1

העברת אניונים דרך קרום תא דם אדום

מבוא

הוא תוצר של מערכת התמיינות רב שלבית שמיקומה במוח . תא דם אדום הוא תא מיוחד במינו

, מספר רב של הורמוני גידול וגורמים ממיינים אחרים משתתפים בתהליך התמיינות זה. העצמות

.כפי שהוא מופיע בנוזל הדם, שסופו הוא תא דם אדום

, מוקף קרום תאי דו שכבתי קלאסי, )Hb(מבוגר המוזרם לזרם הדם הוא מלא בהמוגלובין התא ה

התא הבוגר הוא גמיש הודות לקרום תאי המתוחזק בפיגומים רשתיים . אך חסר אורגנלות פנימיות

גמישות זו היא חיונית . מתכווצים שגם מקנים לו את צורתו האופיינית הדו קערורית) שלדיים(

.דרך המעברים הצרים בנימים ושנחשף תוך כדי כך ללחצים פיזייםלתא העובר

­Hb בגוף הודות ל­O2 הוא הנשא העיקרי של ה, מחד. הייחודיות שבתא הדם האדום היא כפולה

מהגוף ­CO2 מאידך הוא גם הגורם העיקרי התומך בסילוק ה. אשר מרווה את תוכנו הציטוזולי

ממסת ­1/4 כ(ויה בקרום התא בכמויות משמעותיות הודות למערכת נשאים של אניונים המצ

). ממסת המשקל היבש של הקרום­1/8החלבונים של הקרום או כ

ש צורך במערכת העברת אניונים

Cהנפלט בתהליכי גליקוליזה ונשימה נמס כ ­CO2חלק קטן . בנוזלי הגוף בצורה מוגבלת

:יה הספונטאנית עם המיםידי הריאקצ­ על­­HCO3 כול להיהפך ל

CO2+ H2O ↔ H2CO3 ↔ HCO3- + H+

למה י

­O2ה

ממנו י

2

ידי הדם יהיה יעיל חייב תהליך ההמסה להתרחש בזמן שתאי ­ על­CO2 אך על מנת שסילוק ה

. התהליך הספונטאני אינו מספיק. ) בממוצעשניות- מילי 50 -ב(הדם האדומים עוברים דרך הנימים

נוספים נהפכים ­5% וכ, נקשר להמוגלובין30%, בפלאזמה נמס ­CO2 מכלל ה ­10% כ

כאן התפתחה מערכת משולבת ? מה עם היתר. ידי הדם הזורם­ ונישאים על­­HCO3 ספונטאנית ל

.מעניינת ביותר

שהתמוסס בנוזל הרקמות עובר גם בדיפוזיה לתוך הציטוזול של תאי הדם וכאן בעזרת ­CO2 ה

­HCO3 הוא נהפך במהירות ל) carbonic anhydrase=CA(האנזים קרבוניק אנהידראז - + H+ .

גרמו לעליה בריכוזי ­­HCO3 והפיכתו ל­CO2 האיזון החשמלי לא מופר אך כביכול המסת ה

).­pHירידה ב (H+ -ה

הנוצר­­3HCO מה קורה ל

HCO3 ר מומס כן נוצר יותCO2וככל שיותר , ריכוזו עולה בתא הדם האדוםעד להגעת -

מסך כל נוזלי ­30% הנוזל הפנימי של תאי הדם האדומים מהווה רק כ. הריאקצייה לשיווי משקל

­HCO3 הדם ולכן נותרת הבעיה כיצד להעביר את התאי הדם (. מתוך הכדוריות לשאר נוזל הדם -

וזל זמין להמסת מסך כל נפח התא האדום הוא נ70% מסך כל נוזל הדם אך רק ­45% תופסים כ

HCO3 ­ ו­Clהמשחלף בין יוני , כאן נכנס לתמונה נשא האניונים. )חומרים הנקרא -

anion exchanger 1 (AE1) החלבון הקרומי אוBAND 3. Cl- המצוי בנוזל הדם משתחלף עם ה-

HCO3 CO2 בתור ­40% כCO2:וכך הופך כל נוזל הדם זמין להשאת , שבתא עד לשווי משקל -

­HCO3 היתר כוהזמן הדרוש : הוא מהיר ביותר האניוניםמשחלףהמבוצע על ידי התהליך . -

התהליך אינו דורש. מהיונים הוא קצר מזמן המעבר של תאי הדם האדומים­1/2 לשחלוף של כ

, והוא יוצא לפועל בצורה מתווכת אך בלי שינויים במטענים החשמליים, השקעת אנרגיה חיצונית

עבור יונים חד 1:1 והסטוכיומטריה של השחלוף היא )הכרחי(א אובילגטורי שכן השחלוף הו

.ערכיים

TissueCarbonicanhydrase

Plasma

-

(

AE1 Cl-HCO3

-

HCO3- carried in RBC

H++HCO3-

H2CO3-

Hb

HbCO2CO2

TissueCarbonicanhydrase

Plasma

-

(

AE1 Cl-HCO3

-

HCO3- carried in RBC

H++HCO3-

H2CO3-

Hb

HbCO2CO2

תכלית פעילות–נשא האניונים של תא הדם האדום בדם CO2 היא

ולהגדיל את כושר השאת ה

AE1לשחלף תפקידו הקרומי הוא Cl - HCO3 -ב -

תכלית פעילותו של נשא האניונים בתא דם אדום היא להגדיל את בדםCO2-כושר נשיאת ה

3

H+­ מה גורל ה

Hb -ידי ה- עלH+קליטת . הציטוזולי­pH וכך נמנעים שינויים בHb -ידי ה- שנוצר נקלט עלH+ -ה

ת לרקמוO2 - ומזרזת את שחרור הO2 - לHbמביאה גם לידי הקטנת האפיניות בין

(Bohr effect).

ושימורו , הנוצר ברקמותCO2בסך הכל הכוח המניע העיקרי במערכת הוא הלחץ החלקי הגבוה של

בהגעת הדם . )לכוון הריאות( באמצעות זרם הדם CO2 -ידי סילוק ה על,של מפל לחצים זה

מתרחש אותו התהליך שתיארנו קודם לכן , הוא נמוך ביותרCO2בהם הלחץ החלקי של , לריאות

לעומת זה ( בדם CO2כאן הכוח המניע הוא הלחץ החלקי הגבוה של . אך בכוון הפוך, ברקמות

HCO3 - וCO2 - מהדם הרווי בCO2 - לעצמך איך מסולק ה)י(תאר. )שבחללי הריאותכל . -

שכן כל (אך בכוון ההפוך , המשתתפים שתיארנו קודם לכן פועלים גם בתהליך המתרחש בריאות

.)!השלבים הם הפיכים

המנגנון הבסיסי של העברת האניונים

Cl- ו-HCO3HCO3. יונים העיקריים בנוזלי היונקיםאנ הם ה -

. הפיזיולוגי) buffer( הוא הבופר -

ואין כמעט עדיפות של יון אחד על mM 10האפיניות של שני יונים אלה לנשא האניונים היא בערך

. א לשיווי משקל את שני היונים באותה יעילותכך שמערכת שחלוף האניונים תשאף להבי, משנהו

­Cl ,­ Cl - ב­Clיכולה המערכת לשחלף גם , ל"בנוסף ליכולת המערכת לשחלף את שני היונים הנ

