1중단위과제 결과요약

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약물대사기반연구사업단

중단위 요약 장내미생물 배양법을 이용한 미생물대사체 독성 평가시험법 개발중단위 요약 장내미생물 배양법을 이용한 미생물대사체 독성 평가시험법 개발중단위 요약 장내미생물 배양법을 이용한 미생물대사체 독성 평가시험법 개발중단위 요약 장내미생물 배양법을 이용한 미생물대사체 독성 평가시험법 개발2009-2011. / 1 ( )2009-2011. / 1 ( )2009-2011. / 1 ( )2009-2011. / 1 ( )

장내미생물에 대한

독성 평가기술 개발

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제 중단위 연구과제제 중단위 연구과제제 중단위 연구과제제 중단위 연구과제< 1 >< 1 >< 1 >< 1 >

요약문1. ·············································································································3

연구개발 내용 및 방법1-1. ···········································································3

연구결과 고찰 및 결론1-2. ···········································································9

연구개발 목표2. ·······························································································11

연구내용2-1. ···································································································11

기대성과2-2. ···································································································12

표 세부과제별 연구목표와 내용. ······································································13

연구의 내용 및 방법3. ······················································································14

세부과제3-1. 1-1 ·························································································14

세부과제3-2. 1-2 ·························································································15

세부과제3-3. 1-3 ·························································································15

최종 연구결과4. ·································································································17

차년도4-1. 1 ····································································································17

차년도4-2. 2 ····································································································20

차년도4-3. 3 ····································································································25

연구결과 고찰 및 결론5. ··················································································30

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요약문요약문요약문요약문1.1.1.1.

중과제 연구개발 내용 및 방법중과제 연구개발 내용 및 방법중과제 연구개발 내용 및 방법중과제 연구개발 내용 및 방법1-1. 11-1. 11-1. 11-1. 1

가 연구내용가 연구내용가 연구내용가 연구내용....

장내미생물에 의한 독성평가 기술 개발장내미생물에 의한 독성평가 기술 개발장내미생물에 의한 독성평가 기술 개발장내미생물에 의한 독성평가 기술 개발○○○○

장내미생물 배양법을 이용한 미생물 대사체 독성 평가시험법 개발 장내세균- :

총의 배양법 확립 세포독성평가법의 개발 및 확립 세포수준의 면역독성평가 세, , ,

포 및 분자수준의 유전독성 평가 및 표준작업수순서의 작성을 수행함, .

건강한 한국인 인 이상를 선발하여 기준 설정- 100 fecalase

독성시험을 위한 효소복합체 개발 건강한 한국인 인- In vitro (fecalase) : 100

이상의 신선한 분변을 수집하여 성별 연령별 분류 등 개, , -glucuronidase 10β

이상 효소활성을 분석 등 개 이상의 천연 기질에 대한 활성, ginsenoside Rb1 10

분석 의약품 천연추출물 개 이상 을 이용한 함유성분에 대한 활성, , (10 ) fecalase ,

기질특이성 대사반응 분석 식품 의약품 등의 섭취 등에 의한 의 활성, , , fecalase

의 변화 분석 장내세균총의 대사체를 대신할 한국인 표준 활성 기준, fecalase

확립 및 개발 등의 연구를 수행함fecalase

미생물의 대사 작용에 의한 독성여부 평가를 위한 모델 정립 무균- in vivo :

동물의 확보 및 장내미생물의 정착 모델 개발 무균동물 및 정착동물의 유지 독, ,

성평가 장내미생물 정착동물을 이용한 독성동태 연구 항생물질에 의한 화학물질, ,

독성동태의 변화에 관한 연구 및 장내미생물 대사를 통한 독성평가 기술in vivo

에 관한 표준작업수순서 작성 등의 연구를 수행함.

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장내미생물 응용 식품 의약품 등 독성평가 수행 개발된 평가기법을 활용하- · :

여 식품 및 의약품 등에 대하여 독성평가를 수행함.

나 연구방법나 연구방법나 연구방법나 연구방법....

장내미생물총 대사체의 에서 독성평가장내미생물총 대사체의 에서 독성평가장내미생물총 대사체의 에서 독성평가장내미생물총 대사체의 에서 독성평가in vitroin vitroin vitroin vitro

대사체 규명 각 시험물질이 장내미생물에 의한 대사과정을 거쳐- In vitro :

생성되는 대사체의 종류와 구조를 규명하기 위하여 독성물질과 장내미생물을 일

정시간 배양한 시료에서 대사체 분석실험을 수행함.

임파구 증식능 독성 영향에 대사과정이 역할을 하는지를 파악하기- In vitro :

위한 연구의 일환으로 시험물질을 비장세포 배양액에 처리하여 임파구 증식능 시

험을 수행함.

세포 내 측정 세포 내 의 양은 형광 인 을 사용하- ROS : ROS probe DCF-DA

여 측정함.

를 이용한 세포독성 측정 에 세포농- MTT assay : 96-well microtiter plate

도를 조절하여 넣고 미생물 대사 독성 물질을 농도별로 처리 한 다음 배양함 배.

양액을 에 를 첨가하여 준비한MTT labeling reagent electron coupling reagent

후 파장에서 흡광도를 이용하여 미생물 대사 독성 물질의 세포독성을550 nm

조사함.

배양액 내 측정 활성은 기- lactate dehydrogenase (LDH) leakage : LDH

질 가 로 감소되는 정도를 조사하여 측정함pyruvate lactate .

을 이용한 세포 사멸 관련 유전자 발현 측정 시료를- RT-PCR : guanidium

에 용해시키거나 용액을 이용하여 전체 세포내 를 분thiocyanate RNA zol RNA

리한 다음 을 이용하여 를 분리한 후, oligo-d(T) cellulose spin column mRNA

합성한 를 이용하여 세포 사멸 관련 유전자 발현을 이들 유전자에 특이적cDNA

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인 를 이용한 로 증폭시킨 후 이들 유전자의 발현 양상을 측정함primer PCR .

를 통한 발현 조절 인자 측정 및 발현 조절 측정 유전- Repoter assay : p53

자의 발현을 활용한 유전독성 물질에 대한 이들 유전자의 전사 활성도에 대한 영

향을 조사하기 위하여 인간 에서 각각의 프로모터 부분을 방genomic DNA PCR

법을 이용하여 유전자가 발현되는 벡터에 삽입하여luciferase pGL3 luciferase

유전자가 발현되도록 재조합 플라스미드를 제조함 형질전환시킨 후 미생물 대.

사 독성 물질을 처리하고 시간 후에 세포 추출물을 얻어 활성을24 luciferase

측정함.

에 의한 유전독성 측정 세포를 에 넣고 미생물- Comet assay : 6-well plate

대사 독성 물질을 처리 한 후 시간 동안 배양 후 새로운 배지를 교환 후 세포24

를 모아 로 후 원심분리하여 시킨 후 전기 연동하여 손상PBS washing lysis DNA

정도를 측정함.

세포배양 거식세포주 은- RAW 264.7 : RAW 264.7 (ATCC TIB-71) 10%

그리고fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units/ penicillin,㎖

이 함유된 배지를 이용하여100 / streptomycin RPMI 1640 37㎍㎖ ℃

에서 배양함humidified 5% CO2 incubator .

을 이용한 및 염증성 유전자의 발현 측정 분- RT-PCR COX-2 cytokines :

리한 와 와 를mRNA oligo d(T)18 primer superscript reverse transcriptase

이용하여 를 합성하고 합성한 를 이용하여cDNA cDNA COX-2, IL-1 , IL-6β

및 의 발현을 아래의 를 이용하여 로 증폭시킴 또한 정량적TNF- primer PCR .α

분석을 위하여 하여 제조한 와 합성한 를cloning artificial competitor cDNA

로 하여 을 이용하여 측정함template semiquantitative PCR .

염증성 의 생성량 측정 을 배양하여 미생물 대사 독- cytokines : RAW 264.7

성 물질을 처리한 뒤 상층을 이용하여 대표적 염증성 인cytokine IL-1 ,β

의 생성량을 로 측정함IL-6, TNF- ELISA .α

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를 이용하여 및 활성도 측정- COX-2 plasmid transfection luciferase : Raw

을 를 이용하여 형질전환 시킨 후 세포 추출물을264.7 cell LipofectAMINE Plus

얻어 활성도 측정에 사용함lLuciferase .

과 정량- pLUC(NF- B)3, pLUC(AP-1)3, transfection LUC : COX-2κ

의 부위를 하여 이들을 활성을 갖는promoter clonling luciferase

에 삽입시켜 재조합 플라스미드를 만들어pLUC-promoter vector , NF- B,κ

전사촉진제의 활성도에 의존적으로 유전자가 발현되도록 함Ap-1 luciferase .

