J South Med Univ, 2013, 33(9): 1341-1346 doi 10.3969/j.issn.1673-4254.2013.09.19

烟烟熏联合脂多糖气管内滴注熏联合脂多糖气管内滴注建立原发性高血压大鼠慢性肺阻塞建立原发性高血压大鼠慢性肺阻塞模模型型余常辉，陈 燕，李 婷，李 维，蔡绍曦，孟 莹南方医科大学南方医院呼吸内科，广东 广州 510515

Establishment of a chronic obstructive pulmonary disease model by passive cigarettesmoking and intratracheal LPS instillation in spontaneously hypertensive ratsYU Changhui, CHEN Yan, LI Ting, LI Wei, CAI Shaoxi, MENG YingDepartment of Respiratory Disease, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China

摘要：目的 通过单纯烟熏法和烟熏联合气管内滴入脂多糖法建立符合慢性肺阻塞（COPD）病人病理生理特点的原发性高血压

大鼠COPD模型，比较两种方法复制COPD模型的效果。方法 将15只原发性高血压雄性大鼠随机分为3组，每组5只。其中一

组为正常对照组，其他两组分别为单纯烟熏（CS）组和脂多糖联合烟熏（LPS+CS）组建立COPD模型组。八周后观察动物一般

情况，测量大鼠肺功能，肺组织病理学；Western blot 检测各组肺组织中肺泡表面活性物质结合蛋白A（SP-A）、核蛋白 NF-κB、

Histone、胞浆蛋白p-Iκ-Kα/β、Iκ-Kα/β、IκB-α蛋白表达；qRT-PCR检测TNF-α和 IL-6 mRNA表达的变化。结果 两个模型组大鼠

消瘦，伴有间歇咳嗽和气促。有创肺功能检测CS组气道阻力（RI）较对照组增高，但差异无统计学意义；气峰流速（PEF）较对照

组明显降低。LPS+CS组PEF明显低于对照组和CS组，而RI较对照组和CS组明显增高（P<0.05）。肺组织 HE染色显示两个

模型组大鼠均具有慢性支气管炎和肺气肿的典型病变，CS组和 CS+LPS组平均肺泡数(MAN )明显低于对照组，而肺组织平

均内衬间隔 (ML I)和肺泡破坏指数（DI）明显高于对照组，差异有统计学意义 (P<0.05)；CS+LPS组 ML I和DI值较CS 组明显升

高，MAN值较CS组明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。各组大鼠肺组织中，SP-A和 IκB-α表达水平在CS+LPS组和CS组

中表达较对照组明显减少（P<0.05），CS+LPS组较CS组明显减少（P<0.05）；而NF-κB表达水平及 Iκ-Kα/β的磷酸化水平表达在

CS+LPS组和CS组中表达较Control组明显增加（P<0.05），CS+LPS组较CS组明显增加（P<0.05）。CS和CS+LPS组大鼠肺组

织中TNF-α组和 IL-6 mRNA表达水平较正常组明显增加（P<0.05），且CS+LPS组TNF-α和 IL-6 mRNA表达水平较CS组明显

增加（P<0.05）。结论 烟熏加气管注内毒素及单纯熏香烟，在原发性高血压大鼠上可复制较理想的COPD模型，但烟熏加气管

注内毒素较单纯熏香烟建立的COPD大鼠模型更为理想。

关键词：慢性肺阻塞；动物模型；高血压大鼠；吸烟

Abstract: Objective To establish a chronic obstructive pulmonary disease (COPD) model by passive cigarette smoking and (or)intratracheal instillation of lipopolysaccharide (LPS) in spontaneously hypertensive (SH) rats. Methods Fifteen male SH ratswere randomly divided into control group, cigarette smoking exposure (CS) group and CS+LPS (cigarette smoking exposureplus intratracheal instillation of LPS) group. After 8 weeks' treatment, the COPD model was validated by inspecting thegeneral condition and examining lung function and pulmonary pathological changes. The expressions of surfactant-associatedprotein A (SP-A), NF-κB, histone, p-Iκ-Kα/β, Iκ-Kα/β, and IκB-α were determined with Western blotting, and the expression ofTNF-α and IL-6 mRNA were measured using qRT-PCR. Results The rats in both CS and CS+LPS groups were marantic withintermittent cough and tachypnea. Lung function test showed increased RI and lowered peak expiratory flow in CS group,which were more prominent in CS + LPS group (P<0.05). HE staining demonstrated typical chronic bronchitic inflammationand emphysema in the lungs of the two model groups with significantly decreased mean alveolar number and significantlyincreased mean lining intermiment and destrction index. The emphysema level was more serious in CS+LPS group than in CSgroup. Western blotting showed markedly decreased expressions of SP-A and IκB-α in CS group and CS+LPS , especially thelatter group. The protein levels of NF-κB, Iκ-K phosphorylation and mRNA expressions of TNF-α and IL-6 increasedobviously in the two model groups. Conclusion COPD model can be established by passive smoking and (or) intratrachealinstillation of LPS in SH rats, and the model induced by combined exposures is optimal.Key words: chronic obstructive pulmonary disease; animal models; spontaneously hypertensive rat; cigarette smoking

