạt hoa của tác n h â n gây ung thư.

Một số các virus đã được liệt vào danh sách các tác nhân gây ung thư:

- Các virus v iêm gan B và c (Hepatitis B, Hepatitis C) gây bệnh ung t hư gan. Ngay ở nước M ỹ có khoảng Ì t r i ệu n g ư ờ i v i êm gan B. Virus v iêm gan c là thủ phạm g â y ung thư gan số một ở M ỹ v ớ i h àng t r i ệu n g ư ờ i n h i ễ m virus.

- M ộ t vài loạ i virus lây n h i ễ m đường sinh dục và m à n g nhầy thuộc n h ó m papillomaviruses (HPVs) (bệnh virus lây t ruyền qua đường sinh dục) gây bệnh ung thư cổ tử cung ở phụ nữ . Có khoảng 20 t r iệu phụ nữ n h i ễ m HPVs ở M ỹ và m ỗ i n ă m c ó t h ê m 5,5 t r iệu ngườ i m ớ i n h i ễ m .

- Các hợp chấ t chứa chì , các tia phóng xạ, kể cả tia X , mộ t số hợp chấ t c ó chứa trong thịt nướng hoặc rán ở nhiệt đ ộ cao, một số các chất nhuộm m à u v ả i , sơn , mực...

198

T ỷ l ệ đàn ông mắc bệnh ung thư cao hơn phụ nữ , ở M ỹ m ộ t phần hai số đàn ông và một phần ba số phụ n ữ bị mắc bệnh ung thư ở c ác đ ộ t u ổ i khác nhau.

11.2. Ô NHIỄM KHÔNG KHÍ

Thành phần chủ yếu của kh í quyển trái đ ấ t g ồ m ni tơ, oxy, hơi nước, C 0 2 , H 2 , Oy, N H 4 , các khí trơ. Lượng hơi nước thay đ ổ i theo thờ i t i ế t k h í hậu, từ 0,4% kh i mùa khô lạnh tớ i 4% thể tích vào mùa nóng ấm. Trong k h ô n g kh í của tầng đ ố i lưu thường có một lượng kh í S 0 2 và bụ i . Trong tầng b ình lưu đã xuấ t h i ện m ộ t quá tr ình phá huy tầng ozon, khí ozon có tác dụng ngăn các tia tử ngoại ch iếu xuống bề mặ t trái đấ t . H i ệ n nay, do hoạt động của con ngườ i , lớp kh í ozon c ó xu hướng mỏng dần, đe dọa tớ i sức khoe con ngườ i và sinh vật trên trái đấ t .

Nhiệt độ bề mặ t trái đấ t , được tạo nên do sự cân bằng giữa năng lượng mặ t t rờ i đến

bề mặt trái đấ t và năng lượng bức xạ ngược l ạ i , từ trái đấ t vào k h ô n g gian vũ trụ . Bức xạ từ trái đấ t d ễ dàng bị kh í quyển g i ữ l ạ i . Các tác n h â n gây ra sự hấp thụ bức xạ của khí quyển là khí C 0 2 , bụ i , hơi nước, kh í mêtan , kh í CFC... d ẫ n đ ế n sự gia tăng nhiệt độ của khí quyển trái đấ t . H i ệ n tượng này d i ễ n ra theo cơ c h ế tương tự như nhà k ính trồng cây và được gọ i là h iệu ứng nhà k ính .

Sự gia tăng tiêu thụ nh iên l i ệ u hoa thạch của loài n g ư ờ i đ ang l àm cho nồng độ khí C 0 2 của khí quyển tăng lên. Theo Bản b á o cáo l iên ch ính phủ về thay đ ổ i kh í hậu (IPCC) n ăm 2007, nồng đ ộ kh í C 0 2 trong kh í quyển n ă m 2005 là 379 ppm 3 so vớ i mức 280 ppm 3 của thờ i k ỳ trước k h i có nền c ô n g nghiệp. Bắ t đ ầ u từ cuộc cách mạng công nghiệp vào những n ă m 1850 con n g ư ờ i đã tiêu thụ năng lượng hoa thạch và thải ra lượng khí C 0 2 ngày một t ăng . Sự gia tăng này có thể đạt tớ i mức hơn 560 ppm vào những n ăm cuối t hế k ỷ X X I . Lượng kh í C 0 2 này đã đạt mức cao nhấ t trong 750.000 n ăm l ạ i đây. Cùng vớ i sự gia t ăng của kh í mê tan sự thay đ ổ i nồng đ ộ C 0 2 sẽ là n g u y ê n nhân gây ra sự gia tăng nhiệt đ ộ từ 1,4 - 5 ,6°c từ n ă m 1990 đ ế n 2100 (Theo tài l i ệ u của H ộ i nghị toàn cầu về biến đ ổ i kh í hậu, Bali , 3-14 tháng 12, 2007). H ộ i ngh ị toàn cầu về biến đ ổ i kh í hậu d i ễ n ra t ạ i Trung t âm h ộ i nghị Quốc t ế Bali của Indonesia v ớ i hơn 10.000 ngườ i tham dự bao g ồ m đ ạ i d i ện của 188 nước, các quan sát viên của ch ính phủ, các tổ chức phi chính phủ và các phương t i ện t ruyền t hông đ ạ i c h ú n g là mộ t khẳng đ ịnh rằng nhân loại đã thức tỉnh, rằng ô n h i ễ m do công nghiệp có thể d ẫ n đ ế n khủng khoảng toàn cầu, rằng tăng trưởng k inh t ế nóng ở mức 2 con số có thể l àm cho mộ t vài quốc gia giàu lên nhưng đồng thờ i n ó cũng m ở ra siêu l ộ d ẫ n nhân loạ i đ i đ ế n sự tự huy diệt nhanh hơn. Các thành quả của nền k inh t ế sẽ bị m ặ t trái này của phát t r iển công nghiệp tr iệt t iêu.

Sự gia tăng kh í C 0 2 và các kh í nhà k ính khác trong k h í quyển trái đấ t l àm nhiệt độ trái đấ t tăng. Theo t ính toán của các nhà khoa học, kh i nồng đ ộ C 0 2 trong kh í quyển tâng gấp đôi thì nhiệt đ ộ trái đấ t t ăng lên khoảng 3 ° c . D ự báo , nếu k h ô n g có b iện pháp khắc phục h iệu ứng nhà kính, nhiệt đ ộ trái đấ t sẽ tăng lên 1,5 - 4 , 5 ° c vào n ă m 2050. Va i trò gây nên h iệu ứng nhà k ính của các chấ t kh í được xếp theo thứ tự C 0 2 , CFC, C H 4 , 0 3 , N 0 2 . Hơi nước cũng là kh í nhà kính quan trọng nhấ t . Các hoạt động của con ngườ i , đốt các nhiên l i ệ u hoa thạch và phát quang những cánh rừng, đã tạo ra nồng độ kh í nhà kính

199

cao hơn mức m à thực vật và đ ạ i dương có thể hấp thụ . Sự n ó n g lên của trái đ ấ t l à m thay đ ổ i đ iều k i ệ n sống b ình thường của các sinh vật trên trái đấ t . M ộ t số loài sinh vậ t th ích nghi vớ i đ iều k i ệ n m ớ i sẽ thuận l ợ i phát t r iển. Trong k h i đ ó , nh iều loài sẽ bị thu hẹp về

diện tích hoặc bị tiêu diệ t . N h i ề u loạ i bệnh tật m ớ i đ ố i v ớ i con n g ư ờ i sẽ xuấ t h i ện , các loạ i dịch bệnh lan tràn, sức khoe của con n g ư ờ i bị suy g iảm. N ô n g nghiệp sẽ bị t àn phá do lụ t l ộ i , nước b iển dâng cao, do g iông bão và hạn hán .

11.3. TÁC ĐỘNG CỦA CÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC XANH

K h ả năng phân chia của t ế bào thực vật theo cấp số nhân cho p h é p con n g ư ờ i tạo ra rừng cây g ồ m hàng t r i ệu , thậm ch í hàng chục t r iệu bản copy từ m ộ t cây ưu v i ệ t ban đ ầ u trong một năm. T ế bào thực vật còn là nhà m á y năng lượng sạch có thể tạo ra c á c nguồn

năng lượng tái sinh có thể coi là vô tận từ ánh sáng mặ t t rờ i , đồng thờ i sản sinh ra dưỡng kh í là oxygen. Kha i thác những t i ề m năng trên đây của Công nghệ t ế bào thực vật , nhân loạ i có thể g iả i quyết được những vấn đề hóc búa nhấ t của thờ i đ ạ i c h ú n g ta.

11.3.1. Hai quá trình trái ngược nhau trên hành tinh, các vấn đề thời đại và tương

la i của t r á i đ ấ t

Trên trái đấ t đang xảy ra hai quá trình đ ố i lập nhau: c h á y và xanh hoa. Q u á tr ình cháy ở đây được hiểu là bất k ỳ h iện tượng phân g i ả i n à o của các hợp chấ t hữu cơ v ớ i sự tham gia của oxy ( 0 2 ) , g i ả i phóng ra năng lượng và kh í thả i cacbonic ( C 0 2 ) . Xanh hoa được h iểu là quá trình tích l ũy năng lượng mặ t t rờ i d ư ớ i dạng chấ t hữu cơ có sự tham gia của các sinh vật quang hợp, trong đ ó hấp thụ C 0 2 và tạo ra dưỡng k h í 0 2 .

a. Quá trình cháy: Trái đất của chúng ta đang cháy

Trái đấ t của chúng ta là hành t inh duy nhấ t được b iết đ ế n trong vũ trụ c ó sự sống và m à u xanh .Vì vậy, trái đ ấ t đã được g ọ i là "Hành t inh xanh". M à u xanh là b iểu tượng của:

- Q u á tr ình quang hợp và t ích l ũy năng lượng mặ t t r ờ i - nguồn n ăng lượng quan trọng nhấ t hành t inh

- Sự sống

- V ẻ đẹp d ịu dàng của thiên nh iên

- Hoa bình,

Nhưng nếu chúng ta quan sát trái đấ t từ tầm nhìn vệ t inh, c h ú n g ta sẽ thấy trái đấ t của chúng ta đang cháy .