세포에 를 이용하여 과 를LiphofectAMINE pLUC( B)3 pLUC(AP)3κ

시킨 다음 시간 배양한 후 미생물 대사 독성 물질을 처리 한 후transfection 24 , ,

를 만들고 상층액만을 취하여 활성도를 측정함lysate luciferase .

활성 분석 및 제조활성 분석 및 제조활성 분석 및 제조활성 분석 및 제조FecalaseFecalaseFecalaseFecalase

대상 우리나라 건강한 성인 중 최근 주간 약물복용경험이 없는 자 특히- : 2 ,

최근 주간 항생제에 노출되지 않은 자을 중심으로 명 이상을 대상으로 함2 100 .

검체수집 대상자의 신선한 분변 그램 이상 채취하여 신속하게 배의 희- : 5 20

석용 혐기성배지 또는 환원제첨가 수로 현탁하여 제조함peptone .

분변시료의 조제 현탁액을 원심분리하여 상등액을 채취하고 채취한 상등액- : ,

을 에 넣고 원심분리하여 상등액은 버리고 동량의 희석용 혐기microcentrifuger

성배지에 현탁하여 제조함.

합성기질을 이용한 효소활성 측정 합성기질 종 이상- : 4-Nitrophenyl- 10

의 활성을 측정함.

천연물 분리 성분의 활성 분석- : purarin, mangiferin, amygdalin, arbutin

등의 의 대사활성을 분석함.

상관성 분석 통계방법은 을 이용하여 군간의 비교는- : SPSS for win 8.0 2

로 하였으며 각군간의 효소활성치 비교는independent T-test ,

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혹은 로 사후검정은 로Wilcoxon-signed test ANOVA test , Duncan Test P

이하인 경우를 유의성 있는 것으로 판단함value 0.05 .

무균동물 확보 유지 및 공급 시스템 확립 무균동물을 유지하고 있는 일본- , :

의 한 연구소로부터 확보한 무균동물을 에서 유지하면서 정기적인 미생물isolator

검사를 실시하여 무균상태로 사육되는지에 대한 조사를 실시하였으며 무균 환경,

에서 동물을 번식시켜 실험에 필요한 동물수량이 원활하게 공급될 수 있도록 함.

장내 미생물총을 적용한 동물모델 확립 선정된 장내 미생물을 무균동물에- :

정착시키고 미생물 검사를 실시하여 정착시킨 미생물이 정착되었는지에 대한 검

증을 실시하고 확보된 정착균동물을 에서 유지하면서 미생물 검사를 실, isolator

시하여 정착균상태로 사육되는지에 대한 조사 실시하였으며 차년도에는 정착균, 2

동물을 번식시켜 실험에 필요한 동물수량이 원활하게 공급될 수 있도록 하였고,

차년도에는 단기간 정착 후 실험에 사용하고자 하였음3 .

장내 미생물총을 적용한 동물모델의 독성물질 대사연구 정착균동물과 대조- :

무균동물을 활용하여 독성대사체 연구를 수행함 장내미생물에 의한 대사는 환원.

반응 가수분해 반응 등이 주를 이루므로 과 같은 표준 독성물질을 활용하, arbutin

여 혈액 중의 독성물질과 대사체 분석 조건 등에 대한 연구를 수행함 먼저 시험.

물질과 대사체 분석을 위한 를 시행하여 분석법을 확립하고 각validation test ,

시험물질이 장내미생물에 의한 대사과정을 거쳐 생성되는 대사체의 종류와 구조

를 규명하기 위하여 독성물질을 투여한 동물에서 채취한 시료에서 대사체 분석실

험을 수행함.

장내미생물 대사 독성평가 모델의 개발 시험군을 군 정착균동물- In vivo : (I )

군 군 무균동물군 군 동물군으로 구성하여 선정된 시험물질을 투여, (II ) , (III ) SPF

하고 일정 시간 간격으로 혈액 시료를 수집하였으며 시험물질 투여 전 시간, , 3

정도를 절식시킴 채혈 종료 후 동물들을 마취하에 개복하여 후대정맥에서. ether

채혈을 실시한 후 외표 피하 복강장기 흉강장기 등을 육안적으로 검사하였음, , , .

후대정맥에서 채혈한 혈액을 혈청분리관에 넣고 원심분리하여 획득한 혈청을 이

용하여 혈청생화학 시험을 수행함 계획도살 시까지 생존한 모든 동물에 대하여.

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부검 후 몇 가지 장기에 대하여 절대장기 중량을 전자저울을 이용하여 측정한 다

음 장기를 고정하여 대조군과 시험물질군의 장기를 파라핀 포매하고 로 박, , 4 ㎛

절하여 염색 표본을 만들어 광학현미경 하에서 검경함H&E .

항생제 처치에 의한 대사 특성 변화 연구 정상동물 랫드 수컷 및- : (SD ICR

마우스 수컷 에 종의 항생제를 처치한 시험군과 대조군을 설정함 정상 동물과) 3 .

항생제 처치 동물에서 장내미생물총을 시험하여 항생제 처치시 미생물총의 변화

를 시험하여 항생제 처치 시 장내미생물총의 변화에 대한 정보를 수집함 항생제.

처치 시 독물동태 연구를 위하여 장내미생물에 의한 대사가 알려진 에 대baicalin

하여 정상동물군과 항생제 처치동물 간의 평가를 수행하여 동태 변화를 비교하였

으며 각 시험군에서의 독성물질과 가능한 경우 대사체를 분석하여 실제 장내미,

생물에 의한 대사가 화학물질의 독성작용에 미치는 영향을 시험함.

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1-2.연구결과 고찰 및 결론

세부과제1-1○

장내미생물 대사독성 기술개발을 위해 장내미생물 배양 사람 분변In vitro ,

를 독성물질 대사계로 활용하여 대사활성화계를 평가하였고 독성평가fecalase ,

기술의 개발을 위해서는 각종 동물세포배양에서의 분자수준의 유전독성 및 면역

독성 등의 평가지표를 개발함 이는 기존의 장내미생물 활용 독성 평가에서는 대.

부분 미생물을 이용한 시험에 제한적으로 연구가 수행되었지만 본 연구에서는 동

물세포 배양계를 접목하였다는 점이 특징적이었고 단순한 독성평가보다는 독성,

기작을 분자수준에서 판단할 수 있는 시험들을 개발함 향후 장내미생물 효소계.

에 대한 표준화와 독성시험의 확립을 위한 추가 연구를 수행한다면 독성평가 기

술의 새로운 패러다임을 제시할 것으로 판단됨

세부과제1-2○

장내세균총 유발 독성 평가를 위한 장내세균효소복합체 개발을 위하여 건강한

한국인의 분변으로부터 합성기질 천연성분 의약품 색소제에 대한 대사활성을, , ,

분석하였고 한국 성인 장내세균총의 대사반응계인 표준 를 개발하여 표, fecalase

준화하였고 연령별 성별에 따른 장내미생물 대사활성을 비교 분석하였음 이를, , .

통해 사람의 장내미생물총의 효소활성에는 개인차가 상당히 크다는 사실을 확인

할 수 있었고 성별이나 연령에 따른 차이는 없었음을 알 수 있었음 또한 장내미, .

생물총의 효소활성은 항생물질에 의해 급격히 감소하였으며 한약 및 기능성식품,

으로 사용되고 있는 인삼이나 황금의 주성분은 장내세균에 의해 대사되며 장내,

세균총에 의해 생성된 대사체들의 생리활성이 더 강했졌으나 괴화추출물은 유전,

독성 평가에 를 이용하여 유전독성이 더 높아짐을 밝힘 또한 사람의fecalase .

를 대신할 수 있는 사람분변미생물로 제조한fecalase intestinal bacterial

을 개발하고 이를 이용하여 유전독성평가실험 에 적용enzyme mix , (Ames test)

하여 사용 가능함을 확인함 와 는 제. Fecalase intstinal microbial enzyme mix 1

세부과제에도 시료를 공급하여 독성평가기법의 개발에 실제 적용할 수in vitro

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있었음 또는 을 독성평가에 활용할. Fecalase intestinal bacterial enzyme mix

수 있게 됨으로써 소화관에서 대사되는 약물의 특성 등에 대한 정보를 제공하기

쉬워 졌고 장내세균총에 의해 독성이 발현될 가능성이 높은 물질에 대한 독성평,

가 기반도 확보되었다고 판단됨

세부과제1-3○

장내미생물 독성평가 기술의 개발을 위하여 가장 역점을 두고 수행한In vivo

부분은 국내에 전혀 연구기반이 없는 무균동물의 생산과 유지를 통한 안정적인

무균동물 공급 체계를 구축하는 것이었음 많은 시행착오가 있었지만 도입된 무.

