독성평가를 위한 생체지표 연구webbook.me.go.kr/dli-file/nier/09/021/5609190.pdf ·...

발 간 등 록 번 호NIER-GP2015-157

11 -1480523-002434-01

독성평가를 위한 생체지표 연구

2015

- i -

목 차

요 약 문 ·······························································································1

Ⅰ. 세포독성시험 ························································································2

1. MTT Assay ··············································································································2

2. LDH leakage Assay ······························································································4

3. Neutral red Assay ·······························································································5

Ⅱ. 산화적손상시험 ····················································································7

1. ROS Assay ·············································································································8

2. NO Assay ··············································································································10

3. GSH/GSSG Assay ································································································12

III. 염증성단백질분석시험 ······································································14

1. IL-1α/β ···················································································································14

1) IL-1α ····················································································································14

2) IL-1β ···················································································································15

2. IL-6 ························································································································16

3. IL-8 ························································································································16

4. IL-10 ························································································································17

5. VEGF ·······················································································································17

6. TNF-α ······················································································································18

7. TGF-β ······················································································································19

- ii -

8. 사이토카인 측정 방법 ··························································································19

1) ELISA 원리 ············································································································20

2) 시험방법 ·················································································································22

IV. 참 고 문 헌 ························································································26

V. 부 록 ·····································································································29

- iii -

그 림 목 차

그림 1. MTT Assay 원리 ·······························································································2

그림 2. 산화제와 항산화제간의 불균형 모식도 ·························································7

그림 3. ROS Assay 원리 ································································································8

그림 4. NO Assay 원리 ································································································10

그림 5. GSH/GSSG Assay 원리 ·················································································12

그림 6. 면역시스템에서 다양한 세포들의 사이토카인 네트워크 모식도 ···········15

그림 7. ELISA 종류 ·······································································································21

그림 8. 일반적인 ELISA 시험 순서 모식도 ······························································22

그림 9. Microplate layout 예시 ··················································································23

독성평가를 위한 생체지표 연구 ㅣ 2015

- 1 -

요 약 문

1. 제목

독성평가를 위한 생체지표 연구(2015)

2. 목

- 화학물질의 유해성평가를 위해 독성 발현 시 나타나는 다양한 생체 이상 반

응을 활용하여 독성 발생 및 기전을 규명하는 방법론 제시

- 다양한 독성 시험을 단기간 또는 중·장기간 내에 나타나는 독성을 질적·양적

으로 검사하여 독성 여부를 규명하기 위한 참고 지표 제시

- In vivo 및 In vitro 시험을 통해 생성된 다양한 샘플로 측정 가능한 독성 지표

제시

3. 연구내용

- 세포독성시험

MTT, LDH, Neutral Red Assay

- 산화적손상시험

ROS, NO, GSH/GSSG Assay

- 염증성단백질분석시험

염증 관련 단백질 8종 Assay

- 2 -

Ⅰ. 세포독성시험

세포독성은 광범위하게 사용하는 in vitro 독성학 연구이다. MTT assay, LDH

leakage assay, Neutral red assay는 독성 물질 혹은 유해 물질 노출에 의한 세포

독성 또는 세포 생존율을 측정하는 가장 일반적인 시험법이다. 대표적인 3가지

시험에 대한 원리와 시험 방법은 아래와 같다.

1. MTT Assay

1) MTT assay원리

Tetrazolium-based colorimetric (MTT) 시험법은 많은 시료를 쉽게 빠르게 판독

할 수 있어 배양된 세포에서 세포 독성에 관한 연구에 주로 사용된 방법이다. 이

방법은 대사 과정이 온전한 세포의 미토콘드리아 내의 탈수소효소가 노란색 수용

성 tetrazoliumsalt[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide]

(MTT)를 비수용성의 짙은 자주색 MTT formazan 결정으로 환원시키는 원리를

이용한 것으로 적절한 파장 (주로 500 ~ 600nm)에서 흡광도를 측정하여 세포독

성을 평가할 수 있다.1),2)

http://en.wikipedia.org/wiki/MTT_assay

그림 1. MTT 원리


- 3 -

2) 실험재료 및 방법

① 실험재료

- PBS

- MTT 용액: MTT 2 ~ 5mg/ml로 PBS에 녹인 뒤, 필터 하여 tube에 담아 빛 차단 후

4℃보관

- DMSO

- 96well plate (flat bottom)

② 실험방법

- 96well plate에 각 well 당 1 × 104 ~ 1 × 10

6으로 세포를 분주한다.

- 측정하고자 하는 물질을 농도별로 각 well에 첨가한다.

