het opstellen van een microvesikelsignatuur van humane...

Het opstellen van een

microvesikelsignatuur van

humane kankercellijnen

Freja SCHEYS

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. Kris Gevaert

Vakgroep GE07 – Biochemie

Academiejaar 2013-2014

Het opstellen van een

microvesikelsignatuur van

humane kankercellijnen

Freja SCHEYS

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. Kris Gevaert

Vakgroep GE07 - Biochemie

Academiejaar 2013-2014

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”

Datum

Freja Scheys Prof. Dr. Kris Gevaert

VOORWOORD

Het maken van deze masterproef was een heel leerrijke ervaring die ik zonder de hulp van

anderen niet had kunnen waarmaken. Ik zou daarom graag langs deze weg enkele mensen willen

bedanken.

Eerst en vooral wil ik mijn promotor Prof. Dr. Kris Gevaert bedanken dat hij het mogelijk heeft

gemaakt voor mij om mee te werken aan dit interessante onderwerp. Bedankt voor al de raad, het

vele verbeterwerk en de kans om mijn eerste stappen te zetten in het wetenschappelijk onderzoek.

Daarnaast gaat mijn dank uit naar mijn begeleidsters Kathleen Moens en An Staes. Kathleen wil

ik graag bedanken om mij, in onze korte tijd samen, klaar te stomen voor mijn eerste praktische

laboratoriumervaring. An, bedankt om steeds klaar te staan met goede raad en hulp, mij veel

kennis bij te brengen en zo veel geduld op te brengen voor mijn beperkte computerkennis. Jullie

waren geweldig om mee samen te werken en om van bij te leren!

Al mijn collega’s van het Proteomics Onderzoekslaboratorium wil ik bedanken voor alle hulp en

de gezellige sfeer op de werkvloer.

Hierbij wil ik graag Berdien, Bart en Sander bedanken voor de leuke biomedische jaren, die met

jullie erbij voorbijgevlogen zijn!

Mijn medestudenten in het labo Britt, Eva C., Eva V. en Sebastiaan wil ik bij deze bedanken voor

de toffe babbels, het vele gelach en gezellige middagpauzes.

Ten slotte wil ik nog graag mijn ouders en mijn zus Debbie bedanken voor de vele motiverende

gesprekken, het nalezen van mijn werkjes ondanks de interesse voor het onderwerp, het printen

van stapels cursusmateriaal, de toffe pauzes tijdens het studeren en de vele verwennerij tijdens de

examenperiodes. Bedankt voor de vele steun tijdens deze jaren!

Bedankt!

INHOUDSOPGAVE

AFKORTINGEN………………………………………………………………………………………………

SAMENVATTING ................................................................................................................... 1

SUMMARY ............................................................................................................................... 2

1.1 KANKER ....................................................................................................................... 3

1.2 EXOSOMEN .................................................................................................................. 3

1.2.1. MICROVESIKELS ....................................................................................................... 3

1.2.2. DE EXOSOMALE INHOUD ........................................................................................... 5

1.2.3. BIOLOGISCHE FUNCTIES VAN EXOSOMEN .................................................................. 6

1.2.4. ISOLATIE EN KARAKTERISERING VAN EXOSOMEN ..................................................... 8

1.2.5. EXOSOMEN ALS BIOMERKERS ................................................................................... 9

1.3. DOELSTELLING ....................................................................................................... 11

2. MATERIAAL EN METHODEN ...................................................................................... 12

2.1. CELCULTUUR ........................................................................................................... 12

2.1.1. KEUZE CELLIJNEN ................................................................................................... 12

2.1.2. CULTUURCONDITIES ............................................................................................... 12

2.1.3. Medium exosoomvrij maken ............................................................................... 13

2.1.3.1. Ultracentrifugatie en filtratie ............................................................................... 13

2.1.3.2. Amicon stirred cell ............................................................................................... 13

2.1.4. CELLYSATEN BEREIDEN .......................................................................................... 13

2.1.5. SILAC LABELING ................................................................................................... 14

2.1.6. CELLULAIRE SECRETOOMISOLATIE ......................................................................... 15

2.2. ISOLATIEMETHODEN ............................................................................................ 15

2.2.1. COLLECTIE GECONDITIONEERD MEDIUM ................................................................. 15

2.2.2. EXOQUICK-TC ........................................................................................................ 15

2.2.3. DIFFERENTIËLE CENTRIFUGATIE ............................................................................. 16

2.3. WESTERN BLOT ....................................................................................................... 17

2.3.1. SDS-PAGE ............................................................................................................ 17

2.3.2. BLOTTEN – ODYSSEY SYSTEEM ............................................................................... 17

2.3.3. BLOTTEN – ENHANCED CHEMILUMINISCENCE (ECL) ............................................. 17

2.4. MASSASPECTROMETRIE ...................................................................................... 18

2.4.1. STAALVOORBEREIDING ........................................................................................... 18

2.4.1.1. LYSIS EXOSOMEN ........................................................................................................ 18

2.4.1.2. DETERGENT REMOVAL KOLOMMEN ............................................................................. 18

2.4.1.3. IN GEL TRYPSINISATIE ................................................................................................. 18

2.4.2. MASSASPECTROMETRIE .......................................................................................... 19

2.4.3. IDENTIFICATIE VAN DE MS/MS SPECTRA ................................................................ 20

2.4.4. DATA-ANALYSE ...................................................................................................... 21

2.5. EXOCARTA ................................................................................................................ 22

3. RESULTATEN ................................................................................................................... 23

3.1. MEDIUM EXOSOOMVRIJ MAKEN ...................................................................... 23

3.2. EXOSOOMISOLATIE AAN DE HAND VAN DE EXOQUICK-TC KIT ........... 24

3.2.1. AANWEZIGHEID VAN SERUM ................................................................................... 24

3.2.2. CELLEN 24 H SERUMVRIJ ......................................................................................... 25

3.3. EXOSOOMISOLATIE AAN DE HAND VAN DIFFERENTIËLE

CENTRIFUGATIE ................................................................................................................ 29

3.3.1. STAALVOORBEREIDING DOOR MIDDEL VAN DETERGENT REMOVAL KOLOMMEN ..... 29

3.3.2. STAALVOORBEREIDING DOOR MIDDEL VAN IN GEL TRYPSINISATIE ......................... 33

3.4. SILAC LABELING EN ANALYSE VAN HET CELLULAIRE SECRETOOM 36

3.5. EXOCARTA ................................................................................................................ 38

3.6. VALIDATIE DOOR WESTERN BLOTTING ........................................................ 39

4. BESPREKING ............................................................................................................. 41

ALGEMEEN BESLUIT ........................................................................................................ 47

REFERENTIELIJST ............................................................................................................. 48

AFKORTINGEN

ABC: ammoniumbicarbonaat

ACN: acetonitrile

CSV: cerebrospinaal vocht

DC: differentiële centrifugatie

dFKS: ‘depleted’ foetaal kalfsserum; exosoomvrij foetaal kalfsserum

DMEM: Dulbecco’s gemodificeerd Eagle’s medium

EGFR: epidermale groeifactor receptor

EMEM: Eagle’s minimum essentieel medium

ESI: elektronspray ionisatie

FKS: foetaal kalfsserum

HBMVEC: humane hersenen microvasculaire endotheliale cellen

IL-2 : interleukine 2

MS: massasprectrometer/massaspectrometrie

NK cellen : natural killer cellen

PBS: fosfaat gebufferde zoutoplossing

PVDF: polyvinylideen fluoride

SDS: natriumdodecylsulfaat

SILAC: stabiele isotoop labeling door aminozuren in celcultuur

TBS: Tris-gebufferde zoutoplossing

TBS-T: Tris-gebufferde zoutoplossing en Tween

TEAB: triëthylammoniumbicarbonaat

TEM: transmissie elektronenmicroscopie

TFA: trifluorazijnzuur

TGF-β: transformerende groeifactor beta

VEGF: vasculaire endotheliale groeifactor

http://en.wikipedia.org/wiki/Eagle's_minimal_essential_medium

1

SAMENVATTING

Exosomen zijn ronde, komvormige cellulaire vesikels met een gemiddelde diameter van 30 –

100 nm. Ze bevatten intact en functioneel RNA, lipiden en een specifieke eiwitinhoud

afkomstig van hun producerende cel. Ze spelen een belangrijke rol in kankerontwikkeling en -

progressie en hun inhoud werd reeds beschreven als een potentiële bron van diagnostische en

prognostische biomerkers.

Exosomen kunnen geïsoleerd worden uit diverse lichaamsvloeistoffen zoals bloed, urine,

speeksel, alsook in vitro van in cultuur gebrachte cellijnen. Isolatie van deze vesikels en

karakterisering van hun inhoud kan bijdragen tot de ontwikkeling van innovatieve methoden

voor de diagnose van kanker. Daarom worden in dit onderzoek exosomen geïsoleerd van vier

humane kankercellijnen aan de hand van twee isolatiemethoden. Deze methoden worden

vergeleken op basis van de opbrengst, zuiverheid en reproduceerbaarheid. Daarnaast worden

er eiwitcatalogen bepaald van de geïsoleerde exosomen via massaspectrometrische technieken

en vergeleken met totale cellysaten en het cellulaire secretoom. Op basis van de verschillende

eiwitcatalogen wordt vervolgens een exosoomsignatuur opgesteld voor de bestudeerde

kankercellijnen.

Resultaten bekomen door middel van massaspectrometrie tonen aan dat het aangewezen is om

gebruik te maken van differentiële centrifugatie, in tegenstelling tot de Exoquick-TC kit, om

exosomen te isoleren vanuit celcultuurmedia. Hierbij wordt best gebruik gemaakt van

detergent removal kolommen als staalvoorbereiding voor massaspectrometrie. Echter, steeds

zijn er wel nog contaminerende serumeiwitten aanwezig in de stalen.

Verder worden voor de verscheidene cellijnen zowel gemeenschappelijke exosomale eiwitten

geïdentificeerd als unieke eiwitten. Op basis van deze exosomale eiwitten kunnen cellijn-

specifieke exosoomsignaturen opgesteld worden. De twee geselecteerde borstkankercellijnen,

MDA en MCF7 cellijn, blijken echter weinig overeenkomst te vertonen in exosomale

eiwitten. Dit zou eventueel te wijten kunnen zijn aan hun verschillende graad van agressie.

2

SUMMARY

Exosomes are membranous vesicles that are secreted by a variety of cell types, including

tumor cells, both under normal as well as pathological conditions. They are characterised by

their nanometer size (30 – 100 nm diameter), cup-shaped morphology and they contain

specific proteins, mRNAs, miRNAs and lipids derived from their originating cell. A detailed

study of these exosomes may provide more insights into the role of exosomes in cancer

development and cancer progression and new biomarkers can be identified.

In the present study, exosomes were isolated from four human cancer cell lines by means of

differential centrifugation and the Exoquick-TC kit of System Biosciences, and both isolation

methods were compared based on the overall yield, reproducibility and purification.

Differential centrifugation appears to be the most favourable when isolating exosomes from

cell culture media. However, there still is contamination with proteins derived from serum

present in the growth media.

The protein content of the exosomes from these different cell lines was determined using

mass spectrometry and compared to the proteins found in total cell lysates and cellular

secretomes. Common and unique (for the cell studied) exosomal proteins were identified.

With this information, proteomic signatures were developed for exosomes derived from the

different cell lines. Comparison of these proteomic signatures points out that the proteomic

content of exosomes is not necessarily correlated with the origin of their originating cell. Of

note is that exosomes isolated from MCF7 or MDA cell lines show little similarities, which

can be possibly caused by their difference in metastatic capacity.

3

1. INLEIDING

1.1 Kanker

Wereldwijd is kanker, naast hart- en vaatziekten, de meest voorkomende doodsoorzaak (1).

Kanker is een dynamische ziekte die ontstaat door defecten in de regulatie van normale

celproliferatie en homeostase (2). Het kankerproces is een meerstappenproces dat tot stand

komt door veranderingen in het genoom. Kanker omvat een breed ziektebeeld dat veel

verschillende types en subtypes bevat en onder andere gepaard gaat met zelfvoorziening van

groeisignalen, ongevoeligheid voor anti-groeisignalen, ontsnappen aan apoptose,

ongelimiteerde replicatie, angiogenese en weefselinvasie en metastasevorming.

Een precieze en tijdige diagnosestelling is belangrijk voor een aangepaste behandeling en het

voorkomen van uitzaaiingen (2). De meeste kankergerelateerde sterfgevallen worden

veroorzaakt door metastasen. Vaak worden patiënten echter pas gediagnosticeerd in een

vergevorderd stadium of is er sprake van overdiagnose (3, 4). Dit is te wijten aan weinig

gevoelige en weinig specifieke diagnose- en opvolgingsmethoden (5). Ook zijn deze

methoden, zoals cystoscopie en biopsie, vaak invasief, duur en bieden niet altijd informatie

over de prognose (5, 6). Daarom is er nood aan meer sensitieve diagnostische en

prognostische biomerkers voor een betere en snellere detectie (7, 8).

1.2 Exosomen

1.2.1. Microvesikels

Microvesikels zijn membraanafgeleide vesikels die continu afgescheiden worden via

exocytose door diverse celtypes (8). Dit gebeurt zowel onder normale als onder pathologische

condities (9). Deze microvesikels kunnen worden ingedeeld op basis van hun grootte, vorm

en secretiemechanisme in exosomen en micropartikels zoals weergegeven in figuur 1 (10, 11).

Exosomen zijn ronde, komvormige vesikels met een gemiddelde diameter van 30 – 100 nm

(12). Ze worden gevormd door inwaartse knopvorming van endosomale membranen die

intraluminale vesikels vormen binnen intracellulaire multivesiculaire lichamen (13). Deze

multivesiculaire lichamen dragen bij tot de afbraak van geïnternaliseerde eiwitten door fusie

met lysosomen (9). Ze kunnen ook versmelten met het plasmamembraan en zo hun

intraluminale vesikels vrijstellen als exosomen. Exosomen worden gesecreteerd door

verschillende celtypes zoals reticulocyten, immuuncellen (dendritische cellen, B cellen, T

cellen, mastcellen), epitheliale cellen, bloedplaatjes, levercellen en tumorcellen (3, 11).

4

Micropartikels zijn met een gemiddelde diameter tussen 100 nm en 1 µm groter dan

exosomen en hebben een onregelmatigere vorm (10). Ze worden, in tegenstelling tot

exosomen, meteen vrijgesteld aan het plasmamembraan.

Exosomen werden reeds bestudeerd in verschillende pathologische aandoeningen zoals

atherosclerose, pulmonale hypertensie, thrombose en andere vasculaire aandoeningen alsook

bacteriële infecties en kanker (13). Er is vooral veel interesse naar de rol van exosomen in

kankerontwikkeling en kankerprogressie. Zo werden exosomen reeds bestudeerd in vele

verschillende types kanker zoals prostaat-, borst-, ovarium- en colorectale kankers en

melanomen (3, 5).

De secretie van exosomen kan gereguleerd worden in verschillende celtypes door

ligandherkenning of onder stresscondities (12). Ook is de hoeveelheid van de gesecreteerde

exosomen afhankelijk van verschillende factoren zoals celtype, celcyclus en het stadium van

de kanker (13). Dit laatste kan verklaard worden door het feit dat oncogene mutaties de

mogelijkheid hebben om cellulaire vesiculatie pathways te moduleren (7). Dit werd reeds

geobserveerd bij oncogene mutaties in de epidermale groeifactor receptor (EGFR) en Ras, wat

een effect had op downstream gelegen moleculen in de pathway zoals Rab27a, waardoor de

exosoomsecretie toenam in deze kankercellen.

Figuur 1: Vorming en secretie van exosomen en micropartikels.