균동물을 안정적으로 유지할 수 있도록 무균동물 입수 및 관리에 대한 부분과 미

생물 오염을 검사할 수 있는 각종 시험기법 등에 대한 표준작업수순서를 확립하

였고 연 약 마리의 무균동물을 생산할 수 있는 기반을 구축할 수 있었음 무, 300 .

균동물 유지 기술의 확립과 더불어 이를 활용한 각종 시험물질에 대한 적용평가

를 실시하여 및 에 대한 약물동태 연구를acetaminophen, geniposide baicalin

수행하였고 한국과학기술연구원 한양대학교 영남대학교의 개 연구진이 협동연, , , 3

구를 통하여 각 연구팀에서 강점을 갖고 있는 시험물질의 분석을 실시하여 소기

의 연구결과를 도출할 수 있었음 본 세부과제의 수행을 통하여 무균동물. ,

항생제 처치 동물 등 다양한 시험모델을 정립함으로써 향후gnotobiote, in vivo

연구가 필요한 부분에서 적극 활용이 될 것으로 판단됨 뿐만 아니라 사in vivo . ,

업단 연구를 통하여 이제 무균동물의 안정적인 공급시스템이 갖추어진 바 이 기,

반기술을 활요할 수 있는 추가연구를 활성화시킬 필요가 있다고 판단됨.

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연구목표연구목표연구목표연구목표2.2.2.2.

장내미생물 배양법을 이용한 미생물 대사체 독성 평가시험법의 개발

한국인 인 이상 분변미생물의 합성기질 천연성분의 대사활성 분석(50 ) ,

합성기질 천연물성분 의약품 포함 에 대한 의 기질 특이성 한국인, ( ) fecalase ,

성인 표준 대사활성 설정 및 표준 대사활성을 갖는 제조방법fecalase fecalase

에 관한 작성SOP

장내미생물을 이용한 대사독성 평가모델 정립in vivo

합성기질 및 천연성분의 대사활성에 대한 기질 특이성을 분석하여 를fecalase

대신할 수 있는 약물대사효소계 의 제조(intestinal microbial enzyme mix)

연구내용2-1.

장내미생물 배양법을 이용한 미생물 대사체 독성 평가시험법 개발장내미생물 배양법을 이용한 미생물 대사체 독성 평가시험법 개발장내미생물 배양법을 이용한 미생물 대사체 독성 평가시험법 개발장내미생물 배양법을 이용한 미생물 대사체 독성 평가시험법 개발

장내미생물 배양기술 확립 및 대사체 분석법 개발-

및 를 이용한 대사체 독성평가- Fecalase intestinal microbial enzyme mix

기술개발

장내미생물 대사체의 면역독성 평가-

장내 미생물을 이용한 세포독성 및 세포사멸 평가기술 개발-

장내 미생물을 이용한 유전독성 평가기술 개발-

장내세균총 유발 독성평가를 위한 장내세균효소 복합체 개발장내세균총 유발 독성평가를 위한 장내세균효소 복합체 개발장내세균총 유발 독성평가를 위한 장내세균효소 복합체 개발장내세균총 유발 독성평가를 위한 장내세균효소 복합체 개발(fecalase)(fecalase)(fecalase)(fecalase)

한국인 인 이상 총 인 이상 의 분변 미생물의 합성기질 천연성분 천- 50 ( 150 ) , ,

연추출물의 대사활성을 분석하여 한국인 평균 장내세균총의 약물대사활성 도출

한국인 성인 표준 대사활성 설정- fecalase

한국인의 소화관으로부터 분리한 의 제조- intestinal microbial enzyme mix

약물 및 독성물질 대사에 있어 장내미생물 대사의 중요성 평가-

및 의 제조방법에 관한 표준작업- Fecalase intestinal microbial enzyme mix

수순서 작성

12121212////34343434


미생물 대사체 독성 평가기술 개발미생물 대사체 독성 평가기술 개발미생물 대사체 독성 평가기술 개발미생물 대사체 독성 평가기술 개발In vivoIn vivoIn vivoIn vivo

무균동물의 확보 유지 및 공급시스템의 확립- ,

장내미생물 정착균동물의 확립-

무균동물 및 장내미생물 정착균동물을 활용한 동태연구-

항생제 처치동물에서의 식품 또는 의약품의 동태변화에 대한 연구-

장내미생물 대사를 통한 독성평가 기술에 관한 표준작업수순서 작성- in vivo

기대성과기대성과기대성과기대성과2-22-22-22-2

식품 및 의약품 등의 안전성 평가를 위한 장내미생물 대사체 독성시험법의 개-

발 및 제공

장내미생물의 분해 대사 작용에 의해 독성을 나타내는 식품 및 의약품 등을 평- ,

가하여 기초자료를 제공함으로써 안전관리 정책에 기여

식품 및 의약품 등의 안전성평가에 필요한 새로운 기술의 확보 및 선진화-

독성학연구에 있어서 장내미생물에 의한 대사의 중요성 인식-

장내미생물 활용 독성평가 인력 및 기술 기반의 구축-

- 장내미생물의 대사작용을 이용한 식품 및 의약품 등의 영향평가를 통해 안전관리

정책에 활용가능

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세부과제 연구목표 연구내용

1-1

세부과제

장내미생물에 의한 독성평가기술 개발

장내세균 효소복합체를 이용한 세포(fecalase)

독성 및 세포 사멸에 대한연구

장내세균 효소복합체를 이용한(fecalase)

유전독성 및 면역독성 연구

장내미생물 배양기술의 확립

장내미생물에 의한 독성 대사체의 독성 평가기술의 개발 활성산소종 세포독성( , ,

등apoptosis )

발현 및8-Oxoguanine glycosylase p53을 활용한 장내미생물에 의한repoter gene

독성 대사체의 유전독성 평가기법의 개발 연구

Comet assay 및 를in vitro micronucleus이용한 장내미생물에 의한 독성 대사체의 유전독성 평가기법의 개발 연구

염증관련 유전자 발현 평가를 활용한 장내미생물에 의한 독성 대사체의 면역독성 평가기법의 개발 연구

전사인자 활성화 기법을 활용한 독성평가기술의 개발 연구

1-2

세부과제

식품첨가물 한약 천연물, ,신약 등으로부터 장내미생물총에 의해서 생성되는 대사체들에 대한 약효 및 독성평가를 위한 한국인 표준

대사활성을 설정fecalase하고 표준 대사활성을 갖는

의 제조방법을 표fecalase준화 함

한국인 인 이상 총 인 이상 의 분변100 ( 235 )미생물의 합성기질 천연성분 천연추출물의, ,대사활성 분석하여 한국인 평균 장내세균총의약물대사활성 도출

한국인 성인 표준 대사활성을 설정fecalase

한국인의 소화관으로부터 분리한 intestinal의 제조 및 독성평가microbal enzyme mix

에 적용함

및Fecalase intestinal microbial enzyme의 제조방법 개발 및 설정mix SOP

1-3

세부과제

장내미생물 대사In vivo이용 독성평가 기술의 개발을 위한 무균동물 생산 및유지 기반 조성

사람 장내미생물총 대체 동물모델 구축을 통하여 약물동태 독성평가 모델의 정립/

무균동물 사육조건 확립무균동물 유지 및 공급을 위한 시스템 확립장내미생물 정착동물의 개발 및 확립

의 생산 및 유지 시스템 정립gnotobiote무균동물 및 미생물 검사법 확립gnotobiote무균동물 및 동물모델을 활용한gnotobiote동태연구(ginsenoside Re, acetaminophen,geniposide, baicalin)항생제 처치 동물모델 랫트 및 마우스 을 활( )용한 의 동태변화 연구baicalin

14141414////34343434


연구내용 및 방법연구내용 및 방법연구내용 및 방법연구내용 및 방법3.3.3.3.

세부과제세부과제세부과제세부과제(1) 1-1(1) 1-1(1) 1-1(1) 1-1

장내미생물 배양기술 확립 및 대사체 분석법 개발장내미생물 배양기술 확립 및 대사체 분석법 개발장내미생물 배양기술 확립 및 대사체 분석법 개발장내미생물 배양기술 확립 및 대사체 분석법 개발 장내미생물 배양법을 확립:

하고 등을 장내미생물 배양액에 처리하여 대사여부를 분석법, arbutin HPLC

및 분석법으로 확인LC-MS

장내미생물 대사체의 면역독성 평가장내미생물 대사체의 면역독성 평가장내미생물 대사체의 면역독성 평가장내미생물 대사체의 면역독성 평가:::: 마우스 비장세포 배양에서 및B-cell

의 면역독성을 조사한 결과 의 대사체인T-cell mitogenicity arbutin

과 장내미생물과 을 배양한 시료에서 면역 독성이 증강hydroquinone arbutin

여부를 확인.