- 시험물질이 충분히 노출될 수 있도록 적절한 시간동안 37℃, 5%, CO2 incubator에

배양한다.

- 상층액을 다른 실험에 사용한다면 제거하고 그렇지 않다면 plate에 그대로 둔다.

- 2 ~ 5mg/ml MTT 용액을 넣는다. (MTT 용액은 빛에 민감하므로 빛의 노출은

최소화)

- 37℃, 5%, CO2 incubator에 4시간 방치한다.

- MTT 용액을 제거 또는 제거하지 않은 채로 DMSO를 분주한다.

- 빛 차단한 상태에서 plate를 10 ~ 30분 동안 충분히 흔들어준다.

- Plate reader를 이용하여 흡광도를 측정한다. (파장: 500nm ~ 600nm)

- 4 -

2. LDH leakage Assay

1) LDH (latate dehydrogenase) leakage assay원리

LDH assay는 젖산탈수소효소의 활성을 측정하는 시험법으로 빠르고, 간단하며

신뢰성이 높은 것이 특징이다. 젖산탈수소효소는 일반적으로 세포막을 통과하지

못하여 세포 밖으로 배출되지 않으나, 세포막이 손상되거나 세포가 죽는 경우 배

지 중으로 방출된다. 따라서 배지 중의 젖산탈수소효소 양은 치사 또는 상해를

입은 세포의 수와 비례하게 된다.2),4)

2) 시험방법

① 실험재료

- 시판되고 있는 다양한 LDH Assay kit 중에서 선택


② 실험방법

- 96well plate에 각 well 당 세포 현탁액을 50 ~ 200㎕씩 분주한다.

(대조군: 세포는 없고 배지만 있는 대조군 준비, 양성대조군은 옵션)

- Triton X-100 용액을 각 kit에서 권장하는 용량만큼 첨가한다.

- 측정하고자 하는 물질을 농도별로 각 well에 첨가한다.


배양한다.

- 원심분리기를 이용하여 400 ~ 600g, 5분 동안 세포를 침전시킨다.

- 새로운 96well plate에 상층액을 옮긴 후 LDH reaction 용액을 각 well에 첨가한다.

- 상온 또는 37℃에서 30분간 방치한다. (빛 차단 필수)

- Plate reader를 이용하여 흡광도를 측정한다. (파장: 450nm ~ 490nm)


- 5 -

3. Neutral red Assay

1) Neutral red assay원리

Neutral red는 비확산에 의해 세포막을 통과하여 리소좀 안에 축적되는 양이온

성 염색시약이다. 상해입지 않은 세포의 리소좀에 흡수된 neutral red dye가 누적

되고 외부물질 또는 화학물질에 의해 세포막이나 리소좀이 손상되면 neutral red

가 세포 내부에 있지 않고 외부로 빠져나가게 되는 원리를 통해 세포 독성을 평

가할 수 있다.2),3),4)

2) 시험방법

① 실험재료

- 시판되고 있는 다양한 Neutral red Assay kit 중에서 선택


② 실험방법

- 세포 현탁액이 들어있는 96well plate에 시험물질을 농도별로 각 well에 첨가한다.


배양한다.

- 96well plate에 세포만 남기고 배지는 제거한다.

- Neutral red 용액을 각 well에 분주한다.

- 2 ~ 4시간동안 37℃, 5%, CO2 incubate에 방치한다.

- 조심스럽게 용액을 제거하고, PBS 또는 HBSS로 빠르게 세척한다. (용액 제거

전 현미경으로 세포 내 빨간색 결정 확인)

- Neutral red 고정액을 분주한다.

- 고정액 또는 세척액을 제거하고 가용화용액을 분주한다. (처음 배지 용량과 동

- 6 -

일한 용량 분주)

- 10분간 상온에서 shaker 또는 피펫팅을 통해 결정을 녹여준다.

- Plate reader를 이용하여 흡광도를 측정한다. (파장: 540nm)


- 7 -

Ⅱ. 산화적손상시험

현대인의 다양한 질병과 노화의 원인으로 산화적 스트레스가 위험인자로 알려

져 있다. 각종 산화제의 생체 내 작용은 생체막지질의 과산화, DNA 변성, 단백성

분의 손상, 효소불활성화 등 다양한 세포손상과 연관이 되어 있다. 이로 인한 기

능 장해로 각종 성인병, 암, 염증 질환 그리고 노화의 원인이 되는 것이다.6),7)

정상적인 경우 생체 내 항산화 효소와 항산화 물질이 존재하여 보호 작용을 하

나 물리적, 화학적 영향으로 인해 이상이 발생할 경우 활성산소가 생성되어 방어

기작으로 산화적 스트레스가 나타나게 된다.6),7)

이와 같은 기전으로 독성 물질 혹

은 유해 물질 노출에 의해 발생한 산화적 스트레스를 측정하는 대표적인 3가지

시험에 대한 원리와 시험 방법은 아래와 같다.

