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ESTUDIO TEÓRICO DEL VIRUS DEL SÍNDROME RESPIRATORIOAGUDO SEVERO (SARS) A TRAVÉS DEL USO DE MÉTODOS

DE ACOPLAMIENTO MOLECULAR

THEORETICAL STUDIES OF THE VIRUS SEVERE ACUTE RESPIRATORYSYNDROME (SARS) THROUGHT OF THE USE OF METHODS

OF MOLECULAR DOCKING

ESTUDO TEÓRICO DO VÍRUS DA SÍNDROME RESPIRATÓRIAAGUDA SEVERA (SARS) A TRAVES DO USO DE MÉTODOS

DE ACOPLAMENTO MOLECULAR

Ricardo Vivas-Reyes1, José Luis Ruiz, Roger Caraballo

Recibido: 14/07/09 – Aceptado: 26/11/09

En este estudio se ha evaluado por mediode la metodología de acoplamiento mole-cular una serie de 5 ligandos borados, queson variantes de la molécula FL-078.Estas moléculas tienen actividad inhibito-ria frente a la proteasa Mpro responsablede la replicación del SARS-CoV.

Haciendo uso del programa SYBYL7.0se optimizó el homodímero de la Mpro (có-digo 1Q2W), y a través del softwareFlexX se hizo el acople molecular con elfin de escoger el confórmero más establede los ligandos aril borados frente a lamacromolécula Mpro, encontrándose quela estructura FL-166 fue la de mejor con-formación.

Los 5 ligandos aril borados tienen lapropiedad de interaccionar con el grupohidroxilo (OH) presente en los residuostales como serinas, treoninas y tirosinas.Los resultados acople molecular mues-tran que el mejor acercamiento sobre lacavidad se da sobre el conjunto de treoni-nas 21, 24, 25 y 26, y no como se afirmaen la literatura: que se da sobre el conjun-to de serinas 139, 144 y 147.

: síndrome respiratorioagudo severo, acoplamiento molecular,FlexX, inhibición.

In this study a set of 5 aryl boronic ligandswhich are variations of the FL-078 mole-

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REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA, VOLUMEN 38, No. 3 DE 2009

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1 Programa de Química, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Cartagena. Campus de Zaragocilla,Cartagena, Colombia. [email protected]

cule were assessed. These moleculeshave inhibitory activity against of the Mpro

protease involved in the SARS-CoV re-plication.

A homodimer of the Mpro (ID 1Q2W)was optimized using the SYBYL7.0 pac-kage and through the FlexX software wascalculated the molecular docking with theaim of choose the most stable ligand frontto Mpro macromolecule. Was foundamong the five boronic ligands that thebest pose corresponded to the FL-166structure.

These molecules show interactionwith the hydroxil group beared by ami-noacid residues such as serines, threoni-nes and tyrosines. The docking calcula-tion results presented here show that thebest approaching over the cavity occur onthe threonines set 21, 24, 25 and 26 ins-tead of the set pointed out by other aut-hors Serines 139, 144 and 147.

: Severe acute respiratorysyndrome, docking molecular, FlexX ,inhibition.

Neste estudo avaliou-se através da meto-dologia do acoplamento molecular umaserie de 5 ligandos contendo boro, quesão variantes da molécula FL-078, estasmoléculas têm atividade inibitória à pro-tease Mpro responsável da replicação doSARS-CoV.

Usando o programa SYBYL7.0 se oti-mizou o homodímero da Mpro (código1Q2W), e através do software FlexX serealizou o acoplamento molecular com afinalidade de escolher o confórmero maisestável dos ligandos aril borados frente à

macromolécula Mpro. Encontrando-seque a estrutura FL-166 foi a de melhorconformação.

Os 5 ligandos aril borados têm a pro-priedade de interagir com o grupo hidro-xila (OH) presente nos resíduos tais comoserinas, treoninas e tirosinas. Os resulta-dos de acoplamento molecular mostraramque a melhor aproximação sobre a cavi-dade ocorre sobre o conjunto de treoninas21, 24, 25 y 26 e não como se afirma na li-teratura que se da sobre o conjunto de se-rinas 139, 144 y 147.