Sự cháy là b iểu tượng của:

- Sự phân giã của các chấ t hữu cơ và tạo thán kh í

- Sự g iả i phóng các nguồn năng lượng đã tích lũy được

- Sự tích lũy than kh í và cạn nguồn năng lượng có thể d ẫ n đ ế n sự t iêu vong của loài ngườ i .

200

H i ệ n t ạ i quá t r ình cháy của các chấ t hữu cơ, chủ y ế u là than đá , dầu m ỏ , kh í đốt , tạo ra n ăng lượng cơ bản vận hành nền công nghiệp của trái đấ t và tạo ra thán kh í , trong đ ó

chủ y ế u là cacbonic ( C 0 2 ) :

Q u á tr ình cháy của các chấ t hữu cơ:

Các chất hữu cơ (Than đá , dầu m ỏ , kh í đố t , sinh k h ố i , q u á t r ình h ô hấp của sinh

giớ i . . . ) + 0 2 (Dưỡng khí) > C 0 2 (Thán khí) + H 2 0 + E (Năng lượng)

Quá trình cháy của chất hữu cơ sinh ra thán khí co2 xảy ra:

+ Trong hệ thống công nghiệp:

H à n g nghìn các khu công nghiệp khổng l ồ , t răm t r i ệu chiếc ô tộ , m á y bay, xe máy , các nhà m á y x i m ã n g , hàng vạn lò gạch, lò vôi , các nhà m á y nhiệt đ iện w . . .

Trái đấ t của c h ú n g ta đ ang bốc cháy , đang tự thiêu đốt , tạo ra thán k h í và độc tố . Theo BP Statistical Review of W o r l d Energy, d ự trữ dầu m ỏ t rên t h ế g i ớ i vào khoảng 1037,6 t ỷ t hùng , trong k h i t iêu thụ dầu n ă m 1997 đạt 71,67 t r i ệu thùng ngày . N ế u v ớ i tiêu thụ dầu n h ư t rên và mức t ăng sử dụng 2% n ă m thì dự trữ dầu m ỏ t h ế g i ớ i sẽ cạn k iệ t vào khoảng n ă m 2037, ngược l ạ i nếu lượng tiêu thụ dầu g i ảm đi 2% m ỗ i n ă m thì lượng dầu m ỏ t h ế g iớ i sẽ cạn k i ệ t sau 80 n ă m kể từ n ă m 1997. H i ệ n t ạ i 90% n ăng lượng tiêu dùng trên trái đ ấ t là các chấ t đố t (chủ yếu là than đá , dầu m ỏ , k h í đ ố t tự nhiên. . . ) . M ỗ i n ă m từ nh iên l i ệ u (than đá , dầu m ỏ , kh í đốt) tạo ra khoảng 25 tỷ tấn kh í cacbonic (năm 1995), lượng C 0 2 t rên đầu n g ư ờ i vào khoảng 4,7 t ấ n / n ă m . K h í đ ố t tạo ra vỏ bọc thán kh í C 0 2 l àm cho trái đ ấ t ngày càng nóng lên.

+ Trong quá t r ình h ô hấp của sinh g iớ i : t rên 6 tỷ n g ư ờ i , h àng t ỷ động vật nuô i và hoang dã , các v i sinh vật d ị dưỡng khác, . . .

C h ú n g ta c ó thể nó i rằng trái đ ấ t đã dấu trong lòng n ó tấ t cả những t i ề n đ ề n ă n g lượng cho sự sinh t ồ n và phá t t r iển văn minh n h â n l o ạ i . Đ ó là dầu m ỏ , k h í đố t , than đá , ... các khu rừng già bạt ngàn . . . m à ngồn gốc của các nguồn n ă n g lượng đ ó c h í n h là sản phẩm quang hợp t ích l ũ y được từ á n h sáng mặ t t rờ i qua h à n g t r ă m t r i ệ u n ă m l ịch sử phát t r iển của t rái đ ấ t . N h â n l o ạ i n g à y nay v ớ i hơn 6 t ỷ n g ư ờ i (thực chấ t con n g ư ờ i và t h ế g i ớ i động vật , m ộ t phần v i sinh vật là các nhà m á y t iêu thụ n ă n g lượng) và các phương t i ệ n do n ó tạo ra đ a n g t iêu huy nguồn n ă n g lượng đ ó ở mức k h ô n g thể tái sinh

k ịp, gây ra:

- Sự cạn nguồn n ă n g lượng

- T h á n kh í và H i ệ u ứng nhà k ính

- N h i ệ t đ ộ ngày mộ t nóng lên

- B i ế n động thờ i t i ế t

- V ấ n đề lương thực

N ế u lượng oxy trong m á u của chúng ta g iảm xuống mộ t chú t và lượng C 0 2 chỉ t ăng lên mộ t chút thôi c h ú n g ta sẽ cảm thấy ngạt thở; đã phải n g á p dài và cơ thể c ảm thấy

201

mệt m ỏ i . C h ú n g ta hãy tưởng tượng đến một ngày nào đ ó n h â n l oạ i h à n g t ỷ n g ư ờ i sẽ

phải ngẩng mặ t lên t rờ i để đớp dưỡng khí . N h â n loạ i có thể sẽ phải đ ố i đ ầ u v ớ i m ộ t cuộc chiến tranh sinh thái trong tương lai , trong đ ó hàng t r i ệu n g ư ờ i sẽ phả i tranh g i ành nhau

những mảnh đấ t cằn c ỗ i và những nguồn nước ngọt ít ỏi.

Do vậy, quá trình "cháy" tạo thán kh í của guồng m á y c ô n g nghiệp đồng nghĩa v ớ i

"chết", "tiêu huy", những "thảm hoa xã h ộ i " .

b. Quá trình quang hợp

Q u á trình ngược l ạ i v ớ i đ á m cháy l ớ n đó , ngược l ạ i v ớ i q u á t r ình tự th iêu huy đ ó của

nền công nghiệp trái đấ t là quá tr ình quang hợp. Quang hợp là q u á t r ình chuyển hoa

năng lượng của mặ t t rờ i đ ể nuôi dưỡng trái đấ t :

H 2 0 + C 0 2 X , L ụ c l ạ p - > C 6 H , A + 0 2 (Dưỡng khí) 1 1 Ánh sáng mặt ười " Ú t , i\ to /

Quang hợp tạo ra:

+ Khoảng 170 tỷ tấn các chấ t hữu cơ/1 n ă m ,

+ Lương thực: nuôi dưỡng trên 6 t ỷ n g ư ờ i , hàng chục t ỷ con vật nuô i t rên trái đấ t .

+ Dưỡng khí : T ừ thán k h í C O z và nước, d ư ớ i ánh sáng mặ t t rờ i tạo ra các chấ t hữu

cơ và dưỡng kh í ( 0 2 ) .

Do vậy quang hợp là quá tr ình "Xanh hoa", "Tái s inh" , " Phục h ồ i "

Biện chứng phát t r iển đ ố i lập của hai q u á tr ình "Cháy" và "Xanh hoa" sẽ quyết đ ịnh

tương lai của trái đấ t .

11.3.2. Vai trò của CNSH xanh hay khả năng của con người tác động vào thảm

xanh thực v ậ t n h ư t h ế n à o ?

T ế bào của phiến lá là nhà m á y năng lượng mặ t t rờ i , chuyển hoa n ă n g lượng ánh

sáng thành năng lượng hoa học và tạo ra dưỡng khí . Đ â y là q u á t r ình xây dựng và phục

h ồ i các năng lượng sống của trái đấ t .

Bộ máy quang hợp và sản phẩm:

M ộ t phiến lá chứa vài chục ngàn t ế bào . M ộ t t ế bào c ó 40 - 5 0 lục lạp , t i ế t d i ệ n cắ t

ngang của lục lạp bằng 4 um (bốn phần ngàn của mm) , Ì lục lạp chứa h à n g t r i ệu p h â n tử

d iệp lục. Phân tử d iệp lục hấp thụ năng lượng mặ t t rờ i , g i ả i p h ó n g ra các đ i ệ n tử tự do và

từ đ ó tạo ra hàng t r iệu các d ò n g đ iện l i t i trong lục lạp. Dựa t rên nguồn n ă n g lượng đ ó

xảy ra các phản ứng quang hợp. Phản ứng quang hợp xảy ra ở t ế b à o ph iến lá của thực

vật đã được tóm tắt bằng công thức hoa học: 6 C 0 2 + 6 H 2 0 = C 6 H 1 2 0 6 , trong Ì phản

ứng quang hợp hoàn chỉnh, cây xanh:

- H ấ p thụ 6 phân tử C 0 2 > G i ả m h iệu ứng n h à k ính

202

- Cung cấp 6 phân tử 0 2 > Tăng dưỡng kh í

- Tạo ra Ì phân tử đường > Nguồn năng lượng hoa học, nâng lượng tái sinh của

trái đấ t .

T ấ t cả than đá , dầu lửa, kh í đốt , m ù a m à n g và sinh k h ố i t rên trái đ ấ t đ ề u là kế t quả của quang hợp trong quá k h ứ và h iện t ạ i .

