치아 관련 기능성 시험

백대일1, 진보형2, 황인경3

서울대학교 치과대학1, 신구대학교 치위생과

2, 서울대학교 생활과학대학

식품영양학과3

1. 치아건강 / 772

(1) 치아기능의 정의 ···························································································772

(2) 구강건강의 정의 ···························································································772

(3) 치아 건강 조절의 정의 ················································································772

(4) 치아 건강 조절의 범위 ················································································772

(5) 치아건강관련 기능성 성분 및 식품에 대한 검토 ······································776

2. 치아 건강 기능성의 biomarker / 777

3. 치아건강 기능성 평가 표준 시험법 / 778

(1) 기능성평가시험 일반원칙 ·············································································778

(2) 치아기능 조절 관련 기능성 평가체계의 일반적인 구조 ·························780

(3) 동물실험법 ·····································································································781

(4) 인체실험항목 ·······························································································782

(5) 표준시험법 세부 내용 ··················································································785

4. 참고문헌 / 791

- 772 -

1. 치아건강

(1) 치아기능의 정의

치아는 식물 (食物)을 저작하고 발음을 조작하는 구강에 존재하는 기관으로 법랑

질과 상아질 및 치수등과 같은 조직으로 구성되어 있으며 저작기능과 발음기능

및 미용기능을 발휘한다 (김종배 et al., 2001; 김종배 et al, 2001).

- 저작기능: 치아의 가장 중요한 기능으로서, 치아별 형태에 따라 독특한 기능을

발휘한다.

- 발음기능: 치아와 혀 및 구강조직은 모두 발음을 조작하는 역할을 한다.

- 미용기능: 치아나 기타 다른 구강조직이 결손으로 안모 손상시, 취업이나 사회

활동에 큰 지장을 받을 수 있다.

(2) 구강건강의 정의

상병에 이환되지 않고 허약하지 않으며 정신작용과 사회생활에 장애가 되지 않는

악안면구강조직기관의 상태이다 (김종배 et al., 2001; 김종배 et al., 2001).

(3) 치아 건강 조절의 정의

치아건강조절이란 치아를 구성하는 경조직의 변화로, 구강내 여러 우식발생요인

에 의한 영향을 고려하여, 정상적인 생체 기능을 조절하여 치아 경조직 손상의

위험성을 감소시키고, 구강건강을 유지하는 것으로 정의할 수 있다 (김종배 et

al., 2001; 김종배 et al., 2001).

(4) 치아 건강 조절의 범위

일반적으로 우리나라 국민의 치아발거원인 비중에 관한 조사 결과, 치아우식증에

의한 발거는 75.2%, 치주조직병에 의한 발거 비율은 21.2%로 조사된 바 있다. 또

한 Table 1에서 보는 바와 같이 우리나라 국민의 우식경험영구치지수와 치면세마

필요자율은 1995년에 비하여 2000년에는 더 증가하였으며, 이러한 결과는 치아우

식증과 치주조직병이 우리나라 국민의 구강건강을 파탄시키는 양대구강병임을 입

증한다고 할 수 있다. 그러므로 이의 발생을 예방하기 위한 다양한 노력이 필요

하다고 할 수 있다. 한편, 세계보건기구에서 건강의 개념을 생활개념으로 규정하

고, 구강건강에 관한 관심이 증대되면서, 사회생활에 장애가 되는 구취 예방과

제거에 대한 관심도 증대됨에 따라, 구취 원인과 구취제거방법에 대한 다양한 연

구들이 수행되어 왔다 (보건복지부, 2000; 김종배 et al., 2001; 김종배 et al.,

2001; Newbrun E., 1992).

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Table 1. 우리 나라 국민이 치아우식증과 치주병이 유병율 추이 비교 (김종배 et

al., 2001; 김종배 et al., 2001)

1990 2000

12세 아동의 우식경험영구치수 3.03개 3.30개

15세 아동의 치면세마필요자율 32.3% 43.4%

이들 구강병의 유병율을 줄이기 위해서는 이들의 발생원인을 규명하고 작용기구

를 차단하는 방법적인 접근이 필요하다. 대부분의 구강상병은 다양한 발생요인에

의해 발생되므로, 복합구강건강관리방법 (Shotgun approach)에 의해 관리함이 필

요함과 동시에 가장 제어하기 쉬운 요인을 제거하는 방법도 유용한 방법이라 할

수 있다. 그러므로 여기에서는 치아우식관리를 치아건강기능조절의 주영역으로

정의하고, 치주조직병과 구취 관리를 치아건강기능조절의 부영역으로 규정하여

이의 관리에 필요한 내용을 중심으로 고찰하고자 한다.

가. 치아우식

치아우식증은 인류에서 가장 빈발하는 만성질환 중 하나이며, 1970년대 이후 선

진국을 중심으로 그 유병률이 감소하고 있으나 개발도상국 등에서는 오히려 증

가하는 추세이다.

치아우식증이란 치질 중의 무기질이 탈회되고 유기질이 파괴되어 치아조직의 결

손을 초래하는 치아조직질환으로서, 인류에서 가장 빈발하는 만성질환이다. 일단

발생된 치아우식증은 완전하게 치유되지 않아, 반드시 후유증을 남기며 세계 어

느 곳에서도 발생된다. 따라서, 치아우식증을 범발성 질환이라고 할 수 있다. 인

종요인, 성별요인, 경제요인, 사회요인의 영향을 받으며 발생되므로 다인성 질환

이라고 한다. 치아우식은 mutans streptococci라고 총칭되는 구강연쇄구균에 의

해 발생하며, 사람의 구강에서는 Streptococcus mutans와 Streptococcus

sobrinus의 2종이 분리된다. 이 중 S.mutans는 glucosyltransferase (GTase)를

생산하며 이들 효소의 작용에 의해 sucrose로부터 불용성이며 강력한 접착력을

갖는 glucan을 합성한다. 이 insoluble glucan은 S.mutans를 치면에 부착시켜 정

착시키는 접착제 역할을 한다. 치면에서 성장 증식한 S.mutans는 다종의 구강내

세균와의 회합에 의해 균괴를 생성한다. 이 균괴가 성장하여 치면을 덮으면 육안

으로 보여지는 치면세균막이 된다. 치면세균막을 구성하는 S.mutans가 당질을 대

사하여 생성하는 유산 등의 유기산이 치면세균막 내부에 축적되어 pH가 저하되면

법랑질의 탈회를 유발하여 치아우식증에 이르게 된다. 최근에는 치아우식예방을

위해 S.mutans에 대한 항균, GTase활성억제, cell adherence억제, 산 생성억제

등에 효능이 있는 물질의 검색이 활발히 이루어지고 있다 (보건복지부, 2000; 김

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종배 et al., 2001; 김종배 et al., 2001; 남상해 et al., 1998; 배광학 et al.,

2001).