基础研究

慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary

disease, COPD）是一种慢性气道炎症并肺气肿的复杂

的炎症性疾病，表现为不可逆的肺通气受限及进行性的

肺功能恶化，多与肺部对吸入的害气体、颗粒或感染细

菌、病毒等产生的炎性反应有关。宋一平等［1］通过被动

吸烟复合气道内注入脂多糖（LPS）法模拟人类COPD

吸烟及感染两大最重要的诱因制备符合人类COPD发

收稿日期：2013-05-21

基金项目：广东省科技计划项目（2009B060300021）

作者简介：余常辉，硕士，E-mail: ych4231@gmail.com

通信作者：孟 莹，副主任医师，E-mail: mylx99@gmail.com

··1341

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生发展的病理生理状况COPD大鼠模型，但正常大鼠抵

抗性强，制备的COPD模型稳定性差［2-3］。正如易感人群

容易患环境相关的疾病，获得某种遗传易感性的大鼠容

易建立相应疾病的实验模型。由于自发性高血压（SH）

大鼠具有容易获得心血管疾病和肺损伤的基因易感

性［4］，因此我们设想原发性高血压大鼠（spontaneously

hypertensive rat, SHR）可能用于建立吸烟诱导的

COPD模型。本实验尝试用SH大鼠建立COPD大鼠模

型，观察其病理、气道阻力及炎症情况及相关炎症因子

的水平来评价SH大鼠 COPD模型是否符合COPD病

人的病理生理特点。

1 材料和方法

1.1 动物

选取SPF级健康 SH（spontaneously hypertensive）

雄性大鼠 15只，体质量250±20 g，由北京维通利华实验

动物技术有限公司提供。饲养于南方医科大学实验动

物中心清洁级动物房。

1.2 实验主要试剂及仪器

脂多糖 LPS（15 mg/支，日本化药株会社）；红双喜

牌香烟（焦油量 12 mg，烟气烟碱量1.0 mg，烟气一氧化

碳量 14 mg，上海卷烟厂）；兔来源的肺泡表面活性蛋白

（SP-A）多克隆抗体（美国 Santa Cruz 公司）；兔来源

NF-κB、Histone、p-Iκ-Kα/β、Iκ-Kα/β、IκB-α多克隆抗体

（美国CST公司)；有机玻璃熏箱 120 L（50 cm×40 cm×

60 cm，自制）；PLY3211 小动物肺功能检测系统（美国

Buxco Electronics公司）；OLYMPUS光学显微镜（日本

OLYMPUS公司）；Odyssey V3.0扫描仪（Li-cor公司）。

1.3 动物分组及模型制备

大鼠常规饲养1周后，随机分为空白对照组、单纯

吸烟（CS）组、吸烟＋脂多糖（CS+LPS）组，共 3组，每组

5只。COPD 大鼠模型制备用气管内滴注脂多糖加烟

熏 8周（即56 d）［5］。除空白组外，其余组每天烟熏 2次

（上、下午各 1 次），每次吸烟 10 支，每支燃烧 10 min，换

烟停止 5 min，每周烟熏 6 d；除外第 1天、第 15天、第29

天及第43天气管内滴注脂多糖（用量 1 mg/kg）时不予

烟熏。每次熏烟后，将大鼠置于鼠笼内常规饲养。于第

57天测量老鼠肺功能、采动脉血做血气分析及收集

肺组织。

1.4 大鼠肺功能检测

停止烟雾暴露后第2天，行有创肺功能法检测大鼠

肺功能。检测指标：呼吸峰流速（peak expiratory floe,

PEF）及气道阻力（resistance index, RI）。大鼠肺功能检

测在广州医学院呼吸疾病研究所进行，为保证肺功能数

据质量，操作均由同一人进行。

1.5 大鼠肺组织病理学观察及形态定量分析

结扎右侧主支气管及左上肺支气管并注入4%多聚

甲醛至左下肺膨胀，随后将左下肺浸入4%多聚甲醛中

固定 24 h，石蜡包埋、4 μm连续切片，常规苏木素-伊红

(HE) 染色，光学显微镜观察 HE 染色。每只动物随机

选取 2张肺组织 HE染色病理切片，每张切片随机选取

上、中、下、左和右 5 个视野（避开大血管和支气管），×

100显微镜下观察，数码相机摄像。在每个视野正中心

划十字交叉线，计算与交叉线相交的肺泡间隔数（Ns）和

每个视野内肺泡数（Na），同时测量十字线总长（L）和每

个视野面积（S）。根据以下公式计算肺组织平均内衬间

隔（MLI）和平均肺泡数（MAN)∶MLI=L/Ns（其数值反

映肺泡平均直径）、MAN=Na/S（其数值反映肺泡密

度）。肺泡破坏指数（Destructiveindex, DI）的测定参

照陈燕等［6］的方法进行：每只小鼠取 3个HE 染色切片，