Các giống cây trồng năng suất cao có thể hấp thu 70 tấn C 0 2 / 1 ha.

a. Các phương pháp công nghệ sinh học ứng dụng và cải biến quá trình quang hợp

C ô n g nghệ sinh học thực vật được g ọ i là công nghệ sinh học xanh, c ô n g nghệ này có thể tạo ra giống cây trổng m ớ i và nhân bản thực vật quy m ô công nghiệp nhằm tâng cường thảm xanh thực vật trên trái đấ t . D ư ớ i đây là những vai t rò cơ bản của các công nghệ này:

+ Tạo các nguồn năng lượng sạch

- Sản xuấ t chấ t đ ố t sạch từ c ác sản p h ẩ m quang hợp: Brasil đã phá t t r iển mộ t chương t r ình đ ồ sộ sản xuấ t c ồ n từ m í a và sắn t h ô n g qua c ô n g nghiệp v i sinh. Cồn được sử dụng chạy m á y thay x ă n g v ớ i g iá t h à n h hạ , k h ô n g gây ô n h i ễ m m ô i t rường, g ọ i là n ăng lượng sạch.

- Ngh iên cứu ứng dụng quang phân ly nước:

D i ệ p lục d ư ớ i á n h sáng mặ t t rờ i c ó thể phân ly nước thành các ô x y và hydro nguyên tử H 2 0 = 2 H + + o

Oxy và hydro có k h ả n â n g tái hợp tạo ra nước và nguồn n ăng lượng l ớ n và sạch.

2 H + + O" = E + H 2 0

Tuy nh iên nguồn n ă n g lượng này h i ện nay v ẫ n chưa khai thác được. N g h i ê n cứu m ô phỏng hệ thống quang phân ly nước ở lục lạp có thể tạo ra nguồn n ăng lượng m ớ i , sạch, vô tận chăng?

+ Cải tạo giống cây tăng hiệu suất quang hợp:

Cây xanh có k h ả nâng rấ t khác nhau trong hấp thụ n ăng lượng mặ t t rờ i , cây hoang dại ch ỉ hấp thụ được khoảng 0,2%, cây n g ô 1 - 2 % n ăng lượng mặ t t rờ i . Các giống n g ô m ớ i có thể tạo ra n ă n g suất 25 tấn/ha, cây mía là cây có khả n ăng quang hợp đ áng ngạc nhiên, c ó thể tạo ra n â n g suất t rên 300 tấn/ha, tương đương v ớ i khoảng 30 tấn đường/ha, có thể hấp thu được đ ế n 8% nâng lượng ánh sáng của mặ t t rờ i . N ế u ta sẽ đố t cháy 25 tấn ngô , hoặc 30 t ấ n đường thì ta sẽ có thể h ình dung được nguồn n ăng lượng mặ t t rờ i và lượng kh í C 0 2 đã được tích l ũy như t h ế nào trên Ì ha đ ấ t canh tác .

Căn cứ vào những khác biệt trong quá tr ình quang hợp, n g ư ờ i ta chia cây trồng thành 2 n h ó m , n h ó m cây C 4 và N h ó m C 3 : Q u á tr ình hô hấp sáng ở cây Q làm g iảm h iệu suất quang hợp t ớ i 40%. Các thực vật C 4 mang nhiều đặc t ính n ô n g học quan trọng: h iệu quả quang hợp cao, sinh t rưởng nhaiịh... M í a và n g ô là hai cây C 4 đ iển h ình .

203

Cây C 3 ,C 4 và năng suất cây trồng:

N ă n g suất cây C3 N ă n g suất c ây Q

Lúa: 17 tấn/ha N g ô : 25.tấn/ha

Lạc: 7 tấn/ha M í a : 300 tấn/ha

+ cải biên cây trồng bằng kỹ thuật gen:

K ế t hợp phương p h á p chọn giống t ruyền thống và công nghệ sinh học h i ệ n đ ạ i n g ư ờ i

ta hy vọng sẽ chuyển được các gen m ã hoa cho các enzym tham gia vào q u á t r ình quang hợp của cây C 4 vào lúa và các cây Oi khác . Đ ó là các gen:

- Phosphoenol pyruvate cacboxylase (PEPC);

- Pyruvat orthophosphat dikinase (PPDK)

- N A D P - m a l i c ( M E ) .

Các nhà khoa học cho rằng n ă n g suất lúa được chuyển m ộ t trong ba gen t rên có

thể l àm t ăng n ă n g suất lên từ 10-30%. Ở H à n Quốc, g iống lúa được chuyển gen quang

hợp tách chiết từ m ộ t loài v i k h u ẩ n quang hợp đã t ă n g n ă n g suất đ ế n 30% so v ớ i g iống đ ố i chứng.

+ Tạo ra thảm xanh thực vật:

Theo d ự t ính của các nhà khoa học, thảm xanh thực vậ t c ó thể tạo ra lượng sinh k h ố i hữu cơ khổng l ồ khoảng trên 100 tỷ t ấ n / n ã m trên mặ t đấ t , hấp thụ C 0 2 l à m g i ả m h iệu ứng nhà kính, đồng thờ i tạo ra dưỡng kh í nuô i dưỡng trái đấ t . D o vậy , tạo ra t h ả m xanh thực vật là một chiến lược toàn cầu.

" Công nghệ sinh học xanh" n h â n giống thực vật có thể tạo ra v ô vàn cây xanh từ nuôi cấy m ô t ế bào sống ở thực vật i n vi tro và tạo ra các h ệ thống canh tác m ớ i .

Ở nước ta, c ô n g nghệ t ế bào thực vật phải đ ả m nhận chức n ă n g tạo g iống và nhân

bản thực vật ở qui m ô công nghiệp và th iế t l ập các hệ thống giá thể t rồng c â y ngay cả trên nền bê tông . N h â n giống phủ xanh 5 t r i ệu hecta rừng, phủ xanh 14 t r i ệ u hecta đ ấ t trống đ ồ i núi trọc là mộ t trong các sứ mệnh trước mắ t của c ô n g nghệ sinh học thực vật .

Két luận và những bài học:

T ừ tầm nhìn vệ t inh chúng ta thấy trái đấ t đ ang cháy . C ô n g nghiệp c à n g l ớ n , càng thiêu huy và ô n h i ễ m nhiều. T h ả m xanh thực vật của ư á i đ ấ t đ a n g l à m d ịu đ i đ á m c h á y lớn đó . Cũng từ tầm nhìn vệ t inh, c h ú n g ta thấy V i ệ t Nam của c h ú n g ta m ớ i ch ỉ bắt đ ầ u phát t r iển công nghiệp, ở đ ó bầu t rờ i còn d ịu d à n g hơn vì chưa có nền c ô n g nghiệp l ớ n . Đ ó là ưu t h ế của mộ t quốc gia và phải bảo t ồ n và phá t t r iển ưu t h ế đ ó .

Vậy triết học xây dựng dứ nước của chúng ta là gì ?

Tạo ra một nước V i ệ t Nam khác biệt : " V i ệ t Nam xanh, V i ệ t Nam nước sạch và k h ô n g kh í trong lành". Đ ó sẽ là mộ t đ ấ t nước tuyệt đẹp, hấp d ẫ n đ ố i v ớ i sự sinh t ổ n của chúng ta và du khách , hấp d ẫ n đ ầ u tư phát t r iển .

204

C á c c ô n g t r ình k i ế n t rúc v ĩ đ ạ i của n h â n l o ạ i từ t rưóc n ă m 2000 n h ư K i m tự tháp ở A i Cập; T ử c ấ m thành, V ạ n lý t rường thành ở Trung Quốc; T h á p E i f f e l và Cung đ iện

Louvre ở Pháp ; Cung đ iện Ermitage ở nưóc Nga; Toa t h á n h Vatican ở I ta ly. T ấ t cả đ ề u

đ ã được xây dụng trên nền đá , x i m ă n g , sắt t h é p và vàng son k i m l o ạ i . N h ư n g những k i ế n t rúc vĩ đ ạ i của n h â n loạ i trong tương la i , k ể từ sau n ă m 2000 chắc chắn sẽ phải là các k i ế n t rúc m à u xanh, k i ế n trúc đa dạng sinh học. Đ ó sẽ là nhũng k i ế n t rúc m ớ i phản á n h thờ i đ ạ i . Nước ta phả i cạnh tranh v ớ i c á c d â n tộc k h á c bằng k i ế n t rúc m à u xanh. Đ ó sẽ là n h ư n g c ô n g t r ình khổng l ồ mang t ầ m cỡ quốc gia và quốc t ế . D o vậy , c h ú n g ta phả i

ngh iên cứu th iế t k ế tổng thể m à u xanh của nước ta, th iế t k ế đ ế n t ận l àng x ã đ ể chuẩn bị cho mộ t h ệ sinh thái xanh t ầ m cỡ t hờ i d ạ i .

Đạo lý sống của thòi đại chúng ta là gi?

- Trồng m ộ t cây xanh là l à m m ộ t đ iều t h i ện , vun đ ắ p m ã i m à u xanh của đ ấ t nước chúng ta.

- N h à nước ta phả i sớm x â y dụng và thực h i ệ n ch iến lược phá t b i ể n xanh.

11.4. LÀM SẠCH SINH HỌC (BIOREMEDĨAĨTON)

L à m sạch s inh học (Bioremedia t ion) là q u á t r ình sử dụng c á c c ơ t hể sinh vật , chủ yếu là các loài v i sinh vậ t đ ể thúc đ ẩ y nhanh q u á t r ình p h â n g i ả i c á c hợp chấ t tự nh iên hoặc các vật l i ệ u k h ô n g mong m u ố n k h á c do con n g ư ờ i tạo ra.