이와 같은 치아우식증이 발생을 도식화 해보면, Fig. 1과 같다. 일반적으로 치아

우식발생과 관련된 음식의 영향요인으로는 음식섭취횟수, 당질 형태, 치아에 대

한 점착성, 음식섭취 순서, 음식에 함유된 무기질의 양 등이 영향을 많이 미치는

것으로 보고되고 있다. 즉, 설탕 등의 당질을 많이 함유한 간식을 빈번하게 섭취

하는 경우에는 치면세균막의 형성을 촉진하게 되고 치아표면에서 구강내 우식원

세균에 의해 생성된 산의 접촉 시간이 증가하게 되어 결과적으로 치면의 탈회가

가속화하게 되는데, 이런 현상이 빈번하게 일어나게 되면 결과적으로 치면세균막

내의 mutans streotococci 증식이 일어나 장기적으로는 우식경험율의 증가를 초

래한다고 할 수 있다. 여기에서 알 수 있듯이 치아우식발생에 작용하는 다양한

요인 중에서 영양, 음식성분 등 이와 관련된 부분에 대해서는 환경적인 조절이

가능하며, 이는 치아기능성 식품을 통해서 어느 정도 관리가 가능한 부분이라고

볼 수 있다 (보건복지부, 2000; 김종배 et al., 2001; 백대일 et al., 1998; 변

상희 et al., 1998; 이재춘 et al., 2002; Bowen WH., 1992; Pienihakkinen K.,

1987; Courtesy Navia JM., 1994)

숙주요인

↑ ↓

치면세균

세균

영양소 충치 타액

음식성분 분비와

조성

무기질

불소성상

↓ ↑

(영양, 유전, 인종, 연령)

Fig. 1. 치아우식발생과 영향요인 모식도 (Courtesy Navia JM, Carbohydrates

and dental Health. Am J Clin Nutr, 59(Suppl.):719-727, 1994.)

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나. 치주질환

치주질환이란 치주조직에 생기는 일체의 질병을 말한다. 그러나, 비교적 자주 발

생하는 치주질환은 만성치은염, 만성치주염, 급성괴저성궤양성치은염, 소년치주

염 등이다. 대부분 국가의 국민에서는 주로 만성치은염과 만성치주염이 발생한

다. 일반적으로, 개발국가에서는 치주병의 유병율이 감소하는 경향이 있다.

치아우식증과 마찬가지로 치주질환도 구강내에 존재하는 세균이 발생에 많은 영

향을 미치는데, 치은연상 치면세균막 (Supragingival plaque)내에 있는 세균은

치은염 (gingivitis)발생과 연관이 깊고, 치은연하 치면세균막 (Subgingival

plaque)의 세균은 치주염 (Periodontitis)의 발생과 관련이 깊다고 알려져 있다.

일반적으로 모든 치은염이 치주염으로 이행된다고 볼 수는 없다. 즉 치주염은 치

은염과 함께 발생되나 모든 치은염이 치주염으로 진행되는 것은 아니다.

치아우식증을 일으키는 세균과 달리 치주질환이 발생과 연관이 깊은 세균은 혐기

성균으로 주로 Prophyromonas gingivalis, Prevotella intermedia,

Actinobacillus actinomycetemcomitans, Eikenella corrodents, Fusobacterium

nucleatum, Bacteroides forsythius, Campybacterrectus, Treponema

(spirochetes) 등이 관련 있는 것으로 보고되고 있다. 특히 치은염은 흔히 치은

의 염증성 변화에 의해서 발생되므로 이때 적절한 관리를 통해서는 원상태로 회

복이 가능하기도 하다.

치아우식증과 마찬가지로 치주질환 역시 감염성 질환으로 다양한 요인에 의해서

발생하게 된다. 특히 병원균의 독작용과 숙주방어체계에 의해 일정 기간 동안 질

병의 진행과 회복이 순환단계를 거치게 되는데, 치아우식증과 당질의 관계와는

달리 이 과정에 영양요인이 치주병 발생에 좀 더 미묘한 역할을 담당하는 것으로

알려져 있다. 즉 치주병은 적절한 영양섭취를 통해 감염을 예방하고 상처치유를

촉진시킬 수 있는 일련의 과정을 따른다고 할 수 있다. 이런 측면에서 보면 건강

한 치은을 지닌 사람도 꾸준히 치주조직의 건강상태를 유지하기 위해서는 적절한

영양소의 섭취가 요구되고, 치주조직에 염증이 있는 경우에도 치유효과가 있는

영양소를 섭취할 필요가 있다.

일반적으로 치주조직의 건강을 위해서는 균형잡힌 식사와 타액분비를 촉진할 수

있는 섬유질 섭취 증가 및 적절한 비타민과 무기질의 공급이 중요시 되는데, 이

런 관점에서 보면 치아 기능조절 식품의 섭취를 통해 어느 정도 치주조직병의 예

방과 관리가 충분히 가능하다고 할 수 있으며, 이 부분에 대한 명확한 평가 및

관리 체계의 구축이 필요하다고 볼 수 있다 (김종배 et al., 2001; 김종배 et

al., 2001; 백대일 et al., 1998; 신형식 et al., 1996).

