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EXPLORACIÓN DE LAS PROPIEDADES ANTIMICROBIANAS DE EXTRACTOS

VEGETALES A PARTIR DE Caléndula officinalis Y Tropaeolum majus Y SU USO

POTENCIAL EN LA INDUSTRIA DE ALIMENTOS Y COSMÉTICA

LORENA MARIA ACOSTA ABRIL

TRABAJO DE GRADO

DIRECTOR: CLEMENTINA CUETO VIGIL

MICROBIOLOGA , MSc en Ciencias

UNIVERSIDAD DE LA SABANA

FACULTAD DE INGENIERÍA

INGENIERÍA DE PRODUCCIÓN AGROINDUSTRIAL

LÍNEA DE INVESTIGACIÓN: FERMENTACIONES

BOGOTÁ, D.C.

2006

Nota de aceptación:

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PRESIDENTE DEL JURADO

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JURADO

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JURADO

Bogotá, D.C., Noviembre de 2006

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“La biodiversidad, aquella útil biotecnológicamente, necesita la existencia de la

especie, pero también quién sepa describirla y quien sepa transformarla en unas

necesidades específicas”.

Carlos Eduardo Ángel Villegas, 2004 Coordinador de proyectos e investigador del

Instituto de Estudios Ambientales Universidad Nacional de Colombia

3

AGRADECIMIENTOS

A mis padres, Inirida y Oscar porque sin su amor, apoyo, dedicación y respaldo no

podría alcanzar los objetivos propuestos en el transcurso de mi vida.

A Clementina Cueto, directora y consejera, por su guía y constancia en el desarrollo

de este trabajo, por compartir sus conocimientos y brindarme apoyo constante en

la elaboración del mismo.

A mis hermanas, Gina y Juanita por su cariño incondicional.

A Mateo, una inspiración de mi vida.

A Diego, por su amor incondicional y su empeño por ayudarme a lograr lo que me

he propuesto.

A la Línea de Investigación de Fermentaciones de la Facultad de Ingeniería,

Universidad de La Sabana por patrocinar este trabajo, a la Universidad misma por

ser centro de desarrollo intelectual y personal, por sus maravillosas instalaciones, y

por promover y cultivar mi aprendizaje en los últimos 6 años; al equipo de trabajo

de laboratorios de Ingeniería por su colaboración y participación en el desarrollo

de la etapa experimental de este proyecto de grado.

4

CONTENIDO

Pág.

INTRODUCCIÓN ………………………………………………….…………………………………………… 19

1. OBJETIVO GENERAL …………………………………………………………………………………... 21

1.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ……………………………………………………………………….... 21

1.1.1. Fase I ………………………………………………………………………………………………………… 21

1.1.2. Fase II ………………………………………………………………………………………………………. 21

1.1.3. Fase III ……………………………………………………………………………………………………… 21

2. MARCO TEÓRICO ………………………………………………………………………………………… 22

2.1. Colombia y su biodiversidad ……………………………………………………………………. 22

2.2. Investigación en Colombia ………………………………………………………………………. 23

2.2.1. Especies vegetales silvestres …………………………………………………………………. 24

2.2.1.1. Caléndula officinalis L. ………………………………………………………………………… 24

2.2.1.2. Tropaeolum majus ……………………………………………………………………………… 25

2.3. Antimicrobianos naturales ………………………………………………………………………. 25

2.3.1. Fito – antimicrobianos …………………………………………………………………………… 26

2.3.1.1 Fitofenoles …………………………………………………………………………………………….. 27

Métodos de extracción ..………………………………………………………………………...………… 27

Espectro antimicrobiano ……………………………………………………………….………………… 27

Mecanismos de acción ……………………………………………………….……………………………. 27

2.3.1.2. Saponinas …………………………………………………………….………………………………. 28

Métodos de extracción …..………………………………………………………………………………… 28

5

Pág.

Espectro antimicrobiano y mecanismos de acción ………..……………………………. 29

2.3.1.3. Flavonoides ……………………………………………………………………………….………… 29

Métodos de extracción .....………………………………………………………………………….……. 30

Espectro antimicrobiano y mecanismos de acción ……………………………………… 31

2.3.1.4. Glucosinolatos ………………………………………………………………………….…………. 31

Métodos de extracción ..……………………………………………………………………….………….. 32

Espectro antimicrobiano y mecanismos de acción ……………………….…………….. 32

2.3.1.5. Carotenoides …………………………………………………………………….…….…………… 32

2.4. Trabajos con extractos vegetales …………………………………………….….………….. 34

2.5. Trabajos específicos con Caléndula officinalis L. y Tropaeolum

majus ………………………………………………………………………….……….………………………………

37

2.6. Regulación, seguridad y estandarización de productos de origen

botánico …………………………………………………………………..………………….……………………..

40

2.7. Microorganismos indicadores ............................................................................ 43

3. MATERIALES Y MÉTODOS ……………………………..…………………………………….……… 45

3.1. Fase I: Obtención de Extractos ………………………………………………………………… 45

3.1.1. Material vegetal ……………………………………………………………………………………… 45

3.1.2. Método de extracción ……………………………………………………………………………. 46

3.1.3. Diseño experimental Fase I …………………………………………………………………… 47

3.1.4. Cuantificación de los extractos …………………………………………………………….. 48

3.1.4.1. Maceración ………………………………………………………………………………………….. 48

6

Pág.

3.1.4.2. Rotoevaporación ………………………………………………………………………………… 49

3.2. Fase II: Evaluación de la actividad antimicrobiana y determinación de

la capacidad bactericida o bacteriostática y fungicida de los extractos …….

50

3.2.1. Microorganismos indicadores ………………………………………………………………. 50

3.2.2. Ensayo microbiológico ………………………………………………………………………….. 50

3.2.3. Diseño experimental Fase II ………………………………………………………………….. 56

3.2.4. Evaluación de la actividad antibacteriana y antifúngica ………………….. 57

3.2.4.1. Método de difusión por disco …………………………………………………………… 57

3.2.5. Determinación de la actividad bactericida o bacteriostática y

fungicida o fungistática ……………………………………………………………………………………

59

3.2.5.1. Método del tubo pequeño ………………………………………………………………... 59

3.3. Fase III: Aplicación de los extractos en sistemas In Vivo ………………………. 60

3.3.1. Material de ensayo …………………………………………………………………………………. 60

3.3.2. Métodos de aplicación ………………………………………………………………………….. 61

3.3.2.1. Aplicación de los extractos acuosos como conservantes naturales

en pulpa de frutas ……………………………………………………………………………………………..

61

3.3.2.2. Aplicación de los extractos etanólicos en jabón – gel antibacterial

para su uso sin enjuague ………………………………………………………………………………...

61

4. RESULTADOS Y ANÁLISIS ……………………………………………………………………………. 63

4.1. Fase I: Obtención de los extractos ..................................……………………………. 63

4.2. Fase II: Evaluación de la actividad antimicrobiana ……………………………….. 64

7

Pág.

4.2.1. Evaluación de la actividad antimicrobiana y antifúngica …………………. 64

4.2.1.1. Método de difusión por disco …………………………………………………………… 64

4.2.2. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria, la actividad

bactericida o bacteriostática y fungicida o fungistática ……………………………….

80

4.2.2.1 Determinación de la actividad bactericida o bacteriostática y

fungicida o fungistática por medio del método del tubo pequeño …...……..