장내 미생물을 이용한 세포독성 및 세포사멸 평가기술 개발장내 미생물을 이용한 세포독성 및 세포사멸 평가기술 개발장내 미생물을 이용한 세포독성 및 세포사멸 평가기술 개발장내 미생물을 이용한 세포독성 및 세포사멸 평가기술 개발:::: 원물질과 대사

체 장내세균 효소복합체 와, (fecalase) 장내미생물 약물대사효소계(intestinal

에microbial enzyme mix) 원물질을 첨가하여 대사를 유도한 후 세포 독성

및 세포사멸을 조사한 결과 장내미생물 에 의해 가수분해된( -glucosidase)β

대사체에 의해서 (arbutin hydroquinone,→ geniposide 세포 독성genipin)→

및 세포 사멸이 증가되는지 확인 또한 다양한 세포 독성 지표들 세포독성. , ( ,

을 통한 독성 대사체의 세포사ROS, Bcl-2 family, caspase-3, apoptosis)

멸에 대한 영향 규명 및 세포 사멸에 대한 독성 평가법을 제시함 또한 장내세.

균 효소복합체 및 장내 약물대사효소계에 대한 대사 활성을 비교함으로서 최

적화된 장내미생물을 이용한 세포 독성법 및 시험수순서를 제시하고자 하였음

장내 미생물을 이용한 유전독성 평가기술 개발장내 미생물을 이용한 유전독성 평가기술 개발장내 미생물을 이용한 유전독성 평가기술 개발장내 미생물을 이용한 유전독성 평가기술 개발:::: 장내세균 효소복합체

또는(fecalase) 장내 미생물대사효소계를 이용 독성대사체에 대한 유전 독성

을 평가하기 위하여 유전자 발현 관련 독성평가기술 개발p53 ,

발현을 이용한 유전독성 평가기법의 개발을 수8-oxoguanine glycosylase

행. 장내미생물 에 의해 가수분해된 대사체에 의해서( -glucosidase) (arbutinβ

hydroquinone,→ geniposide 유전 독성이 증가함을 확인함 위 연genipin) .→

구 기반을 바탕으로 및 소핵시험을 통하여 장내미생물comet assay in vitro

15151515////34343434


에 의해 가수분해된 대사체에 대한 유전 독성을 조사하고( -glucosidase)β

최신의 유전독성 평가기법을 적용하여 장내미생물을 이용한 유전독성 가이드

라인을 제시함.


한국인 인 이상 총 인 이상 의 분변미생물의 합성기질 천연성분100 ( 2350 ) , ,

천연 추출물의 대사활성 분석하여 한국인 평균 장내세균총의 약물대사활성 도

출

한국인 성인 표준 대사 활성을 설정fecalase

한국인의 소화관으로부터 분리한 의 제조intestinal microbial enzyme mix

천연추출물 및 성분의 유전독성 평가에 및fecalase intestinal microbial

적용enzyme mix

장내미생물의 천연물 성분의 독성 및 약효발현 관여성 분석 (baicalin,

등ginsenoside Rb1 )

및 제조방법의 표준작업수순서Fecalase intestinal microbial enzyme mix

작성


장내미생물에 의한 대사를 통한 독성평가모델의 정립을 위하여 개년 동in vivo 2

안 다음과 같은 연구를 수행함

무균동물의 확보 유지 및 공급시스템의 확립무균동물의 확보 유지 및 공급시스템의 확립무균동물의 확보 유지 및 공급시스템의 확립무균동물의 확보 유지 및 공급시스템의 확립,,,, 확보된 무균동물의 사육조건에 대:

한 시험과 미생물 검사를 실시하여 무균상태의 사육조건을 확립하고자 하였고,

무균동물을 독성평가에 활용이 가능하도록 원활한 대량공급을 위한 공급시스템

을 구축하고자 하였다.

장내미생물 정착균동물의 확립장내미생물 정착균동물의 확립장내미생물 정착균동물의 확립장내미생물 정착균동물의 확립 차년도에는 의 생산기틀을 마련하고: 2 gnotobiote

차년도에는 개발된 의 지속적인 생산체제를 마련하는 한편 생산된3 gnotobiote ,

무균동물과 에서 장내미생물에 의한 대사가 알려져 있는 시험물질을gnotobiote

선정하여 독성평가 시험을 수행하였으며 각종 시험법에 대한 표준작업수순서를,

16161616////34343434


작성하고자 하였다.

무균동물 및 장내미생물 정착균동물을 활용한 동태연구무균동물 및 장내미생물 정착균동물을 활용한 동태연구무균동물 및 장내미생물 정착균동물을 활용한 동태연구무균동물 및 장내미생물 정착균동물을 활용한 동태연구:::: 2 차년도에 걸쳐 확립, 3

된 모델동물에서 시험물질 및 의 대사 및(acetaminophen, geniposide baicalin)

동태 연구를 수행하여 정상동물과의 차이점을 도출하고 이러한 정보를 계속해서

축적하여 장내미생물에 의한 독성평가 데이터베이스의 활용자료가 되도록 하였

다.

항생제 처치동물에서의 식품 또는 의약품의 동태변화에 대한 연구항생제 처치동물에서의 식품 또는 의약품의 동태변화에 대한 연구항생제 처치동물에서의 식품 또는 의약품의 동태변화에 대한 연구항생제 처치동물에서의 식품 또는 의약품의 동태변화에 대한 연구:::: 무분별하게 사

용되고 있는 항생물질에 의하여 장내미생물총의 변화가 생길 때 나타날 수 있는

화학물질의 동태지표의 변화에 대한 연구를 을 대상으로 차년도에baicalin 2, 3

걸쳐 수행하였다.

장내미생물 대사를 통한 독성평가 기술에 관한 표준작업수순서 작성장내미생물 대사를 통한 독성평가 기술에 관한 표준작업수순서 작성장내미생물 대사를 통한 독성평가 기술에 관한 표준작업수순서 작성장내미생물 대사를 통한 독성평가 기술에 관한 표준작업수순서 작성in vivoin vivoin vivoin vivo 본:

연구를 통하여 확립되는 대사독성 평가에 대한 표준작업수순서를 작성in vivo

하여 독성평가 기법의 보급을 위한 준비를 수행하였다.

17171717////34343434


최종연구결과4.

차년도 연구결과차년도 연구결과차년도 연구결과차년도 연구결과1) 11) 11) 11) 1


장내미생물 배양법 개발장내미생물 배양법 개발장내미생물 배양법 개발장내미생물 배양법 개발①①①①

장내미생물 배양법을 이용한 미생물 대사체 독성 평가시험법 개발을 위한 시

험균주 선정

(Bifidobacterium longum HY81, B. longum HY82, B. adolescentis

HY83, Bacteroides fragilis KCTC3688)

최소영양배지 조성을 위한 배지조건 분석

증균배지 및 혐기희석액에 시험물질 대사시켜 대사체 분석하여 장내미생물 배

양법을 통한 대사체 독성 평가 가능성 확인

신속한 독성평가가 가능한 장내미생물 배양기술 확립in vitro

시험물질 및 대사체 분석법 개발시험물질 및 대사체 분석법 개발시험물질 및 대사체 분석법 개발시험물질 및 대사체 분석법 개발②②②②

대사전 물질인 과 독성대사체인 의 동시 정량 분석법 확arbutin hydroquinone

립

증균배지 및 혐기희석액 내에서 장내미생물에 의한 대사로 양은 감소arbutin

하고 대사체인 의 생성 확인hydroquinone

그 외 다양한 시험물질에 대한 분석법 개발

장내미생물의 종류 및 배양조건에 따라 시험물질의 대사능에 현저한 차이가

있음을 규명하였고 개인간 장내미생물총의 조성 차이에 따라 장내에서의 화학물,

질 대사에 있어서 현저한 개인차를 보일 수 있음을 확인

면역독성 평가법 개발면역독성 평가법 개발면역독성 평가법 개발면역독성 평가법 개발③③③③

대사전 물질과 장내미생물에 의한 대사체를 대상으로 면역독성 평가를 위한

비장세포의 실시proliferation assay

및 물질 자체에 의한 면역독성 평가하였을 때Arbutin hydroquinone arbutin

18181818////34343434


은 및 에 영향을 미치지 않았으나 은LPS ConA mitogenicity , hydroquinone

100 농도에서 세포와 세포 증식능을 모두 억제M T- B-μ

장내미생물에 의해 을 대사시킨 후 면역독성 평가하였을 때 실제로 독arbutin ,

성이 강한 으로 대사되었고 이들 대사체 생성으로 및hydroquinone , LPS ConA

처리군에서 모두 비장세포의 증식능이 저해받았음

이는 장내미생물이 시험물질의 대사에 영향을 미침으로써 독성대사체가 생성

되고 이로 인하여 면역독성이 발생될 수 있음을 의미

세포독성 평가법 개발세포독성 평가법 개발세포독성 평가법 개발세포독성 평가법 개발④④④④

및 로 세포독성을 평가하였고 활성산소에 대한 영향 평가MTT LDH assay ,

및 활성 및 방법으로 세포사멸 평가를 수행함caspase-3 APOPercentage

그 결과 원물질 자체의 세포독성은 나타나지 않았지만, arbutin

자체에서는 세포독성 발현됨hydroquinone

장내미생물 배양을 이용한 독성물질 대사체 독성 평가장내미생물 배양을 이용한 독성물질 대사체 독성 평가장내미생물 배양을 이용한 독성물질 대사체 독성 평가장내미생물 배양을 이용한 독성물질 대사체 독성 평가⑤⑤⑤⑤