다. 구취

구취는 입을 통하여 나오는 호기의 냄새다. 그러나 일반적으로 호기의 냄새 중에

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서도 타인으로 하여금 불쾌감을 느끼게 하는 냄새를 말한다. 구취는 많은 성인에

게 영향을 미치는 일반적 불평이며, 대다수의 사람에 있어서 구강내의 미생물대

사로 인해 발생하는 경우가 많다. 구취는 현실적으로 타인에게 불쾌감을 주는 요

인이 되고 있음에도 불구하고, 사회구성원 개개인들은 각자의 입냄새에 적응이

됨으로써 구취에 대한 특별한 인식을 하지 못하고 일상생활을 하기도 하며, 이와

는 반대로 구취가 심하게 나지 않음에도 불구하고 심한 구취를 가지고 있다고 걱

정을 많이 하는 구취공포증을 가진 환자들도 다수 있다. Rosenberg등은 구취공포

증환자들은 일반적으로 사회적으로 대인관계를 꺼리게 되고, 자주 잇솔질을 하거

나, 껌을 자주 씹거나 사탕을 자주 섭취함으로써 구취를 제거하려는 노력을 하게

되며, 대화시 상대와 일정간격을 유지하려고 함으로써 상대가 냄새를 인식하지

못하도록 하려는 노력을 하게 된다고 언급한 바 있다. 또한 Yaekaki는 구취가 심

하거나 구취공포가 심할 때는 사회적으로 고립되고 자신의 치아를 모두 발거하기

를 원하며 심지어 자살을 한 예를 보고한바 있다. 구취를 발생시키는 요인은 구

강내국부요인과 구강외신체요인으로 구분할 수 있으며, 구강내국부요인으로서는

구강부패작용, 구강식물잔존, 불량구강환경, 치아우식증, 설태 및 치주조직병 등

을, 구강외 신체요인으로서는 공복 약물투여 및 구강외신체질환을 각각 열거할

수 있다. 따라서, 구강환경을 잘 관리함으로써 구취를 억제시키거나 제거시키려

는 목적으로 다양한 연구들이 이루어지고 있다. 한편, 대부분의 구취는 구내 미

생물의 대사작용에 의하여 발생됨이 알려졌는데 그 성분은 황화합물, 저급지방

산, 알코올, aldehyde 등 다양하다. 이 중에서도 특히 구취의 강도와 관련이 있

는 성분은 hydrogen sulfide, methyl mercaptan, dimethyl sulfide 등의 휘발성

황화합물로서 methyl mercaptan의 농도와 감각적으로 느끼는 구취 사이에는 비례

적 상관관계가 있고 구취를 억제하기 위해서는 methyl mercaptan의 발생을 억제

하는 것이 대단히 중요하다 (김종배 et al., 2001; 김종배 et al., 2001; 김종배

et al., 1991)

(5) 치아건강관련 기능성 성분 및 식품에 대한 검토

치아는 항시 구강내에 있는 여러 가지 요인에 의해 영향을 받으며, 육안 검사를

통해 관찰이 가능한 초기우식병소에서 시작된다. 초기우식병소는 적절한 1차 예

방을 통해 원상태로 회복이 가능한 가역반응단계를 거치게 된다. 이 단계를 촉진

시킬 수 있는 요인으로는 타액내 무기질 함량, 치면세균막내 우식원세균의 활성

도 저하, 재결정화 촉진 등을 들 수 있다. 즉, 구강내에 오래 잔류하면서 치질의

무기질 탈회를 억제할 수 있는 성상으로 만든 제재가 필요하게 된다. 그러나 건

강기능식품에 관한 법률 제 3조에는 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을

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사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조가공한 식품으로만

규정하고 있다. 그러나 미국 FDA에서는 당알코올로 만든 껌과 캔디는 의미있는

영양소를 갖고 있지 않음에도 우식증과 관련된 건강효능주장 표명이 허용된다는

점과 질병에 따라 발생기구가 다양하고 이의 작용기구를 차단하는 방법 또한 다

르다는 점을 감안하면 우선적으로 그간의 연구결과를 검토해 보고, 이에 따라 치

아 건강 관련 기능성 식품의 형태에 대한 제안을 할 필요가 있다고 검토되었다

(한국식품과학회, 2002; 식품의약품안전청, 2002).

2. 치아 건강 기능성의 Biomarker

이번 과제를 통해 조사된 연구 결과를 분석한 결과 다음과 같은 Biomarker를 고

려해 볼 수 있다. 현재 연구 중이거나 명확히 기전이 밝혀지지 않은 biomarker를

제외한 것을 여기에 제시하도록 한다. 그러나 보조 항목부분은 추후 연구를 통해

연관성을 명확히 할 필요가 있다고 검토되었다.

Biomarker 관찰내용

주항목

1 치면세균막 지수 Decrease of dental plaque

2 구강내 다형연쇄상 구균수Suppression of Mutans

Streptococci

3 치면세균막 pH Suppression of acid production

4 재결정화 촉진 Promotion of remineralization

보조

항목

1 Ca농도

2 P 농도

3 Salivary Lactoperoxide Activity

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3. 치아건강 기능성 평가 표준 시험법

(1) 기능성평가시험 일반원칙

가. 동물효능실험 일반원칙

시험조건

시험물질- 시험물질의 물리, 이화학적 성질들에 관한 자료제공

- 시험물질의 처방, 품질규격 등의 표준에 적합하여야 한다.

시험동물

- 기능성별 시험에 따라 계통, 성별, 연령 등을 고려하여

선택한다.

- 랫트 사용을 원칙으로 하며 필요에 따라 개 등을 사용 한

다.

시험설계

투여경로는 임상투여 경로를 원칙

3개의 시험 용량군과 대조군 설정

(필요시 양성대조군 사용 가능)

시험군당 마리수는 통계적 분석 가능한 수준

식이 간섭에서 최소 2주의 도입기간 설정되었나?

시험기간은 최소 1개월 이상 (도입 기간 제외)

통계처리

데이터에 적절한 통계학적 방법이 응용되었는가?

통계학적으로 유의하다라는 말이 적절하게 설명되었나?

상대적인 효과와 절대적인 효과가 구별되었는가?

나. 동물실험설계의 일반 원칙

동물모델

Sprague-Dawley (Male or female)

연령 : 21-28일

개체수는 각 군당 10마리 이상

투여경로 및 기간Ad Libitum feeding

6-8주 (2주 간격 평가, 도입기간 2주 필요)

검사항목-치아우식경험도 (하악 대구치, Key method, 1958)

-치면세균막지수

결과해석 유의수준 0.05에서 결과 평가

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다. 인체 효능시험평가 일반원칙

시험원리시험물질이 in vitro, in vivo 기능성 평가를 통하여 기능성이 확보

된 상태에서 인체작용 효과를 확인하는 목적으로 실시

시험방법 이중맹검, 무작위 배정, 대조군 시험, 종단면 연구

요구사항시험물질은 안전성이 확보되어야 한다.

