甜瓜 DUS 测试标准品种 SSR 指纹图谱构建及应用

Author ：张少慧Supervisor: 刘 莉

2013-9-27

一、甜瓜简介一、甜瓜简介

三 四一 二

二、研究背景及进展二、研究背景及进展

三、实验内容三、实验内容

四、参考文献

一、甜瓜简介

甜瓜 (Cucumis melo L.) 是葫芦科 (Cucurbita-ceae), 黄瓜属甜瓜亚属的一种蔓生植物 , 在世界十大水果中仅次于葡萄、香蕉、柑橘、苹果。据统计 , 我国甜瓜的栽培面积和产量均居世界第 1 位 , 为广大城乡人民普遍喜爱的传统夏季鲜食水果。

甜瓜是葫芦科中变异性最为丰富的一个种，不仅在形态学上表现出极大的差异，在生长发育、呼吸跃变以及香气特征等生理生化性状上也表现出丰富的多样性，被称作“多态性种”（黄庆芝， 2011 ）。

二、研究背景及进展

甜瓜品种多、乱、杂的状况严重影响了育种者的权益和甜瓜种业的健康发展，知识产权保护问题日益严峻。中国甜瓜在生产中普遍存在同名异物或同物异名现象，恶性事件不断，尽管近些年来随着中国种子企业素质的提高，低劣种子造成生产损失的事件在减少，但品种真实性的纠纷仍在增加。为解决甜瓜种子经营中的纠纷与市场混乱问题，有必要建立中国甜瓜品种的核酸指纹库，为品种真实性鉴定提供技术支撑。

2.1研究背景

DUS 测试工作，即特异性（ Distinctness ）、一致性（ Uniformity ）和稳定性（ Stability ）测试，为品种鉴定提供了新的途径，愈来愈受到重视（张晗等， 2011 ）。 DUS 测试根据其特异性、一致性和稳定性的试验结果 , 可以判定测试品种是否属于新品种 , 为植物新品种保护提供可靠的判定依据。李汝玉等（ 2001 ）认为 , SSR 标记是植物品种特异性鉴定的最好方法。吴渝生等（ 2003 ）、李晓辉等（ 2005 ）、王凤格等（ 2003 ）、赵久然等（ 2003 ）、张金渝等（ 2006 ）对玉米品种 DNA 指纹图谱的构建进行了大量研究 , 建立了用于品种鉴定的 SSR 标准体系并确定了绘制指纹图谱的 SSR 核心引物。陆光远等（ 2008 ）用 SSR 标记分析油菜品种的特异性和一致性 , 表明 SSR 标记是适合开展油菜品种 DUS 测试的鉴定技术。

2.1研究背景

传统的 DUS 测试主要以形态特征为基础，受环境影响大、稳定性差，测试周期长，其标准统一的品种描述和测试技术规程，在实际操作过程中较难执行，严重影响 DUS 测试的有效性和权威性（陈海荣等， 2002 ）。由于形态 DUS 测试存在本身固有的缺陷 ,寻求快速、简便、准确的测试方法 ,使之成为形态 DUS 测试的有效辅助手段 , 是当前面临的重要研究课题。近年来 ,DNA分子标记技术发展迅速 ,

已被广泛应用于甜瓜遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位、杂交种鉴定等多个方面。 DNA分子标记技术应用于新品种 DUS 测试的优越性是显而易见的 ,

如多态性高 ,较少的标记就可满足鉴定的需要 ; 测试周期短 , 不受季节的限制 ,任何时候都可进行测试 , 可大大缩短时间 ; 不受环境的影响等 (Dolores Velez 等， 2012) 。

