guia de microbiologia

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NORMAS DE BIOSEGURIDADNORMAS DE BIOSEGURIDAD

Principios Generales Principios Generales

1. La señal internacional de riesgo biológico debe colocarse en las puertas de los locales en donde se manipulan microorganismos del Grupo de Riesgo 2,3,4.

2. En la zona de trabajo del laboratorio o Aula de Prácticas no se permitirá al personal: comer, beber, fumar, guardar alimentos, ni aplicar cosméticos.

3. No se permitirá pipetear con la boca.

4. Habrá que mantener el laboratorio limpio y aseado, retirando del mismo cualquier material que no tenga ninguna relación con el trabajo.

5. Las superficies del trabajo se decontaminarán al terminar la práctica y en caso de derramamiento de sustancias potencialmente peligrosas.

6. El personal de laboratorio y/o alumnos se lavarán las manos después de haber manipulado material infeccioso, así como al abandonar el laboratorio.

7. Todos los procedimientos técnicos se practicarán de manera que se reduzca al mínimo la formación de aerosoles.

8. En el laboratorio se utilizarán: mandiles, batas, uniformes u otras prendas apropiadas, esta ropa no se llevará fuera del laboratorio.

9. Habrá que utilizar guantes en todos los trabajos con riesgo de contaminación directa con la sangre, material infeccioso o materiales infectados.

10. Todos los derramamientos, accidentes y exposiciones reales o potenciales a material infeccioso se notificarán inmediatamente al profesor.

Recomendación para el Manejo del MicroscopioRecomendación para el Manejo del Microscopio

En Microbiología el manejo del microscopio es de gran ayuda para el reconocimiento de los microorganismos, por lo que es necesario conocer su correcto manejo.

Las preparaciones coloreadas necesitan el uso de objetivos de inmersión, en las cuales se utiliza aceite de cedro en la interfase objetivo-portaobjetos, el condensador próximo a la platilla y el diafragma abierto para pemitir una buena iluminación. Antes y después de su uso limpie los objetivos con papel para lentes.

Cómo manipular los Cultivos y el Material ContaminadoCómo manipular los Cultivos y el Material Contaminado

- Siempre trabajar cerca de la llama de un mechero de gas o alcohol.

- Nunca dejar tubos ni placas destapadas.

Guía de Prácticas de Microbiología Médica 2011 3

UNFV – FMHU - Colocar las placas Petri en posición invertida para evitar que caiga el agua de condensación la cual

puede estar contaminada.

- Mantener los tubos en posición vertical para evitar que se mojen los tapones.

- Abrir los tubos en forma adecuada, flamear la boca del tubo antes y después de efectuarse el trabajo. No dejar la tapa del tubo sobre la mesa. Las placas deben ser cubiertas cuidadosamente para evitar que se contaminen.

- Esterilizar las asas de alambre antes e inmediatamente después de usarlas. Si se ha empleado para trabajar un material que crepita como el caso del esputo, previamente al flameado introducir el asa en un frasquito de vidrio que contenga arena y alcohol. Nunca dejar las asas sobre la mesa de trabajo sino en frascos especiales y en posición vertical con el alambre hacia arriba.

- Aprender a usar las pipetas adecuadamente: para el trabajo bacteriológico éstas vienen estériles y envueltas en papel. Manipularlas exclusivamente por su extremo posterior, desenvolviéndolas en el momento de usarlas. No quitar el algodón que llevan, por ser un elemento de protección para el que la usa. Emplear tetinas para realizar la succión. No pipetear con la boca.

- Eliminar pipetas, láminas y todo el material contaminado en el bocal con solución desinfectante.

- En caso de accidentes como, ruptura de una placa o un tubo con material infectante, contaminación del mandil o de la mesa, etc., durante el trabajo, avisar inmediatamente al profesor.

Precauciones para realizar la Inoculación de AnimalesPrecauciones para realizar la Inoculación de Animales

1. Preparar el inóculo con cuidado.

2. Proteger la aguja con su propio tubo antes de hacer la inoculación, para que no se disperse el material.

3. Tener cuidado de no lastimarse con la aguja.

4. Eliminar inmediatamente el material de inoculación al desinfectante.

5. Colocar al animal inoculado, debidamente identificado en una jaula y llevarlo al bioterio con sus respectivos alimentos, observar la evolución del animal y registrar los datos.

Precauciones para realizar la Autopsia de los Animales Precauciones para realizar la Autopsia de los Animales

1. Usar guantes.

2. Colocar sobre la mesa papel Kraft impregnado en desinfectante.

3. Hacer la menor cantidad de manipulaciones posibles, cuidando de no herirse con el material de la autopsia, el cual debe mantenerse en todo momento dentro de un recipiente con desinfectante.

4. Terminado el trabajo, envolver en el papel Kraft al animal autopsiado con todos sus detritus y entregarlo para ser incinerado.

5. Colocar los guantes y material quirúrgico en una bandeja con desinfectante.


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Como terminar el Trabajo de Práctica Como terminar el Trabajo de Práctica

1. Todos los cultivos que se incuben deben tener las siguientes anotaciones: nombres e iniciales de los estudiantes, nombre del germen y número de mesa, sala y fecha de siembra.

En caso de las placas, todas deben ser invertidas a menos que sean dadas instrucciones contrarias por el profesor.

2. Los tubos deben estar bien tapados y colocados en canastas con gradillas de metal. 3.- Los alumnos se responsabilizarán de colocar estos cultivos en estufas a 37° C.

Terminada la práctica: al finalizar el trabajo Terminada la práctica: al finalizar el trabajo

1. Limpiar la mesa de trabajo con algodón embebido en desinfectante.

2. Comprobar que las llaves del gas estén cerradas.

3. Lavarse prolijamente las manos con jabón carbólico.

4. El protocolo de cada práctica deberá ser controlado por el profesor al final de ella.


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II U N I D A DU N I D A D

BacteriologíaGeneral


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BACTERIOLOGÍA GENERALBACTERIOLOGÍA GENERAL

MicrobiologíaEs el estudio de los organismos microscópicos, deriva de 3 palabras griegas: mikros (pequeño), bios (vida) y logos (ciencia) que conjuntamente significan el estudio de la vida microscópica.Los microorganismos son diminutos seres vivos que individualmente son demasiado pequeños como para verlos a simple vista. En este grupo se incluyen las bacterias, hongos (levaduras y hongos filamentosos), virus, protozoos y algas microscópicas.Normalmente tendemos a asociar estos pequeños organismos con infecciones, enfermedades como el SIDA, o con el deterioro de alimentos. Sin embargo, la mayoría de los microorganismos contribuyen de una forma crucial en el bienestar de la Tierra ayudando a mantener el equilibrio de los organismos vivos y productos químicos en nuestro medio ambiente:Los microorganismos de agua dulce y salada son la base de la cadena alimentaria en océanos, lagos y ríos; los microorganismos del suelo destruyen los productos de desecho e incorporan el gas nitrógeno del aire en compuestos orgánicos, así como reciclan los productos químicos en el suelo, agua y aire; ciertas bacterias y algas juegan un papel importante en la fotosíntesis, algunos animales dependen de las bacterias que habitan en sus intestinos para realizar la digestión y síntesis de algunas vitaminas como son la K y algunas del complejo B.

Primeras observaciones de los microorganismos (Leeuwenhoek y sus microscopios)La existencia de los microorganismos no se conoció hasta la invención del microscopio. La primera persona en describir los microorganismos en detalle fue el holandés Antony Van Leeuwenhoek en 1684, a los cuales denominó animáculos. Leeuwenhoek examinó el agua de lluvia, de mar, de río, saliva y otras materias.

La fermentación como proceso biológico (Pasteur y el vino francés)Sin duda desde la Prehistoria los hombres utilizan con provecho las fermentaciones. El pan fermentado se conoce desde hace varios miles de años. Los jeroglíficos egipcios, así como representaciones gráficas en todo el Próximo Oriente atestiguan que el hombre recurría a la fermentación para fabricar bebidas alcohólicas ya varios milenios antes de Jesucristo. Al preparar el pan, vino, cerveza o sake, los egipcios, sumerios y todas las personas hasta mediados del Siglo XIX, empleaban sin saberlo, y de una manera empírica, una familia de agentes biológicos muy originales: las levaduras. Son ellas las que realizan la fermentación alcohólica.

El papel de las levaduras como agentes fermentadores no fue reconocido hasta 1856 por Luis Pasteur. Las teorías científicas de esa época reconocían la presencia de levaduras en la fermentación alcohólica, pero estas levaduras eran consideradas como compuestos químicos complejos, sin vida.

Esta era la teoría mecanística liderada por los químicos alemanes von Liebig y Wöhler. Luis Pasteur, químico francés, propuso la teoría vitalística y demostró que las células viables de levaduras causan fermentación en condiciones anaeróbicas; durante dicha fermentación el azúcar presente en el mosto es convertido principalmente en etanol y CO2. Sus ilustraciones claramente muestran auténticas levaduras vínicas y en sus escritos él las diferenciaba claramente de otros componentes.

En 1866, Pasteur publicó la obra titulada "Estudios sobre el vino, sus enfermedades, causas que las provocan. Nuevos procedimientos para la conservación y envejecimiento". Entre las mejoras aconsejadas había un método para aumentar la calidad de la conservación de los vinos consistente en calentarlos a una temperatura de 68° C durante 10 minutos y después enfriarlos rápidamente. Esta técnica ha venido a ser conocida como pasteurización y es ahora ampliamente utilizada en el tratamiento de la leche.


UNFV – FMHU Descubrimiento de la función de los microorganismos como causantes de enfermedades (Koch y la bacteria del carbunco)Ya en 1546 Girolano Fracastoro había sugerido que las enfermedades podían deberse a organismos tan pequeños que no podían verse y que eran transmitidos de una persona a otra. Sin embargo, el descubrimiento de que las bacterias pueden actuar como agentes específicos de las enfermedades infecciosas en los animales fue realizado a través del estudio del carbunco, infección grave de los animales domésticos que es transmisible al hombre. La demostración concluyente de la causa bacteriana o etiología del carbunco la proporcionó en 1876 Robert Koch, un médico rural alemán. Koch empezó a estudiar el mundo microbiano después de que su mujer le regalara por su 28 cumpleaños un microscopio. Seis años después Koch anunció al mundo que había encontrado la bacteria del carbunco (Bacillus anthracis). Posteriormente él y sus colaboradores descubrieron las bacterias que causan la tuberculosis y el cólera.

Esta serie de experimentos se ajustaban a los criterios necesarios para poder establecer la relación causal entre un organismo específico y una enfermedad específica.Estos criterios se conocen como los postulados de Koch:

El microorganismo debe estar presente en todos los casos de la enfermedad. El microorganismo debe ser aislado del hospedador enfermo y obtenerse en cultivo puro en el

laboratorio. La enfermedad específica debe reproducirse cuando un cultivo puro del microorganismo se

inocula a un hospedador susceptible sano. El microorganismo debe ser recuperable de nuevo a partir del hospedador inyectado

experimentalmente.

El descubrimiento posterior de los virus (Dimitri Ivanovski en 1892; el virus del mosaico del tabaco pasaba los filtros que retenían a las bacterias), agentes que no crecen en medios artificiales en el laboratorio como lo hacen las bacterias, han permitido realizar algunas modificaciones en los postulados de Koch.

Este trabajo sobre el carbunco condujo rápidamente a la edad de oro de la bacteriología. En 25 años la mayoría de los agentes bacterianos de las principales enfermedades humanas habían sido descubiertos y descritos.

BacteriasLas bacterias o eubacterias son microorganismos unicelulares que pertenecen al dominio Bacteria. Los miembros de este dominio tienen diferencias con aquellos pertenecientes a los otros dos dominios, Archaea y Eukarya.

En la Tierra, existen sólo dos tipos básicos de células que son estructuralmente muy diferentes: las procariontes y las eucariontes. Las bacterias son células procariontes. Estas células poseen un único cromosoma desnudo, es decir, que este cromosoma no se halla envuelto por una membrana nuclear sino que se halla en el citoplasma. Algunos investigadores se refieren a este cromosoma desnudo como nucleoide o núcleo primitivo. Otra de las características principales de las células procariontes es que no poseen organelas rodeadas por membranas como retículos endoplásmicos, mitocondrias, aparato de Golgi o lisosomas.

Clasificación de las bacterias


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Bacterias gram negativas de importancia en medicinaForma de la célula Familia Género

Cocos Neisseriaceae

Veillonellaceae

NeisseriaBranhamellaAcinetobacterKingellaMoraxellaVeillonella (an)

Bacilos Enterobacteriaceae

Vibronaceae

SpirillaceaePseudomonadaceae

Pasteurellaceae

Otros

LegionellaceaeBacteroidaceae

EscherichiaEdwardsiellaCitrobacterSalmonellaShigellaKlebsiellaEnterobacterSerratiaProteusProvidenciaMorganellaYersiniaVibrioAeromonasPlesiomonasCampylobacterPseudomonasXanthomonasPasteurellaHaemophilusActinobacillusBrucellaBordetellaFrancisellaCardiobacteriumStreptobacillusSpririllumBacilo del arañazo de gatoLegionellaBacteroides (an)Fusobacterium (an)

(an) Anaerobio


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Bacterias gram positivas de importancia en medicinaForma de la célula Familia Género

Coco Micrococcaceae

Streptococcaceae

Otros

Staphylococcus ()Micrococcus ()Streptococcus ()Enterococcus ()Peptostreptococcus (an)PeptococcusAerococcus ()

Bacilos Bacillaceae

Propionibacteriaceae

LactobacillaceaeAfiliación incierta

Actinomycetaceae

NocardiaceaeMicobacteriaceae

Bacillus ()Clostridium (an)Propionibacterium (an)Eubacterium (an)Corynebacterium ()Lactobacillus (an)ListeriaEryspelothrixActinomyces (an)Bifidobacterium (an)Nocardia ()Micobacteria ()

(an) Anaerobio() Catalasa-positivos.() Catalasa-negativos.() Con ácidos micolicos en pared celular.

Otras bacterias de interés em medicina

Familia u orden GéneroEspiroquetas

ChlamydiaceaeMycoplasmataceae

Rickettsiaceae

TreponemaBorreliaLeptospiraChlamydiaMycoplasmaUreaplasmaRickettsiaCoxiellaRochalimaeaEhrlichia


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PRÁCTICAPRÁCTICA

1 1Reconocimiento de los tres ambientesReconocimiento de los tres ambientes

del laboratorio de Microbiología ydel laboratorio de Microbiología y Parasitología. Parasitología.

Uso del microscopio. BioseguridadUso del microscopio. Bioseguridad

I. USO DEL MICROSCOPIO

Objetivo: Familiarizar al estudiante con el uso del microscopio.

1. Material 2 láminas portaobjetos 2 láminas cubreobjetos 1 asa de Kolle 1 mechero de Bunsen Solución salina Microscopio óptico

2. Procedimiento Con el asa de Kolle esterilizada a la llama, tome una muestra de tártaro dentario. Deposite sobre una lámina portaobjeto una gota de solución salina y coloque sobre ella la

muestra obtenida. Cubrir con una laminilla cubreobjetos. Observar al microscopio a menor, mediano y mayor aumento. Observar al microscopio de campo oscuro. Dibuje y anote en su cuaderno de trabajo lo observado.

II. MATERIAL QUE SE USA EN MICROBIOLOGÍA

Objetivo: Conocer el material de uso común en el laboratorio microbiológico.

1. Medios de Cultivo e Insumo Químicos: Frascos de medios de cultivo, específicos para diferentes organismos. Insumos químicos: H2SO4, HCI, KOH, HCI, etc.

2. Material de Vidrio, Plástico y Porcelana:Vidrio: Pipetas graduadas y volumétricas Pipetas Pasteur Tubos de ensayo de diversos tamaños y marcas. Tubos de centrifugadora. Placas Petri de 9 x 12 cm. de diámetro (Pyrex) Campanas de Durhan para demostración de gas en cultivos líquidos. Frascos, matraces, Kitasatos, Erlenmeyer, viales, gotero, embudos. Buretas. Probetas de diferentes graduaciones. Fiolas. Porta objeto y cubre objetos.Porcelana: MorterosPlástico: Embudos

3. Aparatos de Uso Microbiológico:


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Autoclave Horno eléctrico Incubadoras Centrifugadoras Baño María Refrigeradora Microscopios monoculares y binoculares Destiladores Balanzas de Precisión

4. Otros Aparatos: Gradillas de madera o aluminio Soporte y trípodes Portapipetas y portaplacas de metal Filtro de diversos tipos Mecheros de Bunsen Rejillas de amianto Asa de Kolle, espátula de Digralsky, pinzas de madera y metal Papel indicador de pH Algodón, alcohol, lápiz de cera, soluciones coloreadas y químicas Medios de cultivo, reactivos, colorantes, indicadores.

5. Uso de Indicadores y Amortiguadores: Los cambios de los nutrientes durante el metabolismo bacteriano producen metabolitos que

alteran el pH del medio del cultivo. Existen sustancias que evidencian dichos cambios con el viraje de su color: indicadores (rojo fenol, rojo neutro, etc.)

Durante la preparación de los medio de cultivos es importante observar el pH final pues es requerimiento esencial es obtener un pH indicando para el crecimiento bacteriano. Esto se logra utilizando las sustancias buffer. HCl o KOH (Amortiguadores).

III. CUESTIONARIO

1.-¿Con qué finalidad se utiliza la solución salina o suero fisiológico?2.-¿Qué es agar?3.-¿Diga en que momento se requiere el uso de los indicadores y amortiguadores?


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Partes del Microscopio

Morfología esquemática de las bacterias


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PRÁCTICAPRÁCTICA

2 2Presencia de microorganismos en elPresencia de microorganismos en el medio ambiente. Técnicas para elmedio ambiente. Técnicas para el aislamiento de microorganismos.aislamiento de microorganismos.

Necesidad de practicar las técnicasNecesidad de practicar las técnicas asépticamente. Cultivo de organismosasépticamente. Cultivo de organismos

anaerobios.anaerobios.

Objetivos: Familiarizar al alumno con el uso adecuado del material microbiológico y adiestrarlo en la práctica de las técnicas de cultivo y aislamiento bacteriano. Reconocimiento de la diversidad de microorganismos existentes en el medio ambiente.

I. EXPERIMENTO N° 1:

Presencia de microorganismos en el medio ambiente

1. Material : 1 Placa Petri con Agar Nutritivo 1 Placa Petri con Agar Sangre Suero salino Asa de Kolle, lápiz de vidrio, mechero de Bunsen, lámina portaobjetos.

2. Procedimiento: Tome la placa con agar nutritivo y con el lápiz de vidrio trace sobre su superficie posterior

dos líneas perpendiculares que lo dividen en cuatro cuadrantes. Numérelos del 1 al 4. Con el Asa de Kolle estéril(llameado) tome una muestra de agua de caño y con ella dibuje

estrías sobre la superficie de medio de cultivo en el sector 1. Cierre la placa y flamee el asa de Kolle.

Repita el procedimiento tomando muestra de saliva, agua procedente del piso del laboratorio de la piel del alumno sembrando en los sectores 2, 3 y 4 respectivamente.

Tome la placa de Agar Sangre y tosa sobre él. Incube ambas placas en la estufa a 37° C por 24 h.

II. EXPERIMENTO N°2:

Técnicas para el aislamiento de microorganismos. Necesidad de practicar las técnicas sépticamente.

1. Material: 1 Placa Petri “Estéril” con Agar Nutritivo 1 Placa Petri “No Estéril” con Agar Nutritivo. 2 Tubos de prueba con caldo Nutritivo 1 Pipeta estéril de 1 ml. 1 Tubo con caldo de cultivo mixto de bacterias


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1 Asa de Kolle2. Procedimiento:

Aislamiento por método de sembrado de estrías.a) Estría Simpleb) Estría por Agotamiento

Siguiendo estrictamente las reglas de asepsia aprendidas en experimento 1, con el asa de Kolle, tome una muestra del tubo con caldo de cultivo mixto y dibuje, estrías sobre la superficie del medio de cultivo en la placa Petri estéril con agar nutritivo, como en el esquema.

Esquemas:

Estría Simple Estría por Agotamiento

Marque la placa con lápiz de vidrio y lleve a la estufa a 37°C por 24 h. Tome la placa Petri no estéril y márquela en su parte posterior colocando “No estéril”,

llévela a la estufa a 37°C por 24h. Tome los dos tubos de caldo nutritivo y con la pipeta estéril transfiera 1 ml de caldo de un

tubo a otro y viceversa por 5 veces, usando la misma pipeta, tapone los tubos y llévelos a la estufa a 37°C por 24 a 48 h.

III. EXPERIMENTO N° 3:

Cultivo de Organismos Anaerobios.

1. Material : 2 Tubos con Agar Nutritivos vertical 2 Tubos con Agar Nutritivos inclinado 2 Tubos con Caldo de Tioglicolato o caldo carne Campaña de Durham o Jarra Gaspack Cepas de Clostridium sporógenos y Bacillus subtilis

2. Procedimiento: Siembre cada cepa en uno de cada par de tubos, por puntura en el agar vertical, por estría en

el inclinado y asada en el caldo. Tapone los tubos y lleve a la Campaña de Durham. Incube a 37°C por 24 h.

IV. CUESTIONARIO

1.- Interprete los resultados obtenidos en cada uno de los medios de cultivo utilizados.


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Inoculación de placas de cultivo para el aislamiento de colonias bacterianas

Técnica de inoculación de medios para recuentos semicuantitativos de colonias bacterianas.

Inoculación de un tubo con caldo. A. Inclinar La inoculación de un pico de agar se realiza el tubo e inocular en el sitio indicado. De este mediante un alambre recto. A. Atravesar con modo el sitio de inoculación queda sumergido el alambre el agar en profundidad. B. Retirarbajo la superficie. el alambre y estriar la superficie del agar

con un movimiento en S.


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Algunas características de las colonias bacterianas


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Clasificación de los Medios de Cultivo

1. Según su estado físico

Líquidos: Llamado caldo, libre de agar que contiene productos orgánicos. Sólidos: Derivan de los líquidos, añadiendo un coloide en estado de gel y este le da la solidez.

Es usado en Placa Petri. Semisólidos: Contiene menos del 1% del agar.

2. Según su composición

Empíricos: Son aquellos preparados a partir de sustancias naturales, cuya naturaleza química se desconoce.

Sintéticos: Sus preparados son disoluciones de diversas sustancias químicas conocidas. Semisintéticas: Es una mezcla de los anteriores.

3. Por su composición

Comunes: Su finalidad es el crecimiento de microorganismos poco exigentes. Ejm: Caldo común, agar simple.

Enriquecidos: Son los medios comunes a los que añade un suplemento nutritivo, para el crecimiento y desarrollo de bacterias exigentes. Ejm: Agar sangre, agar pata glucosa.

Selectivos: Permiten seleccionar un tipo y este se consigue alterando las condiciones físicas y químicas del medio. Pueden ser:

o Por cambio de ph. Favorece a los lactobacillus.o Por cambios de temperatura. Favorece S. Faecalis.o Por altas [ ] osmóticas. Como el staphylococus.o Con antisépticos. Ejm: el medio Salmonella – Shigella.

Con antibióticos. Ejm: Candida albicans. Diferenciales: Permiten distinguir a simple vista dos o mas tipos de bacteria en función a su

comportamiento sobre el medio. A su vez pueden ser simples o combinados. De transporte: Utilizado para asegurar la viabilidad de las bacterias desde el momento de la toma

hasta su siembra en el laboratorio. Ejm. El medio de transporte de Amies.

Medio de Cultivo

Un medio de cultivo es una solución acuosa (como tal o incorporado a un gel) en la que están incorporados todas las sustancias necesarias para el crecimiento y multiplicación de microorganismos en el laboratorio, con el objeto de aislar las diferentes especies bacterianas u hongos, para luego proceder a su identificación y llevar a cabo una serie de estudios complementarios.

Siembra, aislamiento y transplante de bacterias

Siembra es el procedimiento por el cual se acondiciona al microorganismo a un medio de cultivo fértil para que este pueda desarrollarse.

Aislamiento es la técnica que separa microorganismos al estado de pureza y para ello se requiere un medio sólido.

Transplante significa la separación de la cepa a un medio de cultivo apropiado en tubo, lográndose conocer las propiedades bioquímicas y su identificación.


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PRÁCTICA PRÁCTICA

33Metabolismo Bacteriano. Enzimas de losMetabolismo Bacteriano. Enzimas de los

microorganismos. Fermentaciónmicroorganismos. Fermentación bacteriana.bacteriana.

I. EXPERIMENTO N° 1:

Hidrólisis del Almidón

Objetivo: Hacer conocer al alumno que existen microorganismos que producen exoenzimas y que atacan substratos importantes como Carbohidratos y Proteínas.

El almidón es un polímero de glucosa, se encuentra como material de reserva. Es hidrolizado por las enzimas: Alfa Amilasa y Beta Amilasa. También puede ser hidrolizado por los Acidos Minerales.

ALFA AMILASA + ALMIDON = DEXTRINA + ALFA MALTOSABETA AMILASA + ALMIDON = ALFA MALTOSA

Las Amilasas son enzimas extracelulares

1. Materiales: Solución de Yodo (Lugol) Cepas de Bacillus subtilis y Escherichia coli. 1 Placa de Agar Almidón

2. Procedimiento: Dividir en dos sectores la placa de Agar almidón Inocular en estrías cada sector con las capas de B. subtilis y E. coli. Incubarlo a 37ºC por 24 h.

Se comprueba la Hidrólisis añadiendo unas gotas de Lugol. La ausencia de color azul indica Hidrólisis total del Almidón. El color pardo puede indicar Hidrólisis Parcial del Almidón.

Nota: Este experimento también se puede realizar el tubo de Agar-Almidón.

II. EXPERIMENTO N° 2:

Hidrólisis de la Gelatina

La gelatina es una proteína dotada de la propiedad de tomar GEL cuando se disuelve en agua caliente Por tratarse de una proteína puede ser atacada por alguna bacterias que la priven de su propiedad gelitificante.La hidrólisis de la gelatina es una reacción enzimática y se conoce por GELATINASA la enzima causante de esta transformación.

1. Materiales: Cepas de S. Aureus, B. subtilis y E. coli. Tres tubos de Gelatina Nutriente estéril Asa de Kolle en aguja


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2. Procedimiento: Inocule cada uno de los organismos en un tubo de Gelatina Nutriente por puntura hasta el

fondo del tubo, una sola vez. Incube a temperatura ambiente por 2 a 7 días, no en incubadora porque derrite la gelatina.

Lectura: Observar los tubos donde la gelatina no está gelificada.

III. EXPERIMENTO N° 3:

Producción de Hemolisinas

Objetivo: Conocer y estudiar las exoenzimas que tienen efectos destructivos sobre los glóbulos rojos.

Hemolisina Beta: Destruye y decolora la Hemoglobina. Esto se observa como áreas claras alrededor de la colonia.

Hemolisina Alfa: No decolora la Hemoglobina, pero la cambia a un color verdoso. (Biliverdina)

1. Materiales: Cepa de Staphylococcus aureus (o B. subtilis) y Streptococcus pneumonias o Streptococo

Lact. Agar sangre (1 ó 2)

2. Procedimiento: Dividir en dos placas petri. Inocular en estrías las cepas en cada uno de los lados. Incubar a 37º C por 24-48 h. Observar si ha habido hemólisis

IV. EXPERIMENTO Nº 4:

Demostración de la Producción de Coagulasa N.

La Coagulasa es una exoenzima elaborada por el Staphylococcus aureus y que coagula el plasma humano o de cobayo.

1. Materiales: Cepa de S. Aureus Plasma humano o de cobayo citratados en tubo.

2. Procedimiento: Tomar una azada de la cepa e inocular en el tubo que contiene el plasma citratado. Incubar por 2-3 horas. Revisar cada 30’ el tubo para ver si han empezado a formar coágulos.

Para esto incline el tubo para ver que tan líquido está el plasma.

V. EXPERIMENTO N° 5:

Fermentación de Carbohidratos


UNFV – FMHU Fermentación se refiere a la degradación anaeróbica de los carbohidratos. La capacidad para fermentar los carbohidratos depende de las enzimas que contenga cada bacteria. La degradación de los carbohidratos conduce a la formación de productos lácteos, por lo tanto se utilizará un indicador de ph: Rojo Fenol.

En la práctica se utilizará el medio TSI en tubo. Si la bacteria no tiene las enzimas necesarias para atacar los carbohidratos, no cambiará el ph.

La prueba contendrá lo siguiente: Agar TSI (3 azúcares y hierro) favorece el desarrollo de la mayoría de bacterias. Azúcares químicamente definidos: Lactosa, sacarosa y glucosa. Un indicador de ph.

NC no cambio de phA ácidoAG ácido y gasb básico

Cuando no hay carbohidratos utilizables en el medio la energía necesaria la obtiene la bacteria de proteínas y su producto final es gas amoniaco.

1. Materiales: Cultivo de Escherichia coli , Alcaligenes faecalis y Staphylococcus aureus 3 tubos con TSI en plano inclinado

2. Procedimiento: Sembrar por estría y puntura:

a) E. Coli - TSIb) Alcaligenes - TSIc) Staphylococcus - TSI

Incubar por 24 h. A 37°C

VI. EXPERIMENTO N° 6:

Reducción de Nitratos a Nitritos

En la respiración anaeróbica, las bacterias utilizan al nitrato como aceptor final de H +, este fenómeno lo pueden realizar algunos gérmenes aerobios, anaerobios, y anaerobios facultativos.Se observa al final de la reacción la presencia de gas nitrógeno libre.

Nitrato de Potasio KNO3 Nitrato de Potasio2H + NO3 H2O + NO2

1. Materiales: Cultivo de E. coli, Pseudomona areuginosa Caldo nutritivo con nitrato 6cc. Sol. Dimetil - alfa - naftilamina Sol. de ácido sulfanílico Tubos de pruebas estériles (3)

2. Procedimiento:

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

2cc caldo de 2cc caldo de 2cc de caldonitrato + E. coli nitrato + Pseudomona nitrato + Bacillus


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Incubar por 24 hrs. a 37ºC. Agregar a cada tubo 3 gotas de ácido Sulfanilico y 2 gotas de alfanaftilamina Observa cambio de color, color rosado o rojo: Prueba positiva.

VII. EXPERIMIENTO Nº 7:

Reducción de ácido Sulfhídrico

Cuando se realiza la fermentación de las proteínas se obtiene como producto el ácido Sulfhídrico, ya que las proteínas contienen aminoácidos sulfurados. Algunas bacterias tienen enzimas que desprenden al ácido de azufre de estos aminoácidos, el cual es reducido con hidrógeno del substrato para formar ácido sulfhídrico. Por lo tanto el azufre funciona como aceptor de H +.

H2S + FeSO4 FeS + H2SO4(negro)

1. Materiales: Cultivo de E. coli y Proteus vulgaris Tubos con TSI, con superficie inclinada (2)

2. Procedimiento: Inocular a cada tubo de TSI, las cepas de E. coli y Proteus respectivamente, por estría y

puntura. Incubar a 37ºC por 24 hrs. Observar la formación de FeS color negro.