시험물질은 안정성이 확보되어야 한다.

시험조건

대상선정

및

표본크기

건강인부터 질병 경계영역의 사람 대상

표본 크기는 유의적인 효과를 나타내기 위해 통계적으로 문제점이

없는가?

조절된 간섭연구의 경우 대상자 선정시 무작위로 선정하였는가?

시험설계

최소 2개 이상의 시험 용량군과 대조군으로 한다.

필요시 대조군은 양성대조군을 사용할 수 있다.

대조/간섭 식이가 적절하게 구성되고 측정하기에 적합한가?

연구에서 사용된 간섭 또는 follow-up기간이 주요결과를 찾아내는데

효과가 있을 정도로 충분한가?

(단순 임상시험은 최소 4주 이상, 종단조사는 최소 2년 이상)

횡단조사에서 식이처리기간 사이에 적절한 중단기간(wash-out)이 있

는가?

피험자의 이상 반응에 대한 사전 대책이 수립되어 있어야 한다.

통계처리

데이터에 적절한 통계학적 방법이 응용되었는가?

통계학적으로 유의하다라는 말이 적절하게 설명되었나?

상대적인 효과와 절대적인 효과가 구별되었는가?

라. 인체실험 피검자 선정 원칙

피험자

선정기준

치아조건

이상 검사로 현재 진행중인 우식병소의 증거가 없는 건강인

관찰가능한 초기우식병소를 1개 이상 지닌 경계역의 준건강인

타액조건

자극성 타액 분비량 정상 (>1.0㎖/min, 전타액)

LB/SM 구강내 우식원 세균수 : 105CFU/㎖ 이상

Baseline gingival index : 1.5이하 (Silness-Loë)

Baseline plaque index : 1.5이하

피험자

제외기준

실험기간동안 항생제 복용

실험에 영향을 미칠 수 있는 구강진료 수취

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마. 인체실험 설계의 일반원칙

피험자수

◀ 생체실험 : 각 군당 15명 이상 (관찰 시편수 30개 이상)

단 치면세균막의 pH 변화는 5명 이상

◀ 환자대조군 연구 : 최소 250명 이상

(경계역 환자 125명 이상 포함)

◀ 종단연구 : 실험군 100명, 대조군 20명 이상

시험기간최소 4주 이상, 종단연구는 2년 이상

(단, 연구목적에 따라 변경 가능)

대상자배정 무작위, 이중맹검

부작용예방대책 명백한 우식발생이 관찰되는 경우에는 실험 중단

기타요구사항 자발참여원칙, 피험자 서면 동의

(2) 치아기능 조절 관련 기능성 평가체계의 일반적인 구조

시험 구분 실험검사항목 기능성 평가 요건

시험관 실험

(In

vitro)

- S. mutans군 및 인체프라그에 의한 발효성

- S. mutans군의 발육에 미치는 영향

- 불용성 글루칸 합성유무

모든 실험 결과 만족

(시험관 실험 결과는

필수 제출 항목이 아님)

동물실험

(In vivo) - 우식유발성 시험 (Rat Model) 모든 실험 결과 만족

인체 실험

(In vivo)

- 함극법에 의한 프라그 pH 변화

- 치면세균막 형성력

- 탈회재결정화 측정

- 치면세균막형성도

- 구강내 우식원 세균 활성도

- 우식경험도

기능성 인정 제품별로 최

소 2개 이상의 실험결과

제시

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(3) 동물실험법

기능성 인정 성분이나 제품의 성상에 따라 고체시료와 액체시료로 나누어 각각에

맞는 표준 시험법을 제시하도록 하겠다 (백대일 et al., 1998).

가. 고체 시료의 경우

사료 성분

- 제 1군 : 설탕사료군

- 제 2군 : 옥수수 전분군

- 제 3군 : 피험 시료군

실험과정

쥐의연령

15 18 23 25 32 39 46 67(일)

사육일수 0 5 7 14 21 28 49

균의 감염과 동시에 피험감미료 사료로 사육

옥수수 전분군 보통사료 옥수수 전분사료

설 탕 군 보통사료 설탕사료

피험감미료군 보통사료 피험감미료 사료

균의 장착후에 피험 감미료 사료로 사육

옥수수전분군 보통사료 설탕사료 옥수수전분사료

피험감미료군 보통사료 설탕사료 피험감미료사료

↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑

항생제투여 감염 균의정착 확인

쥐에 대한 치아우식유발 모델 (Tsunchiro. et al., 1997).

분석항목 (세부 방법은 부록 참조)

- Dental plaque의 유기산 함량

- 경과 시간별 치아우식경험도

- 782 -

나. 액체 시료의 경우

실험과정

쥐의 월령 15 18 23 73

실험 기간 0 5 55

항생제 투여

균주 접종

매일 액체 시료 섭취

분석 항목 (고체 시료와 동일)

(4) 인체실험항목

측정항목 시험방법

치면세균막 pH변화 측정

Sampling

Microtouch

Telemetry

Microanalytic

탈회재결정화 측정 Intra experimental caries model

치면세균막형성도 Plaque index

구강내 우식원 세균활성도S. mutans count

Lactobacillus count

우식경험도 DMFT/ DMFS

가. 인체 시험 항목별 세부 요건과 결과 판정

치면세균막 pH 측정

식이 일반 식이

CE-2 고농도 설탕(20%) 식이

쥐 희생후 관찰

- 783 -

① 실험대상자 세부요건

- 최소 구강상태가 양호한 7인 내외 실험대상자

- 치면세균막은 2-3일간 축적

- 타액분비율, 타액완충능 정상

- 구강내 S. mutans의 양은 105CFU/㎖ 이상

② 판정기준

- 발효성 당질을 함유한 음식 섭취후 치면세균막의 pH가 5.7이하로 떨어지지 않

는 경우

- 음식섭취와 섭취후 30분 동안 치면세균막 pH저하가 5.7이하로 유지되지 않는

경우

치면세균막재형성율

① 원리 : 치면세균막 재형성율을 비교로, 실험 시료의 효능을 평가

② 실험 세부 사항

- 치면세균막 부착 정도 측정 (Quigley & Hein index 이용)