2.2 DUS测试研究进展

分子标记是继形态标记、细胞学标记、生化标记之后发展起来的新的一种遗传标记，反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的 DNA片段，直接反映了基因组 DNA间的差异，有许多明显的优越性，表现为： (1)直接以 DNA 的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题； (2)数量极多，遍布整个基因组； (3) 多态性高，自然界存在许多等位变异。无须人为创造； (4) 表现为中性，不影响目标性状的表达； (5)许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体．根据其核心技术可将其分为三大类。第 l类是以分子杂交 (Southern 杂交 ) 为核心的标记技术，包括 RFLP 标记、 DNA 指纹技术、染色体原位杂交等；第 2类是以聚合酶链式反应 PCR 技术为核心的标记技术，包括RAPD 、 SSR 、 ISSR 、 AFLP 、 STS 、 SCARs 、 AP—PCR 、 SRAP 标记等；第 3类是一些新型的分子标记，如 SNP 标记， EST 等（许勇等， 1999 ）。

2.2 DUS测试研究进展

目前， SSR （ simple sequence repeats ）技术被认为是植物新品种测试中较理想的标记技术， SSR 即简单重复序列，又称微卫星 DNA(Microsatellites) ，是一种基于 DNA 长度多态性的分子标记技术。已经成功应用于油菜（陆光远等， 2008 ）、水稻（程本义等， 2008 ）、小麦（王立新等， 2010 ）、玉米（张华生等， 2011 ）、番茄（ Cooke 等， 2003 ）等多种农作物的 DUS 测试。

2.2 DUS测试研究进展

SSR分子标记技术在甜瓜品种（系）鉴定及多样性的研究上均有报道。赵娜等 (2009) 与盛云燕等 (2006)分别采用 61 对和 50 对 SSR 特异引物对甜瓜材料进行分析。以上结果均表明基于分子标记进行分析的结果与传统甜瓜分类基本一致。王美荣等 (2010)利用 SSR 标记技术对 21 份厚皮甜瓜品种组合进行 DNA 指纹分析，筛选合适的多态性引物，初步建立了其 SSR 指纹图谱；艾呈祥等 (2006)

在比较分析各试材图谱的基础上，探讨了品种指纹图谱的统计学方法，并对构建的

2 个甜瓜杂交种的指纹图谱进行了可信度分析，建立了适于种子检验中使用的标准

SSR 标记指纹图谱。

2.3 SSR分子标记在甜瓜图谱上的应用进展

一个完善的核酸指纹库在建库材料上要具有代表性与完备性，要有足够多品种（系）的标准指纹图谱，并且在核心引物的选择上也要有一定的标准 ( 王凤格等，2005) 。所谓核心引物，是指多态性、稳定性和重复性等综合特性好并可作为初步研究优先选用的一套引物。在初期研究中，将多态性高低作为核心引物选择的最重要指标，并结合扩增带型统计的难易及引物的重复性高低，但是经过进一步大量研究及实践发现，随着大量 DNA 指纹数据的产生，扩增带型统计的难易作为核心引物选择的最重要指标，在该原则指导下，随着试验的进一步深入，可能会有更好的引物不断补充到核心引物中，某些引物也会从核心引物中去掉。因此，核心引物的确立又是一个不断调整及不断优化的过程。

2.3 SSR分子标记在甜瓜图谱上的应用进展

马铃薯（ Schneider 等， 1997 ）、玉米 (Heckenberger 等， 2002) 、柑橘(雷天刚等， 2009) 等粮食、果树作物都已经进行了指纹图谱库的构建，其中最成功的案例为中国玉米标准 DNA 指纹数据库，并且玉米 DNA 数据库管理系统网站也已经正式开通（ www.maizeDNA.com.cn ），至今累计完成近万份玉米品种的标准指纹入库，完成了大量品种管理部门及企业等委托的品种鉴定工作，而甜瓜指纹图谱库的研究尚未见报道。