: Síndrome respirató-ria aguda severa, acoplamento molecu-lar, FlexX, inibição.

En los primeros años del presente siglo,la aparición del virus del Síndrome Respi-ratorio Agudo Severo (SARS) (1), y surápida expansión, puso a muchos científi-cos y autoridades de salud a nivel mundiala pensar en cómo desarrollar potentes fár-macos que fuesen eficaces en la inhibi-ción del virus y, por tanto, en su replica-ción (2). En general esta clase de estudiosdebe partir del conocimiento bioquímico,morfológico y de los mecanismos del fun-cionamiento del virus.

La principal proteinasa del coranovi-rus del SARS es la 3CLpro o Mpro (3), quedesempeña un papel importante en la re-plicación del virus y está formada por dossubunidades que tienen un sitio activo enel cual se encuentra la díada catalíticaformada por la histidina-41 y cisteína-145(4-7). Debido a que la Mpro es fundamen-tal en la replicación del virus, se conside-ra como un blanco relevante para el dise-

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ño de drogas y de posibles inhibidores encontra del virus del SARS.

El diseño de posibles inhibidores parala Mpro del SARS-CoV es posible hoy endía gracias al uso de herramientas bioin-formáticas. Entre las herramientas bioin-formáticas más usadas para el diseño mo-lecular está la técnica del acoplamientomolecular (8, 9). Esta técnica permite lageneración de múltiples confórmerospara cada ligando, que son probados condiferentes ligandos sobre diferentes sitiosde una proteína dada (10). Dependiendodel software utilizado, diferentes búsque-das conformacionales se pueden dar de-pendiendo del método utilizado (11-17).Independientemente del método aplicado,el proceso de encontrar confórmeros ópti-mos debe ser guiado por la función deevaluación, la cual se usa para evaluar lasdiferentes interacciones fisicoquímicasentre la molécula del ligando y la proteí-na. En este estudio se utilizó el programaFlexX (8) para la evaluación de cinco li-gandos del tipo aril bóricos que poseenactividad inhibitoria; estas 5 estructurasmoleculares presentan actividad inhibito-ria, la cual ha sido evaluada experimen-talmente (18).

La estructura tridimensional (3D) de lamolécula Mpro fue obtenida a través delProtein Data Bank (PDB), bajo el códigoID 1Q2W (19); esta molécula es un ho-modímero. La modelización, visualiza-ción y optimización de esta molécula serealizaron con la ayuda del paquete deprogramas computacionales Sybyl (20).Los átomos de hidrógeno y pares solita-rios fueron agregados a la estructura cris-talina de rayos X usando el módulo Bio-

polimer de Sybyl. La orientación inicialde los hidrógenos fue la misma utilizadaen el diccionario de definiciones del pro-grama (20). Hay que aclarar en este puntoque todos los cálculos teóricos fueron he-chos para un monómero, porque se infie-re que el otro monómero actúa de manerasimilar por tener igual estructura y se-cuencia peptídica. La optimización delmonómero se realizó usando el campo defuerza MMFF94s (21), con un criterio deconvergencia para el gradiente de energíade 0,05 kcal mol-1 usando el método delgradiente conjugado (22). La estructurade los ligandos (Figura 1) fue optimizadausando el programa Gaussian (23) a unnivel de cálculo AM1 (24).

Los cálculos de acoplamiento molecularde la Mpro con los compuestos bóricos seimplementaron usando el módulo FlexX(8), incluido en el paquete computacionalde SYBYL 7.0 (20). De este paquetecomputacional se empleó el móduloCscore como función de evaluación delos resultados (25, 26) arrojando alrede-dor de 100 conformaciones por ligandoen el sitio activo, las cuales fueron defini-das como todos los residuos encontradosdentro de un radio de 6,5 Å de la Cys-145e His-41 de la proteasa Mpro del virus delSARS. El programa FlexX automática-mente coloca los ligandos dentro del sitioactivo previamente definido, consideran-do las restricciones tanto de tipo geomé-trico como electrónico.