每张切片低倍镜( 切片，每张切片下至少观察 20个非重

复视野，分别以正常(N)或破坏(D)记录肺泡结构的破坏

情况，要求每一例各切片的 N、D值总和≥总和泡结"改

为3000，以公式计算DI=D/(D+N)×100。

1.6 Western blot

用-80 ℃保存的组织提取总蛋白（检测 SP-A、β

β-actin）、核蛋白（检测 NF-κB、Histone）和胞浆蛋白（检

测p-Iκ-Kα/β、Iκ-Kα/β、IκB-α、β-actin），Bradford 法测定

蛋白浓度。5%浓缩胶 80 V 衡压 30 min，10%分离胶恒

压 110 V，40 min，湿转 120 mA恒流50 min，37 ℃摇床

5%BSA 封闭 2 h，转印 后 加 入一抗：SP-A、NF-κB、

Histone、p-Iκ-Kα/β、Iκ-Kα/β、IκB-α、β-actin（1∶1000）

4 ℃过夜。TBST 洗膜 5 min×3次。次，山羊抗兔或山

羊抗鼠近红外二抗 1∶15000，常温避光摇床孵育 1.5 h，

避光TBST 洗膜 15 min×4次。Odyssey V3.0扫描仪扫

描膜。重复 3 次。

1.7 RT-PCR检测TNF- 和IL-6 mRNA表达的变化

（1）取约30 mg加入1 ml Trizol，按试剂说明提取

总 RNA，经分光光度计检测RAN纯度与浓度，D260/280

在1.8~2.0之间的RNA用于合成cDNA；（2）cDNA的合

成：取 500 ng 总 RNA 逆转录成 cDNA。（3）实时定量

PCR：采用荧光染料法，按照试剂盒说明进行操作，以

β-actin为内参。引物序列：β-actin：F:5'GAGAGGGAA

ATCGTGCGTGAC3'，R:5'TGTTGGCATAGAGGTCT

TTACGG3'；TNF-α：F:5'GGTGATCGGTCCCAACA

AGG3'R:5'CCTCCCAGGTACATGGGCTC-3'； IL-6：

F:5'TAGAGTCACAGAAGGAGTGG3'；R:5'-GCCAG

TTCTTCGTAGAGAAC-3'。PCR反应体系20 μl：SYBR

Green mix 10 μl，上下游引物各1 μl，cDNA 2 μl，ddH2O

6 μl，每个样品做 2 个复孔。用 ABI 7500 Real-time

PCR仪进行扩增，反应条件为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，

60 ℃ 60 s，扩增40循环。PCR 结束采用溶解曲线确定

产物特异性。由 PCR 扩增曲线得到 Ct 值（域值循环

数），采用域值循环数方法进行相对定量。将正常组作

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为对照组。

1.8 统计学分析

应用SPSS 13.0统计学软件，采用单因素方差分析

法，首先利用Levene方法进行方差齐性检验，确定方差

齐性且整体比较组间差异有统计学意义后进一步作多

重比较，多重比较采用LSD法。以P<0.05为差异有统

计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况观察

各组大鼠均未出现死亡。CS组和 CS+LPS 组大

鼠在每次熏烟初始喜聚集成堆闭目静卧，熏烟较长时间

后逐渐出现张口喘息、流涎、大汗，腹式呼吸加剧；CS和

CS+LPS组动物分别在造模开始的第 1周和第 2周前后

逐渐出现间歇咳嗽，呼吸急促，精神萎靡，拱背蜷缩，皮

肤松弛，皮毛无光泽发黄且脱落严重，消瘦。CS和CS+

LPS两组造模结束时的外观无明显差异。对照组大鼠

实验前后活动正常，无咳嗽、气促，皮肤毛发有光泽、并

无脱落。

2.2 大鼠肺功能测定

CS组大鼠RI较对照组增高，无明显统计学差异。

CS+LPS组大鼠RI较对照组明显增高，有统计学差异（P均<0.05）。CS组及CS+LPS组大鼠PEF较对照组明显降

低，差异均有统计学意义（P均<0.05）；CS+LPS组大鼠

PEF较CS组明显降低，有统计学差异（P均<0.05，图1）。

2.3 组织病理切片HE染色观察肺气肿及气道炎症情况

图1 大鼠造模8周后行有创肺功能检查Fig.1 Resistance index (A) and peakexpiratory flow (PEF, B) of the ratsdetected by an invasive method after 8weeks's exposure. *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs CS group.