80

4.2.2.2. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) …….. 84

4.3. Fase III: Aplicación de los extractos ……………………………………………………….... 86

4.3.1. Aplicación de los extractos acuosos como conservante natural en

pulpa de frutas …………………………………………………………………………………………………..

86

4.3.2. Aplicación de los extractos etanólicos como jabón-gel antibacterial

para su uso sin enjuague …………………………………………………………………………………

89

5. CONSIDERACIONES FINALES …………………………………………………………………….. 93

6. CONCLUSIONES …………………………………………………………………………………………… 95

RECOMENDACIONES ……………………………………………………………………………………… 97

BIBLIOGRAFÍA …………………………………………………………………………………………………… 99

ANEXOS …………………………………………………………………………………………………………….. 106

8

LISTA DE TABLAS Pág.

Tabla 1. Posición mundial de Colombia en biodiversidad …………………………… 22

Tabla 2. Resultados obtenidos después de la evaluación de actividad antimicrobiana determinando la concentración mínima inhibitoria (CMI) de cuminaldehído aislado ……………………………………………………………………………….

34

Tabla 3. Resultados obtenidos después de la evaluación de actividad antimicrobiana de los extractos etanólicos, etéreos, acuosos y en acetato de etilo de Drimys granadensis frente a indicadores Gram positivos, Gram negativos, hongos y levaduras ……………………………………………………………..

35

Tabla 4. Resultados obtenidos después de la evaluación de actividad antimicrobiana determinando la concentración mínima inhibitoria (CMI) de anetol aislado a partir de extractos alcohólicos de anís estrellado (Illicium verum) y un patrón de acetol de Merck® ……………………………………….

35

Tabla 5. Resultados obtenidos después de la evaluación de actividad antimicrobiana de amplio espectro de los extractos combinados de canela y cebollin chino con diversos tratamientos ……………………………………….

36

Tabla 6. Resultados obtenidos después del estudio comparativo y sinérgico entre varias especias y Bifidobacterium longum contra el crecimiento de E. coli O157:H7 en la carne molida ……………………………………..

36

Tabla 7. Resultados obtenidos después de la evaluación de actividad antimicrobiana de aceites esenciales obtenidos a partir de canela, clavo de olor, limonaria, mostaza, naranja, salvia, tomillo y romero contra los hongos presentes en el pan de centeno: P. roqueforti, P. corilofilum, A. flavus …………………………………………………………………………………………………………………

37

Tabla 8. Determinaciones analíticas del contenido del extracto acuoso de Caléndula officinalis ………………………………………………………………………………………….

38

Tabla 9. Tabla de muestras obtenidas. Frecuencia de agitación: 200 rpm. Tiempo de extracción: 24 horas ………………………………………………………………………

48

Tabla 10. pH de extractos vegetales de Caléndula officinalis y Tropaeolum majus ……………………………………………………………………………………………

64

Tabla 11. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto acuoso de Caléndula officinalis a diferentes concentraciones, obtenido a 25°C, por el método de tubo pequeño …………………………………………………………………….

81

9

Pág.

Tabla 12. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto acuoso de Caléndula officinalis a diferentes concentraciones obtenido a 50°C por el método de tubo pequeño ……………………………………………………………………………

81

Tabla 13. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto acuoso de Tropaeolum majus a diferentes concentraciones obtenido a 25°C por el método de tubo pequeño ……………………………………………………………………………

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82

Tabla 15. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae del extracto etanólico de Caléndula officinalis a diferentes concentraciones obtenido a 25°C, por el método de tubo pequeño ……………………………………………………….

82

Tabla 16. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto etanólico de Caléndula officinalis a diferentes concentraciones obtenido a 50°C, por el método de tubo pequeño ……………………………………………………….

82

Tabla 17. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto etanólico de Tropaeolum majus a diferentes concentraciones obtenido a 25°C, por el método de tubo pequeño …………………………………………………………..

83


83

Tabla 19. Evaluación preliminar de la Actividad Bactericida o Bacteriostática y Fungicida o Fungistática de los Extractos acuoso y etanólicos de Tropaeolum majus y Extractos etanólicos de Caléndula officinalis …………………………………………………………………………………………......................

84

Tabla 20. Evaluación preliminar de la Actividad Bactericida o Bacteriostática y Fungicida o Fungistática del Extracto acuoso de Caléndula officinalis obtenido a 50°C …………………………………………………………....

84

Tabla 21. Intervalos de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de los extractos de Caléndula officinalis y Tropaeolum majus ……………………………….

85

Tabla 22. Características microbiológicas de una pulpa de frutas congelada …………………………………………………………………………………………………………..

10

Pág.

Tabla 23. Conteo previo y conteo posterior de la carga microbiana presente en las manos de dos individuos a los cuales se les aplicaron dos soluciones desinfectantes …………………………………………………………………………………

90

Tabla 24. Evaluación preliminar de la capacidad antimicrobiana de los extracto acuosos y etanólicos a partir de Caléndula officinalis y Tropaeolum majus contra E.coli, S. aureus y S. cerevisiae ……………………………

106

Tabla 25. Resultados de las mediciones de los diámetros de los halos de inhibición formados por cada sendidisco impregnado con el extracto correspondiente a cada tratamiento ………………………………………………………………

108


133


133


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135 Tabla 32. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto acuoso de Caléndula officinalis a diferentes concentraciones obtenido a 50°C por el método de tubo pequeño ……………………………………………………………………………

136


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11

Pág.


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138

Tabla 38. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto acuoso de Tropaeolum majus a diferentes concentraciones obtenido a 50°C por el método de tubo pequeño …………………………………………………………………….........

139

Tabla 39. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto acuoso de Tropaeolum majus a diferentes concentraciones obtenido a 50°C por el método de tubo pequeño …………………………………………………………………………...

139


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12

Pág.

Tabla 45. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto etanólico de Caléndula officinalis a diferentes concentraciones obtenido a 50°C, por el método de tubo pequeño ……………………………………………………....

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Pág.


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Tabla 57. Clasificación y descripción de los microorganismos identificados en los frotis de manos ………………………………………………………………..

149

14

LISTA DE FIGURAS Pág.

Figura 1. Caléndula officinalis …………………………………………………………………………. 45

Figura 2. Tropaeolum majus ………………………………………………………………………….. 46

Figura 3. Obtención de los extractos vegetales ……………………………………………. 47

Figura 4. Diseño experimental de la Fase I: Obtención de extractos ………… 48

Figura 5. Curva de crecimiento de Escherichia coli ……………………………………… 51

Figura 6. Curva de crecimiento de Staphylococcus aureus ………………………… 52

Figura 7. Curva de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae …………………… 52

Figura 8. Curva estándar de Turbidez para Escherichia coli ………………………. 53

Figura 9. Curva estándar de turbidez para Staphylococcus aureus …………. 54

Figura 10. Curva estándar de turbidez para Saccharomyces cerevisiae ….. 55

Figura 11. Preparación del inóculo ………………………………………………………………… 56

Figura 12. Diseño experimental de la Fase II: Evaluación de la actividad antimicrobiana y determinación de la capacidad bactericida o bacteriostática y fungicida o fungistática .……………………………………………………..