ין הוא שלמרות יהמענ. 2SO4- ביונים לא פיסיולוגיים כגון ­Cl וגם ),-I-, Br (בהלידים אחרים

/ 2SO4–שהשחלוף -2SO4 איטי מהשחלוף יותר 105הוא פי­Cl- / Cl הוא עדיין מראה תכונות

מראה רוויון עם , ­pH תהליך הטרנספורט תלוי ב. ­Cl- / Clקינטיות ומנגנוניות דומות לאלה של

ותלות מאד גדולה , ) mM 30 הואpH °25 , 7.4 - ב2SO4- עבור ­Km ה(ריכוז הסובסטראט

SO4 °0 -ב(בטמפרטורה מנת ­ ורגישות לסדרה גדולה של מעכבים שפותחו על) אינו עובר כלל -2

נקודה המבדילה בין המעבר של שני סוגי האניונים היא האופן . לאפיין את המערכת מבחינה כימית

.­pH בו תלוי המעבר ב

SO42-\ SO4

2- Cl-\Cl-

pH 6.0 7.0 8.0

3.0 3.0

2.0 2.0

1.0 1.0

SO42-\ SO4

2-Cl-\Cl-

x10-5 שטףשטף

Equilibrium exchange (relative pH 6.8)

E++ E+

SO42-\ SO4

2- Cl-\Cl-

pH 6.0 7.0 8.0

3.0 3.0

2.0 2.0

1.0 1.0

SO42-\ SO4

2-Cl-\Cl-

x10-5 שטףשטף

Equilibrium exchange (relative pH 6.8)

E++ E+

pH-וריד או סולפאט בתלות שחלוף כל

מתאימה למודל של נשא מטוטר

4

או , ומם חשמלית והעובדה שהמנגנון הבסיסי של העברת האניונים הוא ד­pH התלות ההפוכה ב

היונים עוברים לא כיונים חפשיים אלא כשהם מצומדים לקבוצה קרומית , היינו(אלקטרוניוטראלי

הביאו חוקרים לידי המחשבה שיש בנשא קבוצות צדדיות )כך שהצמד ניוטראלי­ הטעונה חיובית

והמשתתפות בתהליך הקשירה וההעברה של­pH של חומצות אמינו אשר נטענות כתלות ב

נשא שיכול להיטען עם אחד או שני E - את הפנים ובi - ב, o -אם נציין את החוץ ב. האניונים

: בכל צד של הקרום יהיוEאזי צורות המעבר של , pH -מטענים חיוביים כתלות ב

EEEHH⎯⎯→←⎯⎯→← ++

+++

) הוא האניוןX ) EX יוכלו לקשור ולהעביר אניונים על מנת שהצמד E++ - וE+אך רק הצורות

). 2SO4- ( X ­2או 2X ­ יעביר או ++E - ו, ) -­X) Cl יעביר רק +Eאזי .ייהיה ניוטראל

:ידי הסכימה הבאה לצורות השונות עלE - בצורה סכמטית ניתן לתאר את מעבר ה

[ECl]o↔ [E+]o↔ [E++]o↔ [ESO4]o

[ESO4]i[ECl]i↔ [E+]i ↔ [E++]i ↔

H+Cl-

H+ SO4=

in

outCl-

SO4=

-Cl הקושר +Eעובר פרוטונציות ומשיג מבנה ) TITRATABLE CARRIER(הנשא המטוטר

SO4הקושר ++ E הומבנ EClונותן קומפלכס נויטראלי ESO4ונותן קומפלכס נויטראלי =

פונג­מנגנון הפינג

התלות הכמעט מוחלטת של שחלוף האניונים בהימצאותם של יונים משני צדי הקרום יכולה להיות

ידי שני שלבים עוקבים ­האחד הוא מעבר על: ידי שני מנגנוני העברה שונים­מוסברת על

)sequential (זמני ­ידי מעבר בו­והשני על) (simultaneous . הראשון מצוין בסכימה שלעיל בה לכל

E אתר אחד בלבד ליונים שיכול להיות או במצב E+o או E+

i )לפני קשירת ה ­­Clלמשל ( .

המנגנון האלטרנטיבי . כשרק יון אחד עובר מצד אחד לצד שני, פונג­ן פינגהסובסטרט עובר במנגנו

אחד הפונה החוצה והשני , הוא מנגנון סימולטני והוא דורש בו זמנית שני אתרים לאניונים בכל נשא

.הפונה פנימה

5

אתר קישור אחד לאניונים הנחשף לסירוגין כלפי חוץ או כלפי פניםלמשחלף

קרבונאט על ידי משחלף האניונים- כלוריד בימעבר

So+ Eo

So

ESo

Si + Ei

Si

Ei

Ei

Eo

Eo

ESiEi

ESi

Eo

ESo

סימטריה ואסימטריה

ידי הדגרת התאים בתמיסות אדומים עלכעיקרון ניתן להחליף את התוכן האניוני של תאי דם

את פעילות הנשא . 2SO4- ביוני ­Cl - את כל יוני החליףכך למשל ניתן לה. בעלות הרכב יוני שונה

2SO4-י מעקב אחר העברת "ניתן לבדוק ע35

במידה , י יציאה" או ע,י כניסה"או ע, דרך קרום התא

באותה מידה ניתן ללמוד על . מוקדמתי הדגרה "והתאים הועמסו עם החומר הרדיואקטיבי ע

.-36Clי מעקב אחר מעבר היון "תכונות המערכת ע

יםשני סובסטראטים מסומנים באיזוטופבעזרת ניסויים שנעשו עם ננסה ללמוד על המערכת

, ובמעכבים תחרותיים הנגישים רק לצד החיצוני של קרום התא , 235SO4- - ו-36Cl םראדיואקטיבי

מטרתנו . SO4לגבי ל" וכנClo ובחוץ Cli - נרשום את יוני הכלור בפנים כ.י חדיריםעקב היותם בלת

.היא לבחון את מודל הפינג פונג מבחינת זמינות אתרי הקישור לאניונים בצד החיצון של הקרום

2SO4- - במערכת בה הועמסו התאים ב35

2SO4- - ייצא ה, Clוהורחפו במדיום 35

החוצה באמצעות

2SO4- - תנאים אלה של בדיקת מעבר ה.1AE הנשאניתן גם לעקוב אחר .סימטריים- א הם תנאים 35

2SO4-יציאת 35

2SO4 בהם הורחפו התאים במדיום המכיל סימטריים בתנאים למדיום ל ניתן "כנ. -

או אחרי שהתאים ) שטף פנימה (Cl - או על ידי הוספתו למדיום עתיר 36Cl - -לבדוק את מעבר ה

).שטף החוצה (36Cl - םהועמסו ע

באיזו מהירות היית מצפה שהסולפאט ייצא מתא המכיל רק סולפאט כאניון חדיר לעומת תא

? המורחף במדיום המכיל כלוריד כאניון חדיר

6

2SO4-אם נבדוק את המהירות ההתחלתית של יציאת 35

במקום Cloשהועמס בתאי דם לתוך מדיום

o-2SO4מה נצפה לראות ?