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

RI

(cm

H2O

)

Control CS CS+LPS

*

A BControl CS CS+LPS

**

#

PE

F(m

l/se

c)

16

14

12

10

8

6

CS组及CS+LPS组大鼠出现慢性支气管炎和肺气

肿表现：各级支气管黏膜上皮细胞变性、坏死、增生，纤

毛倒伏、部分脱落，黏液分泌增加，杯状细胞增多；肺实

质呼吸性支气管及肺泡破坏、断裂，部分融合形成肺大

泡；肺间质明显增生，炎症细胞广泛浸润。对照组大鼠

未出现上述情况。肺气肿评分见：肺组织平均内衬间

隔、平均肺泡数及肺泡破坏指数（DI）结果：单位面积

内，CS组和 CS+LPS组 MAN明显低于对照组，而 ML I

和DI明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；

CS+LPS组 MLI和DI值较CS 组明显升高，MAN值较

CS组明显降低，差异有统计学意义（P<0.05，图2）。

2.4 各组大鼠肺组织中 NF-κB 信号通路相关蛋白及

SP-A表达的变化

核蛋白检测见CS组NF-κB核转位蛋白较对照组

的明显增加，CS+LPS组的较CS组明显增加。胞浆蛋

白检测见CS组 IS显增加。胞蛋白磷酸化水平较对照

组的明显增加，CS+LPS组的较CS组明显增加；而 I明

显增加及SP-A蛋白在CS组明显减少，CS+LPS组较CS

组明显减少。可见在CS组和CS+LPS组大鼠肺组织中

NF-κB核转位明显增加。

2.5 各组大鼠肺组织中NF-κB下游炎症因子TNF-α和

IL-6 mRNA表达的变化

RT-PCR检测了结果见CS和CS+LPS组大鼠肺组

织中TNF-α和IL-6 mRNA表达水平较正常组在明显增

加，并且CS+LPS组TNF-α和 IL-6 mRNA表达水平较

CS组在明显增加。

3 讨论

COPD已经成为全球性的公共卫生难题，是继癌

症、心、脑血管疾病等之后的第4大死亡原因，具有高发

病率、高死亡率以及高社会经济负担等特点。是多因素

诱发的临床综合征，其发病机制复杂，使得模拟COPD

的病理变化和临床特征十分困难。因此，建立标准化的

和符合临床实际的COPD 动物模型一直是国内外学者

探索的难题。

吸烟在COPD的发生发展过程中占据了重要的地

位，是最重要的危险因素。吸烟者中，约有一半发展为

气流受限，但仅有约 10%~20%发展为有临床症状的

COPD［5］，提示遗传易感性可能是产生COPD的主要因

素［7］。吸烟诱发大鼠气道炎症和COPD是目前常用的

动物模型。良好的吸烟诱发COPD的动物模型的建立

是开展研究的必要条件。然而，现有的动物模型因受多

方面的影响，并不能非常成功的模拟人体的真实发病情

况［8-11］。不同种系的大鼠对烟熏的易感性是有差别的，

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普通的大鼠如SD大鼠对烟熏刺激表现了一定的抵抗

力，被动吸烟［12］或SO2［13］后仅造成轻微的气道炎症反应

和粘液分泌，并且炎症损伤很快恢复。此外，被动吸烟

诱导的COPD大鼠模型建立周期较长，稳定性相对较

差［5］。这是因为普通的大鼠在肺部受到炎症损伤后有

很强的代偿和再生能力［3］。正如易感人群容易患环境

相关的疾病，获得某种遗传易感性的大鼠容易建立相应

疾病的实验模型。研究发现，SH大鼠具有以下基因特

性：全身氧化应激性［14］和炎症反应［15］、高凝状态［16］、免疫

抑制状态［17］、临界状态肺动脉高压［18］，上述均为引起

COPD的发病因素［19］。国外有学者报道，与普通大鼠相

比，SH大鼠更容易形成肺损伤和炎症反应［4, 20］。因此我

们设想SH大鼠可能用于建立稳定的COPD模型。

本实验通过单纯熏香烟及熏香烟加气道注内毒素

两种方法复制原发性高血压大鼠COPD模型。

吸烟及反复下呼吸道感染是人类COPD发病的重

要原因［21］。烟草中含有焦油、尼古丁、过氧化物等化学

物质，可以引起气道上皮细胞及肺泡上皮细胞受损后激

活NF-kB信号通路，引起下游炎症瀑布反应，释放大量

炎症因子，如TNF-α、IL-6［22］，同时诱导炎性细胞浸润，进

一步损伤气道上皮细胞及肺泡上皮细胞，导致慢性气道

炎症及肺气肿［23-25］。在CS组SH大鼠肺组织切片HE染

色，我们也观察到气道壁炎细胞浸润明显，气道上皮细

胞大量受损，杯状细胞、粘液腺体及平滑肌显著增生，管

壁胶原纤维显著增多，肺气肿形成，气道阻力明显增加，

符合COPD病人的表现。同时，我们检测也发现CS组

肺组织NF-kB信号通路明显活化，并且肺泡表面活性物

质中的主要活性成份表面活性蛋白A表达明显减少。

吸烟者气道上皮细胞损伤引起的纤毛运动及防御

功能减弱，增加了肺部感染的可能性。特别是革兰阴性

(G-)菌感染后，在机体免疫系统作用下，细菌裂解释放

出外膜的重要成分LPS，与细胞膜受体 toll 样受体 4

（TLR-4）结合，激活NF-kB信号通路，引起下游炎症瀑