Se eligió la conformación molecular másfavorable de la serie de ligandos despuésde hacerle su respectivo acoplamiento

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molecular; igualmente se realizó unacomparación entre los diferentes paráme-tros de valoración, a través de un consen-so que se desarrolla entre las funciones deevaluación. Las funciones de evaluaciónmás frecuentemente utilizadas son:Chemscore (27), D-score (28), PMF-sco-re (29) and Gscore (13) y Total-Score deFlexX (8). La función Cscore categorizalas energías en orden de 0 a 5 las mejoresenergías acomplejantes. Sin embargo,cada función de evaluación seleccionatambién su mejor conformación y es portal motivo que estas se clasifican en el or-den de mayor a menor energía como nú-meros enteros de menor a mayor, respec-tivamente, y así, después de realizar lamedia, el que tenga número entero de me-

nor valor será el que tenga el valor ener-gético mayor.

Después de elaborar el consenso, setomó el valor Chem_Score como referen-cia para compararlo con los resultadosexperimentales (21). Estos valores sonmostrados en la Tabla 1, en donde los va-lores de la constante de inhibición (Ki) yel parámetro � indican la competitividadde los ligandos, es decir, que entre másbajo sea el valor de �Ki, la inhibición seráentonces no competitiva.

Se ha reportado en la literatura una seriede compuestos borados (18), (Figura 1),que experimentalmente presentan activi-

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Estructuras químicas de los bifuncionales aril bórico, tomadas del trabajo de Bacha y cols., 2004(18).

dad antiviral frente a la proteasa Mpro

mostrando selectividad hacia los residuosde aminoácidos que poseen grupos OH,tales como treoninas y serinas. Los com-puestos aril bóricos en general han sidousados en diversas áreas de la química,tales como química organometálica, sín-tesis orgánica y química medicinal (30).Por ejemplo los ácidos fenil bóricos (31,32), como también algunos otros aril bó-ricos (33) han demostrado tener actividadinhibitoria débil para la serina proteasa.La inhibición más potente de la serinaproteasa se ha observado para los ácidosbóricos incorporados dentro de un esque-leto péptido mimético (34, 35). En la ac-tualidad existen reportes de una gama deinhibidores peptidilborano (36, 37).

El sitio activo de la estructura de laMpro está constituido por histidina 41-cis-teína 145 (14). Se eligió una distancia de6,5 Å alrededor de la cisteína 145; en esteradio existen unos conjuntos bien confor-mados de treoninas [21, 24, 25 y 26] y se-rinas [139, 144, 147], que forman una ca-vidad que resultó ser del tamañoadecuado para retener a los compuestosaril bóricos.

A partir de los cálculos de acoplamientomolecular hechos sobre la cavidad de lasserinas [139, 144, 147] (Figura 2), se en-contró que los resultados sobre esta cavidaddifieren de los reportados en la literatura(18), en los que se afirma que la inhibiciónse desarrolla debido al hecho de que loscompuestos aril bóricos (Figura 1) interac-cionan con los hidroxilo (OH) de las seri-nas, lo cual propicia un acercamiento haciala díada catalítica conformada por la histidi-na y cisteína [His 41-Cys 145] (4-7). Sin

embargo, a través de este estudio se de-muestra claramente que el acercamientorealmente no es sobre la cavidad rica en se-rinas, sino que se da sobre la cavidad queposee el grupo hidroxilo (OH) en su estruc-tura química, y que está conformado por unconjunto de treoninas 21, 24, 25 y 26, difi-riendo en este caso con lo reportado por Ba-cha y colaboradores (18) como se puedeobservar en las Figuras 3 y 4.

El acoplamiento realizado sobre laMpro con los diferentes ligandos bóricosmuestra que estos pueden ser posiciona-dos adecuadamente en algún sitio activode una proteína, pero la fortaleza de lasinteracciones no son suficientementegrandes dentro del complejo enzima-li-gando como para mantenerlo unido deforma estable, lo cual hace que este ligan-do no pueda competir contra el sustratoasociado a la proteína.

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Cavidad de la proteasa homodiméricadentro de un radio de 6,5 Å, ubicando el sitio activoy el conjunto de treoninas y el conjunto de serinasencontradas en la parte posterior, para su respectivoacoplamiento molecular frente al conjunto de ácidosbóricos.