יש לזכור . וברר לעצמך את מסלולי היציאה האפשריים של הסולפאטהבאה תכל בסכימה הס

iשהמעבר -2ESO4 ­ o

-2ESO4נוכחות . הוא האיטי ביותר בסכימה הכלליתClo תזרז את מעבר

בצד הפנימי וזה יגביר את מהירות השטף של ESO4 2–הנשא פנימה כך שבכל רגע ורגע יימצאו יותר

.סולפאט החוצה

[ECl]o↔ [E+]o↔ [E++]o↔

[ECl]i↔ [E+]i ↔ [E++]i ↔

[ESO4]o

[ESO4]i

H+

H+

in

outCl-

SO4=

נוטה המערכת , בתנאים בהם סולפאט הוא היון שבתא וכלור היון החיצוני: לפי סכימת הראקציה

++Eלהיות בעיקר במצב של iו ­[E-SO4]i , בגלל שמהירויות המעבר של כלוריד הן הרבה יותר גבוהות

לעומת תנאים קצב יציאת הסולפאט יגבר בתנאים אסימטריים אלה , דהיינו. מאלה של סולפאט

. סימטריים

++Eנוטה המערכת להיות בעיקר במצב של , כשסולפאט בחוץ וכלור בפנים, במקרה ההפוךo

:o[E-SO4]­ ו

[ECl]o ↔ [E+ ]o ↔ [E++]o ↔

[ECl]i ↔ [E+ ]i

[ESO4 ] o

↔ [E++]i ↔ [ESO4 ]i

H+Cl-

H+ SO4=

in

out

7

2SO4-בתנאים אלה תהיה הכניסה של 35

לתוך התאים יותר מהירה מאשר בתנאים בהם סולפאט הוא

. האניון שבפנים התא

2SO4- אם במקום 35

מה היית מצפה יהיו , כבחן למדידת שטפי אניונים -36Cl ­ב היינו משתמשים

כלוריד (לעומת סימטריים ) סולפאט בחוץ( בתנאים אסימטריים -36Clההבדלים במהירות היציאה של

.השתמש בסכימה לצורך הברור? )בחוץ

את הזמינות של אתרי הטרנספורט על שטח פני התא ניתן לבחון גם על ידי בדיקת הקישור של

את תכונות . גדולה יחסית לאתר הקישור של האניוניםאפיניותבלתי חדיר אך בעל ובסטראט ס

לשטח פני התאים במדיום סובסטראט הקשירה ניתן למדוד ישירות על ידי מדידת קשירת ה

]. SO4o- Cli[ו ] [Clo - SO4i--: או אסימטרי ] SO4 -SO4[או ] Cl-Cl[סימטרי

?יים השוניםמה נצפה לראות בתנאים הניסו

היבטים ביוכימיים

המבנה שלו , בודד ושוחזר לתוך מערכת מלאכותית, זוההAnion Exchanger נשא האניונים

בקרום נחקר בצורה מקיפה וגם הגן שלו שובט ורצף חומצות האמינו נקבע הן מרצף הנוקלאוטידים

איזומורפיות עיקריות של צורות 3קיימות . והן ישירות במקטעים של החלבון המבודד­cDNA ב

בתא הדם . היא הצורה המופיעה בתאים אריטרואידיים­AE1 כש , ­AE (AE1, AE2, AE3) ה

פעם 12-14חוצה את הקרום ,100,000האדום האנושי החלבון הוא בעל משקל מולקולרי של

. ממברנליים­י מקטעים טרנס"הפעילות נישאת ע. מהמסה עגונה בתוך הקרום­55%וכ

The organization of the RBC membrane proteins. The organization of the RBC membrane proteins.

העיקרי של הקרום תא הדם ) GLYCOPROTEIN(מזוהה כחלבון AE1האניונים -משחלףדימרים שחלקם קשורים לשלד ל יושב בקרום כ"הנ) . BAND -3 (3-האדום ונקרא בשם פס

)המקנה לו תכונות אלסטיות ופלאסטיות(התא

8

פועלים רק על , היינו(ימת קבוצה של מעכבים לנשא האניונים אשר אינם חודרים לתוך הכדורית קי

חומר אחד . stilbene disulfonic acids והם הסטילבן דיסולפונאטים )צדו החיצוני של קרום התא

dinitro-2,2'-stilbene disulfonate (DNDS-'4,4(הנגזרת די ניטרו סטילבן דיסולפט , מקבוצה זו

ניתן להשתמש גם . שפעולתו הפיכה וספציפית על מערכת מעבר האניונים, הוא מעכב תחרותי

בנגזרות בעלות כושר קשירה קובלטי ובעזרתן ניתן לסמן ספציפית את החלבון האחראי

.לטרנספורט של אניונים ולערוך עליו בדיקות כימיות

9

ניסויה

ניסוי סימולציה המבוסס על תוצאות ו) מעבדה רטובה(להלן תאור הניסוי המעבדתי

לפיו כל זוג תלמידים יקבל , במעבדה נערוך רק את הניסוי היבש). ניסוי יבש(ניסוייות

.ח המעבדתי"אותן הוא ילמד לנתח ועל פיהן הוא יערוך את הדו, תוצאות ניסוייות

על . שניתנות כאן לצרכי הדגמה בלבד, ההערות הבאות מתייחסות לניסוי המעבדתי

אורטי והכרת חומר המעבדהיהחובה לבוא עם ידע ת) ה(תלמידה

"רטוב" לניסוי ההנחיות כלליות

תלמיד שלא . ולא כהנחיות לבצוע מעבדתי- פרוטוקול המעבדה הניסויית מובא רק לצורך הדגמה

.יש להתארגן בזוגות. לא יורשה להשתתף במעבדה) עם ידע תיאורטי על נושא המעבדה(יגיע מוכן

)המעבדתי(טרת הניסוי מ

2SO4-( האניון סולפאט רדיואקטיבי יבדק השטף שליבניסוי זה 35

דרך קרום תא הדם האדום )

). ראו פרקים הנוגעים למערכת זו באתר הקורס(, AE 1המוצא לפועל על ידי מערכת הטרנספורט

ניתן לעקוב ניסויית האניון הנידון נבחר לניסוי זה בגלל היותו סובסטראט למערכת ובגלל העובדה ש

אחרי תנועותיו דרך קרום התא הדם האדום בקלות יחסית בעזרת שיטות הזמינות במעבדת

דבר הדורש מיכשור מיוחד , העובר את הקרום בחלקי שניותClלעומת האניון הטבעי (תלמידים

). ומיומנויות ייחודיות

בעזרת סמנים מים ביולוגיים דרך קרו היא ללמוד את הטכניקה של מדידת שטפים סוינימטרת ה

, pH, השפעת טמפרטורה(בכלל ים וללמוד על מספר תכונות של דיפוזיה מזורזת ירדיואקטיב

על ידי הצבת (בפרט ) הכרחי(ושל מערכת שחלוף אובליגטורי ) במקרה הנידון DNDS -מעכבים

יותר מהר מהשני אך הראשון העובר כמה סדרי גודל , 2SO4 ו Cl: בשני צדי הקרום-אניונים שונים

אשר , )gluconate(אניון אחר שיעשה בו שימוש הוא גלוקונאט ). בעל אפיניות דומה בקישור לנשא

דבר המאפשר לשנות בתמיסה את ריכוזי האניונים שהם , AE 1 - ישמש כאניון שאינו סובסטראט ל

שהיא מתכונתית (מבלי לשנות את העצמה היונית של המדיום , כן סובסטראטים באחרים שהם לא