- 시료섭취 : 껌은 하루에 10분씩 5회 저작, 일반 시료는 하루에 3회 식음

- 관찰기간 : 실험 시작 후 2주, 4주, 6주

③ 결과평가 : 경과시간에 따른 치면세균막 부착도

구강내 우식원 세균 활성도 측정

실험 대상자의 자극성 타액이나 치면세균막의 s. mutans, Lactobacillus변화

측정

① 실험 방법 (Simple chairside methods, 예시)

- S. mutans count (Caries screen SM, Dentocult SM strip)

- Lactobacillus count (Dentoocult-LB)

② 실험 결과 판정 (Caries screen SM)

치아우식경험도

① 실험대상자 : 일반원칙준함

② 검사방법 : 육안검사

③ 관찰기간 : 1년이상

④ 검사기준 :

- 784 -

- WHO의 검사기준적용

- 치면별/치아별 우식경험도 (DMFS/ DMFT)의 변화정도를 측정

나. 인체 실험항목별 비교

측정항목 타당도 신뢰도질병위험도

예측력

치면세균막 pH변화 ◎ △ ◎

탈회재결정화 측정 ○ △ ○

치면세균막형성도 ○ ○ △

구강내 우식원 세균활성도 ○ ○ △

우식경험도 ◎ ◎ ◎

◎ : 매우높음 ○ : 높음 △ : 보통

치아기능조절을 통해 우식발생위험도를 감소시키기 위해서는 1) 치면세균막의 pH

를 저하시키지 않아야 하고 2) 구강내 우식원 세균이 활성도가 높지 않아야 하

며, 3) 치면 탈회를 억제하고 재결정화를 촉진하여야 한다. 이와 같은 지표를 측

정하기 위해서는 몇 가지 실험법이 사용될 수 있는데, 이번 과제 수행 중에 각

집락수 판 정

1 ~ 5만 무 활 성

5 ~ 10만 경도 활성

10 ~ 25만 중등도 활성

25만 이상 고도 활성

- 785 -

지표별로 타당도와 신뢰도 및 질병위험도 예측력의 항목으로 나누어서 검토해 보

았다. 그 결과는 아래의 표와 같다. 치아우식발생의 정량적인 결과를 가장 잘 나

타내는 우식경험도 측정은 장시간의 관찰기간을 요하지만 타당도나 신뢰도 및 질

병위험도 예측력 등에서 가장 뛰어난 방법이라 검토되었으며, 나머지 측정법들은

제시한 바와 같다. 그러므로 기능성을 평가하기 위해서는 적어도 2개 이상의 측

정을 통해 기능성을 검정 받을 필요가 있다고 사료되었다.

(5) 표준시험법 세부 내용

가. In vitro

In vitro의 경우 S.mutans군 및 인체 프라그 의한 발효성, S. mutans군의 발육에

미치는 영향, 불용성 글루칸 합성유무에 미치는 영향을 파악하기 위해서 세 가지

항목, 즉 항균성과 산 생성량, 균체 부착 억제 정도를 모두 실험해야 하는 것으

로 한다.

항균성 측정

① Brain heart infusion broth에 균수가 105가 되도록 S.mutans를 배양한다.

② 37℃ incubator에서 24시간 동안 배양한다.

③ 시료 추출물을 다양한 농도로 하여 넣는다. 대조군은 시료 추출물 대신 멸균

수를 넣는다.

④ 37℃ incubator에서 48시간 동안 배양한다.

⑤ Paper disc법을 이용하여 항균성을 측정한다.

산생성량 측정

① Brain heart infusion broth에 시료 추출액을 다양한 농도로 넣는다. 대조군

은 시료 추출물 대 신 멸균수를 첨가한다.

② 균수가 105∼106이 되도록 S.mutans를 접종한다.

③ 37℃ incubator에서 48시간 동안 배양한다.

④ 배지 속에 분비된 산 생성량을 HPLC를 이용하여 측정한다.

균체 부착 억제 정도

① 50㎖의 glass tube에 1% sucrose를 함유한 BHI (brain heart infusion)

broth를 10㎖넣고 시료 추출물을 다양한 농도로 넣는다. 대조군은 시료 추출

물 대신 멸균수를 첨가한다.

② S.mutans가 105이 되도록 접종한다.

- 786 -

③ Glass tube를 30°기울인 상태로 37℃ incubator에서 24시간 동안 정치배양한

다.

④ 배양한 후 0.5M NaOH 용액을 5㎖ 가하여 벽면에 부착한 균체를 현탁시킨다.

⑤ 현탁액 1㎖를 취하여 550nm에서 흡광도를 측정한다.

나. In vitro-preparation of the specimen

법랑질 시편제작 (Bovine Incisor/Human Premolar)

- 매몰형 모델 (embedded model) : 우전치의 순면을 직경 6mm되게

다이아몬드드릴로 삭제한 후에 methylmethacrylate레진에 포매한다. 법랑질의

표면은 200~600 grit의 연마제로 연마한다 (Fig. 2).

Fig. 2. Embedded model

- 원판 모델 (DISC model)

법랑질을 직경이 3mm가 되게 원통형을 삭제한 후에 0.5mm두께가 되게 법랑질

부분을 micro-sectioning machine으로 자른다. 모든 원판을 현미경으로

관찰하여 상아질 부위를 완전히 제거한 뒤에, 표면을 silicon-carbide paper

(1,200~4,000grit)로 연마한다. 원판을 에탄올 (70%) 세척과 초음파 세척하여

잔사를 제거하고 건조시킨다. 원판의 측면과 바닥을 Platinum 코팅을 하거나

레커칠을 한다.