Amira A.M. Adly., 2010

그림 2. 산화제와 항산화제간의 불균형 모식도

- 8 -

1. ROS Assay

1) ROS (Reactive Oxygens Species) assay원리

생체 내에서 유해활성산소 형성은 산소를 사용하는 과정에서 자연스레 생성된

다. 산소는 전자를 획득하기 쉬운 상태가 되어 강력한 산화제가 될 수 있다. 이

산소분자는 호흡과정에서 4개의 전자에 의해 환원되어 물로 바뀌는데 불완전하

게 환원되는 것을 ROS라고 한다. 이러한 ROS 발생 정도를 DCFH-DA

(Dichlorofluorescin diacetate) 염색 방법을 이용하여 측정한다. 소수성 물질인

DCFH-DA는 세포막을 투과한 후, 세포내 에스테라제에 의해 아세틸화되어 형광

을 띠지 않는 DCFH로 분해된다. 이때 DCFH가 ROS에 의해 산화되면 녹색 형광

을 띠는 DCF로 변환되게 된다. 이 형광 세기를 측정하여 세포내 ROS 농도를 평

가할 수 있다.7)

Gomes, A., et al. 2005

그림 3. ROS assay 원리


- 9 -

2) 시험방법

① 실험재료

- 시판되고 있는 다양한 ROS Assay kit 중에서 선택


② 실험방법

- 세포를 96 well clear 또는 black plate에 37℃, 5%, CO2 incubator에 배양한다.

- 배지를 제거하고 DPBS 또는 HBSS로 세척한다.

- 시험물질이 충분히 노출될 수 있도록 적절한 시간동안 노출시킨다.

- 배지를 제거하고 DPBS 또는 HBSS로 세척한다.

- DCFH_DA를 포함하는 배지용액을 만들어 분주 후 30 ~ 60분간 처리한다.

- 배지를 제거하고 DPBS 또는 HBSS로 2 ~ 3번 세척 후 용액을 모두 제거한다.

- Microplate fluorometer로 λexcitation 499 nm, λemission 522 nm에서 형광의 세기를

측정하고, 형광 현미경으로 관찰한다.

- 10 -

2. NO Assay

1) NO (Nitric Oxide) assay원리

NO는 혈액응고 및 혈압조절 기능, 암세포에 대한 면역 기능 등에 중요한 역할

을 하지만 ROS처럼 산화되어 활성 NO로 변화된다. 이는 단백질 및 지질의 과산

화를 유도하고 세포독성을 야기하는 강력한 산화제인 peroxynitrite (ONOO-)를

생산한다. 염증성 매개 물질에 노출된 세포에 의해서 생성된 NO의 증가는 NO가

생체 방어와 자유기에 의해 유발된 조직 손상에 기여한다고 알려져 있으며 다양

한 염증성 질환 시 증가된다.9)

NO 활성도는 대사산물인 nitrate (NO3-)와 nitrite (NO2

-)의 생성농도를 확인할

수 있으며 이를 그리스 반응 (Griess reaction)을 통해 확인한다. 질산환원효소를

이용하여 NO3-를 NO2

-로 환원 시키고 Griess 시약을 이용한 발색반응으로 NO2-의

농도를 측정할 수 있다.10)

Nims R.W., et al. 1995

그림 4. NO assay 원리


- 11 -

2) 시험방법

① 실험재료

- 시판되고 있는 다양한 NO Assay kit 중에서 선택

② 실험방법

- 시험물질에 노출 시킨 샘플 준비

다양한 샘플 측정 가능: Urine, culture media, plasma, serum, tissue

homogenate

- 실험 전 샘플 전처리 실시

Griess 시약은 외부 요인들에 영향을 받아 NO2- 로 환원 되지 않을 수 있다. 세

포 배지, 동물의 경우 식이 섭취로 인한 NO3-의 영향을 줄이기 위해 필터 방법

또는 kit 내 용액으로 전처리를 한다.

- 전처리 한 샘플을 96well plate에 분주한다.

- 질산환원효소를 첨가한다.

- 상온에서 1시간 방치한다.

- Griess 시약을 첨가 한 후 상온에서 약 10분간 방치한다.