증균배지를 이용하여 실제로 장내미생물과 을 함께 배양 시 독성변화arbutin

를 측정함

로 간세포주에 관한 세포독성 분석시 증균배지로 이용된 및MTT assay BL

배지 자체에 처리 시에는 세포독성이 유발되지 않았지만 및CM arbutin , BL

배지에 장내미생물 균주와 을 함께 처리하여 배양하면CM arbutin B. longum

및HY81 B. longum 배양액에서 세포독성이 강하게 나타남82

이는 장내미생물이 대사에 관여하여 세포독성을 유발하는 대사체를arbutin

생성시켰음을 의미함

19191919////34343434



한국인 인의 분변에서 개 효소활성 측정한국인 인의 분변에서 개 효소활성 측정한국인 인의 분변에서 개 효소활성 측정한국인 인의 분변에서 개 효소활성 측정74 2174 2174 2174 21①①①①

한국인 인의 분변에서74 -glucuronidase(1), -arabinopyranosidase (2),β α

-galactopyranosidaseβ (3), -xylopyranosidase(4), lipase(palmitase), 5),β

lipase(stearatase), 6), -arabinopyranosidase(7), -cellobiosidase(8),β β

-fucopyranosidase(9), -fucopyranosidase(10),α β β-maltosidase(11), α

-rhamnosidase(12), N-acetyl- -galactosamidase(13), N-acetyl-α β

-galactosamidase(14), N-acetylβ-glucosamidase(15), α

-arabinfuranosidase(16), -galactopyranosidase(17),α α

-xylopyranosidase(18), -mannopyranosidase(19), Sulfatase(20),β β

효소활성 측정-glucopyranosidase(21)

인의 분변 평균 효소활성은 효소에 따라 상당한 차이를 보임74

미국인과의 분변효소활성 비교미국인과의 분변효소활성 비교미국인과의 분변효소활성 비교미국인과의 분변효소활성 비교②②②②

미국인이 칼락토시다제는 높고 자일로시다제는 유의차 없었음,

알파글루코시다제 베타글루쿠로니다제 퓨코시다제는 한국인이 높았음, ,

일본인과의 분변효소활성 비교일본인과의 분변효소활성 비교일본인과의 분변효소활성 비교일본인과의 분변효소활성 비교③③③③

한국인이 글루코시다제 굴루쿠로니다제는 높았으나 설파타제는 차이 없었음,

한국인이 산성 및 알칼리성 우레아제는 아주 낮았음

한국인 인의 천연성분의 장내세균체에 의한 대사활성 분석한국인 인의 천연성분의 장내세균체에 의한 대사활성 분석한국인 인의 천연성분의 장내세균체에 의한 대사활성 분석한국인 인의 천연성분의 장내세균체에 의한 대사활성 분석74747474④④④④

사람의 장내미생물총의 를 비롯한 천연성분의 대사활성에geniposide

개인차가 큼

성별의 차이는 없었음

한국인 인의 의약품의 장내세균체에 의한 대사활성 분석한국인 인의 의약품의 장내세균체에 의한 대사활성 분석한국인 인의 의약품의 장내세균체에 의한 대사활성 분석한국인 인의 의약품의 장내세균체에 의한 대사활성 분석74747474⑤⑤⑤⑤

사람의 장내미생물총의 의 대사활성에acetaminophen, digoxin, bisacodyl

개인차가 큼

20202020////34343434



한국인 인의 천연성분 의약품 방부제 색소제 등의 장내세균체에 의한 대사한국인 인의 천연성분 의약품 방부제 색소제 등의 장내세균체에 의한 대사한국인 인의 천연성분 의약품 방부제 색소제 등의 장내세균체에 의한 대사한국인 인의 천연성분 의약품 방부제 색소제 등의 장내세균체에 의한 대사74 , , ,74 , , ,74 , , ,74 , , ,⑥⑥⑥⑥

활성 분석활성 분석활성 분석활성 분석

사람의 장내미생물총의 의 대사활성에 개methylparaben, sudan II, Sudan IV

인차가 큼




장내세균 효소복합체를 이용한 유전독성 평가기술 개발장내세균 효소복합체를 이용한 유전독성 평가기술 개발장내세균 효소복합체를 이용한 유전독성 평가기술 개발장내세균 효소복합체를 이용한 유전독성 평가기술 개발①①①①

장내미생물 대사체에 의한 유전독성 영향을 평가하기 위하여 p53,

유전자 발현을 통한 분석을 실시하였음8-oxyguanine glycosylase (OGG1) .

이때 원물질인 는 유전자 발현에 아무런 영향이 없었으나 장내미생, geniposide

물에 의한 대사체 인 은 유전자 및(geniposide genipin) genipin p53, OGG1→

활성이 증가됨을 확인p53

장내세균효소복합체 에 를 첨가하여 대사를 유도한 후 유(fecalase) geniposide

전자 발현에 대한 영향을 측정한 결과 의 장내미생물 대사체인, geniposide

에서 유전자 및 활성이 증가됨을 확인genipin p53, OGG1 p53

장내미생물 효소복합체를 이용한 전사조절인자 영향 평가기술 개발장내미생물 효소복합체를 이용한 전사조절인자 영향 평가기술 개발장내미생물 효소복합체를 이용한 전사조절인자 영향 평가기술 개발장내미생물 효소복합체를 이용한 전사조절인자 영향 평가기술 개발②②②②

장내미생물 대사체에 의한 면역독성을 유전자 발현 및 전사조절인자COX-2

활성을 통해 평가하였음(NF- B, AP-1) .κ

그 결과 는 발현에 영향이 없었으나 장내미생물에 의해 가, geniposide COX-2

수분해된 genipin은 의 전사조절인자의 활성화를 통하여NF- B, AP-1κ

21212121////34343434


발현을 증가시키는 것으로 나타났음COX-2 .

또한 를 에 동시 배양한 후 마우스 대식세포주에 처리했을 때geniposide fecalase

에도 geniposide가 으로 대사되어 의 전사조절인자의genipin NF- B, AP-1κ

활성 및 발현을 증가시키는 것으로 확인되었음COX-2


한국인 인의 분변에 대한 개 효소활성한국인 인의 분변에 대한 개 효소활성한국인 인의 분변에 대한 개 효소활성한국인 인의 분변에 대한 개 효소활성100 21100 21100 21100 21①①①①

인의 분변에서 개의 효소활성을 측정하였더니 개개인 사이에 상당한 차100 21

이를 나타냄

성별 및 연령에 따른 차이는 보이지 않았음

및 의 분변 장내세균 효소 분획에 대한및 의 분변 장내세균 효소 분획에 대한및 의 분변 장내세균 효소 분획에 대한및 의 분변 장내세균 효소 분획에 대한Acetaminophen, digoxin bisacodylAcetaminophen, digoxin bisacodylAcetaminophen, digoxin bisacodylAcetaminophen, digoxin bisacodyl②②②②

대사활성대사활성대사활성대사활성

및 도 장내세균효소에 의해 대사되었으며Acetaminophen, digoxin bisacodyl ,

사람의 장내미생물총의 및 대사활성에 개acetaminophen, digoxin bisacodyl

인차가 크게 나타남

성별의 차이는 나타나지 않았음

천연성분의 분변 장내세균 효소 분획에 대한 대사활성천연성분의 분변 장내세균 효소 분획에 대한 대사활성천연성분의 분변 장내세균 효소 분획에 대한 대사활성천연성분의 분변 장내세균 효소 분획에 대한 대사활성③③③③