Exosomen worden gevormd door inwaartse knopvorming van endosomale membranen in multivesiculaire

lichamen. Deze kunnen versmelten met het plasmamembraan voor vrijstelling van exosomen of opgenomen

worden in lysosomen voor degradatie van hun inhoud. Micropartikels worden meteen vrijgesteld aan het

plasmamembraan.

5

Er worden verschillende termen in de literatuur gebruikt die allemaal verwijzen naar deze

extracellulaire vesikels; exosomen, ectosomen, extracellulaire membraanvesikels,

nanopartikels, oncosomen en andere (10). In deze masterproef zal verder de term exosomen

gebruikt worden.

1.2.2. De exosomale inhoud

Exosomen worden omsloten door een tweelagige lipidenmembraan (3, 13). Dit membraan

bevat voornamelijk dezelfde lipiden als het plasmamembraan, namelijk fosfolipiden,

cholesterol, sphingomyeline en ceramide (10, 14). Exosomen worden verder gekarakteriseerd

door een densiteit van 1,13 – 1,19 g/ml in een sucrosegradiënt en ze sedimenteren bij 100.000

g (12). De inhoud en biologische functies van exosomen zijn afhankelijk van de cel van

herkomst en de condities waaronder ze geproduceerd werden (15). Ze bevatten verschillende

bioactieve moleculen zoals eiwitten, lipiden en genetisch materiaal (mRNA, miRNA, rRNA

en tRNA) (3, 5, 10). De online exosoomdatabank ExoCarta (http://exocarta.org) bevat

informatie omtrent deze inhoud van exosomen van reeds 146 studies en is gratis

raadpleegbaar.

Exosomen bevatten een uniek eiwitprofiel (9). Deze eiwitten kunnen ingedeeld worden in

twee groepen (16). Een eerste groep bestaat uit een geconserveerde, gemeenschappelijke set

van exosomale eiwitten die een rol spelen in adhesie (integrines), biogenese van exosomen

(Alix, TSG101 en clathrine), membraantransport (annexines, Rab eiwitten) en het cytoskelet

(actine, tubuline en myosine) (3, 16). Een tweede groep bevat eiwitten gerelateerd aan de

producerende gastheercel (16). Bijgevolg zijn bij exosomen gesecreteerd door tumorcellen

deze laatste groep van eiwitten gerelateerd aan het tumorfenotype en de pathologische

functies (10, 16). De inclusie of exclusie van cellulaire eiwitten in exosomen is niet

willekeurig maar wordt gecontroleerd door een eiwit sorteermechanisme tijdens de formatie

van de vesikels (10). Gesuggereerde sorteermechanismen werken via cargo-eiwitten of

gebruiken co-sortering door eiwit- of lipideninteracties.

Exosomen beschikken ook over intact en functioneel mRNA en miRNA (8). miRNA’s zijn

korte RNA moleculen die vooral binden aan de 3’UTR van targettranscripten en hierdoor

repressie van translatie of degradatie van het transcript als gevolg hebben. Ze kunnen hierdoor

veel fundamentele biologische processen beïnvloeden zoals tumorsuppressie en oncogenese.

Zowel mRNA’s als miRNA’s kunnen na secretie functioneel doorgegeven worden aan

naburige of verder afgelegen cellen en daar genexpressie moduleren (10, 14). Zo kunnen

6

mRNA’s aanleiding geven tot een functioneel eiwit (17). Het is mogelijk dat specifieke

mRNA’s en miRNA’s ook selectief opgenomen worden in exosomen, maar in de literatuur is

hier nog geen duidelijkheid over (10).

Naast eiwitten en genetische informatie bevatten exosomen ook lipiden (10). Zoals eerder

vermeld bestaat het lipidenmembraan van exosomen voornamelijk uit dezelfde lipiden als

deze die we aantreffen in het plasmamembraan, doch in exosomen afkomstig van

verschillende celtypes werden verschillen in lipidencompositie vastgesteld. Deze lipiden

kunnen bijdragen tot de biologische functies van exosomen zoals bv. de angiogene activiteit

van exosomen gesecreteerd door tumorcellen, die voornamelijk gereguleerd wordt door

sfingomyeline.

Uniek voor exosomen afkomstig van kankercellen is dat ze eiwitten kunnen bevatten die

rechtstreeks gelinkt zijn aan het kankerproces (7). Deze eiwitten kunnen mutaties bevatten of

gewijzigd tot expressie komen door onder meer een oncogene activatie of repressie van hun

translatie. Daarnaast kunnen ze ook kankergerelateerde moleculen bevatten zoals bv. Myc,

Ras, PTEN, HER2 en β-catenine.

1.2.3. Biologische functies van exosomen

Exosomen oefenen verschillende biologische functies uit zoals antigenpresentatie,

intercellulaire communicatie, regulatie van de immuunrespons en kankerontwikkeling en -

progressie (9).

Exosomen spelen een belangrijke rol in cel-cel communicatie (12). Ze interageren met cellen

via verschillende mechanismen (12, 16). Ze kunnen ofwel binden op het oppervlak van de cel

door middel van exosomale adhesiemoleculen of ligand-receptor interacties ofwel is er

interactie door fusie met het plasmamembraan of internalisatie aan de hand van receptor-

gemedieerde endocytose of fagocytose. De interactie van exosomen met cellen uit hun

omgeving leidt tot modulatie van specifieke cellulaire activiteiten en regulatie van

fysiologische en pathologische processen (16). Deze intercellulaire communicatie speelt een

belangrijke rol in communicatie tussen tumorcellen en hun omgeving (17).

Meer specifiek hebben exosomen een grote invloed op kankerontwikkeling en -progressie (8).

Ze spelen namelijk een rol in proliferatie, immuunsuppressie, angiogenese, invasie,

metastasevorming en druginterferentie zoals weergegeven in figuur 2 (16). Er werd reeds

aangetoond in een glioblastoom model dat exosomen gesecreteerd door tumorcellen de

proliferatie van andere tumorcellen kunnen bevorderen (17). Dit toegenomen effect van

7

proliferatie en overleving wordt onder meer mogelijk gemaakt door het exosomaal transport

van apoptose inhiberende eiwitten zoals survivine (16). Ook dragen exosomen bij tot

immuunsuppressie onder meer door inhibitie van interleukine 2 (IL-2) gemedieerde activatie

van natural killer (NK) cellen en inhibitie en apoptose van T-cellen.

Door middel van een in vitro angiogenese assay werd de rol van exosomen in angiogenese

aangetoond (17). Hierbij werden humane hersenen microvasculaire endotheliale cellen

(HBMVEC) in cultuur gehouden in matrigel-gecoate platen met medium gesupplementeerd

met gezuiverde glioblastoom microvesikels of angiogene groeifactoren. Hieruit bleek dat

exosomen angiogenese kunnen initiëren. Dit gebeurt onder meer door middel van angiogene

eiwitten (angiogenine), mRNA’s en miRNA’s (16, 17). Tetraspanines bijvoorbeeld kunnen

endotheelcellen activeren en vertakking induceren door vasculaire endotheliale groeifactor

(VEGF) expressie te induceren in doelcellen (12, 16).

Figuur 2: Biologische functies van exosomen gesecreteerd door tumorcellen.

Algemeen spelen exosomen een rol in intercellulaire communicatie en dit op verscheidene manieren.

Daarnaast spelen exosomen gesecreteerd door tumorcellen een rol in groei van de tumor door proliferatie

en overleving van tumorcellen te bevorderen. Ze dragen bij tot immuunsuppressie door inhibitie van acti-

vatie van natural killer (NK) cellen en inhibitie en apoptose van T-cellen. Ze spelen ook een rol in de vor-

ming van premetastatische niches door angiogenese en remodulatie en degradatie van de extracellulaire

matrix (ECM). Ook dragen ze bij tot drugresistentie door actieve export van de geneesmiddelen of door

interactie met antilichamen.

8

Deze stimulatie van angiogenese draagt, samen met het moduleren van stromale cellen en het

remoduleren van de extracellulaire matrix, bij tot het vormen van premetastatische niches en

stimulatie van tumorinvasie (12). Exosomen beschikken over enkele metalloproteasen die de

extracellulaire matrix degraderen en zo tumorinvasie vergemakkelijken. Ook induceren ze

door vrijstelling van transformerende groeifactor beta (TGF-) de differentiatie van

fibroblasten naar myofibroblasten. Deze stromale cellen dragen bij tot tumorgroei,

vascularisatie en metastasen. Op deze manier wordt een ideale omgeving gevormd voor

tumorcellen in verder afgelegen sites die bijdragen tot metastasenontwikkeling.

Ten slotte wordt de protumorigene rol van exosomen verder duidelijk door inductie van

resistentie voor verscheidene geneesmiddelen (12, 16, 18). Dit gebeurt door verscheidene

mechanismen. Een eerste steunt op actieve export van de geneesmiddelen uit de tumorcellen

via exosoomsecretie. Zo werd vastgesteld dat humane ovarium kankercellen die resistentie

ontwikkeld hebben voor Cisplatine het geneesmiddel actief inbrengen in hun exosomen en dat

hun exosoomsecretie toeneemt. Een andere manier van drugresistentie komt tot stand door

interactie van exosomen met antilichamen. Zo bevatten exosomen gesecreteerd door

borstkankercellijnen met HER2-overexpressie een intacte HER2-molecule. Deze molecule

laat exosomen toe om te binden met anti-HER2 antilichamen (bv. Trastuzumab) en reduceert

zo cytotoxiciteit van deze antilichamen.

1.2.4. Isolatie en karakterisering van exosomen

Exosomen kunnen geïsoleerd worden uit diverse lichaamsvloeistoffen zoals plasma, urine,

speeksel, ascites en amniotisch vocht of in vitro van in cultuur geëxpandeerde cellijnen (8,

14). Dit wordt mede mogelijk gemaakt daar exosomen stabiel zijn in lichaamsvloeistoffen en

stabiel blijven gedurende collectie, opslag en verwerkingscondities door hun

lipidenmembraan (6, 14). De isolatie van exosomen kan op verschillende manieren gebeuren

zoals door differentiële ultracentrifugatie, densiteitgradiënt centrifugatie, ultrafiltratie of

immunoprecipitatie (5, 10).

De eerste methode steunt op de eigenschap dat exosomen sedimenteren bij 100.000 g (12). Zo

wordt op basis van enkele centrifugatie- en ultracentrifugatiestappen een exosoompellet

bekomen (19). Bij densiteitgradiënt centrifugatie wordt ook nog rekening gehouden met de

densiteit van exosomen en wordt een sucrosekussen of sucrosegradiënt gebruikt. De

ultrafiltratie methode vervangt de eerste centrifugatiestappen door filtratie over een 0,22 µm

filter, waarna de exosomen gepelleteerd worden door een laatste ultracentrifugatiestap.

9

Immunoprecipitatie daarentegen maakt gebruik van magnetische beads die gecoat zijn met

antilichamen die specifiek gericht zijn tegen exosomale membraaneiwitten, zoals

tetraspanines (CD63, CD81 en CD9).

Hierbij moet wel rekening gehouden worden met de volgende zaken. Lichaamsvloeistoffen

bevatten microvesikels die afkomstig zijn van heterogene celtypes waardoor de verdere

analyse van hun samenstelling en de interpretatie van de bekomen resultaten bemoeilijkt kan

worden (4). Circulerende exosomen hebben ook vaak maar een korte halfwaardetijd (7).

Daarnaast zijn de eigenschappen (morfologie, grootte en inhoud) van exosomen geïsoleerd uit

celculturen vaak verschillend van exosomen die vrijgesteld werden door de tumor in vivo. Er

heerst ook nog steeds geen consensus over de isolatiemethoden of validatie van de zuiverheid

(16). Ook al bevatten exosomen gemeenschappelijke componenten, toch worden

verschillende resultaten gevonden door het gebruik van verschillende isolatietechnieken (10).

Deze isolatiemethoden resulteren ook vaak nog in een variabele opbrengst, bevatten vaak

contaminanten en nemen veel tijd in beslag (20). Daarom zal in dit onderzoek, naast een

algemene isolatiemethode, ook een minder arbeidsintensieve isolatiemethode op basis van de

Exoquick-TC kit van System Biosciences (SBI) uitgetest en vergeleken worden met andere

methoden.

Validatie en zuiverheid van de geïsoleerde vesikels gebeurt meestal via transmissie

elektronenmiscroscopie (TEM) en Western blotting (13). De eerste methode steunt op de

specifieke morfologie van exosomen terwijl bij de laatste enkele exosoomspecifieke eiwitten

worden gevisualiseerd zoals tetraspanines (CD9, CD63 en CD81), Alix en TSG101 (21).

1.2.5. Exosomen als biomerkers

Exosomen werden reeds beschreven als potentiële bron van diagnostische biomerkers. Ze

kunnen aangewend worden voor klinische applicaties zoals nieuwe diagnostische

mogelijkheden en therapieën, en kunnen informatie verschaffen over de prognose en

medicatierespons van de patiënt (10, 14). Door het vrijstellen van exosomen geven cellen

immers informatie over hun aanwezigheid, abundantie en status (7).

Het gebruik van exosomen in de diagnostiek biedt enkele voordelen ten opzichte van de

huidige technieken zoals cystoscopie en biopsie, waarbij er met behulp van een cystoscoop in

de blaas wordt gekeken of een stukje weefsel wordt weggenomen. Daar exosomen aanwezig

zijn in verschillende toegankelijke lichaamsvloeistoffen, kunnen ze op een niet-invasieve

wijze geïsoleerd worden (8). Daarnaast kan de diagnose van aandoeningen op moeilijk te

10

benaderen plaatsen, zoals de hersenen, gebeuren door isolatie van exosomen uit serum of

cerebrospinaal vocht (CSV) (7, 22). Verder kunnen exosomen aangewend worden om

evoluerende, genetische veranderingen gerelateerd aan tumorprogressie en behandeling te

detecteren, waardoor deze detectie een dynamisch karakter krijgt (17). Ze bevatten ook

informatie over het genotype van de tumor en bieden zo informatie om nieuwe therapieën te

ontwikkelen. Naast diagnosticum kunnen exosomen zelf ook in therapie ingezet worden als

bv. drug afgiftesystemen (2).

We kunnen dus concluderen dat exosomen aangewend kunnen worden als een niet-invasieve

en dynamische detectiemethode van maligniteiten en kunnen bijdragen tot de ontwikkeling

van nieuwe therapiemogelijkheden daar ze een rol spelen in het kankerproces en voorkomen

in verschillende toegankelijke lichaamsvochten (5, 8, 13, 17).

11

1.3. Doelstelling

Isolatie van exosomen en karakterisering van hun inhoud kan bijdragen tot de ontwikkeling

van verschillende innovaties op het vlak van detectie. Daarom worden in dit onderzoek

exosomen geïsoleerd van vier verschillende humane kankercellijnen aan de hand van twee

isolatiemethoden; differentiële centrifugatie en de Exoquick-TC kit. De eerste methode is

gebaseerd op opeenvolgende (ultra)centrifugatiestappen. De tweede methode versnelt het

centrifugatieproces door gebruik te maken van de Exoquick-TC precipitatieoplossing. Deze

methoden zullen vergeleken worden op basis van de opbrengst, zuiverheid en

reproduceerbaarheid.

Vervolgens zullen de eiwitcatalogen bepaald worden van deze geïsoleerde exosomen aan de

hand van massaspectrometrische technieken en vergeleken met de eiwitinhoud van totale

cellysaten en het secretoom van de corresponderende cellijnen. Dit heeft het opstellen van

specifieke exosoomsignaturen voor de verschillende kankercellijnen als doel.

12

2. MATERIAAL EN METHODEN

2.1. Celcultuur

2.1.1. Keuze cellijnen

In dit onderzoek werd geopteerd voor vier humane kankercellijnen als bron van exosomen.

Een eerste set bestaat uit twee borstkankercellijnen; de MCF7 cellijn en de agressievere

MDA-MB-231 cellijn (MDA). Zo kunnen eventuele verschillen aangetoond worden in

exosoominhoud tussen zelfde types kanker, maar met een verschillende graad van agressie.