N g u y ê n tắc c ơ bản của l à m sạch sinh học là l à m p h â n g iã c á c c h ế phẩm hữu cơ gây ô n h i ễ m m ô i t rường thành c á c hợp chấ t hữu c ơ đ ơ n g i ản h ơ n n h ư C 0 2 , nước, m u ố i các loạ i và các sản p h ẩ m v ô h ạ i k h á c .

P h â n g i ả i h ữ u c ơ là m ộ t q u á t r ình vậ t lý , hoa học, sinh học x ả y ra ư ơ n g m ô i trường tự nhiên , trong đ ó c ơ t h ể sống trong nhũng đ i ề u k i ệ n th ích hợp thực h i ệ n v iệc phân g i ả i các vật l i ệ u hoặc chấ t t h ả i hữu cơ, tạo ra C 0 2 , nước, nhiệ t và chấ t m ù n .

Đ ể việc p h â n g i ả i chấ t thả i hữu c ơ x ả y ra m ộ t c á c h t ố i ưu cần tạo ra những đ i ề u k i ệ n t ố i ưu cho hoạt động của c á c v i sinh vật , v í d ụ đ ộ ẩm của chấ t t hả i phả i khoảng 45- 65%.

Phân g i ả i hữu c ơ c ó t h ể là:

P h â n g i ả i ưa k h í (aerobic process): đòi h ỏ i c ó h à m lượng oxy th ích hợp cho c á c hoạt động của sinh vậ t h i ế u kh í .

P h â n g i ả i k ỵ k h í (Anaerobic process): k h ô n g đòi h ỏ i c ó oxy cho c á c hoạt động của sinh vật k ỵ kh í .

Q u á t r ì n h p h â n g i ả i g ồ m 3 g ia i đ o ạ n sau:

Gia i đ o ạ n Ì g ọ i là mesophilic (Hay là giai đoạn nhiệt đ ộ trung b ình ) . G ia i đoạn này k é o dà i m ộ t vài ngày .

Gia i đ o ạ n 2 (Thermophilic) hay là giai đ o ạ n nhiệt đ ộ cao, c ó thể k é o dà i vài ngày đ ế n vài t háng .

Gia i đ o ạ n 3: Gia i đ o ạ n nguội hay chúi .

205

Thời gian (tháng)

Sơ đồ 11.1. Biến thiên nhiệt độ trong quá trình phân giải chất hữu cơ

Ghi chú: Ì tháng tương ứng với 5 ô (mỗi ô 6 ngày)

Khoảng 6 ngày đầu nhiệt độ tăng từ nhiệt độ bình thường 20- 25°c lên đến 50°c.

T ừ 6 ngày đ ế n khoảng 50 ngày nhiệ t đ ộ t ăng lên t rên 6 0 ° c và bắ t đ ầ u g i ả m xuống trên 5 0 ° c .

Giai đoạn 3, nhiệt đ ộ g i ảm nhanh và đạt nhiệt đ ộ ban đ ầ u .

Ở m ỗ i giai đoạn thay đ ổ i của nhiệt độ , có những n h ó m v i sinh vậ t th ích hợp ch iếm

ưu t h ế hoạt động. Giai đoạn Ì xảy ra quá t r ình phân g i ả i nhanh các chấ t hoa tan và d ễ phân g iả i bở i các n h ó m v i sinh vật ưa nhiệt trung b ình (mesophilic microbs). Q u á trình phân g i ả i k è m theo sản sinh nhiệt , l àm cho nhiệt đ ộ t ăng nhanh. K h i nh iệ t đ ộ t ăng lên trên 4 0 ° c , n h ó m ưa nhiệt trung b ình sẽ bị n h ó m ưa nhiệ t đ ộ cao (thermophil ic) canh

tranh, ở nhiệt đ ộ 5 5 ° c và cao hơn, nh iều v i sinh vật gây bệnh bị t iêu d iệ t (nhiệt đ ộ 6 5 ° c tiêu d iệ t hầu hết các l o ạ i v i sinh vật) và tốc đ ộ phân g i ả i hữu c ơ do vậy bắ t đ ầ u g i ả m .

Đ ể bảo đ ả m thông kh í và nhiệt đ ộ thấp hơn (< 65°C), n g ư ờ i ta cho t h ổ i k h í qua lò ủ. Trong giai đoạn nhiệt đ ộ cao (thermophilic) tốc đ ộ của q u á t r ình p h â n g i ả i các chấ t đ ạ m (protein), chấ t béo , các chấ t cacbohydrate phức tạp (cellulose và hemicellulose), các thành phần cấu trúc c ơ ' b ả n của thực vật t ăng lên. K h i các cơ chấ t hữu cơ cần phân g i ả i (thức ăn của v i sinh vật) cạn k i ệ t dần, nhiệt đ ộ của lò ủ cũng g i ả m dần. Đ ế n giai đoạn này, các v i sinh vật ưa nhiệt trung b ình l ạ i bắt đ ầ u hoạt động ở giai đ o ạ n 3, giai đ o ạ n kế t

thúc của quá tr ình phân g i ả i hữu cơ.

C á c cơ t h ể sống t h a m gia q u á t r ì n h p h â n g i ả i h ữ u cơ :

Rấ t nhiều loài sinh vật tham gia v ớ i vai t rò khác nhau trong p h â n g i ả i các chấ t thả i hữu cơ, trong đ ó có các cơ thể đơn bào và đ a bào . D ư ớ i đây là danh sách các loài sinh vật t ìm thấy trong m ù n hữu cơ:

- Các v i khuẩn ch iếm 80- 90% tổng số hàng tỷ các v i sinh vật t ìm thấy trong l g chấ t mùn . V i khuẩn chịu t rách nh iệm ch ính trong phân huy hữu cơ và sinh nhiệt , c h ú n g sở

206

hữu m ộ t phổ enzym rấ t rộng có khả năng phân g i ả i c á c chấ t hữu cơ k h á c nhau. á c v i khuẩn khác nhau g ồ m v i khuẩn Bacillus h ình que, n h ó m Cocci h ình cầu, n h ó m Spirilla

h ình xoắn.

- Actinomycetes là n h ó m v i khuẩn g ă m dương , đ ó n g vai t rò quan trọng trong phân g i ả i các chấ t n h ư l ignin , cellulose, chi t in và protein. Sự c ó mặ t của các loài này l àm cho m ù n hữu cơ c ó m ù i đấ t . Các n h ó m enzym của các v i khuẩn này c ó khả n ăng phân g i ả i các mảnh sợi g ỗ của thân, vỏ cây, g iấy b á o hoặc hộp các - tông .

- Các loài n ấ m : g ồ m một n h ó m các loài n ấ m n h ư n ấ m men, n ấ m mốc (mold) , chúng phân g i ả i các chấ t hữu cơ phức tạp trong phế thả i hoặc trong đấ t , các sản phẩm do các loài n ấ m này tạo ra l ạ i được các v i khuẩn phân g iả i t i ếp . Đ a số các loài n ấ m nằm ở bên ngoài của chấ t m ù n và chúng c ó mặ t ở m ọ i giai đoạn của q u á t r ình phân g i ả i các chấ t

hữu cơ.

- Protozoa: là mộ t loài động vật đơn bào , c h ú n g sống bằng các sản phẩm hữu cơ do

các v i sinh vật khác tạo ra.

Ngoà i ra còn có các l o ạ i cơ thể sống khác nhau tham gia trong quá t r ình phân g iả i hữu cơ như là các rot i íer (các v i sinh vật đa bào) , nhiều loài côn t rùng , nhện (mites), snowbugs (rệp), k i ế n , giun đấ t , giun đỏ .

Nuô i giun là mộ t c á c h phân g iả i hữu cơ. Sự có mặ t của giun trong m ù n hoặc đấ t chứng tỏ độ m à u m ỡ của đ ấ t v ớ i sự tồn t ạ i của các nguồn cacbon và thức ăn quan trọng đ ố i vớ i sinh t rưởng của cây trồng. Metan được tạo ra trong q u á t r ình phân g i ả i hữu cơ k ị

kh i .

Đ ể tăng cường hoạt động của các v i sinh vậ t l à m sạch m ô i t rường đấ t , phương pháp đơn g iản là t hêm các v i sinh vật th ích hợp và các chấ t d inh dưỡng vào m ồ i t rường. Các v i sinh vật sử dụng các chấ t gây ô n h i ễ m n h ư nguồn dinh dưỡng và p h â n g i ả i chúng .

K ỹ t h u ậ t d i t r u y ề n t h i ế t k ế c á c s inh v ậ t l à m sạch:

Hơn 100.000 các hợp chấ t hoa học được sản xuấ t h àng n ă m t rên t h ế g i ớ i . M ộ t số có khả năng phân huy nhờ các cơ thể sinh vật , mộ t số khác ví dụ như các hợp chấ t chlorinated (các hợp chấ t hoa học chứa chlor) l ạ i bền vững đ ố i v ớ i các v i sinh vật . Đ ể giả i quyết v ấ n đề này , các nhà khoa học đã phân lập các gen g ọ i là KF707 từ mộ t số v i sinh vật có k h ả n ăng phân huy polychlorinated biphenyls (PCBs) (v i khuẩn Pseudomonas pseudoalkali). N h ó m các gen c ó k h ả năng sản sinh các enzym phân g i ả i các PCBs đã được phân lập.