사람의 장내미생물총의 를 비롯한 천연성분의 대사활성에 개인차가geniposide

크게 나타남

성별의 차이는 나타나지 않았음

의약품 성분의 장내세균 효소에 의한 대사활성의약품 성분의 장내세균 효소에 의한 대사활성의약품 성분의 장내세균 효소에 의한 대사활성의약품 성분의 장내세균 효소에 의한 대사활성④④④④

사람의 장내미생물총의 대사활성에 개인차가 크게 나타났지ginsenoside Rb1

만 성별이나 연령에 따른 대사활성 차이는 없었음,

22222222////34343434


사람의 장내미생물총의 대사활성에 개인차가 크게 나타났음baicalin . Baicalin

대사체로는 가 동정되었으며 성별이나 연령에 따른 대사활baicalein, oroxylin A ,

성 차이는 나타나지 않았음

황금 주성분 및 대사체의 약리효능 항소양 효과 비교황금 주성분 및 대사체의 약리효능 항소양 효과 비교황금 주성분 및 대사체의 약리효능 항소양 효과 비교황금 주성분 및 대사체의 약리효능 항소양 효과 비교baicalin ( )baicalin ( )baicalin ( )baicalin ( )⑤⑤⑤⑤

경구투여한 경우에는 모두 약리효과를 나타baicalin, baicalein, oroxylin A

냈으나 복강투여한 경우에는 이 거의 효과가 없었고 그 대사체인baicalin ,

및 은 효과를 나타내었음oroxylin A baicalein

항생제를 투여한 모델 동물에서는 일반동물에 비교해서 은 효과가 낮baicalin

아졌으나 그 대사체는 차이가 없었음

더덕 주성분 의 장내세균총에 의한 대사더덕 주성분 의 장내세균총에 의한 대사더덕 주성분 의 장내세균총에 의한 대사더덕 주성분 의 장내세균총에 의한 대사lancemaside Alancemaside Alancemaside Alancemaside A⑥⑥⑥⑥

는 경구투여에 의해 소화관에서 로 대사되Lancemaside A echinocystic acid

었으며 혈액중으로도 이 대사체가 흡수되었고 흡수 최대시간은 시간이었음, , 6

사람 분변과 배양했을 때 생쥐에 경구투여한 경우와 유사한 과정으로 대사되,

었음


무균동물 및 장내미생물 정착균동물 확보 유지 및 공급 시스템 확립무균동물 및 장내미생물 정착균동물 확보 유지 및 공급 시스템 확립무균동물 및 장내미생물 정착균동물 확보 유지 및 공급 시스템 확립무균동물 및 장내미생물 정착균동물 확보 유지 및 공급 시스템 확립,,,,①①①①

를 도입하여 에서 유지 및 번식 시키면서 증Gern-free mouse hard isolartor

식에 따른 미생물 검사를 실시

무균동물 확보를 위한 사육조건 및 미생물 검사법을 확립하고 유지 공급시스

템의 기반 마련

장내미생물 정착균동물의 개발 및 확립장내미생물 정착균동물의 개발 및 확립장내미생물 정착균동물의 개발 및 확립장내미생물 정착균동물의 개발 및 확립②②②②

장내미생물 정착균동물인 제작을 위하여 에 사gnotobiote germ-free mouse

람 분변을 경구투여하여 분변내 포함되어 있는 장내미생물총이 제대로 정착되

었는지 분변검사를 통해 확인

장내미생물 정착이 확인된 개체로부터 교배를 통해 증식 및 유지gnotobiote

를 위한 생산기틀 마련하고 를 활용한 대사 평가 연구가 가능토록gnotobiote

23232323////34343434


함

무균동물 및 장내미생물 정착균동물을 활용한 동태연구무균동물 및 장내미생물 정착균동물을 활용한 동태연구무균동물 및 장내미생물 정착균동물을 활용한 동태연구무균동물 및 장내미생물 정착균동물을 활용한 동태연구③③③③

및 마우스를 활용한 의 동태시험을 실시함Germ-free SPF ginsenoside Re .

즉 본 세부과제를 통해 생산된 와 마우스에, germ-free SPF ginsenoside Re

를 경구투여하여 혈청 생화학 및 병리조직검사 혈중 를 비교 분석하였음, PK

및 마우스를 활용한 대사 연구Germ-free, gnotobiote SPF acetaminophen

를 실시함 즉 본 세부과제에서 생산된 무균동물과 에. , gnotobiote

를 경구투여하여 혈청 생화학 및 병리조직검사를 하였고 중단acetaminophen , 2

위에 혈액 시료를 제공하여 의 를 분석함으로써 장내미생물에acetaminphen PK

의한 영향을 평가할 수 있게 하였다.

항생제 처치동물에서의 식품 또는 의약품의 동태변화에 대한 연구항생제 처치동물에서의 식품 또는 의약품의 동태변화에 대한 연구항생제 처치동물에서의 식품 또는 의약품의 동태변화에 대한 연구항생제 처치동물에서의 식품 또는 의약품의 동태변화에 대한 연구④④④④

항생제 처치 동물모델을 활용하여 장내미생물에 의한 대사 영향을 평가하고자

을 제작하였고 항생제 처치로 인한 정상동물과의 병리antibiotic- treated rat ,

학적 문제를 배제하고자 조직병리학적 검사 장내용물의 미생물수 검사를 실시,

하였음 그 결과 에서 병리학적 소견은 발견되지 않았. , antibiotic-treated rat

고 정상동물과 비교시 장내미생물 수에 있어서 현저한 차이를 보였음 이는, .

이 정상적으로 제작되었음을 의미하며 항생제 처치군과antibiotic-treated rat ,

정상군 간의 약물 대사양식 연구에 활용가능하다고 결론을 얻었음

장내미생물이 및 이들 대사체에 미치는 영향을 항생제 처치 동물모델baicalin

로부터 얻기 위하여 시험물질인 및 대사체의 생체내 분석법을 확립하baicalin

였음

확립된 및 대사체 분석조건을 이용하여 정상동물과 항생제 처치동물baicalin

에서 및 대사체의 약물동태를 비교 분석하였음 그 결과 정상동물에baicalin . ,

비해 은 의 혈중 농도가 현저히 낮았고antibiotic-treated rat baicalin , Cmax,

AUC0→∞도 감소되었으며 반감기는 오히려 길어지는 양상을 나타냄, .

은 정상동물에 비해 뿐 아니라 주요 대사체의Antibiotic-treated rat baicalin

혈중 농도도 전체적으로 현저히 감소되어 장내미생물이 대사에 직접적baicalin

24242424////34343434


인 영향을 끼치는 인자임을 확인함

또한 장내용물에서의 및 대사체 대사 특성을 간접적으로 확인하기 위baicalin

하여 항생제 처치군과 정상군의 장내용물을 추출한 후 과 함께 혐기배baicalin

양하여 대사 특성을 분석하였음 그 결과 장내용물을 이용한 대사에서. , in vitro

도 항생제 처치군과 정상군 간에 대사 양식에 차이가 있음을 확인하였baicalin

음 특히 의 대사 결과가 대사 양식과 상당한 차이가. baicalin in vitro in vivo

있음을 알 수 있었고 이를 통해 장내미생물의 대사체 독성평가 기술에서, in

연구가 반드시 필요하다는 것을 다시 한번 확인할 수 있었음vivo

25252525////34343434




장내세균 효소복합체를 이용한 세포사멸 평가기술 개발장내세균 효소복합체를 이용한 세포사멸 평가기술 개발장내세균 효소복합체를 이용한 세포사멸 평가기술 개발장내세균 효소복합체를 이용한 세포사멸 평가기술 개발①①①①

방법을 이용하여 장내세균 효소복합체에 의한 장내미생물의TUNEL assay

영향을 평가하였음 그 결과 장내세균 효소복합체에 의해. , arbutin, geniposide

가 으로 대사되었을 때 세포 사멸이 증가됨을 확인하였hydroquinone, genipin

음

장내세균 효소복합체에 반응된 는 의 단백질 발현을arbutin, geniposide Bax

증가시켰고 의 단백질 발현을 농도의존적으로 억제시켰음, Bcl-2

장내세균 효소복합체에 반응된 에 항산화제를 처리하였을arbutin, geniposide

때 생성능 및 세포독성이 억제되었음ROS

장내미생물 효소복합체와 장내미생물 대사효소계의 세포사멸 평가기술 개발장내미생물 효소복합체와 장내미생물 대사효소계의 세포사멸 평가기술 개발장내미생물 효소복합체와 장내미생물 대사효소계의 세포사멸 평가기술 개발장내미생물 효소복합체와 장내미생물 대사효소계의 세포사멸 평가기술 개발②②②②

및 대사활성 비교및 대사활성 비교및 대사활성 비교및 대사활성 비교

장내세균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 의해 대사된 반응arbutin

액을 방법으로 세포독성을 분석한 결과 세포독성이 증가하였음MTT assay , .