- Plate reader를 이용하여 흡광도를 측정한다. (파장: 540 ~ 550nm)

- 12 -

3. GSH/GSSG Assay

1) GSH/GSSG assay원리

Glutathione은 세포 내 주요 물질로써 glutamic acid, cysteine, glycine으로 구

성된다. 이는 산화적 스트레스에 대한 항산화제 역할로 세포 및 조직을 보호하는

기능을 한다. Glutathione peroxidase는 GSH 환원제롤 사용하여 세포의 과산화

지질을 낮추는 역할을 한다. 생체 내에 glutathione은 GSH와 GSSG로 존재하며

정상일 경우 전체 glutathione 중 90% 이상 GSH, 10% 이하 GSSG의 비율이다.

GSH와 GSSG의 비율은 세포 내의 산화-환원 상태를 반영하고 앞서 말한 바와 같

이 GSH가 GSSG보다 많이 존재하고 있다. 산화된 GSH가 GSSG로 산화되면 비율

은 급격하게 변화하게 된다. 전체 GSH와 산화된 GSH의 차이로 환원된 GSH의

양을 형광색소를 이용하여 측정할 수 있다.11)

Owen J.B., et al. 2010

그림 5. GSH/GSSG assay 원리


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2) 시험방법

① 실험재료

- 시판되고 있는 다양한 GSH/GSSG Assay kit 중에서 선택

② 실험방법

- 시험물질에 노출 시킨 샘플 준비

다양한 샘플 측정 가능: Urine, culture media, plasma, serum, tissue

homogenate

- 실험 전 샘플 전처리 실시: Kit 내 설명서에 따라 처리

- 전처리 한 샘플을 96well plate에 분주한다.

- 발색단이 포함된 Ellman’s 시약 (glutathione 환원효소 역할)을 첨가한다.

- 빛 차단 후 회전교반기에 반응시킨다.

- End point method: 25 ~ 30분간 방치 후 plate reader를 이용하여 흡광도를 측

정한다. (파장: 405 ~ 414nm)

- Kinetict method: 30분 동안 5분 간격으로 plate reader를 이용하여 흡광도를

측정한다. (파장: 405 ~ 414nm)

- 14 -

Ⅲ. 염증성단백질분석시험

면역 균형을 유지하기 위해서는 면역세포들의 직접 또는 간접적인 상호작용이

있어야 가능하다. 세포간의 상호작용은 수용체간의 직접적인 결합뿐 아니라 세포

가 분비한 단백질에 의해서 발생하는 경우가 많다. 이 단백질들은 다양한 면역세

포의 증식과 분화 유도, 기능과 활성의 변화를 유도할 수 있으며 이를 사이토카

인 (cytokine)이라고 부른다.12)

외부 또는 내부 인자로 인한 상해가 일어날 경우 보호 작용으로써 염증반응이

나타나게 되는데 이때 사이토카인을 분비하여 병원체 등에 대항하기 위해 백혈구

생성 신호를 보내는 역할을 담당하게 된다. 이러한 염증은 초기에 제어하지 못하

면 생체 기능이 상실되고 항상성이 깨져 만성감염, 자가면역질환, 대사성질환 등 다

양한 질병이 야기될 수 있다.13)

질병은 대부분 염증과 관련되어 있으며, 염증세포들이 염증을 유도시키는 물질

을 분비하게 된다. 이 때 분비되는 것을 염증성 단백질 (inflammatory cytokine)

이라 하며, 환경유해인자, 바이러스, 약물 등이 체내에 들어오게 되면 증가하게

된다.13)

이처럼 독성 물질 혹은 유해 물질 노출에 의해 발생하는 대표적인 염증성

단백질 종류와 측정 방법은 아래와 같다.

1. Interleukin-1α/β(IL-1α/β)

1) Interleukin-1alpha (IL-1α)

IL-1α는 주로 활성화된 대식세포, 호중구, 상피세포, 내피세포에 의해 생성된다.

대사, 생리, 조혈 과정에 관여하며 단백질 가수분해 과정과 세포손상에 대한 반

응, 세포자멸사를 유도하는 등 면역 반응 조절에서 중요한 역할을 담당한다.14),15)

정상 사람 표피에서 상당량 발견되며 상피세포와 각질층은 1:1 비율로 분포되

어 있다. 신체에 병원성미생물 침입으로부터 보호하는 장벽으로써 피부 장벽 기

능을 유지하는 역할을 한다. 관련된 질병으로는 류머티즘성 관절염과 알츠하이머


- 15 -

병과의 연관성이 알려진 사이토카인이다.16)

Stenken J.A., Poschenrieder A.J. 2015

그림 6. 면역시스템에서 다양한 세포들의 사이토카인 네트워크 모식도

2) Interleukin-1beta (IL-1β)

IL-1β는 활성형인 카스파제 1로 단백질 가수분해를 통해 프로단백질

(proprotein)로써 활성화된 대식세포에 의해 생성되며 염증반응의 매개체와 세포

증식·분화·자멸사를 포함한 다양한 세포활성에 중요한 역할을 하는 사이토카인이다.