布反应［22, 26-27］。进一步加重肺部的炎症，导致气道上皮

图2 组织病理切片HE染色和肺气肿评分Fig.2 Pathological examination of the right lower lung tissue with HE staining (A-C, Original magnification: ×10; D-F,×40)and emphysema scores (G-I) after 8 weeks of treatment. A, D: Control group; B, E: CS group; C, F: CS + LPS group. DI:Destrction index; MLI: Mean lining intermiment; MAN: Mean alveolar number. *P<0.05 vs control.

Control CS CS+LPS

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0.0

DI

*

*

#

GControl CS CS+LPS

*

*

#400

300

200

100

0

ML

I(μ

m)

H

Control CS CS+LPS

*

*

#MA

N(1

0-4 ·μm

-2)

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0I

A B C

D E F

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图4 各组大鼠肺组织中NF-κB下游炎症因子TNF-因和 IL-6 mRNA表达的变化Fig.4 Expression of TNF-α (A) andIL-6 (B) mRNA in the lungsdetected by Q-PCR. *P<0.05 vscontrol; #P<0.05 vs CS group.

Control CS CS+LPS

*

*

IL-6

mR

NA

6

5

4

3

2

1

0B

Control CS CS+LPS

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

TN

F-α

mR

NA

*

A

Control CS CS+LPS

#

*

*

SP-A

β-actin

SP

-Aβ-

acti

n

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0.0

B

Control CS CS+LPS

#

*

*

NFκB

Histone

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

NF

-κB

/His

tone

A

Control CS CS+LPS

*

*

#

p-Iκ-Kα/β

IκKα/β

p-Iκ

-Kα/β/

IκKα/β

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

C

Control CS CS+LPS

*

*

#

IκB-α

β-actin

IκB

-α/β

-act

in

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

D

图3 Western blot检测各组大鼠肺组织中NF-κB信号通路相关蛋白及SP-A表达的变化Fig.3 Western blotting for detecting expressions of NF-κB signaling related proteins and SP-A in rat lung tissues. *P<0.05 vscontrol; #P<0.05 vs CS group.

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及肺泡上皮受损。我们模拟这一过程，在熏香烟的基础

上，CS+LPS组两周1次气管内注小量内毒素，其主要成

份为LPS。CS+LPS组SH大鼠表现出较CS组更明显

的气道炎症及肺气肿，气道阻力也明显增加。并且肺组

织NF-kB信号通路激活、下游炎症瀑式反应及SP-A减

少都较CS组明显。

本实验中单纯烟熏以及烟熏联合脂多糖建立的高

血压大鼠COPD模型与人类慢性支气管炎及阻塞性肺

气肿在形态学、功能学以及病理生理学上具有相似的改

变，因此，我们认为高血压大鼠建立的COPD模型能够

有效、稳定地模拟人类COPD的发生、发展过程，为揭示

COPD 的遗传背景、诱发因素、发病机制及新药开发提

供良好的实验平台，具有良好的社会和经济效益。

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（编辑：孙昌朋）

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