57

Figura 13. Evaluación antimicrobiana por el Método de difusión por disco ……………………………………………………………………………………………………………………

59

Figura 14. Evaluación de la actividad antimicrobiana por el Método del tubo pequeño ………………………………………………………………………………………...............

60

Figura 15. Comparación de Promedios de diámetros de halos de inhibición por cada tratamiento aplicado a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae ………………………………………………………………………………………………………..

66

Figura 16. Comparación de promedios por solventes de extractos aplicados a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae …………………………………………………….

67

Figura 17. Comparación de promedios por plantas de extractos aplicados a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae ……………………………………………………………………..

68

15

Pág.

Figura 18. Comparación de promedios de la interacción entre solvente y planta de extractos aplicados a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae ………………….

69

Figura 19. Comparación de promedios de la interacción entre temperatura y planta de extractos aplicados a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae. …………………………………………………………………………......................................

70

Figura 20. Comparación de promedios de la interacción entre temperatura, planta y solvente de extractos aplicados a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae ………………………………………………………….....................................................

71

Figura 21. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de E. coli, obtenidos a partir de un extracto de Caléndula officinalis en Agua a una temperatura de 50°C …………………………………………………………………………………

72

Figura 22. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de E. coli, obtenidos a partir de un extracto de Caléndula officinalis en Etanol al 95% a una temperatura de 50°C. ………………………………………………………………..

72

Figura 23. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de S. aureus, obtenidos a partir de un extracto de Caléndula officinalis en Agua a una temperatura de 50°C …………………………………………………………………..

73

Figura 24. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de S. aureus, obtenidos a partir de un extracto de Caléndula officinalis en Etanol al 95% a una temperatura de 50°C …………………………………………………….

73

Figura 25. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de S. cerevisiae, obtenidos a partir de un extracto de Caléndula officinalis en Agua una temperatura de 50°C ………………………………………………………………………

74

Figura 26. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de S. cerevisiae, obtenidos a partir de un extracto de Caléndula officinalis en Etanol al 95 % a una temperatura de 50°C …………….……………………………………..

74

Figura 27. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de E. coli, obtenidos a partir de un extracto de Tropaeolum majus en Agua a una temperatura de 50°C …………………………………………………………………………………

75 Figura 28. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de E. coli, obtenidos a partir de un extracto de Tropaeolum majus en Etanol al 95 % a una temperatura de 50°C ……………………………………………………………………

75

16

Pág.

Figura 29. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de S. aureus, obtenidos a partir de un extracto de Tropaeolum majus en Agua a una temperatura de 50°C ..……………………………………………………………………………

76

Figura 30. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de S. aureus, obtenidos a partir de un extracto de Tropaeolum majus en Etanol al 95 % a una temperatura de 50°C ……………………………………………………

76

Figura 31. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de S. cerevisiae, obtenidos a partir de un extracto de Tropaeolum majus en Agua a una temperatura de 50°C …………………………………………………………………..

77

Figura 32. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de S. aureus, obtenidos a partir de un extracto de Tropaeolum majus en Etanol al 95 % a una temperatura de 50°C ……………………………………………………

77

Figura 33. Comparación del efecto bioconservante del extracto acuoso de Caléndula officinalis contra E.coli y un Blanco de crecimiento de E.coli ……………………………………………………………………………………………………………………

87

Figura 34. Comparación del efecto bioconservante del extracto acuoso de Tropaeolum majus contra S. aureus y un Blanco de crecimiento de S. aureus …………………………………………………………………………………………………………………

88

Figura 35. Aplicación del extracto etanólico de Caléndula officinalis obtenido a 50°C, en la manos como loción antibacterial después de un frotis. Muestra 1 …………………………………………………………………………………………………

91

Figura 36. Aplicación del extracto etanólico de Caléndula officinalis obtenido a 50°C, en la manos como loción antibacterial después de un frotis. Muestra 2 …………………………………………………………………………………………………

91

Figura 37. Aplicación del extracto etanólico de Tropaeolum majus obtenido a 50°C, en la manos como loción antibacterial después de un frotis. Muestra 1 …………………………………………………………………………………………………

92

Figura 38. Aplicación del extracto etanólico de Tropaeolum majus obtenido a 50°C, en la manos como loción antibacterial después de un frotis. Muestra 2 …………………………………………………………………….................................

92

17

LISTA DE ANEXOS Pág.

Anexo 1. Evaluación preliminar de la capacidad antimicrobiana de los extracto acuosos y etanólicos a partir de Caléndula officinalis y Tropaeolum majus contra E.coli, S. aureus y S. cerevisiae ……………………………

106

Anexo 2. Resultados de las mediciones de los diámetros de los halos de inhibición formados por cada sendidisco impregnado con el extracto correspondiente a cada tratamiento ………………………………………………………………

108

Anexo 3. Análisis de Varianza. ANOVA ……………………………………………………….. 114

Anexo 4. Tablas de aplicación de extractos por el método del tubo pequeño ……………………………………………………………………………………………………………

133

Anexo 5. Clasificación y descripción de los microorganismos identificados en los frotis de manos ………………………………………………………………..

149

Anexo 6. Fotografías del conteo previo y post conteo de la aplicación de la loción antimicrobiana a partir de Caléndula officinalis …………………………....

150

Anexo 7. Fotografías del conteo previo y post conteo de la aplicación de la loción antimicrobiana a partir de Tropaeolum majus …………………………..... 152

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INTRODUCCIÓN

Durante el curso de la historia, se han presentado diferentes avances y descubrimientos que el ser humano ha puesto al servicio de sus semejantes. Bien sea investigación o azar, tales descubrimientos demuestran altruismo, adaptación y cuidado de las especies, lo que ha llevado al género humano a la cabeza de un gigante ecosistema. Muestra de lo anterior, es la lucha contra las enfermedades infecciosas por medio de uno de los más importantes logros: los antibióticos. En el siglo XX, “como consecuencia del uso de agentes quimioterapéuticos, se produce la resistencia de los microorganismos hacia dichos fármacos, resultado de procesos naturales mediante los cuales los microorganismos desarrollan tolerancia a nuevas condiciones ambientales” (Pelczar y Chan, 1984). En este contexto, aquellas sustancias que se han convertido en inefectivas exponen la necesidad de desarrollar nuevos agentes antimicrobianos que puedan complementarlas y/o reemplazarlas. En el siglo XXI, como resultado de experiencias con agentes químicos, crece la demanda de productos naturales tanto en el campo de la salud, como en el de la industria alimenticia y cosmética. Gracias a las técnicas microbiológicas modernas se ha demostrado que gran variedad de especies vegetales silvestres manifiestan atributos antimicrobianos. Especias y hierbas usadas comúnmente para reforzar sabor y aroma de los alimentos, también fueron usadas por nuestros antepasados para preservar los alimentos y con fines terapéuticos. Ya en el siglo XIX experimentos científicos documentaban las propiedades antimicrobianas de algunas especias, hierbas y sus componentes (Snyder, 1997). Aunque actualmente los productos botánicos juegan un papel importante en el mundo agrícola, cosmético y de la salud, su participación sigue siendo mínima y con información limitada dentro de los campos mencionados. Sin embargo, los productos vegetales presentan un enorme potencial y han contribuido a la ampliación de la investigación agroquímica moderna. Aparece entonces una nueva gama de productos: los alimentos funcionales. El término de alimento funcional incluye sustancias botánicas que han sido usadas como suplementos dietarios o como aditivos alimenticios. Estos últimos llamados conservantes biológicos comprenden un amplio grupo de productos naturales a partir de plantas o microorganismos, que pueden ser útiles para prolongar la vida útil de los alimentos, reduciendo o eliminando las bacterias patógenas e incrementando la calidad de los productos alimenticios (Draughon, 2004).

