LézercsipeszOptika szeminárium

Butykai Ádám, Orbán Ágnes2012. április 5.

A működés alapjai

Sugároptika

Maxwell-egyenetek

Gyakorlati megvalósítás

Alkalmazási területek

Legmodernebb berendezések alapelvei

Lézeres rácsok

Felületi plazmonok

Kitekintés

Tartalom

Optikai csipesz (lézercsipesz) 1970 Arthur Ashkin1 : 10-10.000 nm (baktériumok, vírusok) csapdázása

1986 Steven Chu2 : atomok magneto-optikai csapdázása és hűtése, Nobel-

díj

pN nagyságrendű erők alkalmazása és mérése

Elmozdulás mérése nm pontossággal

Legújabb technológiák: optikai alapú sejtszétválasztás, plazmon

erősítés, stb.

Bevezető

Optikai csapda: nagy NA lencsével lézernyaláb

erősen lefókuszálva

Dielektromos részecskére a fókusz közelében erő

hat a beeső fotonok impulzusátadása révén

n>nm eset, szórás és visszaverődés

Csapdázás feltétele: max Frefraction>Freflection

Az optikai csapdázás elméleti alapjai: sugároptika (a>>λ)

Rayleigh- szórás pontszerű dipólusra (a<<λ)

A mérőberendezés felépítése

• Mikroszkóp• Pozíció detektor• CCD kamera• Dikroikus tükrök• Lézerfényt visszaverik, a megvilágítást

áteresztik• Piezoelektromos mozgató• Mintatartó mozgatása a fix csapdához

képest

• Csapdázó lézer• Nyalábtágító• A Gauss-nyaláb dereka kitölti a mikroszkóp objektívet

• Irányító optika• Fókusz helye és rugalmassága• Pozíció- és erőmérés• Manuális fókuszálás

Csapdázó lézer

• Általában Gauss TEM00 módus

• Jó pontstabilitás, kis teljesítményingadozás

• Teljesítmény: kb. ~1pN/10mW csapdázásnál (mikronos beadekre)

• Hullámhossz

• Minta átlátszósága (pl. biológiai minták NIR)

• Abszorpció -> melegedés -> minta roncsolódása

Objektív• NA és a transzmisszió számít

• Immerziós olajba merítik általában ->kicsi munkatávolság (~0.1mm)

• Szférikus aberrációk arányosak a törésmutató eltéréssel az olaj és a

vizes csapdázó közeg között

• Nagy NA -> nagy intenzitásgradiens, de kisebb munkatávolság

• Kettős objektív elrendezés: 1:1 teleszkóp T2 transzmisszió

Pozíció detektálás• Pozíció- és erőmérés kalibrációja gömb alakú mintával• Többféle eljárás• Videó alapú detektálás• Kvadráns fotodióda

• Lézeres detektálás

• Egy vagy két lézerrel

• Polarizációs mérés, QPD detektoros mérés

• Axiális pozíció detektálása

• Mintán szórt lézerfény detektálása egy túltöltött fotodiódával• Előreszórt és nem szóródó fotonok interferenciájával –

intenzitásmérés a kondenzorlencse hátsó fókuszsíkján

Dinamikus pozícióváltoztatás I.• Dinamikus fókuszváltoztatás• Brown mozgás relaxációjánál gyorsabb

vezérlés kell• Pásztázó tükrök• 1-2kHz, 100µs válaszidő• Nagy szögeltérítés lehetséges

• Akkusztooptikai eltérítők• TeO2 kristály• Akkusztikus „optikai rács”• Gyors válasz (foltméret/hangsebesség)• 1D eltérítés, 2 AOD: 2D• Intenzitásvesztés

• Elektrooptikai eltérítők• Feszültség -> törésmutató változás• Drága

Dinamikus pozícióváltoztatás II.

• Holografikus optikai csapda

• Több csapda egyidejű létrehozása

• Piezzoelektromos mozgató

• Mintatér mozgatása

• Gyors 3D pozícionálás

• Erő-visszacsatoló kör: konstans erő →pozícionálás

Videó detektálás• CCD kamerával ismert méretű minta vizsgálata

• Pixelméret kalibrálása távolságra

• ~5nm pontosság

• Valós idejű képfeldolgozás

• Mintavételezés ~15-120 Hz

• CMOS kamera nagy frekvencián is működik (40kHz), de a

számítógép sebessége korlátozó tényező

• Nem megfelelő eljárás a fókuszhoz képesti relatív pozíció

(erőmérés) meghatározására

Kvadráns fotodióda• A csapdázott objektumot egy kvadráns fotodiódára képezik

• Az egyes szegmensek közti különbségi jelet mérve (teljes

intenzitással normálva) a pozíció meghatározható

• Kis látótér, a csapda jó leképezése szükséges

• Nagy nagyítást igényel

Pozíció kalibráció I.