).כ ריכוז היונים החיוביים והשליליים בתמיסה"לסה

, בה התלמידים יקבלו קבצים של תוצאות ניסוייות, עיקר העבודה תעשה במעבדה וירטואלית

. לעבד ולנתח בעזרת מחשב, אותן הם ילמדו לסכם

תאור הניסוי

טעינת התאים. א

תא בפנים תחילה להחליף יש צורך, 2SO4- ו Cl על מנת ליצור תנאים אסימטריים מבחינת היונים

. באופן חלקי או מלא, SO4 2–­ ב ­Clאת האניון העיקרי

עד להגעתם לשיווי ) ClST) NaCl / Na2SO4התאים יודגרו בתמיסות איזוטוניות של תחילה . 1

. Na2SO4 0.1mM; NaCl 135 mM) - מורכב מClST(משקל יוני בין הפנים והחוץ

10

הכוללת גםNaCl / Na2SO4התאים יעברו טעינה עם תמיסה איזוטונית של לאחר מכן .2

S) Na235SO4

. ) β הפולט קרני S הוא איזוטופ רדיואקטיבי של 35

2SO4-­ בטמפרטורה זו ה( ­C°0 בתום הטעינה התאים יעברו שטיפה עם תמיסה איזוטונית ב. 3

. )אינו עובר דרך קרום התא

בדיקת השטף . ב

­S35 עקב אחר הופעת העשה מ בתמיסות שונות ובטמפרטורות שונות ונ מורחפיםתאים טעונים

2SO4-היינו (ידי סרכוז את ­ידי כך שאנו נפריד על­מעקב זה יעשה על. בתמיסה החיצונית ) 35

. )ף החוצהשט( effluxשיטה זו נקראת . התאים מתמיסת השטף ונדגום דוגמאות מהנוזל העליון

ידי שחלוף עם החומר החיצוני ­ יוני בין הפנים והחוץ עלשיווי משקלכששיטה זו מבוצעת בתנאי

SO4) היינו ( ­35S שאינו מסומן באת ). (EEe Equilibrium Exchange efflux היא נקראת2-

מהנפח הכללי ­2% פחות מ(הניסוי נבצע כך שכמות התאים בנפח הבדיקה תהיה קטנה ביותר

ולכן , שהנפח החיצוני הוא אינסופי ביחס לנפח התאים עצמםרושו של דבריפ. )יהיה נפח התאים

או זמן לשיווי משקל , זמן זה נקרא זמן אינסוף. מן התאיםSO4 2-­ אם נחכה מספיק זמן יצא כל ה

, TCAואנו נעשה זאת בעזרת , ידי פיצוץ התאים­ניתן כמובן לצמצם זמן זה פשוט על. איזוטופי

.ומצה טריכלורואצטיתח

תוצאות הניסוי. ג

.Excelכל תוצאות הניסוי יינתנו לכם מראש בצורת קובץ ' יבשה'כיוון שזוהי מעבדה

)2נספח (הוראות לפתיחת קובץ התוצאות

sulfate.xlsקובץ הבנה מ בנוזל החוץ תאי בזמנים ) 35S (יבירדיואקטל מכיל תוצאות ניסיוניות של הופעת חומר ”קובץ הנה

35Sתוצאות אלה הן מדידות של ראדיואקטיביות של . שונים כפי שמוסבר בחוברת המעבדה

-B( שהתקבלו בזמנים שונים במערכות הניסוייות השונות )התפרקויות לדקה (cpmביחידות של L ( זמני המדידה מופיעים בטור . ובטמפרטורות שונותA . השונות הרכב התמיסות) בהן הורחפו

:כדלקמן B -Lורים טמופיעות ב) התאים

מוןסי ערכתמ ורט

B קורת ב(ClST, pH=7.4) control

C (ClST, pH=7.4) + DNDS (5µM) dn5

D (ClST, pH=7.4) + DNDS (10µM) dn10

E (ClST, pH=7.4) + DNDS (20µM) dn20

F (ClST, pH=7.4) + DNDS (30µM) dn30

G (GST, pH=7.4) g H (GST, pH=7.4) + DNDS (2µM) gdn2

I (ClST, pH=6.0) pH 6.0 J (ClST, pH=6.5) pH 6.5 K (ClST, pH=7.0) pH 7.0 L (ClST, pH=8.0) pH 8.0

11

Media:

SST (pH): Na2SO4, 100mM (270 mOsM), HEPES 5mM, MES 5mM H2SO4

ClST (pH): NaCl 150mM, Na2SO4 1.5 mM, HEPES 5 mM, MES 5mM HCl

GST (pH): Na-gluconate 160mM, Na2SO4 1.5mM, Hepes 5mM, Mes 5mM (pH=7.4)

DNDS = 4,4'-dinitro-stilbene disulfonic acid in CLST

).37°Cעד 25°C -מ(תוצאות מופיעות בטמפרטורות שונות ה

) ידי המתרגל-שתינתן על (רטורה אחתצטרך לנתח את התוצאות של כל המערכות בטמפזוג יכל

). סטים15כ ”סה(וגם את הביקורות בכל הטמפרטורות

12

עיבוד הנתונים

. FA(Fractional activity(ישוב של ח. 1 מנת ( FAידי חישוב של - הנרמול נעשה על. שלב ראשון עליכם לנרמל את התוצאות שלכםב

:לפי הנוסחה הבאה. ) tבתאים בכל זמן הראדיואקטיביות ש

FA t cpm cpm tcpm cpm

( ) ( ) (( ) (

=))

∞ −∞ − 0

)1(

FA מייצג את פרקציית או מנת החומר המסומן הנותר בתא בנקודת זמן t . פרקציה זו יורדת עם

.∞ בזמן ­0 עד ל0 בזמן ­1 הזמן מ – xcelE -עבודה במומלץ לעיין במסמך , xcelEאם אינכם בקיאים בעקרונות העבודה בתוכנת (

)3נספח :עליכם לבצע את הפעולות הבאות) 1(לפי נוסחה FA -כדי לחשב את הב

) שמופיע בצד השמאלי התחתון של המסך. (FAפתיחת גיליון .1

מומלץ לבחור בתא השמאלי . שאליו אתם רוצים להכניס את הנוסחה, לתא cursor-עברת הה .2

.'העליון בכל טמפ

)= םתא הנבחר הנכם כותביב .3

שימו לב שתא . cpהכניסו את הכתובת של התא שבו נמצא הערך של )= -חרי סימן הא .4

ולכן עליכם תחילה לעבור לגיליון זה ובו בעזרת העכבר להעביר את Sulfate זה נמצא בגיליון

.ל וללחוץ על הכפתור השמאלי”החץ לתא הנ

m( )∞

m( )

).מינוס( -תבו כ .5

cpm(t)את הכתובת של התא שבו נמצא הערך של ) ותו דרךאב(כניסו ה .6

) /(תבו כ .7

cpכניסו את הכתובת של התא שבו נמצא הערך שה .8 ∞ל

).מינוס( -תבו כ .9

cpm(0)את הכתובת של התא שבו נמצא הערך של ) באותו דרך(כניסו ה.10

<Enter> ולחצו (תבו כ.11

כעת עליכם להעתיק את הנוסחה . ופיע בתא הנבחרי FAשב של ואחר פעולות האלה הערך המחל

לשם כך העבירו את הסמן אל התא עם ). הנתונה' בטמפ, או(לשאר התאים בטבלה FAלחישוב

בשלב ראשון עליכם לקבע את הערכים . ה מאפשר לערוך את תוכן התאז. <F2>הנוסחה ולחצו

נמצא נאמר : נדגים זאת. אחת) טור(מערכת בים נלכל הזמ cpm(0)-ו של

, אזי הנוסחה שלכם. 8נמצא בשורה cpm(t=10) -ו, 6נמצא בשורה cpm(t=0) , 13בשורה

:תראה כדלקמן, בינתיים

cpm( )∞cpm( )∞

ש

=(Sulfate!B13-Sulfate!B10)/(Sulfate!B13-Sulfate!B6)