Các n h à khoa học Nhật Bản đã phân lập các n h ó m gen k h á c nhau có k h ả n ăng phân giả i các PCBs khác nhau, r ồ i từ đ ó đưa các gen này vào các chủng v i khuẩn có khả năng phân g i ả i PCBs, nhờ vậy làm tăng khả năng của các chủng này trong phân g iả i các chấ t PCBs khác nhau.

T i ế n sỹ Anand Chakrabarty đã thực h iện việc chuyển gen phân huy dầu vào v i khuẩn Pseudomonas, tạo ra chủng p. aureginos có khả n ă n g ăn và phân huy dầu m ỏ t hành các chấ t hữu cơ đơn giản, kh i dầu m ỏ bị ăn hết, các v i sinh vật ăn dầu t ự chết vì

k h ô n g còn thức ăn. Các loài Penicil l ium cũng có khả n ă n g ân dầu m ỏ nhưng thờ i gian

207

cần làm sạch lâu hơn nh iều so v ớ i v i khuẩn chuyển gen. N h ó m v i k h u ẩ n Alcanivorax cũng c ó k h ả n ăng phân hủy c á c c h ế phẩm dầu m ỏ .

N g ư ờ i ta cũng đ ã phân l ập được các gen g ọ i là mergene từ c á c l o ạ i v i k h u ẩ n c ó k h ả năng chống chịu thúy ngân , các gen này chịu t rách n h i ệ m p h â n g i ả i c á c hợp chấ t hữu c ơ có chứa thúy ngân . N g ư ờ i ta cũng đ ã p h â n l ập được các tod-gene t ừ v i k h u ẩ n p h â n g i ả i toluene và đã th iế t k ế được gen t odCl c ó k h ả n ăng sản sinh c á c enzym p h â n g i ả i toluene và đã chuyển được gen này vào chủng v i khuẩn KF707. Chủng n à y c ó k h ả n ă n g phân huy manh đ ố i v ớ i trichloroethylene (TCE). Chủng KF707 cũng c ó k h ả n ă n g sinh t rưởng trên toluene hoặc benzen.

X ử lý ô n h i ễ m c ô n g n g h i ệ p :

M ộ t số chấ t thử công nghiệp nguy hạ i c ó t h ể g â y các bệnh h i ể m n g h è o n h ư ung thư, ví dụ methylene chloride. Các v i sinh vật đ ó n g vai t rò là các chấ t x ú c tác sinh học c ó thể tiêu hoa các chấ t này , b iến c h ú n g thành H 2 0 , C 0 2 và m u ố i . M ộ t số v i khuẩn , v í dụ Geobacter metallừeducens d ù n g đ ể l à m sạch uranium từ c ác nguồn nước thả i ở c á c nơi khai thác .

Xử lý ô nhiễm công nghiệp giấy:

Chấ t thải công nghiệp g iấy thường rấ t g iàu celỉulose và lignocellulose. Cellulose rấ t bền đ ố i v ớ i các enzym và k h i l iên k ế t v ớ i l i gn in sẽ rấ t k h ó p h â n g i ả i b ở i t ác động hoa học và enzym. Do l ignin và các cacbohydrate tạo ra l iên k ế t bền vững trong g ỗ , do vậy quá tr ình c h ế b iến g iấy cũng gặp k h ó khăn .

Các nhà khoa học đã ngh iên cứu sử dụng enzym, n h ư Alka l ine xylanase đ ể t ẩ y trắng g iấy (Pulp bleaching), thay t h ế hoặc l à m g iảm sử dụng chlorine, nhờ vậy l à m g i ả m chấ t thải có chứa chlorine ư ơ n g công nghiệp. Đ ể l àm việc này , n g ư ờ i ta đ ã p h â n l ậ p các chủng v i sinh vật sản sinh ra xylanase, ví dụ Bacillus stearthermophilus được phân lập từ đấ t . Các enzym xylanase được sử dụng rộng rãi bở i chúng bền vững trong đ iều k i ệ n nhiệt đ ộ và đ ộ k i ề m t ố i ưu cao. V í dụ , Alka ỉ ine xylanase ở v i khuẩn B. stearthermophilus hoạt hoa ở p í ỉ = 9 và nhiệt đ ộ 6 5 ° c .

Nước thả i giàu sulphite từ công nghiệp g iấy c ó chứa khoảng 60% ligno-sulphate, 36% đường và h ỗ n hợp các chấ t hữu cơ k h á c , l o ạ i nước thả i n à y c ó thể được x ử lý bằng n ấ m men (Candida albicans). N ấ m men sử dụng đường và sinh t rưởng, tạo ra gần Ì tấn n ấ m men từ 2 t ấ n nước thả i . N g ư ờ i ta c ó thể sử dụng c á c v i sinh vậ t b i ến đ ổ i gen đ ể xử lý m ô i t rường. V í d ụ ở M ỹ chủng Flovobacterium đ ã được th iế t k ế gen đ ể p h â n g i ả i pentachlorophenol trong đấ t . Các n h à v i sinh vật M ỹ cũng đ ã d ù n g chủng v i sinh GS-15 có khả n ăng hấp thụ uranium từ nước thả i của các n h à m á y c h ế tạo bom hạt n h â n . Chủng v i sinh này chuyển uranium trong nước vào mộ t hợp chấ t k h ô n g tan trong nước, tạo ra các hạt lắng đọng c h ì m xuống đ á y và sau đ ó được l ấ y đ i . Chủng v i sinh n à y rấ t hữu ích cho làm sạch m ô i t rường ở các vùng khai m ỏ uranium.

Các v i sinh vật , thậm ch í các v i sinh vật đã chết cũng có k h ả n ă n g hấp thụ nh i ều l o ạ i lon k i m loạ i khác nhau trong nước do k h ả n ăng đặc b iệ t của thành t ế bào . V í d ụ sinh k h ố i của loài n ấ m Rhiiopus arhiius c ó thể hấp thụ 30-130 mg Cadimi/g sinh k h ố i k h ô .

208

N ấ m sở hữu các lon â m trên thành t ế bào như các n h ó m amine, cacboxyl và hydroxyl và do vậy c ó k h ả n ă n g hấp thụ các cation k i m loạ i . N g ư ờ i ta t ính rằng 1,5 k g bột sợi n ấ m có thể sử dụng để hấp thu k i m loạ i từ Ì m 3 nước có chứa 5 g Cd. C ô n g ty Biorecovery System đ ã đ ă n g k ý sáng c h ế sử dụng Algasorb (dong hấp thụ ) c ó k h ả nàng hấp thụ các ion k i m l o ạ i nặng từ nước thải hay nước ngầm theo c ơ c h ế tương tự. Sinh k h ố i alga (dong biển) chết được nén trong vật l i ệ u hạt silica gel đ ể tạo ra Algasorb. Hạ t silica gel bảo vệ sinh k h ố i dong k h ỏ i các v i sinh vật , n ó hoạt động n h ư các cột trao đ ổ i ion, hấp thụ k i m loạ i nặng. Các k i m loạ i nặng n h ư thúy ngân , cadimi , chì . . . là các chấ t gây ô n h i ễ m thường xuyên có mặ t trong nước thả i công nghiệp h i ện đ ạ i . Các k i m loạ i này cũng có t hể được hấp thụ bở i các v i khuẩn. V í d ụ Pseudomonas aureginos c ó khả năng hấp thụ uranium, Thiobacillus c ó k h ả n ăng hấp thụ bạc. Các công ty m ô i t rường M ỹ đã bán những h ỗ n hợp v i sinh vật và enzym để l àm sạch các chấ t thả i hoa học g ồ m các loạ i dầu mỡ , các chấ t tẩy rửa, thuốc B V T V . . .

Cầy trồng cũng được sử dụng để l àm sạch ô n h i ễ m k i m l o ạ i ỏ các vùng ô n h i ễ m . Cây hấp thụ k i m l o ạ i vào các k h ô n g bào trong t ế bào . Q u á t r ình này được g ọ i là Phytoremediation ( L à m sạch bằng thực vật) . K i m l o ạ i được thu h ồ i sau k h i đ ố t cháy thực vật.

11.5. CÁC GIẢI PHÁP CẢI THIỆN MÔI TRƯỜNG KHÁC

11.5.1. Thay thế chất dẻo tổng hợp bằng chất dẻo sinh học (Bỉoplastics)

Sản xuấ t chấ t dẻo sinh học là phương p h á p sản xuấ t chấ t dẻo polymer từ các v i sinh vật, cây trồng, động vật , trong đ ó các v i sinh vật và/hoặc enzym được sử dụng để chuyển hoa cacbonhydrat và/hoặc protein thành chấ t dẻo mong muốn (The Economist, 2003).

Sự quan t â m của xã h ộ i đ ố i v ớ i chấ t dẻo sinh học hay còn g ọ i là các chấ t dẻo tổng hợp từ nguồn vật l i ệ u tá i sinh hay vật l i ệ u sinh học gia t ăng mạnh trong những n ă m gần đây do chấ t dẻo sinh học có các đặc t ính quan trọng như c ó k h ả n ăng bị phân g i ả i hoặc tự phân g i ả i d ễ d à n g , k h ô n g gây ô n h i ễ m m ô i t rường. Chấ t dẻo sinh học m ớ i ch iếm

khoảng 1,25% (500 t r i ệu tấn) t rên tổng số 40 tỷ tấn chấ t dẻo toàn cầu. D ự báo nếu giá

thành sản xuấ t chấ t dẻo sinh học g i ảm xuống thì sản lượng sản xuấ t c h ú n g sẽ t ăng gấp 3 lần vào n ă m 2010 (Reverchon, 2002).