수산화인회석원판 제작

① 10ml의 증류수에 acrylamide gel 9g과 bisacrylamide 0.24g을 넣어 용해

② ①용액 4ml에 증류수 1.7ml와 ammonium persulfate (0.15g/10ml) 및 TEMED 2

㎕를 혼합하여, 60%의 polyacrylamide gel을 제조

- 787 -

③ 3g의 수산화인회석현탁액을 넣은 삼각플라스크에 첨가하여, vortexing

④ ③을 micropipette으로 300㎕씩 multiwell plate에 분주

⑤ 상온에서 4시간 경화

⑥ 건조된 polyacrylamide수산화인회석원판을 multiwell plate에서 분리

⑦ 180℃ furnace에서 10분간 구움

탈회용액의 예시

- 0.05M KCl 완충용액 (1mM phosphate(pH 6.0), 1mM CaCl2, 0.1mM MgCl2)

- 0.1M lactic acid에 6wt% hydroxyethyl cellulose를 첨가하고 NaOH로 pH

4.0되게 조정

인공치면세균막 형성법 예시

- 0.75% agarose와 50mmol/L glucose를 첨가한 YEPC (0.5% yeast extract, 0.1%

peptone, 0.85% Nacl, 0.05% L-cysteine HCL, 10% v/v glycerin)에 S.mutans

cells(A660= 3.0)접종하여 37℃에서 22시간 배양

Surface Microhardness (SMH) : Vickers' / Knoop

- Enamel surface에서 정확히 200㎛를 삭제

- Initial hardness test - 초기경도 측정 후 법랑질 시편을 그룹당 10개씩 동일

한 경도가 되도록 분류

- 탈회 유발

- SMH를 6군데에서 Harness 측정

- 시료에 정해진 순서에 따라 일정시간 담그고 SMH 측정

다. In vivo (Animal Study)

Dental Plaque의 유기산 함량 (동물실험)

① 턱을 무균 처리하여 제거하고 275mM glucose solution 30㎕로 5분 동안 tooth

surface를 씻어낸다

② 냉동된 HPLC reagent 1㎖에 넣고 320W에서 three 10-s bursts해서

Braun-sonic 1510 probe로 sonication시킨다.

③ suspension은 10분 동안 1200g 냉동 centrifuge에서 centrifuge 0.2㎛

microfiltrefuge tube를 통해 거르고 -20℃에서 얼린다.

④ carboxylic acid를 분리하기 위해 Perkin-Elmer chromatograph와 partition

HPLC column을 사용하는 HPLC로 분석한다.

⑤ Citric, pyruvic, succinic, lactic, formic, acetic, propionic,

- 788 -

isobutyric, butyric, isovaleric acid로 standard를 잡아서 HPLC 결과와 비

교 한다.

미세경도 측정

① Sprague-Dawley계 자성 백서 60마리를 생후 3주경을 분양받아 1주일간의 적응

기간을 가지도록 한다.

② 원하는 기간동안 다양한 농도로 시료를 제공한다. (단,실험 기간은 적어도 8

주 이상이 되도록 한다.)

③ 섭취 기간이 끝나면, ethyl ether로 흡입 마취시킨 후 dental rotary engine

에 연결된 low speed용 disk로 백서 절치를 gingival line 상에서 절단한다.

④ 절단한 치아 시료는 수세, 세마시킨 후 생리식염수에 담아 4℃의 냉장고에 보

관한다.

⑤ window가 형성된 백서 절치 시료를 청량 음료 20cc에 2시간 침지시킨다.

⑥ 채취된 백서 상악절치는 가능한 4mm2이상의 절편이 나오도록 절단하여 총 72

개의 법랑질 시편을 만들어 탈회된 평활면을 제외한 모든 면이 포매되도록

unsaturated polyester를 이용하여 지름 10mm, 높이 15mm 정도의 원기둥을 제

작하고, 포매된 시편의 장축에 대해 법랑질 조직표면이 수직이 되도록 #1200

silicone carbide paper로 연마하고, 알루미나 분말로 최종 연마하여 표면미

세경도 측정을 위한 시료로 준비한 후 Vicker's diamond indenter가 부착된

미세경도측정기를 이용하여 시편당 3개 부위의 미세경도를 측정한다.

⑦ 이상과 같이 초기표면미세경도를 측정한 시료들의 평균을 구하여 평균±2 S.D

내의 시료만을 수집하여 이들 시료만을 대상으로 청량음료에 침지시킨 후 다

시 표면미세경도를 측정한다.

라. In vivo (Human Study)

In vivo의 경우 전극법에 의한 프라그 pH 변화, 치면 세균막 형성 억제 효과 및

S.mutans의 균수 측정 중 2가지 이상을 실험해야 하는 것으로 한다.

치면 세균막 형성 억제 효과

① 실험 대상자는 40명 정도여야 하며 실험 기간동안 항생제의 복용과 실험에

영향을 미칠 수 있는 구강진료수취를 금한다.

② 모든 실험 대상자에게 치면 세균막 부착 정도를 측정하고 치면 세마를 하여

치면세균막지수가 0이 되도록 한 후 두 군으로 나누어 한 군에는 실험 시료

를, 다른 한 군에는 대조 시료를 하루에 3회씩 식음하도록 한다.

③ 실험 시작 후 2주, 4주, 6주 동안 치면세균막 부착정도를 관찰한다.

- 789 -

치면세균막 부착 정도 측정

Turesky가 변형한 Quigley와 Hein의 치면 세균막 평점 기준에 따라, 각 실험 대

상자의 협설측 치면을 각각 근심 원심 중앙치면으로 구분하여 6개 부위를 측정하

고, 측정대상치아는 15, 13, 26, 36, 32, 44번 치아로 한다.

<Turesky가 변형한 Quigley와 Hein의 치면 세균막지수의 기준>

0 : 치면세균막 불부착

1 : 치은연부에 점상부착

2 : 치은연을 따라서 선상부착(넓이가 1mm이하)

3 : 치경부측 1/3까지 치면 세균막이 있는 경우

4 : 치경부측 2/3까지 치면 세균막이 있는 경우

5 : 치경부측 2/3를 넘어서 치면 세균막이 있는 경우

S.mutans 수의 측정

① 실험 대상자는 40명 정도여야 하며 실험 기간동안 항생제의 복용과 실험에 영

향을 미칠 수 있는 구강진료수취를 금한다.

② 모든 실험 대상자에게 S.mutans수를 측정하기 위한 타액을 채취하고 치면 세

마를 하여 치면세균막지수가 0이 되도록 한 후 두 군으로 나누어 한 군에는

실험 시료를, 다른 한 군에는 대조시료를 지급한다. 실험 대상자들은 하루에

3회씩 시료를 섭취하도록 한다.

③ 실험 시작일, 시작 후 2주, 4주, 6주에 소환하여 s. mutans수를 측정하기 위

한 타액을 채취한다.

④ 15㎖ Falcon tube에 멸균된 0.1% 펩톤 용액을 5㎖씩 분주하여 40개를 준비한

후, 실험 대상자가 펩톤 용액을 15초간 수구하게 한다.