2.3 SSR分子标记在甜瓜图谱上的应用进展

三、实验内容

（ 1 ）材料筛选：选取差异较大的不同品种的甜瓜材料； （ 2 ）甜瓜核心引物的开发及基本库和扩展库的建立：采用生物信息学的方法在甜瓜整个基因组序列上搜索 SSR位点，针对具有自主知识产权的甜瓜不同生态类型的品种开发出多态性高、稳定性、重复性好，不同谱带之间大小容易区分，在染色体上均匀分布，能够覆盖全基因组的核心引物。依据引物多态性的不同分为基本核心引物和扩展核心引物，并建立相应的数据库。

3.1 实验内容

3.1 实验内容

（ 3 ）甜瓜品种真实性鉴定：根据国家现行对主要农作物品种试验 DNA 指纹鉴定管理的一般办法，选取 20对核心引物对具有自主知识产权的甜瓜 3 －

5 个品种进行检测，对于 SSR 测试的电泳结果数据进行统计分析，仅有 1 个位点差异为近似品种， 2 个以上位点有差异为不同品种，所有位点相同为疑似相同品种。对上述疑似近似品种与相同品种再增加引物进行检测，最终以SSR 标记相似度大于或等于 95％的品种定为相似品种或相同品种。（ 4 ）不同品种甜瓜 DNA 指纹图谱构建：首先进行指纹代码构建，采用英文字母和数字组合对每个核心引物多态性位点赋值，记录每个品种经不同的核心引物扩增获得的多态性位点，形成由字母和阿拉伯数字组成的该品种 SSR

指纹代码，并使用二维码转换工具建立指纹图谱 QR二维编码；

3.1 实验内容

（ 5 ） SSR 标记甜瓜 DUS 标准品种遗传多样性分析：采用 NTSYS-PC

2.02软件，采用非加权配对算术平均法 (UPGMA) 建立遗传相似系数聚类图，并分别对形态标记、分子标记计算出的遗传聚类结果进行比较，获得其遗传相似系数相关散点图并计算二者的相似系数；（ 6 ）甜瓜杂交种纯度快速检测体系的建立：从核心引物中筛选甜瓜 3 － 5

个杂交种的共显性引物，找出具有条带清晰，共显性明显的引物组合，用来鉴定甜瓜杂交种的纯度。 研究从浸种催芽、种子及根尖 DNA 提取、 PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 到银染检测的整个实验过程中的技术要点，摸索实验条件细节，建立简单、快捷、经济、高效的整套实验检测体系。

3.1 技术路线

3.3试验进度安排

根据本课题的研究目的和具体要求，拟定下述步骤完成课题。2013-06 ～ 2013-09 查找文献； SSR引物查找并合成；2013-10 ～ 2013-12 试验材料筛选；2014-01 ～ 2014-06 核心引物的筛选；