VIII. EXPERIMENTO N° 8:

Demostración de la producción de Indol

Algunas bacterias degradan el aminoácido triptófano formando INDOL.

1. Materiales: Cultivo de E. coli y Bucillus subtilis Caldo Triptona 2 tubos con 3cc cada uno) Solución de Kovacs Pipetas de 1cc

2. Procedimiento: Inocular un tubo de caldo Triptona con E. coli y otro con Bacillus, Incubar a 37ºC por 24

horas. Agregar a cada tubo y en zona el reactivo de Kovacs. Si el Indol está presente, al agregar el

reactivo de Kovac aparecerá un color rojo cereza.

IX. EXPERIMENTO N° 9:

Detección de la Catalasa

La Catalasa es una enzima que está relacionada con la capacidad de una bacteria para utilizar el oxígeno. La falta de esta enzima en los organismos anaerobios es la causa de que el O2 les sea perjudicial. Cuando hay Oxígeno estos organismos lo emplean como aceptor final de Hidrógeno para formar Agua Oxigenada, pero ésta no puede desdoblarse en H2O y O2 porque falta la Catalasa; por lo tanto el agua oxigenada se acumula y mata a la bacteria.

Catalasa2H2O2 2H2O + O2 (gas)

Agua Oxigenada


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1. Materiales: Cultivo de E. coli y Stafilococo aureus. Tubos con Triptosa Caldo (2) Agua Oxigenada 3.0%

2. Procedimiento: Inocular en cada tubo una de las cepas Incubar a 37ºC por 24 hrs. Cubrir la superficie del caldo con Agua Oxigenada y observar la presencia de burbujas en el

tubo donde hay catalasa.

X. EXPERIMENTO N° 10:

Reducción de Azul de Metileno

Se trata de demostrar la oxidación en los procesos fermentativos, realizada por los gérmenes anaeróbicos, llamada oxidación anaeróbica, donde el sustrato cede un H +, para lo cual se necesitan aceptores de H +, el azul de metileno actúa como aceptor.

Azul de Metileno + 2H Azul de etileno - 2 H(azul) (Incoloro)

Reducción del azul de Metileno.

1. Materiales: Cultivo de E. coli 7.5cc. Tubo de Prueba (3) Pipetas estériles Azul de Metileno de Loeffer Caldo nutritivo 7.5cc

2. Procedimiento: Rotular los tubos con 1,2,3.

Tubo 1 Tubo 2 Tubo34cc cultivo 2.5 cultivo 1cc. cultivo1cc de caldo 2.5 caldo 4cc de caldo

Mezclar y agregar 1 gota de azul de Metileno a cada tubo. Incubar a 37ºC. Observar cada 10 minutos hasta los 20 minutos y anotar los cambios de

color.

XI. CUESTIONARIO

1.- Fundamente los resultados obtenidos en cada experimento.


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Esquema general del metabolismo bacteriano


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PRÁCTICAPRÁCTICA

44Determinación de los requerimientosDeterminación de los requerimientos

mínimos para el crecimiento bacteriano.mínimos para el crecimiento bacteriano. Medios de cultivos selectivos yMedios de cultivos selectivos y

diferenciales.diferenciales.

I. EXPERIMENTO N° 1

Objetivo: Conocer los diferentes nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano.

1. Materiales: Ingredientes necesarios para la preparación de diferentes medios de cultivo.

a) Unicamente Agar (lavado y purificado antes de disolverlo)b) Agar + Minerales (NH4 H2 PO4; Mg SO4; KCl)c) Agar + Minerales + Glucosad) Agar + Minerales + Glucosa + Fuente de Nitrógeno Orgánico (Peptona)

4 placas Petri estériles.conteniendo los medios de cultivo de a,b,c,y d. Cultivo Escherichia coli. Stafilococcus aureus y candida albicans.

2. Procedimiento: Con un lápiz de cera, trace sobre el fondo de vidrio de cada placa petri para dividirlo en

cuatro sectores y enumera cada sector. Inocule los sectores correspondientes de cada placa con uno de los tres organismos.

Deje el cuarto sector de cada placa sin inocular. Vierta las placas, incúbelas a 38ºC por 48 horas y observe el crecimiento en cada uno de los sectores inoculados.

Pregunta:¿Qué interpretaciones puede hacer respecto a la habilidad de los distintos organismos para proliferar en los distintos medios usados?

Recomendación:Es de esperarse que el estudiante examine las fórmulas de los distintos medios y analice el contenido de cada medio con respecto a las fuentes de Nitrógeno, energía y factores necesarios para crecimiento bacteriano.

II. EXPERIMIENTO N° 2:

Medios selectivos y diferenciales

Objetivo: Conocer los diferentes medios de cultivo, que permitan el aislamiento e identificación de bacterias.

1. Materiales: Agar nutriente Porción de Agar-Cloruro de sodio Porción de rojo fenol-Agar Cultivo de Staphylococcus epidermidis y Alcaligenes


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2. Procedimiento: Con el lápiz de cera dividida cada placa en tres sectores: el primero etiquételo Alcaligenes

faecalis el segundo S. Epidermidis y el tercero déjelo sin rotular. Use el asa de kolle para sembrar en estrías cada sector de la placa con el cultivo

correspondiente. Invierta las placas Petri e incúbelas por 24 horas a 37°C.

Considerando los resultado obtenido ¿Cuál de los tres medios empleados es selectivo y cual es diferencial? Fundamente su respuesta.

Ciclo de crecimiento

1. Fase de Latencia: Es la fase de adaptación al medio, existe aumento de la masa celular pero no hay aumento en el número de células.

2. Fase de Crecimiento Exponencial: Es la fase donde se produce un incremento exponencial del número de microorganismos.

3. Fase Estacionaria: Es la fase a la que se llega cuando se ha agotado la fuente de energía. 4. Fase de Muerte: Es la fase que se caracteriza por una disminución exponencial del número de

microorganismos.

Guía de Prácticas de Microbiología Médica 2011

PLACA PETRI

La placa petri es un instrumento muy usado en microbiología, compuesta de dos cristalizadores y se emplea para el cultivo y aislamiento de microorganismos. La tapa puede ser remplazada por porcelana para evitar cúmulo de agua de condensación.

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PRÁCTICAPRÁCTICA

5 5Citología de los microorganismos.Citología de los microorganismos.

Preparación del frotis y fijado. TinciónPreparación del frotis y fijado. Tinción simple. Tinción diferencial: coloraciónsimple. Tinción diferencial: coloración

gram, ácido alcohol resistentes. Tincióngram, ácido alcohol resistentes. Tinción negativa. Demostración de los gránulosnegativa. Demostración de los gránulos

metacromáticos.metacromáticos.

Objetivos: Estudio de las características morfológicas y estructurales de los microorganismos mediante el microscopio y utilizando las diferentes técnicas de tinción.

I. PREPARACIÓN DE FROTIS Y FIJADO

Preparar una lámina portaobjeto lavándola con agua y jabón, luego secar. Colocar una gota de solución salina al centro de la lámina portaobjeto y diluir en ella la

muestra a observar rotándola hasta obtener una película delgada y homogénea (si la muestra es líquida, no necesita diluirse).

Dejar secar al aire o suavemente a la llama. Fijado. El medio más usado para la fijación es el calor, también se puede usar alcohol, éter,

formol y otros.

II. TINCIÓN SIMPLE

Llamada así por la utilización de un solo colorante. Ejemplo la coloración con azul de metileno de Loeftler.

1. Materiales: Lámina portaobjetos. Asa de Kolle. Solución Salina. Caldo de cultivo, cepas de Estafilococos aureus y Eschericha coli. Colorante azul de metileno.

2. Procedimiento: Frotis y Fijado de la muestra con alcohol Cubrir la muestra con azul de metileno. Deja reaccionar por cinco minutos. Lavar con agua de caño Secar y observar al microscopio.


UNFV – FMHU III. TINCIÓN DIFERENCIAL

Se denomina Coloración Diferencial cuando se emplean dos o más reactivos. La más empleada en la bacteriología es la coloración Gram y la coloración para bacilos ácido alcohol resistentes.

Coloración Gram

La tinción Gram se compone de cuatro reactivos diferentes: El Cristal Violeta que es el colorante básico inicial que tiñe todas las bacterias, el segundo reactivo es el lugol que actúa como mordiente (sustancia que aumenta la unión del colorante y el substrato). El tercer reactivo es el alcohol-acetona que actúa como decolorante. Mucho microorganismos retienen el cristal violeta permaneciendo teñidos y tomando el nombre de bacterias Gram positivas; otro grupo de mircroorganismos pierde el color fácilmente por acción del decolorante, al añadirse la safranina que es de color rojo, toman este segundo colorante, denominándose microorganismos Gram negativos.

1. Materiales: Solución Cristal Violeta de Genciana Solución de Lugol Alcohol Acetona Fucciana básica o Safranina Lámina portaobjeto, Asa de Kolle, Solución salina. Cepas de Estafilococos aureus y Eschericha coli.

2. Procedimiento: Frotis y fijado de la muestra Cubrir la muestra con solución de cristal violeta durante 1 minuto Lavar ligeramente con agua de caño Cubrir la muestra con solución de lugol durante 1 minuto Lavar con agua de caño Decolorar con alcohol-acetona hasta que el alcohol-acetona no arrastre color. Lavar con agua de caño. Colorear con safranina por 30 segundos Lavar, secar y observar

Examinar el preparado al microscopio con objetivo 100x de inmersión (aceite). Las bacterias Gram positivas se tiñen de azul oscuro; las bacterias Gram negativas aparecen rojo rosadas.

Coloración para bacilos ácido-alcohol resistentes o coloración Ziehl-Neelsen.

Tinción ácido-resistente se llama así a la naturaleza ácida del agente decolorante, el cual es más fuerte que la mezcla alcohol-acetona usada en el Gram. Estos microorganismos resisten la decoloración debido a las sustancias lipídicas de su membrana. Ejemplo el M. tuberculosis, el M. leprae.

1. Material: Cultivo o esputo conteniendo m. tuberculosis. Colorante de Ziehl-Neelsen o fucsina fenicada Alcohol ácido Azul de metileno de Loeffler

2. Procedimiento: Después de la fijación, cubrir la muestra con Ziehl-Neelsen puro por 3 minutos y calentar

por tres veces con un mechero del alcohol, hasta la emisión de humo cada vez. Decolorar con alcohol ácido al tercio hasta que no arrastre color. Lavar con agua y teñir con azul de metileno por 3 minutos. Lavar con agua, secar y observar. Los bacilos aparecen de rojo en un fondo azul.


UNFV – FMHU IV. DEMOSTRACIÓN DE LOS GRÁNULOS METACROMÁTICOS.

Se trata de visualizar los gránulos metacromáticos, llamados así debido al hecho de que algunos colorantes cambian de color en su presencia.

1. Material: Cultivo fresco de Corynebacterium. Colorante de Albert. Solución yodada de Albert o de Gram.

2. Procedimiento: Frotis y fijado de la muestra Cubrir el portaobjetos con el colorante de Albert de 3 a 5 minutos. Eliminar el colorante. Cubrir con lugol por 3 minutos. Lavar con agua corriente, secar.

Se observa un citoplasma verde pálido e incoloro y los gránulos metacromáticos de color verde oscuro.

V. TINCIÓN NEGATIVA.

Para demostrar la imagen exacta de los microorganismos. En este caso no son los microorganismos los que tienen sino la superficie de vidrio sobre la cual se encuentran. Esta técnica permite evaluar el tamaño real de microorganismo observado, porque en ésta no se aplica el tiempo al calor.

1. Materiales: Suspensión conteniendo Klebsiella neumoniae Tinta china o Nigrosina

2. Procedimiento: Deposite dos asas llenas de la suspensión sobre un objeto limpio. Añadir una asada de tinta china y con movimientos rotatorios mezcla las 2 suspensiones, si

la dilución es correcta esta debe aparecer gris Dejar que la mezcla se seque al aire, no fije a la llama. Observe al microscopio comparando esta preparación con el frotis de tinción siempre de

azul de metileno.

V. CUESTIONARIO

1.- Esquematizar las observaciones

2.- Explique el uso de: Alcohol-ácido en la coloración de Ziehl-Neelsen. Solución de Lugol y Alcohol-Acetona en la coloración Gram.

3.- ¿Para qué se empleó la Tinción Negativa o de Contraste?


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Etapas de la tinción Gram

Pasos MétodosResultados

Gram (+) Gram (-)

Colorante básico

Mordiente

Decoloración

Contraste

Violeta de genciana

Lugol

Alcohol de 95% o alcohol acetona

Fucsnia o safranina

Se tiñe de violeta

Permanece violeta

Permanece violeta

Permanece violeta

Se tiñe de violeta

Permanece violeta

Se decolora

Se tiñe de rojo

Etapas de la tinción Zhiel-Neelsen

Pasos Métodos

Resultados

Acidoalcohol-resistente

No ácidoAlcohol-resistente

Colorante básico

Mordiente

Decoloración

Contraste

Fucsina

Calor

Alcohol-clorhídrico

Azul de metileno

Se tiñe de rojo

Permanece rojo

Permanece rojo

Permanece rojo

Se tiñe de rojo

Permanece rojo

Se decolora

Se tiñe de azul


COLORACIÓN DE CÁPSULAS

La cápsula de bacterias no tiene la misma afinidad por los colorantes que los otros componentes celulares. De allí que la cápsula se distingue por contraste, pues los demás componentes se tiñen. Otros producen una coloración diferencial cuando la cápsula admite un colorante, por ejm. El método de Muir y de Hiss.

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Técnicas de tinción

Fundamentos

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativameute (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán.

Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el ácido tánico. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante.

Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía, son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe.

La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.


UNFV – FMHU Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaución, ya que pueden conducir a errores. Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.

Bacteria Gram positiva

Bacteria Gram negativa

Formas básicasMorfología bacteriana en una tinción GRAM

Cocos

Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la división celular. Diplococos, aparecen por pares. Estreptococoss, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran tamaño


Tiene una capa gruesa de peptidoglicano (mureina) y dos clases de ácidos teicoicos. Ácido Lipoteicoico que está en la superficie, empotrado en la capa de peptidoglicano y unido a la membrana citoplásmica. Y ácido teicoico de la pared que está en la superficie y se une sólo a la capa de peptidoglicano. El ácido Teicoico es el responsable del determinante antigénico del organismo.

Tiene una capa delgada de peptidoglicano (mureina) unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido. En el lipopolisacárido, la porción de lípido está embebida en el fosfolípido y el antígeno O polisacárido está en la superficie. El lípido se llama Lípido A y es tóxico, pero el lipopolisacárido entero se llama Endotoxina. La pared de la célula tiene poros llamado Porines para el transporte de substancias de peso molecular bajo. Entre la membrana citoplásmica y la pared celular hay un espacio periplásmico con enzimas hidrolíticas, enzimas inactivadoras de antibióticos y proteínas de transporte.

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forma esférica: se llama

Coco

División a lo largo del mismo plano, formando cadenas cortas División a lo largo de

2 planos diferentes: Tétradas

División a lo largo de 3 planos

2 cocos juntos: Diplococos

4 - 20 en cadenas: Estreptococos

regularmente: Sarcinasirregularmente: Estafilococos

Bacilos

Grandes variaciones morfológicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos.

Esp irales

(Treponemas, Borrelias...)

Forma espiral rígida se llama: Espirilo

Si la espiral es flexible y ondulada se llama: Espiroqueta

Utilizamos el término Pleomorfismo para referirnos a la adopción de diferentes formas en una misma especie.

Tinción GRAM: Bacterias Gram-Positivas

Cocos Gram-positivos

Racimos: forma típica de Staphylococcus sp, como S. aureus


Forma de vara: se llaman Bacilos

Dos bacilos juntos: Diplobacilos

Cadenas de bacilos: Estreptobacilos

Empalizadas, Bacilos lado con lado o en figuras en X, V o Y

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Cadenas: forma típica de Streptococcus sp, como S. pneumoniae, Streptococcus grupo B

Tetradas: forma típica de Micrococcus sp

Bacilos Gram-positivos

Gruesos: forma típica de Clostridium sp, como C. perfringens, C. septicum.


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Finos: forma típica de Listeria sp

Ramificados: forma típica de Actinomycetes y Nocardia, como A. israelii

Tinción GRAM: Bacterias Gram-Negativas

Cocos Gram-negativos

Diplococos: forma usual de Neiseria sp, como N. meningitidisTambién Moraxella sp y Acinetobacter sp aparecen con morfología de diplococos.Acinetobacter puede ser pleomórfico, y a veces aparece como coco Gram-positivo.


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Cocobacilos: forma usual de Acinetobacter sp, que puede ser Gram-positivo o Gram-negativo, y, a menudo, Gram-variable.

Bacilos Gram-negativos

Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae, como E. Coli

Cocobacilos: forma usual de Haemophilus sp, como H. influenzae


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Curvados: forma usual de Vibrio sp, como V. cholerae, y Campylobacter sp, como C. jejuni

Forma de aguja fina: forma usual de Fusobacterium sp

PRÁCTICAPRÁCTICA

66Guía de Prácticas de Microbiología Médica 2011 39

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Evaluación de antibióticos por el métodoEvaluación de antibióticos por el método disco difusión.disco difusión.

I. EXPERIMENTO N°1:

Evaluación de antibióticos por el método disco difusión.

1. Materiales: Cultivo de S. aureus, E. coli. Disco de antibiograma para gram + y gram -. Placas petri con agar nutritivo TSA.

Mechero, asa de kolle, hisopo estéril.

2. Procedimiento: Sembrar con hisopo estéril en la superficie de las placas cada sp. Asépticamente colocar con pinzas los discos de antibiograma en cada placa. Incubar por 24 hrs. a 37°C y dibujar los resultados.

II. CUESTIONARIO

1.- Fundamente los resultados obtenidos.

Los cinco mecanismos básicos del efecto antibiótico

Inhibición de la síntesis de la pared celular. Alteración de la membrana celular. Inhibición de la síntesis de los ácidos nucleicos. Inhibición de la síntesis de proteínas. Actividad antimetabólica o antagonismo competitivo.

Clasificación de los antimicrobianos por su mecanismo de acción

I. Antimicrobianos que actuan sobre la sintesis de la pared celular


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Antimicrobianos -lactámicos: (Penicilinas, Cefalosporinas, Monobactámicos, Carbapenems, Inhibidores de la -lactamasas)

Antimicrobianos glucopéptidosBacitracinaFosfomicina

II. Antimicrobianos que actuan sobre la membrana citoplasmática

Polimixinas

III. Antimicrobiano que inhiben la sistesis proteica

Aminociclitoles: (Espectinomicina, Aminoglicosidos)MacrólidosLincosamidas

TetraciclinasAnfenicolesMupirocinaSinergistina

IV. Antimicrobianos que inhiben la sintesis de ácidos nucleicos

FluoroquinolonasRifamicinas

Nitroimidazoles

V. Antimicrobianos que interfieren vias metabólicas

SulfamidasTrimetoprima

PASSulfonas

VI. Antimicrobianos inhibidores de ácidos micolicos

El Antibiograma

¿Por qué realizar un antibiograma?

El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de una cepa bacteriana que se sospecha es la responsable de una infección a uno o varios antibióticos. En efecto, la sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos para la eficacia in vivo de un tratamiento antibiótico. El antibiograma sirve, en primer lugar, para orientar las decisiones terapéuticas individuales.

El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolución de las resistencias bacterianas. Gracias a este seguimiento epidemiológico, a escala de un servicio, un centro de atención médica, una región o un país, es como puede adaptarse la antibioterapia empírica, revisarse regularmente los espectros clínicos de los antibióticos y adoptarse ciertas decisiones sanitarias, como el establecimiento de programas de prevención en los hospitales.

Hay pues un doble interés: Terapéutico y epidemiológico.

¿Cuándo realizar un antibiograma?

Siempre que una toma bacteriológica de finalidad dìagnóstica haya permitido el aislamiento de una bacteria considerada responsable de la infección.

Establecer esta responsabilidad exige una colaboración entre el bacteriólogo y el clínico. En efecto, en ciertas circunstancias, el microbiólogo no podrá determinar con certeza que el aislamiento de una bacteria exige un antibiograma, sin los datos clínicos que le aporta el médico. Por ejemplo, una bacteria no patógena puede ser responsable de la infección de un enfermo inmunodeprimido o en un lugar determinado del organismo. La presencia de signos clínicos puede ser también determinante para la realización de un antibiograma (por ejemplo: la infección urinaria con un número reducido de gérmenes).


UNFV – FMHU Sensibilidad bacteriana a los antibióticos

La determinación de la Concentración Inhibidora Mínima (CIM) es la base de la medida de la sensibìlidad de una bacteria a un determinado antibiótico. La CIM se define como la menor concentración de una gama de diluciones de antibiótico que provoca una inhibición de cualquier crecimiento bacteriano visible. Es el valor fundamental de referencia que permite establecer una escala de actividad del antibiótico frente a diferentes especies bacterianas.

Hay diferentes técnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de rutina, y de manera semicuantitativa, las CIM (métodos manuales y métodos automatizados o semiautomatizados). Estos diferentes métodos de rutina permiten categorizar una cierta cepa bacteriana en función de su sensibilidad frente al antibiótico probado. Esta cepa se denomina Sensible (S), Intermedia (I) o Resistente (R) al antibiótìco.

Para un determinado antibiótico, una cepa bacteriana es, según la NCCLS:

Sensible, si existe una buena probabilidad de éxito terapéutico en el caso de un tratamiento a la dosis habitual.

Resistente, si la probabilidad de éxito terapéutico es nula o muy reducida. No es de esperar ningún efecto terapéutico sea cual fuere el tipo de tratamiento.

Intermedia, cuando el éxito terapéutico es imprevisible. Se puede conseguir efecto terapéutico en ciertas condiciones (fuertes concentraciones locales o aumento de la posología).

Ciertas moléculas son representativas de un grupo de antibióticos. Los resultados (S, I, R) obtenidos con estas moléculas pueden ser ampliados a los antibióticos del grupo, que en ese caso no es necesario ensayar (Ejemplo: Equivalencia entre la cefalotina que se ensaya y las restantes cefalosporinas de 1ª generación que no es necesario probar, ya que el resultado puede deducirse del obtenido en la cefalotina).

Este hecho permite ensayar un número reducido de antibióticos, sin limitar por ello las posibilidades terapéuticas.

Interpretación de un Antibiograma

Cìertos mecanismos de resistencia se expresan débilmente in vitro, cuando se inscriben en el DNA bacteriano. Su expresión en el organismo, en donde las condiciones en cuanto a medios son diferentes, expondría al riesgo de fracaso terapéutico. Para evitar esto, el antibiograma debe ser interpretado de manera global a fin de descubrir, a través de la comparación de las respuestas para cada antibiótico, un mecanismo de resistencia incluso débilmente expresado. Así, gracias a la interpretación, una cepa que aparece como falsamente sensible será categorizada como I o R (Ejemplo: Una cepa de Klebsiella pneumoniae productora de BLSE puede aparecer sensible in vitro a las cefalosporìnas de 3" generación. El resultado de Sensible debe ser corregido a Intermedio o Resistente, ya que la utilización de estos antibióticos correría el riesgo de provocar un fracaso terapéutico).


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PRÁCTICAPRÁCTICA

77Destrucción e inhibición deDestrucción e inhibición de

microorganismos. Efecto de lamicroorganismos. Efecto de la concentración de iones H+, PH. Efectoconcentración de iones H+, PH. Efecto

del calor. Acción oligodinámica dedel calor. Acción oligodinámica de metales pesados.metales pesados.

I. EXPERIMENTO Nº 1:

Efecto de la Concentración de iones H+

El pH de una solución es el valor negativo del logaritmo en base 10 de su concentración de iones hidrógeno en mol x lt.

pH = - log H +

Según Bronsted y Lowry (1923), un ácido se caracteriza por su tendencia a perder H+, mientras que una base se caracteriza por su tendencia a asociarse con H+. Por lo tanto, los ácidos aportan con una concentración determinada de H+.Aplicando la fórmula encontraremos que a mayor concentración de H +, menor pH (mayor acidez).

El pH puede ejercer una acción bactericida según la concentración de hidrógenos y la especie de la bacteria sometida a dicho pH.

1. Materiales: Cepas de E.coli o Estafilococo en suspensión Reactivos: HCL 1.0N y NAOH 1.ON Medio de Cultivo: Caldo Peptonado.

2. Procedimiento: Es tres tubos con caldo de cultivo estériles, realizar la siembra de E. coli en asadas. A cada tubo agregarle gota HCL 1.0N, NAOH 1.0 N hasta que en los tubos se obtengan los

siguientes pH: 2 y 9 respectivamente. El tercer tubo servirá de control. Volver a taponar los tubos e incubar a 37ºC por 24 hrs. Después de este tiempo, leer por

turbidez.

Lectura: Tubo 1:

Tubo 2:

Tubo 3:

II. EXPERIMENTO 2:


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Efecto del calor

1. Materiales: Cepas de E.coli o Estafilococo Equipo: Baño María y estufa Medios de cultivo: caldo peptonado

2. Procedimiento: Empleando tres tubos de caldo peptonado, realizar la siembra de E.coli. Someter a dos de los tubos a la acción del calor por baño María, graduando en 40ºC y

100ºC por 10 minutos respectivamente. El tercer tubo no se somete a la acción del calor para que sirva de control.

Retirar los tubos del baño María e incubar los tres tubos a 37ºC por 24 horas. Realizar la lectura por turbidez.

III. EXPERIMENTO Nº 3:

Acción oligodinámica de los metales pesados.

Las sales solubles de mercurio, arsénico, plata, cobre y otros metales pesados, alteran la actividad enzimática formando mercáptidos con grupos sulfhidrilo de residuos de cisteína. La reacción inicial es reversible, y si se agregan grupos SH extraños en forma de glutation o tioglicolato de na, muchas de las células se recuperan. La capacidad de unión de los mercuriales se extiende en un amplio rango de ligandos a demás de los grupos que contienen SH, por ejemplo carboxilados, fosfatos y aminas.

1. Materiales: Cepas de E. coli ó Estafilococo Reactivo: Mercurio Cromo. No3Ag al 1% Medios de cultivo: caldo peptonado Equipo: Estufa

2. Procedimiento: Realizar la siembra de una cepa de E. coli en dos tubos de caldo y en dos placas con Agar

nutritivo hacer la siembra en toda la superficie del agar. A uno de los tubos, agregarle 5 a 10 gotas de mercurio cromo o nitrato de plata. El otro

constituye el control. Incubar a 37ºC por 24 horas. La lectura se hace por turbidez en la siembra en caldo y por

halo de inhibición en agar.

Principales métodos de esterilización

Agentes físicos Agentes químicos- Calor seco

Flameado Incineración Horno de Pasteur

- Calor húmedo Autoclave Tindalización

- Radiaciones ionizantes- Luz ultravioleta- Filtración

- Oxido de etileno- Formaldehido- Glutaraldehído


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Principales desinfectantes y antisépticos

Derivados argénticos Derivados mercuriales Agua oxigenada Permanganato potásico Derivados clorados Derivados yodados

Alcoholes Fenoles Clorhexidina Detergentes aniónicos Detergentes catiónicos Glicoles

Algunos instrumentos de esterilización por calor

AUTOCLAVE: Consta de una caldera de cobre batido estañada interiormente protegida por una camisa metálica también de cobre. En su base está instalada la fuente calórica (gas o electricidad). Posee además un manómetro, una válvula de seguridad, un termómetro y una llave.

APARATO DE ARNOLD- KOCH: Aparato para la esterilización por el calor húmedo. Consta de un cilindro de doble pared con tapa, una criba como apoyo y agua por debajo de la placa cribosa.

HORNO PASTEUR: Muy utilizado en la esterilización en calor seco. Consiste en un cilindro de triple pared, revestido de planchas de asbesto.

Pasos para esterilizar al vapor

Paso 1: Descontamine, limpie y seque todo instrumental y demás objetos que se vayan a esterilizar.

Paso 2: Abra o desconecte todo instrumento y demás objetos articulados, tales como hemóstatos y tijeras, y desmonte los que sean de componentes múltiples o corredizos. Esto permite que el vapor llegue a tocar todas las superficies del objeto las superficies.

Paso 3: Si hay que envolver el instrumental y demás objetos antes de esterilizarlos al vapor, utilice dos capas de papel, papel de periódico o tela de algodón o muselina (no use tela de lona). No se deberán meter los instrumentos y demás objetos en recipientes encerrados. Si se emplean cilindros, hay que asegurarse de que estén abiertos los agujeros del cilindro.

Paso 4: Arregle todos los paquetes, cilindros u objetos sin envolver en la recámara del autoclave de manera que el vapor se circule libremente.

Paso 5: Nota: Las unidades de presión indicadas en el manómetro variarán según el autoclave individual. Las siguientes cantidades de presión (que son equivalentes aproximados) indican la presión correcta para la esterilización al autoclave.

15 libras por pulgada cuadrada 106 kPa (106 kilopascales) 1 atm (1 atmosphere) 1 kgf/cm2 (1 kilograma de fuerza por centímetro cuadrado) 776 mm Hg (776 milímetros de mercurio)

Paso 6: En los autoclaves automáticos, se apagará la calefacción y la presión empezará a bajar una vez que se complete el ciclo esterilizante. En los autoclaves que no sean automáticos, hay que apagar la calefacción o quitar el autoclave de la fuente de calor, después de 30 minutos para los objetos envueltos, y después de 20 para los objetos sin envolver. Espere hasta que se indique "cero" en el manómetro antes de abrir el autoclave. Abra la puerta o la tapa para dejar que se escape el vapor que quede. Deje los paquetes del instrumental u otros objetos en el autoclave hasta que se sequen completamente, lo cual puede tardar hasta 30 minutos.


UNFV – FMHU Paso 7: Usando pinzas esterilizadas, saque del autoclave los paquetes, cilindros u objetos sin envolver. Para impedir que se ocurra la condensación después de sacar los objetos del autoclave, hay que ponerlos en una superficie acolchada de papel o tela esterilizados y dejar que se enfríen. Espere a que los paquetes, cilindros u objetos lleguen a bajar a la temperatura ambiente (lo cual puede tardar varias horas) antes de almacenarlos.

Paso 8: Guarde los objetos correctamente. Es tan importante guardar los objetos correctamente como lo es esterilizarlos correctamente: Objetos envueltos. Bajo condiciones óptimas de almacenaje y al tocarlos mínimamente, se considerarán esterilizados los objetos envueltos correctamente con tal de que se mantengan íntegros y secos. Para almacenar los objetos de modo óptimo, encierre los objetos esterilizados en armarios que estén en áreas secas o de baja humedad, de temperatura moderada y por las que no pase mucha gente. Si hay cualquier duda de que si un paquete está esterilizado o no, habrá que considerarlo contaminado y volver a esterilizarlo.