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Acoplamiento del inhibidor FL-078 con la cavidad formada por las treo-ninas y en la parte posterior el conjunto de serinas.

Cavidad formada por el conjunto de treoninas y el sitio activo de la Mpro, acoplado con los inhibido-res aril bóricos. Paneles A y B, acoplamiento de inhibidores FL-106 y FL-136 con la cavidad; panel C, el inhi-bidor FL-101 se aleja del conjunto formado por las treoninas, acercándose al conjunto de serinas; panel D, in-hibidor FL-166 se ubica en la parte posterior de la cavidad.

En la Tabla 1 se muestran los valoresenergéticos del acople molecular realiza-do sobre la estructura de la Mpro con los li-gandos bóricos; estos valores indican quea pesar de la posición en la que está ubica-do el ligando bórico dentro de la estructu-ra acomplejante FL-101_013, con un or-den de energía de –16,59 Kcal/mol, apartir de este valor energético puede asu-mirse que el complejo presentará interac-ciones débiles si se compara con los otroscasos, y por tanto el complejo enzima-in-hibidor (FL-101_013) será el más inesta-ble, como también se puede inferir de suconstante de inhibición 16,0 �M, el pará-metro � = 4,2 eleva el valor de la cons-tante a �Ki = 67,2 �M, (4), lo cual corro-bora que a pesar de que su estructura,como se muestra en la Figura 5 (panel B),se encuentra cercano a la díada histidina41 y cisteína 145, la fortaleza de las inte-racciones no es suficientemente grandecomo para mantenerlo unido en formaestable.

Análogamente se tienen las estructurasFL-136 y FL-106; estas moléculas tienenuna constante de inhibición de 6,0 �M,que experimentalmente las clasifica comomejores que la estructura FL-101. Al ana-lizar esto desde el punto de vista de la su-

perficie molecular formada entre el ligan-do con el conjunto de treoninas, se tieneque la FL-106, con una energía de –17,05Kcal/mol, hace que las interacciones

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� �

FL-166_017 -22,22 0,04 1,8

FL-136_005 -20,54 6 2,5

FL-078_003 -17,33 4,5 3,3

FL-106_002 -17,05 6 5,6

FL-101_013 -16,59 16 4,2

Resultado energético del acoplamiento molecular realizado por FlexX para el conjuntode treoninas y los compuestos bóricos

* Datos tomados por Bacha y cols. (18).

Acoplamiento de inhibidores FL-078 (panelA) y FL-101 (panel B) frente al homodímero Mpro (ID1Q2W).

energéticas sean por –0,46 Kcal/mol másestables que la FL-101, aunque tanto laFL-106 como la FL-136 se ubican dentrode la misma zona lejana de la histidina 41y cisteína 145 debido a las constantes in-hibitorias y los valores de las interaccio-nes que presentan –17,05 y –20,54Kcal/mol, respectivamente. Como se ob-serva en la Tabla 1, estos ligandos tienenel mismo valor de la constante de inhibi-ción (18), se diferencian en los valoresque se encuentran en el producto de estaconstante y el parámetro de inhibición�Ki, los cuales son, respectivamente,15,00 �M y 33,60 �M para la FL-136 y laFL-106.

La constante de inhibición del comple-jo formado entre la proteasa y el ligandoFL-078, 4,5 �M, está dentro de los valo-res hallados anteriores (de 6 �M) ya queenergéticamente posee interacciones quecaen dentro del rango anterior (–17,05 y–20,54 Kcal/mol) y su valor energético(–17,33 Kcal/mol), y posible que este li-gando no siga la tendencia experimentaldebido quizás a que no se tuvo en cuentael efecto que puede generar el solvente enla estructura proteínica, el efecto salino ode iones y el pH, entre otros; pero es bas-tante claro que al observar las estructurasde la Figura 6, correspondientes a la delas FL-078, FL-106 y FL-136, respecti-vamente, se puede apreciar que las tresestructuras están en la misma zona, y es-tructuralmente es muy probable que estose refleje en sus actividades cercanas, yaque, como se ha planteado, puede tratarsede un sitio con posible actividad.