19

Debido a la demanda actual de agentes antimicrobianos naturales, tanto antifúngicos como antibacterianos, a la interminable búsqueda de principios naturales biológicamente activos (Mukhopadhyay et al., 2001) y con el objeto de aprovechar racionalmente los recursos naturales presentes en nuestro país, se planteó el desarrollo de este proyecto. Por el promisorio potencial antimicrobiano de Caléndula officinalis y de Tropaeolum majus, se propuso determinar la capacidad de inhibición de sus extractos etanólicos y acuosos contra Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Saccharomyces cerevisiae. Se planteó para los extractos acuosos una aplicación en una matriz alimentaria como es la pulpa de fruta sin conservantes y para los extractos etanólicos una aplicación en jabón - gel antibacterial para uso sin enjuague. Los trabajos realizados con estas dos especies son muy escasos, por ello, además de llevar a cabo un estudio exploratorio y aplicaciones innovadoras con Caléndula officinalis y Tropaeolum majus, se pretendió aportar información de interés para futuros investigadores interesados.

20

1. OBJETIVO GENERAL

Evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos acuosos y etanólicos de Caléndula officinalis y de Tropaeolum majus. 1.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1.1.1. FASE I

- Obtener extractos acuosos y etanólicos a partir de cada especie vegetal: Caléndula officinalis y Tropaeolum majus.

1.1.2. FASE II

- Explorar la capacidad antimicrobiana de los extractos obtenidos en la Fase I frente a Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Saccharomyces cerevisiae.

- Determinar la actividad bactericida o bacteriostática para las bacterias y

fungicida o fungistática para las levaduras, de los extractos etanólicos y acuosos de Caléndula officinalis y de Tropaeolum majus. 1.1.3. FASE III

- Determinar la efectividad de la aplicación de los extractos acuosos como

conservantes naturales en pulpa de frutas y de los extractos etanólicos en jabón - gel antibacterial para uso sin enjuague.

21

2. MARCO TEÓRICO

2.1. COLOMBIA Y SU BIODIVERSIDAD Etimológicamente, la palabra biodiversidad es una contracción de la expresión ‘diversidad biológica’, la cual expresa la variedad del mundo biológico (Pascual, 1997), variedad de vida que se manifiesta en la diversidad genética de poblaciones, especies, comunidades, ecosistemas y paisajes. En este campo, Colombia, “puerta de entrada” a América del Sur, ostenta el segundo lugar en biodiversidad del planeta ya que posee entre el 10% y 14% de la diversidad mundial en una superficie que corresponde al 0.8% de las tierras emergidas del mundo. Además, en diversidad vegetal tiene entre 35.000 y 45.000 especies de plantas vasculares y cuenta con el mayor número de especies de palmas del mundo, 248 (FPAA, 2005). En la tabla 1, se resume la posición que Colombia ocupa dentro del contexto mundial. Esta realidad confirma los análisis realizados respecto al comportamiento de la economía dependiente en buena medida de los recursos naturales del país, o por lo menos así lo demuestran los componentes del Producto Interno Bruto (PIB) en las últimas dos décadas (FPAA, 2005). Tabla 1. Posición mundial de Colombia en biodiversidad.

Grupo Estado

Plantas superiores

3er. Puesto mundial (después de Brasil e Indonesia) No. Especies: 35.000 - 45.000 No. Especies endémicas: 15.000 - 17.000 Participación mundial: 6 - 6.8%

Mamíferos

4to. Puesto mundial No. Especies: 456 No. Especies endémicas: 28 No. Especies amenazadas: 35

Aves

1er. Puesto mundial No. Especies: 1815 No. Especies endémicas: 28 (5to lugar) No. Especies amenazadas: 35

Reptiles 3er. Puesto mundial (después de Australia y México) No. Especies: 920 No. Especies endémicas: 97 (11vo. Puesto)

Anfibios No. Especies: 583 No. Especies endémicas: 367 (1er lugar en ambos casos)

Fuente: Instituto de Investigación en Recursos Biológicos Alexander Von Humboldt, 2000.

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Aunque esto último demuestre que la economía nacional depende del aprovechamiento agrícola, es necesario abarcar más que la siembra y la cosecha. Es de suma importancia generar procesos de utilización de sustancias funcionales de las especies vegetales, promover una economía competitiva y sostenible, que nos lleve a desmentir lo que actualmente se afirma respecto al aprovechamiento de la biodiversidad, ya que se conoce “menos del 1% de lo que tenemos” (Díaz, 2004). La enorme riqueza natural del país es una oportunidad y una responsabilidad con generaciones futuras. El desarrollo de Colombia debe estar íntimamente ligado con el aprovechamiento de la biodiversidad, buscando una distribución más justa y equitativa de los costos y beneficios derivados de ésta. Para lograr este objetivo se formuló una Política Nacional de Biodiversidad publicada en 1997, en la cual se consignan las estrategias y acciones orientadas al conocimiento, conservación y utilización sostenible de la biodiversidad en Colombia (Samper et al., 1998).

2.2. INVESTIGACIÓN EN COLOMBIA Según Colciencias para el año 1999:

“El 57% de los investigadores se dedicó al campo vegetal y agrícola, el 17% al de la salud humana, el 14% a lo ambiental, el 7% al animal y el 5% a lo industrial” (Ángel, 2004).

“El 35% del desarrollo de estas investigaciones lo hicieron las universidades,

el 33% el sector productivo, el 27% los centros de investigación y el 5% otras instituciones” (Ángel, 2004).

El 57% de los investigadores era de nivel pregrado, el 26% tenía algún tipo

de maestría y el 19% contaba con un nivel de doctorado en filosofía” (Ángel, 2004).

En el último año, en el taller del Programa Nacional de Biotecnología, programa de Colciencias, se afirmó que “…en los últimos 30 años en investigación de productos naturales se han invertido US$7 millones y no hay ningún producto en el mercado originado de esa investigación” (Sánchez, 2004). Estos planteamientos expuestos en el foro “Biotecnología en el agro”, organizado por la Escuela Colombiana de Ingeniería en el año 2004, nos permiten ver el marco de referencia que tienen grandes investigadores colombianos para promover la educación orientada hacia la investigación; es de vital importancia generar conocimiento, desarrollar nuevos procesos que involucren la biodiversidad y la biotecnología, único camino para establecer una economía nacional competitiva y

23

dejar atrás el subdesarrollo que ha estancado a un país lleno de naturaleza viva y expectante a su utilización racional.

2.2.1. ESPECIES VEGETALES SILVESTRES Se conocen alrededor de 35.000 especies vegetales en Colombia, algunas de estas clasificadas por usos medicinales, otras usadas como condimentos, aditivos o simplemente de uso ornamental; han sido ubicadas dentro del Convenio Andrés Bello como especies promisorias por su potencial de explotación en el campo de la salud, la agricultura y la industria. Dentro de este selecto grupo de especies promisorias hallamos a las dos protagonistas de la presente investigación:

2.2.1.1. Caléndula officinalis L.

FAMILIA GÉNEROCompositae (Asteraceae) Calendula officinalis L.