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PRÁCTICAPRÁCTICA

8 8Limpieza de la piel y antisepsia cutánea.Limpieza de la piel y antisepsia cutánea.

I. EXPERIMENTO Nº 1:

1. Materiales (Observación del crecimiento): Placa petri (3) con agar nutritivo o TSA dividido en 2 sectores cada uno Isopos de algodón estéril (3) Solución antiséptica, alcohol yodado Un tubo con caldo nutritivo estéril

2. Procedimiento: En el sector 1 toque con sus dedos varias zonas, lavase las manos con agua y jabón séquese

y toque con sus el sector 2, lavase las manos por segunda vez y toque el sector 3 lavase las manos por tercera vez y toque el sector 4.

En otra zona de su piel aplique el desinfectante por 2 minutos sobre esta zona humedezca con caldo nutritivo y siembra esta con el hisopo estéril en la zona 5. Aplique el desinfectante por dos minutos más y repita lo anterior para sembrar en el sector 6.

Incube a 37°C por 24 hrs. observe y comente los resultados.

II. CUESTIONARIO

1.- Fundamente los resultados obtenidos.

Nociones básicas

Se considera como medio séptico cuando existen microorganismos patógenos, mientras que el medio será aséptico cuando está exento de ellos.

Cuando el medio séptico quiere transformarse en aséptico, se precisa realizar una desinfección.

Si se quiere obtener un determinado medio exento de microorganismos patógenos, se podría conseguir de dos formas diferentes. Una adoptando medidas que impidan la llegada de éstos hasta ese medio. La segunda consistirá en la eliminación de los microorganismos patógenos presentes. Estas acciones diferentes han dado origen a dos conceptos diferentes:

Asepsia: conjunto de procedimientos que impiden la llegada de microorganismos patógenos a un medio.

Entre las medidas generales de asepsia que se pueden utilizar en el hospital, se pueden citar: técnicas de aislamiento; indumentaria adecuada; cámaras de flujo laminar; desinfección; formación sanitaria del personal

Antisepsia: acciones que conducen a la eliminación de los microorganismos patógenos presentes en un medio.


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Para conseguir estos fines se utilizan los antisépticos, que son sustancias germicidas de baja toxicidad que pueden utilizarse en la piel y tejidos vivos, y los desinfectantes, germicidas de mayor toxicidad que se emplean para objetos, ambiente y superficies.

Entre los antisépticos más utilizados en la práctica quirúrgica, se encuentran: compuestos yodados, fundamentalmente la Povidona yodada (derivado orgánico); los alcoholes, fundamentalmente el etílico y el isopropílico, de propiedades idénticas; la clorhexidina, como solución acuosa alcohólica; el hexaclorofeno, fenol que se puede utilizar como los anteriores para la preparación de piel para cirugía, desinfección de manos.

Los desinfectantes más utilizados en la actualidad son: compuestos de cloro (cloro gas; hipoclorito de calcio; clorinato sódico; solución acuosa de hipoclorito); ácidos-álcalis; aldehidos, fundamentalmente dos: glutaraldehido y formaldehido (formalina, solución acuosa al 40%; glutaraldehido, solución acuosa al 2%). Se utilizan para esterilización de objetos sensibles al calor: citoscopios, laparoscopios, instrumentos manchados de sangre; instrumentos de hemodiálisis; fenoles, se utilizan para la desinfección de objetos, superficies y ambientes. Se pueden utilizar para paredes y suelos de quirófano, salas de partos, cuidados intensivos.


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I II I U N I D A DU N I D A D

Inmunología


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PRÁCTICAPRÁCTICA

1 1 FagocitosisFagocitosis

Casi desde principios de la historia de la bacteriología médica, la fagocitosis ocupa un lugar muy importante en la resistencia a las enfermedades infecciosas.

Existen células capaces de ingerir y digerir muchos tipos de organismos que logran penetrar en el cuerpo, sin necesitar la ayuda inmunitaria especifica del sistema linfoide. Los macrófagos y los fagocitos mononucleares participan fundamentalmente en el fenómeno de Fagocitosis.

Ciertas sustancias que facilitan la velocidad con que son fagocitados las bacterias y otros agentes infectantes son las OPSONINAS.

I. FAGOCITOSIS IN VITRO

1. Materiales: Cultivo de Candida albicans 5cc de sangre fresca con anticoagulante Wintrobe 1cc Una jeringa de 5cc. Baño María Pipeta Pasteur Colorante de Wright. Agua tamponada Colorante rojo de congo al 1% Láminas portaobjetos y cubreobjetos, microscopio. Aceite de cedro.

2. Procedimiento: Obtener 5ml de sangre fresca, agregar sol. Wintrobe 1cc y agitar Agregar al tubo con sangre 2cc de caldo de Candida albicans Incubar a 37ºC por 30’ , luego centrifugar Con una pipeta Pasteur retirar de la interfase plasma, sangre, la capa leucocitaria. Depositar una gota en una lámina con una gota de rojo congo. Cubrir con laminilla

cubreobjetos. Observar microscopio Depositar otra gota en una lámina portaobjeto y extender como para hemograma y

colorear con Wright Observar al microscopio

II. FAGOCITOSIS IN VIVO

1. Materiales: Cepa de Candida albicans. Jeringa hipodérmica de 1cc. 1 Pericote.

2. Procedimiento: Inocular 0.5cc de Candida albicans vía intraperitoneal al pericote. A las 24 h. autopsiar al pericote y hacer improntas de hígado, corazón, líquido

peritoneal: colorear con Wright. Observar al Microscopio.


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Fagocitosis y muerte de una bacteria.

Etapa 3-4: aumento respiratorio.Etapa 5: lesión por acción de intermediarios oxígeno reactivos.Etapa 6-7: lesión por acción de peroxidasas, proteínas Catiónicas, lisozimas, lactoferrina.


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PRÁCTICAPRÁCTICA

2 2Reacciones: Antígeno-AnticuerpoReacciones: Antígeno-Anticuerpo

I. EXPERIMENTO Nº 1:Reacción de precipitación

La reacción de precipitación ocurre cuando un anticuerpo IgG divalente reacciona con una antígeno polivalente soluble. La precipitación es el resultado de la formación de grandes complejos Insolubles de moléculas interconectadas de antígeno y anticuerpo.

La precipitación se forma en la zona óptica de equivalencia entre el antígeno y el anticuerpo. La inmunoprecipitación es el método mas simple y directo para la demostración de la reacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio.

Precipitación en tubo Capilar: (Determinación de PCR)La proteínas C reactiva no se encuentra normalmente en la sangre, sino que aparece en los estadios iniciales o las enfermedades caracterizadas por cambios inflamatorios. Es serológicamente diferente de las proteínas normales y puede ser detectada prontamente su presencia con un antisuero especifico para la proteínas C.

1. Materiales: Tubos capilares 1x80 mm. Suero Suero problema Bases de plastilina

2. Procedimiento: Un tubo capilar es sumergido dentro del suero anti PCR, dejar que el líquido se eleve de

25 a 30 mm dentro del tubo capilar. Es esencial que el tubo capilar sea sumergido en el antisuero primero para evitar contaminación del mismo con el suero del paciente.

Coloque el dedo sobre el extremo superior del capilar y sáquelo del antisuero Sin remover el dedo del extremo superior del tubo capilar, sumerja el capilar dentro del

suero del paciente deje que un volumen igual del suero del paciente penetre al capilar. Es importante que el antisuero y el suero del paciente estén en contacto. Deben ser evitadas las burbujas del aire.

Invierta el tubo capilar varias veces para lograr la mezcla de los sueros, coloque el dedo en un extremo dejando un espacio de aire alrededor de 1 cm en el extremo opuesto.

Inserte los tubos en la base de la plastilina, estando seguros que el final de la columna de suero esté alrededor de 1 cm por encima del bloque.

Coloque en la incubadora a 37º durante dos horas. También se permite dejar el tubo a la temperatura ambiente si no hay incubadora

disponible. Si la proteína C reactiva está presente en el suero del paciente, un precipitado será

percibido al cabo de 3 minutos y un informe cualitativo puede ser hecho en este tiempo. Continúe la incubación por espacio de 2 horas en total, y entonces coloque dentro de la

refrigeradora heladera a 0 - 6ºC durante la noche y a la mañana siguiente puede hacer la lectura final.


UNFV – FMHU LECTURA:

Deberán ser realizadas examinando los capilares frente a una luz, sin necesidad de usar un fondo de contraste especifico. El colorante presente en el antisuero acentúa cualquier precipitado antígeno-anticuerpo, permitiendo una lectura fácil.

Las lecturas pueden ser clasificadas de la siguiente manera:

NO PRECIPITADO NEGATIVO

1mm de precipitado Una cruz

2mm de precipitado Dos cruces

3mm de precipitado Tres cruces

4mm de precipitado Cuatro cruces

5mm de precipitado Cinco cruces

6mm de precipitado Seis cruces o más

REFERENCIA:

Inmunodifusión Simple (Ouchterlony)

Esta prueba actualmente no vigente se basa en una reacción de Ag-Ac. y como resultado forma precipitados en la zona de equivalencia.

Si sobre la superficie quieta de un líquido aplicamos una gota de cualquier colorante, observamos que esta se difundirá de manera uniforme en todas las direcciones del seno del líquido, si en vez de utilizar este medio empleamos un gel, esta difusión se hará en forma más lenta y uniforme.

Este principio junto con la propiedad que tienen los anticuerpos de formar precipitados con sus respectivos antígeno. Se aplican en el estudio de las proteínas del plasma enfrentándolas con antisueros específicos para ellas. Lo que condiciona en el lugar de contacto de los bordes de la difusión es la formación de bandas de precipitación, si la concentración y velocidad de difusión de ambas sustancias son iguales.

Los resultados se interpretan como: Identidad total, Identidad Parcial o No Identidad.


UNFV – FMHU a) Identidad Total: Línea de confluencia obtenida con do antígenos que no pueden distinguirse por el antisuero utilizado.b) Identidad Parcial: Formación de espolón por tratarse de antígenos parcialmente relacionados con una determinante común “x” pero determinantes individuales “y” y “z” que reaccionan con una mezcla de anticuerpos dirigida contra “x” e “y”. El antígeno con determinantes “x” y “z” sólo puede precipitar anticuerpos dirigidos contra “x”. Los anticuerpos remanentes (Ac y ) cruzan la línea de precipitina para reaccionar con el antígeno de la cubeta adyacente que contiene determinante “y”, dando origen a un espolón sobre la línea de precipitina.c) Cruce de líneas formadas por antígenos no relacionados.

II. EXPERIMENTO Nº 2: Reacción de Aglutinación Bacteriana

La aglutinación es un fenómeno inmunológico producto de una reacción ANTIGENO-ANTICUERPO en el que uno de los reactantes, el antígeno, es de naturaleza particulada de tamaño grande, que no le permite formar suspensiones coloidales o soluciones en medios acuosos (antígeno insoluble). Estas partículas pueden ser bacterias, eritrocitos partículas de látex, bentonita, etc. y se encuentran recubiertas en formas natural o artificial por antígenos o anticuerpos. Al ser suspendidas en un medio salino y mezclarse con antisueros o antígenos específicos, formaran los respectivos complejos Ag-Ac, observables a simple vista o con lentes de poco aumento.

Aglutinación bacteriana:Existen muchos métodos comúnmente empleados para demostrar la aglutinación bacteriana. Uno de los más simples es la aglutinación microscópica en lámina de una suspensión de bacterias de salmonella tiphy con suero positivo (con anticuerpos ant-salmonella). A esta prueba se le denomina Prueba de Widal.

1. Materiales: Una lámina para aglutinación con espacios marcados. Sueros problemas de pacientes. Un set de antígenos para aglutinación en lámina: Tifico “O”, Tifico “H”, paratifico “A”,

paratifico “B”. 4 pipetas estériles Palillos mondadientes

2. Procedimiento:A. CUALITATIVAS

Con la pipeta coloque una gota de suero problema en cada uno de los espacios marcados (50 mL).

Agregar una gota de cada uno de los antígenos a cada uno de las gotas de los sueros problema de un mismo paciente, proceda del mismo modo con los otros sueros.

Mezclar uniformemente con un mondadiente distinto para cada gota. Haga rotar suavemente la lámina durante 3 - 5 minutos.

La aglutinación se observa por la aparición de grumos de tamaño variable, que tienden a agruparse en la periferie de la gota.

Anotar el resultado.

ANTÍGENOS O H A B

SUERO (50 mL)

Resultado: Cualitativo: 1+, 2+, 3+, ....


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B. SEMICUANTITATIVO Preparar diluciones colocando cantidades decrecientes de suero: 0.04 (40 ml), 0.02 (20

ml), 0.01 (10 ml) y 0.005 (5 ml). Agregar el antígeno que resultó positivo en el cualitativo. Ejemplo: “O” somático: positivo 3+

SUERO

40 mL 20 mL 10 mL 5 mL

DILUCIONES 1/40 1/80 1/160 1/320

RESULTADOS

Resultado: Es la mayor dilución donde aún existe aglutinación. Ejemplo: “O” 1/160


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PRÁCTICAPRÁCTICA

3 3Hemoaglutinación determinada: GrupoHemoaglutinación determinada: Grupo

SanguíneoSanguíneo

La superficie de los eritrocitos contiene un gran número de determinantes antigénicos que son productos directos o indirectos de los genes. Estos determinantes antigénicos se clasifican en grupos sanguíneos. Dentro de cada grupo sanguíneo los antígenos parecen que se heredan como producto de un solo gen o de un grupo de genes íntimamente ligados.

Grupo ABO.- En 1900. Landstelner público su observación de un patrón consistente en la aglutinación de las células sanguíneas del humano por otro suero humanos. Las células de personas A eran aglutinadas por el suero de los individuos del suero B y viceversa. Las células de algunas personas (grupo O) no eran aglutinadas por ningún suero. Estas personas tenían anticuerpos contra A y B. Poco después el cuarto AB fue hallado. El suero de la sangre AB no tiene anticuerpos contra A ni contra B.

Isohemaglutinación:

GRUPO SANGUINEO ISOANTIGENO ISOANTICUERPO

O Ninguno Anti A y B

A A Anti B

P B Anti A

AB A y B Ninguno

La determinación de grupos en el sistema ABO es rápida y simple: los tipos son rápidamente determinados con adición de un suero tipo conocido, por medio del método de aglutinación en lámina. El suero tipo se prepara en conejo y son cuidadosamente adsorbidos hasta que sean altamente específicos y no den reacción cruzada con antígeno de otra sangre de diferente grupo. Además en los eritrocitos aproximadamente el 85% a 90% de la población existe un antígeno Rhesus (Rh) (D) que no tiene normalmente aglutininas pero que es importante su conocimiento en inmunoterapia e inmunopatología.

1. Materiales: Suero Anti. A. Anti B y Anti D (Rh) Algodón, alcohol yodado, lancetas y portaobjetos

2. Procedimiento: Utilizando la lanceta punzar un dedo limpiando previamente el pulpejo con alcohol

presionando el dedo haga caer tres gotas de sangre sobre una lámina portaobjetos. A una de ellas añadirles una gota de suero anti-A, a la otra una gota de suero anti B y a

la tercera agregarle una gota de suero anti-D. Mezcle cada muestra con un palillo mondadiente diferente.

Continuar mezclando con movimientos giratorios a la lámina durante unos minutos: la aglutinación se observa generalmente de 2 a 3 minutos, se aprecia fácilmente por la presencia de grumos consistentes en grandes conglomerados de eritrocitos. Su ausencia indica reacción negativa.


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1. Interpretación:Sistema ABO

SUERO ANTI-A SUERO ANTI-B GRUPO SANGUINEO

Positivo Positivo AB

Positivo Negativo A

Negativo Positivo B

Negativo Negativo O

Sistema Rh

SUERO Rh (Anti-D) GRUPO Rh

+ Positivo

- Negativo

- (falso) Variante Du


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Donación de Sangre


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PRÁCTICAPRÁCTICA

44Poder bactericida del sueroPoder bactericida del suero

El suero normal fresco contiene sustancias capaces de destruir a los microorganismos. Se sabe que en parte esta actividad es debida a la presencia de anticuerpos normales, pero está también la presencia de factores humorales. Por ejemplo el suero fresco no calentado contiene una sustancia conocida como COMPLEMENTO, el cual bajo ciertas condiciones juega un rol importante en la destrucción de los microorganismos. Esta sustancia puede ser destruida si el suero es primeramente calentado a 56º por 30’.

El propósito de esta práctica consiste en demostrar los efectos combinados de las sustancias antes mencionadas sobre algunas bacterias patógenas comunes.

1. Materiales : 4 Tubos 16x150; 6 tubos 13x100 4 Pipetas de 1 ml (1/10); una pipeta de 10ml (1/10) 1 Jeringa de 10ml con agua 20x1 Cultivo en caldo de Escherichia coli Solución salina estéril 100ml (CINa 0.85%) Agar nutritivo licuado; repartido en 9 tubos con 10ml c/u 9 Placas de Petri Baño María a 35º Baño María a 56º

2. Procedimiento:

Valiéndose de la jeringa extraer 10ml de sangre venosa. Obtener el suero por centrifugación.

La mitad del suero obtenido llevarlo al Baño María a 56º por 30’. Conservar la otra mitad.

Preparar 3 diluciones de caldo de cultivo con el microorganismo en sol. salina estéril (1:104, 1:105, 1:106) tal como sigue.

A. 1.0ml de 1:10,000 en 9ml de sol, salina.................1:100.000 B. 1.0ml de 1:10,000 en 9ml de sol, salina.................1:1’000.000

CUIDADO: Esté seguro de usar algodón protector en la pipeta cuando maneja gérmenes patógenos.

Repartir soluciones obtenidas (A y B) 0.5ml de c/u en 3 juegos de 3 tubos A los tres primeros tubos añadirles 0.5ml de suero normal, a los siguientes tubos

añadirles 0.5ml de suero calentado a 56º y a los tres últimos añadirles 0.5ml de sol. salina (control).

Mezclar el contenido de los tubos e incubar a baño maría por una hora a 37º Después de incubados vertir el contenido de cada tubo en Petris estériles marcándolos

con lápiz de cera Añadir 10ml de Agar fundido a 45º en cada Petri y agitar suavemente con el propósito

de distribuir en forma pareja los microorganismos en el medio Después que el agar se halla solidificado, incubar todas las placas en forma invertida

por 24 hs.


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LECTURA E INTERPRETACIÓN

Después de la incubación marcar cuidadosamente aquellas placas que tengan no menos de 30 ni mas de 300 colonias. Las que no se encuentren dentro de estos límites deben ser descartadas: Hacer comparaciones. Registrar los resultados y explicarlos.

Número de Colonias

Escherichia coli Suero normal Suero calentado Solución Salina

1:104

1:105

1:106

CUESTIONARIO

1.- ¿Cuáles son los factores del complemento responsable de la citólisis?2.- ¿Qué tipo de anticuerpos han actuado en el experimento?3.- ¿Porqué el agar fundido en el momento de añadirlo a la placa Petri debe estar a una temperatura de

45º?4.- ¿Qué sucedería si el paso Nº6 del experimento incubamos por 24 hrs?5.- Si en un animal de experimentación inoculamos por vía endovenosa 0.5ml. de cada una de las

diluciones preparadas de Escherichia coli. ¿Cómo podría comportarse en cada caso?6.- Después de una Proctosigmoidoscopia, una extracción dentaria o una debridación de abscesos, se

produce pasaje de bacterias al torrente circulatorio. ¿Porqué no se produce septicemia?


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PRÁCTICAPRÁCTICA

55

Prueba de Fijación de ComplementoPrueba de Fijación de Complemento

Este procedimiento emplea dos sistema Antígeno-Anticuerpo. La prueba consiste en colocar primero el Antígeno específico y el Anticuerpo en cuestión, conjuntamente con el complemento y luego, en un segundo paso, aplicar el sistema indicador consistente en Eritrocitos de carnero y suero de conejo antieritrocito de carnero (hemolisina). Si el complemento está presente en el momento de añadir el sistema indicador, quiere decir que el primer sistema no lo utilizo en su reacción y por tanto los eritrocitos de carnero son hemolisados. Si el primer sistema empleó complemento, es decir lo fijó, al añadir el segundo sistema, la hemólisis no se producirá por la ausencia de complemento libre en la mezcla.

1. Materiales: Suero problema, positivo y negativo: Inactivados a 56ºC por 30 min. Antígeno: Adenovirus en solución. Buffer de Mayer Complemento (suero de cobayo) Sistema Hemolítico: mezcla de partes iguales de eritrocitos de carnero al 2% y

Hemolisina Tubos de Kahn (8) Pipetas de 1 ml (8)

2. Procedimiento: Diluir 0.2 ml de cada uno de los sueros con 0.8 ml de Buffer de Mayer. Se obtiene así

una dilución de 1/5. Rotular un tubo e Kahn para el suero problema y cuatro (4) tubos más para control

positivo, control negativo control de antígeno y control de sistema hemolítico. Añadir a cada tubo los siguientes reactivos en el orden señalado

SP C+ C- CAg CSH

Suero Problema (1/5) 0.2 ml -.- -.- -.- -.-

Suero Positivo (1/5) -.- 0.2 ml -.- -.- -.-

Suero Negativo (1/5) -.- -.- 0.2 ml -.- -.-

Antígeno 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml -.-

Complemento 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml -.- -.-

Buffer de Mayer 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.4 ml 0.5 ml

Incubar todos los tubos a 37º en Baño María por 15 minutos Añadir a cada tubo 0.3 ml del sistema hemolítico Incubar todos los tubos en Baño María a 37ºC por 15’


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LECTURA

Observa la presencia o ausencia de hemólisis en cada uno de los tubos los controles deben dar la siguiente lectura:

Control positivo No hemólisis

Control negativo Hemólisis

Control del antígeno: No hemólisis

Control del Sistema Hemolítico: No hemólisis

Anotar el resultado del suero problema: .......................................


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Prueba de Inmunoensayo: Test Elisa paraPrueba de Inmunoensayo: Test Elisa para VIHVIH

El Test ELISA para HIV se basa en un inmunoensayo absorbente enzimático ligado para la detección de anticuerpos al virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 y 2 en suero humano o plasma. La prueba se realiza en tres tiempos:

1.- Incubación de la muestra problema2.- Incubación del conjugado3.- Incubación del sustrato

En los micropozos se encuentran una combinación de cuatro antígenos recombinantes de los virus HIV 1 y 2 relacionados a la envoltura y al core del virus HIV.

1. Materiales: Suero problema del paciente Placas con micropozos ELISA Conjugando: Antígeno-Ig G humano marcado con una enzima Sustrato: TMB (Tetrametilbenzidina) H2SO4 4N Micropipetas de 50 ul.. 100ul Buffer isotónico, baño maría y/o estufa a 37ºC Lector ELISA Lavadora de placas de ELISA

2. Procedimiento:* Como paso previo debe tratarse todos los reactivos a temperatura ambiente.

a) Añadir 150 ul. de muestra problema y controles a los pocilos correspondientesb) Cubrir los micropozos con un adhesivoc) Incubar a 37ºC durante 1 hr.d) Aspirar y lavar todos los pocillos cinco veces con tampón de lavadoe) Añadir 200 ul. de conjugado a todos los pocillosf) Incubar a 37ºC durante 1 hr.g) Aspirar y lavar todos los pocillos cinco veces con tampón de lavadoh) Añadir 200 ul. de solución sustrato a todos los pocillosi) Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 min.j) Añadir 50 ul. de ácido sulfúrico 4N a todos los pocillos para detener la reacciónk) Realizar la lectura de los micropozos en un lector ELISA

NOTA: Esta práctica se realizara en forma demostrativa.


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PRÁCTICAPRÁCTICA

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Test Antiestreptolisina “O” (ASO)Test Antiestreptolisina “O” (ASO)

NEUTRALIZACION: DE LA ESTREPTOLISINA “O”Una de las funciones inmunitarias más importantes mediadas por anticuerpos específicos es la neutralización de toxina. Estos anticuerpos específicos llamados “Antitoxinas” tienen el papel principal la inmunidad adquirida a enfermedades graves como difteria, tétanos. etc.

Casi todas las cepas de estreptococo grupo A producen dos factores hemolíticos: estreptolisinas “O” y “S” (exotoxinas). Cuando ocurre una infección por estreptococos de este grupo, la estreptolisina “O”, no asi la “S”, estimula el desarrollo de un anticuerpo específico: la antiestreptolisina “O”, dicho anticuerpo bloquea la hemólisis por estreptolisisna “O”. Este fenómeno proporciona las bases para la determinación cuantitativa del anticuerpo.

La determinación de los títulos séricos de antietreptolisina “O” tiene gran importancia por su valor diagnóstico en paciente que tienen o han tenido recientemente una infección por estreptococo hemolítico del grupo A, sobre todo por las secuelas que estas infecciones incluyen: fiebre, reumática, glomerulonefritis, eritema nodoso.

Por la frecuencia de infecciones estreptocócicas se encuentran títulos bajos de Antiestreptolisina “O” en casi todos los individuos. Se considera títulos normales de Antiestreptolisina “O” de 40 a 160 Unidades Todd.

La Estreptolisina “O” en su forma reducida, agregada a Glóbulos rojos, producen hemólisis, si el suero de un paciente posee Antiestreptolisina “O” al añadirse la Estreptolisina se produce una reacción Antígeno- Anticuerpo y el anticuerpo neutraliza al antígeno total o parcialmente según el nivel de anticuerpo presente si una cantidad constante de Estreptolisina (Antig..) se agrega a cantidades cada vez menores de suero y si el anticuerpo (ASO) presente es suficiente para neutralizar el antígeno no habrá hemólisis cuando se agregue glóbulos rojos, cuando el Ag.excede al Ac. de exceso de Estreptolisina causará hemólisis. El Titulo de ASO es reciproca de la mayor dilución de suero que impide la hemólisis de los glóbulos rojos.

FUNDAMENTO DEL TEST ANTIESTREPTOLISINA “O”En el suero del paciente enfermo se encuentran los anticuerpos circulantes de tipo antiestreptollina en el cual al unirse a un antígeno de una fase sólida (látex) va a producir una reacción complejo Ag-Ab que se va a traducir por la presencia de una aglutinación del látex.

En caso de un paciente negativo a este anticuerpo no ocurrirá la reacción de aglutinación.

1. Materiales: Suero problema del paciente Antígeno fase sólida absorbida en látex Suero control positivo Suero control negativo Diluyente Palillos Placas de reacción


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2. Procedimiento: Colocar 5º ul. de suero problema en un circulo de la placa. Colocar 50º ul. de suero control positivo y negativo en cada uno de los círculos

restantes. Agregar a cada uno de ellos 1 gota (50 ul.) del antígeno látex, mezclar suavemente. Agitar en forma rotativa por 3 min. Leer en busca de una reacción de aglutinación.

Nota: Se debe descartar la prueba en caso de observar aglutinación inapropiada con los controles positivo y negativo.

CUESTIONARIO :

1. ¿Qué función tienen los glóbulos rojos en esta prueba?2. ¿Qué otras pruebas de laboratorio se conocen para el diagnóstico de fiebre reumática?3. Explique por qué se inhibe la hemólisis en la determinación de la ASO4. Explique por qué se utilizan glóbulos rojos “O” Rh + en la determ. de ASO.

Significancia Clínica

La antiestreptolisina -O- (ASO.) es una exotoxina producida por el estreptococo B-hemolítico (grupo A) la cual tiene la capacidad de hemolizar los glóbulos rojos de varias especies. La estreptolisina - O tiene capacidad antigénica resultando en la producción por parte del organismo de anticuerpos antiestreptolisina –O.La determinación de los niveles de ASO es un método universalmente aceptado para el diagnóstico de diversas enfermedades por infección de estreptococo tales como la fiebre reumática y glomerulonefritisLa concentración de ASO en individuos normales varia ampliamente. Después de la fase aguda de una infección por estreptococo, el titulo comienza a aumentar en alrededor de dos semanas llegando a sus niveles máximos en cuatro a seis semanas, manteniéndose alto por un periodo de tiempo relativamente prolongado. En pacientes con fiebre reumática. se encuentra un título elevado en más de 90% de los casos, títulos mantenidos por sobre las 500 unidades se consideran como evidencia de fiebre reumática.La determinación de la concentración de ¡a ASO en forma aislada es de relativa utilidad. por lo cual se recomienda la repetición de la prueba a Intervalos de 10 a 15 días. Si se observa un aumento progresivo de los títulos obtenidos, es posible concluir que se está frente a una infección reciente. Por otra parte, la disminución subsecuente de los títulos es un índice claro de recuperación


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PRÁCTICAPRÁCTICA

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Prueba de Mantoux (HipersensibilidadPrueba de Mantoux (Hipersensibilidad tardía)tardía)

Reacción al polvo de casaReacción al polvo de casa (Hipersensiblidad inmediata)(Hipersensiblidad inmediata)

I. EXPERIMENTO N° 1: Hipersensibilidad TardiaEs una intradermorreación en la que se usa un filtrado de cultivo de bacilos tuberculosos conocido como Derivado Proteico Purificado” (PPD). Si existen linfocitos sensibilizados a este antígeno, dan lugar a la aparición de pápula y eritema en la zona inyectada, en un lapso de 24 horas a 48 horas.

1. Materiales: 1 Jeringa de tuberculina con aguja Nº 25 PPD 50 U.I x mm Algodón y Alcohol Regla milimetrada

2. Procedimiento:

Limpiar una zona de la piel

antebrazo y aplicar con la jeringa 0.1 ml de PPD (5UI) por vía intradérmica.

3. Lectura:

Después de 24 a 48 horas de la aplicación se efectúa la lectura de la respuesta inflamatoria producida la cual estará en relación con la mayor o menor sensibilidad del organismo a este tipo de antígeno.


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4. Tipo de Respuesta:

Eritema, edema y necrosis central Positivo ++++

Eritema acentuado y edema de más de 20 mm Positivo +++

Eritema y edema de 10 a 20 mm Positivo ++

Eritema y edema de 5 a 10 mm Positivo +

Leve eritema e indicios de edema de 5mm o menos Dudoso

Solo se aprecia el lugar de inoculación de el agua Negativo

DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSIS POR LAPRUEBA DE MANTOUX

¿Por qué debe hacerse la prueba de Mantoux?La prueba de la Mantoux puede mostrar si la persona ha sido infectada con las bacterias causantes de la tuberculosis.

¿Quién necesita hacerse la prueba?- Personas que hayan tenido contacto diario muy cercano con alguien que tenga la tuberculosis

activa. - Personas que tengan síntomas de tuberculosis tales como cansancio constante, pérdida de

apetito, fiebre, sudores nocturnos, pérdida de peso, tos persistente. - Personas que tienen un sistema inmunológico débil o problemas de salud.

¿Qué cuidados se debe tener después de la prueba?- NO cubrir el lugar del pinchazo con una curita. - NO rascarse el brazo, si pica, ponerse una compresa fría.- Puede lavarse el brazo y secarlo dándose palmaditas, pero NO debe frotárselo.