Por último, se tiene la estructura del li-gando FL-166 (Figura 6, panel C); seacompleja con la Mpro con una energía de–22,22 Kcal/mol y con un valor de 0,04

�M en su constante de inhibición. Estosdatos muestran que esta es la mejor es-tructura, estando este resultado con lo

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Acoplamiento de inhibidores FL-106 (panelA), FL-136 (panel B) y FL-166 (panel C) frente al ho-modímero Mpro (ID 1Q2W).

planteado por Bacha (18), debido al inter-cambio de grupos ester por grupos ami-das, lo cual proporciona interaccionesmucho más fuertes desde el punto de vistaenergético, a diferencia de todas las de-más. No obstante, la ubicación molecularde este ligando está hacia el centro de ladíada catalítica (14), pero puede decirseque es estabilizado debido a la interacciónque ocurre con el residuo Thr 25, y muyespecialmente con el residuo Asn 119, loscuales se ubican dentro de la zona que seha mencionado repetidamente para las es-tructuras anteriores como un posible sitiodonde los ácidos bóricos presentan activi-dad; sin embargo, el valor para el pará-metro de inhibición es �Ki 0,078 y la cla-sifica como una estructura que por suubicación en el centro activo histidina 41cisteína 145 (14) puede interferir compe-titivamente con el sustrato y con la díadacatalítica.

La tendencia energética calculada por elacoplamiento molecular de la Mpro y loscomplejos es FL-166_017 > FL-136_005> FL-078_003 > FL-106_002 >FL-101_013; al compararla con el compor-tamiento dado por el producto del parámetroalfa y la constante de inhibición (Tabla 1) in-dican que el parámetro alfa es el que tiene elmayor peso sobre la tendencia para el meca-nismo de inhibición no competitiva, como seobserva en la ecuación 1 y la Figura 7:

[1]

A partir de lo expuesto anteriormente sepuede concluir que los compuestos bifun-cionales, tales como los aril bóricos y susdiversas variaciones, tienen gran selecti-vidad por el grupo hidroxilo (OH) que seencuentra en el residuo de la treonina,que es un aminoácido pequeño, polar yque presenta en su estructura molecularun alcohol primario en su cadena lateral,que puede actuar como nucleófilo durantelas reacciones de catálisis enzimática. Elcompuesto aril bórico codificado comoFL-166 presenta una alta inhibición enzi-mática, lo cual se evidenció a través de suenergía de interacción proteína-Ligando–22,22 Kcal/mol y por su constante de in-hibición 0,04 �M determinada experi-mentalmente. Este compuesto podría sertambién blanco de futuras variaciones es-tructurales.

La estructura del ligando FL-166acomplejada con la Mpro es la mejor es-tructura frente a los cinco compuestos re-portados por Bacha, debido al intercam-bio de grupos ester por grupos amidas, locual proporciona interacciones muchomás fuertes desde el punto de vista ener-gético, a diferencia de todas las demás.No obstante, la ubicación molecular de

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Mecanismo de inhibición no competitiva.

este ligando está dirigida hacia el centrode la díada catalítica, pero puede decirseque es estabilizado debido a la interacciónque ocurre con el residuo Thr 25, y muyespecialmente con el residuo Asn 119, loscuales se ubican dentro de la zona que seha mencionado repetidamente para las es-tructuras anteriores como un posible sitiodonde los ácidos bóricos presentan activi-dad, sin embargo, este valor para el pará-metro de inhibición �Ki 0,078 obtenidoexperimentalmente, la clasifica como unaestructura que por su ubicación en el cen-tro activo histidina 41, cisteína 145, pue-de interferir competitivamente con elsustrato y con la díada catalítica.

El comportamiento dado por el pro-ducto de �Ki indica que � es la que marcala tendencia para el mecanismo de inhibi-ción no competitiva al compararlo con losresultados energéticos dados a través delos cálculos de acople molecular.

Los autores agradecen a la Universidadde Cartagena y a Colciencias por el so-porte económico prestado para el desa-rrollo de este trabajo, en especial al Pro-grama de Jóvenes Investigadoresfinanciado por las dos instituciones.

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