UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDEUNIDADE ACADÊMICA DE ENGENHARIA QUÍMICA

DISCIPLINA: MICROBIOLOGIADOCENTE: LÍBIA CONRADO

Contagem do fungo filamentoso Trichoderma sp utilizando Câmara de Neubauer espelhada e Determinação de Açúcares Redutores (Método

do DNS) e Proteínas(Método de Bradford) do Bagaço do Caju e do Extrato Enzimático do Bagaço do Caju, Respectivamente.

Alunas Matrículas

Deborah Almeida dos Anjos 20911697 Márcia Cristina de Sousa 20911051

Campina Grande-Pb, 30 de novembro de 2011

SUMÁRIO

1. OBJETIVO........................................................................................ 3

2. INTRODUÇÃO................................................................................. 4

2.1-DETERMINAÇÃO DE AR DO BAGAÇO DE CAJU....................42.2-DETERMINAÇÃO DO TEOR DE PROTEÍNA DE UM EXTRATO ENZIMÁTICO PELO MÉTODO DE BRADFORD...............................5 2.3-CONTAGEM DO FUNGO FILAMENTOSO TRICHODERMA SP UTILIZANDO CÂMARA DE NEUBAUER ESPELHADA...................6

3. METODOLOGIA EXPERIMENTAL............................................7

3.1 MATERIAIS........................................................................................73.2 METODOLOGIA................................................................................8

4. RESULTADOS..................................................................................9

5. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS................................................12

6. CONCLUSÃO...................................................................................13

7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA.................................................13

8. ANEXOS............................................................................................14

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1. OBJETIVO

O referente experimento teve como objetivo a determinação de açúcares redutores do bagaço do caju e a dosagem de proteínas utilizando-se o método de Bradford do extrato enzimático do bagaço do caju provindo de um processo de fermentação semi-sólida. Além destes, a contagem do fungo filamentoso Trichoderma sp utilizando-se câmara de Neubauer espelhada, também foi uma finalidade desta prática.

32. INTRODUÇÃO

Os experimentos realizados tiveram por base análises microbiológicas, as quais determinam a eficiência dos microrganismos a partir de técnicas laboratoriais. Tais microrganismos podem ser as bactérias, alguns fungos (leveduras e bolores), os protozoários, as algas microscópicas e os vírus.

As técnicas trabalhadas no dia 26/11/2011 ás 14:00 foram:2.1-Determinação de AR do bagaço de caju;2.2-Determinação do teor de proteína de um extrato enzimático pelo método de Bradford;2.3-Contagem do fungo filamentoso Trichoderma sp utilizando Câmara de Neubauer espelhada;

2.1 Determinação de AR do bagaço de caju

A determinação de açúcares redutores (AR) do bagaço de caju é encontrada pela equação (1).

(1)

Onde,AR = concentração de açúcares redutores;Absorbância= leitura feita no espectrofotômetro;Fc= fator da curva de glicose para AR;VA= volume da amostra;mA= massa da amostra;

A partir da adição do reagente DNS a amostra, teremos o início da reação a qual será acelerada pelo aquecimento da mistura em banho maria a 100ºC. Após um tempo de 5min a reação é concluída e a mistura colocada em banho gelado para que aquela seja cessada. Depois da ocorrência da reação, observa-se que a cor da mistura (amostra + DNS) torna-se mais escura o que significa que há presença de açúcar, assim, quanto mais escura estiver a mistura maior será a concentração de açúcar. Esta concentração é obtida através da leitura realizada em espectrofotômetro que fornece a absorbância a partir da medição e comparação da quantidade de luz (energia radiante) absorvida pela solução. Se a amostra tiver muito açúcar é necessário fazer uma diluição para tornar possível a leitura da absorbância.

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2.2 Determinação do teor de proteína de um extrato enzimático pelo método de Bradford

A concentração de proteínas pode ser obtida por meio de diversos métodos tais como:

Kjeldahl: Determina a concentração de nitrogênio na amostra e a partir desta a de

proteínas;

Biureto: Se baseia na reação do reativo do biureto, que é constituído de uma mistura de cobre e hidróxido de sódio. O cobre, em meio alcalino, reage com proteínas formando um complexo quadrado planar com a ligação peptídica.