¿Qué significa un resultado negativo?Esto puede significar que la persona no ha sido infectada con las bacterias que causan la tuberculosis. Puede significar que a la persona le hicieron la prueba muy pronto después de haber inhalado las bacterias. El cuerpo reacciona a la prueba de la tuberculina unas cuantas semanas después de haberse infectado con las bacterias. En este caso, la prueba debe repetirse después de tres meses.

¿Qué significa un resultado positivo?Esto significa que las bacterias que causan la tuberculosis están en su cuerpo. A pesar de que la persona está infectada con las bacterias de la tuberculosis, esto no significa que tenga la enfermedad

PPD

DefiniciónPPD (Derivado Purificado de Proteína) es un examen selectivo estándar para la tuberculina, un antígeno que causa tuberculosis. La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa crónica de los pulmones.Razón para el procedimientoUna PPD se da habitualmente a todas las personas admitidas como un enfermo hospitalizado. No requiere una PPD si se ha tenido una reacción positiva en el pasado o si tiene prueba que se ha tenido una PPD en los últimos tres meses.


UNFV – FMHU Procedimiento Una aguja diminuta se usa para inyectar una cantidad pequeña de solución líquida bajo la piel en su brazo. En 2 ó 3 días una enfermera verá si hay alguna reacción a la prueba.Una reacción es positiva si un abultamiento cerca del tamaño de un borrador de lápiz o más grande aparece en su brazo. A menudo rojez también se desarrolla en el sitio en el que la inyección se dio. Estas reacciones significan que usted sido expuesto(a) a la tuberculosis en algún momento en el pasado. No significa que tiene TB. Otras pruebas incluyendo una radiografía del tórax (rayos X del pecho) se hacen para ver si usted en realidad tiene TB. Si se tiene una reacción positiva al PPD, a menudo es tratada(o) con el medicamento INH (Isoniazida) por 6 a 9 meses. El propósito de estas pastillas (tomadas una vez al día) es destruir los gérmenes de TB en su cuerpo y prevenir que usted desarrolle TB en realidad.

II. EXPERIMENTO N° 2: Sensibilidad al Polvo de CasaEs una reacción de hipersensibilidad de tipo inmediata. Es positiva en los pacientes que presentan mastocitos sensibilizados en IgE especifica contra este antígeno.

Una vez el sistema inmunitario de un atópico ha comenzado a producir IgE contra alérgenos la nueva IgE producida se va a ir anclando en la superficie de células que tengan receptores para IgE en su superficie. Los mastocitos están presentes en el tejido conectivo de muchos tejidos. Dado que estas células tienen receptores para IgE pueden recoger en su superficie la IgE producida por los linfocitos B. Cuando los alérgenos acceden a un tejido como la mucosa respiratoria, los que sean específicos de las IgEs presentes en la superficie de los mastocitos, se unirán y conducirán a la activación del mastocito. La activación del mastocito conduce a la liberación de diferentes mediadores (Histamina, leucotrienos, TNF-a que van a tener diferentes efectos sobre vasos sanguíneos, bronquios e intestinos. Todo esto conduce a una reacción de hipersensibilidad inmediata que puede producir broncoconstricción, liberación de mucus y que pone en marcha el mecanismo de una posterior reacción retardada a las pocas horas.

1. Materiales: 1 Jeringa de tuberculina con aguja N° 25 Antígeno: Polvo de casa en solución Algodón y alcohol Regla milimetrada

2. Procedimiento: Limpiar una zona de la piel antebrazo e inyectar por vía intradérmica 0.1. ml de la

solución de polvo de casa.

3. Lectura: Observa la aparición de mácula y pápula a los 15.30 y 60 minutos después.


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Reacciones de Hipersensibilidad

TIPO I

TIPO III


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PRÁCTICAPRÁCTICA

88Shock AnafilácticoShock Anafiláctico

La práctica consiste en una anafilaxia generalizada y suele obtenerse en el laboratorio inyectando una pequeña dosis de antígeno a un animal (dosis sensibilizante), y algunos días más tarde, otra dosis intravenosa de antígeno (dosis desencadenante).

En el hombre este fenómeno es más complejo desde el punto de vista fisiopatológico y recibe el nombre SHOCK ALERGICO.

1. Materiales: 1 Cobayo Jeringa de Tuberculina Suero de caballo 1:100 ó albúmina de huevo 1:10 en sol. salina (Antígeno)

2. Procedimiento:

Inocular un cobayo por vía intraperitoneal con 1 ml de la solución del antígeno a elección.

Después de 10 a 20 días inyectar por vía intracardiáca 1 ml de dicha solución de antígeno.

RESULTADOS:

Las manifestaciones de la anafilaxia varían según la especie, pues varía también el órgano de choque afecta en el cobayo, a los pocos minutos de la inyección del antígeno (dosis desencandenante) en animal empieza ara estornudar, toser, quizás presenta convulsiones, e incluso colapso y muerte.

CUESTIONARIO:

1.- ¿Qué debe hacerse antes de inyectar por vía intravenosa por primera vez cualquier medicamento?2.- Investiga en algún hospital por una Historia Clínica donde un paciente haya presentado Shock

anafiláctica. presentar un resumen del caso3.- ¿Qué valor tiene la aplicación de antihistaminicos después de producido el shock anafiláctico?


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SHOCK ANAFILÁCTICO

Definición: Síndrome clínico grave, súbito y adverso de etiología variada con relación a los agentes desencadenantes, con mecanismos inmunológicos implicados en su fisiopatología, que se manifiesta por síntomas y signos aislados o combinados, fatales en muchas ocasiones si no se diagnostican y tratan urgentemente. Fisiopatología:La anafilaxia proviene tras la exposición a una proteína externa que activa la generación de un anticuerpo especifico de la clase de Inmunoglobulina IgE. Estas moléculas de IgE se unen rápidamente a los mastocitos y basófilos, estimulando la degranulación de estas células para la liberación masiva de mediadores preformados como la histamina, triptasa, quininas, factor de activación de plaquetas y metabolismo del ácido araquidónico especialmente leucotrienos.Para que se produzca la anafilaxis es necesario que el individuo haya estado expuesto al antígeno antes y que haya sintetizado una gran cantidad de anticuerpos IgE específicos.En una siguiente exposición puede producirse una reacción de hipersensibilidad inmediata.Los medicamentos del tipo de las penicilinas, derivados y antibióticos relacionados con esta familia, así como los sueros heterólogos figuran como las causales más frecuentes de las severas reacciones de anafilaxia. Diagnóstico:Se basa en el antecedente de la exposición a algún alergeno externo y los signos y síntomas clínicos caracterizados por congestión de los tejidos y edema.Los signos y síntomas son derivados de:1. Shock circulatorio:

HipotensiónAlteraciones de la frecuencia cardíaca (Bradicardia o taquicardia en dependencia del

estadio de la afección)Palidez marcadaSíncope

2. Obstrucción de las vías aéreas superiores:Edema de la Epiglotis y laringeEstridor respiratorioTiraje supraesternal

3. Broncoespasmo:DisneaPolipneaTiraje supraesternal e infraesternal, intercostal y subcostal Respiración de KusmaullHipersecreción pulmonar(edema)Sibilancias

4. Síntomas cutáneos:SudoraciónPalidez EritemaUrticariaPrurito

5. Síntomas gastrointestinales:Dolor AbdominalDiarreasNáuseas Vómitos

6. Síntomas neurológicos:CefaleaMareosConfusión mental


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Convulsiones Alteraciones de la conciencia de diversa severidad (Somnolencia, Estupor, Letargo,

Coma)

Diagnóstico diferencial:Reacción anafilactoide: Histaminoliberadores inespecíficos, degranulación de basófilos

y mastocitos, no existe reacción antígeno – anticuerpo. Se activa el complemento (C3A, C5A) por inhibición de la síntesis de Prostaglandinas

Coma hipoglicémico (Ayunas, ejercicios violentos, etc)IMAReacción Vasovagal

Conducta a seguir:Una vez efectuado el diagnóstico de anafilaxis se procederá al tratamiento inmediato, cuyo objetivo fundamental será garantizar la vida del paciente, para lo cual se tomaran las siguientes medidas de urgencia:

Posición de shock: Colocar al paciente en posición supina con las extremidades inferiores elevadas

Mantener vías aéreas permeables (pudiendo ser necesarias la entubación pulmonar para la respiración asistida o mecánica y/o la traqueotomía según lo merite el caso).

Canalización una vena profunda para la administración de los medicamentos necesarios. Mantener estables los parámetros vitales tales como frecuencia cardíaca, temperatura,

tensión arterial, frecuencia respiratoria, PVC, Monitoreo constante, etc.Realizar una evaluación del estado de los gases e iones en el organismo por medio de

una gasometría e ionograma, corrigiendo las alteraciones que pudieran presentarse.Realizar un balance de los líquidos corporales.Proceder a la extracción de muestra de sangre además para conocer el estado de los

elementos formes de la sangre, grupo sanguíneo y factor Rh.

El tratamiento específico se realizará simultáneamente y consiste en:

Adrenalina acuosa (amp. 1ml)-1:1000, administrar:

EdadNiños de 2 a 6 años

Niños de 6 a 12 años

Usar 0.5 ml diluido en 10cc de Solución Salina Isotónica, EV lento(2 o 3 min)Adultos

Dosis(cc)

0.15 ml

0.2 ml

0.3-0.5ml/10-15’, hasta un total de 2 cc

Si existiera colapso venoso, pudiera utilizarse la vía intramuscular ó subcutáneaPudiera utilizarse Epinefrina acuosa a 5 mg en 500 ml de Solución Salina EV a goteo

según la tensión arterial, en los casos de severidad.El Shock Anafiláctico debe tratarse en el lugar donde ocurra, de disponerse de los

medicamentos indispensables. Sólo después de la recuperación de los signos vitales debe procederse a su remisión, siempre acompañado de un personal médico y enfermera.


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Si es producido por la picadura de insectos se aplicará un torniquete por encima de la picadura; en la zona de esta se administrará la Epinefrina de 0.1 a 0.3 en forma circular cuatro punturas, de ser posible se debe extraer el aguijón sin exprimir.

Tratamiento complementario:

Antihistamínicos: a)Difenhidramina(EV o IM): (amp. 20 mg en 2 ml)

Niños: 5 mg/Kg./24 horas Adultos: 25-50 mg c/6 horas. b)Cimetidina: (amp. 300 mg en 2 ml) 4mg/Kg/dosis, sin exceder los 2 g

En casos prolongados de anafilaxia pueden utilizarse como terapia los corticoesteroides por vía parenteral a razón de: a)Prednisona(EV): (Bbo. 60 mg en 3cc ó 5cc) Niños: - Menores de 1 año = 10mg/Kg/dosis c/6 u 8 horas- De 1 a 14 años = 20mg/Kg/dosis c/ 6 u 8 horas Adultos: 60 mg c/8 horas. b)Hidrocortisona(EV): (Bbo. 100-500 mg en 3cc ó 5cc) Niños: 15 mg/Kg/dosis c/6 u 8 horasAdultos: 100 mg c/8 horas

Si persiste el broncoespasmo administrar: a)Broncodilatadores: Aminofilina(EV): Niños: 5-7 mg/ Kg/24 horas Adultos: 250 mg (1amp.) lento de 10-20 minutos, puede repetirse la dosis cada seis horas.

Si la hipotensión persiste puede añadirse a la venoclisis un suplemento de Dopamina o Norepinefrina.

También se pueden utilizar expansores de volumen Albúmina o Dextrán para el tratamiento de la hipotensión persistente.

Prevención de la Anafilaxis: 1. Efectuar una Historia Clínica Farmacológica antes de administrar cualquier medicamento.2. Administrar los medicamentos por vía oral siempre que sea posible, reservar la vía parenteral para los casos en que sea indispensable.3. Observar al paciente durante 30 minutos después de la administración de un fármaco por vía parenteral.4. Si se descubren antecedentes de hipersensibilidad, se deben efectuar pruebas cutáneas, si no se dispone de un medicamento alternativo.5. El paciente debe conocer y llevar en todo momento una tarjeta de alerta médica.


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I I II I I U N I D A DU N I D A D

BacteriologíaAplicada


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BACTERIOLOGÍA APLICADABACTERIOLOGÍA APLICADA

La Bacteriología aplicada estudia al microorganismo como agente causal de la enfermedad y el espécimen clínico del paciente.

Los especimenes clínicos, son sustancias que son evacuadas o expulsadas por el individuo enfermo. Estos especimenes clínicos contienen a los microorganismos y a partir de ellos se inicia el estudio, observando primeramente sus características físicas para luego realizar las pruebas bacteriológicas y bioquímicas correspondientes, tendientes a identificar al microorganismo causante del mal.

Son ejemplo de especimenes clínicos: el esputo, la orina, el pus, secreción faríngea, LCR, etc.

Selección de medios primarios de aislamiento para muestrasde diferentes sitios del organismo

Fuente de la muestra Bacterias patógenas potenciales

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Garganta Streptococcus pyogenes xEsputo Streptococcus pneumoniae x x x

Aspirado transtraqueal Haemophilus influenzae x x x xStaphylococcus aureusKlebsiella pneumoniaeBacterias anaerobias

Orina Escherichia coli x xKlebsiella spp.

Proteus mirabilisPseudomonas aeruginosa

Estreptococos grupo DHeridas y abscesos Staphylococcus aureus x x x x

Escherichia coli y otrosbacilos "entéricos"

Streptococcus pyogenesBacteroides fragilis,

Clostridium perfringens y otras bacterias anaerobias

Estreptococos grupo DHeces Salmonella spp. x x x x

Shige//a spp.Escherichia coli

(enterotoxigénica)Staphylococcus aureusYersinia enterocolitica

Uretra/cérvix Neisseria gonorrhoeae xLiq. Cefaloraquideo Neisseria meningitidis x x x

Streptococcus pneumoniaeHaemophilus influenzae


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Fuente de la muestra

Bacterias patógenaspotenciales

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Ojos y oídos

Neisseria gonorrhoeae

x x x x

Hemophilus spp.Staphylococcus aureusStreptococcus pyogenes

Pseudomonas aeruginosaMoraxella spp.

Liq.de articulaciones

Neisseria gonorrhoeae

x x x xStaphylococcus aureus

Escherichia coli y otras especies de enterobacterias

Moraxella spp.

HE, Hektoen Enteric; XlD, xilosa, lisina, desoxicolato; ss, Salmonella-Shisel/a GN, Gram negativo

BAGG, buffer oLida glucosa glicerol; SF, Srreprococcus faecalis

Medios especializados requeridos para aislar agentes infecciosos poco frecuentes

Fuente de la muestra

Diagnóstico presuntivo

Bacterias Patógenas Medios de aislamiento

Garganta

Laringitis y epiglotitis

obstructiva agudaHaemophilus influenzae

Agar chocolate o agar de Casman con sangre equina.

Colocar disco de baci- tracina (10 /Lg) en el área de inoculación

Faringitis membranosa

Corynebacterium diphteriae

Medio de loefflerAgar de TinsdaleTelurito de sodio

Hisopado nasofaringeo

Tos terina Bordetella pertussisAgar patata de

Bordet-Gen- gou

Esputo

Tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis

Medio delowenstein-Jensen

Otras micobacteriasMedio 7H-11

de Middlebrook

Micosis pulmonarBlastomyces dermatitidis u otros hongos dimorfos

Agar infusión de cerebroy corazón con y

sin cicloheximida y cloramfenicol (C&C)

Sangre, médula ósea o biopsia de

tejidoBrucelosis Brucella spp.

Agar Brucella (mantener los cultivos durante 3 semanas)

Orina Leptospirosis Leptospira spp.Medio semisólido

de Fletcher

Heces CóleraVibrio comma Medio de peptona alcalina

Vibrio parahaemolyticusAgar tiosulfato-citrato sales biliares-sucrosa

(tcbs)

Cualquier fuente de

bacterias anaerobias

Abscesos paramucosales

o profundos

Bacteroides fragilis y otras especies

anaerobias

Agar sangreAgar sangre con

antibióticos: neomicina, vancomicina, kanamicina, gentamicina

Agar sangre-alcohol feniletlico

PRÁCTICAPRÁCTICA


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1 1Estudio del Estafilococo, Estreptococo yEstudio del Estafilococo, Estreptococo y

NeumococoNeumococo

Espécimen clínico: Pus (traída por los estudiantes)Secreción faringea (obtenida de estudiantes voluntarios)Esputo

Cepa conservada de: Stafilococcus AureusStreptococcus B HemolíticoNeumococos o Streptococcus Neumoníae

Materiales de Laboratorio: Mechero, asa de kolle, lámina porta, batería de coloración Gram, microscopio óptico, isopos estériles.

Medios de Cultivo: Agar manitol salado, Agar sangre, Agar DNA, Agar azida, Caldo biliado

I. PROCEDIMIENTO

Utilizando una asa de Kolle, previamente flameada, realizar la siembra del esputo por agotamiento en estría a las placas con Agar MS, Agar azida y Agar sangre.

Con el isopo estéril, tomar muestras de secreción faríngea y sembrarlo en la placa de Agar azida y Agar sangre.

En una placa con Agar DNA hacer la siembra por puntura o dibujando una Z de la cepa Stafilococo.

A partir del pus y la secreción faríngea (muestras del trabajo), efectuar extendidos en láminas porta objetos. Fijar la película de muestra a fuego lento.

Colocar la lámina con la materia de coloración Gram, siguiendo la técnica. Secar y observar al microscopio óptico, utilizando el objetivo de inmersión y una gota de aceite

de cedro. Por sus características de agrupación y coloración identificar los estafilococos, estreptococos y neumococos, que se observan en el campo microscópico.

Dibuje y coloree sus observaciones.

Especies más importantes de Stafilococcus humanos

Especie Area colonizada Capacidad patógenaCoagulasa positivos

S. aureus Fosas nasales, piel Muy frecuenteCoagulasa negativos

S. epidermidis

S. saprophyticusS. haemolyticus

S. hominisS. simulansS. capitis

S. warneri'S. cohnii

Fosas nasales, piel, axilas, oído externo, conjuntivaTracto urinario bajo

Axilas, pielPielPiel

Cabeza, brazosPielPiel

Habitual

HabitualPoco frecuentePoco frecuentePoco frecuente

RaraPatógeno rara

Rara


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Estreptococos y sus enfermedades

S. pneumoniae (&)Neumonía Sínusítis

Otitis mediaMeningitis Bacteriemía

S. pyogenes (*) ‘’(grupo A)

FaringitisPioderma

Fiebre reumáticaGlomerulonefritis

S. agalactiae (*)(grupo B)

Meningitis neonatalNeumonía neonatal

Bacteriemia neonatalSepsis posparto

Enterococcus (#)(grupo D)

Infección urinariaAbsceso abdominalInfección de heridas

Endocarditis

Grupo virídans (&)

Caries dentalBacteriemiaEndocarditis

Absceso abdominal

(*): -Hemolíticos. ‘’gral. -Hemolíticos (#): Algunos -Hemolíticos y otros No -Hemolíticos

(&): No -Hemolíticos

Diferenciación de las especies de Estafilococos

ESPECIES

S. Aureus S. Epidermidis S. SaprophyticusCARACTERÍSTICAS

Color de la colonia amarillo – blanco blanco blanco

Hemólisis en agar sangre + + / - -

Crecimiento anaerobio + + + / -

Coagulasa + - -

Fermentación de la glucosa + + +

Fermentación del manitol + - -

Novobiocina sensible sensible resistente


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Algoritmo de identificación de cocos Gram positivos

Epidemiología de la enfermedad neumocócica


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PRÁCTICAPRÁCTICA

2 2Lectura a las 24 horasLectura a las 24 horas

Observar el crecimiento de colonias en el Agar M.S. Interpretar el viraje de color del medio. En las placas de Agar sangre, observar la presencia o no de hemólisis según los especímenes

clínicos sembrados. Diferenciar los tipos de hemólisis. Para la lectura de la placa con Agar DNA, bañar previamente la superficie del Agar con una

solución al 1 N de HCI. Se observará que precipitan ciertas zonas del agar (se torna opaco), mientras que las desarrolladas se rodean de una transparencia tipo aureola.

Con su profesor de prácticas interprete sus resultados. Coger 0.5 ml de capa de neumococo y suspender en caldo biliado, a los 15 minutos observar la

lisis de las colonias de neumococos, si éstas no son lisadas no son neumococos. Inocular 0.5 ml de la suspensión de neumococo en forma intraperitoneal a un pericote y observar

su reacción. Si no muere a las 24 horas sacrificarlo y realizar improntes de hígado, corazón y líquido peritoneal. Colorear con coloración de Gram y observar al microscopio.

Dibuje o esquematice sus observaciones.

NOTA: Se entregará a los estudiantes, medio de transporte Stuart para gonococo.

Fig. Streptococus


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PRÁCTICA PRÁCTICA

33Siembra de Muestras Biológicas para elSiembra de Muestras Biológicas para el

aislamiento de Neisseriaaislamiento de Neisseria

Especímen clínico : Secreción uretral (Neisseria gonorroeae o gonococo)

Materiales : Mechero de gas, asa de Kolle, láminas porta, batería de coloración Gram, microscopio óptico y aceite de cedro.

Medios de Cultivos : Agar sangre, Agar Thayer Martín.

I. PROCEDIMIENTO

Con el asa de Kolle esterilizada a la llama y enfriada, realizar la siembra de las cepas y los especímenes clínicos en las placas de Agar Thayer Martín (para el aislamiento de Neisseria).

A partir de los especímenes clínicos y las cepas, realizar y colorearlos con el método de Gram. Trabajar con cuidado procurando no contaminarse.

Observar las láminas coloreadas con el objetivo de inmersión e identificar los microorganismos en estudio.

Esquematice o dibuje sus observaciones macroscópicas y microscópicas.

II. LECTURA

Observar las placas de Agar sangre sembradas y reconocer la presencia de algún tipo de hemólisis en alguna de las dos bacterias en estudio.

En las colonias desarrolladas en Agar Thayer Martín, realizar la prueba de la oxidasa agregando para tal efecto una gota de 2,4 paradimetilendofenolamina. Ver el cambio de color de las colonias de Neisseria. Interprete esta prueba.

Dibuje o esquematice sus observaciones.

Entrega de material para aislamiento de Brucella y Bordetella.


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Infecciones asociadas a Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae

N. meningitidisMeningitis Neumonía

ArtritisSepticemia

N. gonorrhoeae

UretritisCervicitisSalpingitisProctitis

SepticemiaArtritis

ConjuntivitisFaringítis

Enfermedad inflamatoria pélvica

Principales características diferenciales del género Neisseria

Características

Crecimiento a 22º C

Fermentación de azúcares

Especies glucosa maltosa sacarosa lactosa

N. Meningitidis - + + - -

N. Gonorrhoeae - + - - -

N. Lactámica - + / - + - +

Moraxella catarrhalis + - - - -

N. Sicca + + + + -

N. Flavescens + - - - -


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Diagnóstico de laboratorio de Neisseria gonorrhoeaeLa fiabilidad de la tinción de Gram disminuye cuando las muestras proceden de las cérvix, la faringe o el recto, doce existe contaminación con Neisserias comensales y otros microorganismos de morfología similar. Otras bacterias de crecimiento rápido puede eclipsar el crecimiento de N. Gonorrhoeae, a menos que se utilicen medios

selectivos.

1+:

2+:

3+:

4+:


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PRÁCTICAPRÁCTICA

44Estudio del Género BrucellaeEstudio del Género Brucellae

Las Brucelas son las formas más pequeñas de todas las bacterias Gram negativas, se presentan como cocobacilos o bacilos cortos de 0,5 a 2 um de ancho, no móviles, no esporulados, según Hudleson son capsulados. Son aerobios aunque a menudo su crecimiento mejora con CO 2; parásitos obligados de animales y el hombre, le causa enfermedad, que en el hombre se caracterizan por un cuadro septicémico (cuadro agudo, infección generalizada), seguido de una Fase Crónica (de localización).

Se reconocen 4 especies principales de Brucella: B. abortus, B. melitensis, B. suis y B. canis, los cuales difieren por sus caracteres metabólicos, composición antigénica, requerimientos atmosféricos, formación de H2O respuesta a los colorantes, susceptibilidad a lisis por Brucella Bacterófagos, resistencia a antibióticos, etc.

DIAGNÓSTICO DE BRUCELOSIS

Se realiza mediante:1.- Cultivo o aislamiento de Brucella: De sangre, líquidos asépticos, orina, heces o material patológico.2.- Detección de anticuerpos contra Brucella: En el suero de pacientes: PRUEBAS SEROLOGICAS.

I. AISLAMIENTO DE BRUCELLA

1. CULTIVO DE SANGRE (HEMOCULTIVO)

Es regla importante realizar esta prueba a partir de pacientes en fase aguda de la enfermedad.

Las muestras de sangre deben obtenerse antes de comenzar el tratamiento antibiótico. Nunca debe confiarse en el resultado de un solo hemocultivo, debe hacerse 3 o 4 en un lapso

de 24 horas tratando de tomar las muestras durante el episodio febril. Por la escasez de Brucella en la sangre circulante u otros líquidos corporales, los medios

líquidos son adecuados que los sólidos como primer paso en el aislamiento de estos organismos.

2. MEDIO BIFÁSICO DE RUIZ CASTAÑEDA

Es el medio de cultivo más adecuado para el aislamiento no solo de Brucella sino también en otras bacterias. Consta de un medio sólido y líquido dentro de un mismo recipiente.


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COMPOSICIÓN:

AGAR TRIPTOSA:Triptosa 20 g/LD () Glucosa 1 g/LCINa 5 g/LTiamina Dicloruro 0,005 g/LAgar Agar 13 g/LpH 7,3

CALDO TRITOSA: Triptosa 20 g/L

CINa 5 g/LDextrosa 1 g/L Frasco de CastañedaH2O esp 1 g/LpH 7,2

II. EXPERIMENTO 1Técnica de Hemocultivo

1. Materiales: Frasco con medio de Ruiz Castañeda (Preferible 2). Alcohol, tintura de yodo, ligadura, gasa estéril. Jeringa de 10cc

2. Procedimiento: Marcar los frascos con el nombre del paciente. Aplicar el torniquete con la ligadura en el brazo elegido, y limpiar vigorosamente la piel

de la zona de venopuntura elegida con algodón y alcohol, luego con gasa embebida en tintura de yodo. Dejar secar.

Quitar las tapas de los frascos y limpiar con alcohol los diafragmas de jebe. Usando jeringa estéril sacar 10cc de sangre del paciente sospechoso. Sin cambiar de

aguja distribuir 5cc en cada frasco. Colocar las tapas de los frascos. Mezclar el contenido del frasco inclinándolo suavemente 2 o 3 veces, llevar a incubar a

37°C, y 1 de los frascos en atmósfera con 10% de CO2, manteniendo los frascos en posición vertical.

A intervalos de 48 horas el frasco se inclina para que la mezcla líquida corra sobre el plano inclinado de agar (transferencia), previamente a esta operación se examina cuidadosamente el plano para observar si han crecido o no colonias sobre él.

Los cultivos de sangre para brucelosis deben incubarse 3 semanas como mínimo (preferible 28 días) antes de descartarlos como negativos.

3. Resultados: Las colonias de Brucela aparecen comúnmente después de la 3era transferencia. Si la capa de agar muestra colonias después de 24 a 48 hrs, es probable que el cultivo se

halla contaminado. Las colonias que aparecen a la 72 a 96 hrs. (entre la 1era. y la 2da. Transferencia) son generalmente Salmonellas, Estafilococos, Streptococos, Haemofilus o Coliformes.

4. Observación microscópica de Brucella: Se entregará a los alumnos láminas preparadas para ser observadas al microscopio a

mayor aumento con lente de inmersión.

5. Frotis y Tinción: Con ayuda del asa de kolle tomar una muestra de colonia sospechosa del frasco de Ruiz

Castañeda, hacer un extendido sobre un porta objeto y fijar. Teñir con tinción de Gram y observar al microscopio.


UNFV – FMHU III. EXPERIMENTO 2Identificación de especies de Brucella

La identificación de la especies de Brucella se realiza principalmente en base a la necesidad de CO2, para su crecimiento, producción de H2S, y efecto de los colorantes sobre su crecimiento.

Los medios diferenciales usados son los que contienen Fucsina y Tionina.

1. Materiales: Frasco de R.C. con colonias sospechosas. Placas de Agar con Fucsina y Tionina. Asa de Kolle, mechero. Tres tubos de caldo con cepas de B. melitensis, B. abortus y suis.

2. Procedimiento: Tomar las placas (2) de agar y con el lápiz de cera dividirla en 4 cuadrantes.

Numerarlos del 1 al 4.

1: B.m.2: B.a.3: B.s.

Col. Sospechosa Col. Sospechosa

Sembrar por estría las 3 cepas dadas en las cuadrantes 1, 2 y 3 de cada placa Tome con el asa una muestra de 1 colonia sospechosa del plano inclinado del frasco de

Ruiz Castañeda y siembre por estría en el cuadrante N° 4 de cada una de las placas. Incube a 37°C por 24 hrs.

3. Resultados :

ESPECIE FUCSINA TIONINA

B. melitensis + +

B. abortus + -

B. suis - +

Positivo: Crecimiento de colonias transparentes, superficie lisa a 5mm de diámetro.Negativo: Inhibición. Ausencia de colonias

Observe el sector 4 de ambas placas e identifique la especie de B. Aislada

4. Referencia: Diagnóstico serológico Después de ceder los síntomas agudas, los cultivos de sangre son generalmente

negativos pero para entonces ya existen en el suero del placiente anticuerpo demostrables. El principal método de diagnóstico serológico es la prueba de aglutinación

5. Materiales: Suero de paciente sospechosa Antígeno: Brucellas muertas en suspensión


1 2

3 4

1 2

3 4

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6. Procedimiento: Sobre una placa de vidrio colocar una gota del suero del paciente y luego agregar sobre

ella una gota de antígeno. Mezclar ambas gotas usando un palillo de dientes, por unos minutos.

7. Resultados:Positivo: AglutinaciónNegativo: No aglutinación

Características de la brucelosis humana

Especie Reservorio animal Síndromes clínicos

Brucella melitensis Cabras, ovejasEnfermedad aguda grave

con complicaciones (frecuente)

Brucella abortusGanado vacuno

Enfermedad leve con complicacionessupurativas (frecuente)

Brucella suisCerdos

Enfermedad crónica, supurativay destructiva

Brocella canisPerros

Enfermedad leve con complicaciones supurativas (rara)

Respuesta de anticuerpos en la brucelosis no tratada


UNFV – FMHU IV. DIAGNÓSTICO INDIRECTO


Las pruebas serológícas indican las titulaciones de anticuerpos específicos presentes en cada paciente. Las más utilizadas se comentan a continuación.

AglutinaciónEn sus diferentes modalidades, es la prueba más utilizada debido a su rapidez y sensibilidad. El aumento significativo del título de anticuerpos es la base diagnóstica de la enfermedad.