⑤ 펩톤 용액을 멸균된 0.067M Phosphate buffer 용액 (pH 7.2)으로 10배 희석한

다.

⑥ 희석한 용액의 100㎕를 취하여 Mitis Salivarius Agar (MSA)에 분주하고, 멸

균된 bending glass로 평판에 전체적으로 도말하고, 37℃ 배양기에 12시간 배

양 후, Anaerobic chamber에서 37℃ 48시간 동안 다시 배양하고, colony

counter를 이용하여 각 배지에서 S.mutans의 colony를 측정하여 기록한다.

프라그 pH 변화측정법　　

- Plaque sampling method: 치면세균막 채취 즉시 이온선택전극 (combination

type)을 이용하여 측정하는 방법

① 실험대상자의 치면을 세마한 뒤에 3일간 해당 부위는 3일간 잇솔질을 금하도

록 한다.

- 790 -

② 3일째 되는 날 내원하여 실험군과 대조군이 해당 시료로 양치하게 하여 pH의

변화를 50분간 관찰한다.

③ 축적된 치면세균막은 협면, 설면, 인접면에서 아말감 조각도나 기타 날카로운

도구를 이용하여 채취하도록 한다.

④ 채취한 치면세균막 0.05ml정도를 증류수에 풀어서 채취후 20초 안에 pH의 변

화를 측정한다.

⑤ 매 측정 전에 전극은 측정전후에 pH 완충액을 이용하여 Calibration하도록 한

다.

- Microtouch method

Pallidium touch microelectrode (D: 0.1mm) 이용하여 직접 치간사이의 치면세

균막에서 측정하는 방법으로 이 부위에 reservior역할을 하는 것을 부착해 둘

필요는 없다.

① 구강내 수복물이 없는 부위를 선정한다.

② 전극접촉부위는 치간접촉점 직하방으로 한다.

③ 제작한 glass electrode와 refence electrode는 3mol/L KCL 용액으로 salt

bridge를 형성하여 측정하도록 한다.

④ 매 측정 전에 전극은 측정전후에 pH 완충액을 이용하여 Calibration하도록 한

다.

- Telemetric method

Glass pH electrode (D: 2 mm)를 이용하여 가철성 의치에 부착되어 있는 인공

치면에 축적된 치면세균막의 pH 농도변화를 측정하는 방법

① 환자의 하악을 인상채득한 뒤에 가철성 의치를 제작하고, 이의 협면에 우치를

삭제하여 삽입한 뒤, 멸균하여 실험기간동안 장착하도록 한다.

② 잇솔질시를 제외하고 의치를 장착하도록 한다. 의치를 장착하고 있는 동안은

일체의 구강환경관리를 금하며, 단지 물로 양치만 실시하도록 한다. 최소 4일

동안 치면세균막을 축적하도록 한다.

③ 실험대상자는 적어도 측정 2시간 전부터는 음식물과 음료의 섭취를 금하도록

한다.

④ 매 측정 전에 전극은 측정전후에 pH 완충액을 이용하여 Calibration하도록 한

다.

⑤ Reference electrode는 skin reference electrode를 사용한다.

⑥ 측정이 완료되면 실험대상자의 치면을 연마해 주도록 한다.

- 791 -

- S. mutans 수의 측정

① 모든 실험 대상자의 타액채취 후, 치면 세마.

② 치면세균막지수가 0이 되도록 한 후 두 군으로 나누어 실시.

③ 실험 대상자들은 하루에 1~3회씩 시료를 섭취하도록 한다.

④ 실험 기간 : 실험 시작일, 시작 후 2주, 4주, 6주

⑤ 자극성 타액 혹은 5㎖ Falcon tube에 멸균된 0.1% 펩톤 용액 5ml으로 펩톤 용

액을 15초간 수구하게 한다.

⑥ 자극성 타액 혹은 펩톤 용액을 멸균된 0.067M Phosphate buffer 용액 (pH

7.2)으로 10배 희석한다.

⑦ 희석한 용액의 100㎕를 취하여 Mitis Salivarius Agar (MSA)에 분주하고, 멸

균된 bending glass로 평판에 전체적으로 도말하고, 37℃ 배양기에 12시간 배

양하고, Anaerobic chamber에서 37℃ 48시간 동안 다시 배양한 후, colony

counter를 이용하여 각 배지에서 S.mutans의 colony를 측정 기록한다.

- Strip mutans technique (Dentoocult-SM): 20% sucrose를 함유한 선택적인

mitis salivarius broth에서 mutans streptococci의 ability를 측정하는 방법

① Sampling : 둥근 plastic strip을 함유하고 있는 kit를 사용

② 배양액에 5㎍의 bacteriocin tablet을 broth에 첨가

③ Paraffin gum을 저작 2분 후에, plastid strip을 후설면에서 회전하여 saliva

film을 채취하여 양을측정

④ 37℃에서 48시간 배양 후 결과판정

- Dip slide method for lactobacilli count: Salivary lactobacilli의 수

(selective agar이용, Dentocult-LB method)

① Paraffin-stimulated saliva : 각각 슬라이드에 떨어뜨림

② 슬라이드를 plastic container에 끼워 넣고 4일 동안 37℃에서 배양

③ Agar 표면의 군집 생성 여부 관찰

4. 참고문헌

곽노성, EU의 건강식품 관리 제도, Reading university, UK

김가영(1997) 한국식품위생안전성학회지, 12(2); 102-106.

김옥수 et al.(2002) 대한치주과학회지, 32(1); 235-242.

김종배 et al.(1990) 대한구강보건학회지 14(1); 27-33.

김종배 et al.(1991) 대한구강보건학회지, 15(2); 187-193.

- 792 -

김종배 et al.(2001) 공중구강보건학, 고문사

김종배 et al.(2001) 예방치학, 고문사

남상해 et al.(1998) 한국농화학회지, 41(5); 395-398.

데이코산업연구소(2002) 기능성 식품 시장의 현황 및 전망, 데이코산업연구소

배광학 et al.(2001) 대한구강보건학회지, 25(1); 51-59.

백대일 et al.(1998) 치아를 지키는 감미료, 도서출판 건치, 15-83

변상희 et al.(1998) 한국식품과학회지, 30(2); 446-449.

보건복지부(1998) 국민건강 영양조사, 보건복지부

보건복지부(2000) 국민구강건강실태조사, 보건복지부

송근배 et al.(2002) 대한구강보건학회지, 26(2); 219-231.