TAMAÑO NOMBRES COMUNES

Hierba anual, de 30 a 60 cm de altura. Inglés: Marigold, Pot marigold.Español: Caléndula, Maravilla de los jardines.

FOLLAJE FLORES Hojas color verde claro, simples, opuestas,gruesas y de textura suave.

Flores en forma de margarita, de coloramarillo pálido hasta anaranjado fuerte,tienen 5 cm de diámetro aprox..

SUSTANCIAS ACTIVAS USOSAceites esenciales, principios amargos,mucílagos, glucósidos, xantofila, fermentos,saponinas.

Cicatrizante, desinflamante, tratamientospara úlcera gástrica, conjuntivitis,antiespasmódica y bactericida.

Adaptado de Carreño (2000), Especies Vegetales Promisorias de los países del Convenio Andrés Bello, (1999), Acosta et al. (2004).

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2.2.1.2. Tropaeolum majus

FAMILIA GÉNEROTropaeolaceae Tropaeolum majus L.

TAMAÑO NOMBRES COMUNES12 pulgadas de alto por 8 pulgadas deancho.

Inglés: Nasturtium, Indian Cress. Francés: Capucine. Español: Capuchina.

FOLLAJE FLORES Hojas color verde claro, alternadas,redondeadas, con bordes ondulados y venasfuertemente marcadas que radian del centro.

Flores colores vistosos como rojo, rosado,anaranjado, amarillo, crema o pastel. Cadaflor tiene 5 sépalos unidos a la base, 5pétalos y 8 estambres.

SUSTANCIAS ACTIVAS USOSSustancias antibióticas aún no identificadas Antiescorbútico, antiséptico y calmante.

Adaptado de Carreño (2000), Especies Vegetales Promisorias de los países del Convenio Andrés Bello, (1999).

2.3. ANTIMICROBIANOS NATURALES Los conservantes son un grupo de antimicrobianos naturales que provienen de cualquiera de los sistemas naturales presentes en el ecosistema incluyendo plantas o microorganismos que pueden ser usados para alargar la vida útil de los alimentos, reduciendo o eliminando la carga bacteriana patógena ya que poseen actividad antibacterial, antufúngica o antiviral (Olaya y Méndez, 2003). Los vegetales elaboran dos tipos de componentes químicos: los principios inmediatos y los principios activos. Los primeros, son sustancias que no tienen actividad farmacológica sobre el organismo animal, los elaboran las plantas alimenticias y son fundamentales para la nutrición. Dentro de estos principios se encuentran las proteínas, lípidos, carbohidratos, entre otros; los segundos, son sustancias que proveen beneficios o perjudican al organismo que los consume, dependiendo de su composición química. Por ejemplo, una infusión de hojas de coca provee bienestar digestivo, mientras que de la extracción con solventes químicos de estas mismas hojas de coca se obtiene el clorhidrato de cocaína, estimulante nervioso, que produce adicción y estados de euforia (Olaya y Méndez, 2003). La conservación de alimentos data desde tiempos prehistóricos y ha sido perfeccionada con el arte de la culinaria y la industrialización. Los beneficios potenciales de las plantas comestibles, así como de los fitoquímicos que las

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componen han ayudado a mejorar la calidad organoléptica de algunos otros alimentos. Desde hace 5000 años los chinos han utilizado las hierbas con fines medicinales y el uso más anticipado que se conoce de las hierbas y especias antimicrobianas y conservantes se lo dieron los egipcios hacia el año 1550 AC, cuando utilizaban la canela, el comino y el tomillo para preservar alimentos y en la momificación (Hirasa y Takemasa, 1998). Se tienen evidencias científicas sobre el potencial antimicrobiano de las especias, en el siglo XIX Webb y Tanner (1944) reportaron la actividad antimicrobiana del aceite de canela contra esporas de Ántrax. Luego, Grove (1918) observó la capacidad de preservar la salsa de tomate con extractos acuosos y etanólicos de canela. Fabian (1939) encontró que la canela inhibía el crecimiento microbiano en una dilución de 1:50 y los clavos en dilución 1:800 para inhibir Staphylococcus aureus (Naidu, 2000). Según Lindsay (1996) las hierbas son partes de plantas: arbustos y árboles, como tallos u hojas suaves y aromáticas; mientras que las especias son raíces, rizomas, cortezas, flores, frutos y semillas. Comúnmente, las hierbas provienen de plantas de clima templado o subtropical y las especias de plantas de clima tropical. Las especias son comercializadas frescas o secas, las secas se pueden extraer con solventes como el etanol. También pueden ser sometidas a destilación, presión fría o extraídas con dióxido de carbono supercrítico para obtener aceites esenciales (Hirasa & Takemasa, 1998). Las civilizaciones antiguas reconocieron el potencial antiséptico y antimicrobiano de varios extractos vegetales pero la caracterización fitoquímica se dio gracias a los avances de las técnicas de separación molecular que permiten hoy en día aislar los compuestos fito–antimicrobianos (Naidu, 2000).

2.3.1. FITO – ANTIMICROBIANOS .Los fito – antimicrobianos son sustancias presentes en las plantas, ya sea en sus tallos, hojas, flores y/o frutos que han demostrado tener capacidades antimicrobianas. El creciente uso de especias, hierbas y de sus aceites esenciales como aditivos alimentarios demuestra la gran capacidad antimicrobiana que estos tienen. La gran limitante en muchos casos ha sido la concentración de estos componentes antimicrobianos que resultan muy bajas para ser usadas efectivamente sin afectar las características sensoriales de los alimentos. (Naidu, 2000).

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Entre los antimicrobianos más estables que se han encontrado hasta el momento en hierbas y especias se hallan en los componentes de la canela, clavos de olor, semillas de mostaza, romero, salvia, tomillo y vainilla. También, ciertos agentes fito – fenólicos tales como las oleoresinas del aceite de oliva que han demostrado aportar beneficios fisiológicos al consumidor y por lo tanto un atractivo favorable para la industria de la comida saludable (Naidu, 2000). Los fito – antimicrobianos más representativos conocidos hasta el momento son: 2.3.1.1. Fitofenoles Los fitofenoles son los componentes principales de las especias, responsables de su actividad antimicrobiana y ubicados en la fracción de los aceites esenciales (Beuchat, 1994). Por ejemplo, la actividad antimicrobiana de la canela, la pimienta y los clavos se atribuye al eugenol (2 metoxi-4 alil fenol) y al aldehído cinámico, los cuales constituyen la mayor parte de los aceites volátiles de estas especias (Farrel, 1985). Métodos de extracción Para aislar cualquier sustancia antimicrobiana se debe elegir el solvente a usar, teniendo en cuenta la habilidad de éste para arrastrar la mayor cantidad de componentes antimicrobianos. Es necesario utilizar un solvente puro y llevar el proceso de extracción bajo condiciones de temperatura moderadas entre 30-60°C, utilizando cuando sea posible solventes de baja reactividad (Ghisalberti, 1993). Espectro antimicrobiano Innumerables factores influyen en la actividad antimicrobiana de los fitofenoles, como la composición química, influenciada por el origen geográfico y la variedad de cultivos. También, el tipo de ensayo puede afectar la actividad antimicrobiana de estos compuestos, ya que ciertos componentes antimicrobianos son hidrófobos, por lo tanto los ensayos con discos pueden no ser apropiados para evaluar la actividad (Hammer et al., 1999). La coexistencia con otros componentes del alimento como las proteínas, los lípidos, minerales, el pH, el tiempo y temperatura de extracción, pueden también controlar la actividad biológica de los fenoles. Mecanismos de acción Los estudios se han centrado en el mecanismo por el cual las especias o sus aceites esenciales inhiben crecimiento de microorganismos, llegando a concluir que los terpenos, presentes en los aceites esenciales de las especias, son los principales antimicrobianos.