Verder werd de HepG2 cellijn, afkomstig van een levercarcinoom geselecteerd alsook de

HeLa cellijn, afkomstig van een patiënt met een cervicale kanker. Op deze manier beschikken

we over cellijnen afkomstig van drie verschillende origines, waartussen ook eventuele

verschillen kunnen aangetoond worden.

De MDA cellijn werd bekomen via het Departement voor Moleculair Biomedisch Onderzoek

(UGent) en de HepG2 cellijn was aanwezig in het Departement voor Medisch Proteïne

Onderzoek (UGent). De HeLa en MCF7 cellijnen werden aangekocht via het American Type

Culture Collection (Manassas, Virginia, VS).

2.1.2. Cultuurcondities

Deze verschillende cellijnen werden gegroeid tot 70 – 80% confluentie in hun

standaardmedium verrijkt met 10% foetaal kalfsserum (FKS, HyClone, Thermo Scientific,

Waltham, Massachusetts, VS) en 0,5% van een 5000 U/ml streptomycine/penicilline-

oplossing (Gibco Life Technologies, Grand Island, New York, VS). Dit medium werd eerst

exosoomvrij gemaakt door middel van de methode van Théry et al. (20), zie ook verder. Voor

de MDA en HepG2 cellijn was dit standaardmedium het Dulbecco’s gemodificeerd Eagle’s

medium (DMEM, Gibco Life Technologies). De MCF7 en HeLa cellijn werden in cultuur

gehouden in Eagle’s minimum essentieel medium (EMEM, Sigma-Aldrich, Saint-Louis,

Missouri, VS). Voor deze laatste cellijn werd het medium verrijkt met niet-essentiële

aminozuren (NEAA, 1/100, Sigma-Aldrich). De cellen werden in cultuur gehouden in T75 en

T175 Falcon flessen (Thermo Scientific) en geïncubeerd bij 37°C in 5% CO2 (Forma, Thermo

Scientific).

http://en.wikipedia.org/wiki/Eagle's_minimal_essential_medium

13

2.1.3. Medium exosoomvrij maken

2.1.3.1. Ultracentrifugatie en filtratie

Na optimalisatie werd gekozen om het medium exosoomvrij te maken aan de hand van de

methode van Théry et al. (20). Medium (DMEM en EMEM) werd bereid met 20% FKS en

1% van een 5000 U/ml streptomycine/penicilline-oplossing. Vervolgens werd dit medium

onderworpen aan ultracentrifugatie. Hiervoor werden 6 ultracentrifugatietubes (Beckman

Coulter, Fullerton, Californië, VS) gevuld met elk 50 - 60 ml medium en geultracentrifugeerd

bij 4°C onder vacuüm voor minimum 17 h bij 35.000 tpm (45 Ti rotor, Beckman Coulter).

Hierna werd het medium afgenomen door middel van een pipet. Hierbij werd steeds 5 ml op

de bodem van de centrifugatietubes achtergelaten om contaminatie met de pellet te vermijden.

Aansluitend werd dit medium opeenvolgend gefiltreerd door een 0,22 µm filter (Corning

Incorporated, Corning, New York, VS) en een 0,1 µm filter (VWR International, Radnor,

Pennsylvania, VS) (5). Dit exosoomvrij medium werd vervolgens aangelengd met medium

zonder additieven tot medium bekomen werd met 10% FKS en 0,5% van een 5000 U/ml

streptomycine/penicilline-oplossing.

2.1.3.2. Amicon stirred cell

Medium (DMEM) werd bereid met 10% FKS en 0,5% van een 5000 U/ml

streptomycine/penicilline-oplossing. Dit medium (200 ml) werd gefiltreerd met een Amicon

stirred cell (Millipore, Billerica, Massachusetts, VS) en aansluitend gefiltreerd door een 0,22

µm filter (Corning Incorporated). Dit werd uitgevoerd in samenwerking met Dr. Koen

Raemdonck en Stephan Stremersch (Vakgroep Geneesmiddelenleer, VIB Zwijnaarde,

UGent).

2.1.4. Cellysaten bereiden

Cellysaten werden bereid van de vier verschillende kankercellijnen. Hierbij werd uitgegaan

van een T175 Falcon als startmateriaal (gemiddeld 10 – 20 miljoen cellen). De cellen werden

voor het lyseren 24 h serumvrij geplaatst (9).

Het medium werd zo volledig mogelijk verwijderd en de cellen werden twee maal gewassen

met een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Hierna werd 300 µl 20 mM

ammoniumbicarbonaat (ABC) toegevoegd en de cellen losgemaakt met een celschraper en

overgebracht naar een 1,5 ml Eppendorf tube. Hierna werd drie maal een vries-dooi cyclus

14

toegepast voor lysis van de cellen waarna het cellysaat 20 min gecentrifugeerd werd bij

13.000 g en 4°C (centrifuge 5415R, Eppendorf, Hamburg, Duitsland). Aansluitend werd de

eiwitconcentratie bepaald met de Bradford methode (Bio-Rad, Hercules, Californië, VS). Na

overnacht digereren met 2,5 µl van een 0,2 µg/µl trypsine-oplossing (Promega, Madison,

Wisconsin, VS) bij 37°C (Thermomixer, Eppendorf, Hamburg, Duitsland) werden de stalen

geanalyseerd via massaspectrometrie (MS). Dit werd voor elke cellijn in triplicaat uitgevoerd.

2.1.5. SILAC labeling

De HeLa cellen werden SILAC gelabeld in een 1/1 verhouding met zwaar (13

C6) en licht

gelabelde (12

C6) arginines en lysines zodat een verschil van 6 Da bekomen werd tussen de

lichte en zware aminozuren (Silantes, München, Duitsland). Hierbij werden de HeLa cellen in

cultuur gebracht in DMEM vrijgemaakt van natuurlijk arginine, lysine en glutamine, met 10%

gedialyseerd FKS (Gibco, Life Technologies), 0,5% van een 5000 U/ml

streptomycine/penicilline-oplossing en Glutamax (1/100, Gibco, Life technologies). Hieraan

werden de licht en zwaar gelabelde arginines (16,8 mg/l) en lysines (183 mg/l) na filtratie

toegevoegd. De cellen werden minimum 8 dagen in cultuur gehouden om volledige labeling

te bekomen.

Dit medium werd ook eerst exosoomvrij gemaakt volgens de methode beschreven in deel

2.1.3.1. Hierbij werd het medium, met reeds 10% gedialyseerd FKS, geültracentrifugeerd en

vervolgens gefiltreerd waarna de overige componenten werden toegevoegd.

Door deze SILAC labeling kon later de oorsprong (humaan, rund) van de verschillende

geïsoleerde eiwitten onderscheiden worden na massaspectrometrische analyse zoals

weergegeven in figuur 3.

Figuur 3: MS spectra bekomen na SILAC labeling van HeLa cellen.

A: Eiwitten aangemaakt door de HeLa cellen zullen zowel zwaar als licht gelabeld arginine en

lysine bevatten. Hierdoor zullen hun peptiden, bekomen na digestie met trypsine, voorkomen als

een koppel met 6 Dalton verschil in de MS spectra.

B: Serumeiwitten zullen niet gelabeld zijn en enkel licht arginine en lysine bevatten.

15

Van deze gelabelde cellen werden exosomen geïsoleerd via differentiële centrifugatie (zie

deel 2.2.3). Hiernaast werd ook het cellulaire secretoom geanalyseerd volgens de methode

besproken in deel 2.1.6. Deze analyses werden steeds in triplicaat uitgevoerd.

2.1.6. Cellulaire secretoomisolatie

Cellulaire secretomen werden geïsoleerd van SILAC gelabelde HeLa cellen (deel 2.1.5.)

Hiervoor werd uitgegaan van een T175 Falcon (gemiddeld 15 miljoen cellen) met 25 ml

medium als startmateriaal. De cellen werden eerst 24 h serumvrij geplaatst voor de isolatie

(9). Het medium werd gefiltreerd over een 0,45 µm filter en aansluitend werd protease

inhibitor toegevoegd (cOmplete, EDTA-vrij, Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland).

Vervolgens werd het secretoom geconcentreerd door middel van een Macrosep filter met een

begrenzing van 3 kDa (Pall corporation, Port Washington, New York, VS). Het secretoom

werd gedurende 5 min opgekookt bij 95°C en aansluitend 10 min op ijs geplaatst. Na

overnacht digestie met 2,5 µl van een 0,2 µg/µl trypsine-oplossing (Promega) bij 37°C

(Thermomixer, Eppendorf) werd het secretoom geanalyseerd via MS. Dit werd in triplicaat

uitgevoerd.

2.2. Isolatiemethoden

2.2.1. Collectie geconditioneerd medium

De cellen werden gegroeid tot een confluentie van 70 – 80 % in hun standaardmedium

verrijkt met 10% FKS en 0,5% van een 5000 U/ml streptomycine/penicilline-oplossing.

Vervolgens werden de cellen gedurende 24 h geïncubeerd met serumvrij medium om de

achtergrond van serumeiwitten te beperken (9). Hierna werd het cultuurmedium afgenomen

met een pipet en overgebracht naar 15 ml of 50 ml centrifugatietubes (Greiner Bio-One,

Frickenhausen, Duitsland), afhankelijk van het volume van het geconditioneerd medium dat

nodig was voor de isolatiemethode.

2.2.2. Exoquick-TC

Deze isolatiemethode werd uitgevoerd volgens de handleiding van de Exoquick-TC kit van

het SBI (Mountain View, Californië, VS). Een T75 Falcon (gemiddeld 1 miljoen cellen) werd

gebruikt als startmateriaal. Het geconditioneerde medium (14 ml) werd afgenomen met een

pipet en overgebracht naar een 15 ml centrifugatietube. Dit medium werd gecentrifugeerd

gedurende 15 min bij 3.000 x g en 4°C (Z400K, Hermle). De bovenste 10 ml van het

supernatans werd afgenomen met een pipet en overgebracht naar een nieuwe

centrifugatietube.

16

Vervolgens werd 2 ml Exoquick-TC (SBI) toegevoegd aan het supernatans. Dit geheel werd

goed gemengd en overnacht geïncubeerd (min. 12 h) bij 8°C. Hierna werd het staal terug

gecentrifugeerd gedurende 30 min bij 1.500 x g en 4°C (Z400K, Hermle). Vervolgens werd

het supernatans afgenomen met een pipet. Hierbij werd 2 ml supernatans achtergelaten boven

de pellet. Het overgebleven supernatans werd een laatste maal gecentrifugeerd gedurende 5

min bij 1.500 x g en 4°C (Z400K, Hermle). Het supernatans werd daarna zo volledig mogelijk

afgenomen door middel van een micropipet (Gilson, Middleton, Wisconsin, VS). Ten slotte

werd de exosoompellet geresuspendeerd in 50 µl 0,4% natriumdodecylsulfaat (SDS) voor

lysis van de exosomen.

2.2.3. Differentiële centrifugatie

Deze methode is gebaseerd op het protocol van Théry et al. (20). Als startmateriaal werden 4

T175 Falcons (gemiddeld 40 – 80 miljoen cellen) gebruikt die elk 25 ml medium bevatten.

Het medium werd afgenomen met een pipet en overgebracht naar 50 ml centrifugatietubes.

Vervolgens werden deze tubes 20 min gecentrifugeerd bij 2000 x g en 4°C (Z400K, Hermle).

Het supernatans werd overgebracht naar nieuwe centrifugatietubes (Beckman Coulter)

waarbij 5 ml supernatans achtergelaten werd boven de pellet om eventuele contaminatie met

componenten van deze pellet te reduceren. Hierna werd het supernatans gecentrifugeerd

gedurende 30 min bij 4000 tpm en 4°C (45 Ti rotor, Beckman Coulter) en werd het

supernatans terug overgebracht naar nieuwe centrifugatietubes (Beckman Coulter). Hierbij

werd terug 5 ml supernatans achergelaten boven de pellet. Het supernatans werd vervolgens

gedurende minimum 70 min gecentrifugeerd bij 35.000 tpm en 4°C (45 Ti rotor, Beckman

Coulter). Hierna werd het supernatans zo volledig mogelijk verwijderd en werden de

exosoompellets geresuspendeerd in 1 ml PBS. De geresuspendeerde pellets werden

vervolgens samengevoegd in één centrifugatietube (Beckman Coulter) en aangelengd met 45

ml PBS. Er werd nog een laatste maal gecentrifugeerd gedurende 1 h bij 35.000 tpm en 4°C

(45 Ti rotor, Beckman Coulter). Het supernatans werd terug zo volledig mogelijk afgenomen

en de exosoompellets werden geresuspendeerd in 50 µl 0,4% SDS voor lysis van de

exosomen.

17

2.3. Western Blot

2.3.1. SDS-PAGE

De stalen werden voorbereid voor SDS-PAGE door toevoeging van ladingsbuffer (4x, Bio-

Rad, Hercules, Californië, VS) en reducerend agens (20x, Bio-Rad). Vervolgens werden de

stalen opgewarmd gedurende 10 min bij 95°C (Thermomixer, Eppendorf). De eiwitten

werden gescheiden via SDS-PAGE bij 120 V. Er werd gebruik gemaakt van een 4 – 12% Bis-

Tris Criterion XT-gel (Bio-Rad) en MOPS buffer (Bio-Rad).

2.3.2. Blotten – Odyssey systeem

De eiwitten werden gedurende 30 min bij 100 V in Tris-Boor buffer geblot naar een

polyvinylideen fluoride (PVDF) membraan (Immobilon, Millipore, Billerica, Massachusetts,

VS). Hierna werd het membraan minimum een half uur geblokkeerd met Odyssey blocking

buffer (LI-COR, Odyssey, Lincoln, Nebraska, VS) en aansluitend 10 min gewassen met 1 x

Tris gebufferde zoutoplossing en Tween (TBS-T) om de blokkeerbuffer te verwijderen.

Vervolgens werd het membraan gedurende 3 uur of overnacht geïncubeerd met het primaire

antilichaam (anti CD63, polyklonaal, 1/2.000, SBI). Hierna werd de blot 3 maal gedurende 10

min gewassen met TBS-T om het overtollige primaire antilichaam te verwijderen.

Aansluitend werd het membraan gedurende 1 h geïncubeerd met een geit anti-konijn

secundair antilichaam (1/20.000, Odyssey). Vervolgens werd de blot 3 keer gewassen

gedurende 10 min met TBS-T. Een laatste wasstap gebeurde met TBS gedurende 10 min. Ten

slotte werd de blot gescand via de Odyssey Infrared Imager (LICOR, Odyssey).

2.3.3. Blotten – Enhanced chemiluminiscence (ECL)

De eiwitten werden gedurende 30 min bij 100 V in Tris-Boor buffer geblot naar een Hybond-

P membraan (GE Healthcare Limited, Life Sciences, Buckinghamshire, Engeland). Hierna

werd het membraan minimum gedurende een half uur geblokkeerd met TBS-T met 3% runder

serum albumine (BSA) en aansluitend 10 min gewassen met TBS-T om de overmaat

blokkeerbuffer te verwijderen. Vervolgens werd het membraan geïncubeerd met het primaire

antilichaam (anti CD63 of anti CD81, polyklonaal, 1/5.000, SBI) gevolgd door 4 wasstappen

zoals eerder beschreven (deel 2.3.2.). Aansluitend werd het membraan gedurende 1 h

geïncubeerd met een geit anti-konijn HRP-geconjugeerd secundair antilichaam (1/50.000,

SBI) waarna het membraan terug gewassen werd zoals eerder beschreven (deel 2.3.2.). Ten

slotte werd het membraan 1 min geïncubeerd in Select HRP chemiluminiscent substraat kit

(Amresco, Solon, Ohio, VS) en ontwikkeld (SRX-101A, Konica Minolta, Tokyo, Japan).