Lowry:Baseia-se numa mistura contendo molibdato, tungstato e ácido fosfórico,

(reagente Folin-Ciocalteau), que sofre uma redução quando reage com proteínas, na presença do catalisador cobre (II), e produz um composto com absorção máxima em 750 nm.

Bradford:É baseado na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de proteínas

que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. No pH de reação, ainteração entre a proteína de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica, que absorve fortemente em 595 nm.

Smith ou BCA:Se baseia na reação de cobre (II) com proteínas, em meio alcalino, produzindo

cobre ( I ) e formando um complexo com o BCA, que absorve fortemente na região de 560 nm.

Nesta prática, a determinação da concentração de proteínas foi realizada utilizando-se o método de Bradford para o qual a equação (2) é válida.

(2)

Onde,C = concentração de proteínas;Abs = leitura feita no espectrofotômetro;F = fator da curva para o reagente de Bradford;

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d= obtido através da análise da fermentação mais extração ;

2.3 Contagem do fungo filamentoso Trichoderma sp utilizando Câmara de Neubauer espelhada

A Câmara de Neubauer é utilizada para a contagem de esporos. Esta é feita apenas em cinco regiões principais da Câmara. Dessas regiões é tirada a média dos esporos contados e esta será aplicada na equação (3).

C esporos=E ×25 ×104 × Fd (3)

Onde,Cesporos= concentração de esporos;E= média dos esporos contados na Câmara de Neubauer;Fd= fator de diluição;

Nesta prática, na qual se objetiva a contagem do fungo filamentoso Trichoderma sp, os fungos estão sob a forma de esporos utilizando-se o sabugo de milho como meio de cultivo. Para que haja o desprendimento dos esporos é necessário adicionar uma solução de Tween e após é realizada uma filtração. Se necessário, faz-se uma diluição para que seja possível a visualização dos esporos através do microscópio utilizando-se uma lente de 20.

FIGURA 1-Câmara de Neubauer.

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3. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

3.1 Materiais

Vidrarias e Outros

Becker; Erlenmeyer; Estantes; Gases; Gelo; Papel Alumínio; Papel de Filtro; Papel Manteiga; Pipetadores; Pipetas de 1, 5 e 10 ml; Proveta de 50 ml; Recipiente para aquecimento dos tubos de ensaio; Tubos de Ensaio;

Aparelhos

Autoclave; Balança Analítica; Espectrofotômetro (Marca: Bel photonics; Leitura Máxima: 2000UV); Aparelho para aquecimento da amostra ( neste experimento utilizou-se

um fogão); Vórtex (Marca: Biomixer; Modelo: QL-901);

Reagentes e Soluções

Água Destilada; Cromassie Blue G-250 (reagente de Bradford); DNS para AR; Meio de cultivo para o crescimento dos esporos do fungo filamentoso

Trichoderma sp; Solução de Tween;

73.2 Metodologia

Determinação de Açúcares Redutores pelo Método do DNS

Pesou-se 0,5g do bagaço do caju em um Becker adicionando-se 200ml de água destilada. Deixou-se por 30min agitando-se sempre;

Após o tempo de 30min filtrou-se a amostra, utilizando-se papel de filtro, em um erlenmeyer ;

Adicionou-se 1ml do filtrado mais 1ml de DNS em tubo de ensaio colocando-se em banho Maria a 100 oC por 5 min;

Após os 5 min retirou-se os tubos colocando-os em banho gelado. Depois da amostra ser resfriada colocou-se 8 ml de água destilada nos tubos;

Agitou-se os tubos em Vórtex e em seguida realizou-se a leitura em espectrofotômetro a 540nm e luz visível;

Preparou-se uma amostra em branco para zerar o espectrofotômetro contendo 1ml de água destilada e 1ml de DNS.

Determinação de Proteínas pelo Método de Bradford

Cobriu-se os tubos de ensaio com papel alumínio adicionando-se a este 0,5ml do extrato enzimático do bagaço de caju;

Adicionou-se 5ml do reagente de Bradford cobrindo-se os tubos com pedaços de papel alumínio;

Deixou-se reagir por 10 min; Leu-se em espectrofotômetro a 595nm e luz visível; O branco foi preparado com 0,5ml de água destilada e 5ml do reagente de

Bradford;

Contagem do fungo filamentoso Trichoderma sp utilizando Câmara de Neubauer espelhada

Adicionou-se 40 mL de uma solução de Tween 80 a 0,3% (v/v) nos frascos de sabugo com esporos(terceiro repique);