사이클로옥시게나제 (COX-2, cyclooxygenase-2) 효소 유도로 인해 중추신경계

에서 염증성 통증 과민증에 기인하는 사이토카인으로 알려져 있다. IL-1β 생성이

증가되면 자가염증성질환이 야기된다.17)

- 16 -

2. Interleukin-6 (IL-6)

T 세포와 대식세포의 면역 반응 자극으로 인해 분비되며 염증과 B 세포 성숙

기능에 관련된 사이토카인이다. 정신적 외상과 감염 특히 화상 또는 염증을 초래

하는 다른 조직 손상들로 인해 분비된다. 자가면역질환 또는 감염성질환 환자에

발열을 유도한다.

염증 초기에 생성되며, IL-6 수용체를 통해 전사 염증 반응을 유도하고 혈청 안

에서 분비된다. 진성 당뇨병, 전신 소아 류머티즘과 같은 다양한 염증 관련 질병

과 연관되어 있음을 보여준다.18)

또한 다른 사이토카인과 협력하여 선천면역과 후천면역간의 연관성을 제공한

다. 천식 환자의 객담에서는 비만 세포 활성화 후 IL-6의 양이 증가하는 것이 발

견되었다. 그리고 IL-6는 Th2와 Th17세포를 증가하는 역할을 해서 천식에 있어

전염증 (proinflammation) 기능을 하며 TNF-a, IL-1과 IL-10 활성을 억제하는 효

과를 통한 항염증사이토카인으로써의 역할도 한다. 마우스에서도 폐렴연쇄구균

에 대항하기 위해 IL-6가 요구되는 것을 보여주었다.19)


IL-8은 다양한 조직과 상피세포, 대식세포, 호중구 등의 세포에서 분비되고 염

증 반응의 주요 매개자 중의 하나이다. 호중구에 대한 강력한 화학주성인자로써

염증 부위에 호중구를 소환하고 활성화 시키는 다양한 생물학적 효과를 나타낸

다.20)

이러한 특성으로 기관지 천식, 아토피 피부염 같은 알레르기성 질환 뿐 아니라

호지킨병 (악성 림프종), 류머티즘성 관절염, 건선 등 만성 염증성 질환 발병에 중

요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

그리고 낭포성 섬유증의 원인으로 호중구를 폐상피로 소환하여 기도 내 호중구

의 과잉자극과 기능장애로 폐조직의 손상을 초래하게 한다. 알레르기성 기관지

천식 환자의 폐세척액에서 IL-8을 확인할 수 있으며, 바이러스로 인한 호흡기 감

염인 경우 기도상피세포에서 바이러스가 증식하여 IL-8의 분비가 발생하게 되어


- 17 -

결국 기도폐쇄를 일으켜 천식 등의 증상을 야기하게 하는 사이토카인이다.21)


IL-10은 대식세포, 비만세포, 자연살해세포, 호산구, 호중구 등 선천면역과 후천

면역 시스템 세포에 의해 발현되는 사이토카인이다. 그리고 T 세포와 비만세포를

자극하여 B 세포 성숙과 항체를 생성한다. 또한 강력한 항염증사이토카인으로 전

염증성 (proinflammatory) 사이토카인 IFN-γ, IL-2, IL-3, TNF-α, GM-CSF 등의

합성을 억제하여 지나친 면역 반응에 대항하는 중요한 역할을 담당한다.22)

동물실험을 통한 IL-10의 효과를 보면 IL-10 결핍된 마우스는 소장에 염증반응

을 나타내는데 IL-10을 처리하면 염증반응이 멈추었다는 연구 결과가 있다. 이 뿐

만 아니라 자가면역뇌척수염, 췌장염, 1형 당뇨병 등에 효과적인 영향을 미치는

것으로 보고23)되었으며 천식, COPD (chronic obstructive pulmonary disease) 발

병 시 IL-10의 과한 발현으로 항원제시가 억제되는 등 강력한 면역조절자로의 역

할을 하는 사이토카인이다.19)