2013-07 ～ 2013-11 遗传多样性分析及指纹图谱构建； 撰写及发表论文；

2013-12 ～ 2014-03 补充试验、试验结果的整理；2014-03 ～ 2014-06 论文的撰写及答辩阶段

四、参考文献

[1] Naito Y, Suzuki S, Iwata Y, Kuboyama T. Genetic diversity and relationship analysis of peanut germplasm using SSR markers.Breeding Science, 2008, 58: 293-300. [2] 黄庆芝． 温室春季栽培甜瓜品比试验［ J］． 天津农业科学， 2011 ， 17( 4) :150 － 152． [3] 赵 娜 , 周 晶 , 杨文才 , 沈火林 , 谭 芳 , 郭 爽 , 王银磊 . 厚皮甜瓜遗传多样性的 SSR 分析 . 中国瓜菜 , 2009(5):5-10. [4] 盛云燕 , 栾非时 , 陈克农 . 甜瓜 SSR 标记遗传多样性的研究 . 东北农业大学学报 , 2006, 37(2): 165-170. [5] 王美荣 , 许 勇 , 詹永乐 , 郭绍贵 , 任 毅 , 宫国义 , 张海英 .厚皮甜瓜品种组合 SSR 指纹图谱构建 . 中国农学通报 , 2010, 26(20):47-51. [6] 艾呈祥 , 余贤美 , 马国斌 , 刘庆忠 . 甜瓜杂交种 SSR 指纹图谱的构建 . 果树学报 , 2006, 23(3): 415-419. [7] 王凤格 , 赵久然 , 郭景伦 , 孙世贤 . 中国玉米新品种标准 DNA 指纹库构建研究的几点思考 . 植物学通报 , 2005, 22(2): 121-128.[8] Schneider K, Douches D S. Assessment of PCR-based simple sequence repeats to fingerprint north American potato cultivars.American Journal of Potato Research, 1997, 74: 149-160.[9] Heckenberger M, Bohn M, Ziegle J S, Joe L K, Hauser J D, Hutton M,Melchinger A E. Variation of DNA fingerprints among accessions within maize inbred lines and implications for identification of essentially derived varieties. I. Genetic and technical sources of variation in SSR data. Molecular Breeding, 2002, 10: 181-191.

[10] 雷天刚 , 何永睿 , 吴 鑫 , 姚利晓 , 彭爱红 , 许兰珍 , 刘小丰 , 陈善春 . 柑橘栽培品种( 系 )DNA 指纹图谱库的构建 . 中国农业科学 ,2009, 42(8): 2852-2861.[11] 许勇 . 张海英 . 康国斌 . 王永健 分子标记技术在西瓜甜瓜上的应用研究进展 [期刊论文 ]- 中国西瓜甜瓜 1999(4) [12] 李汝玉 ,宋国安 ,杨平平 .利用 SSR 标记进行品种权有争议品种的鉴定 [ J ]. 种子 , 2001 ( 1) : 66 - 67[13] 吴渝生 ,杨文鹏 ,郑用琏 . 3 个玉米杂交种和亲本 SSR 指纹图谱的构建 [ J ]. 作物学报 , 2003, 29 ( 4) : 496 – 500[14] 李晓辉 , 李新海 , 高文伟 , 等 . 玉米杂交种 DNA 指纹图谱及其在亲子鉴定中的应用 [ J ]. 作物学报 , 2005, 31 ( 3) : 386 - 391[15] 王凤格 , 赵久然 ,郭景伦 , 等 . 中国玉米新品种 DNA 指纹库建立系列研究 I. 玉米品种纯度及真伪鉴定中 SSR技术标准实验体系的建立 [ J ]. 玉米科学 , 2003, 11 ( 1) : 3 - 6[16] 赵久然 , 王凤格 ,郭景伦 , 等 . 中国玉米新品种 DNA 指纹库建立系列研究 Ⅱ .适于玉米自交系和杂交种指纹图谱绘制的 SSR 核心引物的确定 [ J ]. 玉米科学 , 2003, 11 ( 2) : 3 - 5, 8[17] 张金渝 , 张建华 ,杨晓洪 , 等 . 玉米 DUS 测试标准品种的 SSR分子指纹图谱的构建 [ J ]. 玉米科学 , 2006, 14 ( 4) : 47 – 52[18]陆光远 ,伍晓明 , 张冬晓 , 等 . SSR 标记分析国家油菜区试品种的特异性和一致性 [ J ]. 中国农业科学 , 2008, 41 ( 1) : 32 – 42[19] 张晗 ,姚凤霞 , 刘永杰 , 等 .EST-SSR 标记在冬小麦品种 DUS 测试中的应用 [J].麦类作物学报 , 2010,30 (5):801-806[20]陈海荣 ,顾晓君 .浅谈西瓜新品种的保护 [J]. 中国西瓜甜瓜 , 2002, (4):36-37[21]M. Dolores Velez, Javier Ibanez. Assessment of the uniformity and stability of grapevine cultivars using a set of microsatellite markers[J]. Euphytica, 2012, 186: 419-432

请各位老师、同学指正

谢谢