18

2.4. Massaspectrometrie

2.4.1. Staalvoorbereiding

2.4.1.1. Lysis exosomen

De bekomen exosoompellet werd geresuspendeerd in 50 µl 0,4% SDS. Het staal werd

aansluitend 10 min geïncubeerd bij kamertemperatuur voor een complete lysis.

2.4.1.2. Detergent removal kolommen

SDS is niet compatibel met MS en moet na lyse verwijderd worden uit het staal. Hiervoor

werd gebruik gemaakt van detergent removal kolommen (Thermo Scientific) die een

concentratie tot 0,1% SDS verlagen tot 0,01% (23). Eerst werden deze kolommen drie maal

gewassen met 200 µl 20 mM triethylammoniumbicarbonaat (TEAB, pH 8,4 – 8,6).

Vervolgens werd 25 µl van het staal aangelengd tot 100 µl met 20 mM TEAB, zodat een

concentratie van 0,1% SDS bekomen werd, en dit werd op de kolom geladen. Het geheel

werd gevortext (MS2 minishaker, IKA, Staufen, Duitsland) en vervolgens 10 min

geïncubeerd op kamertemperatuur. Hierna werd het staal 2 min gecentrifugeerd bij 1500 x g

(centrifuge 5415R, Eppendorf). Het staal werd vervolgens overgebracht naar een 1,5 ml

Eppendorf tube en opgewarmd bij 95°C gedurende 10 min (Thermomixer, Eppendorf).

Voor digestie van de eiwitten werd 2,5 µl van een 0,2 µg/µl trypsine-oplossing (Promega)

toegevoegd aan de stalen en aansluitend overnacht geïncubeerd bij 37°C (Thermomixer,

Eppendorf). Vervolgens werd trypsine gedeactiveerd door aanzuring met 10%

trifluorazijnzuur (TFA). Het staal werd vervolgens gecentrifugeerd gedurende 5 min aan

13.000 x g om eventueel onoplosbaar materiaal uit de oplossing te verwijderen waarna het

supernatans overgebracht werd in een proefbuisje voor MS analyse. Het staal werd

vervolgens geconcentreerd onder vacuüm (Savant Speedvac Concentrator, SVC100H,

Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, VS) en daarna opgelost in 40 µl laadsolvent

(0,1% TFA en 2% acetonitrile (ACN)).

2.4.1.3. In gel trypsinisatie

Exoquick-TC bevat nog ongekende bestanddelen die storend kunnen zijn voor de LC-MS/MS

analyse. Daarom zullen deze aanwezige contaminanten verwijderd worden na SDS-PAGE

scheiding van de eiwitten. Het staal werd voorbereid door toevoeging van ladingsbuffer (4x,

Bio-Rad) en reducing agent (20x, Bio-Rad) en vervolgens opgewarmd gedurende 10 min bij

19

95°C (Thermomixer, Eppendorf). Het staal werd geladen op een 4 - 12% Bis-Tris

polyacrylamidegel (Criterion XT-gel, Bio-Rad) en gescheiden met MOPS buffer (Bio-Rad)

bij 120 V. Electroforese werd gestopt nog voor een volledige scheiding van de eiwitten

optrad.

De eiwitbanden werden gekleurd met Coomassie (SimplyBlue SafeStain, Life Technologies)

en daarna uit het gel gesneden en overgebracht naar 0,5 ml Eppendorf tubes. Hierna volgden

verschillende wasstappen. Eerst werd 100 µl Milli-Q water (Millipore), toegevoegd en het

geheel goed gemengd. Vervolgens werden de gelbandjes gedurende 15 min geïncubeerd bij

kamertemperatuur. Hierna werden de stalen terug gemengd en gedurende 2 min

gecentrifugeerd bij 13.000 x g (centrifuge 5415R, Eppendorf). Vervolgens werd het

supernatans afgenomen. Deze stappen werden herhaald met 100 µl 50% ACN en 100 µl

ACN. Vervolgens werden de stalen onder vacuüm gedroogd (Savant Speedvac Concentrator,

SVC100H). Hierna werden de eiwitten in gel gedigereerd met trypsine (Promega). Trypsine

werd verdund tot 0,2 µg/µl in 50 mM TEAB met 10% ACN (digestiebuffer) en van deze

oplossing werd 6 µl toegevoegd aan de stalen. De gelblokjes werden 15 min geïncubeerd bij

kamertemperatuur zodat ze de trypsine-oplossing konden absorberen. Vervolgens werd extra

digestiebuffer toegevoegd zodat de gelblokjes volledig ondergedompeld werden en de stalen

werden overnacht geïncubeerd bij 37°C (Thermomixer, Eppendorf). Na digestie werden de

stalen gedurende 2 min gecentrifugeerd bij 13.000 x g (centrifuge 5415R, Eppendorf) en het

supernatans werd overgebracht naar een nieuwe 1,5 ml Eppendorf tube. Hieraan werd 2 µl

10% TFA toegevoegd zodat de pH daalde tot 2-3 en trypsine gedeactiveerd werd. De stalen

werden goed gemengd en aansluitend gedurende 2 min gecentrifugeerd bij 13.000 x g. Ten

slotte werden de stalen overgebracht in een proefbuisje voor MS/MS analyse en gedurende

minimum 3 h gedroogd onder vacuüm (Savant Speedvac Concentrator, SVC100H). Finaal

werden de stalen geresuspendeerd in 40 µl laadsolvent (2% ACN en 0,1% TFA).

2.4.2. Massaspectrometrie

Het bekomen peptidenmengsel (2 µl) werd geladen met solvent A (0,1% TFA, 2% ACN) op

de trapping kolom (geprepareerd in het labo, 100 µm interne diameter (ID) x 20 mm, 5 µm

beads C18 Reprosil-HD, Dr. Maisch) van de nano-LC die online geconnecteerd is met de

LTQ Orbitrap Velos massaspectrometer (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Duitsland). Na

een wasstap op de trapping kolom met solvent A, werden de peptiden geïntroduceerd in de

reverse-phase analytische kolom (geprepareerd in het labo, 75 µm ID x 150 mm, 5 µm beads

20

C18 Reprosil-HD, Dr. Maisch). De peptiden werden geladen met solvent A* (0.1%

mierenzuur) en gescheiden met een lineaire gradiënt (30 min) van 2% naar 50% solvent B

(0,1% mierenzuur en 80% ACN) bij een flowsnelheid van 300 nl/min. Deze lineaire gradiënt

werd gevolgd door een wasstap waarbij 100% solvent B bekomen werd.

De geëlueerde peptiden werden geïoniseerd in de nano-Electron Spray Ionisation (ESI) bron

om zo de massaspectrometer binnengebracht te worden. De MS spectra werden bekomen in

de Orbitrap waarbij de 10 meest abundante ionen geïsoleerd werden voor fragmentatie en

detectie van deze fragmenten in de lineaire ion trap.

2.4.3. Identificatie van de MS/MS spectra

De identificatie van de opgenomen MS/MS spectra gebeurde met het MASCOT algoritme

(http://www.matrixscience.com). Hierbij werd gebruik gemaakt van de Mascot Daemon

software (versie 2.4.0., Matrix Science). Eerst werden de gewenste parameters ingevuld. Er

werd gezocht tegen de Swiss-Prot databank (versie 2014_04 van de UniProtKB/Swiss-Prot

eiwitdatabank). Hierbij werden de humane en runder eiwitsets gecombineerd om na te gaan in

hoeverre er contaminatie aanwezig was van serumeiwitten. Wanneer uit deze resultaten bleek

dat er weinig achtergrond was van serumeiwitten, werd verder gezocht op de humane set

alleen, met een aparte controle in de runder eiwitset. Als variabele modificaties werden

acetylatie van de N-terminus van de eiwitten, omzetting van N-terminaal glutamine naar

pyroglutaminezuur, oxidatie van methionine en vorming van een propionamide van cysteïne

opgegeven wanneer de staalvoorbereiding in gel trypsinisatie inhield. Indien dit niet het geval

was, werd deze laatste modificatie weggelaten. Als gebruikte protease werd trypsine/P

opgegeven, wat erop wijst dat trypsine ook kan knippen na lysines en arginines die door een

proline gevolgd worden. Als maximum gemiste knipplaatsen werd 1 ingesteld. De accuratesse

Figuur 4. Opbouw van de LTQ Orbitrap Velos massaspectrometer.

Overgenomen van de productspecificaties van de LTQ Orbitrap Velos van Thermo Fisher Scientific.

(www.thermoscientific.com)

21

werd voor massa’s van de peptiden ingesteld op ± 10 ppm en voor de fragmentionen op ± 0,5

Dalton. De stalen werden geanalyseerd met de LTQ Orbitrap Velos massaspectrometer

waarbij als instrumentsetting een ESI-TRAP opgegeven werd. Wanneer de verschillende

parameters opgeslagen waren, werden de ruwe data toegevoegd en werd de spectra generatie

en zoekopdracht gestart. Alleen peptiden die scoorden boven de ingestelde drempelwaarde,

die werd ingesteld op 99% betrouwbaarheid, werden weerhouden. Wanneer de zoekopdracht

afgerond was, werden deze bekomen spectra alsook de eerder bekomen ruwe data opgeslagen

in het ms_lims systeem (24). Kwantificatie na SILAC labeling werd eveneens uitgevoerd

gebruik makend van Mascot Daemon software.

2.4.4. Data-analyse

Data-analyse gebeurde door gebruik te maken van het programma KNIME (versie 2.9.0,

http://www.knime.org/). Een workflow, zoals weergegeven in figuur 5, werd opgesteld om de

vergelijking te maken tussen totale cellysaten en de exosoomstalen bekomen door de

verschillende isolatietechnieken (Exoquick-TC kit en differentiële centrifugatie in combinatie

met detergent removal kolommen of in gel trypsinisatie). Hierbij werd eerst een algemeen

Excel bestand gecreëerd van alle stalen samen met het accessienummer, eiwitomschrijving en

procentuele abundantie van elk eiwit. De procentuele abundantie werd bekomen door het

aantal spectra voor elk eiwit te delen door het totaal aantal spectra in dat staal en te

vermenigvuldigen met 100 zodat procenten bekomen werden. Hierbij werd steeds gebruik

gemaakt van het aantal spectra, wat slechts een relatieve kwantificatie toelaat (13). Echter,

doordat de experimenten steeds in triplicaat zijn uitgevoerd, biedt dit meer zekerheid over de

identificatie en relatieve kwantificatie van de eiwitten. Vervolgens werden de stalen van

interesse via een kolomfilter geselecteerd. Aansluitend werden de eiwitten van de

exosoomstalen gerangschikt volgens aflopende procentuele abundantie zodat ze vergeleken

konden worden met de totale cellysaten. Figuren werden bekomen via het R softwarepakket

(versie 3.1.0.) in KNIME.

http://www.knime.org/

22

Kwantificatie van de SILAC gelabelde stalen (exosoomstalen en cellulaire secretomen) werd

eveneens uitgevoerd met behulp van KNIME. Hierbij werd voor alle stalen de log2 waarde

genomen van de L/H waarden voor een zo goed mogelijke benadering van de

normaalverdeling. Vervolgens werd, per staal, van deze waarden de Huber scale en de

mediaan berekend en werd via deze waarden een 95% betrouwbaarheidsinterval opgesteld.

Omdat er sprake was van veel extreme waarden, was dit interval breed waardoor hetzelfde

nogmaals werd herhaald op een selectie van de L/H waarden, uitgedrukt in log2 waarden,

gelegen tussen -1 en 1. De distributiecurves werden bekomen via R in KNIME.

2.5. ExoCarta

De geïdentificeerde eiwitten van de exosoomstalen, totale cellysaten en cellulaire secretoom

werden vergeleken met de online exosoomdatabank ExoCarta (http://www.exocarta.org/).

Hiervoor werd de eiwit/mRNA dataset (datum van vrijgave: 29/05/12) gedownload en werden

de gennamen van deze eiwitten vergeleken met deze van de gegenereerde dataset van dit

onderzoek door verticaal zoeken via Excel. De humane eiwitten gemeenschappelijk voor

beide datasets werden weerhouden. In deze eiwitlijst werd specifiek gezocht naar de

exosomale eiwitten geïdentificeerd in dit onderzoek.

Figuur 5. KNIME workflow voor de vergelijking van de exosoomstalen met de totale cellysaten.

De KNIME workflow gevolgd voor de vergelijking van de exosoomstalen, bekomen door de verscheidene

aangewende isolatiemethoden, met de totale cellysaten.

23

3. RESULTATEN

3.1. Medium exosoomvrij maken

Het medium werd exosoomvrij gemaakt door een combinatie van ultracentrifugatie en filtratie

(zie deel 2.1.3.1.) (figuur 6). Stalen werden genomen voor ultracentrifugatie, na

ultracentrifugatie (staalname aan de top van de centrifugatietube en midden van de

centrifugatietube) en na filtratie. Hiernaast werd ook een vergelijking gemaakt met

exosoomvrij medium bekomen na filtratie door een Amicon stirred cell (Millipore) en

aangekocht exosoomvrij serum van het SBI. Tevens werd als positieve controle DMEM met

20% FKS geanalyseerd. Als primair antilichaam werd gekozen voor een antilichaam specifiek

gericht tegen één van de gekende exosomale merkers; anti CD63 (~53 kDa) (21).

37

50

75

Figuur 6: Medium exosoomvrij maken.

Western blot van het exosoomvrij maken van medium (A - grijswaarden, B – kleur) met 1) DMEM met

20% FKS, 2) DMEM met 20% FKS na ultracentrifugatie(UC) – topfractie, 3) DMEM met 20% FKS na

UC – middenfractie, 4) DMEM met 20% FKS na UC - gepoolde fractie, 5) DMEM met 20% FKS na

filtratie, 6) DMEM met 10% dFKS, 7) DMEM zonder additieven.

Western blot van het exosoomvrij maken van medium (C) met 1) DMEM met 10% aangekocht exo-

soomvrij medium, 2) EMEM met 10% aangekocht exosoomvrij medium, 3) DMEM met 10% FKS na

filtratie door de Amicon stirred cell.

Het moleculair gewicht van de merkers wordt weergegeven in kDa.

24

Figuur 6 toont aan dat na ultracentrifugatie de top- en middenfractie van het medium met 20%

FKS respectievelijk geen en een zwak signaal geven voor aanwezigheid van CD63, dit in

tegenstelling tot de positieve controle (DMEM met 10% FKS) en het aangekochte serum van

het SBI. Echter, de gepoolde fractie bevat wel nog een merkelijk aantoonbaar signaal, wat

erop wijst dat toch nog exosomen meegenomen werden door het samenvoegen van de

fracties. De extra filtratiestappen hebben geen zichtbaar effect op de signaalsterkte voor

CD63. Het eindresultaat, medium met 10% FKS, bevat een duidelijk minder aantoonbaar

signaal voor CD63 wat vergelijkbaar is met het medium dat bekomen werd na filtratie door de

Amicon stirred cell.

3.2. Exosoomisolatie aan de hand van de Exoquick-TC kit

3.2.1. Aanwezigheid van serum

Isolatie van exosomen van MDA en MCF7 cellen gegroeid in medium met 10% FKS,

vrijgemaakt van exosomen, gebeurde door middel van de Exoquick-TC kit (zie deel 2.2.2.).

Dit experiment werd twee maal uitgevoerd met de MDA celllijn en één maal met de MCF7

cellijn. De 15 meest abundante eiwitten voor de drie stalen samen, gerangschikt volgens

aflopend aantal unieke peptiden, worden getoond in tabel 1.

Tabel 1: Lijst van de 15 meest abundante (unieke) eiwitten aanwezig na isolatie van exo-

somen van MDA en MCF7 cellen gegroeid in medium met 10% FKS.