13

, כלומר( cpm(0) -ו בהן נמצאיש, את ערכי השורות) להפוך לקבועים(ש לקבע עת יכ

כך שתקבלו את הנוסחה $והכניסו את הסימן <F2>לחצו , לצורך כך הגיעו לתא). 6- ו13שורות

:הבאה

)cpmם )∞

=(Sulfate!B$13-Sulfate!B10)/(Sulfate!B$13-Sulfate!B$6)

ידי -עם הנוסחה על לשם כך סמנו את התא. range- הנוסחה הזאת לכל העת יש להעתיק אתכ

כ לחצו על הכפתור הימני של העכבר ומהתפריט "אח. לחיצה על הכפתור השמאלי של העכבר

בלי לשחרר את range -לחצו על הכפתור השמאלי ומשכו את העכבר לכל ה .Copy שייפתח בחרו

המסומן ולחצו range-תוכן של הלת החץ של העכבר כעת העבירו א. מסתמן range-ה. הכפתור

Paste.

:תופיע תוצאת החישוב של, משלל, )FAבגיליון ( B6לאחר הפעולה הזאת בתא

=(Sulfate!B$13-Sulfate!B6)/(Sulfate!B$13-Sulfate!B$6)

C10בתא ו

=(Sulfate!C$13-Sulfate!C10)/(Sulfate!C$13-Sulafte!C$6)

כל קבוצה (אתם צריכים לבנות את קבוצות הגרפים הבאות , להשוות בין התוצאותכדי שיהיה נוחב

):בדף אחד

. עם ביקורתDNDSל המערכות של כ .1

. עם ביקורתל המערכות עם גלוקונטכ .2

. ים השונים עם ביקורת- pHל המערכות עם כ .3

.Y - FAובציר , Time (min)זמן בדקות - של הגרפים יסומן כ X - יר הצ

?צרים גרפים מהנתוניםכיצד יו

ר גרף ועב ;FAגיליון , FAעבור גרף של (הרלבנטיים data-פני התחלת הגרף יש לעבור לגיליון עם הל

כ "ואח, מהתפריט הראשי nsertIכדי ליצור גרף חדש יש לבחור ). 'וכו FA(ln(-גיליון ה, ln)FA(של

Chart .הגרף שאתם צריכים ליצור הוא מסוג של . וחרים סוג של הגרףב חלון שיפתחב

X-Y (Scatter) נקודות(בחרו באופציה הזאת ולאחר מכן בחרו את הצורה של הצגת הנתונים ,

בשלב הבא תבדקו .extN<ותלחצו ) שניהם ביחד (2בחרו באופציה ). או שניהם ביחדםקווי

של נתונים שברצונכם -Rangeועליכם לבחור את ה , (columns)שהנתונים שלכם הם בטורים

ניתן , כאשר אין רציפות בין הטורים. השוניםY -כ את כל ה"ואח X- ליכם לסמן את הע. להציג

- זמנית על הכפתור השמאלי של העכבר ו- י לחיצה בו"הבלתי רציפים ע) םי(להעתיק את הטור

<Ctrl> ה. ונים עם כותרות שלהםדאי להכניס את הנתכ .ל המקלדתע-range הנבחר יופיע בתוך

בשלב הבא תתנו כותרות משמעותיות לגרף . די לעבור לשלב הבאכ extN<תלחצו . המסגרת

. extN<ו צולצירים ותלח

.ם רלוונטי לגיליון של הגרףש תתנוו heetsAs a new תבחרו באופציה ןשלב האחרוב

14

k, ישוב של קבוע מהירות הראקציהח. 2

:ידי ריאקציה מסדר ראשון­מכדוריות הדם מתוארת על35SO4 2- ­ יציאת ה

ln(FA) = -k(t) . t-1 המבוטא ביחידות של (rate constant) הוא קבוע מהירות הריאקציה k רשאכ

בזמן היא FAהעקומה שמתארת את ההתנהגות של , ראקציה היא מסדר ראשוןהשום שמ

ניתן להתאים קוו ישר , kכדי לחלץ את המקדם . kראקציה שהמקדם שלו הוא קבוע ה, אקספוננט

:בדרך הבאה עושים את זה Excel-ב. kכשהשיפוע של הקו הנו קבוע הריאקציה , tכנגד ln(FA) -ל

כ " ואח)ln= מקישים בתא רק , כדי לעשות את זה. FAשל ln-מחשבים את ה, קודם כל

סוגרים את הסוגריים ולוחצים , FA של מכניסים את הכתובת של התא שבו נמצא הערך

<Enter> . כ מעתיקים את הנוסחה לכל ה"חא-range כפי שהוסבר לעיל.

Dataבוחרים את האופציה oolsTמתוך תפריט של . FA(ln( - א התאמת קו ישר לוהשלב הבא ה

analysis ומהחלון שיפתח בוחריםRegression .כמה שבו אתם מכניסים , ייפתח חלון נוסף

י "עו, (Input Y range)אתם מעבירים את העכבר למסגרת של משתנה תלוי , קודם כל. נתונים

כתובות של התאים יופיעו בתוך ה. ממערכת אחת בלבד ln(FA)ל שהעכבר מסמנים את הנתונים

, (Input X range)תלוי -כ אתם לוחצים בעכבר בתוך החלון של המשתנה הבלתי"אח. המסגרת

כ אתם מסמנים בעכבר את הריבוע של "אח. מכניסים את הזמנים של המדידותובאותה דרך

Line Fits Plot ,ולחצו , הכדי שהתוכנה תבנה גרף של ההתאמ<OK> . התוכנה תפתח גיליון חדש

בשיפוע של הקו : נעשה שימוש רק בשלושה ערכים, מתוך כל התוצאות המתקבלות. עם התוצאות

X-coefficient) (B18,ית התקן שלו בסטStandard error) C18 (וב- R Square) B5 .( כאשר

משמעות הדבר שאין התאמה סטטיסטית טובה בין הנקודות 0.8 -קטן מ R Squareערכו של

לעיתים נובע הדבר מהימצאותן של נקודות בודדות הסוטות בצורה . הניסוייות לבין הקו התיאורטי

-י הסרת נקודות אלה "לשפר את תוצאות הרגרסיה עאם באפשרותכם ). ?מדוע(משמעותית מהקו

.עשו זאת

בקורות בטמפרטורות 4 -רטורה נתונה ופ סטים בטמ11( פעמים 15זרו על הפעולה הזאת ח

double clickניתן לשנות את שם הגיליון לשם רלוונטי על ידי הקשה לצורך ארגון ). אחרות

ומדפיסים את השם , תחתית המסך בצד שמאלהמופיע ב )בעזרת העכבר(יק ’ופצ’מהירה על הצ

.ln(FA) Ctrl 37 -ל Sheet1דוגמא ניתן לשנות את השם ל. החדש

כנגד הזמן עבור הביקורת של הטמפרטורה ln(FA)ח המעבדה הגישו גרף של הריגרסיה של "בדו

.)4נספח ( עצוב והענקת משמעות לגרפיםלהלן טיפים חשובים על . שלכם

15

דרך נוספת לחישוב קבוע הריאקציה

2SO4-­ הזמן הדרוש לירידת פרקצית ה: היא כדלקמןkצורה אחרת לחישוב בתאים לחצי מערך 35