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La hipótesis planteada por Juven et al. (1994), afirma que la reacción de los compuestos fenólicos con las proteínas en la membrana citoplasmática del microorganismo causa un cambio en la permeabilidad de la membrana produciendo una fuga de solutos y afectando la fuerza motora de protones. 2.3.1.2. Saponinas Son compuestos que protegen a las plantas del estrés biótico y además promueven actividades antibacteriales, antifúngicas y antivirales. Esta actividad antimicrobiana de amplio espectro puede ser útil para la conservación de alimentos (Naidu, 2000). Las saponinas son un grupo que se presenta en los glicósidos, abundantes en el reino vegetal, sin embargo, algunos animales marinos también contienen estos compuestos. Las saponinas se pueden encontrar en diferentes partes de la planta, como raíces, flores, vástagos y semillas. La característica más común de las saponinas es la formación de espuma jabonosa cuando se agita en solución acuosa. Dependiendo de la estructura de las saponinas, éstas pueden mostrarse con actividad hemolítica, antimicrobiana, despolarizante de membranas, capaz de inmovilizar el colesterol. Desde el punto de vista nutricional, la actividad hemolítica de las saponinas no representa amenaza para el consumidor, ya que se digieren y no pasan a través del torrente sanguíneo (Naidu, 2000). La actividad antimicrobiana es importante en la planta para protegerse contra patógenos. La localización de saponinas con gran actividad antimicrobiana depende de la función que quiera afectar el patógeno, por ejemplo, las partes aéreas de algunas plantas acumulan un sabor amargo para protegerse de los herbívoros (Oleszek et al., 1999). Las saponinas se encuentran en plantas comestibles como soya, fríjol, guisantes, avena, tomate, espárragos, té, maní, espinaca, remolacha, mora y ñame; en plantas usadas como alimento animal están las legumbres, la alfalfa, el forraje, castañas y el girasol; y en plantas usadas como saborizantes, alimentos saludables, tónicos, etc., incluyendo hierbas, semillas comestibles, ginseng y nuez moscada (Price et al., 1987). Métodos de extracción En un extracto vegetal puede demostrarse su presencia simplemente con la agitación y la consecuente formación de espuma, a pesar de ello, algunas saponinas no forman espuma estable. Por otro lado, ciertos extractos vegetales pueden no tener saponinas y podrán formar espuma.

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Existen trabajos sobre saponinas que incluyen una extracción con metanol, etanol y agua, seguida de una evaporación de alcohol y la extracción de saponinas dentro de n-butanol. En ésta extracción líquida-líquida los compuestos altamente polares presentan una matriz de sacáridos permanente en la solución acuosa dando cierta purificación al extracto, sin embargo, la evaporación del butanol produce un oscurecimiento de la solución rica en sólidos con muchos compuestos que interfieren y se sugiere por lo tanto la diálisis para remover pequeñas moléculas solubles en agua (Massiot et al., 1996). No obstante, estos procedimientos tienen como desventaja que las saponinas pueden degradarse debido a la utilización de una solución acuosa y metanol caliente (Massiot et al., 1996). Espectro antimicrobiano y mecanismos de acción La acción principal de las saponinas sobre los microorganismos es su interacción con la membrana de esteroides, por lo tanto, las bacterias cuyas membranas sean bajas en colesterol no serán sensibles a las saponinas. Tanto las saponinas triterpenas como las esteroidales han mostrado actividad antibacterial (Takeya, 1997). El grado de actividad depende de la estructura de la saponina y el microorganismo objetivo (Masamitsu et al., 1998). La saponina más común es la de la hiedra que es más efectiva contra bacterias Gram positivas (Kim et al., 1998). El mayor efecto producido por las saponinas sobre las bacterias es la liberación de proteínas y ciertas enzimas de las células de las bacterias (Zablotowicz et al., 1996). Las saponinas triterpenas y esteroidales son las que comúnmente demuestran actividades antifúngicas. Al parecer el mecanismo principal de la predisposición y sensibilidad de un microorganismo a las saponinas son las interacciones con esteroles, proteínas y fosfolípidos de la membrana, pero su efecto todavía no es específico (Gruiz, 1996). 2.3.1.3. Flavonoides Han sido extensamente caracterizados por su actividad antimicrobiana de amplio espectro y por la capacidad de inducir al organismo objetivo una baja resistencia a su actividad antimicrobiana (Naidu, 2000). Los Isoflavonoides son potentes inhibidores de crecimiento fúngico y su uso potencial se destina al control de enfermedades en las plantas, específicamente, se han sugerido como alternativa al uso de fungicidas convencionales en el control de almacenamiento de granos en países subdesarrollados. Los flavonoides son reconocidos por aportar cualidades nutricionales, sensoriales y antioxidantes a las frutas y a los productos derivados de ellas, como los jugos y vinos. Estos compuestos se presentan hoy en día como

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ingredientes nutracéuticos de gran atractivo para la industria de alimentos (Naidu, 2000). El término flavonoides (lat. Flavus=amarillo) fue usado por primer vez para la familia de compuestos de color amarillo con el grupo 2-fenil-cromo (Swain, 1976). Luego, se extendió a varios polifenoles para incluir a los compuestos menos coloreados. En las plantas puede reconocerse su presencia en flores, frutas, raíces y cortezas de color blanco o amarillo, esta característica le permite a la planta protegerse de la radiación UV producida por el sol (Swain, 1979). Una planta puede contener varios tipos de flavonoides, por ejemplo los que tienen atractivos colores son blanco visual para los insectos polinizadores. Las catequinas y otros flavonoides poseen características astringentes y actúan como repelentes, mientras que los isoflavonoides son importantes protectores de la planta. Estos ácidos fenólicos son de gran interés para el hombre desde diferentes aspectos, ya que ellos contribuyen a la calidad sensorial y nutritiva de las frutas y de productos derivados de ellas. Además, son responsables de mejorar la estabilidad del color en los productos derivados de las frutas (Mazza y Miniati, 1993). De todas las sustancias identificadas de las plantas medicinales, los flavonoides representan uno de los compuestos bioactivos más interesantes. Actualmente, alrededor de 40 plantas son usadas como fitomedicinas debido a su contenido en flavonoides. En estas plantas, los flavonoides comúnmente suceden como glicósidos; las clases de flavonoides más comunes son: los flavonoles, flavonas y sus dihidroderivados, seguidos por las antocianinas e isoflavonas. La distribución de los flavonoides en las frutas es bastante amplia, por ejemplo, las uvas son una fuente rica en compuestos fenólicos incluyendo flavonoides y no flavonoides. Las clases de flavonoides más comunes son las antocianinas (uvas rojas) y flavonoles. Estos últimos componen en su mayoría a las uvas y se identifican como todos los glicósidos presentes en ella (Cheynier y Rigaud, 1986), como la mircetina, quercetina, kaempferol. La variación en la composición fenólica depende del estado de madurez de la fruta así como de su variedad. Métodos de extracción Los flavonoides son inestables y pueden ser degradados por la acción de las enzimas en la planta fresca, por lo tanto es necesario un cuidadoso procesamiento. Se recomienda la liofilización de la planta, ya que se obtiene un polvo que puede ser almacenado en recipientes sellados en un congelador, sin deterioro del compuesto. Para cuantificar el contenido de flavonoides se recomienda un rápido congelamiento en nitrógeno líquido inmediatamente después de la cosecha. En la práctica, si las antocianinas o taninos no están involucrados, se puede optar por el secado de la planta en una estufa a 100°C. Luego de este procedimiento, el material seco puede almacenarse en una bolsa plástica por varios meses bajo