Accesie Eiwit Unieke peptiden Cellijn

A0JN77 Runder Bifunctioneel ATP-afhankelijk dihydroxyaceton ki-

nase/FAD-AMP lyase 189 MDA

A0JN91 Runder Complement C3 83 MDA

A2VDN8 Humaan Collageen alfa-1(XII) keten 73 MDA

A2I7N0 Runder Serpin A3-4 (fragment) 68 MDA

A1A4R1 Runder Alfa-2-macroglobuline 64 MDA

A2I7M9 Runder Serpin A3-2 62 MDA

B8Y9S9 Runder Embryo-specifiek fibronectine 1 transcript variant 49 MCF7

A2VE41 Humaan Fibronectine 46 MDA

F1MY85 Runder Complement C5a anafylatoxine 45 MCF7

Q7SIH1 Runder Alfa-2-macroglobuline 41 MDA

A2VDL6 Runder Inter-alfa-trypsine inhibitor zware keten 36 MDA

A2VDZ0 Runder Proteïne fosfatase 2, regulatorische subeenheid B', alfa

isoform 36

MDA

A5A3E0 Runder Coagulatie factor V 35 MDA

P15497 Runder Apolipoproteïne A-I 33 MCF7

P02769 Runder Serum albumin 31 MCF7

A4IFL4 Runder PPARD protein 30 MDA

A3KMV5 Humaan Thrombospondine-1 29 MDA

Tabel 1: De resultaten bekomen na massaspectrometrie van de geïsoleerde exosomen van de MDA en

MCF7 cellijn met de Exoquick-TC kit. Weergegeven zijn het accessienummer, de omschrijving van het

eiwit en het aantal gevonden unieke peptiden. De lijst is gesorteerd van het meest geïdentificeerde eiwit

naar het minst geïdentificeerde eiwit.

25

Tabel 1 toont aan dat er veel achtergrond is van serumeiwitten. Hierdoor werd geopteerd om

de cellen steeds 24 h serumvrij te plaatsen voorafgaand aan isolatie van exosomen.

3.2.2. Cellen 24 h serumvrij

Exosomen werden geïsoleerd van MDA, MCF7 en HepG2 cellen met de Exoquick-TC kit

(zie deel 2.2.2.). Hiervoor werden de cellen eerst 24 h serumvrij geplaatst om achtergrond van

serumeiwitten te beperken. De stalen werden voorbereid voor MS/MS analyse door in gel

trypsinisatie. Dit experiment werd vier maal uitgevoerd met de MDA cellen, in triplicaat voor

de MCF7 cellijn en één maal met de HepG2 cellijn.

De herhaalbaarheid van de exosoomisolatie via de Exoquick-TC kit wordt weergegeven in

figuur 7.A. De algemene verdeling van de procentuele abundantie (dit is het aantal spectra per

eiwit gedeeld door het totaal aantal spectra in dat staal, uitgedrukt in percentages) van de

eiwitten aanwezig in de exosoomstalen en de totale cellysaten worden, per cellijn,

gevisualiseerd (figuur 7.B). Hieruit kunnen gelijkenissen (MDA, HepG2) of verschillen

(MCF7) in distributie van de eiwitten in de exosoomstalen en totale cellysaten afgeleid

worden.

Enkele eiwitten zijn steeds sterk aanwezig in de exosoomstalen van alle cellijnen en zijn

afwezig of duidelijk minder aanwezig in de overeenstemmende totale cellysaten;

glucocorticoïd receptor (P04150) en POTE ankyrine domein familielid F (A5A3E0). Een

visuele weergave hiervan wordt weergegeven voor het eerst vernoemde eiwit (figuur 8).

Vergelijkbare grafieken werden bekomen voor de overige eiwitten.

Ook waren in alle exosoomstalen contaminerende eiwitten, zoals keratines, uitgesproken

aanwezig en dit is heel wellicht te wijten aan de behandeling van de stalen.

26

Figuur 7: Herhaalbaarheid van exosoomisolatie met Exoquick TC en de algemene verdeling van de

procentuele abundantie van de eiwitten.

A. Herhaalbaarheid van de exosoomisolatie door de Exoquick TC kit met rood – MDA cellijn, blauw –

MCF7 cellijn en groen – HepG2 cellijn.

B. Verdeling van de procentuele abundantie van de eiwitten na exosoomisolatie (blauw) en de totale

cellysaten (rood) met de Exoquick TC kit.

27

Figuur 8: Aanwezigheid van glucocorticoïd

receptor.

De grafieken tonen de verdeling aan van de

procentuele abundantie van de eiwitten van de

exosoomstalen (blauw) en totale cellysaten

(rood). De blauwe cirkels tonen de aanwezigheid

aan van glucocorticoïd receptor in de

exosoomstalen. De rode cirkel toont de

aanwezigheid aan van dit eiwit in de totale

cellysaten.

28

Ook worden cellijn-specifieke eiwitten aangetroffen, voornamelijk voor de HepG2 cellijn

(tabel 2). Deze zijn steeds duidelijk meer aanwezig in de exosoomstalen dan in de

overeenstemmende totale cellysaten.

De geïdentificeerde exosomale eiwitten worden steeds vergeleken met de eiwitten

geïdentificeerd in het onderzoek van Chiasserini et al., dit om gelijkenissen aan te tonen met

de eiwitinhoud van in vivo geïsoleerde exosomen (25).

MCF7 HepG2

Apolipoproteïne A1 * P02647 Apolipoproteïne E * P02649

Clusterine P10909

Fibrinogeen alfaketen * P02671

Fibrinogeen betaketen * P02675

Fibrinogeen gammaketen P02679

Galectine 3 bindend proteïne Q08380

Glypican-3 P51654

Nucleoline P19338

Reeline P78509

Daar met deze isolatiemethode steeds een lage opbrengst bekomen werd en de herhaalbaar-

heid gering was, werd dit experiment niet uitgevoerd in triplicaat voor de HepG2 cellijn. Ook

werd dit experiment niet meer herhaald met de HeLa cellijn.

Tabel 2: Cellijn-specifieke eiwitten waargenomen in exosoomstalen na isolatie door de Exoquick-TC kit,

weergegeven voor de MCF7 en HepG2 cellijn met links de naam van het eiwit en rechts het accessienum-

mer. Er werden geen cellijn-specifieke exosomale eiwitten aangetroffen in de MDA cellijn. De aangeduide

eiwitten (*) werden ook reeds geïdentificeerd in humaan CSV (25).

Tabel 2: Cellijn-specifieke eiwitten gevonden na exosoomisolatie via de Exoquick TC kit.

29

3.3. Exosoomisolatie aan de hand van differentiële centrifugatie

3.3.1. Staalvoorbereiding door middel van detergent removal kolommen

Exosomen werden geïsoleerd van de vier verschillende kankercellijnen (MDA, MCF7, HeLa

en HepG2 cellijnen) door differentiële centrifugatie (zie deel 2.2.3.). Hiervoor werden de

cellen eerst 24 h serumvrij geplaatst om de achtergrond van serumeiwitten te beperken. De

stalen werden voorbereid voor LC-MS/MS analyse door middel van detergent removal

kolommen (deel 2.4.1.2.). Dit werd voor elke cellijn uitgevoerd in triplicaat (figuur 9).

Figuur 9: Reproduceerbaarheid van de exosoomisolatie via differentiële centrifugatie en staal-

voorbereiding voor MS via detergent removal kolommen.

De grafieken tonen de verdeling aan van de procentuele abundantie van de eiwitten in de exosoomsta-

len na isolatie door differentiële centrifugatie en voorbereiding voor MS via detergent removal ko-

lommen. De drie experimenten worden steeds weergegeven in een andere kleur; blauw, rood en groen.

30

De algemene verdeling van de procentuele abundantie van de eiwitten wordt weergegeven,

zowel voor de exosoomstalen als voor de totale cellysaten, voor de vier cellijnen (figuur 10).

Figuur 10: Algemene verdeling van de procentuele abundantie van de eiwitten in de exosoomstalen

en de totale cellysaten.

De grafieken geven de algemene verdeling weer van de procentuele abundantie van de eiwitten in de

exosoomstalen (blauw) en de totale cellysaten (rood) na exosoomisolatie via differentiële centrifugatie

gevolgd door voorbereiding voor MS door detergent removal kolommen. Dit wordt getoond voor de 4

cellijnen.

31

Verscheidene eiwitten zijn waarneembaar in alle vier de cellijnen en zijn afwezig of duidelijk

minder aanwezig in de totale cellysaten van de overeenkomstige cellijnen (tabel 3). Het

voorkomen van de eiwitten 4F2 cell-surface antigen heavy chain en glucocorticoïd receptor

wordt visueel weergegeven voor de HeLa cellijn (figuur 11). Vergelijkbare resultaten werden

bekomen voor de overige cellijnen, alsook voor de andere vernoemde eiwitten.

Accessienummer Eiwitnaam

P62249 40 S ribosomaal eiwit S16


P08195 4F2 cell-surface antigen heavy chain

P04150 Glucocorticoïd receptor

P04908 Histon H2A type 1-B/E

O60814 Histon H2B type 1-K

Q01650 Large neutral amino acid transporter small subunit 1

Q15758 Neutral amino acid transporter B(0)

P11166 Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 1

Tabel 3: Eiwitten die specifiek voorkomen in de exosoomstalen van de 4 cellijnen na isolatie door

differentiële centrifugatie en staalvoorbereiding voor MS via detergent removal kolommen. Deze

eiwitten werden nog niet geïdentificeerd in humaan CSV (25).

Figuur 11: Aanwezigheid van specifieke exosomale eiwitten in de HeLa cellijn.

De grafieken tonen de verdeling aan van de procentuele abundantie van de eiwitten in de exosoomstalen

(blauw) en de totale cellysaten (rood). De blauwe cirkels tonen de aanwezigheid aan van 4F2 cell-surface

antigen heavy chain (4F2, links) en glucocorticoïd receptor (GR, rechts) in de exosoomstalen. Beide ei-

witten werden niet geïdentificeerd in de totale cellysaten.

Tabel 3: Eiwitten specifiek aanwezig in de exosoomstalen van alle cellijnen.

32

Alle vier de cellijnen bevatten ook steeds hoge aantallen heat shock cognate 71 kDa en ver-

scheidene annexines (onder meer annexine A2, A3 en A4), maar deze eiwitten komen niet

meer voor in de exosoomstalen.

Ook worden cellijn-specifieke eiwitten gevonden die enkel aanwezig zijn in exosoomstalen

van één van de vier cellijnen (tabel 4). Deze eiwitten zijn ook duidelijk minder aanwezig in de

totale cellysaten van de overeenstemmende cellijnen.

Tabel 4. Cellijn-specifieke eiwitten.

MDA MCF7

Dermcidine P81605 40S ribosomaal S15a P62244

Heat shock cognate 71 kDa P11142 Catenine alfa-1 P35221

HLA klasse 1 A2 P01892 CD63 P08962

Hornerine Q86YZ3 Nucleoline P19338

Integrine alfa-3 P26006 Ras GTPase activating like

protein

Q13283

Lactadherine * Q08431 Semaphorine-3C Q99985

Lysozyme C P61626

Proteolipide protein 2 Q04941

HeLa HepG2

Alkaline fosfatase P05186 Apolipoproteïne A1 * P02647

Annexine A6 P08133 Apolipoproteïne E * P02649

Basigine P35613 Fibrinogeen alfa keten * P02671

CD 109 Q6YHK3 Fibrinogeen beta keten * P02675

CD 99 P14209 Fibrinogeen gamma keten P02679

Flotilline-1 O75955 Fibronectine P02751

Histon H2AX P16104

Histon H2B type 1-J P06899

Podocalyxine O00592

Ras-related protein Rab-7a P51149

Ras-related protein Rab-1A P62820

Ras-related protein Ral-A P11233

Tubuline beta 4A keten P04350

Voorts zijn ook eiwitten teruggevonden die duidelijk meer voorkomen in de exosoomstalen

dan in de totale cellysaten en dit steeds voor drie van de vier cellijnen, zoals CD44 antigen

(P16070), POTE ankyrine domein familielid F (A5A3E0), clusterine (P10909) e.a. (de

volledige lijst is als bijlage beschikbaar). Ook valt op dat de MDA en MCF7 cellijn, beide

afkomstig van een borst adenocarcinoom, meer gelijkenissen vertonen met de HeLa cellijn

dan met elkaar. Er is slechts één exosomaal eiwit dat uitsluitend voorkomt in de beide

borstkankercellijnen; MARCKS related protein (P49006).

Tabel 4: Cellijn-specifieke eiwitten waargenomen in exosoomstalen na isolatie door differentiële centrifuga-

tie en staalvoorbereiding voor MS via detergent removal kolommen. Voor elke cellijn is links de eiwitnaam

weergegeven en rechts het accessienummer. De aangeduide eiwitten (*) werden ook reeds geïdentificeerd in

humaan CSV (25).

33

3.3.2. Staalvoorbereiding door middel van in gel trypsinisatie

Exosomen van de vier verschillende kankercellijnen werden geïsoleerd door differentiële

centrifugatie (deel 2.2.3.) en voorbereid voor MS via in gel trypsinisatie (deel 2.4.1.3.). Dit

werd voor elke cellijn uitgevoerd in triplicaat (figuur 12).

Figuur 12: Reproduceerbaarheid van de exosoomisolatie via differentiële centrifugatie en

voorbereiding voor MS door in gel trypsinisatie.

De grafieken tonen de verdeling aan van de procentuele abundantie van de eiwitten in de exo-

soomstalen na isolatie via differentiële centrifugatie en voorbereiding voor MS door in gel trypsini-

satie. De drie experimenten worden steeds weergegeven in een andere kleur; blauw, rood en groen.

De grafieken worden weergegeven voor de 4 cellijnen.

34

De algemene verdeling van de procentuele abundantie van de eiwitten aanwezig in de exo-

soomstalen en de totale cellysaten worden getoond voor de vier cellijnen (figuur 13).

Verschillende eiwitten zijn waarneembaar in de exosoomstalen van alle vier de cellijnen en

deze zijn afwezig in de totale cellysaten; glucocorticoïd receptor (P04150) en POTE ankyrine

domein familielid F (A5A3E0). Ook werden steeds eiwitten afkomstig van de behandeling

van de stalen weergevonden in de exosoomstalen zoals keratines, hornerine en dermcidine,

die afwezig waren in de totale cellysaten. Er werden enkel cellijn-specifieke eiwitten, aange-

troffen in hoge mate in de exosoomstalen en afwezig of weinig aanwezig in de totale cel-

lysaten, gevonden voor de HeLa en HepG2 cellijn (tabel 5).

Figuur 13: Algemene verdeling van de procentuele abundantie van de eiwitten in de exosoomstalen

en totale cellysaten na isolatie door differentiële centrifugatie en voorbereiding voor MS via in gel

trypsinisatie.

De grafieken tonen de verdeling aan van de procentuele abundantie van de eiwitten in de exosoomstalen

(blauw) en de totale cellysaten (rood). Dit wordt weergegeven voor elke cellijn afzonderlijk.

35

Tabel 5: Cellijn-specifieke eiwitten gevonden na exosoomisolatie door differentiële cen-

trifugatie en voorbereiding voor MS via in gel trypsinisatie.

HepG2 HeLa

Alfa-2-macroglobuline P01023 4F2 cell-surface antigen heavy chain P08195

Fatty acid synthase P49327 Annexine A2 P07355

Fibrinogeen alfa keten * P02671 Filaggrine-2 Q5D862

Galectine-3-bindend eiwit Q08380 Histon H2B type 1-K O60814

Large neutral amino acid transporter small subunit 1 Q01650

Neutral amino acid transporter B(0) Q15758

Sodium/pottassium-transporting ATPase subunit 1 * P05023

Transferrine receptor protein 1 * P02786

Op basis van de exosomale eiwitten, bekomen door de verscheidene isolatiemethoden,

werden exosoomsignaturen opgesteld voor de vier cellijnen (zie bijlage). Hiernaast werd ook

gekeken naar alle eiwitten geïdentificeerd in de exosoomstalen. Ongeveer de helft van deze

eiwitten (gemiddeld 46 tot 59%) waren louter aanwezig in de exosoomstalen en afwezig in de

totale cellysaten. Hierbij werd een verband opgemerkt tussen de eiwitinhoud van de

verschillende cellijnen (figuur 14). Hiervoor werd geen gebruik gemaakt van het aantal

spectra maar louter van de aanwezigheid van een eiwit. Het wil echter niet zeggen dat

wanneer een eiwit niet geïdentificeerd wordt, het effectief ook afwezig is in het staal.