: t1/2כלשהו נקרא זמן מחצית חיים

הווה אומר

FA(t1/2 ) = 1/2 1/2אוln(1/2) = -k * t

- שמכאן

בגרף זה עליכם למצוא את הזמן הדרוש : כנגד הזמןcpmמהגרף של ניתן לחשב t1/2את ערך

: בחוץ מגיעים לערך ­cpm כלומר הזמן שבו ה, בתוך התא לחצי­cpm לירידת ה

ניתן לחשב במקומו את הזמן שלוקח t1/2במידה והרדיואקטיביות לא הגיע במהלך הניסוי לערכי

).'וכו t1/4 או t1/3( מהערך ההתחלתי 1/4- או ב1/3- לרדת בFA-ל

חשבו . עבור הביקורת בטמפרטורה שלכם) התוצאות הגולמיות( כנגד הזמן cpmהכינו גרף של

. לפי שיטה זוkמתוך הגרף את הערך של

inhibition const.) ( KIישוב של קבוע העיכוב ח. 3

נבדק אפקט של B-Dבמערכת . DNDSשלב הבא של העבודה הנו חישוב של קבוע העיכוב של ה

DNDS 2- בריכוזים שונים על שחלוףSO4 ) Aנקרא לקבוע הקצב בנוכחות . ) היא מערכת ביקורת

ki -DNDS ולזה בהעדרו k0. חשב את היחסk0/ki והצג אותו כנגד I - הריכוז שלDNDS .שיטה זו

אנו ,שטף= זרם /שטח כידוע ).KI( יחסית למציאת קבוע העיכוב המדומה Dixonשיטת נקראת

Vi = ki[S[ניתן להראות שמהירות המעבר או זרם הסולפאט הינו . נניח שהשטח קבוע לכל תא דם

. הוא ריכוז הסובסטראטS רשאכ, V0 = k0[S]ו

:מיכאליס מנטןולפי

V0הוא המהירות או הזרם ב ­mmol/liter/min

2/12/1

693.0693.0t

kk

t =⇒=

2

)0()()0( cpmcpmcpm −∞+

][]max[

0 sKsVV

m +=

[ ] ][)/1(]max[

sKIKsV

Imi ++=V

16

:ועבור מעכב תחרותי

. הוא קבוע המעכבKI - הוא ריכוז המעכב וIכאשר

: אם כן

:בדרך הבאה KIחשבו את

][][[

EI] IEK I =

][

][)1(00

sK

sKIKm

kk

VV

m

I

ii +

++==

])[(][

][][

][0

sKKIK

sKs

sKKm

kk

mI

m

mmi ++

++

+=

[

])[(I

sKKK

k mI

m

i ++=10k ]

). ערכים5כ "סה (DNDSלכל הריכוזים של k0/kiבנו טבלה של ערכים .1

והמשתנה k0/ki המשתנה התלוי הוא היחס ). כפי שהוסבר למעלה(עשו רגרסיה ליניארית .2

עצוב ראו -ח " עבדו את הגרף שהתקבל להגשה בדו].DNDS- ,]Iתלוי הוא הריכוז של ה- הבלתי

והענקת משמעות לגרפים

I

I

KI

VV

][1

max)max(

+=

אילו ים מתקבלו שהייםאת הקושהתקבל מהריגרסיה לינארית גם גרף העל סכמטית וצייר .3

S=20mMו ­S=1mM .איך היו נראים הקוים , של מעכב לא תחרותי עם אותם נתונים במקרה

!צייר אותם ? S = 1mM ועבור S=20mMעבור

: מיכאליס מנטן בנוכחות מעכב לא תחרותימשוואת

17

(activation energy)ישוב של אנרגית השפעול ח. 4

לפי , יתן לחשב את אנרגית השפעול של הריאקציה מהתלות של קבוע הריאקציה בטמפרטורהנ

:Arrheniusמשוואת

ln( ) *k A EaR T

= −1

- ו היא הטמפרטורה המוחלטתkcal/mol ,T) ( היא אנרגית השפעול Ea, הוא קבוע הגזיםR -כש

A הוא קבוע פרופורציה.

kשל קבועי ריאקציה ln שהואln(k)כשהמשתנה התלוי הוא , רגרסיה ליניארית צורך זה נבצעל

הוא הטמפרטורה T-כאשר, T/1לוי הוא ת-והמשתנה הבלתי, במערכת הביקורת בכל טמפרטורה

. Kelvinהמוחלטת במעלות

.הציגו גרף זה כולל חישוב אנרגית האקטיבציה

ורת הגשת הדוחצ כל מה שמסומן (הכולל את תוצאות החישובים והגרפים שנתבקשתם להכין ודפסמש להגיש דוח י

).באדום

: השאלות הבאותכלכמו כן יש לענות על

אלותש

,CO2 - בעזרת סכימה דומה לזו שציירנו במבוא את השלבים השונים שעוברים האר ת )1

HCO3הנוזל הבין תאי וחלל , תא הדם: יד הריאותל השונים ם במדוריO2 -וה, +H -ה, -

שמשתתפים חלבונים ה את, נו את הממברנות השונות שהגזים צריכים לעבורציי. הריאות

אל תעתיקו תמונות , )ביד או במחשב(טטו בעצמכם שר .' וכוכווני הריאקציות, בתהליכים

!!!!מוכנות מהמצגת או מהאינטרנט

כיצד נקבע כיוון הריאקציה של , משחלף האניונים פועל בצורה הפוכה ברקמות ובריאות )2

? הסבר, המשחלף

SO4 -מדוע שונה מהירות יציאת ה. א )3לעומת המהירות -Clחיצוני המכיל לתוך מדיום 2-

בסכימה המתאימה במבוא וברר הסתכל ? -Clחיצוני שאינו מכיל יוםיציאה לתוך מד

. לעצמך את מסלולי היציאה האפשריים של הסולפאטציין את . ציין מהו הגרף הרלוונטי? אילו מהתוצאות שברשותך מצביעות על תופעה זו. ב

.קבועי הקצב המצביעים על הדבר

מנגנון הפעולה של המשחלף האם מתוצאות הניסויים שניתחתם ניתן לדעת מהו. א )4

?)סימולטני או עוקב( ?איזה ניסוי מוכיח זאת. ב . שמאפשרים להבחין בין המנגנונים השוניםנוספיםהצע לפחות שני ניסויים . ג

18

-Cl : הוא­Cl - יחס הדונאן של יוני ה מסוימיםאם בתנאים )5i / Cl-

o = H+o / H+

i = 0.8

. צרף חישוב? 2SO4-מה יהיה יחס דונאן עבור יוני

מהו ריכוז הסולפאט בתוך התא , mM 100הוא ) החיצוני(ם ריכוז הסולפאט האיזוטוני א

?שיווי משקלב

).Control-רק עבור קבוצת ה(כנגד זמן שקיבלת FAהסבר את צורת הגרף של . א )6

. t1/2העזר בגרף זה לחישוב . ב

?t1/2 = 0.693/kהאם מתקיים הקשר . ג

צרפו . המתאים מהגרףKI את קבוע העיכוב צוחל, 1.5 mM=[S] ו Km=30mM -בידיעה ש )7

!א לשים לב ליחידות של כל פרמטר מחושבנ .החישוב

איך יתכן שישנו עיכוב למרות שריכוז ? של סובסטרטKm- של מעכב והKI-מה הדמיון בין ה )8