Esterilizou-se dois beckers, uma proveta de 50ml, uma pipeta de 1ml e um funil em autoclave;

Agitou-se o frasco contendo o sabugo e a solução de tween e em seguida filtrou-se com o auxilio de gases para um becker estéril;

Em seguida tranferiu-se 1ml da suspensão de esporos para outro becker estéril e adicionou-se 39ml Tween 80 a 0,3% (v/v) (diluição da concentração de esporos para leitura);

Pegou-se essa solução de microrganismos e colocou-se na Câmara de Neubauer para ser feita a contagem dos esporos;

84. RESULTADOS

Determinação de Açúcares Redutores pelo Método do DNS

Primeiramente é feita uma média entre os valores das absorbâncias obtidas para os outros grupos e, a partir dela, é determinada a concentração de açúcares através da equação (1).

( 1 )

Para a qual temos:F = 1,6689;VA = 200ml;mA = 0,5g;

TABELA 1-Média entre as absorbâncias lidas de cada grupo e a concentração de açúcares redutores.

Grupo   ABSCyntia/Cristiane 0,412Pedro/Edísio 0,416Adriano/Hebert 0,408Jaqueline/Ruan 0,409Monaísa/Danilo 0,408Adriana/Deny 0,42Média   0,412AR(gAR/gA) 0,275

Após, encontra-se a concentração de açúcares redutores presentes somente na amostra com a qual nosso grupo trabalhou, neste caso o grupo é composto por Deborah/Márcia. Dessa forma, comparam-se os resultados obtidos através do cálculo do erro percentual.

TABELA 2-Valor da concentração de açúcares redutores para a amostra do grupo Deborah/Márcia e o erro percentual em relação a concentração determinada a partir da média das absorbâncias obtidas para os outros grupos.

Grupo   ABSAR(gAR/gA)

Erro (%)

Deborah/Márcia 0,406 0,271 1,45

9Determinação de Proteínas pelo Método de Bradford

A concentração de proteínas é obtida a partir da equação 2

( 2 )

Para a qual temos:F = 0,2203;D = esse valor é desconsiderado para este caso;

Como para a determinação de açúcares redutores, será feita a média entre os valores de absorbância obtidos para os outros grupos e a partir dela, será determinada a concentração de proteínas. Em seguida, é determinada a concentração para a absorbância obtida pelo nosso grupo ( Deborah/Márcia ) e feita a comparação entre os resultados.

TABELA 3-Média entre os valores de absorbâncias dos outros grupos e concentração de proteínas a partir dessa média.

Grupo   ABSCyntia/Cristiane 0,035Pedro/Edísio 0,036Adriano/Hebert 0,023Jaqueline/Ruan 0,029Monaísa/Danilo 0,033Adriana/Deny 0,019Média   0,029C(mg/ml)  

0,0063887

TABELA 4-Valor da concentração de proteínas para a amostra do grupo Deborah/Márcia e o erro percentual em relação a concentração determinada a partir da média das absorbâncias obtidas para os outros grupos.

Grupo   ABSC(mg/ml)

Erro (%)

Deborah/Márcia 0,047 0,010354 62,07

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Contagem do fungo filamentoso Trichoderma sp utilizando Câmara de Neubauer espelhada

A concentração de esporos na suspensão é obtida através da equação ( 3 )

C esporos=E ×25 ×104 × Fd (3)

Para a qual temos:Fd=40 ml;

Abaixo está representada a quantidade de esporos em cada quadrado para o qual foi realizada a contagem.

7 2723

14 35

TABELA 5-Média entre a contagem dos esporos nos cinco quadrados principais da Câmara de Neubauer e a concentração de esporos na mesma.

Esporos7

14232735

Média 21,2C(esporos/ml) 212x106

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5. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS

Para a primeira parte da prática, ou seja, na determinação de açúcares redutores o erro obtido em relação a média das leituras dos outros grupos foi muito pequeno, mostrando que a leitura obtida para o nosso grupo é bastante confiável.

A existência de erro pode ser explicada pela medição irregular dos volumes da amostra e do reagente DNS, na qual observou-se,para alguns grupos, a formação de bolhas de ar e uma medida de volume maior ou menor que o requerido. Outro possível fator de erro está no tempo em que a mistura (amostra junto com o DNS) passou exposta a luz antes de ser aquecida, pois o DNS é bastante volátil motivo pelo qual o frasco onde se coloca o reagente deve ser do tipo âmbar e ainda ser coberto para evitar o contato do mesmo com a luz.