Tabel 5: Cellijn-specifieke eiwitten waargenomen in exosoomstalen (HepG2 en HeLa cellijn) na isolatie door

differentiële centrifugatie en staalvoorbereiding voor MS via in gel trypsinisatie. Links wordt de eiwitnaam

weergegeven, rechts het accessienummer. De aangeduide eiwitten (*) werden ook reeds geïdentificeerd in

humaan CSV (25).

Figuur 14: Overeenkomst van de exosomale eiwitten van de vier cellijnen.

De verdeling van de exosomale eiwitten wordt weergegeven in een Venndiagram voor de vier cellijnen.

Hierbij wordt steeds het aantal geïdentificeerde eiwitten in de exosoomstalen weergegeven. Zo kan men

het aantal unieke en gemeenschappelijke exosomale eiwitten aflezen voor deze cellijnen.

36

3.4. SILAC labeling en analyse van het cellulaire secretoom

HeLa cellen werden gelabeld met zwaar en licht gelabelde arginines en lysines in een 1/1

verhouding (zie deel 2.1.5.) waarna exosoomisolatie gebeurde door differentiële centrifugatie,

alsook cellulaire secretoomisolatie (deel 2.1.6.). Hiervoor werden de cellen eerst 24 h serum-

vrij geplaatst. Deze experimenten werden uitgevoerd in triplicaat.

3.4.1. Vergelijking exosoomstalen met de geïsoleerde cellulaire secretomen

De bekomen cellulaire secretomen werden vergeleken met de exosoomstalen bekomen door

differentiële centrifugatie in combinatie met detergent removal kolommen. Enkele exosomale

eiwitten, die duidelijk meer aanwezig zijn in de exosoomstalen dan in de totale cellysaten,

werden ook aangetroffen in het secretoom (tabel 6).

Tabel 6: Exosomale eiwitten aangetroffen in het secretoom

P10909 Clusterine S

P49327 Fatty acid synthase E

P21333 Filamine A S

Q08380 Galectine-3 bindend proteïne S

P04150 Glucocorticoïd receptor S = E

A5A3E0 POTE ankyrine domein familie lid F S

3.4.2. Kwantificatie

Distributiecurves werden opgesteld, na SILAC labeling, zowel voor de exosoomstalen als

voor de cellulaire secretomen. Ze tonen de distributie van de eiwitten die zich bevinden tussen

de 2 limieten van het 95% betrouwbaarheidsinterval dat werd opgesteld gebruik makend van

alle data, alsook voor het interval dat werd berekend via de selectie van waarden (L/H = -1;1).

Deze curves zijn voor de exosoomstalen, voor twee van de drie experimenten, weergegeven

(figuur 15). De derde herhaling van het experiment gaf een vergelijkbaar resultaat als de bo-

venste curve (bijlage). Voor de secretomen worden deze distributiecurves, voor één experi-

ment, weergegeven (figuur 16). De twee herhalingen van dit experiment gaven vergelijkbare

curves (bijlage).

Tabel 6: Exosomale eiwitten weergevonden in de secretomen van de HeLa cellijn. Links wordt het

accessienummer weergegeven, in het midden de eiwitnaam en rechts of het eiwit voornamelijk voorkomt in

de secretomen (S) of in de exosoomstalen na isolatie door middel van differentiële centrifugatie in combinatie

met detergent removal kolommen (E).

37

Figuur 15: Distributie van de eiwitten in de exosoomstalen na SILAC labeling.

De distributiecurves van de eiwitten van de exosoomstalen, na SILAC labeling, worden getoond voor de

brede limieten (rood) en de nauwe limieten (blauw). Elke grafiek toont een herhaling van een experiment.

Figuur 16: Distributie van de eiwitten in de secretoomstalen na SILAC labeling.

De distributiecurves van de eiwitten in het cellulaire secretoomstaal, na SILAC labeling, worden getoond

voor de brede limieten (rood) en de nauwe limieten (blauw).

38

De eiwitten die terug te vinden waren binnen het nauwe betrouwbaarheidsinterval, waren met

95% zekerheid afkomstig van de cellijnen en niet van het cultuurmedium. Hierbij werd zowel

gekeken naar de eiwitten weergevonden in de exosoomstalen als deze in de cellulaire secre-

tomen. Bijna de helft (43%) van de eiwitten geïdentificeerd in de exosoomstalen, waren afwe-

zig in de cellulaire secretomen (tabel 7).

Tabel 7: Exosomale eiwitten weergevonden in de SILAC gelabelde exosoomstalen.

P62241 40S ribosomal protein S2




P26373 60S ribosomal protein L13



P04083 Annexin A1

P07355 Annexin A2

P08758 Annexin A5

Q562R1 Beta-actin-like protein 2

P16070 CD44 antigen

O43854 EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3 *

Q9UBI6 Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(O) subunit gamma-12

P01891 HLA class I histocompatibility antigen, A-68 alpha chain

P01889 HLA class I histocompatibility antigen, B-7

Q01650 Large neutral amino acids transporter small subunit 1

P29966 Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate

A6NIZ1 Ras-related protein Rap-1b-like protein

P08134 Rho-related GTP-binding protein RhoC

P05023 Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1 *

3.5. ExoCarta

De geïdentificeerde eiwitten uit dit onderzoek, zowel voor de exosoom-, totale cellysaat- en

cellulaire secretoomstalen, werden vergeleken met de online databank ExoCarta. Hierbij

werden 879 gemeenschappelijke humane eiwitten teruggevonden en hiervan waren 47

eiwitten geïdentificeerd als specifieke exosoomeiwitten (bijlage).

Tabel 7: Exosomale eiwitten weergevonden in de SILAC gelabelde exosoomstalen en afwezig in de SILAC

gelabelde secretoomstalen. Links wordt het accessienummer weergegeven en rechts de eiwitnaam. De aange-

duide eiwitten (*) werden ook reeds geïdentificeerd in humaan CSV (25).

39

3.6. Validatie door Western blotting

Validatie van de exosoomisolatie werd uitgevoerd via Western blotting en analyse met het

Odyssey systeem (LI-COR, Odyssey). Als primair antilichaam werd een gekende exosomale

merker, CD63 (~53 kDa), gebruikt en tubuline (~51 kDa) aangewend als ladingscontrole (21).

Hierbij werden de geïsoleerde exosomen, bekomen door differentiële centrifugatie en de

Exoquick-TC kit, van de MDA en MCF7 cellijn vergeleken met hun totale cellysaten (figuur

17).

Dit experiment werd herhaald met een meer gevoelige methode gebaseerd op enhanced

chemiluminiscence (ECL). Hierbij werden de exosomale merkers CD63 (figuur 18) en CD81

(bijlage) aangewend als primair antilichaam bij de exosoomstalen afkomstig van isolatie door

middel van differentiële centrifugatie (21). Voor de exosoomstalen geïsoleerd via de

Exoquick-TC kit werd enkel CD63 als primair antilichaam gebruikt (bijlage).

Figuur 17: Validatie exosoomisolatie – Odyssey systeem.

Western blot met CD63 (groen) en tubuline (rood) als primair antilichaam met 1) cellysaat - MCF7

cellen, 2) exosomen na isolatie door differentiële centrifugatie (DC) – MCF7 cellen, 3) exosomen

na isolatie door Exoquick-TC – MCF7 cellen, 4) cellysaat – MDA cellen, 5) exosomen na isolatie

door DC – MDA cellen, 6) exosomen na isolatie door Exoquick-TC – MDA cellen.


40

Figuur 18: Validatie exosoomisolatie – ECL systeem.

Western blot met CD63 als primair antilichaam met laan 1) exosomen - MDA cellen, 2) exosomen –

MCF7 cellen, 3) exosomen – HeLa cellen, 4) exosomen – HepG2 cellen, 5) cellysaat – MDA cellen,

6) cellysaat – MCF7 cellen, 7) cellysaat – HeLa cellen, 8) cellysaat – HepG2 cellen.


41

4. BESPREKING

Exosomen zijn membraanvesikels die vrijgesteld worden door verscheidene celtypes en reeds

werden bestudeerd in verschillende pathologische aandoeningen zoals vasculaire ziekten,

bacteriële infecties en kanker (13). Ze bevatten specifieke eiwitten, lipiden en genetisch

materiaal en oefenen verschillende biologische functies uit (3, 9). Onderzoek naar exosomen

is recent zeer populair geworden door de mogelijkheid hen aan te wenden als diagnostisch

middel en voor nieuwe therapiemogelijkheden (2, 5).

In deze studie werden exosomen geïsoleerd van verschillende humane kankercellijnen

gebruikmakend van twee verschillende isolatiemethoden. Het doel was om een vergelijking te

maken van de eiwitinhoud van exosomen afkomstig van kankercellen met een verschillende

oorsprong en agressiegraad en zo gelijkenissen alsook verschillen aan te tonen. Ook werd een

vergelijking gemaakt met totale cellysaten van de cellijnen en het secretoom van de HeLa

cellijn. De twee aangewende isolatiemethoden werden vergeleken op basis van de opbrengst,

zuiverheid en herhaalbaarheid.

Een eerste uitdaging bestond uit het exosoomvrij maken van het medium gebruikt om cellen

in cultuur te houden. Hierbij werden verschillende methoden uitgetest en vergeleken;

differentiële centrifugatie in combinatie met filtratie, de Amicon stirred cell en aangekocht

exosoomvrij serum van het SBI. Er werd uitgegaan van differentiële centrifugatie van

medium met 10% FKS. Dit gaf initieel goede resultaten en hiervoor was ook alle materiaal

voorhanden. Daar steeds weinig medium tegelijk geprepareerd kon worden en de

groeisnelheid van de cellen afnam, werd vervolgens overgestapt naar de methode van Théry

et al., waarbij uitgegaan werd van medium met 20% FKS wat na centrifugatie aangelengd

werd tot het medium 10% FKS bevatte (20). Hierdoor verdubbelde de opbrengst van het

geprepareerde medium en de groeisnelheid van de cellen nam terug toe. Deze

centrifugatiemethode werd gecombineerd met filtratie ter compensatie voor de extra

hoeveelheid serum. Deze methode reduceerde de hoeveelheid exosomen aanwezig in het

medium aanzienlijk, zoals aangetoond via Western blotting, en daarom werd ze aangewend in

het verder onderzoek.

De methode steunend op het gebruik van de Amicon stirred cell werd tevens uitgetest, dit in

samenwerking met collega’s van het VIB in Zwijnaarde. Ook deze methode resulteerde in een

duidelijke reductie van exosomen in het medium, maar had echter enkele nadelen. Dit toestel

42

was niet voorhanden in ons labo wat dus de aankoop ervan noodzakelijk maakte. Ook kan met

dit toestel slechts 200 ml medium tegelijk behandeld worden, waarna ook nog een

bijkomende filtratiestap nodig is daar de eerste niet steriel verloopt. Wegens deze

verschillende nadelen hebben we niet geopteerd voor deze methode.

Ten slotte werd ook een vergelijking gemaakt met aangekocht exosoomvrij serum van het

SBI. Dit serum bevatte echter nog meer exosomaal materiaal dan medium dat exosoomvrij

werd gemaakt via de overige twee methoden en zou hiernaast ook steeds een dure aankoop

vormen waardoor hier geen verder gebruik van gemaakt werd.

Verder vormde de achtergrond van heel wat serumeiwitten na isolatie van exosomen van

MDA en MCF7 cellen met de Exoquick-TC kit initieel een probleem (tabel 1). Hierbij

werden twee methoden gebruikt om dit te omzeilen.

Een eerste methode was om de cellen 24 uur voor isolatie van exosomen serumvrij te

plaatsen. Dit resulteerde in veel minder achtergrond van serumeiwitten, aangetoond door

middel van MS analyse. Daarom werd niet uitgekeken naar eventuele langere tijdstippen.

Een tweede methode bestond uit SILAC labeling van de HeLa cellen waardoor via MS een

onderscheid gemaakt kon worden tussen de eiwitten afkomstig van de cellen en deze van het

serum. Uit dit experiment bleek dat in de exosoomstalen bekomen door differentiële

centrifugatie in combinatie met detergent removal kolommen nog steeds een grote

meerderheid van de eiwitten afkomstig is van het serum. Enkel voor de derde herhaling van

dit experiment was contaminatie met serumeiwitten gering. Dit toont aan dat verdere

optimalisatie van de isolatietechniek alsook eventueel een introductie van extra wasstappen

noodzakelijk is om deze contaminatie tegen te gaan. Echter, in tegenstelling tot de

exosoomstalen, bevatten de secretoomstalen opvallend minder serumeiwitten. Dit kan

eventueel verklaard worden daar secretomen veel meer eiwitmateriaal bevatten, in

tegenstelling tot exosomen, en hierdoor deze eiwitten meer abundant aanwezig zullen zijn in

de stalen ten opzichte van de serumeiwitten en zo sneller opgepikt via MS.

Hoewel andere onderzoeksgroepen dit probleem niet aankaarten, wordt via dit experiment

duidelijk dat er, voor deze isolatiemethode, toch nog veel achtergrond van serumeiwitten

aanwezig is, wat de identificatie van exosomale eiwitten bemoeilijkt. Het is dus aangeraden

om in de toekomst meer onderzoek uit te voeren omtrent dit gegeven en te zoeken naar

alternatieven om deze contaminatie te beperken.

43

Exosomen werden geïsoleerd gebruik makend van twee isolatiemethoden; differentiële

centrifugatie en isolatie aan de hand van de Exoquick-TC kit. Deze isolatiemethoden kunnen

vergeleken worden op basis van de opbrengst, zuiverheid en herhaalbaarheid. Hier moet

echter rekening gehouden worden met de verschillende voorbereiding van de stalen voor MS.

Voor de differentiële centrifugatiemethode was het reduceren van de concentratie van het

detergent SDS met detergent removal kolommen voldoende. Echter, bij de Exoquick-TC kit

was er nood aan SDS-PAGE om ook de bestanddelen van de Exoquick-TC-oplossing te

verwijderen die storen voor trypsine digestie en LC-MS/MS analyse. Deze verschillen in

voorbereiding kunnen eventueel ook een effect hebben op de resultaten. Daarom werden

stalen na isolatie aan de hand van de differentiële centrifugatie methode voorbereid voor MS

zowel door detergent removal kolommen als door in gel digest om het eventuele effect van

deze verschillende voorbereidingsmethoden na te gaan. Hieruit blijkt dat het gebruik van in

gel trypsinisatie negatieve gevolgen heeft voor de bekomen resultaten. De opbrengst is voor

alle cellijnen, behalve de MCF7 cellijn, lager bij in gel trypsinisatie in vergelijking met de

detergent removal kolommen. Ook blijkt voor deze eerste MS voorbereidingsmethode de

reproduceerbaarheid geringer te zijn. Hiernaast zijn tevens steeds eiwitten aanwezig in de

stalen afkomstig van de manuele behandeling waardoor de in gel trypsinisatie ook op het vlak

van zuiverheid slechter scoort dan de detergent removal kolommen. Algemeen is het dus

aangewezen om, indien mogelijk, gebruik te maken van detergent removal kolommen.