?המעכב קטן בהרבה מריכוזו של הסובסטרט

מתאימות למודל הנשא שונים pH- בefflux-דק הבהם נב התוצאות שקיבלת במערכות האם )9

.איתו) או לא מתיישבות(הסבר מהו המודל וכיצד התוצאות מתיישבות ? המטוטר

ערך התייחסו ל.י דיפוזיה פשוטה"ולא עי מתווך " הן הראיות ששטף האניונים מבוצע עמה )10

ים נוספים אילו ממצא. על מערכות אנזימטיותם ולידוע לכם שקיבלתEaאנרגית השפעול

?מצביעים על כך

כלומר חיוני שיהיו ( מראים ששחלוף האניונים הוא תהליך אובליגטורי םהאם הניסויים שערכת )11

? ל"איך היית עורך ניסוי שיוכיח את הטענה הנ, אם לא? )אניונים משני צידי הקרום

לא דרך כך שמעבר הסולפאט הוא עלחד משמעיתהאם ניסוי כלשהו מבין אלה שערכת מצביע )12

?תעלה

כמו מבוא או (נא לא לכלול דברל "ים והגרפים הנבחוץ מתשובות לשאלות ולחישו, ימו לבש

יואב או ( ואת שם המתרגל כל זוג מתבקש לציין את התאריך בו השתתף במעבדה).ב"שיטות וכיו

. )גיא

19

1נספח

!)לצרכיי הדגמה בלבד" (רטוב"מהלך הניסוי ה הכנת הדם. א

ל” מ50ודה היא במבחנות של העב שטיפת הדם. 1

. 3000g x)' דק5(ערבב וסרכז , ClST תמיסת ml 20 דם הוסף ml 20קח .הרחק את הנוזל העליון ואת שכבת הבניים הצהובה בין המשקע האדום לנוזל העליון

.ערבב המתן כדקה וסרכז שוב, ClSTהוסף .לול וללא שכבת בנייםחזור על פעולות אלה עד לקבלת נוזל עליון צ

) טעינה עם חומר קר(טעינה עם סולפאט . 2

ml 45 ( ClST + דם ml 5 ( 10% הכן תרחיף תאי דם 1מהדם שבסעיף ]1הכן את מלוא כמות הדם המתקבלת בסעיף [

. והרחק נוזל עליוןx 3000g' דק5סרכז ' דק30 ל ­C °37טלטל ב .x 3000g’ דק5סרכז . ’ דק60 ל C °37 וטלטל ב )10%ל ( ClSTהוסף

)טעינה עם חומר חם) ( סולפאטS35עם (טעינה . 3

.ml 50 ל ClSTהוסף , ורכז את כל הדם למבחנה אחת2הרחק את הנוזל העליון מסעיף הרחק . x 3000g’ דק5סרכז , ’ דק60 ל °37 וטלטל ב lµ 100 (1.5 X 107 cpm/ml) 35Sהוסף

רכז בקור, 0 ) °(C קר SSTהוסף . )לכלי אסוף המיוחד לפסולת רדיואקטיבית נוזלית (נוזל עליון C) ° ( 0 5דק ’x 3000g .הרחק נוזל עליון חזור על פעולות אלה עד קבלת נוזל עליון צלול.

.שמור את תאי הדם בקרח

. דם טעוןml 12כל קבוצה צריכה להישאר עם לפחות התלמ"יבוצע ע(הכנות. ב )ידיםי A-J מהתמיסות ml 8הוסף אליהם . A-J בקבוקי סנטילציה המסומנים באותיות 10הכן . 1

.)2ראה טבלה (המתאימה לקבוצתך ' ושים באינקובציה בטמפ)1ראה טבלה (בהתאמה J1…… A1. המסומנות eppendorf מבחנות 40הכן . 2

A4.…… J4 זה נועד להפסיק את השטפים הן על (שמור בקרח , DNDS 10mM תמיסת µl 20הוסף לכל מבחנה

.DNDS)ידי קור והן על ידי המעכב )J,..,A( כאשר לכל מערכת 2 מבחנות אפנדורף המסומנות כבסעיף 60הכן . 3

∞A)דוגמא ( ∞ מבחנות המסומנות באות המערכת ובסימן 2הוסף TCA 15% תמיסת µl 250הוסף לכל מבחנה

והזמן)A...( המערכת )א...(בקבוקי סנטילציה עם שרוול המסומנים באות הקבוצה 60הכן . 4)...1(

.סמן בחלק העליון של הבקבוק בלבד

ע(הניסוי . ג התלמידים"יבוצע )י :הנחיות

.העבודה תעשה עם כפפות אין לגעת בחלקי גוף חשופים בעת העבודה× .גימהיש להחליף חוד בין דגימה לד . עד להוספת הדם שמור אותו בקרח

20

במקרה ונשפכת דגימה של חומר רדיואקטיבי על שולחן העבודה יש לספוג אותה את כל . כ מים בלבד וליבש"ואח, לעבור על המקום עם מים וסבון, בעזרת נייר סופג

.הניירות יש להשליך לפח רדיואקטיבי .ערבב והחזר לטלטול, ­S35 ב תאי דם טעוניםml 1הוסף לכל כלי ראקציה . 1

הכרחי קבוצות ’ וב' קבוצה א( שניות 30 של , בזמנים קצוביםיש להוסיף את הדם לכלי הראקציה .)יכולות במרווחי זמן גדולים יותר’ ה’­ג

eppendorf מכלי הראקציה והעבר למבחנת סרכוז µl 800 2הוצא בזמנים המופיעים בטבלה .לערבב ולהחזיר לקרח, ק יש צורך לפקו . ­DNDS הכוללת

.בזמנים קצוביםהמשך לקחת דגימות בהתאם לטבלת לוח הזמנים והקפד על הוצאה לאחר הערבוב ולפני ההחזרה DNDSיש להעביר את הדגימה ל ­ לקיחת דגימה בזמן אפס

.לטלטול . שניות בצנטרפוגה שעל שולחנך­5 סרכז ל, המלאות דגימהDNDSאת מבחנות ה . 2

ערבב וסרכז , פקוק, התואמתTCA המכילה eppendorf אל מבחנת ה מהנוזל העליוןµl 500העבר .’ דק5למשך

מכלי הראקציה והעבר למבחנות µl 800בגמר הוצאת כל הדגימות הוצא , ∞לקיחת דגימת זמן . 3 .)2המשך כמו בשלב ( התואמות TCA עם ­eppendorf ה )בלבד( והעבר לתוך השרוול מהנוזל העליוןµl 400 הוצא דגימה של 2ב מכל מבחנה בגמר של. 4

.בקבוקון הסינטילציה התואם . פקוק היטב ורכז את הדוגמאות לפי סדר המערכת)במנדף( נוזל סנטיליציה ml 3.5הוסף

ים יהיו יש להקפיד שהבקבוק. כיוון שזה יגרור נזילה מהשרוול ואבוד הדגימהml 3.5אין להוסיף יותר מ ( .)יבשים