Rosa de Bengala: Utiliza como antígeno en una suspensión bacteriana a la que se ha añadido el colorante rosa de bengala, enfrentándola al suero sin diluir del enfermo. Proporciona una aproximación diagnóstica en pocos minutos con una sensibilidad y especificidad muy altas. Presenta elevado grado de correlación con la seroaglutinación y, por su simplicidad, es muy útil como prueba de despistaje inicial o screening.

Serogalutinación en tubo o placa con pocillos: Enfrenta diluciones crecientes del suero problema a una cantidad constante de B. abortus. Este antígeno reacciona tanto con anticuerpos de esa especie como frente a los de B. melitensis y B. suis, que son las tres especies responsables en la práctica de la totalidad de enfermos con brucelosis. El título positivo de 1/160 se considera, en un país endémico, el punto de corte en el diagnóstico de la enfermedad. Debido a que los anticuerpos responsables de la serogalutinación son fundamentalmente de la clase IgM, lo habitual es que vayan descendiendo en el transcurso de 3-6 meses, con o sin curación de la enfermedad.

Prueba de Coombs:Es de gran interés para el diagnóstico de la brucelosis crónica. Se utiliza para demostrar la presencia de anticuerpos aglutinantes y no aglutinantes, fundamentalmente IgG. El suero de Coombs (inmunoglobulina humana) se encargaría de facilitar la aglutinación de los anticuerpos no aglutinantes del suero problema, fijados a la suspensión antigénica de B. abortus. El título obtenido es, por ello, como mínimo el de la aglutinación y generalmente es mucho más elevado, tanto más cuanto mayor es el tiempo de evolución de la enfermedad. Pueden persistir en ocasiones de forma prolongada y con titulación elevada, incluso en pacientes con tratamiento adecuado y buena evolución clínica.

Serogalutinación tras tratamiento del suero con 2-mercaptoetanol:Es una modificación de la seroaglutinación en la que se usa solución salina al 0,85% con 0,1 M de 2-mercaptoetanol. Este compuesto es capaz de destruir las moléculas de IgM, perdiendo éstas su capacidad aglutinante, sin interferir con las de IgG que son las que se cuantifican. Se considera la persistencia de anticuerpos resistentes al tratamiento con 2-mercaptoetanol como indicativa de la actividad de la enfermedad.

EnzimoinmunoanálisisCon estas técnicas podemos detectar la presencia de los anticuerpos específicos que seleccionemos (IgG, IgM o IgA), con unos valores excelentes de sensibilidad y especificidad El antígeno absorbido sobre placas de poliestireno es, fundamentalmente, el lipopolisacárido de brucelas en fase lisa. Los anticuerpos IgM, por su rápida desaparición son valorables, pero no puede olvidarse los anticuerpos IgG pueden persistir en sujetos curados. Aunque permiten conocer una mayor precisión el perfil de las inmunoglobulinas en el curso de la enfermedad, tampoco ofrecen la posibilidad de establecer un criterio para discernir entre curación y evolución a cronicidad.

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PRÁCTICAPRÁCTICA

5 5Estudio de los Géneros Haemophilus yEstudio de los Géneros Haemophilus y

BordetellaBordetella

I. EXPERIMENTO 1

Género Haemophilus

Son bacilos gram negativos que requieren para su crecimiento factores presentes en sangre denominados X y V. Existen cepas más virulentas que son conformados por organismos encapsulados y que son responsables de los cuadros invasivos como meningitis bacteriana aguda en niños, y cepas de organismo no encapsulados que están asociados a infecciones crónicas del aparato respiratorio; estos organismos cultivados de LCR o esputo en el primer o segundo casos van a dar colonias lisas o rugosas respectivamente.

El medio apropiado para su crecimiento es el agar chocolate. En agar sangre el crecimiento es escaso por la presencia en él de inhibidores; sin embargo en este medio puede crecer alrededor de las colonias de estafilococo, ya que este último germen le proporciona el factor V, a estos se llama Fenómeno de Satelitismo.

3. Materiales: Agar sangre Cepa de estafilococo Cepa de haemophilus Agar chocolate

4. Procedimiento: Sembrar por estría en toda la superficie de la placa de agar chocolate la cepa de

Haemophilus. Incube a 37°C por 24 horas con 10% de CO2

Haga lo mismo en la placa de agar sangre, e inmediatamente siempre por puntura en diferentes zonas de la placa el estafilococo.

Haemophilus

ESTAFILOCOCO

AGAR CHOCOLATE AGAR SANGRE

Incubar A 37°C por 24 horas.


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5. Resultados: Observe y anote en su cuaderno de práctica las características de las colonias de

Haemophilus obtenidas en la placa de agar chocolate. En la placa de agar sangre observe el fenómeno de satelitismo

II. EXPERIMENTO 2

Género Bordetella

Son bacilos gram negativos pequeños, capsulados, aerobios estrictos, que incluye 3 especies de los cuales la más importante es la B. pertuasis responsable de una enfermedad aguda localizada en vías aéreas caracterizada por tos paroxística denominada “Tos quintosa”.

Para el diagnóstico de esta enfermedad es fundamental el aislamiento del germen a partir de la secreción bronquial o nasofaringe.

1. Material: Medio de Bordet Gengou

2. Procedimiento: Abrir placa acercándola a más o menos 15 cm de la boca de un niño sospechoso de

tener la enfermedad (tos ferina), en el momento del acceso. Tapar la placa. Incubar a 37°C por 24 hrs

3. Resultados: Observe y grafique en su cuaderno de práctica las características de las colonias.

Especies Bordetella y sus enfermedades

Género Especies Enfermedad

Bordetellapertussis

parapertussisbronchiseptica

Tos ferinaTos ferina

Enfermedad broncopulmonar

Presentación clínica de la tos ferina


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Especies de Haemophilus que se asocian con las enfermedades humanas

Especie Enfermedad primaria Frecuencia

H. influenzae Neumonía, sinusitis, otitis, conjuntivitis, meningitis, epiglotitis, celulitis, bacteriemia

Frecuente

H. ducreyi Chancroide Infrecuente (en EE.UU.)

H. aphrophilus Endocarditis, infecciones oportunistas Infrecuente

H. para influenzaeBacteriemia, endocarditis, infecciones

oportunistasRaro

H. haemolyticus Infecciones oportunistas Raro

H.parahaemolyticus Infecciones oportunistas Raro

H.paraphrophilus Infecciones oportunistas Raro

H. segnis Infecciones oportunistas Raro

Las infecciones por H. influenzae tipo B suelen ser invasivas, la meningitis, epiglotitis, celulitis, artritis y conjuntivitis son las que se declara mas a menudo. Los cultivos de LCR y sangre (en meningitis) son gral. positivos a menos que halla recibido tratamiento antibiotico.


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PRÁCTICAPRÁCTICA

66Aislamiento de Entero-PatógenosAislamiento de Entero-Patógenos

CoprocultivoCoprocultivo

1. Materiales: Medio de transporte: Cary y Blair (CB) Isopo Medio Mac Conkey (MC) Medio Desoxicolato citrato (DC) Caldo Selenito (CS) Asa bacteriológica en argolla

2. Procedimiento: La muestra en el medio de transporte (CB) se sembrará según indicaciones del profesor

de prácticas en los medios de aislamiento primaria. Para estas prácticas se usará: el (MC) y el (DC).

Sembrar el medio de enriquecimiento (CS), siguiendo las indicaciones del profesor Incubar a 37°C por 24 hrs.

3. Comentario: Los enteropatógenos actúan por invasividad, pudiendo llegar hasta la sangre. También

lo hacen por toxigenicidad en ambos casos es posible el aislamiento del agente a partir de las heces. Sin embargo un solo medio de cultivo no es suficiente para aislar todos los agentes de infecciones entéricos, siendo necesario el uso de varios medios de cultivo para el aislamiento primario y otros tantos para el aislamiento previo enriquecimiento. En nuestras prácticas se incidirá mayormente en ENTEROBACTERIACEAE.

I. DIFERENCIACIÓN BIOQUIMICA

1. Materiales: Placas con colonias en (MC – DC) Tubos de TSI (5) Tubos de LIA (5) Papel para indol (5) Caldo selenito sembrado Placas con SS agar Asa en aguja

2. Procedimiento: Estudiar las características de las colonias en los diferentes medios de cultivo Con el asa en aguja picar la colonia escogida y repicar por una sola vez en TSI hasta el

fondo y con el mismo inóculo repicar por tercera vez en el espesor del medio LIA hasta el fondo.

Colocar el papel para indol en el tubo de LIA Sembrar con el asa en argolla el medio SS agar a partir del selenito Incubar a 37° C por 18 - 24 horas.

3. Comentario:La prueba bioquímicas permiten diferenciar a los patógenos de otros inocuos. Estas pruebas son básicas y previas al estudio o paso siguiente que son las pruebas serológicas. El medio TSI tiene


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como sustrato: la glucosa (1%), lactosa (10%) y sacarosa (10%) además se puede leer la producción de H2S y la producción de gas a partir de los azúcares usados.

Identificación presuntiva y rápida, de bacterias entéricas gramnegativas

Fermentación rápida de lactosa

Fermentación lenta de lactosa

Sin fermentación de lactosa

Echerichia coli: brillo metálico sobre medio diferencial; dotado de motilidad; colonias no viscosas, aplanadas.

Enterobacter aerogenes: colonias elevadas, sin brillo metálico; con frecuencia mótiles; crecimiento más viscoso.

Klebsiella pneumoniae: muy viscoso, crecimiento mocoide, no mótil

Edwardsiella

Serratia

Ctitrobacter

Arizona

Providencia

Erwinia.

Especies de Shigella: carentes de motilidad, no forman gas a partir de la gluscosa.

Especies de Salmonella: dotado de motilidad; generalmente forman ácido y gas a partir de la glucosa.

Especies de Proteus: swarming sobre agar; hidrólisis rápida de la urea (olor amonacal).

Especies de Pseudomonas: pigmentos solubles, fluorescencia azul – verdosa; olor dulzón.

Familia Enterobacteriaceae – TSI

GAS (+) GAS (-)

H2S (+)

SalmonellaArizona

EdwardsiellaCitrobacter

Proteus

Salmonella typhi

H2S (-)

EcherichiaEnterobacter

KlebsiellaProvidencia serratiaSalmonella paratifica

ShigellaYersiniaProteus

Providencia serratiaEscherichia enterobacter

El medio LIA tiene como sustrato principal a la Lisina la cual puede ser desaminada, descarboxilada o bien no ser lisada. Como sustrato diferencial este medio tiene glucosa (1%). Según estas indicaciones se puede observar las siguientes divisiones.

INDOL (+) INDOL (-)

DESCARBOXILACIONEscherichia coli

Edwarsiella

Salmonella typhiArizona

Klebsiella serratiaEnterobacter

DESAMINACIONProteus vulgaris

ProvidenciaProteus mirabilis

NEGATIVO

CitrobacterYersiniaShigella

Escherichia coli

YersiniaSerratiaShigella

Enterobacter


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Tabla para identificación de Enterobacterias

Citrato de Simon

´sGas H2S Indol Lisina Motilidad Ornitina Sacarosa Ureasa Lactosa Gelatinasa Glucosa

Citrobacter + + V V - + V V V V - +

Edwardsiella - + + + + + + - - V - +

Enterobacter + + - - V + + + V + - / V +

Echerichia V + - + + V V V - + - +

Klebsiella V V - V V - - V V + - +

Morganella - V - + - + + - + - - +

Proteus V V V V - + V V + - + +

Providencia + V - + - + - V V - - +

Salmonella V V V - V + V - - - - +

Serratia + V - V V + V V - V V / + +

Shigella - - - V - - V - - - - +

Yersinia - V - V - - V V V V - / V +


UNFV – FMHU II. DIFERENCIACIÓN SEROLÓGICA

1. Materiales: Cultivo sospechoso de Salmonella typhi Cultivo sospechoso de Salmonella paratyphi B Cultivo sospechoso de Salmonella paratyphi A Cultivo sospechoso de Shigella Láminas de vidrio 1x3 (5) Suero polivalentes y agrupadores de Salmonella y Shigella Suero fisiológico formolado Asa en argolla Depósito con mezcla sulfocrómica Lápiz de vidrio.

2. Procedimiento: Marcar con el lápiz de vidrio 4 cuadrados por lámina Colocar en la parte superior del cuadrado una gota de suero fisiológico formolado. Tomar con el asa una pequeña porción del cultivo en TSI o LIA y suspender

homogéneamente en la gota suero fisiológico formolada. En el lado opuesto colocar una gota del suero polivalente Mezclar ambas gotas con el asa y leer a contra luz. Registrar los resultados y proseguir con los otro sueros hasta determinar serogrupos.

3. Comentario: UTILIZANDO LOS SUEROS ESPECIFICOS (ANTICUERPOS) se puede determinar

hasta serotipos. La reacción antígenoanticuerpo es de aglutinación. La determinación serológico de las bacterias tienen gran utilidad epidemiológica

serológica y clínica. Según la pruebas serológicas se puede determinar las siguientes reacciones en SALMONELLA.

POLV. A B C1 C2 D E

S. Typhi +++ - - - - ++ -

Salmonella newport +++ - - - ++ - -

Salmonella para tiphy A +++ ++ - - - - -

SHIGELLA

A B C D

S. Dysenteriae ++ - - -

S. Flexneri - ++ - -

S. Boydil - - ++ -

S. Sonnei - - - ++

.


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Familia Enterobacteriaceae

TRIBU GÉNEROS

Tribu I EscherichieaeGénero Escherichia

Género Shiguella

Tribu II Edwardsielleae Género Edwardsiella

Tribu III Salmonelleae Género Salmonella

Tribu IV Citrobactereae Género Citrobacter

Tribu V Klebsielleae Género Klebsiella

Tribu VI Proeteeae

Género Proteus.

Género Morganella

Género Providencia

Tribu VII Yersinieae Género Yersinia

Otros géneros de la familia Enterobacteriaceae son Budvicia, Buttiauxella, Cedecea, K/uyvera, Koserella, Leminore/la, Moellerella, Obesumbacterium, Rhanella, Tatume/la, Xenorhabdus y Yokenella, así como

diversos grupos entéricos sin denominación.

Localización de las infecciones producidas por las enterobacterias


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PRÁCTICAPRÁCTICA

77Estudio de Bacilos aerobios esporulados:Estudio de Bacilos aerobios esporulados:

BacillusBacillus

A este género pertenecen microorganismos de forma bacilar, Gram positivo esporulados, que se agrupan en cadenas y que requiere O2 para su metabolismo; son en su mayoría saprofitos, (B. cereus, B. subtilis), excepto B. anthracis que es patógeno para el hombre y animales. En la presente práctica se pondrá en evidencia los caracteres microscópicos (forma del bacilo, localización de las esporas), culturales, presencia de hemólisis, acción sobre las proteínas (gelatina), movilidad, y acción sobre el almidón.

I. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA: COLORACIÓN DE GRAM Y WIRTZ

Tomar una muestra de espécimen o cepa de Bacillus y hacer frotis en 2 láminas. Teñir una de ella con Gram y la otra con Verde Malaquita (coloración de Wirtz).

Secar las láminas y observar al microscopio con lente de inmersión.

II. SIEMBRA EN MEDIO DE CULTIVO

Medios de cultivo a usarse: Agar sangre, medio SIM, medio gelatina, agar almidón, 2 de cada uno.

1. Materiales: Cepas de B. anthracis ó B. subtilis en caldo Mechero, Asa de Kolle.

2. Procedimiento: Sembrar por estría las cepas de B. anthracis y B. subtilis en una de cada placa de Agar

sangre y Agar almidón. Sembrar cada cepa, por puntura en el medio SIM, hace los mismo con los tubos del

medio gelatina. Incubar a 37°C por 24 horas, marcando previamente cada placa y tubo.

3. Resultados :

Medio Bacillus anthracis Bacillus subtilisAgar sangre (hemólisis) Negativo o Alfa leve Beta

Agar almidón No hidroliza el almidón Hidroliza del AlmidónGelatina No licua o lo hace lentamente Licua rápidamente

Medio SIM No móvil “Pino invertido” Móvil

NOTA: Para observar la hidrólisis del almidón, dejar caer unas gotas de lugol sobre la superficie de la placa de este medio, tratando de que se distribuya regularmente. La zona del medio en la que no ha habido hidrólisis del almidón se teñirá de azul, mientras que aquellas en que si ha ocurrido la hidrólisis se teñirá del color marrón propio del lugol.


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Las especies de Bacillus y sus enfermedades

Microorganismo Enfermedades

B. anthracis*B. cereus*

B. mycoides*B. thuringiensis*

Otras especies de Bacillus.

Carbunco (cutáneo, gastrointestinal, por inhalación)Gastroenteritis (emética, diarreica), infecciones oculares, sepsis

relacionadas con el catéter, infecciones oportunistas.Gastroenteritis, infecciones oportunistas.Gastroenteritis, infecciones oportunistas.

Infecciones oportunistas.

Epidemiología del ántrax en los huéspedes animales y humanos:


UNFV – FMHU III. GENERO CORYNEBACTERIUM

Son bacilos Gram (+), no esporulados, inmóviles; algunas especies forman parte de la flora normal del sistema respiratorio, piel, etc. La especie patógena representativa de este género es el C. Diphtheriae, productora de una poderosa exotoxina causante del cuadro clínico en el hombre.

El aspecto morfológico es característico, presentando forma alargada con dilatación en uno de sus extremos, en su interior se observan los gránulos Metacromáticos que son teñidos intensamente por los colorantes básicos. El cultivo se realiza en el Medio de Suero Coagulado de Loeffer o en Gelosa Sangre cistina-telurito en el cual se puede diferenciar los tres tipos de C. diphtheriae: Mitis, Gravis e Intermedius.

1. Materiales (Observación del crecimiento): Cepa de C. diphtheriae Placas con medio de cultivo con agar telurito de potasio Asa y mechero

2. Procedimiento: Coger 2 azadas del caldo que contiene C. d. y sembrar en la placa por estrías. Llevar a la incubadora por 24 horas. Hacer la lectura para identificar las diferentes variedades al siguiente día

3. Materiales (Observación morfológica y gránulos metacromáticos). Coloración de Gram y Albert:

Cepas de C. diphtheriae Láminas Azul de metileno Lugol

4. Procedimiento : (Col. de Albert para observar gránulos metacromáticos)

Fijar la muestra Cubrir la lámina con azul de metileno de 1 a 2 min. Lavar con agua corriente Aplicar lugol por 1 min. Lavar con agua Secar y observar a inmersión Haga otro frotis, coloree con tinción de Gram para observar morfología.

Especies de Corynebacterium asociadas con enfermedades humanas


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Microorganismo Enfermedades

C. diphtheriaeDifteria (respiratoria, cutánea); faringitis y endocarditis (cepas no

toxigénicas).

C. jeikeium (grupo jk)Septicemia, endocarditis, infección de heridas, infecciones asociadas a

cuerpo extraño (catéter, anastomosis, prótesis).

C. urealyticum (grupo D2)Infecciones del tracto urinario, incluyendo pielonefritis y cistitis con

litiasis alcalina, endocarditis, infección de heridas.

C. amycolatumInfección de heridas, infecciones asociadas a cuerpos extraños,

septicemia, infecciones del tracto urinario, infecciones respiratorias.

C. glucuronolyticum Infecciones del tracto genitourinario (hombres).

C. riegelii Infecciones del tracto genitourinario (mujeres).

C. macginleyi Infecciones oculares.

C. minutissimum Infecciones de heridas, infecciones del tracto respiratorio.

C. psudodiphtheriticum Infecciones del tracto respiratorio, endocarditis.

C. pseudotuberculosis Linfadenitis, linfangitis ulcerativa, formación de abscesos.

C. striatumInfección de heridas, infecciones respiratorias, infecciones asociadas a

cuerpo extraño.

C. ulcerans Difteria respiratoria.


Agar Telurito – Potasio

El telurito inhibe la flora acompañante.Reducen el telurito dando colonias grises a negras.Grises con centro oscuro: Corynebacterium difteriaeGrandes mates: Tipo gravisGrandes lustrosas: Tipo mitisPequeñas: Tipo intermendias

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PRÁCTICA

8 8Género ClostridiumGénero Clostridium

(Bacilos Anaerobios Esporulados)(Bacilos Anaerobios Esporulados)

Son bacilos Gram (+) producen esporas, son anaerobios, su habitat natural es el suelo, intestino del hombre; existen especies saprofitas y otras patógenas, dentro de estas últimas tenemos:

C. botulinum causa el BotulismoC. tetani causa el tétanosC. perfringens causa la Gangrena gaseosa

Estos microorganismos para su crecimiento requieren de condiciones especiales como es la ausencia de O2 (medio anaerobis), el cual puede lograrse utilizando la cámara Brewer o el Gaspack y medio reductores como el caldo carne, o el empleo de agentes reductores como el thioglicolato.

Para la observación de la morfología se debe tener presente la posición de las esporas en las diferentes especies antes mencionadas.

3. Materiales (Observación del crecimiento): Cepa de Clostridium Tubos con caldo de carne o thioglicolato Asa y mechero

4. Procedimiento: Sembrar por azadas (2) en el medio indicado Incubar por 24 hrs Observar las características del cambio ocurrido en el medio

5. Materiales (Observación de la morfología y esporas): Cepas de clostridium Colorante de verde de malaquita y safranina Asa y mechero

6. Procedimiento: Coloración Wirtz Fijar la muestra tomándola de la parte más turbia del tubo. Agregar verde de malaquita y realizar 3 flameadas en 5 min. Lavar a chorro lento. Agregar colorante de contraste Lavar y secar Observar las esporas


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Clostridios patógenos y sus enfermedades humanas asociadas *

Especies Enfermeded humana Frecuencia

C. difficile

C. perfringens

C. septicumC. tertium

C. botulinumC. tetaniC. barati

C. butyricumC. bystolyticum

C. novyiC. sordellii

Diarrea asociada a antibióticos, colitis seudomembranosa.Infecciones de los tejidos blandos (p. ej., celulitis, miositis supurativa, mionecrosis o gangrena gaseosa), intoxicación

alimentaria, enteritis necrotizante, septicemia.Gangrena gaseosa, septicemia.

Infecciones oportunistas.Botulismo.Tétanos.

Botulismo.Botulismo.

Gangrena gaseosa.Gangrena gaseosa.Gangrena gaseosa.

Frecuente

Frecuente

InfrecuenteInfrecuenteInfrecuenteInfrecuente

RaroRaroRaroRaroRaro

*Otras especies de clostridio se han asociado con enfermedad humana, pero lo han hecho fundamentalmente como patógenos oportunistas. Además, algunas especies (p. ej., C. clostridioforme, C. innocuum, C. ramosum), se aíslan con frecuencia pero rara vez se asocian con enfermedad.


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PRÁCTICAPRÁCTICA

99Familia PseudomonadaceaeFamilia Pseudomonadaceae

La Pseudomona es un bacilo gram negativo móvil, que pertenece a la familia Pseudomonadaceae. Es relativamente ubicua y comúnmente se la encuentra en el polvo, el agua, las plantas y verduras, medio ambiente marino y animales.Puede crecer bien en diferentes medios y soporta gran variedad de condiciones físicas. Si bien su predilección son los ambientes húmedos la P. aeruginosa es primariamente un patógeno hospitalario y causa enfermedad en forma frecuente a huéspedes normales. La adherencia de la Pseudomona al epitelio celular, se ve favorecida por la injuria celular –conocida como adherencia oportunista- procesos tales como la intubación, cateterización urinaria, y trauma que crea injuria celular, pueden facilitar la adherencia de la Pseudomona.

Infecciones que produce Las infecciones comunes producidas por Pseudomonas incluyen bacteriemias –particularmente importantes en huéspedes inmunocomprometidos- otitis externa y media, infecciones respiratorias, infecciones del tracto urinario, e infecciones de herida en pacientes quemados. También puede causar infecciones del sitio quirúrgico y han sido responsables de epidemias del sitio quirúrgico. Otras infecciones como osteomielitis, artritis, infecciones de piel, infecciones gastrointestinales, del sistema nervioso central –generalmente seguidas de una cirugía- endocarditis, abscesos han implicado a la Pseudomonas.

Epidemiologia De acuerdo a distintas fuentes bibliográficas, la Pseudomonas es responsable del 17% de las neumonías asociadas a asistencia respiratoria mecánica, 11% de infecciones del tracto urinario, y 3.8% de bacteriemias primarias en las unidades de cuidados intensivos de adultos. Sin embargo en las unidades de pacientes quemados la P. aeruginosa, es causa del 21.5% de las neumonías; 20% de las infecciones urinarias y 9% de las bacteriemias primarias. Otros estudios muestran que la P. aeruginosa es el gram negativo mas frecuentemente aislado (27%) y el mas comúnmente encontrado en los cultivos de traqueostomías.

1. Materiales: Cepa de Pseudomona Aeruginosa Agar Cetrimida (*)


UNFV – FMHU *AGAR CETRIMIDA Medio utilizado para el aislamiento selectivo de Pseudomonas aeruginosa y de otras especies del género.

Fundamento La fórmula de este medio está desarrollada para favorecer la selección de P. aeruginosa y estimular la formación de pigmentos el cloruro de magnesio y el sulfato de potasio promueven la formación de piocianina, pioverdina y piomelanina de P. aeruginosa. La cetrimida es un detergente catiónico que actúa como agente inhibidor, libera el nitrógeno y el fósforo de las células de casi toda la flora acompañante, aunque inhibe también algunas especies de Pseudomonas.

SiembraEn superficie, por inoculación directa de la muestra o a partir de un caldo de enriquecimiento (Cerebro Corazón Infusión o Tripteína Soya Caldo).

IncubaciónDe 24 a 48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.

Resultados


Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Peptona de gelatina 20.0Suspender 45,3 g del polvo por litro de agua destilada. Agregar 10 ml de glicerina. Dejar reposar 5 minutos. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante 1 minuto. Distribuir en tubos o frascos y esterilizar en autoclave 15 minutos a 121°C.

Cloruro de magnesio 1.4 Sulfato de potasio 10.0 Agar 13.6

Cetrimida 0.3

pH final: 7.2 ± 0.2

Microorganismos Crecimiento

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Bueno - excelente

Escherichia coli ATCC 25922 Inhibido

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Inhibido

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PRÁCTICAPRÁCTICA

1100

Familia SpirochaetaceaeFamilia Spirochaetaceae

Las espiroquetas son abundantes en la flora bacteriana y facilitan al alumno para la observación morfológica mediante las tinciones simples.

1. Materiales: Obtención de sarro dentario Láminas porta objetos Colorantes de Gram y Azul de metileno Láminas colocadas en espirilos

2. Procedimiento: Obtener sarro dentario de los alumnos, escoger con infecciones frecuentes en la boca,

hacer un extendido en una lámina porta objetos, fijar con alcohol y hacer una coloración de Gram, otra con violeta de genciana sola durante 1 minuto y una tercera lámina con azul de metileno.

Secar la lámina y observar al microscopio. Se observarán las láminas que se presentan en la práctica.

La observación de leptospiras y borrelia, se realiza en la práctica de láminas preparadas que se presentan para sus observaciones. Tratar de ubicar las características propias de cada género.

Pruebas serológicas para sífilis

Antígeno Fuente del antígeno Pruebas

“Reagina” no treponémica

Extractos de tejidos(Cardiolipina – Lecitina - Colesterol)

Fijación de complemento:Wasserman, Kolmer

Floculación:VDRL, Kahn, Hinton

“Treponémico”

T. PallidumCepa Reiter

T. Pallidum

FCPR (Fij. de complemento con prot. de Reiter)

TPI (Inmovilización de T. Pallidum)FTA-ABS (Fluorescent Treponemal

Antibody Absortion)IgM – FTA – ABS (Inmunoglobulina M -

Fluorescent Treponemal – Absortion)


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Orden de Spirochaetales

Spirochaetales Enfermedad humana Agente etiológicoFam. Spirochaetaceae

Género Borrelia

Género CristispiraGénero Serpulina

Género SpirochaetaGénero Treponema

Fam. LeptospiraceaeGénero LeptosnemaGénero LeptospiraGénero Turneria

Fiebre recurrente epidémicaFiebre recurrente epidémica

Borreliosis de Lyme

NingunaNingunaNinguna

SífilisBejel

FrambesiaPinta

NingunaLeptospirosis

Ninguna

Borrelia recurrentisMuchas especies de Borrelia

Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii, Borrelia afzelii

---

T. pallidum subespecie pallidumT. pallidum subespecie endemicum

T. pallidum subespecie pertenueTreponema carateum

-Leptospira interrogans

-


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PRÁCTICAPRÁCTICA

1111

Género MicobacteriumGénero Micobacterium

FAMILIA: MICOBACTERIACEAEGENERO: MYCOBACTERIUMESPECIES: M. Tuberculosis (Bacilo de Koch)

M. Leprae (Bacilo de Hansen)

Mycobacterium Tuberculosis: V. hominis

Micobacterias típicas: BovisAviumMicrotii

Bacilos Atípicos según Runyon: Grupo I (Fotocromógenos)Grupo II (Escotocromógenos)Grupo III (No cromógenos)Grupo IV (de crecimiento rápido)

I. DIAGNOSTICO BACTERIOLÓGICO DE M. TUBERCULOSIS

A) Por examen directoB) Por cultivoC) Por inoculación

II. OBTENCION DE LA MUESTRA

El M. Tuberculosis se puede aislar de diversos productos patológicos: esputo, lavado gástrico, orina, LCR, líquido ascítico, secreción de fístulas, heces, lesiones de pie, huesos, etc. La forma correcta de obtención de muestras y su procedimiento forma todo un capítulo especial.

III. EXAMEN DIRECTO

Tratándose de esputo, éste adquiere gran valor, pues nos permite además de hacer el diagnóstico, detectar aquellos pacientes bacilíferos (de gran importancia desde el punto de vista epidemiológico). Es un proceso sencillo, barato al alcance de cualquier centro de salud del país. Se necesita solamente un personal entrenado, un microscopio, colorantes y láminas.

Otra ventaja del examen directo, sigue ciertas normas estandarizadas, es el de poder detectar bacilos con resistencia primaria o secundaria y vigilar la eficacia de la droga antituberculosa.

Colorantes: La coloración indicada es la de Zhiel Neelsen

Reactivos:A) Sol. de fucsina fenicadaB) Sol. de alcohol ácido

C) Sol. de Azul de metileno o sol. Saturada de ácido pícrico


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IV. METODOLOGÍA

Usando lápiz para vidrio dividir la lámina en tres tercios El primer tercio sirve para la rotulación Hacer el frotis lo más homogéneo posible en los restantes dos tercios

V. TÉCNICAS DE COLORACIÓN

Preparar el frotis y fijar a la llama. Cubrir con el colorante (fucsina fenicada). Calentar a la llama hasta la producción de tres humos. Lavar con agua de caño. Decolorar con alcohol ácido. Lavar con agua de caño. Colorear con Azul de metileno. Lavar con agua de caño, secar y observar con lente de inmersión usando aceite de cedro.Los gérmenes que retienen el calor rojo a pesar de la decoloración son los llamados alcohol ácido

resistentes y destacando en un fondo de color azul.