의 경우 장내미생물 대사효소계가 장내세균 효소복합체 보다 독성 대사Arbutin

체 생성을 증가시키는 것으로 판단됨

원물질인 에서 독성이 나타났으며baicalin, methyl-paraben , baicalein,

의 경우 원물질 보다 세포독성이 적었음 장내세균 효소복합체 및benzoic acid .

장내미생물 대사효소계에 반응된 은 보다 세포독성이 적음을baicalin baicalein

확인

장내세균 효소복합체와 장내미생물 대사효소계의 유전독성 평가기술 개발 및장내세균 효소복합체와 장내미생물 대사효소계의 유전독성 평가기술 개발 및장내세균 효소복합체와 장내미생물 대사효소계의 유전독성 평가기술 개발 및장내세균 효소복합체와 장내미생물 대사효소계의 유전독성 평가기술 개발 및③③③③

대사활성 비교대사활성 비교대사활성 비교대사활성 비교

장내세균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 반응된 은 손arbutin DNA

상이 높게 발생되었고 의 이동성이 증가하였음 소핵시험으, comet tail . In vitro

로 유전독성을 평가한 결과 에 의해서 소핵 생성능이 증가하였음, arbutin

장내세균 효소복합체와 장내미생물 대사효소계의 면역독성 평가기술 개발 및④

26262626////34343434


대사활성 비교

장내세균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 반응된 는geniposide

의 활성이 증가하였고 의 활성도 증가하였COX-2 promoter , NF- B, AP-1κ

음

장내미생물 대사효소계와 장내세균 복합체의 대사활성 반응에는geniposide

큰 차이가 나타나지 않았음


한국인 인의 장내미생물 효소활성한국인 인의 장내미생물 효소활성한국인 인의 장내미생물 효소활성한국인 인의 장내미생물 효소활성135135135135①①①①

합성기질에 대한 한국인 인의 분변 효소활성을 측정한 결과 사람 장내미135 ,

생물총의 효소활성은 개인차가 크게 나타났고 성별의 차이는 나타나지 않았음

항생물질에 의해서 효소활성이 급격히 감소하였음

인삼 분리성분의 장내세균 대사활성과 합성기질에 대한 대사 활성 비교인삼 분리성분의 장내세균 대사활성과 합성기질에 대한 대사 활성 비교인삼 분리성분의 장내세균 대사활성과 합성기질에 대한 대사 활성 비교인삼 분리성분의 장내세균 대사활성과 합성기질에 대한 대사 활성 비교②②②②

합성기질과의 상관성 있는 효소와 상관성 없는 효소가 공존하고 있었음

과 의 대사활성과는 상관성이 높았음Ginsenoside Rb1 Rg1

의 장내세균총에 의한 대사와 항대장염 효과의 장내세균총에 의한 대사와 항대장염 효과의 장내세균총에 의한 대사와 항대장염 효과의 장내세균총에 의한 대사와 항대장염 효과Ginsenoside Rb1Ginsenoside Rb1Ginsenoside Rb1Ginsenoside Rb1③③③③

를 경구투여하면 소화관에서 가 검출되며 항Ginsenoside Rb1 compoound K ,

생제 투여에 의해서는 거의 생성되지 않았음

항염증 효과 실험에서 보다 가 더 강In vitro ginsenoside Rb1 compound K

한 효과를 보임

과 는 실험에서 항대장염 효과를 나타Ginsenoside Rb1 compound K in vivo

냄

및 이들 대사체의 장내세균에 의한 대사과정 및 항염증 효능 비교및 이들 대사체의 장내세균에 의한 대사과정 및 항염증 효능 비교및 이들 대사체의 장내세균에 의한 대사과정 및 항염증 효능 비교및 이들 대사체의 장내세균에 의한 대사과정 및 항염증 효능 비교BaicalinBaicalinBaicalinBaicalin④④④④

은 장내세균총에 의해 로 대사되었고 황금추출baicalin baicalein, oroxylin A ,

물 중의 성분은 분리성분보다 대사활성이 낮았음baicalin

및 이들 대사체는 에서 모두 항염증 효과를 나타내었으나Baicalin in vivo , in

에서는 대사체만 강한 효과를 나타냄vitro

27272727////34343434



무균동물 및 장내미생물 정착균동물 확보 유지 및 공급 시스템 확립무균동물 및 장내미생물 정착균동물 확보 유지 및 공급 시스템 확립무균동물 및 장내미생물 정착균동물 확보 유지 및 공급 시스템 확립무균동물 및 장내미생물 정착균동물 확보 유지 및 공급 시스템 확립,,,,①①①①

차년도에 이어 무균상태의 유지 평가를 위한 각종 장내미생물 배양 및 미생2

물 검출기법을 확립하였고 무균동물을 안정적으로 공급할 수 있도록 기반 시스,

템을 확립하였음.

현재 약 여개의 무균동물 유지 를 보유 가동하고 있으며 당초 계획90 isolator ,

보다 많은 약 여마리의 무균동물을 생산하고 있으며 주령수를 맞춰 각 연300 ,

구팀의 시험을 수행하였음.

생산의 경우 차년도에는 우선 사람 분변 현탁액을 경구투여하여Gnotobiote 2

미생물 정착을 유도하고 이들을 교배하여 시험하였음 이 때 동물에서는 미. , F1

생물총의 변화가 확인되어 차년도에는 사업단 운영위원회를 통하여 시험물질, 3

의 동태시험 주일 전에 일간 정착을 유도하여 장내미생물을 일시적으로 정착1 3

시키는 시험계를 활용하기로 결정하여 본시험을 수행함.

일반 실험동물 사육과는 달리 무균동물 유지기술의 상용화에 상당한 시일과

기술력이 소요되었으나 개년 동안 다양한 시행착오와 기반 구축을 위한 실험2

을 통하여 독보적인 무균동물 유지 및 공급에 관한 시스템을 확립 할 수 있게

되었음 또한 무균동물 생산시설을 통하여 사람 장내미생물총이 도입된.

모델동물도 생산 유지할 수 있는 기반시스템을 확립하게 되었음gnotobiote .

독물동태 연구독물동태 연구독물동태 연구독물동태 연구In vivo acetaminophenIn vivo acetaminophenIn vivo acetaminophenIn vivo acetaminophen②②②②

마우스를 활용하여 간독성 유발용량에서의Germ-free, gnotobiote, SPF

독물동태를 평가함으로써 장내미생물에 미치는 영향을 규명하고acetaminphen

자 하였음 예비실험에서 마우스에 간독성 유발용량 실험을 진행하였고. , 600

을 투여했을 때 혈청 및 수치가 유의적으로 급격히 증가하였mg/kg ALT AST

음.

따라서 의 독물동태에 미치는 영향을 분석하기 위하여 제조할acetamniphen

마우스에서의 간독성 유발용량은germ-free, gnotobiote, SPF 600 으mg/kg

로 설정하였으나 무균동물에서는 독성이 강하게 나타나 최종적으로 및, 200

용량을 사용함300 mg/kgdm .

의 분석은 한국과학기술연구원 도핑컨트롤센터에서 확립하여Acetaminphen

혈액시료를 본 세부과제에서 준비하여 제공하였고 실험결과는 제 중단위 제, 2 1

28282828////34343434


세부과제의 결과보고서에 제시하였음.

또한 무균동물 및 항생제 처치동물에 대한 의 간독성 평가를, acetaminophen

위하여 간조직내 약물대사효소에 영향과 병리학적 검사도 진행하였음 독성평가.

결과 무균동물에서 독성이 더 강한 경향을 보임을 확인할 수 있었음.

약물동태 연구약물동태 연구약물동태 연구약물동태 연구In vivo geniposideIn vivo geniposideIn vivo geniposideIn vivo geniposide③③③③

우리나라에서 많이 이용되고 있는 치자의 주요성분인 의 약물동태geniposide

에 장내미생물이 미치는 영향을 분석하고자 하였음 이를 위해 한양대학교 약학.

대학 연구진에서 혈중 분석조건을 확립하여 혈액시료를 제공하였geniposide

고 실험결과는 역시 제 중단위 제 세부과제의 결과보고서에 제시하였음, 2 1 .