21

2נספח הוראות לפתיחת קובץ התוצאות

)דפי עזר למעבדת מחשב( בואמ המעבדה מאורגנת . מעבדה זאת נלמד על מערכת העברת אניונים דרך קרום תא הדם האדוםברת בהפיסיולוגיה של תהליך העברת אניונים והפרוטוקול המעבדתי תוארו בחו". ניסוי יבש"כ

בדפים האלה מוסבר כיצד עליכם לנתח את התוצאות הניסיוניות בעזרת הגיליון . המעבדהח המעבדה ולענות על שאלות "כמו כן איך עליכם לארגן את דוו Microsoft Excel, האלקטרוני

. שונות

PC וראות לשימוש במחשב ה .Microsoft Excel למערכת והפעלת הניסכ חרת א! להפעילו מחדש יש, חשב שהנכם מתכוונים לעבוד אתו כבר פעילמאם ה. הפעלת המחשב. 1

.להדליקו" רצוי", אם המשב מכובה. הסביבה עלולה להיות לא נכונה ). :Username(עקבו אחרי הוראות המופיעות במחשב עד שתגיעו לשלב של הופעת השרת . 2

.סיסמתכם הפרטית ולאחר מכן הכניסו את pobדפיסו את שם המשתמש שלכם בחשבון ה מהיר double clickידי -לע Excel הפעילו . עלהתWindows -עקבו אחר ההוראות עד שתכנת ה . 3

:לפני העלאת הקובץ). עם העכבר(שלו icon-על ה . Medium- לigh H- ושנו את הסימון מMacro - Security-בחרו ב, oolsT היכנסו לתפריט . אכנסו : עשו זאת באופן הבא. ata AnalysisDאת האופציה של soolT לתפריט הוסיפו . ב

מתינו עד להופעת חלון ה. ) בריבוע משמאלνסמנו ( nsI-add –ב תבחרוו oolsTלתפריט Ins-add וסמנו את האופציהToolpack-Analysis , ותלחצו>OK< . דאו שהאופציה ו

ata AnalysisD וספה בסוף תפריט נoolsT . י למדריך\ בעיה כלשהי תקרא אם קיימת . גשו , בכדי לעשות כן. ישמכיל את הנתונים של הניסו. xls.sulfateקראו לקובץ , לאחר פעולה זו. 4

ותה פעולה ניתן לעשות א. ileFמהתפריט של penOכ "אחו Excelשבתפריט הראשי של ileF -ל ליכםע, sulfate.xlsלקובץ כדי לגשת . <o>-ו <Ctrl>זמנית של מקשים -ידי לחיצה בו- על על double clickללחוץ , Common on Apps_server/LV_apps (T:) היכנס לכונןל

מנו את ס. sulfate.xls הקובץתשם תמצאו א. blood_lab ובתוכה על התיקיה 72336התיקיה קובץ ה . Enable Macros- בחרו ב, Macrosכאשר תופיע השאלה לגבי .open הקובץ ולחצו .יעלה לגיליון

לחצו על האפשרות . <b>-ו <Ctrl>זמנית את המקשים -חצו בול, בכדי להפעיל את הקובץ. 5

Deleteלאחר הפעולה הזאת הקובץ שלכם מוכן לעבודה ושמור . בכל אחת מההודעות שעולות . שלכם(:H)בכונן

פעם הראשונה שאתם ך ורק בא אתם עושים 5 - ו4את הפעולה המתוארת בסעיפים !!!!ימו לבש. 6

ייבים חאתם , שכבר עבדתם אתו, אם אתם רוצים להעלות את הקובץ .עובדים עם הקובץ Excelמן התפריט הראשי של ileFתבחרו , י לעשות את זהדכ . שלכםHלהעלות אותו מכונן

תמצאו בתוך רשימה של הקבצים את ו H:תעברו לכונן . ileFמהתפריט של penOכ "אחו .הקובץ יעלה לגיליון .OKותלחצו ) File nameהוא יופיע במסגרת של (ל ”הקובץ הנ

זמנית את -לחצו בו, כדי לשמור את הקובץ. פעםי תשכחו לשמור את הקובץ שלכם מדלא. 7

.שמרו את הקובץ עם אותו השםו Save וחרבו File או גשו ל >s<- ו >Ctrl<המקשים

22

3נספח Excel -בנה הנתונים במ

וכל גיליון , כל קובץ מחולק לגיליונות. סמנים ונוסחאות, מספרים: סוגי נתונים3שנם י -Excel ב

מילה עם ( שם הגיליון -לקים חשמורכבת משלושה , לכל תא יש את הכתובת שלו. מחולק לתאים .הכתובת של התא נכנסת כמשתנה לתוך הנוסחאות). מספר(ושורה ) אות(טור , )סימן קריאה בסוף

Excel -וסחאות בנ, בנוסחאות ניתן להשתמש במספרים .)בלי מרכאות("=" מתחילה בסימן Excel-ל נוסחה בכ

וכן בפונקציות מסוגים שונים /) ,*,- , (+תפעולות מתמטיות בסיסיו, )כתובות של התאים(משתנים )ln(), exp(), average(),stdev() etc..(

xcelE-ב' כתובות וכ, עתקה של נתוניםהכדי להעתיק את התוכן של תא אתם מסממנים . יתן להעתיק הן מספרים וסמנים והן נוסחאותנ

פתור הימני של העכבר ככ לחצו על ה"אח. ידי לחיצה על הכפתור השמאלי של העכבר-אותו עלחר מכן העבירו את החץ של העכבר לתא שאתם רוצים אל. Copy ומהתפריט שייפתח תבחרו

אשר מעתיקים כ! שימו לב. Pasteלחצו על הכפתור הימיני ובחרו , העתקתםלהדביק את אשר אם אתם מעתיקים נוסחה , לדוגמא. הכתובות של המשתנים גם משתנים בהתאם, וסחהנ"A1+B1 "תא מC1 תא לD2 ,תיהפך , שתופיע בתא, הנוסחה“B2+C2” ) משום שהמחשב פשוט

הת שני סכום שעליו לחשב את נמצאת הנוסחאמבין שבו פעולה ההעתקה היא ). אים משמאל לתאבמקום להכניס כל פעם את . רב של פעמים על נתונים שונים' מאוד נוחה כשיש צורך בהפעלתה מס

. אותהםפשוט מעתיקי, הנוסחה מחדש

4נספח

:עיצוב והענקת משמעות לגרפים

:כדי לשנות את הכותרות בצעו את הפעולות הבאות

.מהיר בתוך הגרף double clickידי - הגרף עלמנו אתס .1

.בודד clickידי - שאתם רוצים לשנות על, מנו את הכותרתס .2

.<Enter>תבו את הכותרת החדשה ולחצו כ .3

, הניסוייתתהכותרת לגרף כולו צריכה לכלול את שם המערכ. כותרת צריכה להיות משמעותיתה

,למשל. הטמפרטורה וסוג האנליזה

ניתן לתאר 28oCבטמפרטורה Aהביקורת ' של מער ln(FA)סיה ליניארית של את הגרף של רגר

: כדלקמן

Rate constant calculation. 28°C, control..

. Y ln(FA)זאת לציר ו Time(min.)נסמן Xותרת לציר כאת ה

על double clickעושים , )בשלב זה מופיעות רק הנקודות לא מחוברות(כדי לקבל גרף ליניארי ב

- ו line automaticבוחרים Patternsשל dialog box - אחת מנקודות הגרף הורודות ואז ב

marker No.