식품의약안전청(2003) 건강기능식품공전안, 식품의약안전청

식품의약품안전청(2002) 기능성 식품의 합리적 관리체계 구축을 위한 연구, 식품

의약품안전청

신승철 et al.(1998) 대한구강보건학회지 22(1); 19-26.

신형식 et al.(1996) 원광치의학, 6(1); 313-319.

여생규 et al.(1995) 한국영양식량학회지, 24(2); 293-298.

유승한 et al.(2003) 원광치의학, 12(1); 395-407.

윤석영 et al.(2002) 한국식품과학회지, 32(1); 168-173.

이재춘 et al.(2002) 원광치의학, 11(2); 139-150.

이정환 et al.(1998) 대한구강보건학회지, 22(4); 275-288.

장귀현 et al.(2000) 한국식품과학회지, 32(6); 1396-1402.

정진광 et al.(2001) 대한치주과학회지, 31(1); 149-165.

한국보건산업진흥원(2002) 신규 건강기능식품의 기준, 규격 및 시험법 제정을 위

한 연구, 식품의약품안전청

한국식품과학회(2002) 건강기능식품의 기능성 표시 및 평가 방향, 한국식품과학

회

한상헌 et al.(2001) 대한치주과학회지, 31(2); 287-298.

Aaltonen AS.(2000) Octa Odontol Scand., 58(6); 285-292.

Arends J.(1990) Caries Res., 24(4); 256-257.

Assev S. et al.(2002) Oral Microbiol Immunol., 17(2); 95-99.

Bechers HJ.(1988) Caries Res., 22(3); 166-173.

Bolton RW.(1981) J Dent Res., 60(5); 878-882.

Borggreven JM.(1989) Effects of surface-active compounds on the

demineralization of dental enamel., 23(4); 238-242.

Borggreven JM.(1991) Caries Res., 25(4); 264-267.

Borggreven JM.(1991) Caries Res., 25(1); 34-38.

- 793 -

Borggreven JM.(1992) Caries Res., 26(2); 84-88.

Bowen WH.(1990) Arch Oral Biol., 35(10); 839-844.

Bowen WH.(1992) J Dent Res., 71(5); 1166-1168.

Cole MF.(1980) Caries Res., 14(1); 1-15.

Courtesy Navia JM.(1994) Am J Clin Nutr, 59(Suppl.); 719-727

Essig ME.(1985) J Dent Res., 64(8); 1065-1068.

Firestone A.R.(1982) J Dent RES, 61(10); 1130-1136.

Firestone AR.(1986) J Dent Res., 65(7); 1020-1023.

Gaffar A.(1998) Int Dent J., 48(1); 32-39.

Greenwood M.(1984) Caries Res., 18(5); 447-449.

Grenby TH.(1980). Caries Res., 14(4); 210-220.

Grenby TH.(1983) Arch Oral Biol., 28(8); 745-728.

Grenby TH.(1988) Caries Res., 22(5); 269-275.

Grenby TH.(1988) Caries Res., 22(5); 288-296.

Grenby TH.(1989) Caries Res., 23(5); 315-319.

Havenaar R.(1984) Caries Res., 18(3); 269-277.

Havenaar R.(1984) Caries Res., 18(4); 375-384.

Havenaar R.(1984) Arch Oral Biol., 29(12); 993-999.

Havenaar R.(1984) J Dent Res., 63(2); 120-123.

Hefti A.(1980) Caries Res., 14(3); 136-140.

Hietala EL (1995) Arch Oral Biol., 40(12); 1137-1141.

Hiliam, M.A.(1998) The Market for Functional Foods., Leatherhead Food RA

Special Report.

Honeyman AL.(1992) Infect Immun., 60(8); 3369-3375.

Hujoel PP.(1994) J Dent Res., 73(2); 573-579.

Imfeld T. et al.(1991) Caries Res, 25; 352-358.

Karle EJ.(1987) Dtsch Zahnarztl Z., 42(9); 835-840.

Kimmel L.(1991) Oral Microbiol Immunol., 6(5); 275-279.

Leach SA.(1980) Caries Res., 14(1); 16-23.

Lingstrom P. et al.(1993). J Dent Res., 72(5); 865-870.

Luke GA.(1999) Caries Res., 33(2); 123-129.

Makinen KK.(1985) J Am Dent Assoc., 111(5); 745-751.

Makinen KK.(1996) Spec Care Dentist., 16(3); 104-115.

Newbrun E.(1992) J Am Dent Assoc., 123(5); 68-73.

Ooshima T.(1992) Caries Res., 26(1); 33-37.

Ooshima T.(2000) Archives of Oral Biology, 45; 639-645.

- 794 -

Petersson LG.(1991) Caries Res., 25(1); 74-79.

Pienihakkinen K.(1987) Scand J Dent Res., 95(5); 397-404.

Pollard MA.(1995) Caries Res., 29(1); 68-74.

Primrose J.(1989) Caries Res., 23(3); 165-167.

Rekola M.(1986) Acta Odontol Scand., 44(5); 285-290.

Rekola M.(1987) Caries Res., 21(1); 87-94.

Rundegren J.(1980) Caries Res., 14(2); 67-74.

Scheinin A.(1985) Acta Odontol Scand., 43(6); 381-387.

Scheinin A.(1993) Acta Odontol Scand., 51(4); 241-246.

Senti R.(1986) Health aspects of sugar alcohols and lactose, federation of

Americal Societies for experimental biology.

Sintes JL et al.(2002) Am J Dent., 15(4); 215-219.

Sintes JL.(1995) Am J Dent., 8(5); 231-235.

Smits MT.(1985) Caries Res.. 19(6); 528-535.

Smits MT.(1988) Caries Res., 22(3); 160-165.

Tenovuo J.(1997) J Oral Rehavil., 24(5); 325-331.

Tjaderhane L.(1995) Eur J Oral Sci., 103(3); 166-171.

Tseveenjiv B.(2002) Eur J Dent., 6(2); 74-78.

Tung MS.(1985) Caries Res., 19(1); 72-75.

Twetman s.(1995) Swed Dent J., 19(3); 103-108.

Vogel GL.(1997) J Dent Res., 76(2); 673-678.

Walton AG.(1998) Br Dent J., 185(6); 288-289