VI. TÉCNICA DE LECTURA

Se debe colocar la lente de inmersión en la mitad del primer tercio y leer siguiendo el sentido de la flecha hacia la derecha como indica el grabado. Cuando se ha hecho esta operación, significa que se ha leído 100 campos. En caso de negatividad leer otros 100 campos siguiendo el sentido inverso de la flecha.

VII. MODO DE INFORMAR

No se encuentra bacilos en 200 campos: BK negativoMenos de 1, a un bacilos por campo en 100 campos: BK Positivo 1De 1 a 10 bacilos por campo, en 50 campos: BK Positivo 2Más de 10 bacilos por campos, por 20 campos: BK Positivo 3

VIII. OTROS TIPOS DE EXAMEN DIRECTO

Examen directo previa homogenización: usando hidróxido de Na al 4% y luego centrifugando el homogerizado. Del sedimento se hace frotis y coloración. Se usa en aquellos esputos negativos al examen directo común.

Diagnóstico Directo por fluorescencia: Se usa como colorante la Aureamina. Se necesita microscopio de fluorescencia. Se utiliza para el diagnóstico en masa de centros de referencia.

IX. CULTIVOS

Se utiliza en aquellos casos en que pese a la negatividad del examen directo se sospecha de cuadro de TBC. También se utiliza para el aislamiento de germen y poder realizar posteriormente pruebas de sensibilidad, virulencia y tipificación de micobacterias.Hay especimenes que se pueden sembrar directamente: Ejemplo: LCR o las que proceden de cavidades cerradas, es decir, que no están contaminadas. Otras en cambio, como el esputo, necesitan previamente de un proceso de DESCONTAMINACION. En general estos procesos descontaminación tienen por objeto eliminar los gérmenes comunes y poder recuperar el BK, mientras más enérgico es el método, hay menos peligro de contaminar el medio de cultivo y menos poder de recuperación del Bacilo


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Tuberculoso, y al revés, mientras menos enérgico es el método, hay mayor poder de recuperación de BK pero mayor riesgo de contaminar el medio de cultivo.

En los métodos usados en la actualidad, el riesgo de contaminación hasta un 4% se considera aceptable, por eso se deben inocular por los menos 2 tubos con medio Lowenstein – Jensen.

X. MÉTODOS DE DESCONTAMINACIÓN

Método en el que se usa NaOH y HCl, usando rojo de fenol como indicador. Otro método recomendado es el de CORPER y STORNER en la que se emplea Trifosfato de Sodio.

XI. METODO DE SCHMIEDEL

Se usan dos soluciones:Solución “A”NaOH 5grsNa2HPO4 – 12 H2O 3grsa.d. 1000 ml.

Solución “B”CaCl2 6H2O 3grs BaCl2 2H2O 2grsa.d. 1000 ml.

Procedimiento:A 2 ml. de esputo en un tubo estéril con tapón de goma, se añade 8 ml de sol. “A” y 2 gotas de

sol. “B”. Agitar fuertemente y dejar reposar 18 - 24 horas en la oscuridad temperatura ambiente; el sedimento se usa para la siembra utilizando pipeta de Pasteur. Se incuba en forma vertical los tubos inooculados.

XII. MEDIOS DE CULTIVO

El más comúnmente usado es el medio de Lowenstein Jensen que contiene todos los elementos necesarios para el crecimiento de BK e inhibidores para posibles contaminantes. La fórmula contiene KH2PO4 anhidro, MgSO7 H2O, Citrato Magnésico, Asparagina, Glicerina q.p., agua destilada, harina de papas, huevos frescos, verde de Malaquita (sol. acuosa al 2%). Es un medio sólido.

Existen también medios líquidos como el medio de DUBOIS que contiene Tween 80. Otros sintéticos como el de SULA.

En medios sólidos, el germen requiere no menos de 15 días para presentar desarrollo visible. Las colonias son de colorante, seca y rugosas.

XIII. METODOS DE SENSIBILIDAD A LAS DROGAS ANTITUBERCULOSAS

Se realiza incorporando las drogas a los medios de cultivo. Dos principalmente: El método de las concentraciones Absolutas y el Método de las Proporciones. También se están ensayando métodos engorrosos y costosos, sólo se realizan en laboratorios muy especializados.

XIV. PRUEBAS DE VIRULENCIA

Se utiliza las pruebas de “Crecimiento en Cuerda” (Factor Cord.); la prueba de la Niacina, la del rojo neutro, etc.


UNFV – FMHU XV. INOCULACIONES

Se utiliza el cobayo; tiene el mismo valor que el cultivo. Se inocula para ciertos especímenes clínicos como LCR para evitar el riesgo de su contaminación.

XVI. PRUEBAS INMUNOLÓGICAS

Prueba de la Cutirreacción a la tuberculina (Sensibilidad Retardada). Otros tipos de pruebas de inmunidad humoral.

Pruebas usadas para diferenciar Mycobacterias

TIPICAS (No se toma en cuenta el microtil)

ATIPICAS

Tu

berc

ulos

is

bovi

s

aviu

m

Gru

po

I

Gru

po

II

Gru

po

III

Gru

po

IV

Cordón + + + +/- - - -

Pigmento Ante Blanco BlancoAmarillo o

Rojo(a la Luz)

Anaranjado (Luz oscura)

BlancoBlanco,

anaranjado oRojo

Catalasa + + + +++ +++ + +

Rojo Neutro Rojo Rojo RojoBrick-duat“Polvo de ladrillo”

Brick-dust Amarillo Amarillo

Niacina + - - - - - -

Patogenicidad para el cobayo

+++ +++ - - - - -

Patogenicidad para el conejo

+/- +++ + - - - -

Patogenicidad para aves

- - +++ - - - -

Temperatura de desarrolla

No crece a 45°C

Debajo de 25°C

Igual al anterior

Crece a 45°CNo a 25°C

En 1 - 2 semana

crece bien a 25°C

Crece lentamente a

25°C

Semejante al humano

Crece en menos de 1

semana y bien a 25°C

XVII. OBSERVACIÓN DE CULTIVO ATÍPICOS

1. Materiales: Cultivo atípicos de M. Tuberculoso. Láminas coloreadas con M. leprae

2. Procedimiento: El alumno observará al microscopio, las láminas con M. leprae tratando de fijar sus

características propias de estos bacilos.


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Clasificación de una selección de micobacterias patógenas para los humanos

Microorganismo Patogenicidad Frecuencia

Complejo de M. tuberculosisM. tuberculosisM. leproeM. africanumM. bovisM. ulcerans

Grupo I de Runyon (fotocromógenos de crecimiento lento)

M. kansasiiM. marinumM. simiae

Grupo II de Runyon (escotocromógenos de crecimiento lento)

M. szulgaiM. scrofulaceumM. xenopi

Grupo III de Runyon (no cromógenos de crecimiento lento)

Complejo M. AviumM. genavenseM. haemophiliumM. malmoense

Grupo IV de Runyon (crecimiento rápido)M. fortuitumM. chelonaeM. abscessusM. mucogenicum

Patógeno estrictoPatógeno estrictoPatógeno estrictoPatógeno estrictoPatógeno estricto

Gral. patógenoGral. patógenoGral. patógeno

Gral. patógenoA veces patógenoA veces patógeno

Patógeno estrictoPatógeno estrictoGral. patógenoGral. patógeno

A veces patógenoA veces patógenoA veces patógenoA veces patógeno

FrecuenteInfrecuente

RaroRaroRaro

FrecuenteInfrecuenteInfrecuente

InfrecuenteInfrecuenteInfrecuente

FrecuenteInfrecuenteInfrecuenteInfrecuente

FrecuenteFrecuente

InfrecuenteInfrecuente


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PRÁCTICAPRÁCTICA

1122

Observación de láminas coloreadas conObservación de láminas coloreadas con Rickettsia. Coloración de MachiavelloRickettsia. Coloración de Machiavello

1. Materiales: Láminas coloreadas con Rickettsias Colorante de Machiavello

2. Procedimiento : Observar al microscopio 45x las láminas coloreadas que ha sido entregadas. Las Rickettsias se observan en el citoplasma de la célula como pequeños cocobacilos

rojo brillantes. La identificación se establece solamente si los organismos se encuentran intracelularmente.

3. Coloración de Machiavello: Sol. A: Fucsina básica al 0.25% en agua destilada Sol. B: Acido cítrico fresco al 0.4% en agua destilada Sol. C: Azul de metileno al 1% en agua destilada

4. Proceso: Colocar la lámina fijada por 5’ en sol. A. Decantar el colorante y sumergir la lámina en la sol B. Sacarla inmediatamente y colocarla en un recipiente con agua corriente. Sumergir la lámina en la sol C por 10’. Lavar con agua corriente y secar con papel de filtro. Observar al microscopio. Dibujar en su hoja de informe.

Rickettsias de interés médico

ORDEN: Rickettsiales

Familia

Tribu I Género 1Género 2

Tribu IIGénero 1

Rickettsiaceae

RickettsieaeRickettsiaCoxiella

EhrlichieaeEhrlichia


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Epidemiología de las rickettsiosis

Microorganismo Enfermedad Vector ReservorioDistribucióngeográfica

R. conoriiFiebre botonosa

mediterráneaGarrapata

PerroRoedores salvajes

Países MediterráneosAfrica, India

R. rickettsiiFiebre manchada de

las Montañas Rocosas

GarrapataRoedores salvajes

PerroAmérica

R. akariViruela

rickettsiósicaAcaro

Roedores salvajesRatas

América del NorteRusia, Corea, Africa

R. australisFiebre de

QueenslandGarrapata

RoedoresMarsupiales

Australia

R. sibiricaRickettsiosis del

Norte de AsiaGarrapata Roedores salvajes Siberia, Mongolia

R. prowazekiiTifus exantemático

epidémicoPiojo

HombreArdilla voladora

Africa, Asia, Centro y Sudamérica

R. typhiTifus exantemático

endémicoPulga de la rata Ratas Mundial

R. tsutsugamushiTifus de las

malezasAcaro Roedores

Asia, Australia,Islas del Pacífico

C. burnetii Fiebre Q Garrapata (*)Bueyes, ovejas, cabras, gatos,

roedores salvajesMundial

E. senetsuSíndrome

mononucleósicoGarrapata Desconocido

Japón, SudesteAsiático

E. chaffeensis

Síndrome febril y leucopenia

(Ehrlichiosis monocítica)

GarrapataCaballos, perros,

ciervosEstados UnidosEuropa, Africa

Erhlichia spp.

Síndrome febril y leucopenia

(Ehrlichiosis granulocítica)

GarrapataCaballos, perros,

ciervos, rumiantesEstados Unidos

(*) En el hombre la transmisión es normalmente por vía directa (inhalación).


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PRÁCTICAPRÁCTICA

1133

Observación de cultivo y láminasObservación de cultivo y láminas coloreadas con Bartonellacoloreadas con Bartonella

1. Materiales : Lámina coloreadas con Bartonella Colorante de Leishman

2. Procedimiento: Observar al microscopio 45.x láminas coloreadas que han sido entregadas. Examinarlas minuciosamente, poniendo especial atención a la morfología bacilar o

cocoide y a la situación de la Bartonella en relación a los hematíes. Dibujar en su hoja de informes.

Especies de Bartonella asociadas con enfermedades humanas

Especie Enfermedades

B. bacillifomisB. quintana

B. benselae

B. clarridgeiaeB. elizabethae

Fiebre de Oroya (bartonelosis, enfermedad de Carrión).Fiebre de las trincheras; manifestaciones cutáneas, subcutáneas y óseas de la

angiomatosis bacilar; endocarditis.Enfermedad del arañazo de gato; bacteriemia; manifestaciones cutáneas,

linfáticas y hepatoesplénicas (peliosis hepática) de la angiomatosis bacilar; endocarditis.

Endocarditis, enfermedad del arañazo de gato.Endocarditis (raro).


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PRÁCTICAPRÁCTICA

1144

Observación de colonias en mediosObservación de colonias en medios especialesespeciales

1. Materiales: Placas con medios de cultivo especiales conteniendo colonias de Mycoplasma.

2. Procedimiento: Los Mycoplasma son elementos muy pequeños miden de 0.2 a 0.3 de micras. Son reconocidos por su formación de colonias en medios sólidos y la típica formación

de colonias en “huevo frito”, estas colonias son visibles con aumento por ser muy pequeñas y miden de 1 a 300 micras de diámetro.

Los medios de cultivo especiales son: Caldo Mycoplasma base, Agar Mycoplasma base, que contienen peptona, extracto de carne y suero animal al 10 o 20%.


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A T L A SA T L A S

BacteriologíaAplicada

Staphylococcus.

Streptococcus Spp.

Neumococo.

Neisseria Gonorrohoeae.

Brucela Sp.

Haemophilus Influenzae.

Bordetella Pertusis.

Enterobacterias.

Bacillus Sp.

Clostridium Sp.

Corynebacterium diphtheriae.

Spirilos.

Mycobacterium Tuberculosis.

Rickettssia.

Bartonella.

Pseudomona.


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I VI V U N I D A DU N I D A D

Virología


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PRÁCTICAPRÁCTICA

1 1 Estudio de Bacteriófagos.Estudio de Bacteriófagos.

Método de aislamiento de virusMétodo de aislamiento de virus bacteriano.bacteriano.

El descubrimiento de los bacteriófagos se hizo en 1915 por Twot, quien aporto mucho en el estudio de organización y replicación del material genético. Existe un bacteriófago para cada especie bacteriana, esta especificidad es debida a receptores específicos existentes en las bacterias, la acción de los bacteriófagos en ellas puede ser:

A) Interacción lítica.- Donde se multiplica el virus causando lisis de la bacteria.B) Interacción transformadoras.- Donde el genoma viral se integra al genoma del huésped

El ciclo de multiplicación viral se divide en:

- Adsorción (atracción crónica y receptores específicos)- Penetración (ingreso del citoplasma viral al huésped) - Multiplicación (en la bacteria receptora)

I. EXPERIMENTO 1

1. Materiales: Caldo de cultivo de 4 horas de Escherichia coli. Cloruro de calcio al 1.5% Filtrado de fago Agar nutritivo Agar blanco Placas Petri estériles Pipetas estériles de 1cc graduada al 0.1 Tubos estériles

2. Procedimiento: Colocar en un tubo de prueba: 0.5cc de fago, agregar 0.2 de cepa de E.coli, agregar

cloruro de calcio 2 gotas. Preparar placas Petri con agar sólido En los tubos con agar semisólido agregar la mezcla de fago. Mezclar bien los contenidos del tubo y agregar sobre la superficie de la placa de agar

sólido. Mover la placa suavemente de tal manera que el agar forme una capa uniforme sobre el

agar sólido. Marcar las placas, incubar a 37°C y examinar a las 24 horas.


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Clasificación de Virus

FamiliaEstructura del ácido

nucleicoEstructura de

la cápsideEnvoltura Ejemplo

VIRUS ADN

Parvoviridae

HepadnaviridaePapovaviridaeAdenoviridaeHerpesviridae

Poxviridae

ADNmc, lineal (+) o (-)

ADNbc, circularADNbc, circularADNbc, linealADNbc, lineal

ADNbc, lineal

Icosaédrica

IcosaédricaIcosaédricaIcosaédrica Icosaédrica

Compleja

No

SiNoNoSi

Si

Parvovirus humano B-19, verruga

Virus de la hepatitis BVirus de los papilomasAdenovirus humanos

Herpes simple, citomegalovirus

Virus de la viruela

VIRUS ARN

PicornaviridaeCaliciviridaeFiloviridae

FlaviviridaeTogaviridae

CoronaviridaeRhabdoviridae

ParamyxoviridaeOrthomyxoviridae

Bunyaviridae

Arenaviridae

Retroviridae

Reoviridae

ARNmc, lineal (+)ARNmc, lineal (+)ARNmc, lineal (+)

ARNmc, lineal (+)ARNmc, lineal (+)ARNmc, lineal (+)ARNmc, lineal (-)ARNmc, lineal (-)ARNmc, lineal (-)ARNmc, lineal (-)

Segmentado

ARNmc, lineal (-)Segmentado

ARNmc, lineal (+)Diploide

ARNmc, linealSegmentado

IcosaédricaIcosaédricaHelicoidal

DesconocidaIcosaédricaHelicoidalHelicoidalHelicoidalHelicoidalHelicoidal

Helicoidal

Icosaédrica

Icosaédrica

NoNoSi

SiSiSiSiSiSiSi

Si

Si

No

PoliovirusVirus de la hepatitis E

Virus de Marburg y EbolaVirus de hepatitis C

Virus de rubéolaCoronavirus

Virus de la RabiaVirus del sarampión

Virus de la gripeVirus de la encefalitis de

CaliforniaVirus de Lassa

VIH

Rotavirus

mc, monocadena; bc, bicadena; (+), (-), polaridad.

Esquema general de la replicación de los virus(Esquema de la replicación de un virus en un bacteriófago).


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Virus de DNA

Virus de RNA

Formas y tamaños relativos de familias de virus animales que infectan vertebrados DS: Cadena dobleSS: Cadena simple(+) o (-): Polaridades


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Ciclo del bacteriófago


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PRÁCTICAPRÁCTICA

2 2Lectura de las Placas con Bacteriófago.Lectura de las Placas con Bacteriófago.

Inoculación de Huevos Embrionados.Inoculación de Huevos Embrionados.

Los virus respiratorios son los principales responsables de las afecciones respiratorias. Producen cuadros respiratorios altos, el virus de la influenza y el adenovirus. Producen resfriado común y gripe: Rhinovirus Afecciones de vías respiratorias bajas, bronquitis: virus respiratorio sincisial. Producen traqueitis y neumonitis: virus de parainfluenza. Algunos de estos virus son ADN o ARN, y tiene afinidad por la mucina. Inoculación en huevos embrionados de 7 a 9 días, por vía alantoidea y amniótica.

I. PROCEDIMIENTO

1. VIA ALANTOIDEA Visualizar al embrión en el ovoscopio, marcar al embrión y la cámara de aire. Perforar la cáscara en el borde de la cámara de aire. Usando una jeringa de 1cc con agua calibre 22 inocular a través de la perforación de la

cáscara y en un ángulo de 45° en relación al eje longitudinal del huevo y alejado del embrión, en zona libre de vascularización, inyecta 0.1 de la muestra.

2. VIA AMNIOTICA Visualizar en la anterior. Perforar la cáscara en el centro de la cámara de aire. Sostener el huevo en el ovoscopio y con jeringa de 1cc de aguja calibre 22 de 1 y ½

pulgada inocular dirección del embrión 0.1 del inoculo en la cámara amniótica.

En ambos casos sellar con parafina la perforación

II. COSECHA CON LOS HUEVOS EMBRIONADOS E INOCULADOS

1. Cosecha por vía alantoidea: Limpiar la mitad superior de la cáscara del huevo con alcohol. Cortar la cáscara por encima de la cámara de aire. Retirar la membrana corioalantoidea que cubre la cavidad alantoidea. Con un baja lengua estéril empujar el contenido del huevo hacia abajo separándolo de

la cáscara, para que el líquido alantoideo se deposite en este espacio. Retire el líquido alantoideo con pipeta de 5cc y deposítelo en un tubo 13X100. Guardar en refrigeración.

2. Cosecha por vía amniótica: Retirar asépticamente la cáscara y la membrana. Tirar hacia atrás la membrana alantoidea y sacar el líquido de esta cavidad con pepita

de 5cc. Retirar el líquido amniótico con una pipeta Pasteur en un tubo 13X100. Guardar en refrigeración.


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Escherichia Coli E. Coli en AGAR nutritivo

Procedimiento de una inoculación por huevos embrionados

1 Código: Vacuna contra la bronquitis infecciosa

2 Tipo de producto: Antígeno vacunal

3 Subtipo de producto: Vacuna a virus vivo

4 Nombre: Vacuna contra la bronquitis infecciosa

5Modo de obtención: Preparada a partir de cultivo de celulares o fluidos obtenidos de huevos embrionados de gallina SPF

6 Referencias internacionales o de origen: CFR 9 (1992) 113.327

7 Descripción

8 Control de calidad:

8.1 Tipo de cepa: Debe ser hecha por serología con suero mono - específico.

8.2 Pureza:

REFERENCIA CFR 9 (1992) 113.331- 113.300 – 113.37 – 113.36

A) Semillas: Solamente debe contener virus especifico de BRONQUITIS INFECCIOSA. Cepas comúnmente utilizadas: Masachusets, Connecticut, Holandesas (modificaciones por pasajes en Cultivo de la Massachusets-H52-H120). Resulta conveniente limitar el uso de cepas como la Arkansas y otras agresivas Las cepas deben ser controladas por serología específica por la Técnica autorizada (ELISA específico) y en semilla podría utilizarse PCR.

B) La vacuna debe estar libre de Mycoplasma, Salmonella, Leucosis linfoide aviar, virus extraños y virus hemoaglutinantes; siguiendo las técnicas descritas por el CFR.


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9 Procedimiento:

DETECCION DE AGENTES PATOGENOS POR INOCULACION EN HUEVOS EMBRIONADOS:

En el caso de vacunas a "virus vivo", o de semillas de cultivo, previo a esta prueba, debe ser utilizado suero neutralizante para eliminar la acción de virus activo. En esos casos debe practicarse una dilución del virus para que 0,2 ml contengan, el equivalente a 10 dosis de vacuna.

a) Inocular con el producto a investigar a tres grupos de 9 huevos embrionados cada uno.

Grupo I: 0,2 ml en la cavidad alantoidea de cada huevo con 9 a 10 días de edad. Grupo II : 0,2 ml en la membrana corioalantoidea (CAM) de cada huevo de 9 a 10 días

de edad. Grupo III : 0,2 ml en el saco de la yema del huevo de 5 a 6 días de edad.

b) Hacer ovoscopía de los huevos de los Grupos I y II diariamente por 7 días y del Grupo III por 14 días.

c) Eliminar los embriones que se mueren en las primeras 24 horas, por muerte no especifica. La prueba es valida si por lo menos 6 embriones de cada grupo, sobrevive después de las primeras 24 horas, luego de la inoculación. Examinar las anormalidades de todos los embriones que se murieron durante las 24 horas post - inoculación. Examinar también posibles anormalidades de las membranas corioalantóideas de estos huevos y controlar los fluidos alantóideos, para presencia de agente hemoaglutinantes. Además de esto centrifugar a baja velocidad los fluidos alantóideos de los huevos embrionados, inoculados vía saco alantóideo, para depositar las células. Estas serán examinadas por prueba de anticuerpo fluorescente para virus de la Bronquitis Infecciosa

d) Si ocurren muertes por efecto atribuibles al producto se efectuara un posterior pasaje por embriones, haciendo respectivos "pool" de los materiales de embriones vivos y muertos. Inocular cada "pool" en 10 huevos embrionados por cada una de las vías descriptas en el punto a.

e) Materiales de membrana corioalantóidea debe ser inoculados en la membrana corioalantóidea, fluidos alantóideos en la cavidad alantóidea y de la yema en el saco de la yema.

SPF, patógeno específico libre.


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Producción de vacunas

Una vacuna es una suspensión de microorganismos (o alguna parte o producto de ellos) que produce inmunidad al ser inoculada en un huésped. Una vacuna oral o parenteral induce en el huésped la formación de anticuerpos frente al organismo causante de la enfermedad; por lo que, durante exposiciones futuras de este microorganismo, el agente infeccioso es inactivado (neutralizado o matado), se previene su proliferación y por lo tanto no se establece el estado de enfermedad.

El primero en utilizar el término vacuna fue Pasteur en 1880 y proviene del latín vacca. Usando este término Pasteur reconoció el trabajo de Edward Jenner que en 1796 vacunó con éxito a un niño de 8 años (James Phipps) de viruela, vacuna que obtuvo de los exudados de las pústulas de una vaca con viruela. A partir de este momento se desarrollaron numerosas vacunas lo que ha llevado a erradicar enfermedades como la viruela y en otros casos a una reducción dramática en la incidencia de numerosas enfermedades graves como la poliomielitis.

TIPOS DE VACUNAS TRADICIONALES

Las vacunas tradicionales se pueden clasificar dentro de tres tipos: vacunas atenuadas, vacunas inactivadas y vacunas toxoides.

1.- Vacunas atenuadasSon preparaciones de bacterias o virus vivos que están tan debilitados o alterados que ya no son virulentos, siendo todavía capaces de provocar una respuesta inmune. Algunos ejemplos de vacunas vivas son la Sabin para la polio, fiebre amarilla, sarampión, rubéola, parotiditis y la BCG para la tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis). La mayoría de las vacunas de virus atenuados provocan inmunidad para toda la vida sin necesidad de inmunizaciones de recuerdo.

2.- Vacunas inactivadasSon suspensiones de bacterias o virus muertos por la acción de desinfectantes como el fenol o formaldehído. En este tipo de vacunas es necesario dividir la cantidad total que se necesita para inducir la protección en varias dosis con intervalos de días o semanas debido a la alta concentración de microorganismos muertos que se deben administrar ya que no se replican como ocurre con las vacunas atenuadas. Algunos ejemplos de vacunas muertas son la Salk para la polio, rabia, gripe y la tos ferina (Bordetella pertussis).

3.- Vacunas toxoidesSon preparaciones obtenidas a partir de toxinas bacterianas inactivadas. Generalmente se utiliza el formol (c.a. 38% de formaldehído en H2O). Los toxoides son muy efectivos en la prevención de la difteria (Corynebacterium diphtheriae) y el tétanos (Clostridium tetani).A pesar de los logros obtenidos con este tipo de vacunas, existen una serie de limitaciones en la producción de vacunas según el modelo tradicional:

a.- No todos los agentes infecciosos pueden crecerse en cultivo, por lo que todavía no se han desarrollado vacunas para estas enfermedades.b.- La producción de virus animales y humanos requiere cultivos celulares, los cuales son caros, obteniéndose además bajos rendimientos.c.- Son necesarias grandes medidas de seguridad para asegurar que tanto el personal de laboratorio como de producción no van a estar expuestos al agente patógeno.d.- Se corre el riesgo de que los lotes de vacunas no estén completamente muertos o atenuados durante el proceso de producción por lo que se pueden introducir organismos virulentos en las vacunas y dispersar la enfermedad inadvertidamente.e.- Las cepas atenuadas pueden revertir, una posibilidad que requiere continuos ensayos para asegurar que no ha ocurrido una readquisición de la virulencia.f.- No todas las enfermedades (p.ej. SIDA) se pueden prevenir a través del uso de vacunas tradicionales.g.- La mayor parte de las vacunas actuales tienen una vida media limitada y a menudo requieren refrigeración para mantener su potencia. Estos requerimientos originan problemas de almacenamiento en aquellos países con grandes áreas rurales sin electrificar.


UNFV – FMHU En la última década, la tecnología del DNA recombinante ha supuesto la creación de una nueva generación de vacunas que permiten obviar las limitaciones de las clásicas. La disponibilidad de clonación de genes ha permitido a los investigadores contemplar nuevas estrategias en el desarrollo de vacunas:1.- Se pueden eliminar (curar) los genes de virulencia de un agente infeccioso y que mantenga la habilidad de estimular una respuesta inmune. En este caso, el organismo modificado genéticamente puede usarse como una vacuna viva sin las preocupaciones acerca de la reversión a la virulencia, ya que es imposible que un gen completo pueda ser readquirido espontáneamente durante el crecimiento en cultivo puro.2.- Se pueden crear sistemas vivos no patógenos que transporten determinantes antigénicos de un agente patógeno con el que no estén relacionados. De esta forma el sistema transportador facilita la inducción de una fuerte respuesta inmunológica dirigida contra el agente patógeno.3.- Para aquellos agentes infecciosos que no se pueden mantener en cultivo, los genes que codifican para las proteínas que tienen determinantes antigénicos se pueden aislar, clonar y expresar en un huésped alternativo tal como Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae o líneas celulares de mamíferos. Estas proteínas pueden ser formuladas en vacunas de subunidades. Las vacunas de subunidades utilizan solamente aquellos fragmentos antigénicos más adecuados para estimular una respuesta inmunitaria potente. Los genes de estas subunidades proteicas pueden ser introducidos en el genoma de una bacteria o levadura mediante las técnicas de ingeniería genética. La bacteria o levadura produce estas subunidades en cantidad y son después recolectadas y purificadas para utilizarlas como vacunas.

PRODUCCIÓN DE VACUNAS

1.- Producción de toxoides bacterianosLas toxinas bacterianas se inactivan para producir toxoides de tal manera que pierdan su toxicidad pero que retengan su antigenicidad. La vacunación a gran escala no comenzó hasta que Ramon halló en 1924 una forma segura y reproducible de inactivación de las toxinas y los microorganismos patógenos mediante su tratamiento con formaldehido y después de conseguir la atenuación de los patógenos mediante pasos sucesivos en medios de cultivo in vitro.

A. Cepas: La vacunación con toxoides se utiliza en humanos para enfermedades causadas por Clostridium tetani y Corynebacterium diphtheriae. Cada productor ha llevado a cabo a lo largo del tiempo una selección de aquellas cepas que producen un máximo de producción de toxina en el medio de cultivo que él mismo ha desarrollado. La mayoría de las cepas son estables en liófilos.B. Medio de cultivo: Generalmente las toxinas bacterianas no se producen en grandes cantidades en medios sintéticos, por lo que es necesario añadir una fuente de proteínas como la carne, caseína y como alternativa soja. La carne se digiere con papaína o tripsina y la caseína se digiere con ácido o tripsina. Este medio debe ser suplementado con varios aminoácidos y vitaminas por lo que se añade extracto de levadura. La fuente de carbono es glucosa aunque también se puede utilizar sacarosa y maltosa.C. Condiciones de cultivo: La mayoría de las vacunas toxoides se producen a partir de Clostridium (anaerobio) por lo que no hay ningún requerimiento especial para la introducción de gases en el cultivo. Puesto que también son sacarolíticos, son organismos que producen ácidos a partir del azúcar por lo que se debe controlar el pH. El tiempo de incubación se debe determinar en función de la cantidad de toxina que se produce, para lo cual existen diversas técnicas tanto enzimáticas (lecitinasa, hemólisis, proteolisis) como ensayos en animales (cobayas, ratones, conejos) usando como indicadores la muerte o lesiones en la piel.D. Inactivación: Las toxinas bacterianas se inactivan siempre con formaldehido.E. Aislamiento: El toxoide de Clostridium tetani se purifica por ultrafiltración utilizando membranas con un tamaño de poro de 0,001-0,05 µm. La purificación en Corynebacterium diphtheriae difiere en que la toxina se purifica primero y después se convierte en toxoide. Para la purificación primero se elimina la mayor parte de las proteínas por precipitación con 25% de sulfato amónico en presencia de carbón activo y en condiciones alcalinas. Después de filtrar, la toxina presente en el filtrado se precipita por adición de sulfato amónico al 20%, se recoge por filtración, se redisuelve y se elimina el sulfato amónico por diálisis.