5. Vascular endothelial growth factor (VEGF)

혈관내피세포 성장인자로써 혈관 내피세포의 증식과 이동을 유도하며, 새로운

혈관을 형성하고 혈관 투과성을 증가시킨다. 최근 연구결과에서 VEGF는 직접적

으로 nuclear factor-κB (NF-κB)를 활성화시키고, 혈관 내피세포로부터 IL-8와

monocyte chemoattractant protein-1의 합성을 유도한다고 알려졌다. 이를 통해

VEGF가 신생 혈관 생성부위를 향해 백혈구의 충원이 이루어지도록 염증세포를

직접 자극하거나 활성화시킬 수 있음을 보여준다.24)

기도 평활근 세포에 분비되어 혈관 및 기관지 벽 재생 및 투과도 증가와 부종

을 유발한다고 알려졌다. 그리고 천식, 폐결핵 등 만성 폐질환과 급성 하기도 염

증성 질환에서도 증가하는 것으로 보고되고 있다.25) 이는 VEGF가 기도에서 혈관

누수와 새로운 혈관의 성장 조절에 있어 중요한 역할을 담당하고 VEGF와 VEGF

- 18 -

수용체 발현 증가는 천식성 기도에서 혈관분포 증가와 관련 있음을 보여준다. 대

조적으로 VEGF 농도는 COPD 환자의 폐와 객담에서는 감소한다. 게다가 폐기종

의 발달과 치경음 내피세포의 자멸사를 유도하는 VEGF 수용체를 차단한다는 결

과를 보여준다.19)

호흡기 관련 질환 뿐 아니라 증식성 망막증 (proliferative retinopathies), 연령

관련 황반 퇴화 (age-related macular degeneration, AMD), 류머티즘성 관절염,

암, 건성 등 다양한 질환과 관련된 사이토카인이다.26)

6. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)

대식세포, 비만세포, T 세포, 상피세포, 기도 평활근 세포 (airway smooth

muscle cell) 등 많은 세포에서 분비하는 사이토카인이다. 이러한 세포를 활성화

시켜 IL-1 또는 IL-6와 같은 친염증성 사이토카인을 생성하게 한다.19)

바이러스성 감염, 암세포 등의 세포자멸사를 유도하거나 폐혈증 유발, 체내 발

열 유도, 종양생성과 바이러스 복제 억제 능력 등을 가진 사이토카인이다. 또한

TNF-α의 만성적인 생성은 신진대사의 이상으로 악액질과 관련된 질환으로써 만

성 기생충 감염과 암이 발생할 수 있으며, 류머티즘성 관절염 또는 다발성 경화

증 같은 자가면역질환에서도 과다 생성되는 사이토카인이다.27)

TNF-α는 사람 기도 평활근 세포에 직접적으로 작용하여 연축유발인자

(spasmogens)에 대응하여 수축성을 증가시켜 천식질환에 있어 기도과민반응성

(airway hyperresponsiveness, AHR)에 중요한 역할을 한다. 천식성 기도 내 다양

한 세포에서 TNF-α는 발현되며 그 중 비만세포에서 염증반응을 증폭시킨다고 알

려졌다. TNF-α를 차단했을 때 AHR 감소하며 폐기능이 개선되었다고 보고된 바

있다.19)

이처럼 TNF-α는 양면성을 지닌 사이토카인으로써 작용 시점, 질환 등에 따라

다른 경향을 보일 수 있는 사이토카인이다.


- 19 -

7. Transforming growth factor-beta (TGF-β)

T 세포, 혈소판, 단핵구 등에서 분비되며 다기능성장인자로 알려진 사이토카인

이다. T 세포와 자연살해세포 증식과 활성을 억제로 염증에 있어 중요한 역할을

담당한다. 혈소판에 저장되었던 TGF-β가 손상 부위에서 탈과립화되어 많은 양의

TGF-β 방출로 단핵구와 백혈구가 손상 부위로 모이게 되어 만성 염증의 초기 단

계에 이르게 한다. 이로 인해 조직 회복이 조절되지 않아 점진적인 섬유증과 비

슷한 결과를 초래할 수 있게 한다.27)

동물실험을 통해 혈관사이 증식성 사구체염, 당뇨성 신장병, 폐섬유증, 전신성

경화증, 콜라겐 유도로 인한 관절염 등에 영향을 미친다는 보고가 있다. 사람 유

래 세포 실험 결과에서는 기관지 상피 세포의 편평상피 세포 분화를 유도하며 유

해인자로 인한 급성 폐 손상의 섬유화과정을 돕는다고 보고하였다.27),28)

또한

COPD 환자 폐를 microarray를 통해 분석한 결과 TGF-β의 분비가 증가되었으며

중증 천식 환자에서도 발현양이 증가한다는 결과를 나타냈다.19)