11.5.2. Giảm phân bón hoa học và tăng cường phân bón sinh học

2 loạ i phân b ó n sinh học cơ bản h iện nay là:

1. Các chủng v i sinh vật có khả năng cố đ ịnh n i tơ k h í quyển và chuyển hoa ni tơ thành các k h o á n g chấ t d ễ hấp thụ đ ố i v ớ i cây trồng có khả n ă n g l à m tăng đ ộ phì của đấ t và n ăng suất cây t rồng (Mekonnen et ai., 2002)

2. Các chủng v i sinh vật có khả năng tạo phospho hoa tan, d ễ sử dụng đ ố i v ớ i thực vật (Garg et ai. , 2001)

Các v i sinh vật có khả năng cố đ ịnh n i tơ g ồ m : Azospirillum, Azotobacter, Rhhobium, Sesbania, Algac, Mycorrhizae

209

Các v i sinh vật có k h ả n ăng hoa tan phospho: PStriata, B. megaterium, Aspergilỉus.

Ngược l ạ i cây trồng cộng sinh v ớ i các v i sinh vật , cung cấp nguồn n ă n g lượng và vật l i ệ u hữu cơ cho v i sinh vật cộng sinh.

Phân bón sinh học đã được sản xuấ t và sử dụng ở nh iều quốc gia n h ư Brasil , Banglades, các nước n g h è o ở Châu Phi như Kenya, Cộng hoa Tanzania, Zimbabwe (Juma and Konde, 2002). Phân bón sinh học có thể được sản xuấ t t ạ i c h ỗ vì c ô n g nghệ sản xuấ t k h ô n g phức tạp. Các nước này đã có các n h à m á y sản xuấ t p h â n b ó n v i sinh. Tuy vậy , khả n ăng sản xuấ t còn xa m ớ i đ á p ứng yêu cầu của thực t i ễ n .

11.5.3. Tăng cường sử dụng các tác nhân bảo vệ thực vật sinh học

- V i khuẩn (B. thuringiensis) được sử dụng rộng rãi nhấ t để t rừ sâu. Thuốc t rừ sâu v i sinh Bt h i ện v ẫ n là c h ế phẩm B V T V chủ lực h i ệ n nay, c h i ế m 90% trong tổng 160 t r iệu

USD th ị t rường c h ế phẩm B V T V toàn cầu.

- Sử dụng các con r u ồ i bấ t dục đ ể k i ể m soát quần thể r u ồ i g â y bệnh ngủ: Loà i ruồ i Tsetse f l y là vector t ruyền bệnh ngủ- sleeping sickness. N g ư ờ i ta đ ã sản xuấ t các con ruồ i đực bấ t dục, thả c h ú n g vào m ô i t rường đ ể l àm g i ả m sinh sản r u ồ i Tsetse f l y ở đảo

Zanzibar.

- A Wasp (Apoanagyrus lopezi) đã được sử dụng đ ể d i ệ t t rừ Cassava meabybug ở cây sắn (phenacoccus manihoti) , công t r ình ngh iên cứu này đ ã được tặng g i ả i thưởng Wor ld Food Prize.

Nhu cầu sử dụng các c h ế phẩm B V T V ngày c à n g lớn . Tuy vậy , c á c c h ế p h ẩ m này đ ề u còn có mộ t số nhược đ i ể m sau:

- Phổ tác dụng d iệ t trừ hẹp, c h ú n g thường có tác dụng đặc thù đ ể trị m ộ t số l o ạ i sâu bệnh cụ thể , g iớ i hạn.

- D i ệ t trừ v ớ i tốc đ ộ chậm

- D ễ b iến đ ổ i

- Có cảm ứng cao v ớ i ngoại cảnh ( loạ i đấ t , hoa chấ t , nồng đ ộ , đ ộ ẩm)

- Đ ộ bền thấp ( thờ i gian bảo t ồ n và bảo quản ngắn). Đ i ề u k i ệ n bảo quản phức tạp.

11.6. KẾT LUẬN

Hội nghị Bali, 2007, chứng tỏ rằng nhân loại đã tỉnh ngộ khi nhận thức được nguy cơ tiêu huy của hệ sinh thái trên trái đấ t .

Tuy vậy, nguy cơ đ ó v ẫ n k h ô n g h ề suy g i ả m m à c ò n đ ang tăng lên mạnh m ẽ . K ể từ sau đ ạ i chiến t h ế g iớ i lần thứ n , nhân l o ạ i v ẫ n còn tỏ ra đói khá t và hoang dã . Các cường quốc chạy đua phát t r iển công nghiệp, q u â n sự và l àm giàu. N ề n k inh t ế của nh iều nước tăng trưởng trên 10%. Sự phát t r iển n ó n g v ớ i tốc đ ộ hai con số đã mang l ạ i sự phồn thịnh công nghiệp. Tuy nhiên , k h i nh ìn l ạ i nhân l o ạ i l ạ i đang rùng m ì n h trước những sản p h ẩ m do chính n ó tạo ra:

210

- Những thành p h ố tiêu dùng khổng l ồ v ớ i h àng t r i ệu ô tô nhả ống khó i m ỗ i ngày .

- Các nguồn năng lượng cạn k iệ t , giá cả các l o ạ i dầu m ỏ t ăng hàng ngày . Cạnh tranh nguồn dầu m ỏ tạo ra những mâu thuẫn gay gắt và những cuộc đụng đ ộ như cuộc chiến

dầu m ỏ ở Trung Đ ô n g , vụ sụp đ ổ của T h á p đô i n g à y 11/9/2001 và cuộc chiến M e , cuộc đụng đ ộ t h ế k ỷ giữa Israel và Palestine để g iành giậ t mảnh đấ t sa mạc cằn c ỗ i vùng Trung Đ ô n g . Sự đó i khát và hoang dã v ẫ n đ ang còn ở rấ t nh iều nơi v ớ i những vụ tàn sát tập thể và những kho vũ kh í ngày càng đầy lên.

- Hàng nghìn tỷ đ ô la đang bỏ ra m ỗ i n ă m để t i ếp tục ngh iên cứu các phương t i ện huy diệt l ẫ n nhau.

- Các virus mớ i gây bệnh nguy hạ i m ớ i v ẫ n đ a n g t i ếp tục xuấ t h iện . N h i ề u virus và

vi sinh vật có thể được tổng hợp, được tái tổ hợp để t rở nên nguy hạ i hơn mộ t cách hữu ý hoặc vô ý trong các p h ò n g thí nghiệm.

V ấ n đề môi trường, v ấ n đề năng lượng và tương la i nền văn minh của trái đấ t chỉ có thể g iả i quyết được trên cơ sở thống nhấ t lý tr í và h à n h động t rên quy m ô toàn cầu và ở m ỗ i quốc gia.

211

T À I L I Ệ U T H A M K H Ả O C H Í N H

1. Đ ỗ N ă n g V ịnh , 2002. Công nghệ sinh học cây trồng. N X B N ô n g Nghiệp .

2. Đ ỗ N ă n g V ịnh , 2005. Công nghệ t ế bào thực vật ứng dụng. N X B N ô n g Nghiệp .

3. Abelson John N . and Simon M e l v i n ì., Colowick Sidney p . and Kaplan Nathan o . , 2005. Methods in Enzymology. V o i 392. Elsevier Inc.

4. Albert B. , Bray D. , Lewis J., R a f f M , Robert K . and Watson J.D., 1994. Molecular Biology o f the Cell , 3 r d edition. Garland Publishing, I n c , New Y o r k .

5. Becker W . M . , Reece J. M . and Peonie M . F . , 1995. The W o r l d o f the Cel l , 3^ edition, The Benjamin/cummings Publishing Company, Redwood City , C A .

6. Blaese R . M . , 1997. Gene therapy fo r cancer. Sci .Am 276 (June): 111-115.

7. Calladine C.R., 1997. Understanding D N A : The molecule and how Ít vvorks. New York: Academic Press.

8. Campbell Ne i l A . and Reece Jane B., 2002. Biology. 6* edi t ion. Berýamin Cummings.

9. Coutre L . A . and Stinchcomb D . T., 1996. Anti-gene therapy: The use o f ribozyms to inhibit gene íunc t ion . Trends Genet. 12: 510-515.

10. Das H . K . , 2004. Textbook of Biotechnology. W i l e y Dreamtech India Pvt. L t d .

l i . Dri l ica Ka r l , 1997. Understanding D N A and Gene Cloning. 3"* edit ion. M i n Wi ley & Sons, Inc.

12. F A O , 2004. State o f Food and Agricul ture, Agr icul tura l Biotechnology, Meet ing the needs of poor, Rome 2004.

13. Gartland K . M . A . and Davey M . R. Methods i n Molecular Biology, V o i 44: Agrobacterium Protocols. Humana Press Inc, Totowa, New Y o r k .

14. Gr i f f i ths Anthony J. F., Gelbart W i l l i a m M . , M i l l e r Jeffrey H . and Lewont in Richard c , 1999. Modern genetic analysis. w . H . Freeman and Company, Wor th Publishers

15. Hansen G. and Wright M . s., 1999. Recent advances in the t r ans ío rmat ion o f plants. Trends Plant Sci. 4: 226-231.

16. Ha i t i Daniel L . and Jones Elizabeth, 2001. Genetics: analysis o f genes and genome. A 5 l h edition. Jones and Bartlett Publishers.

17. Hartmann Hudson T., Kester Dale E., Davies Fred T. and Geneve Robert L . , 2004. Plant Propagation: Principles and Practices. 6* edition. Prentice Hau o f India Private Limi ted .

18. Haseltine W . A , 1997. Discovering genes for new međ ic ines . Scientific American, March.

19. Hood E.E., Gelvin S.B., Melchers s., Hoekema Ạ. , 1993. New Agrobacterium helper plasmids for gene t rans íer to plants. Transgenic Research 2: 2008-218.