2.- Producción de vacunas viralesEl primer paso esencial en la producción de vacunas víricas, sean vivas o inactivadas, es la obtención de una gran cantidad de material rico en antígenos virales. Debido a que las células vivas son esenciales para


UNFV – FMHU la replicación de los virus, las fuentes de tales materiales están limitadas a tejidos de animales infectados, embriones de pollos y cultivos celulares. Independientemente del sustrato utilizado, es de vital importancia para la producción el mantener un lote de virus como inoculante. Estos lotes se suelen conservar bien liofilizados o congelados en Nitrógeno líquido. Los microbiólogos cultivan los virus para aislar y producir cantidades suficientes tanto para su estudio como para la producción de vacunas. En general, existen 3 métodos para cultivar virus animales: animales vivos, huevos embrionados de pollo (o pato) y cultivos celulares.

A.- Animales vivos: En la actualidad, el uso de animales vivos para la producción de vacunas víricas está prácticamente abandonado. Sin embargo, se ha utilizado para la obtención de vacunas contra la viruela, rabia y fiebre amarilla.B.- Huevos embrionados: Uno de los métodos más económico y práctico para cultivar una gran variedad de virus animales es el uso de huevos de pollo embrionados. El descubrimiento de que los virus se podían cultivar por esta sencilla técnica fue hecho en 1931. Los huevos embrionados pueden ser inoculados asépticamente con virus, usando una aguja y jeringa, a través de un agujero que se realiza en la cáscara. Este agujero se sella con parafina y los huevos se incuban a 36°C durante 2 a 3 días para permitir que los virus se multipliquen.Los embriones de pollo contienen diferentes tipos de células y tejidos en los que varios virus pueden replicarse. Por ejemplo, la membrana corioalantoidea permite el crecimiento de herpesvirus y varicela. La cavidad amniótica permite el crecimiento del virus de la gripe y de la parotiditis. El virus de la gripe también tiene afinidad por la cavidad alantoidea. C.- Cultivo de tejidos: Es el método más usado para el cultivo de virus animales. Una vez que el cultivo celular ha crecido, es posible usarlo como un hospedador in vitro para un virus. Los virus invaden las células causando normalmente algún tipo de cambio visible en el crecimiento de las células de la monocapa cercanas al sitio de la infección inicial. Este cambio localizado, denominado efecto citopático (CPE), es un deterioro de las células del cultivo de tejidos causado por el virus. La CPE puede tener diferentes apariencias dependiendo de un virus particular y del tipo de células en el cultivo.

La elección del sustrato celular para la producción de una vacuna vírica depende de varios factores siendo el más importante la habilidad del virus para multiplicarse en el cultivo de tejidos. Además las células seleccionadas deben estar disponibles en suficiente cantidad, deben provenir de una fuente bacteriológicamente estéril y debe estar libre de otros virus. Los cultivos celulares más utilizados para la producción de vacunas víricas son los preparados a partir de riñón de mono aunque últimamente se están utilizando bastantes células diploides humanas. Una vez que se han multiplicado los virus, se recoge el líquido que se clarifica por filtración para eliminar los restos celulares.

Si lo que se pretende obtener es una vacuna vírica inactivada, se tratan con formaldehído cuyo exceso se neutraliza con metabisulfito sódico. En el caso de las vacunas víricas vivas normalmente se liofilizan después de filtrar el cultivo de tejidos.

D.- Control de calidad: El propósito de los controles de calidad es asegurar tanto la seguridad como la eficacia de estas vacunas. En el caso de las vacunas víricas inactivadas los peligros potenciales son debidos a la incompleta inactivación de los virus. El ensayo utilizado para detectar virus vivos consiste en la inoculación de estas vacunas en cultivos de tejidos y animales susceptibles. Los cultivos se examinan para detectar efectos citopáticos y los animales para síntomas de la enfermedad y evidencias histológicas de infección en la autopsia. Con vacunas víricas atenuadas el peligro potencial son aquellos asociados con la reversión del virus a un grado de virulencia capaz de causar enfermedad con las vacunas. Esta posibilidad se reduce usando lotes estables de cultivos en stock aunque siempre son necesarios ensayos de virulencia en el producto final; por ejemplo, en la producción de la vacuna atenuada de la poliomielitis se compara la neurovirulencia de cada lote con el de una vacuna control por inoculación intraespinal en monos.

La mayoría de los problemas asociados con la producción de las vacunas virales, particularmente los relacionados con la seguridad, pueden desaparecer mediante el uso de la tecnología del DNA recombinante ya que permite producir subunidades víricas en bacterias o levaduras.

3.- Producción de vacunas recombinantes (Hepatitis B)La hepatitis B es una enfermedad vírica que mata cada año a dos millones de personas. En 1976 un equipo de investigación de los laboratorios Merck (Dr. Hilleman) demostró experimentalmente la


UNFV – FMHU viabilidad de una vacuna contra el virus de esa forma de hepatitis (VHB); la inyección de antígeno particulado purificado, procedente del plasma de personas infectadas, protegía a los animales de la infección por el VHB. La vacuna era eficaz, pero no podía producirse en grandes cantidades dada la limitación de donantes. La solución vino de la mano de la clonación del genoma del VHB y la expresión de las partículas del VHB en Saccharomyces cerevisiae. La manipulación genética de la levadura permitió producir elevadas cantidades del antígeno de superficie con la misma conformación que las partículas derivadas de los donantes de plasma. En la actualidad la vacuna se administra a varios millones de personas en todo el mundo, la enfermedad está desapareciendo y cabe esperar que la insuficiencia hepática y el cáncer causados por esta infección pasen pronto a la historia.

Dentro de la estructura del virus de la hepatitis B, se sabía que la glicoproteína de la superficie del virus era una vacuna efectiva, por lo que el primer paso en producir esta vacuna era clonar el gen que codifica para esta proteína del genoma viral. El genoma del virus de la hepatitis B consiste en un DNA de doble cadena parcial, una de las cadenas está incompleta aunque mantiene su forma circular por puentes de hidrógeno. A pesar de su pequeño tamaño (una media de 3200 pares de bases) el genoma codifica para varias proteínas: P, X, C y S (con PreS2 y PreS1). La proteína P es una DNA polimerasa que sintetiza una cadena de DNA por transcripción inversa a partir del mayor mRNA (preC/C). La función precisa de la proteína X, la cual se presenta en pequeñas cantidades, es desconocida. La proteína C es el mayor componente de la cápsida interna (HBc) y la proteína S es la proteína mayoritaria de la envuelta. Algunos transcritos traducen sólamente la región S, produciendo el antígeno de superficie que en la figura se denomina SHBs, otros traducen también preS2 (MHBs) o ambos preS1 y preS2 (LHBs) originando proteínas mayores aunque minoritarias en la superficie del virión.

Una vez conocidas estas circunstancias se construyó un plásmido que expresara el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B en levaduras. Se escogió este hospedador para que la levadura pudiera glicosilar la proteína de superficie tal como ocurre en el virus. A partir del plásmido pHVB-3200 que contenía tanto el gen que codifica para el antígeno de superficie (sAg) como el gen que codifica para el antígeno del núcleo (cAg) del virus de la hepatitis B se construyó un clon que contenía sólo el gen sAg, pHBS-5. El gen SAg se insertó entre un promotor de la alcohol deshidrogenasa (ADH1) en el plásmido pMA-56 para producir el plásmido pHBS-16. Este plásmido final contiene el origen de replicación funcional en Escherichia coli que proviene del plásmido pBR322 y además el origen del plásmido 2µ que le permite replicarse en levaduras. También contiene TRP1 que es un gen de levadura que codifica para un enzima de la ruta biosintética del triptófano y que sirve como marcador selectivo en levaduras.

A pesar de elegir como huésped las levaduras para así glicosilar la proteína de superficie, esta proteína expresada en levadura no se glicosilaba. A pesar de ello estas proteínas se autoensamblaban en una forma que asemejaba a la cubierta del virus con un diámetro de c.a. 22 nm que no se distinguía de la que se encuentra en el plasma de los pacientes. La manipulación genética de Saccharomyces cerevisiae permitió producir elevadas cantidades del antígeno de superficie con la misma conformación que las partículas derivadas de los donantes de plasma.

Esta vacuna producida en levaduras, a la que le faltaban los oligosacáridos, era tan efectiva como la vacuna derivada del plasma humano, y en 1986 se convirtió en la primera vacuna recombinante apta para su uso en Estados Unidos. Antes de esto se necesitaban 40 litros de suero humano para producir una única dosis de la vacuna de la hepatitis B; actualmente se obtienen muchas dosis de la vacuna recombinante a partir del mismo volumen de cultivo de levaduras.

En la actualidad, la vacuna se administra a varios millones de personas en todo el mundo, la enfermedad está desapareciendo y cabe esperar que la insuficiencia hepática y el cáncer causados por esta infección pasen pronto a la historia.


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PRÁCTICAPRÁCTICA

3 3Observación de láminas con EfectoObservación de láminas con Efecto

CitopáticoCitopático

En cultivo de células el virus ingresa y prolifera en las células y en muchos sistemas célula virus, las células llegan a granular y a desintegrarse después de una hora días. Este efecto destructivo producido por el virus es conocido como efecto citopático.

Una línea de células no es susceptible a todos los virus, por lo que es necesario emplear diferentes células para los distintos virus.

1. Materiales: Láminas coloreadas con H-E (Hematoxilina Eosina) de la línea de células establecidas

Hep-2 (Carcinoma epidermoide de laringe) Lámina coloreada con H-E Hep-2 infectada con poliovirus. Lámina coloreada con H-E Hep-2 infectada con adenovirus Microscopio

2. Lectura de las Láminas: Lámina Hep-2 normales se observa una capa de célula poligonales unidas una con

otras, formando una alfombrilla. Lámina infectada con poliovirus (heces positivas de poliomielitis), se apreciará un

efecto citopatogénico, con células redondeadas, refringentes y desprendimiento celular (lisis celular).

Lámina infectada con adenovirus (exudado amigdalino positivo), se observa retracción celular, las células pierden su forma normal, el efecto citopático es caracterizado por la agrupación de células formando racimos.

AGENTE CITOPATOGENICOSSe deberá teñir con colorante citológico apropiado y examinar el área total de la monocapa celular teñida, para evidenciar cuerpos de inclusión, numero total de células Gigantes u otra indicación de anormalidad celular, atribuible a agentes extraños.

EFECTO CITOPATICO: Las alteraciones morfológicas que pueden ser visualizadas en microscopio óptico cuando células en cultivo son infectadas por virus, hasta cierto punto características para cada grupo de virus y que reciben el nombre de efecto citopático.El efecto citopático nos permite identificar a los virus, nos forma una base para el agrupamiento de este virus.Las alteraciones patológicas mas detalladas pueden ser estudiadas a través de cultivos celulares en monocamada, cultivadas sobre laminillas, en “tubos de Leihgton” (Son tubos de fondo chato, conteniendo una laminilla donde las

células en cultivo crecen en la laminilla). Después de aparecer el efecto citopático, causado por la infección de virus, las laminillas son fijadas, coloreadas a través de métodos citológicos de coloración como el método de Hematoxilina-Eosina, y montadas en laminas de microscopio


LAMINILLA

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Prueba de Hemoaglutinación comoPrueba de Hemoaglutinación como diagnostico de virusdiagnostico de virus

Una variedad de virus animales han demostrado aglutinar glóbulos rojos como una particularidad de la partícula viral o uno de sus componentes, formando puentes entre los receptores virales y los glóbulos adyacentes.

La heterogeneidad en la capacidad viral para hemaglutinar se puede clasificar de acuerdo a:

La naturaleza de las hemaglutininas (separables o inseparables de la partícula viral) La naturaleza de la unión formada con los eritrocitos. La potencia de las hemaglutinina para destruir los receptores.

Estos aspectos diferenciales en la hemoaglutinación tienen aplicación diagnóstica.

El virus de la influenza es un modelo interesante para esta demostración y se distinguen por que el antígeno aglutinante o antígeno V ubicado en las proyecciones de la envoltura del virus produce una hemoaglutinación que pasando unas horas se disocia o diluye por acción de la neuranimidasa del virus, que rompe los receptores permitiendo la recuperación del virus.

El antígeno aglutinante está asociado a la producción de inmunidad.

1. Reactivos: Virus: antígeno hemaglutinante Glóbulos rojos de cobayo o humanos grupo = al 4% en sol. Salina. Solución tampón 7.2 como diluente

2. Procedimiento: En una gradilla con tubos de 13X100 colocados en una bandeja con hielo, hacer

diluciones del virus de 1/10 hasta 1/120. Añadir la solución de glóbulos rojos en cantidad de 0.5 a cada tubo de la dilución. Tubo control de hematíes con 0.5 de hematíes más 0.5 de sol. Salina. Agitar fuertemente e incubar a temperatura ambiente por 60´.

3. Lectura: El punto final de la titulaciones la dilución más alta de virus que causa

hemoaglutinación completa y esta representa una unidad hemaglutinante. El titulo de la hemoaglutinación se expresa como la dilución más alta hemaglutinante. El control de hematíes debe contener un botón de hematíes.


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Ejemplo de un procedimiento por hemoaglutinación para enfermedad de Newcastle

VIRUS HEMOAGLUTINANTES

Muestras de frascos de 0,2 ml del producto final son extraídas e inoculadas a 10 huevos embrionados de 9 a 10 días de edad, provenientes de lotes susceptibles a la ENFERMEDAD DE NEWCASTLE, vía cavidad alantoidea. Cinco embriones de la misma edad y lote, no inoculados servirán de control negativo.

Se deberá testar una muestra de fluido alantoideo del virus de Newcastle como control positivo. Tres a cinco días después de la inoculación, la muestra del fluido alantoideo de cada huevo deberá ser controlada separadamente por la prueba rápida en placa, para constatar actividad aglutinante, usando una suspensión de hematíes frescos de gallina al 0,5 %.

Si los resultados son inconclusos deberán efectuarse 1 o 2 pasajes usando el fluido alantoideo. Fluidos de embriones vivos o muertos deben ser usados para confirmación por medio de estos pasajes.

Si se observase actividad hemoaglutinante significara que existe virus activo residual hemoaglutinante o de Enfermedad de Newcastle.

Virus de la polio Adenovirus


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PRÁCTICAPRÁCTICA

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Observación de Corpúsculos de Negri enObservación de Corpúsculos de Negri en láminas coloreadasláminas coloreadas

En la rabia, el virus tiende a concentrarse en ciertas áreas del Sistema Nervioso Central, donde están presentes los cuerpos de inclusión también llamados Corpúsculo de Negri, las áreas afectadas corresponden al tálamo, hipotálamo y núcleos de nervios craneales en el Asta de Ammon del hipocampo con menos frecuencia en la corteza cerebral, ganglios basal y en el núcleo de la neurona craneal.

1. Materiales: Láminas coloreadas con colorante de séller. Microscopio

2. Procedimiento: Las láminas serán observadas con lente de inmersión y tratar de enfocar los

Corpúsculos de Negri como inclusiones de 2 a 10 micras de diámetro son acidofilas y generalmente contienen gránulos basófilos.

3. Tomas de Muestra: Las muestras se pueden tomar de cerebro de perro (Asta de Ammon) y realizar

improntas en láminas porta objetos. También la muestra se obtiene del cerebro humano y se inocula en ratones lactantes.

4. Colorante de Séller:

Preparación de soluciones madre:A) Azul de Metileno 1gr. Metanol absoluto 1000 cc.B) Fucsina básica 5 g. Metanol 1000 cc.Se conservan ambas soluciones en frasco con tapa rosca o vidrio esmerilado.

Soluciones colorante:Sol. A 2 partesSol. B 1 parte

Se mezcla sin filtrar y se guarda en frasco de tapa rosca o vidrio esmerilado. Reposo 24 horas.


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AGENTE CITOPATOGENICOS

Se deberá teñir con colorante citológico apropiado y examinar el área total de la monocapa celular teñida, para evidenciar cuerpos de inclusión, numero total de células Gigantes u otra indicación de anormalidad celular, atribuible a agentes extraños.

En láminas coloreadas de cultivos celulares infectados por virus pueden ser visualizados los “corpúsculos de inclusión”, que en su citoplasma o en su núcleo, coloreadas mas intensamente en general circundadas por un halo. Los corpúsculos de inclusión pueden ser acidófilos(coloreados por eosina-rosa) o basófilos(coloreados por hematoxilina-rojo o azul).

En general, si se localizan coloraciones de corpúsculos de inclusión son característicos de determinados tipos de virus. Los corpúsculos de inclusión que pueden ser visualizados en cortes histológicos de tejidos infectados por virus provenientes de necropsias o biopsias.

A) Corpúsculo de inclusión de Citomegalovirus.B) Corpúsculo de inclusión de virus de la Rabia (Corpúsculos de Negri): Descubiertos por Negri, Aldeschi (1876-1912) el cual fue un médico italiano, que fue conocido por los corpúsculos que llevan su nombre, los cuales son característicos en los animales que mueren por la enfermedad de la Rabia, estos corpúsculos son inclusiones en el protoplasma de células nerviosas de la corteza, cuerno de Ammon y de los núcleos de los animales muertos de hidrofobia. Se consideran característicos de esta enfermedad.

Corpúsculo de Negri Rabia


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Vectores de Enfermedades ViralesVectores de Enfermedades Virales

Garrapata Piojo

Garrapata

Zancudo Liendre

(Gatos, perros, murcielagos, y otros transmiten el virus de la rabia generalmente)


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Método de Elisa como método para Método de Elisa como método para diagnostico de Enfermedades Viralesdiagnostico de Enfermedades Virales

ELISAEnzimoinmunoanálisis con inmunoadsorbentes

Prueba heterogénea de unión con proteínas que puede utilizar un ligando marcado con enzima que compite el ligando de la muestra por el anticuerpo inmovilizado en fase sólida.

En la prueba de ELISA, se emplea un anticuerpo inmovilizado a una fase sólida que tiene afinidad por un ligando (moléculas pequeña con unión no covalente) y que está marcado con la enzima.

Las enzimas utilizadas deben cumplir ciertos requisitos como:a) Poseer elevada actividad especifica.b) Las marcas son estables durante el ensayo y si conservan en refrigeraciónc) No deben estar presentes en líquido biológico que se analiza.d) La enzima retiene gran parte de su actividad cuando se fija al ligando o anticuerpo y deben dar sustrato cromógeno susceptible de ser medido.

El método ELISA puede estar basada en reacciones competitivas o en ensayos inmunométricos (sándwich) directos. Utiliza como sustratos sustancias cromógenas o fluorógenas susceptibles de ser medidos.

ESQUEMA DE ETAPAS

Leyenda:

Anticuerpo Ligando marcado con enzima Ligando

Sustrato Producto


LL

SS PP

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ESQUEMA DE ETAPAS

Etapa 1: Inmovilización del anticuerpo en fase sólida

Lavar Lavar

Fijación del anticuerpo en fase sólida Recubrir en superficie sólida expuesta con otro material proteico

Etapa 2: Reacción del antígeno Etapa 3: Medición de color con del anticuerpo movilizado desarrollado

Lavar Lavar

Añadir anticuerpo Añadir marcado con enzima sustrato

Enzima conviertesustrato en

productoproducto medido

como cambiode color

Ensayo inmunométrico (Sandwich)

Lavar

1) L 2) o-L S

Ensayo competitivo


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VV U N I D A DU N I D A D

Infecciones Micóticas

Superficiales y Profundas


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INFECCIONES MICÓTICAS SUPERFICIALES YINFECCIONES MICÓTICAS SUPERFICIALES Y PROFUNDASPROFUNDAS

Las micosis son infecciones producidas por hongos.

Las micosis superficiales son aquellas infecciones micóticas que están localizadas en la epidermis, pelos uñas, mucosas.

Las micosis profundas afectan la dermis y las vísceras.

Ciertas infecciones tales como la Candidiasis pueden ser superficiales y profundas.

Todo ser vivo lleva una doble designación (terminología binaria o binaminal), la del GENERO y ESPECIE: Ejemplo: Tríchophyton rubrum. El nombre del género se escribe siempre con mayúscula y funciona como sustantivo, en tanto que el de la especie se escribe con minúscula y funciona como adjetivo. En el ejemplo, rubrum indica la calidad (roja) del micelio en los cultivos. Escribir correctamente y subrayados por separados el género y la especie, es obligatorio en la presentación de los trabajos científicos.

Los hongos son aerobios y se nutren como las bacterias, por ósmosis.

La nutrición se asegura mediante fuentes nitrogenadas, hidrocarbonadas y minerales adecuados, disueltas en el agua.

Fuente nitrogenada: el nitrato de potasio, el sulfato de amonio, ácidos aminados como la asparragina o fuentes complejas como la peptona y prótidos son las utilizadas en los medios de cultivo.Fuentes hidrocarbonadas: glucosa, sacarosa, maltosa, almidón y ciertos alcoholes como el glicerol.Las sales minerales: sulfato de magnesio, fosfato monopotásico, cloruro de potasio y sulfato ferroso, el manganeso y cobre como microelementos.

La nutrición y respiración se opera por sistema enzimáticos o menos complejos.

MORFOLOGÍA Y BIOLOGÍA DE LOS HONGOS

Estos seres vivos son vegetales inferiores carentes de la propiedad de formar tejidos diferenciados (hojas, semillas, raíces, etc.) y se los clasifican dentro de las Thallophytas. Los hongos no poseen clorofila, son heterótrofos al no poder operar la fotosíntesis y son eucarióticos, es decir presentan un núcleo completo con membrana nuclear que los diferencia de las bacterias.

Los hongos tienen una amplia distribución en la naturaleza, viven en el agua, tierra, parasitando a las plantas, a los animales y al hombre, presentan interés en la realización de procesos industriales de fermentación, producción de ácidos orgánicos, elaboración de productos alimenticios, en la fitopatología, en la medicina veterinaria humana.

La MICOLOGÍA MÉDICA representa por lo tanto una parte relativamente pequeña de la MICOLOGIA GENERAL.

Los agentes productores de micosis humanas son hongos microscópicos que pueden pertenecer a los hongos verdaderos EUMYCETES o a los SCHIZOMYCETAS, del orden ACTINOMYCETALES. Estos últimos, aún cuando son bacterias, su estudio es realizado por los micólogos, pues presentan un cuerpo o tallo filamentoso y ramificado semejante a los hongos.

Las células de los EUMYCETOS presentan una pared celular gruesa formada por polisacáridos, polímero de glucosa y manosa (glucanos o mananes), semejantes a la quitina, que cubre a los insectos o a la hemicelulosa. Por dentro de la pared celular se encuentra la membrana citoplasmática, habitualmente fina,


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UNFV – FMHU que contiene esterol y envía hacia el citoplasma invaginaciones llamadas mesosomas. En el citoplasma se observan vacuolas, gránulos de reserva con glucógeno o lípidos, ribosomas, mitocondrias, retículo endoplásmico y un núcleo verdadero con membrana nuclear.

El cuerpo de los hongos se denomina thallo o micelio. El micelio vegetativo es la parte del hongo destinado a cumplir funciones de nutrición y crecimiento de la especie y el micelio de fructificación es la porción especializada para la propagación y reproducción a distancia.

El micelio vegetativo puede ser unicelular, filamentoso o seudofilamentoso. En el primero todas las células encuentran separadas entre sí; son esféricas, ovoides o cilíndricas y se reproducen vegetativamente por brotación, tabicamiento o un proceso intermedio en donde el brote se separa de la misma por un septo. En el micelio filamentoso las células se agrupan en tubos cilíndricos que se ramifican hasta formar una trama macroscópicamente visible. Las ramificaciones de este micelio se llaman hifas y presentan tabiques o son continuas (micelio cenocítico).

Cuando se examina una colonia de hongo filamentoso se percibe que éste está compuesto por una parte aérea que se dirige hacia la luz del tubo, un micelio rampante en la superficie del medio de cultivo e hifas sumergidas que penetran en la profundidad del mismo.

CLASIFICACIÓN GENERAL

La clasificación de los hongos se hace en base a todos los elementos morfológicos que presentan, tanto por aspecto macroscópico como por sus caracteres microscópicos.

Los EUMYCETES son divididos en cuatro clases principales:

A) PHYCOMYCETESSon hongos de micelio filamentoso continuo (cenocítico), su fructificación asexuada está generalmente constituida por esporangios o conidias y la sexuada por zigotes u oosporos.B) ASCOMYCETESHongos de micelio unicelular brotante, seudomicelio filamentoso, o micelio filamentoso ramificado y tabicado. Como fructificación asexuada presentan conidias y esporóforos con diversos grados de complejidad y como fructificación sexuada ascos con ascosporos, libres o dentro de ascocarpos.C) BASIDIOMYCETESHongos de micelio filamentoso, ramificado y tabicado o de micelio unicelular brotante. Poseen fructificaciones asexuadas muy diversas, conidias o picnidios con picnosporos y como fructificación sexuada esporos externos formados en una baside: basidiosporos.D) DEUTEROMYCETES O FUNGI IMPERFECTIEn esta clase se agrupan aquellos hongos cuya fructificación sexuada, si existe, es desconocida.

La clasificación de los hongos patógenos es un tema aún incierto, pues se encuentra en plena evolución, como lo demuestra el reciente descubrimiento de la fase sexuada de varios hongos productores de micosis pulmonares y algunos dermatofitos.

ACTINOMYCETALES

Existe un grupo de bacterias grampositivas con tendencia a formar filamentos ramificados, con toda una gama micromorfológica que va desde aquellas semejantes a Corynebacterium y Micobacterium, hasta aquellas con micelio filamentoso bien desarrollado, con micelio aéreo y de fructificación comparables a los de los Eumycetes. Se los clasifica, sin embargo, dentro de los Schizomycetes o bacterias, por los caracteres siguientes: a) su diámetro reducido, alrededor de 1 u; b) carecen de pared celular y de núcleos diferenciados; c) son sensibles a los “phagos” y antibióticos antibacterianos.

Dentro de este orden existen tres géneros de importancia médica:

1) Actinomyces; 2) Nocardia; 3) Streptomyces: 4) Actinomadure


Gémulas

Vacuolas

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Morfología de los hongos

Saccharomyces sp Hifas Septadas


Hifas en espiral Hifas en cuerno de anto Candelero fávico

Hifa pectinada Hifa clavada Hifa raqueta Cuerpo Nodular

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Hifa no septada

Hifa Septada

Reproducción sexual


Reproducción sexual por Basidiosporas en Basidiomycetes

Reproducción sexual por Oosporas unión de los gametos masculino y femenino

Himenio

Basidiospora

x1000Basidio

Anillo

Pileo

Esterigma

Hifa vegetativa

Blastosporas gemando de un pseudomicelio

Conidios

Conidóforo

Vesícula

Rhizopus sp.

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REPRODUCCIÓN ASEXUAL


Hongo dimorfo levaduriforme (Candida albicans) mostrando varios tipos de células: filamentos fungiformes, unas pocas células levaduriformes;

blastosforas en racimos como uvas cerca de las septas hifales y clamidosporas mayores, circulares, de paredes gruesas

Conidiosporas terminal Artrosporas

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CLASIFICACION DE LAS MICOSIS SUPERFICIALES

Los hongos productores de enfermedades en el hombre, se clasifican según su ETIO-PATOGENIA en dos grandes grupos:

1.- MICOSIS SUPERFICIALES2.- MICOSIS PROFUNDAS

PIEDRA BLANCATrichosporum baigellTrich. giganteumTrich. granulosum

Piedra NEGRAPiedraia hortai

I.- PILONODOSIS: Forman nódulosTRICOMICOSIS AXILAR FLAVANocardia tenuisTRICHOMICOSIS AXILAR RUBRANoc. Tenuis mas Micrococcus nigrescensTRICOMICOSIS AXILAR NIGRANoc. Tenuis mas Micrococcus nigrescens

ERITRASMANocardia minutissima (no cultivable)

1.- QUERATOMICOSIS NO PITRIASIS VERSICOLOR DERMATOFITICAS Malassezia furtur

TINEA NEGRA PALMARIS (CladosporiosisExophiala Werneckil epidérmica)

TIÑEAS

II.- QUERA- MICROSPORIAS: Sus agentes TOMICOSIS Microspum canis

M. gypseumM. audouini y otros

2.- QUERATOMICOSISDERMATOFITICAS TRICOFITIAS: Sus agentes

Thichophyton mentagrophytesT. rubrum, T. Tonsurans y otros

EPIDERMOFITIA:(eccema marginado de hebra)Epidermophyton Floccosum

LAS DERMATOMICOSIS son enfermedades superficiales causadas por diferentes hongos. Por lo tanto, una DERMATOFITOSIS será siempre una dermatomicosis, pero no siempre una dermatomicosis es dermatofitosis.

LEVADURAS: que se localizan CANDIDIASIS: Sus agentesen la piel, mucosas, Candida albicansuñas, (perionixis) (onixis) C. Trobicalis

C. ParadruselCorloretinitis (ojos) Rhodotorula sp.


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PRÁCTICAPRÁCTICA

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Infecciones de la Piel producidas porInfecciones de la Piel producidas por DermatofitosDermatofitos

Las infecciones de la piel, también pueden ser causadas por hongos patógenas, produciendo lesiones superficiales conocidas como: DERMATOMICOSIS, los grupos de hongos más frecuentes corresponden a Dermatofitos y Levaduras. Las principales especies de Dermatofitos estan agrupadas en los generos: Trichoplyton, Microsporum y Epidermophyton, los que tienen tropismo por el tegumento cutáneo en donde proliferan a expensas de la queratina, cistina y metionina; circunscritas a la piel y anexos caracterizadas por maculas eritomatosas, prurigionosas, que luego se torna descamativas, en la mayoría de los casos tienen formas irregulares y bordes definidos localizados en cualquier zona de la superficie corporal. Cuando estan comprometidas las uñas, están cambian de coloración, se torna Hiperqueráticas son friables, fragmentándose espontáneamente; en los cabellos hay destrucción del folículo y caída de pelo.

Las levaduras patógenas del genero CANDIDA, producen infecciones agudas o crónicas de piel y/o mucosas (vulvovaginitis, muguet, y omnicomicosis).

Muchos de los Dermatofitos se encuentran en el suelo y/o infectando animales domésticos, estos pueden transmitir la infección al hombre: (ZOONOSIS).

Ciertos hongos como Malasezzia furfur parasitan el estrato más superficial de la piel, dando manchas grisáceas ó violaceas con descamación fina (tiña versicolor o pitiriasis versicolor).

I. CONDICIONES Y TOMA DE MUESTRA DE PIEL

Se debe tomar la muestra antes de iniciar la terapia antimicótica en caso contrario, suspender el tratamiento 5 días del estudio micológico.

Si existe infección bacteriana asociada, someter al paciente a un tratamiento de antibióticos, antes del estudio micológico.

La recolección del material patológico, se hace en condiciones de asepsia en pacientes estériles y en cantidad suficiente. Si se trata de lesiones del cuero cabelludo, retirar los pelos de la zona infectada con una pinza estéril, luego con una tijera corta más o menos a un cm. del bulbo piloso, depositando esta parte en el perfil estéril, desechando la parte distal del pelo.