Na segunda parte da prática ( determinação da concentração de proteínas no extrato enzimático) observou-se uma concentração de proteínas muito pequena devido a desconsideração do D por este ser obtido através da análise da fermentação mais extração que não foi realizada. O erro obtido nesta parte é considerável, também devido a má medição dos volumes da amostra e o contato, em vários momentos, do reagente Cromassie com a luz. Este contato provoca, assim como para o DNS, a volatilização do reagente interferindo, dessa forma, nos resultados.

A terceira parte da prática está relacionada à determinação da concentração de esporos da amostra de Trichoderma SP a qual é feita a partir da contagem dos esporos em cinco regiões principais da Câmara de Neubauer. O resultado obtido mostra uma elevada concentração de esporos a qual seria no mínimo trabalhosa para se determinar através da contagem em todos os quadrados da Câmara.

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6. CONCLUSÃO

Ao final do experimento observa-se que algumas fontes de erro interferiram nos resultados, principalmente na segunda parte para a qual se determinaria a concentração de proteínas na amostra de extrato enzimático do bagaço do caju, resultando em um erro considerável. Apesar destes, pode-se concluir que o objetivo da prática foi alcançado visto que foi possível a contagem dos esporos através da Câmara de Neubauer e a determinação das concentrações de açúcares redutores e proteínas das amostras utilizadas em cada procedimento.

7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS VIA ESPECTROFOMETRIA: VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MÉTODOS EXISTENTES. Disponível em :< http://www.scielo.br/pdf/qn/v21n6/2914.pdf> Acesso em: 30 de novembro de 2011.

EMPREGO DO BAGAÇO SECO DO PEDÚNCULO DO CAJU PARA POSTERIOR UTILIZAÇÃO EM UM PROCESSO DE FERMENTAÇÃO SEMI-SÓLIDA. Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.9, n.2, p.137-142, 2007. Disponível em:< http://www.deag.ufcg.edu.br/rbpa/rev92/Art925.pdf> Acesso em: 30 de novembro de 2011.

 OBTENÇÃO DE CURVAS PADRÃO PARA AÇÚCARESREDUTORES, AÇÚCARES SOLÚVEIS TOTAIS,PROTEÍNAS E AMINOÁCIDOS. Disponível em: < http://pt.scribd.com/doc/50299135/relatorio1-DNS-acucares> Acesso em: 30 de novembro de 2011.

138. ANEXOS

Faz-se a média dos grupos dos dados da absorbância; Calcula-se separadamente a absorbância para nossos dados e para os dados da

média dos outros grupos; Calcula-se o erro percentual (%);

Na determinação de AR pelo método DNS

Média dos grupos = (0,412+0,416+0,408+0,409+0,408+0,402)/6 ≅ 0,412

Deborah/Márcia = 0,406

Fc=1,6689;VA= 200ml;mA = 0,5g;

Equação 1

Média dos grupos

Deborah/Márcia

Erro% =

Erro% = 1,45

Na determinação do teor de proteína de um extrato enzimático

pelo método de Bradford.

Média dos grupos = (0,035+0,036+0,023+0,029+0,033+0,+0,019)/6 = 0,029

Deborah/Márcia = 0,047

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AR=0 ,412∗1 ,6689∗2000,5∗1000

=0 ,275 g AR /g A

AR=0 ,406∗1 ,6689∗2000,5∗1000

=0 ,271 gAR /g A

ARteórico−ARrealARreal

∗100=0 ,275−0 ,2710 ,275

∗100=1 ,45

F = 0,2203

Equação 2

Média dos grupos C = 0,029*0,2203 = 0,0063887mg/ml Deborah/Márcia C = 0,047*0,2203= 0,0103541mg/ml

Erro% =

Erro% = 62,07

Contagem do fungo filamentoso Trichoderma sp utilizando Câmara de Neubauer espelhada

Contagem dos esporos: 7+14+23+27+35 = 106

Média = 106/5 = 21,2

E = 21,2

F = 40 ml

Equação 3

C = 21,2*25*10^4*40 = 212000000esporos/ml

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Cteórico−CrealCreal

∗100=|0 , 0063887−0 , 0103541|

0 ,0063887∗100=62 ,07