Hiermee rekening houdende, blijkt dat de opbrengst en reproduceerbaarheid van

exosoomisolatie door de Exoquick-TC kit nog lager zijn dan bij de in gel trypsinisatie na

differentiële centrifugatie. Voor elke cellijn is steeds maar één isolatie geslaagd. Ook blijft het

probleem van de aanwezigheid van contaminerende eiwitten, afkomstig van manuele

behandeling, in de stalen aanwezig. Uit deze bevindingen blijkt dat de Exoquick-TC kit geen

ideale methode is voor exosoomisolatie, wat in sterk contrast staat met de bevindingen van

Taylor et al (26). Zij isoleerden exosomen uit ascites en duiden de Exoquick-TC kit aan als de

isolatiemethode voor exosomen die de hoogste zuiverheid en opbrengst oplevert. Khan et al.

beschrijven ook een geslaagde exosoomisolatie uit serum via de Exoquick-TC kit (27).

Echter, Xiao et al. halen aan dat exosoomisolatie door middel van Exoquick-TC precipitatie,

van exosomen uit celcultuur, resulteert in onvoldoende aanrijking van exosomen, wat

overeenstemt met de resultaten van ons experiment (8). Uit deze sterke contradictie kunnen

we afleiden dat de Exoquick-TC isolatiemethode geschikt is voor exosoomisolatie uit

patiëntstalen (ascites, serum, urine e.a.) maar geen ideale methode is voor exosoomisolatie uit

44

cultuurmedia.

De Exoquick-TC kit werd tevens reeds aangehaald als een snelle methode voor

exosoomisolatie (28). Echter door de essentiële incubatiestap van minimum 12 h, loopt de

tijdsduur al gauw op en is het sneller om gebruik te maken van differentiële centrifugatie. Wel

is exosoomisolatie via de Exoquick-TC kit minder arbeidsintensief. Een ander voordeel is ook

dat veel minder startmateriaal noodzakelijk is, wat zeker voordelig is wanneer men uitgaat

van patiëntenmateriaal.

De exosoominhoud van de verschillende, geselecteerde cellijnen kan vergeleken worden op

eiwitniveau op basis van de verscheidene geïdentificeerde exosomale eiwitten per cellijn.

Deze geïdentificeerde exosomale eiwitten vertonen veel gelijkenissen voor de verscheidene

isolatiemethoden, waarbij vaak dezelfde eiwitten naar voor kwamen. De differentiële

centrifugatiemethode levert duidelijk de meeste resultaten op.

Deze exosomale eiwitten werden bekomen door een vergelijking te maken tussen de eiwitten

weergevonden in de exosoomstalen en deze in de totale cellysaten. Ook werd een vergelijking

gemaakt met het cellulair secretoom voor de HeLa cellijn. Zo werden enkel de eiwitten die

duidelijk meer aanwezig waren in de exosoomstalen en afwezig of duidelijk minder aanwezig

in de totale cellysaten en het cellulair secretoom benoemd als exosomale eiwitten. Eiwitten

die even sterk naar voor kwamen in de totale cellysaten (clathrine heavy chain 1, annexine

A2, e.a.) en celluaire secretomen (filamine A, clusterine, e.a.) werden niet aangeduid als

exosomale eiwitten.

De exosomale eiwitten die steeds terugkomen in alle cellijnen zijn de glucocorticoïd receptor,

4F2 cell-surface antigen heavy chain, histoneiwitten (histon H2A type 1-B/E, histon H2B type

1-K), ribosomale eiwitten (40 S ribosomaal eiwit S16, 40 S ribosomaal eiwit S2) en

transporters (large neutral amino acid transporter small subunit 1, neutral amino acid

transporter B(0), solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 1). Aangezien

deze eiwitten steeds voorkomen in alle cellijnen, kan men spreken van gemeenschappelijke

exosomale eiwitten die bijdragen tot algemene exosomale structuren en/of functies. Alsook

worden eiwitten weergevonden in alle cellijnen of 3 van de 4 cellijnen die bijdragen tot het

kankerfenotype van de cellijnen zoals 4F2 cell-surface antigen heavy chain en CD44 antigen.

Ze dragen bij tot het kankerproces door neoplastische celgroei, proliferatie en invasie.

Hiernaast werden, in enkele cellijnen, eiwitten weergevonden die specifiek instaan voor de

vesikelformatie en vesiculair transport; de Ras-related eiwitten Rab-5C (vesiculair transport),

45

Rab-35 (vesikel formatie, transport, aanhechting en fusie) en Rab-7a (vesiculair transport) en

flottiline-1 (vesikel formatie). Al deze eiwitten zijn reeds gekend als exosomale eiwitten in de

ExoCarta databank.

Naast deze geconserveerde, gemeenschappelijke set van eiwitten, beschikken de exosomen

van elke cellijn ook over unieke eiwitten afkomstig van hun producerende (kanker)cel.

Enerzijds kunnen deze eiwitten een functie vervullen gerelateerd aan de oorspronkelijke

functie van de cel. Dit wordt vooral duidelijk voor de exosomen afkomstig van de HepG2

cellijn; ze beschikken over eiwitten die specifiek instaan voor functies die, in normale

omstandigheden, uitgeoefend worden door levercellen zoals cholesteroltransport

(apolipoproteïne A-I), katabolisme van lipoproteïne partikels (apolipoproteïne E),

internalisatie van LDL partikels (apolipoproteïne B-100) en formatie van lange vetzuurketens

(vetzuursynthase). Anderzijds kunnen deze unieke eiwitten ook bijdragen tot het

kankerfenotype van de cel. Enkele voorbeelden hiervan zijn galectine-3-bindend eiwit

(HepG2), basigine en podocalyxine (HeLa) en CD63 antigen (MCF7).

Ten slotte kan, voor elke cellijn, op basis van deze geconserveerde set van eiwitten en de

unieke eiwitten een exosoomsignatuur opgesteld worden, bestaande uit alle eiwitten die

specifiek voorkomen in de exosomen van deze cellijn. Hieruit blijkt dat elke cellijn

gelijkenissen heeft met de andere drie cellijnen, maar dat er ook veel onderlinge verschillen

waarneembaar zijn. Dit laatste is duidelijk waarneembaar voor de MDA en MCF7 cellijn.

Deze cellijnen zijn beide afkomstig van een borstcarcinoom, maar vertonen een verschillende

graad van agressie. Naast de geconserveerde set van eiwitten hebben de exosomen van deze

cellijnen slechts één exosomaal eiwit gemeenschappelijk; het MARCKS gerelateerd eiwit. Dit

eiwit speelt een rol in de migratie van kankercellen. Hieruit blijkt dat de eiwitinhoud van

exosomen, gesecreteerd door cellen met een zelfde biologische afkomst, sterk kan verschillen.

Dit roept het vermoeden op dat de exosomale eiwitinhoud gecorreleerd is met een andere

factor, zoals de agressiegraad van de cel van herkomst.

Verdere vergelijking van de cellijnen op basis van de volledige set van geïdentificeerde

eiwitten in de exosoomstalen bevestigt deze eerdere stelling. De MDA en MCF7 cellijnen

vertonen nog steeds een geringe overeenkomst. Echter, de MCF7 cellijn toont meer

gelijkenissen met de HeLa en HepG2 cellijn, in tegenstelling tot de MDA cellijn die steeds

weinig gelijkenissen vertoont met de andere cellijnen. Dit spreekt de eerdere stelling omtrent

de correlatie tussen exosoominhoud en agressiegraad deels tegen.

46

Indien uit de opgestelde exosoomsignaturen van deze verscheidene kankercellijnen specifieke

diagnostische biomerkers willen geïdentificeerd worden, is het noodzakelijk om eerst elk van

deze signaturen te vergelijken met de exosoomsignatuur van een passende controle cellijn.

Hierbij kan bijvoorbeeld voor de MDA en MCF7 cellijnen gebruik gemaakt worden van

humane borst epitheliale cellen (HMEC). Op deze wijze kan nagegaan worden welke

exosomale eiwitten specifiek voorkomen in de exosomen afkomstig van de maligne cel en

afwezig zijn in de exosomen van de normale cel en zo mogelijks aangewend kunnen worden

als biomerker.

Validatie van de exosoomisolatie aan de hand van Western blotting van gekende exosomale

eiwitten (CD63, CD81) met het Odyssey systeem gaf slechts weinig resultaat. Enkel voor één

cellijn (MCF7) werd verrijking aangetoond van CD63 na exosoomisolatie met de Exoquick-

TC kit. Het materiaal bekomen na differentiële centrifugatie was te beperkt om aanwezigheid

van CD63 aan te tonen. Hiervoor werd geopteerd om een meer gevoelige techniek te gebrui-

ken; de ECL methode. Hierbij werd een zwak signaal voor CD63 aangetoond voor enkele cel-

lijnen (MDA, MCF7) na exosoomisolatie door differentiële centrifugatie, maar was geen

signaal waarneembaar voor de Exoquick-TC stalen. Ook was een signaal voor CD81 afwezig

in alle stalen. De MS resultaten ondersteunen deels deze uitkomst; enkel CD63 wordt geïden-

tificeerd in de MCF7 cellijn na isolatie door differentiële centrifugatie. De exosomale merker

CD81 werd in geen van de exosoomstalen geïdentificeerd. Deze bevindingen worden ge-

steund door twee andere papers, die ook geen CD63 of CD81 identificeerden via MS (13, 18).

Dit kan dus twijfels oproepen bij de benoeming van deze eiwitten als algemene exosomale

merkers.

47

ALGEMEEN BESLUIT

Exosomen van de vier geselecteerde kankercellijnen (MDA, MCF7, HeLa en HepG2 cellijn)

werden succesvol geïsoleerd. Hieruit bleek dat het aangewezen is om gebruik te maken van

differentiële centrifugatie voor exosoomisolatie uit celcultuurmedia. Deze methode leidde tot

een betere reproduceerbaarheid, opbrengst en zuiverheid in vergelijking met de Exoquick-TC

kit. Er is echter nog sprake van contaminatie met serumeiwitten, ondanks de aangewende

maatregelen, wat de identificatie van exosomale eiwitten bemoeilijkt. Ook wordt, indien

mogelijk, beter gebruik gemaakt van detergent removal kolommen, in tegenstelling tot in gel

trypsinisatie, als staalvoorbereiding voor massaspectrometrie.

Exosoomstalen werden vergeleken met hun totale cellysaten en cellulaire secretomen op basis

van de resultaten bekomen door massaspectrometrische technieken, zodat exosomale eiwitten

geïdentificeerd werden. Hierbij kan een onderscheid gemaakt worden tussen

gemeenschappelijke, geconserveerde exosomale eiwitten en unieke exosomale eiwitten. Deze

eiwitten vervullen een functie binnen de exosoombiogenese en transport of een specifieke

functie van hun afgeleide cel. Op basis van deze geïdentificeerde exosomale eiwitten kon

voor elke cellijn een exosoomsignatuur opgesteld worden.

Aan de hand van deze verschillende exosoomsignaturen werd duidelijk dat de eiwitinhoud

van exosomen afkomstig van cellen met eenzelfde biologische herkomst niet noodzakelijk

gelijk is. Cellen met eenzelfde herkomst maar met een verschillende graad van agressie

(MDA en MCF7) vertoonden zo slechts geringe gelijkenissen met elkaar.

Samenvattend kunnen we stellen dat het mogelijk is om exosomen succesvol te isoleren uit

celcultuurmedia van verschillende cellijnen en hun eiwitinhoud te achterhalen met

massaspectrometrische technieken. Indien een vergelijking wordt gemaakt van de bekomen

data met exosomale eiwitten afkomstig van de corresponderende normale cellen, zou dit

kunnen leiden tot identificatie van nieuwe diagnostische biomerkers.

48

REFERENTIELIJST

1. World Health Organisation. (2007). The World Health's Organisation fight against cancer:

Strategies that prevent, cure and care. www.who.int.

2. Hanahan D, Weinberg RA. (2000). The hallmarks of cancer. Cell. 100(1):57-70.

3. Sandvig K, Llorente A. (2012). Proteomic analysis of microvesicles released by the human

prostate cancer cell line PC-3. Molecular & cellular proteomics. 11(7):M111 012914.

4. Velonas VM, Woo HH, Remedios CG, Assinder SJ. (2013). Current status of biomarkers

for prostate cancer. International journal of molecular sciences. 14(6):11034-11060.

5. Welton JL, Khanna S, Giles PJ, Brennan P, Brewis IA, Staffurth J, et al. (2010).

Proteomics analysis of bladder cancer exosomes. Molecular & cellular proteomics.

9(6):1324-1338.

6. Chen CL, Lai YF, Tang P, Chien KY, Yu JS, Tsai CH, et al. (2012). Comparative and

targeted proteomic analyses of urinary microparticles from bladder cancer and hernia patients.

Journal of proteome research. 11(12):5611-5629.

7. Rappa G, Mercapide J, Anzanello F, Pope RM, Lorico A. (2013). Biochemical and

biological characterization of exosomes containing prominin-1/CD133. Molecular cancer.

12:62.

8. Xiao D, Ohlendorf J, Chen Y, Taylor DD, Rai SN, Waigel S, et al. (2012). Identifying

mRNA, microRNA and protein profiles of melanoma exosomes. PloS one. 7(10):e46874.

9. Mathivanan S, Lim JW, Tauro BJ, Ji H, Moritz RL, Simpson RJ. (2010). Proteomics

analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell

line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature. Molecular & cellular proteomics.

9(2):197-208.

10. Garnier D, Jabado N, Rak J. (2013). Extracellular vesicles as prospective carriers of

oncogenic protein signatures in adult and paediatric brain tumours. Proteomics. 13(10-

11):1595-1607.

11. Palmisano G, Jensen SS, Le Bihan MC, Laine J, McGuire JN, Pociot F, et al. (2012).

Characterization of membrane-shed microvesicles from cytokine-stimulated beta-cells using

proteomics strategies. Molecular & cellular proteomics. 11(8):230-243.

12. Yang C, Robbins PD. (2011). The roles of tumor-derived exosomes in cancer

pathogenesis. Clinical & developmental immunology. 2011:842849.

13. Hosseini-Beheshti E, Pham S, Adomat H, Li N, Guns EST. (2012). Exosomes as

Biomarker Enriched Microvesicles: Characterization of Exosomal Proteins Derived from a

Panel of Prostate Cell Lines with Distinct AR Phenotypes. Molecular & cellular proteomics.

11(10):863-885.

14. Henderson MC, Azorsa DO. (2012). The genomic and proteomic content of cancer cell-

derived exosomes. Frontiers in oncology. 2:38.

15. Lasser C, Eldh M, Lotvall J. (2012). Isolation and characterization of RNA-containing

exosomes. Journal of visualized experiments. 2012(59):e3037.

16. Choi DS, Kim DK, Kim YK, Gho YS. (2013). Proteomics, transcriptomics and lipidomics

of exosomes and ectosomes. Proteomics. 13:1554-1571.

17. Skog J, Wurdinger T, van Rijn S, Meijer DH, Gainche L, Sena-Esteves M, et al. (2008).

Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and

provide diagnostic biomarkers. Nature cell biology. 10(12):1470-1476.

18. Simona F, Laura S, Simona T, Riccardo A. (2013). Contribution of proteomics to

understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and

new perspectives. Proteomics. 13:1581-1594.

19. Koga K, Matsumoto K, Akiyoshi T, Kubo M, Yamanaka N, Tasaki A, et al. (2005).

Purification, characterization and biological significance of tumor-derived exosomes.

49

Anticancer research. 25(6A):3703-3707.

20. Théry C, Amigorena S, Raposo G, Clayton A. (2006). Isolation and characterization of

exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current protocols in cell

biology. Chapter 3(Unit 3.22):1-29.

21. Mathivanan S, Fahner CJ, Reid GE, Simpson RJ. (2012). ExoCarta 2012: database of

exosomal proteins, RNA and lipids. Nucleic acids research. 40:D1241-1244.