• Piezzo mozgatóval, rögzített beaddel• Előny: teljes 3D kalibráció• Hátrány:• Felesleges és hosszadalmas, ha csak 1

laterális irányban alkalmazunk erőt.• Nem lehet teljes rögzítést megvalósítani:

sokaságátlag kell• Ha csak laterális elmozdulás kell, akkor is

érdemes axiális irányban is kalibrálni, mert a fókusz pontossága <~100nm

• Bead kalibrált mozgatása -> detektor jelének kalibrálása

• Fókusz kalibráció: CCD kamerával felvett csapdázott beaddel

• Képalkotó pozíció detektorral, vagy 2 lézerrel mérünk pozíciót

• Előny: Tetszőleges alakú objektumra kalibrálható és a kalibráció és a pozíciódetektálás egyazon pontban érvényes (fókusz)

• Detektáló lézer előnye: külön fókuszálható a csapda helyére (fókusz mögött) -érzékenyebb a pozícióváltozásra, mint a csapdázó lézer fókusza

Pozíció kalibráció II.

• Hátrány: csak laterális irányú kalibráció (axiális merevség kisebb)

• Csapdázott beaddel, a fókusz kalibrált változtatásával

Axiális pozíciómérés és fókuszsík eltolódás• Biológiai alkalmazásoknál fontos: egyik molekula a felszínhez tapadva, a másik a fókuszban -> távolság• Fókusz axiális eltolódása a határfelületen való törés miatt : Snellius-Descartes és a kísérlet sem jó nagy NA lencséknél.

• Régen: fluoreszcencia méréssel (evaneszcens hullámmal indukált), vagy hidrodinamikai súrlódásméréssel (fal-effektus)

• Pozíciódetektor teljes összegjele (PSD, vagy QPD) arányos a teljes átjutó intenzitással

• Amikor a bead áthalad a fókuszon: 180°-os fázistolás

• A maximumok között elméleti illesztés

• A maximum jó kalibrációs pont. Innen elmozdítva a piezo mintatartót, az abszolút távolság kalibrálható.

• Fókuszsík eltolódás mérése: • Hidrosztatikus közegellenállás • Interferencia mérés

Erő kalibráció, merevség meghatározás

Erő kalibráció direkt fényintenzitás méréssel

Alkalmazások: Transzkripció vizsgálata • RNS polimeráz a DNS láncon halad végig

• Transzkripció: DNS szekvencia másolása, messenger RNS (mRNS) szintetizálása

• A DNS egyik vége a felszínhez kötve, az enzim a beadhez

• Polarizációs interferometrikus pozíciódetektálás

• A beadet a csapda fix pontján tartják → az erővektor a mérés során konst. → DNS lánc feszítése

• A transzkripció sebessége 25pN erőig független a feszítettségtől

• RNS polimeráz erős molekuláris motor

• A piezo mozgatásával → a transzkripció időbeli lefutása

• ~1 sec-os szünetek és állandó sebességű periódusok

• DNS replikációnál a bázispárok olvasása → kettős spirál felbontása (dsDNS → ssDNS = helix-coil átmenet)• Motiváció:• DNS-fehérje kölcsönhatás vizsgálata

• Sok fehérje a DNS-hez kötődik és megváltoztatja annak stabilitását

• Helix-coil átmenet energiája változik (mérhető)

• DNS-hez kötődő gyógyszerek nyomon követése, gyógyszerfejlesztés• Pl. rák elleni gyógyszerek• Különböző gyógyszerek

megkülönböztethetők az átmenet mérésével.

Egymolekulás nyújtás nukleinsavakon

Nyújtási kísérlet:• dsDNS nehezen nyújtható• Túlnyújtás:

• DNS egyik vége szabadon foroghat

• átalakulás kb. konstans erő mellett

• „Erő-indukált olvadás” –modell (egyensúlyi fázisátalakulás)

• Nagyobb erőknél nemegyensúlyi, irreverzibilis átalakulás (függ az erő teljesítményétől is)

• Bezárt terület: fázisátalakulás szabadenergiájának mérése (ΔG(T))

• Átalakulás közben konstans erő• Az oldószer tulajdonságai erősen befolyásolják az átalakuláshoz

tartozó erő nagyságát• Hőmérséklet• pH

• Extrém pH értékeknél lecsökken az olvadáspont• Bázispárok olvadáspontja

• Poly(dG*dC)Poly(dG*dC) 30pN-al magasabb átalakulási erő, mint a Poly(dA*dT)Poly(dA*dT)

• Összhangban az olvadáspontokkal

Bizonyítékok az olvadás-modellre

RNS hajtű kibontása

• Bázispárokkal párhuzamos irányú húzóerő (ellentétben a túlnyújtásos kísérlettel)

• Kb. 15 pN erő szükséges• Az átalakuláshoz szükséges szabadenergia

azonos• Meghatározható a nyújtáshoz szükséges

hossz mindkét esetben• Túlnyújtás: x=0,24nm• Kibontás: x=0,82nm

• Erők arányának becslése:

• F=20pN• Jó egyezés a kísérlettel• Lassú húzásnál a kibomláskor és a

relaxáláskor mért erő azonos volt -> reverzibilitás

Források• 1 Ashkin, A. (1970). "Acceleration and Trapping of Particles by Radiation Pressure". Phys. Rev. Lett. 24 (4): 156–159.