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refrigeración para prevenir la pérdida de flavonoides. El secado por aire a temperatura ambiente no es recomendado, ya que podría causar degradación enzimática. Una buena alternativa es realizar la extracción del material fresco, picando la muestra en un procesador con un solvente apropiado. La actividad enzimática puede evitarse si un alcohol es incluido como solvente de extracción (Naidu, 2000). Espectro antimicrobiano y mecanismos de acción Los flavonoides son lipofílicos, característica que les proporciona actividad antimicrobiana, pues esta propiedad está asociada a la habilidad de traspasar membranas biológicas (Harborne, 1983). La actividad antibacteriana de los flavonoides se observó por primera vez en 1977, Wyman y Van Etten evaluaron seis isoflavonoides contra Pseudomonas, Xantomonas y Acromobacter. Los resultados mostraron un efecto leve a moderado contra Pseudomonas pero una fuerte actividad contra Acromobacter. Extractos de diclorometano y metano de las hojas de Psiadia trinervia, especie del género de las Compuestas, usada en Africa en medicina tradicional como expectorante para el tratamiento de la bronquitis, fueron evaluados por Wang et al. (1983), quienes midieron la actividad antibacterial contra Bacillus cereus dando resultados positivos. Los flavonoides como la quercetina, bioflavonoide ampliamente distribuido en frutas, verduras y el té (Kuhnau, 1976) y la morina, se evaluaron y se encontró que poseían actividad virucida contra el Herpes simple (Beladi, 1977). Se cree que los flavonoides que muestran actividad antiviral interactúan sobre la cápsula de proteínas del virus (Ninomiya y Cols, 1984). Los efectos biológicos de la quercetina y de algunos de sus derivados han sido reportados: como el efecto inhibitorio contra células malignas (Suolinna et al., 1975). Su mecanismo está básicamente ligado a interrumpir el ciclo de replicación. 2.3.1.4. Glucosinolatos Este componente bioactivo ha sido usado durante siglos en preparaciones herbales y remedios para tratar desde el reumatismo hasta picaduras de serpientes venenosas. Los presentes en el rábano y la mostaza han sido usados como estimulantes, aplicándolos en las proteínas grasas del pescado y la carne. Los glucosinolatos volátiles tales como los isotiocianatos han mostrado un amplio rango de efectos antibacteriales y antifúngicos. También, se ha sugerido la aplicación de alil – isotiocianatos gaseosos como preservativos en alimentos empacados. Por último, se ha sugerido que la ingesta constante de brócoli, repollo

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y col de Bruselas ayuda a prevenir el cáncer mamario, sin embargo, ciertos estudios con glucosinolatos purificados revelan toxicidad en algunos animales (Naidu, 2000). Los glucosinolatos están presentes en varias especies de la familia de las Cruciferae, como en el coliflor, la mostaza, el rábano, repollo, brócoli, colinabo entre otros; también se conoce su presencia en algunas variedades de la familia de las Capparaceae y de las Tropaeolaceae, dentro de esta última se encuentra el mastuerzo de indias (Tropaeolum majus) que además contiene un tipo de aceite de mostaza (Martin, 1999). La producción de los glusinolatos dentro de la planta ocurre cuando ésta está amenazada por los insectos (Olsson y Jonasson, 1994). Mecanismos de extracción Los métodos de aislamiento para los glucosinolatos varían dependiendo de su propiedad molecular. Existen varios tipos de glucosinolatos que pueden ser extraídos desde una simple lixiviación con agua con solventes como: acetonas, benceno, etanol al 95%, repasando lavados con estos mismos. El punto de coincidencia en estas extracciones es el tipo de almacenamiento que debe darse al extracto obtenido y es el mantenimiento a bajas temperaturas (Kyung et al., 1997) (Shofran et al., 1998). Espectro antimicrobiano y mecanismos de acción Shofran et al. (1998) reportó el efecto inhibidor de un glucosinolato: alil-isotiocianato (AITC) contra E. coli, S. aureus, B. subtilis, A. hydrophilia, entre otras. Delaquis y Sholberg (1997), probaron el AITC gaseoso contra Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, E. coli O157:H7, Pseudomonas corrugada, Penicillium expansun concluyendo la actividad inhibidora sobre los microorganismos nombrados. Brabban y Edwards (1995) encontraron que la sinigrina, un glucosinolato presente en el rábano, causaba la inhibición de crecimientos de E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, B. stearothermphilus y Streptomyces thermoviolaceus. 2.3.1.5. Carotenoides Son pigmentos sin nitrógeno que se presentan en las plantas atribuyéndoles características especiales de coloración. Los carotenoides son los responsables de la gran mayoría de los colores amarillos, anaranjados o rojos presentes en los alimentos vegetales, y también de los colores anaranjados de varios alimentos animales. Desde el punto de vista químico, pertenecen a la familia de los terpenos y su biosíntesis se produce a partir de isopentenil pirofosfato.

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Se conocen alrededor de 600 compuestos de esta familia, que se dividen en dos tipos básicos : los carotenos, que son hidrocarburos, y las xantofilas, sus derivados oxigenados. A estos tipos hay que unir los apocarotenoides, de tamaño menor, formados por ruptura de los carotenoides típicos. En los vegetales verdes se encuentran en los cloroplastos, formando parte del sistema de biosíntesis a partir de la energía solar, pero son mucho más abundantes, y visibles, coloreando algunas raíces, frutas y flores. Dada su ubicuidad en el reino vegetal, la biosíntesis total anual de carotenoides se ha estimado en unos 100 millones de toneladas. Los animales no pueden sintetizar sustancias de este tipo, pero si pueden transformar una en otra, aunque con bastantes limitaciones (Calvo, 2006). Según Calvo, (2006), los carotenoides son un grupo muy importante de flavonoides con función antioxidante y capaz de modular el sistema inmunológico. Entre estos se destacan:

1. Los carotenos, aquellos que poseen una coloración rojiza y anaranjada:

- Los beta carotenos: precursores de la vitamina A. Se trata de un pigmento vegetal, que una vez ingerido, se transforma en el hígado y en el intestino delgado en vitamina A. Es un componente antioxidante que favorece la no aparición del cáncer, especialmente el de pulmón, boca y estómago. También se ha demostrado que previene las enfermedades del corazón.

- El alfa caroteno: con propiedades más destacadas que el Beta caroteno,

aparece en los mismos alimentos que éste pero en menor proporción.