212

20 Keppel F Fayewt o and Georgopoulos K . , 1988: Strategies for bacteriophage D N A replication. In : The Bacteriophages (ed. R. Calendar), V o i 2., 145 - 162. Plenum Press, New York.

2 1 . Komberg A . and Baker T., 1992. D N A Replication, 2 n d edition. New York : W . H . Freeman and Company, Worth Publishers.

22. Koncz c , Nemeth K . , Redei G.P., Schell J., 1992. T - D N A insertional mutagenesis in Arabidopsis. Plant molecular biology 20: 963-976.

23. Lewin B., 1997. Genes V I . O x í o r d University Press, New York .

24. Lodish H . , Berk, A . , Zipursky S.L., Matsudaira p. , Baltimore D . and Darnell J., 1999. Molecular Cell Biology, 4ứ edition. W . H . Freeman and Company, Worth Publishers

25. Miesíe ld R. M . , 1999. Appl ied Molecular Genetics. Wi ley-Liss ; a John Wi ley and sons, Bạc, publication.

26. Meyerowitz E . M . , 1999. Plants, animals and the logic o f development. Trends in Biochemical Sciences 24: M 6 5 .

27. Nelson David L . and Cox Michael M . , 2000. Lehninger Principles o f Biochemistry. 3"1 edition. Wor th Publishers.

28. Rao Kanury V . s, 2004. Biology o f Immune system. W i l e y Dreamtech India Pvt.Ltd.

29. Raven Peter H . , Evert Ray F. and Eichhom Susan E., 1999. Biology o f Plants. 6 l h

edition. W . H . Freeman and Company, Wor th Publishers

30. Sambrook j . , Fritsch E.F., and Maniatis T., 1989. Molecular cloning: A laboratory Manual, 2 n d edition. Cold spring Habor Laboratory Press. Cold Spring Habor, New York.

31. Smith p. J.and Smith C.J. eds., 1999. D N A Recombination and Repair. New York: Oxford University Press.

32. Staudt L . M . and Brown P.O., 2000. Genomic views o f the immune system. Annual Review of Immunology 18: 829

33. Struhl K . , 1995. Yeast transcriptional regulatory mechanisms. Annual Review of Genetics 29: 651 .

34. Twyman Richard M . , 2003. Advanced Molecular Biology. V i v a books Private Limi ted .

35. Watson.J.D. Gi lman M . , Wi tkowwsk i J. and Zoller M . , 1992. Recombinant D N A , 2 n d ed. New York : W . H . Freeman and Company, Wor th Publishers.

36. \Veissman I . L . and Cooper M . D . , 1993. How the Immune system Develops. Scienti í ic American (September).

37. w w w . b i o . o r g . Biotechnology: A collection of technologies.

213

M Ụ C L Ụ C

M Ở Đ Ầ U 3

Chương 1. KHÁI NIỆM, LỊCH sử VÀ BIỆN CHÚNG PHÁT TRIỂN CỦA C Ô N G N G H Ệ S I N H H Ọ C 5

1.1. Khá i n i ệ m công nghệ sinh học và quan hệ của c ô n g nghệ sinh học v ớ i c á c ngành khoa học tự nh iên và xã h ộ i k h á c 5

Ì .2. Các ngành khoa học về sự sống và m ố i quan hệ biện chứng 6 1.2.1. Các n g à n h khoa học c ơ bản về sự sống 8 1.2.2. Các n g à n h khoa học c ô n g nghệ sinh học 9

Ì .2.3. Các n g à n h công nghệ sinh học ứng dụng 9 Ì .2.4. Các n g à n h khoa học c ô n g nghệ tự nh iên 9

1.3. Lịch sử công nghệ sinh học và vân đề bản chất của sự sống 11

1.3.1. T ó m tắt các giai đ o ạ n phá t t r iển của c ô n g nghệ sinh học và c á c sản phẩm chính của CNSH 11

1.3.2. Những phát minh căn bản của n h â n l o ạ i trong l ĩnh vực sinh học d ẫ n đ ế n

sự ra đ ờ i của CNSH l i 1.3.3. M ộ t vài ứng dụng của CNSH 16

Ì .4. K h á m phá bản chấ t của sự sống và vai t rò chủ đạo của gen 17

1.4.1. K h á m phá bản chấ t của sự sống và k h ả n ă n g c ả i tạo sinh g i ớ i bằng c ô n g nghệ sinh học 17

1.4.2. V a i t rò của gen được thể h i ện n h ư t h ế n à o trong t ế b à o sống? 18

Ì .5. Cải tạo d i t ruyền các cơ thể sống trên cơ sở sinh học p h â n tử và k ỹ thuật gen 20

Ì .6. M ộ t số l ĩnh vực ứng dụng của CNSH 22

Chương 2. CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT 25

2. Ì . T ế bào t iền nhân và t ế bào nhân thực 25

2.2. Những đặc t rưng cơ bản của t ế b à o sống và các huống phá t t r iển cơ bản của công nghệ t ế bào thực vật 26 2.2. Ì . K h ả năng phân bào và p h â n hoa 26 2.2.2. K h ả n ăng trao đ ổ i chấ t 28

2.2.3. T ế bào là kho lưu t rữ t hông t in và là đơn vị t i ến hoa 29

2.2.4. T ế bào thực vật còn là nhà m á y n ă n g lượng mặ t t rờ i - nền tảng cho phá t t r iển Công nghệ sinh học xanh và các công nghệ sạch 30

2.3. M ộ t số hướng khai thác các đặc t rưng cơ bản của t ế bào trong tạo g iống 30

2.3.1. X â y dựng hệ thống tái sinh nâng cao h iệu quả chuyển gen trong tạo giống 30

214

2.3.2. K ỹ thuật đơn bộ i tạo giống m ớ i và d ò n g thuần 31

2 3 3 Thụ t inh nhân tạo, nuôi cấy và tái sinh t ế b à o t rứng, t ế bào hợp tử, t ế

bào n ộ i nhu non thanh cây trong đ iều k i ệ n i n vi t ro 32

2.3.4. Công nghệ t ế bào tạo giống cây ăn quả k h ô n g hạt, chấ t lượng cao và cây lam nghiệp ưu t h ế lai t hông qua nuôi cấy n ộ i nhũ tam b ộ i 32

2.4. Phát minh ra các ứng dụng khác nhau của kỹ thuật nuô i cấy m ô và t ế bào 33

2.4.1. K ỹ thuật nuôi cấy đ ỉnh sinh t rưởng tạo giống sạch bệnh và nhân giống nhanh 33

2.4.2. K ỹ thuật nuôi cấy, tái sinh t ế bào t rần và la i t ế b à o soma 34

2.4.3. K ỹ thuật đơn b ộ i và ứng dụng tạo d ò n g thuần, c ố đ ịnh ưu t h ế la i 34

2.4.4. K ỹ thuật nuôi cấy t ế bào dịch lỏng (suspension culture) sử dụng trong sản xuấ t các chấ t hoạt t ính sinh học 34

2.4.5. Tạo các b iến d ị d ò n g t ế b à o soma ứng dụng trong chọn tạo giống và xác định chức năng của các gen 34

2.4.6. Công nghệ t ế bào ứng dụng trong chuyển gen vào cây trồng 35

2.5. Nuôi cấy m ô và t ế b à o thực vật 35 2.5. Ì . M ộ t số các mô i t rường cơ bản thường d ù n g trong nuô i cấy m ô 35 2.5.2. Thành phần hoa học của các m ô i t rường nuô i cấy m ô , t ế bào thực vật 38

2.5.3. ứ i g dụng của công nghệ nuôi cấy m ô và t ế b à o 58

Chương 3. cơ sở SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA KỸ THUẬT DI TRUYỀN 70

3.1. Các nguyên lý cấu t rúc hoa học của A D N 70

3.2. Dòng chảy của t hông t in d i t ruyền 72

3.3. Biểu h iện của gen 73

3.3.1. Q u á t r ình ph iên m ã (transcription) 73 3.3.2. Q u á t r ình dịch m ã (translation) 74

3.4. Các enzym tham gia vào quá t r ình sinh hoa của A D N 75

3.5. Đ iều kh iển b iểu h i ện của gen 75

3.5.1. Phép b iện chứng trong ngh iên cứu hệ thống sống và v ấ n đ ề đ iều k h i ể n hoạt hoa của gen 76

3.5.2. T ính phức tạp của hệ thống sống 76

3.5.3. H ệ đ iều h à n h gen 79

3.6. Đ ộ t b iến gen 89

3.7. Genom và t hông t in đi t ruyền 92

3.8. Phát h iện các gen quan trọng làm cơ sở cho tạo giống m ớ i 93

3.9. K ế t quả bước đầu trong nghiên cứu sinh học phân tử phục vụ n ô n g nghiệp ở nước ta 95

215

Chương 4. C Ô N G N G H Ệ A D N T Á I T ổ H Ợ P 9 7

4. Ì. Virus , v i khuẩn và khả nâng chuyển t ả i vật l i ệ u d i t ruyền 97

4.1.1. V i khuẩn 97

4. Ì .2. Siêu v i khuẩn X, (Phage lambda) 99 4 . Ì .3. Các plasmid d ù n g trong chuyển gen 100 4.1.4. Cosmids l o i 4. Ì .5 . Siêu v i khuẩn đơn sợi l o i

4.2. Các enzym tham gia vào q u á t r ình A D N tái tổ hợp 102 4.2. Ì . Các enzym cắt g iớ i hạn đặc thù của A D N 102 4.2.2. Ligase và kinase 103 4.2.3. A D N - polymerase và A R N - polymerase 103