다만 가 워낙 고가의 지표성분이라서 다량의 모델동물에 대해 지, geniposide

표성분을 사용하기에는 현실적이 어려움이 있어 치자색소를 생산하는 업체로부

터 조추출물 함량 을 입수하여 실험에 사용하였음geniposide ( , 47%) .

일반 마우스를 이용한 의 투여용량 설정실험에서 를geniposide geniposide

100 mg/kg/10 로 단회 경구투여한 후 시간째의 혈청 를 분석ml 12 ALT, AST

한 결과 간독성 유발용량은 아닌 것으로 확인되었음, .

약물동태 연구약물동태 연구약물동태 연구약물동태 연구In vivo baicalinIn vivo baicalinIn vivo baicalinIn vivo baicalin④④④④

차년도에 확립한 분석법을 활용하여 및2 baicalin germ-free, gnotobiote

마우스에 대한 약물동태를 평가함으로써 장내미생물에 의한 시험물질의SPF

동태변화를 규명하고자 하였음 또한 항생제 처치한 마우스 모델동물에 대한. ,

의 약물동태를 함께 분석함으로써 모델 동물간의 연구결과를 비교하여baicalin

다양한 장내미생물 독성 평가기술을 확립하고자 하였음in vivo .

이를 위해 마우스 혈액으로부터 분석법을 재검증하였음 또한 차년baicalin . 2

도와 동일한 조건으로 마우스에 항생제를 처치한 후 baicalin 100 mg/kg/5 ml

를 경구투여한 후 예비실험을 먼저 진행하였음.

그 결과 정상 마우스와 항생제처치군 간에 약물동태가 확연히 차이가 나는,

것을 확인할 수 있었음 이는 마우스 역시 장내미생물에 의해 의 대사. baicalin

가 영향을 받고 있다는 사실을 뒷받침하는 것임.

무균동물 장내미생물 정착동물 및 대조동물에서의 본시험결과, SPF , baicalin

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은 무균동물에서의 혈액에서는 거의 검출되지 않은 반면 대조동물에서는 정상,

적인 혈중 농도 곡선을 보여 흡수 및 혈중 동태에 장내미생물이 결정baicalin

적인 역할을 하고 있음을 알 수 있었고 정착동물에서는 무균동물과 뚜렷한 차,

이를 보이지 않아 본 연구에서 활용한 미생물 정착 일정에 보완이 필요함을 알

수 있었음.

한편 항생제 처치 마우스를 이용한 의 동태실험의 결과 차년도에서, baicalin , 2

수행한 랫트에서의 결과와 마찬가지로 항생제 처치동물에서 의 동태에baicalin

현저한 변화가 발생함을 알 수 있어 무균동물의 시험결과와 일치하였음.

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연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론5.5.5.5.

지난 약 년간의 연구를 통하여 장내미생물 대사독성 평가법 개발을 위하여지난 약 년간의 연구를 통하여 장내미생물 대사독성 평가법 개발을 위하여지난 약 년간의 연구를 통하여 장내미생물 대사독성 평가법 개발을 위하여지난 약 년간의 연구를 통하여 장내미생물 대사독성 평가법 개발을 위하여3333

개의 세부과제에서는 다음과 같은 연구를 수행하여 소기의 결과를 도출할 수개의 세부과제에서는 다음과 같은 연구를 수행하여 소기의 결과를 도출할 수개의 세부과제에서는 다음과 같은 연구를 수행하여 소기의 결과를 도출할 수개의 세부과제에서는 다음과 같은 연구를 수행하여 소기의 결과를 도출할 수3333

있었음있었음있었음있었음....

세부과제세부과제세부과제세부과제1111○○○○

장내미생물 대사독성 기술개발을 위해 장내미생물 배양 사람 분변In vitro ,

를 독성물질 대사계 등으로 활용하fecalase, intestinal microbial enzyme mix

여 대사활성화계를 평가하였고 독성평가 기술의 개발을 위해서는 각종 동물세,

포배양에서의 분자수준의 유전독성 및 면역독성 등의 평가지표를 개발함 이는.

기존의 장내미생물 활용 독성 평가에서는 대부분 미생물을 이용한 시험에 제한

적으로 연구가 수행되었지만 본 연구에서는 동물세포 배양계를 접목하였다는

점이 특징적이었고 단순한 독성평가보다는 독성기작을 분자수준에서 판단할 수

있는 시험들을 개발하고자 한 점이 중요하다고 판단됨.

하지만 연구기간의 제한 및 연구비의 제한 등으로 인해 시험법의 정립을 위한

세부적인 가종 시험조건에 따른 시험기술의 에는 어려움이 있어 추fine-tuning

후 이에 대한 연구가 더 필요한 것으로 판단되었으며 향후 장내미생물 효소계,

에 대한 표준화와 독성시험의 확립을 위한 추가 연구를 수행한다면 독성평가

기술의 새로운 패러다임을 제시할 것으로 판단됨.

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장내세균총 유발 독성 평가를 위한 장내세균효소복합체 개발을 위하여 건강한

한국인의 분변으로부터 합성기질 천연성분 의약품 색소제에 대한 대사활성을, , ,

분석하였고 한국 성인 장내세균총의 대사반응계인 표준 를 개발하여, fecalase

표준화하였고 연령별 성별에 따른 장내미생물 대사전환율을 비교 분석하였으, ,

며 를 이용한 다양한 시험법을 검증함, fecalase in vitro .

이를 통해 사람의 장내미생물총의 효소활성에는 개인차가 상당히 크다는 사실을

확인할 수 있었고 성별이나 연령에 따른 차이는 없었음을 알 수 있었음 또한, .

장내미생물총의 효소활성은 항생물질에 의해 급격히 감소하였으며 한약 및 기,

능성식품으로 사용되고 있는 인삼이나 황금의 주성분은 장내세균에 의해 대사

되며 장내세균총에 의해 생성된 대사체들의 생리활성이 더 강했음도 알 수 있,

었다 또한 사람의 를 대신할 수 있는 사람 장내세균총 분리미생물에. fecalase

의해 제조된 는 유전독성 실험인intestinal bacterial enzyme mix Ames test

에 사용 가능함도 확인하였음 와 는 제 세부. Fecalase microbial enzyme mix 1

과제에도 시료를 공급하여 독성평가기법의 개발에 실제 적용할 수 있in vitro

었다 본 세부과제 수행을 통하여 또는. fecalase intestinal bacterial enzyme

을 독성평가에 활용할 수 있게 됨으로써 소화관에서 대사되는 약물의 특성mix

등에 정보를 제공하기 손쉬워 졌고 장내세균총에 의해 독성이 발현될 가능성이,

높은 물질에 대한 독성평가 기반도 확보되었다고 판단됨.


장내미생물 독성평가 기술의 개발을 위하여 가장 역점을 두고 수행한In vivo

부분은 국내에 전혀 기반이 없는 무균동물의 생산과 유지를 통한 안정적인 무

균동물 공급 체계의 구축이었음 많은 시행착오가 있었지만 도입된 무균동물을.

안정적으로 유지할 수 있도록 무균동물 입수 및 관리에 대한 부분과 미생물 오

염을 검사할 수 있는 각종 시험기법 등에 대한 표준작업수순서를 확립하였고,

연 약 마리의 무균동물을 생산할 수 있는 기반을 구축할 수 있었다 무균동300 .

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물 유지 기술의 확립과 더불어 시료분석을 위해 한국과학기술연구원 한양대학,

교 영남대학교의 개 연구진이 협동연구를 통하여 시험물질의 분석을 실시하, 3

였고 결과의 재현성을 확인하기 위하여 차례에 걸쳐 반복시험을 수행하였음, 2 .

또한 에 대해서는 항생제 처치동물의 유용성을 확보하고자 병행 실험을baicalin

수행하여 그 유용성을 입증할 수 있었음 이러한 일련의 연구를 통하여 무균동.

물 항생제 처치 동물 등 다양한 시험모델을 정립함으로써, gnotobiote, in vivo

향후 연구가 필요한 부분에서 적극 활용이 될 것으로 판단됨in vivo .

결론적으로 본 사업을 통하여 각종 장내미생물 독성평가 모델들을 확립in vivo

하였고 특히 국내에 기반시설이 전무한 무균동물 유지 및 시험시설을 가동할

수 있었고 연 마리 정도의 무균동물을 공급할 수 있는 시스템을 구축하였, 300

으나 이는 관련연구의 시작이라고 판단되며 이러한 기반구축이 어려운 시설과, ,

를 축적한 상태를 유지 또는 발전시키기 위해서는 이를 적극 활용know-how

할 수 있는 연구에 대한 후속적인 지원체계가 따라야 할 것으로 판단됨.

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1중단위과제 결과요약

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