22. Zhuang X, Xiang X, Grizzle W, Sun D, Zhang S, Axtell RC, et al. (2011). Treatment of

brain inflammatory diseases by delivering exosome encapsulated anti-inflammatory drugs

from the nasal region to the brain. Molecular therapy : the journal of the American Society of

Gene Therapy. 19(10):1769-1779.

23. Bereman MS, Egertson JD, MacCoss MJ. (2011). Comparison between procedures using

SDS for shotgun proteomic analyses of complex samples. Proteomics. 11(14):2931-2935.

24. Helsens K, Colaert N, Barsnes H, Muth T, Flikka K, Staes A, et al. (2010). ms_lims, a

simple yet powerful open source laboratory information management system for MS-driven

proteomics. Proteomics. 10(6):1261-1264.

25. Chiasserini D, van Weering JR, Piersma SR, Pham TV, Malekzadeh A, Teunissen CE, et

al. (2014). Proteomic analysis of cerebrospinal fluid extracellular vesicles: A comprehensive

dataset. Journal of proteomics. http://dx.doi.org/10.1016/j.jprot.2014.04.028

26. Taylor DD, Zacharias W, Gercel-Taylor C. (2011). Exosome isolation for proteomic

analyses and RNA profiling. Methods in molecular biology. 728:235-246.

27. Khan S, Bennit HF, Turay D, Perez M, Mirshahidi S, Yuan Y, et al. (2014). Early

diagnostic value of survivin and its alternative splice variants in breast cancer. BMC cancer.

14:176.

28. Yamada T, Inoshima Y, Matsuda T, Ishiguro N. (2012). Comparison of methods for

isolating exosomes from bovine milk. The Journal of veterinary medical science/the Japanese

Society of Veterinary Science. 74(11):1523-1525.

BIJLAGE

Tabel 1. Exosomale eiwitten geïdentificeerd na exosoomisolatie via Exoquick TC.

Tabel 2. Exosomale eiwitten geïdentificeerd na exosoomisolatie via differentiële centrifugatie

in combinatie met detergent removal kolommen.

Tabel 3. Exosomale eiwitten geïdentificeerd na exosoomisolatie via differentiële centrifugatie

in combinatie met in gel trypsinisatie.

Tabel 4. Exosoomsignatuur van de MDA cellijn.

Tabel 5. Exosoomsignatuur van de MCF7 cellijn.

Tabel 6. Exosoomsignatuur van de HeLa cellijn.

Tabel 7. Exosoomsignatuur van de HepG2 cellijn.

Tabel 8. Exosoomeiwitten gemeenschappelijk met de databank Exocarta.

Figuur 1. Distributiecurves van de exosoomstalen na SILAC labeling.

Figuur 2. Distributiecurves van de secretoomstalen na SILAC labeling.

Figuur 3. Validatie exosoomisolatie via differentiële centrifugatie – ECL systeem.

Figuur 4. Validatie exosoomisolatie via Exoquick TC – ECL systeem.

Tabel 1. Exosomale eiwitten geïdentificeerd na exosoomisolatie via Exoquick TC.

Aanwezig in 2 van de 3 cellijnen

P04114 Apolipoproteine B100 MDA en HepG2

Q00610 Clathrine heavy chain 1 MCF7 en HepG2

P01024 Complement 3 MDA en HepG2

P02751 Fibronectine MDA en HepG2

P07996 Thrombospondine-1 MDA en HepG2

P07437 Tubuline beta keten MCF7 en HepG2

P04004 Vitronectine MDA en HepG2

Tabel 2. Exosomale eiwitten geïdentificeerd na exosoomisolatie via differentiële

centrifugatie in combinatie met detergent removal kolommen.


Q07020 60S ribosomaal eiwit L18 niet in HepG2

P18124 60S ribosomaal eiwit L7 niet in HepG2

P62424 60S ribosomaal eiwit L7a niet in MDA

P09525 Annexine A4 niet in MDA

P16070 CD 44 antigen niet in HepG2

P10909 Clusterine niet in MDA

O43854 EGF like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3 niet in HepG2

P02751 Fibronectine niet in MCF7

Q03113 Guanine nucleotide binding protein alfa 2 niet in HepG2

P62805 Histon H4 niet in HepG2

P05556 Integrine beta 1 niet in HepG2

O15427 Monocarboxylaat transporter 4 niet in MCF7

A5A3E0 POTE ankyrine domein familielid F niet in HepG2

P59190 Ras related protein Rab-15 niet in HepG2

P51148 Ras related protein Rab-5c niet in HepG2

Q8NFJ5 Retinoic acid induced protein 3 niet in HepG2

P05026 Sodium/potassium-transporting ATPase subunit 1 niet in HepG2

Aanwezig in 2 van de 4 cellijnen P62847 40S ribosomaal eiwit S24 MCF7 en HeLa

P62851 40S ribosomaal eiwit S25 HeLa en HepG2

P61247 40S ribosomaal eiwit S3a MCF7 en HeLa

P23396 40S ribosomaal S3 MCF7 en HeLa

P30050 60 S ribosomaal L12 Hela en MCF7

P60709 Actine cytoplasmatisch 1 Hela en MCF7

P50995 Annexine A11 HeLa en MCF7

P07355 Annexine A2 MCF7 en HeLa

P12429 Annexine A3 Hela en MCF7

P08758 Annexine A5 HeLa en HepG2

P48960 CD 97 antigen HeLa en MDA

Tabel 1: Eiwitten die voorkomen in de exosoomstalen van 2 van de 4 cellijnen na isolatie door

Exoquick TC. De eiwitten zijn steeds duidelijk meer aanwezig in de exosoomstalen dan in de totale

cellysaten voor de HepG2 cellijn, dit in tegenstelling voor de MCF7 en MDA cellijn. In de tabel

wordt links het accessienummer weergegeven, in het midden de eiwitnaam en rechts in welke

cellijnen deze eiwitten voorkomen.

P27105 Erythrocyte band 7 integraal membraan proteïne Hela en MCF7

O95757 Heat shock protein 70 kDa, 4L MCF7 en HeLa

P10412 Histon 1,4 MCF7 en MDA

P01891 HLA class I histocompatibility antigen, A-2 alpha chain HeLa en MDA

P01889 HLA class I histocompatibility antigen, B-7 alpha chain HeLa en MDA

P49006 MARCKS related protein MCF7 en MDA

P0CG47 Polyubiquitine B HeLa en HepG2

P31949 Protein S100-A11 HeLa en MDA

Q15286 Rab related protein Rab-35 MCF7 en HeLa

P02786 Transferrine receptor protein 1 HepG2 en HeLa

P04004 Vitronectine HepG2 en HeLa

Tabel 3. Exosomale eiwitten geïdentificeerd na exosoomisolatie via differentiële

centrifugatie in combinatie met in gel trypsinisatie.


P81605 Dermcidine niet in HepG2


P02751 Fibronectine HepG2 en HeLa

P04908 Histon H2A type 1-B/E HeLa en MDA

P14923 Junction plakoglobine HeLa en MDA

P61626 Lysozyme C HepG2 en MDA

P0CG47 Polyubiquitine B HepG2 en MDA

Tabel 2: Eiwitten die voorkomen in de exosoomstalen van 2 of 3 van de 4 cellijnen na isolatie door

differentiële centrifugatie in combinatie met detergent removal kolommen. De eiwitten zijn steeds

duidelijk meer aanwezig in de exosoomstalen dan in de totale cellysaten. In de tabel wordt links het

accessienummer weergegeven, in het midden de eiwitnaam en rechts in welke cellijn deze eiwitten

voorkomen.

Tabel 3: Eiwitten die voorkomen in de exosoomstalen van 2 of 3 van de 4 cellijnen na isolatie door

differentiële centrifugatie in combinatie met in gel trypsinisatie. De eiwitten zijn steeds duidelijk

meer aanwezig in de exosoomstalen dan in de totale cellysaten. In de tabel wordt links het

accessienummer weergegeven, in het midden de eiwitnaam en rechts in welke cellijnen deze eiwitten

voorkomen.

Tabel 4. Exosoomsignatuur van de MDA cellijn.




Q07020 60S ribosomaal eiwit L18

P18124 60S ribosomaal eiwit L7

P16070 CD 44 antigen


P81605 Dermcidine

O43854 EGF like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3

P02751 Fibronectine


Q03113 Guanine nucleotide binding protein alfa 2

P11142 Heat shock cognate 71 kDa

P10412 Histon 1,4



P62805 Histon H4



P01889 HLA class I histocompatibility antigen, B-7 alpha chain

Q86YZ3 Hornerine

P26006 Integrine alfa-3

P05556 Integrine beta 1

P14923 Junction plakoglobine

Q08431 Lactadherine


P61626 Lysozyme C

P49006 MARCKS related protein

O15427 Monocarboxylaat transporter 4


P0CG47 Polyubiquitine B

A5A3E0 POTE ankyrine domein familielid F

P31949 Protein S100-A11

Q04941 Proteolipide protein 2

P59190 Ras related protein Rab-15

P51148 Ras related protein Rab-5c

Q8NFJ5 Retinoic acid induced protein 3

P02768 Serum albumine

P05026 Sodium/potassium-transporting ATPase subunit 1

P11166 Solute carrier family 2

Tabel 4: Exosomale eiwitten van de MDA cellijn met links het accessienummer en rechts de

eiwitnaam.

Tabel 5. Exosoomsignatuur van de MCF7 cellijn.



P62847 40S ribosomaal eiwit S24

P61247 40S ribosomaal eiwit S3a

P62244 40S ribosomaal S15a

P23396 40S ribosomaal S3


P30050 60 S ribosomaal L12



P62424 60S ribosomaal eiwit L7a

P60709 Actine cytoplasmatisch 1

P50995 Annexine A11

P07355 Annexine A2

P12429 Annexine A3

P09525 Annexine A4

P02647 Apolipoproteine A1

P35221 Catenine alfa-1


P08962 CD63 antigen

P10909 Clusterine


P27105 Erythrocyte band 7 integraal membraan proteïne



O95757 Heat shock protein 70 kDa, 4L

P10412 Histon 1,4



P62805 Histon H4



P49006 MARCKS related protein


P19338 Nucleoline


Q15286 Rab related protein Rab-35

Q13283 Ras GTPase activating like protein




Q99985 Semaphorine-3C




Tabel 5: Exosomale eiwitten van de MCF7 cellijn met links het accessienummer en rechts de

eiwitnaam.

Tabel 6. Exosoomsignatuur van de HeLa cellijn.





P61247 40S ribosomaal eiwit S3a

P23396 40S ribosomaal S3


P30050 60 S ribosomaal L12




P60709 Actine cytoplasmatisch 1

P05186 Alkaline fosfatase

P50995 Annexine A11

P07355 Annexine A2

P12429 Annexine A3

P09525 Annexine A4

P08758 Annexine A5

P08133 Annexine A6

P35613 Basigine

Q6YHK3 CD 109 antigen




P10909 Clusterine


P27105 Erythrocyte band 7 integraal membraan proteïne

P02751 Fibronectine

Q5D862 Filaggrine-2

O75955 Flotilline-1



O95757 Heat shock protein 70 kDa, 4L


P16104 Histon H2AX

P06899 Histon H2B type 1-J


P62805 Histon H4




P14923 Junction plakoglobine




O00592 Podocalyxine



P31949 Protein S100-A11

Q15286 Rab related protein Rab-35



P62820 Ras-related protein Rab-1A

P51149 Ras-related protein Rab-7a

P11233 Ras-related protein Ral-A





P02786 Transferrine receptor protein 1

P04350 Tubuline beta 4A keten

P04004 Vitronectine

Tabel 6: Exosomale eiwitten van de HeLa cellijn met links het accessienummer en rechts de

eiwitnaam.

Tabel 7. Exosoomsignatuur van de HepG2 cellijn.






P01023 Alfa-2-macroglobuline

P09525 Annexine A4

P08758 Annexine A5

P02647 Apolipoproteïne A1

P04114 Apolipoproteïne B100

P02649 Apolipoproteïne E

P10909 Clusterine

P01024 Complement 3

P49327 Fatty acid synthase

P02671 Fibrinogeen alfa keten

P02675 Fibrinogeen beta keten

P02679 Fibrinogeen gamma keten

P02751 Fibronectine

Q08380 Galectine-3 bindend eiwit


P51654 Glypican-3




P61626 Lysozyme C


Q15758 Neutral amino acid transporter B

P19338 Nucleoline



P78509 Reeline



P07996 Thrombospondine-1

P02786 Transferrine receptor proteïne 1

P07437 Tubuline beta keten

P04004 Vitronectine

Tabel 7: Exosomale eiwitten van de HepG2 cellijn met links het accessienummer en rechts de

eiwitnaam.

Tabel 8. Exosoomeiwitten gemeenschappelijk met de databank Exocarta.

P61247 40S ribosomal protein S3a


P62424 60S ribosomal protein L7a

P08133 Annexin A6

P02649 Apolipoprotein E

Q6YHK3 CD109 antigen

P16070 CD44 antigen

P48960 CD97 antigen

P14209 CD99 antigen

O43854 EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3

P27105 Erythrocyte band 7 integral membrane protein

P49327 Fatty acid synthase

P02671 Fibrinogen alpha chain

P02675 Fibrinogen beta chain

P02679 Fibrinogen gamma chain

P02751 Fibronectin

P23142 Fibulin-1

Q5D862 Filaggrin-2

O75955 Flotillin-1

Q08380 Galectin-3-binding protein

P07305 Histone H1.0

P04908 Histone H2A type 1-B/E

P16104 Histone H2AX

P06899 Histone H2B type 1-J

O60814 Histone H2B type 1-K

P62805 Histone H4




P17301 Integrin alpha-2

P14923 Junction plakoglobin

Q08431 Lactadherin

Q01650 Large neutral amino acids transporter small subunit 1

P61626 Lysozyme C

P49006 MARCKS-related protein


P19338 Nucleolin

Q15063 Periostin

O00592 Podocalyxin

O75340 Programmed cell death protein 6

Q15286 Ras-related protein Rab-35

P51148 Ras-related protein Rab-5C

P51149 Ras-related protein Rab-7a

P11233 Ras-related protein Ral-A

Q8NFJ5 Retinoic acid-induced protein 3

P11166 Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 1

P07437 Tubulin beta chain

Tabel 8: Exosomale eiwitten gemeenschappelijk met de databank Exocarta met links het

accessienummer en rechts de eiwitnaam.

Figuur 1: Distributie van de eiwitten in de exosoomstalen na SILAC labeling.

De distributiecurves van de eiwitten van de exosoomstalen, na SILAC labeling, worden getoond

voor de berekende limieten (rood) en de zelf opgestelde limieten (blauw).

Figuur 2: Distributie van de eiwitten in de secretoomstalen na SILAC labeling.

De distributiecurves van de eiwitten van de secretoomstalen, na SILAC labeling, worden getoond

voor de berekende limieten (rood) en de zelf opgestelde limieten (blauw). De grafieken boven en

onder behoren toe aan twee verschillende herhalingen van hetzelfde experiment.

Figuur 3: Validatie exosoomisolatie via differentiële centrifugatie – ECL systeem.

Western blot met CD63 en CD81 als primair antilichaam met 1) exosomen - MDA cellen, 2) exosomen –

MCF7 cellen, 3) exosomen – HeLa cellen, 4) exosomen – HepG2 cellen, 5) cellysaat – MDA cellen, 6)

cellysaat – MCF7 cellen, 7) cellysaat – HeLa cellen, 8) cellysaat – HepG2 cellen.

Figuur 4: Validatie exosoomisolatie via Exoquick TC – ECL systeem.

Western blot met CD63 als primair antilichaam 1) exosomen - MDA cellen, 2) exosomen – MCF7 cellen,

3) exosomen – HepG2 cellen, 4) cellysaat – MDA cellen, 5) cellysaat – MCF7 cellen, 6) cellysaat –

HepG2 cellen.

het opstellen van een microvesikelsignatuur van humane...

Documents