4.3. Công nghệ A D N tái tổ hợp 104 4.3. Ì . T h ế n à o là mộ t A D N tái tổ hợp 104

4.3.2. Ý nghĩa của việc t ách các gen đặc thù 104 4.3.3. Các bước tạo A D N tái tổ hợp 104

4.4. Ngh iên cứu phát h i ệ n các gen và ứng dụng k ỹ thuật A D N tái tổ hợp 109

4.4. Ì . a-Interferon tái tổ hợp 109

4.4.2. y-Interferon tái tổ hợp n g ư ờ i Ì l o

4.4.3. Sản xuấ t bFGF (Basis Fibroblast Growth Factor) 110 4.4.4. Vacxin tái tổ hợp p h ò n g v iêm gan B - Hepatitis B virus 110 4.4.5. K ỹ thuật A D N tái tổ hợp sản xuấ t Kí t chẩn đ o á n bệnh (virus H I V ) 111 4.4.6. Chẩn đoán virus v iêm gan c (Hepatitis c virus - H C V ) 111

4.5. K ỹ thuật A D N tái tổ hợp phục vụ chuyển gen vào các cây t rồng 112

4.6. Quan đ i ể m về công nghệ gen và giống cây t rồng chuyển gen 112

4.7. Thư v i ện A D N 113 4.7. Ì . Phân loạ i thư v i ệ n A D N 113

4.7.2. Phương pháp phát h iện d ò n g mang gen quan t â m 114 4.7.3. M ồ i nhận b iết A D N 115

4.7.4. Tạo A D N m ồ i (probe) 115

4.8. D ự án Genom n g ư ờ i 116

4.9. Các d ự án n g h i ê n cứu chức n ă n g h ệ gen (Funct ional Genomics) và so s á n h chức n â n g h ệ gen (Comparat ive Genomics) 116

Chương 5. VIRƯS VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC VIRUS 118

5. Ì . L ịch sử phát h iện ra virus 118

5.2. Đặc đ i ể m chung trong cấu t rúc của virus 119 5.2.1. V ỏ bọc của virus (capsid và envelop) 119

216

5.2.2. Sinh sản virus trong t ế bào sinh vật chủ 119

5.2.3. Cơ chế n h i ễ m bệnh virus 120 5.2.4. Chu trình sinh sản của virus ký sinh ở v i khuẩn 121

5.3. M ộ t số bệnh virus nguy hạ i 122

5.3.1. Virus bại l i ệ t 122 5.3.2. Virus cúm (Influenza hoặc Flu) 123 5.3.3. Virus gây suy g i ảm hệ m i ễ n dịch H I V / A I D S 123

5.4. Các chiến lược cơ bản p h ò n g chống bệnh virus 124

Chương 6. PROTEIN VÀ CÔNG NGHỆ ENZYM 125

6.1. G i ớ i thiệu về protein 125

6.1.1. V a i trò của protein 125 6. Ì .2. Cấu trúc của protein 126

6.2. Công nghệ enzym 127 6.2.1. V a i t rò sinh hoa học của enzym 128 6.2.2. M ộ t số đặc t ính quan trọng của enzym 131 6.2.3. Trung t âm hoạt hoa của enzym 132 6.2.4. Các đ iều k i ệ n hoạt hoa t ố i ưu của enzym 133

6.2.5. Nguồn gốc của mộ t số enzym thông dụng 135

6.3. Úng dụng của công nghệ enzym 136 6.3.1. M ộ t số ứng dụng t ruyền thống và t ình h ình phát t r iển của công nghệ

enzym 136 6.3.2. Kha i thác enzym t inh c h ế hoặc c ố đ ịnh 138 6.3.3. M ộ t số l ĩnh vực ứng dụng quan trọng của enzym c ô n g nghiệp 140

6.4. K ỹ thuật gen và k ỹ nghệ protein trong l ĩnh vực công nghiệp enzym 141

Chương 7. CÔNG NGHỆ SINH HỌC VI SINH 144

7.1. Sơ lược về l ịch sử h ình thành công nghệ v i sinh 144

7.2. Va i trò của v i sinh vật trong tự nh iên và ứng dụng của v i sinh vật 144

7.3. Công nghiệp lên men v i sinh vật 146 7.3.1. V ậ t l i ệ u của công nghiệp v i sinh • 146 7.3.2. Chủng giống v i sinh công nghiệp 148 7.3.3. L ê n men công nghiệp 148

7.4. M ộ t số n g u y ê n lý trong sinh t rưởng của v i sinh vật 149 7 .4 . Ì . Nuô i cấy từng đạ t (batch culture) 150 7.4.2. Phương pháp nuôi cấy liên tục 151 7.4.3. Th iế t bị Bioreator/Fermenter 151 7.4.4. Quy m ô của công nghệ lên men 152

217

Chương 8. C Ô N G N G H Ệ S I N H H Ọ C Y D U Ợ C V À C H Ă N N U Ô I Ì 5 4

8.1. Dược chất và dược chất sinh học (Pharmaceuticals and Biopharmaceutiacal) 155 8.1.1. K h á n g sinh (antibiotics) 155

8.1.2. Vacx in và k h á n g thể đơn d ò n g 156 8.1.3. K h á n g thể đơn d ò n g 159

8. Ì .4. M ộ t số sinh dược chữa bệnh tạo được từ kỹ nghệ gen 160

8.2. Các sản phẩm sinh dược phục vụ chăn nuôi 161 8.2. Ì . Chẩn đoán bệnh bằng k h á n g thể đơn d ò n g 161 8.2.2. K ỹ thuật gen chẩn trị bệnh 162 8.2.3. Các loạ i protein t ăng trưởng phục vụ chăn nuôi 163

8.3. Động vật chuyển gen sản xuấ t sinh dược và hoa chấ t trong sữa 163

8.4. L i ệ u pháp gen 164

8.5. N h â n giống động vật ưu t h ế la i và n h â n bản động vật t rưởng thành 166

Chương 9. KỸ THUẬT DI TRUYỀN KIÊM SOÁT SÂU BỆNH 170

9 .1 . Các gen liên quan đ ế n k h á n g sâu bệnh 170

9.2. Cơ c h ế tác dụng của các gen k h á n g c ô n t rùng và mộ t số t h à n h tựu đạ t được trong b iến nạp các gen này ở cây trồng 171 9.2.1. Cơ c h ế tác dụng 171 9.2.2. M ộ t số thành tựu đạt được 172 9.2.3. Cơ c h ế tác dụng của các gen k h á n g t uyến t rùng và m ộ t số t hành tựu đạt

được trong b iến nạp các gen này ở c ác cây t rồng 174 9.2.4. Cơ c h ế tác dụng của các gen k h á n g n ấ m và m ộ t số t hành tựu đạ t được

trong b iến nạp các gen này ở các cây t rồng 174 9.2.5. Các gen k h á n g virus và mộ t số thành tựu đạt được trong b i ến nạp các

gen này ở các cây trổng 176

9.3. Thành tựu sản xuấ t một số các giống cây t rổng chuyển gen k h á n g sâu bệnh 177

Chương 10. CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHỤC vụ TRONG TRỌT 178

10. Ì . T ầ m quan trọng của n g à n h trồng t rọ t 178

10.2. Các chuyên n g à n h CNSH phục vụ t rồng t rọ t 178 10.2. Ì . Công nghệ gen và công nghệ t ế bào tạo giống cây trồng 179 10.2.2. Những thành tựu n ổ i bật nhấ t trong l ĩnh vực tạo giống và vai t rò của

nó đ ố i v ớ i ngành trồng t rọt 185 10.2.3. Công nghệ sinh học bảo vệ thực vật phục vụ trồng t rọt 190

10.2.4. Công nghệ phân hữu cơ v i sinh và sinh học phục vụ t rổng trọt 193

10.2.5. CNSH và nền n ô n g nghiệp hữu cơ 194

10.3. M ộ t số vấn đề đặ t ra đ ố i v ớ i n g à n h trồng trọt và vai t rò của công nghệ sinh học ở nước ta 195

218

10.3.1. Những thách thức lớn ở các vùng sản xuấ t n ô n g nghiệp nước ta và một số g i ả i pháp công nghệ 195

10.3.2. CNSH trồng trọt tham gia vào mộ t số chương t r ình k inh t ế xã h ộ i lớn 196

Chương li. CỒNG NGHỆ SINH HỌC VÀ VẤN ĐỀ MÔI TRƯỜNG SINH

T H Á I V À N À N G L Ư Ợ N G 198

11. Ì . ô nh iễm hoa học môi t rường sống và bệnh lý 198

11.2. Ô nh iễm k h ô n g kh í 199

11.3. Tác động của công nghiệp và Công nghệ sinh học xanh 200 11.3.1. Hai quá tr ình trái ngược nhau trên h à n h t inh, các v ấ n đ ề thờ i đ ạ i và

tương lai của trái đấ t 200 11.3.2. Va i t rò của CNSH xanh hay khả n ăng của con n g ư ờ i tác động vào

thảm xanh thực vật như t h ế nào? 202

11.4. L à m sạch sinh học (Bioremediation) 205

11.5. Các g iả i p h á p cả i th iện môi t rường khác 209 11.5.1. Thay t h ế chấ t dẻo tổng hợp bằng chấ t dẻo sinh học (Bioplastics) 209 11.5.2. G i ả m phân bón hoa học và tăng cường phân bón sinh học 209 11.5.3. Tăng cường sử dụng các tác nhân bảo vệ thực vật sinh học 210

11.6. K ế t luận 210

TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH 212

219

GT Công nghệ sinh học

63-630 1018/21-08

NN-2007