TGF-β는 전염증성 또는 항염증성 두 가지 효과를 가진 사이토카인으로도 알려

져 있다. 국소조직에서는 면역촉진, 체순환 (systemic circulation)에는 면역억제에

효과를 나타낸다고 보고되었다.27)

8. 사이토카인 측정 방법

사이토카인은 생물지표로써 널리 사용되고 있으며 질병 진행 예측과 치료 효과

를 모니터할 수 있어 중요한 측정 방법 중 하나이다. 염증성 질병 뿐 만이라 동종

이계반응성 (alloreactivity), 알츠하이머병, 천식, 죽상경화증 (atherosclerosis), 대

장암, 암, 우울증, 심장병, 인간면역결핍바이러스, 신장장애, 파킨스병, 패혈증, 류

머티즘성 관절염 등 거의 모든 질병의 생물지표로 사용되고 있다.12)

이러한 사이토카인은 다양한 방법을 통해 측정 할 수 있는데 일반적으로 많이

사용하는 ELSIA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 이용한 시험방법29)을

소개하고자 한다.

- 20 -

1) ELISA 원리

효소 결합 면역 흡착 분석법 또는 효소면역정량법이라고 하여 가장 널리 사용

되고 있는 분석법이다. 항원-항체간의 특이적 결합 반응과 효소기질을 이용한 발

색반응으로 항원 또는 항체를 정성, 정량할 수 있는 방법이다.

단백질, 펩타이드, 호르몬, 비타민, 의약품 뿐 아니라 유전자조작식물, 식품, 알

레르겐, 살충제, 제초제 등 다양한 분야에 적용시켜서 측정할 수 있으며, 매우 낮

은 농도임에도 불구하고 특이적인 반응을 통해 높은 수준의 항체 또는 항원을 분

석할 수 있는 시험법이다. 이는 높은 민감도를 지녔다고 할 수 있으며 경제적, 시

간적 소모가 적어 현재 가장 널리 이용되고 있는 이유이다.

측정 방법에 따라 direct ELISA, indirect ELISA, sandwich ELISA, competitive

ELISA 4가지 종류로 나눌 수 있다.

① Direct ELISA (1971년 개발) : 많은 양의 고분자량 항원을 안정적으로 측정

할 수 있는 방법이다. Microplate well 표면에 바로 항원 또는 항체를 효소와

결합시켜 측정한다. 항원 또는 항체에 결합한 효소의 발색반응을 분석한다.

② Indirect ELISA (1978년 개발) : Direct ELISA에서 고안된 방법이다. 질병에

걸린 혈청을 항원이 코팅된 microplate well에 첨가하면 여기에 대항하는

항원-항체 복합체가 생성되는데 효소가 없어 측정할 수 없다. 이것과 결합하

는 2차 항체에 포함된 효소 반응을 통해 발색반응을 분석한다.

③ Sandwich ELISA (1977년 개발) : 항원에 대한 항체를 plate에 결합하고 그

항체에 대한 항원을 결합 시켜 분석하는 방법으로 microplate well에

capture antibody를 코팅하고 시료를 첨가시켜 항체와 결합시킨다. 그리고

direct 또는 indirect 방법으로 분석한다.

④ Competitive ELISA (1976년 개발) : Microplate well 표면에 항원-특이 항체

또는 항체-특이 항원을 코팅하여 시료 첨가로 항원 또는 항체에 결합한 효소

방응을 측정한다. 표지 되고 표지 되지 않은 항원 또는 항체간의 경쟁에 의

해 발색반응을 분석한다.


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Aydin S. 2015

그림 7. ELISA 종류

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2) 시험방법

Aydin S. 2015

그림 8. 일반적인 ELISA 시험 순서 모식도


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　 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A Blank CONTROL 1 SAMPLE 7 SAMPLE 15 SAMPLE 23 SAMPLE 31