Si se trata de lesión de uña obtener fragmento con tijeras o practicar el raspado con bisturí, recogiendo los detritus de la uña enferma en una placa Petri estéril.


UNFV – FMHU II. PROCEDIMIENTOS

1. Examen directo de la muestras: Con el asa de siembra en ángulo y humedecida, depositar una pequeña cantidad de la

muestra de escamas, pelos y uñas sobre una gota de KOH, al 20% que previamente ha sido colocado en una lámina porta objeto.

Cubrir el preparado con una lámina y calentar suavemente a la llama de un mechero, con el fin de facilitar su aclaración (digestiva de querantina y otras sustancias).

Observar al microscópico con menor y mediano aumento: si se trata de hongos dermatofitos se observará la presencia de hifas refrigeradas, tabicadas. Si se trata de MALASEZZIA FURFUR se observará hifas cortas de extremos romos, irregulares, cilíndricas, curvas, al lado de elementos redondeados agrupados en racimos (Microconidias).

El diagnóstico se hace por examen directo de la muestra por su morfología, características.

2. Cultivo: El estudio de la colonia se hace en cultivos en medio AGAR SABOURAUD,

Glucosado (ASG) que se puede observar a partir del 5to. día al 8vo. días de incubación tanto por las características microscópicas (pigmentación, aspecto de la colonia, esporas, modificaciones de filamentos, etc.)

Para la microscopia se toma un fragmento de la colonia depositándolo sobre una gota de colorante azul de lastofenol en lámina porta-objeto, cubrir el preparado con una laminilla.

Observar al microscopio, con objetivos de mayor y menor aumento. El estudio microscópico se puede observar también en microcultivos.

Tricophyton tonsurans.- Desarrolla colonias membranosas, crateriformes o cerebriformes de consistencia dura, con pigmentación amarillo castaña; al microscopio se observan microconidas piriformes, otras filiformes dispuestas a los dados que en conjunto se parecen al gusano de “Cien pies”, además hay abundancia de clamidosporas, hifas en raqueta y puede desarrollar Macroconidias.

Tricophyton mentagrophytes.- Desarrolla colonias blanquecinas pulverulentas a veces con micelio aéreo elevado, con producción de pigmenta amarillo parduzco en el reverso de la colonia. Al microscopio se observan hifas septadas, con abundantes microconidias esféricas, formando pequeñas agrupaciones, también presentan hifas en espiral, ocasionalmente se pueden observar macroconidias.

Tricophyton rubrum.- Presente colonias de micelio aéreo blanco, elevado de aspecto algodonoso y en el reverso pigmento de color rojo púrpura, al microscopio se observan hifas septadas, con microconidias sésiles piriformes, algunas veces puede observarse macroconidias en forma de salchicha, cuerpo nodulares, y clamidosporas.

Microsporum gypseum.- Presente colonias filamentosas, poco elevadas pulverulentas con producción de pigmento de color canela. Al microscopio se observan hifas septadas macroconidas, con tabiques transversales, constituyendo 4 a 6 células, de pared delgada de superficie lisa agrupadas en racimo, se encuentran escasas microconidias.

Microsporum canis.- Desarrolla colonias de micelio aéreo velloso, de color blanquecino, poco elevado, con pigmento amarillo naranja más notable en el reverso de la colonia. Al microscopio se observan típicas Macroconidias fusiformes o elipsoidales, hasta con 8 tabicaciones trasversales y con granulaciones en la superficie, también se puede observar microconidias y clamidosporas.

Epidermophyton flocosum.- Desarrolla colonias de aspecto pulverulenta de color amarillo azufre con pliegues que se forman en el centro de la colonia, al centro se observa al microscopio macroconidias de pared celular delgada, con extremo distal romo y una base de implantación angosta, con 3 a 4 tabiques transversales que se encuentran aisladamente dispuesta en racimo. El hongo presenta clamidosporas y carece de microconidias.


UNFV – FMHU III. RESUMEN DE CASOS CLÍNICOS

Caso N° 1Paciente con lesiones descamativas, eritematosas pruriginosas, localizadas en la región inguino-crural, en forma bilateral con dos años de evolución.

Caso N° 2Paciente que presenta uñas con cambios de coloración perdida de brillo, estrías transversales en uñas de los dedos pulgar y anular de la mano derecha, con 8 meses de evolución, acompañado de un gran componente inflamatorio peri-ungueal.

Caso N° 3Paciente que presenta numerosas placas pequeñas hipocrómicas de forma redondeada, poco descamativas con prurito discreto, localizadas en el tronco anterior y cuello con 3 años de evolución.

Tratamiento: KETOCONAZOL Tab. 10 mg. Diagnóstico presuntivo: Caso N° 1 Dermatomicosis

Caso N° 2 OminicomicosisCaso N° 3 Pitiriasis Versicolor

Tipo de muestra: Caso N° 1 Escamas de región inguino - cruralCaso N° 2 Fragmentos de uñasCaso N° 3 Escamas de región del tronco

DERMATOFITOS: Estructuras Microscópicas Diferenciales


Microsporum canis

Microsporum gypseum

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Epidermophyton flocosum

Tricophytum mentagrophytes

Tricophytum rubrum

Tricophytum tonsurans

157

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PRÁCTICAPRÁCTICA

2 2Infecciones cutáneo-mucosa producidasInfecciones cutáneo-mucosa producidas

por Candida Albicans y por Sporothixpor Candida Albicans y por Sporothix SchenkiiSchenkii

Las CANDIDISIS, es causada especialmente por Candida albicans, es una infección aguda, o subaguda en el cual el hongo puede producir lesiones en la boca, piel y uñas bronquios y pulmones, vagina, cuello uterino. Estas levaduras pueden encontrarse normalmente en cantidades moderadas en la piel, mucosa oral y material fecal.

Sporothrix schenkii es un hongo cosmopolita, que vive en el suelo de las plantas, madera, ambientes cerrados y húmedos; produce la Esporotricosis en el hombre y en algunos animales. El hongo se implanta en la piel, generalmente mediante un traumatismo con restos punzantes de vegetales y otros objetos contaminados. La infección prevalente está localizada en los linfáticos cutáneos, pueden estar en las mucosas, raramente en las visceras, la forma linfático-cutánea es la mas frecuente, se presenta de inicio en el lufar de inóculo porsteriormente aparecen varios nódulos satélites siguiendo el trayecto de los linfáticos subcutáneos “NÓDULOS EN CORDÓN” que pueden abrirse y dar ulceras indoloras llamadas “Chancro Esporotricótico” ó en “ROSARIO”.

Si se trata de secreción vaginal, recoger la muestra con una torunda estéril, del fondo del saco vaginal y conservarlos en suero fisiológico con antibióticos.

Los abscesos o ganglios infectados se punzan con jeringa hipodérmica y aguja estériles, luego depositar en recipientes estériles.

Las biopsias o necropsias se separan en dos fragmentos uno para el cultivo y otro para incluir en solución fijadora (formol 10%) para el estudio histopatológico.

I. PROCEDIMIENTO

1. Examen directo: Las secreciones, pus, etc. son preparadas en frotis sobre láminas limpias, para la

coloración GRAM y ZIHEL NEELSEN. Al microscopio si se trata de C. albicans, se observará células redondeadas u ovaladas

con yemas Gram positivas, S. shenckii no capta ningún colorante de uso común de ahí que el examen directo se utiliza tan solo para descartar otros microorganismos.

2. Cultivo: Si se sospecha de C.albicans, sembrar la muestra de secreción vaginal en un tubo de

ASG, Agar Mycobiotic a los dos o tres días de incubación a temperatura ambiente ó 37 grados C°, se observa la presencia de colonias de aspecto cremoso y consistencia de color perlados; para la identificación final es necesario cultivar una de las colonias en Agar Almidón Arroz, donde por se un medio bastante empobrecido se forman las típicas CLAMIDOSPORAS, Pseudomicelio y Blastosporas, que identifican a CANDIDA ALBICANS.

Si se sospecha de Sporothix schenkii por ser un hongo dimórtico, la muestra se cultiva en ASG a 26 C° y medio AGAR sangre a 37 C° . En el primer caso desarrolla colonias en un comienzo pequeñas blanquecinas húmedas, carecen de micelio aéreo algodonosos a medida que aumenta el crecimiento, la superficie de la colonia adquiere aspecto


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rugoso y membranosos, el color puede variar de crema a negro según el tiempo medio de cultivo y cepa. Al microscopio se aprecia hifas finas tabicadas, portadora de conidióforos cortos en cuyo extremo se encuentran las conidias agrupadas dando al aspecto de una FLOR DE MARGARITA. En agar sangre, desarrollan formas levaduriformes; al microscopio se observan células en gemación, forma de un cigarrillo, GRAM positivas, en forma similar se observan en frotices procedentes de animales inoculados.

II. RESUMEN DE CASOS CLINICOS

Caso N° 1Paciente en estado de gestación, que desde hace 4 meses presenta prurito intenso vulvo vaginal y abundante secreción blanquecina grumosa.

Tratamiento: Óvulos de NISTATINA

Diagnostico de presunción: Vulvo vaginal candidiásica

Tipo de muestra: Secreción vaginal

Caso N° 2Paciente que en el dorso de la mano, con inicio en el dedo índice derecho presenta lesiones Ulcero-Costrosas y gomosas, de bordes elevados con secreción sero purulenta, rodeada de un Halo Violáceo, no dolorosa y sin infiltración profunda. Las lesiones se inician hace 2 meses con la presencia un grano pruriginosos + - de 0.5 cm. de diámetro con necrosis central de color parduzco y componente inflamatorio localizados en la región pulpar del dedo como consecuencia de traumatismo con astilla vegetal, una semana después el nódulo se reblandeció dejando de salir material purulento, la lesión se fue extendiéndose progresivamente en forma ascendente produciendo una lesión de nódulos dispuestos en cadena de “Rosario”.

Tratamiento: Tintura de lodo ITRACONAZOL

Diagnostico de presunción: Esporotricosis

Tipo de muestra: Secreción de nódulo cutáneo


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GENERO CANDIDA

Examen directo de muestra: Cultivos:

SPOROTHRIX SCHENCKII

EN TEJIDO EN CULTIVO AGAR EN CULTIVO ADS(Inoculación experimental) BHI (37 °C) Conidias en racimo


a)

b)

1) En ADS

2) En AGAR EXTRACTO DE ARROZ

b)

b)

d)

Candida sp. Candida albicans

a) Levaduras gemantesb) Yemas ó blastosporas

c) Pseudomiceliod) Clamidosporas

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UNFV – FMHU Manifestaciones clínicas de infección por Candida albicans en pacientes con VIH

Las especies de Candida pueden ocasionar cualquier tipo de patología en el paciente VIH+, si bien con fines didácticos se suelen establecer dos grandes grupos de infecciones: las de las mucosas y las de los órganos profundos.

Infecciones de las mucosas: Incluyen el muguet, esofagitis y vaginitis entre las principales; pero también tienen entidad propia la afectación de la mucosa del tubo digestivo no esofágica, balanitis, candidiasis cutánea, foliculitis, intertrigo, onicomicosis, candidiasis perianal, etc.

Infecciones de órganos profundos: Incluye la candidiasis del sistema nervioso central (SNC), la cardíaca, la urinaria, la respiratoria, la osteoarticular, la ocular, la candidiasis diseminada ... La afectación del SNC por CA se suele producir en el contexto de una candidiasis diseminada: puede existir afectación del parénquima cerebral y de las meninges. Las lesiones suelen ser microabscesos y la sintomatología es variable pudiendo manifestarse inicialmente como un coma. En el corazón CA puede causar endocarditis, miocarditis y pericarditis. Por lo general la candidiasis diseminada y su repercusión sobre otros órganos es infrecuente en los pacientes VIH+.

Muguet o aftas bucales

La infección de la cavidad bucal por CA es frecuente. El muguet es el término que se aplica a la aparición de placas blanquecinas, a modo de leche cuajada, que se observan en la lengua y otras partes de la boca y que pueden desprenderse con raspado dejando un lecho sangrante. Puede ser asintomático pero es usual la deglución dolorosa, la alteración del sabor de los alimentos y, como consecuencia, la inapetencia y malnutrición. Esofagitis

Aunque no siempre es así, la invasión por CA del esófago se considera como la extensión de una candidiasis oral. En las paredes del esófago se forman pseudomembranas similares a las del muguet. Las lesiones producen denervación del esófago por lo que en algunos casos pueden ser asintomáticas. Se suele presentar dificultad para la deglución, dolor retroesternal, náuseas, vómitos; puede ocasionarse hemorragias por ulceración y perforaciones.

Vaginitis

La infección por CA es causa frecuente de vaginitis en mujeres, sean o no inmunodeficientes. Suele existir un flujo vaginal abundante y sobre todo predomina el picor; la vagina y los labios presentan eritema que se puede extender al periné.


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PRÁCTICAPRÁCTICA

33Hongos que afectan el tractoHongos que afectan el tracto

respiratorio:respiratorio:Paracoccidioides, Histoplasmas yParacoccidioides, Histoplasmas y

AspergillusAspergillus

Las infecciones respiratorias de etiología micótica son ocasionadas generalmente por hongos dimórficos: Histoplasmas Capsulatum, y Paracoccidioides Brasilensis, normalmente se encuentran distribuidos en la naturaleza en su forma micelial, sobre los excrementos de las aves, excremento murciélagos, (Histoplasma) ó bien sobre el suelo, en las plantas, maderas etc. (Paracoccidioides). Estos microorganismos se localizan en los pulmones mediante la aspiración de material contaminado o implantándose por inoculación (astilla, espinas y vegetales) pasando de forma micelial a la forma Levaduriforme.

El histoplasma capsulatum: Inicialmente produce una infección primaria que muchos casos puede ser asintomáticas. Las lesiones pulmonares se caracterizan por se diseminadas en ambos campos pulmonares.

Paracoccidiodes brasilensis: Generalmente infecta a los pulmones por propagación secundaria a partir de otro foco (por ejemplo, mucosa oral).

Algunos hongos saprofitos como ASPERGILLUS FUMIGATUS, poseen patogenicidad condicionada causando infecciones pulmonares generalmente secundarias a otros procesos crónicos como infecciones bacterianas pulmonares, enfermedades consuntivas, o enfermedades metabólicas; también pueden ser consecutivas en algunos casos al uso indiscriminado de drogas inmunosupresoras y antibióticos de amplio espectro.

I. CONDICIONES Y TOMA DE MUESTRA

Cuando se trata de muestras de esputo, esta se tomara por la mañana previo enjuagado de la boca, con solución de lugol, a fin de eliminar bacterias comensales y hongos saprófiticos de la cavidad oral, procurando que muestra sea por expectoración y se sospecha de una ASPERGILIOSIS se recomienda un aspirado bronquial.

Cuando se trata de una biopsia, esta será dividida en 2 fragmentos siendo depositada una de ellas en frascos con suero fisiológico estéril, con antibióticos, servirá para los cultivos, inoculaciones y examen directo: en fresco y coloraciones. El otro fragmento se colocará en un frasco con fijador para el estudio histopatológico.

II. EXAMEN DIRECTO

1. Esputo o aspirado bronquialEn una lámina porta objetos limpia, depositar uno o dos gotas de la muestra y en igual cantidad agregar KOH al 20% cubrir con una laminilla y observar al microscopio, también preparar frotices para su coloración con LEISHMAN, GRAM y ZIEHL-NEELSEN.

H. Capsulatum


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En frotis coloreados, como en cortes histopatológicos, se observan como levaduras pequeñas, ovales y redondas, cubiertas con un discreto halo capsular, contenidas en interior de histiocitos y en ocasiones polimorfonucleares.


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Paracoccidiodes brasilensis En fresco o en frotis coloreados, presenta células esféricas u ovaladas de gran tamaño,

con doble membrana y multigemantes.

Aspergillus fumigatus Se caracteriza por presentar micelios cortos de pared gruesa, color amarillo verdoso,

que en su extremo distal se ensanchan para dar lugar a la cabeza aspergilar que contiene en su superficie estructuras celulares denominadas “ESTERIGMAS” que se continúan con cortas cadenas de conidas.

III. CULTIVO

Para el caso de los hongos dimórficos, la muestra patológica se siembra en ASG con antibióticos y placas de Agar BHI o Agar sangre incubándose a temperatura de laboratorio y 37 °C respectivamente.

Si se sospecha de una Aspergiliosis el cultivo se hace en medios como ASG o agar Papa-Dextrosa, es importante el cultivo de muestra seriada de dar diagnóstico en todos los cultivos debe desarrollar el mismo hongo, a fin de considerar como muestra práctica positiva.

Histoplasma capsulatumEn AGS a temperatura del laboratorio, produce colonias algodonosas de desarrollo exuberante. Microscópicamente se observan hifas tabicadas y ramificadas con producción de Microconidias piriformes y gran cantidad de Macroconidias esféricas tuberculadas (Clamidisporas tuberculadas) células esféricas de pared gruesa con múltiples excreciones superficiales. En agar BHI a 37 °C desarrolla colonias pequeñas de aspecto membranoso, rugosos de color beig (marrón claro) al microscopio se observan levaduras pequeñas, células ovaladas y gemantes.

Paracocidioides brasilensisEn ASG produce colonias de micelio algodonoso de desarrollo superficial, escaso de crecimiento lento. Macroscópicamente se observan hifas tabicadas y ramificadas con microconidias periformes. En Agar BHI o Agar sangre a 37°C, produce colonias cremosas, generalmente cerebriformes, de color beiges . Microscópicamente se observan células esféricas de doble pared multigemadas que a la visión del observador se asemeja a un: “Timón de Barco”.

Aspergillus spDesarrolla colonias filamentosas de crecimiento rápido de color verde oliva, al microscopio se observa micelios gruesos reptados con conióforos que se ensanchan en su extremo distal la cual esta dispuestos radialmente a los “Esterigmas” que se continúan en cortas cadenas de conidias.

IV. RESULTADOS DE CASOS CLINICOS

CASO N° 1Paciente adulto, joven Espeleólogo procedente de Tingo María. Hace 30 días presento resfriado común y dolor de garganta, actualmente sensación de alza térmica, dolor osteo – muscular, tos con expectoración mucosanguinolenta y agrandamiento de abdomen.

Tratamiento: ANFOTERICINA B LIPOSOMAL

Tipo de muestra: ESPUTO Y BIOPSIA

CASO N°2 Paciente de sexo masculino, agricultor, en mal estado general, procedente de Satipo (Chanchamayo), presenta disnea de refuerzo, tos persistente con expectoración mucopurulenta y dolor toráxico bilateral en las regiones basales, hace un año se constata una lesión tumoral ulcerada en la región Orofaríngea y en


UNFV – FMHU las mucosas de las encinas superior derecha de apariencia granulomatosa y movilización espontánea de las piezas dentarias en dicha zona. Como antecedente destaca el hábito de hacer utilizado astilla vegetales en su limpieza dentaria.

Tratamiento: ANFOTERICINA B LIPOSOMAL

Tipo de muestra: ESPUTO Y BIOPSIA

CASO N° 3Paciente de sexo femenino, en aparente estado general, presenta tos, expectoración hemoptoica y hemoptisis, seguida de cuadro febril, dolor en el hemitorax izquierdo. Molestia con un periodo de evolución de 2 años. La Baciloscopia para descartar tuberculosis en 6 ocasiones fueron negativas, al examen tomográfico muestra una imagen cavitaria en el vértice izquierdo con opacidad central.

Tratamiento: TUBERCULOSTATICOS

Diagnostico de presunción: MICOSIS PULMONAR

Tipo de muestra: ASPIRADOS BRONQUIAL


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PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS

HISTOPLASMA CAPSULATUM

3. EN CULTIVO ADS (25 °C)


EN TEJIDO EN CULTIVO AGAR BHI EN CULTIVO ADS (37 °C) (25 °C)

1. CÉLULAS LEVADURIFORMES 2. EN CULTIVO AGAR BHI EN MACROFAGOS (37 °C)

MICRÓSCOPIA DE LUZ VISIBLE MICROSCOPIA ELECTRONICA DE BARRIDO

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PRÁCTICAPRÁCTICA

44Infecciones neurológicas: CryptococusInfecciones neurológicas: Cryptococus

NeoformansNeoformans

Comprende cepas patógenas y no patógenas producidas en pacientes inmunodeficientes (Ejemplo SIDA), infecciones en el S.N.C. El hongo se desarrolla sobre sustancias orgánicas ricas en derivados nitrogenados como la creatinina y otros (excreta de aves como la palomas, etc.) de donde se dispersa el ambiente natural.

La vía de ingreso del hongo generalmente es por vía respiratoria, por inhalación justamente con partículas de polvo de los pulmones, por vía hemática pasa al S.N.C donde se localiza produciendo tumoraciones (CRIPTOCOCOMA) produciendo sintomatología, de acuerdo a su ubicación en el cerebro.

I. CONDICIONES Y TOMA DE MUESTRA

Tomas la muestra del L.C.R. por punción del canal raquídeo y en lo posible de iniciar la terapia antibiótica.

Colectar el L.C.R. en tres tubos estériles, para el examen microbiológico, citológico y químico.

II. PROCEDIMIENTO

1. Examen directo: Observar el aspecto macroscópico del L.C.R. (transparente) Preparación de la muestra patológica Hacer preparaciones en fresco, con tinta china del centrifugado del L.C.R. colocando

una gota de sedimento sobre una lámina porta objeto, añadir luego igual cantidad de tinta china, emulsionarla y luego cubrir la laminilla.

Tanto en los preparados en fresco, frotis coloreados y cortes histológicos de cerebro, el C. NEOFORMANS, se observa como células redondas u ovaladas (del tamaño de un linfocito) gemantes delgadas y redondeadas , de una amplia cápsula de mucopolisacáridos refringente, la cual se observa mas nítidamente en preparados de tinta china.

III. CULTIVO

C. NeoformansEn ASG desarrolla colonias mucoides viscosas y brillantes de color blanquecino con el tiempo cambia a color ocre y con deslizamiento al fondo del tubo de cultivo.

C. NeoformansEn agar urea, hidroliza la urea por producir ureasa.

IV. RESUMEN DEL CASO CLINICO

Paciente de sexo masculino, de 35 años de edad, TEST de ELISA (Positivo) para infección de VHI, presenta sensación de fiebre, acompañado de cansancio, nauseas explosivas, vómitos, cefales frontal


UNFV – FMHU intermitente, que va aumentando de intensidad y se hace permanente, además presenta compromiso del estado mental desorientado, dolor en el cuello y expectoración blanquecina. Destaca que existe un palmar junto a su casa.

Impresión diagnostica: MENINGOENCEFALITIS

Tipo de muestra: L.C.R

ASPERGILLUS

CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS

1. EN TEJIDO 2. EN CULTIVO ADS (37 °C)

Células gemantes y cápsula gigante


Conidios

Esterigma de dos series

Vesícula

Conidioforo

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PRÁCTICAPRÁCTICA

55Agentes de MicetomasAgentes de Micetomas

Micetoma, es una infección caracterizada por tender a deformar por aumento de volumen el órgano afectado que ocurre por necrosis tanto de tejido blando como de estructuras óseas, piel, mediante múltiples causales (canales) o fístulas por donde drena secreción de exudado serohemático o purulento que contiene acumulados pequeños del microorganismo causante, en forma de “Granos o Granulos”. Según el agente causal pueden encontrarse:

1. Micetomas Eumicoticos, cuando el agente es un hongo verdadero:2. Madurella mycetomi, M. grisea, Allescheria boydii, Pyrenochaeta, etc., hongos saprofiticos que

se desarrollan sobre restos de vegetales en descomposición.3. Micetomas Actinomicóticos, causados por Actinomycetos que comprenden especies patógenas

anaerobias y aerobias: Anaerobias: Actinomyces isrraelí, A. bovis, saprofitos que pueden encontrarse

normalmente en los diente con caries, criptas amigdalianas apendica etc. Aerobias: Nocardia asteroide, N. brasilensis, Actinomadura madurae, Streptomyces

somalienses, etc. Que viven en el suelo y sobre todo en el tallo de algunos cereales almacenados de donde contaminan al hombre por inoculación a través de pequeñas heridas.

I. CONDICIONES DE LA TOMA DE MUESTRA

El hongo (granos o gránulos) se pueden recoger en una gasa aplicando en la abertura de la fístula o mediante incisión de un absceso o por respiración de secreción de la fístula aplicando directamente una pipeta pasteur. La muestra también se obtiene por biopsia de tejido afectado.

II. PROCEDIMIENTO

1. Examen directo: Examinar el material patológico obtenido (pus, exudado) con KOH 20% con objetivo

seco, identificado los granos, diferenciarlos en cuanto a su color, consistencias y tamaño.

M. mycetomi, se observa “granos gruesos” de forma irregular y consistencia dura. Actinomyces isrraelí, se observa los típicos granos amarillentos con finas

ramificaciones periféricas “los granos Azufrados”, o pequeñas masas de filamentos ramificados del mismo color. En frotis coloreados son gram positivos. En cortes histopatológicos se observa el grano con las típicas “Clavas Periféricas”.

Nocardias: se observa como una filamentación fina ramificada que al fragmentarse se observa de formas Bacilares parcialmente acido-alcohol resistente. A su coloración son Gram Positivos.


UNFV – FMHU III. CULTIVOS

Madurella mycetomi.- En medio ASG a 37° el desarrollo es óptimo la colonia es filamentosa de aspecto velloso, de color ocre o marron amarillento, ocasionalmente puede ser cerebriformes.Es característicos la producción y difusión en el medio de cultivo de un pigmento marrón oscuro intenso, que cambia de color el medio de cultivo.A la microscopia se observa micelios, estériles tabicados y clamidosporas abundantes intercalares o terminales semejándose a un rosario. En el medio Agar Czapeck se forman “esclerosis oscuros” que se aprecian a simple vista.

1. Actinomyces.- En caldo thioglicolato a 37 ° o Agar BHI semisólido producen colonias suspendidas de color ligeramente amarillas.

2. Nocardia.- En medio ASG incubados a 37°C en aerobiosis o a la temperatura del laboratorio se desarrolla.

N. asteroides.- Colonias secas, de aspecto pulvurento de color blanquecino rosado. N. brasilensis.- Colonias membranosas de superficie corrugada y color amarillento

naranja, tanto en cortes histopatológicos coloreados con Zihel -Neelssen, así como de cultivos, se observan filamentos finos ramificados sin tabique (cenocíticos) que al fragmentarse se observan de formas parcialmente ácido-alcohol resistentes.

III. RESUMEN DE CASOS CLINICOS

CASO N° 1Paciente de sexo masculino de 50 años, agricultor, procedente de Huaraz, con enfermedad de 6 años caracterizada por aumento progresivo de volumen de pie izquierdo el cual presenta múltiples abscesos, necrosis de tejido, fistulización en el dorso de pie, por donde drena material purulento con granos oscuros.

Impresión diagnostica: Micetoma MaduromicóticoTipo de muestra: Secreción de Fístula

CASO N° 2Paciente de sexo masculino de 45 años de edad, agricultor, procedente de Abancay, que hace dos años presenta en el pie derecho lesiones verrucosas ulcero-vegetantes fistulizados y sanguineolientas que últimamente va deformándose con aumento de volumen.

Impresión diagnostica: Micetoma MaduromicóticoTipo de muestra: Secreción de Fístula

CASO N° 3Paciente de sexo femenino, procedente de Huancayo, en buen estado general, que presenta lesiones ulceradas y fistulizadas a nivel del ángulo de la mandíbula inferior, la lesión es indolora y de consistencia dura a partir de una de las fístulas drena material purulento como gránulos amarillentos, con gránulos pequeños menor de 1mm de diámetro.

Impresión diagnostica: Actinomicosis Cervico FacialTipo de muestra: Secreción de Fístula


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MADURELLA MYCETOMII

1. EN TEJIDO 2. EN CULTIVO ADS (37 °C)

ACTINOMYCES ISRRAELII

1) EXAMEN DIRECTO DE MUESTRAS 2. CULTIVO EN AGAR BHI (Grampositivo) (Anaerobiosis a 37 °C)

STREPTOMYCES

MICROCULTIVO EN ADS (25 °C)


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PRÁCTICAPRÁCTICA

66Principales agentes de CromomicosisPrincipales agentes de Cromomicosis

La cromomicosis es una infección crónica, producida por algunos hongos saprofitos: PHIALOPHORA Verrucosa, Hormodendrum Pedresi, etc., que viven comúnmente sobre vegetales, ingresan al organismo mediante traumatismos en la piel por dichos fragmentos vegetales punzantes contaminados. La infección se caracteriza por la presencia de Nódulos cutáneos tipo Verrucoso costroso “Dermatitis Verrucosa” localizados generalmente en los miembros inferiores, afectando la piel y tejido celular subcutáneo.

I. CONDICIONES DE LA TOMA DE MUESTRA

El material Patológico se toma por raspado profundo de preferencia en el tejido entre la lesión y tejido sano, obteniéndose fragmentos de tejido necrótico y costras. También puede ser útil el material de biopsia.

II. PROCEDIMIENTO

1. Examen directo: Haga preparaciones con KOH 20% entre lámina y lámina luego calentar suavemente el

preparado. Se busca y se examina células redondeadas de color pardo, tabicadas de pared gruesa.

III. CULTIVO

1. P.H. VerrucosaEn agar para dextrosa (APD) a temperaturas del laboratorio desarrolla colonia de aspecto filamentoso compacto de color verde olivo.Microscópicamente se observa hifas septadas, ramificadas dispuestas lateralmente esporangioforos en forma de una botella o de una jarra en cuyo extremo se agrupan microconidios esférica en racimo.

2. H. PedrosoiEn APD a la temperatura del laboratorio desarrolla colonia filamentosa pulvurulenta de color pardo – oscuro microscópicamente se observan filamentos tabicados ramificados, conidióforos, cortos de la que emergen microconidias típicas dispuestas en cadenas cortas.


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CROMOMICOSIS


EN APD CÉLULAS OVOIDES CON CICATRICES DE UNIÓN (a)

2. Cladosporium (Hormodendrum)

EN CULTIVO ADS (25 °C)

1. Phialophora verrucosa 3. Ambas especies en tejido

En los exudados y en los tejidos, esto hongos

producen células redondas, pardas, de paredes muy gruesas, que estan divididas por

tabiques, esta tabicación, con

separación retardada da racimos de 4 a 8

células.

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A T L A SA T L A S

Micología Aspergillus Flavus

Aspergillus Fumicatus

Aspergillus Niger

Aspergillus Niger

Candida

Cladosporium Sp.

Epydermophiton Floccosum

Fusarium Sp

Hifas cenocíticas

Hifas tabicadas

Histoplasma Capsulatum

Malassezia Furfur

Microsporum Cannis

Microsporum Gypseum

Mucor Sp

Paracoccidioides Brasillensis

Penicillium

Piedraia Hortae

Rhizopus Sp

Sporothrix Schenkii

Trichophyton Mentagrophytes

Trichophyton Rubrum

Trichophyton Tonsurans


UNFV – FMHU


guia de microbiologia

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