B Standard CONTROL 2 SAMPLE 8 SAMPLE 16 SAMPLE 24 SAMPLE 32

C Standard SAMPLE 1 SAMPLE 9 SAMPLE 17 SAMPLE 25 SAMPLE 33

D Standard SAMPLE 2 SAMPLE 10 SAMPLE 18 SAMPLE 26 SAMPLE 34

E Standard SAMPLE 3 SAMPLE 11 SAMPLE 19 SAMPLE 27 SAMPLE 35

F Standard SAMPLE 4 SAMPLE 12 SAMPLE 20 SAMPLE 28 SAMPLE 36

G Standard SAMPLE 5 SAMPLE 13 SAMPLE 21 SAMPLE 29 SAMPLE 37

H Standard SAMPLE 6 SAMPLE 14 SAMPLE 22 SAMPLE 30 SAMPLE 38

그림 9. Microplate layout 예시

① 실험재료


- Coating buffer: PBS 또는 TBS 사용

- Capture antibody: 1 ~ 15㎍/㎖ 농도에서 사용, coating buffer를 통해 농도 조절

- Washing buffer: PBS + 0.05% Twteen 20, pH 7.2 ~7.4

- Blocking·standard·sample buffer (희석용액): 1 ~ 5% Bovine Serum Albumin

+ PBS, pH 7.2 ~7.4

- Detection antibody: 0.5 ~ 10㎍/㎖ 농도에서 사용, 희석용액을 통해 농도 조절

- Enzyme conjugate: 희석용액으로 200배 희석해서 사용

- Substrate: 용액 A(H2O2)와 용액 B(Tetramethylbenzidine)를 1:1 비율로 제조해서 사용

- Stop 용액: 1 ~ 2M H2SO4 사용

※ 시판되고 있는 cytokine 종류별 kit 중에서 적절한 것을 선택한 후 제조사에서

- 24 -

제시한 시약 제조법 및 시험방법에 맞게 실시하면 간편하게 측정 할 수 있다.

② 실험방법

- Blank well은 비어있는 상태로 유지시킨다.

- Capture antibody를 적절한 농도로 blank 제외하고 100㎕ 분주한다.

- Microplate cover 또는 sealer를 이용해서 이물질이 들어오는 것을 막는다.

- 상온에서 2시간 또는 4℃에서 하룻밤 동안 방치한다.

- ELISA plate 세척기 또는 multi-channel pipette을 이용해서 세척용액을 300 ~

400㎕ 분주하여 3 ~ 4번 세척을 반복한다.

- Blocking buffer를 blank 제외하고 200 ~ 300㎕ 분주 후 cover 또는 sealer로 덮는다.

- 상온에서 1 ~ 2시간 동안 방치한다.

- Standard well에 적절한 농도로 희석한 standard 용액을 100㎕/2well 분주한다.

- Control well에 농도 범위를 알고 있는 control 용액을 100㎕/2well 분주한다.

- Sample well에 standard 범위로 되게 원액 또는 희석한 sample 용액을 100㎕

/2well 분주 후 cover 또는 sealer로 덮는다.

- 상온에서 2 ~ 4시간 정도 방치한다.

- ELISA plate 세척기 또는 multipipet을 이용해서 세척용액을 300 ~ 400㎕ 분주

하여 3 ~ 4번 세척을 반복한다.

- Biotin이 부착된 detection antibody를 적절한 농도로 blank 제외하고 100㎕ 분

주 후 cover 또는 sealer로 덮는다.

- 상온에서 1 ~ 2시간 정도 방치한다.



- Sreptavidin-horseradish peroxidase 용액 (enzyme conjugate)을 blank 제외하


- 25 -

고 100㎕ 분주 후 cover 또는 sealer로 덮는다.

- 빛을 차단하고 상온에서 1 ~ 2시간 정도 방치한다.



- TMB 용액 (substrate)을 100㎕ 분주 후 cover 또는 sealer로 덮는다.

- 빛을 차단하고 상온에서 발색되는 정도를 관찰하면서 방치한다.

- Stop 용액 (2M H2SO4)을 100㎕ 분주 후 plate reader를 이용하여 450nm에서

흡광도를 측정한다.

- 결과계산

▷ Standard 농도와 측정된 O.D 값으로 그래프를 그린다.

▷ y=ax+b 기울기 공식을 토대로 sample O.D 값을 넣어 농도 계산

- 26 -

Ⅳ. 참 고 문 헌

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10.1016/j.cell.2008.02.024


- 29 -

Ⅴ. 부 록

Cytokine 종류 및 기능30),31),32,)33)

- 30 -


- 31 -

- 32 -

독성평가를 위한 생체지표 연구(2015)

편 집 : 환경건강연구부 위해성평가연구과

임연미, 권도영, 김은지, 김현미, 권정택, 김필제, 최경희

인 쇄 : 2015년 12월

발 행 : 2015년 12월

펴 낸 이 : 국립환경과학원장

주 소 : (우) 22689 인천시 서구 환경로 42 종합환경연구단지

국립환경과학원 환경건강연구부 위해성평가연구과

전 화 : 032) 560-7172

팩 스 : 032) 568-2037

ISBN NO. 978-89-6558-333-2 93530

독성평가를 위한 생체지표 연구webbook.me.go.kr/dli-file/nier/09/021/5609190.pdf ·...

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