- El licopeno: componente al cual deben su coloración roja los tomates. Con propiedades similares a los beta carotenos de la zanahoria, tiene propiedades anticancerígenas. El licopeno parece reducir las probabilidades de desarrollar cáncer de próstata, pulmón estómago, vejiga y cuello del útero, tiene además las propiedades de disminuir el colesterol en la sangre y prevenir las inflamaciones de la próstata.

- La criptoxantina: tiene propiedades más destacadas como antioxidante,

aparece en los mismos alimentos que el beta caroteno, principalmente en las naranjas.

2. Las xantofilas, que confieren coloraciones amarillas y rojizas:

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- La luteína: pigmento liposoluble de color amarillento que aparece en algas, bacterias y plantas superiores. Su función es la de proteger a la planta contra la radiación solar. La luteína se encuentra en muchos vegetales, como las judías verdes, las espinacas o el brócoli, aunque su color está enmascarado por el de la clorofila. Junto con la zeaxantina, es el carotenoide responsable del color de la yema de huevo. Se utiliza precisamente para añadirla al alimento de pollos y gallinas, para colorear la piel, carne y huevos.

- La zeaxantina: carotenoide típico del maíz.

- La capsantina: es el principal carotenoide del pimiento común.

2.4. TRABAJOS CON EXTRACTOS VEGETALES Los compuestos derivados de las plantas pueden tener aplicaciones para el control de patógenos que afecten a los alimentos. Es así como la naturaleza ofrece la solución a los problemas que pueden generarse dentro de los frutos que ella da. Estas sustancias abren el camino a la profundización de la investigación en este campo, el cual puede dar frutos económicos rentables y una nueva perspectiva de una producción industrial ecológica y sostenible. Algunos resultados de las investigaciones muestran resultados promisorios: Tabla 2. Resultados obtenidos después de la evaluación de actividad antimicrobiana determinando la concentración mínima inhibitoria (CMI) de cuminaldehído aislado.

EXTRACTO VEGETAL DE

COMPONENTE ACTIVO

CMI mg PEE (Peso de Especia

Equivalente)/ml Microorganismo Indicador

Cuminaldehido aislado

Agrobacterium tumefaciens 10 B. subtilis 10

Micrococcus luteus, 100 Enterobacter aerogenes 100

Escherichia coli 100 Aspergillus niger >100

Fusarium oxysporum >100 Trichophyton rubrum 25

Helminthosporium oryzae 20

Extracto alcohólico de

comino (Cuminum cyminum)

Cuminaldehido (p-isopropil

benzaldehido)

Saccharomyces cerevisiae No se encontró

Adaptado de Mukhopadhyay et al., (2003). Actividad Antimicrobiana de Cuminum cyminum L.

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Tabla 3. Resultados obtenidos después de la evaluación de actividad antimicrobiana de los extractos etanólicos, etéreos, acuosos y en acetato de etilo de Drimys granadensis frente a indicadores Gram positivos, Gram negativos, hongos y levaduras.

EXTRACTO VEGETAL DE

COMPONENTE ACTIVO

TIPO DE EXTRACTO Microorganismo

Indicador Etanólico Etéreo Acuoso

En Acetato de etilo

Gram positivos Staphylococcus

aureus +++ + ++ ++

Gram negativos Salmonella typhi ++ + + +

Pseudomonas aeruginosa + + + +

Hongos filamentosos Aspergillus niger + + + +

Mucor sp. + + + + Fusarium

oxysporum + + + +

Levadura

Drimys granadensis Poligodial

Candida albicans.

+ +++ + +

Adaptado de Garzón y Quintero, (1996). identificación de la sustancias Responsables de la Actividad Antimicrobiana de Drimys granadensis. +++: Óptima efectividad. ++: Mediana efectividad. +: Baja efectividad. Tabla 4. Resultados obtenidos después de la evaluación de actividad antimicrobiana determinando la concentración mínima inhibitoria (CMI) de anetol aislado a partir de extractos alcohólicos de anís estrellado (Illicium verum) y un patrón de acetol de Merck®.

EXTRACTO VEGETAL DE

COMPONENTE ACTIVO

CMI (g/ml) Microorganismo

Indicador Anetol aislado

Anetol patrón de Merck®

Staphylococcus aureus

20 20

Escherichia coli 9 10

Extracto alcohólico de anís estrellado (Illicium verum)

Anetol (1-metoxi-4-(1-

propenil)-benceno) Saccharomyces

cerevisiae 18 20

El patrón de Merck® de anetol indicó su pureza, demostrando gran actividad antimicrobiana comparable con el anetol aislado directamente de la planta.

Adaptado de Mukhopadhyay et al., (2001). Actividad antimicrobiana de Illicium verum.

35

Tabla 5. Resultados obtenidos después de la evaluación de actividad antimicrobiana de amplio espectro de los extractos combinados de canela y cebollin chino con diversos tratamientos.

EXTRACTO VEGETAL DE

COMBINACIÓN ÓPTIMA Microorganismo

Indicador

TRATAMIENTOS QUE REFORZARON LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE AMPLIO

ESPECTRO

Bacillus subtilis Escherichia coli

Flavobacterium sp. Tratamiento térmico

Listeria monocytogenes Pseudomonas

aeruginosa Salmonella

typhimurium Staphylococcus

aureus

Modificación de pH llevándolo a valores bajos, ácidos

Vibrio parahaemoliticus, Aspergillus flavus

Extracto combinado de

canela y cebollin chino

8:1 v/v

Aspergilus niger.

Adición de conservantes para alimentos, excepto el ácido cítrico que afectó su desempeño

Se determinó la capacidad antimicrobiana en pan dulce, jugo de guayaba y en té negro y verde, concluyendo que la combinación puede ser incorporada como conservante en productos alimenticios

Adaptado de Hsieh et al., (2001). Antimicrobial effect of various combinations of plant extracts. Tabla 6. Resultados obtenidos después del estudio comparativo y sinérgico entre varias especias y Bifidobacterium longum contra el crecimiento de E. coli O157:H7 en la carne molida.

MATRIZ DE PRUEBA

Microorganismo Indicador La dosis para cada muestra de carne fue de 2% (p/v).

Especias

Orégano,

Pimientos jalapeños Jengibre Ajo

+++ Redujo hasta 2 Log

UFC ++ - +

Especias y Bifidobacterium longum La mejor combinación resultante fue la de orégano y Bifidobacterium

longum ya que en combinación redujeron hasta 5 log. Bifidobacterium longum

Carne molida E. coli O157:H7

Se inocularon 2 log UFC/ml

Redujo hasta 2 log UFC. Adaptado de Ibrahim et al., (2004). Antimicrobial Activity of Bifidobacterium longum (NCFB 2259) as Influenced by Spices. +++: Óptima efectividad. ++: Mediana efectividad. +: Baja efectividad. -: No mostraron ninguna actividad.

36

Tabla 7. Resultados obtenidos después de la evaluación de actividad antimicrobiana de aceites esenciales obtenidos a partir de canela, clavo de olor, limonaria, mostaza, naranja, salvia, tomillo y romero contra los hongos presentes en el pan de centeno: P. roqueforti, P. corilofilum, A. flavus. MATRIZ DE

PRUEBA Microorganismo

Indicador METODOS DE EVALUACIÓN

MÉTODO 1: Agar de pan de centeno complementado con aceite esencial de 250 ul y 100 ul

Can

ela

Cla

vo d

e o

lor

Lim

on

aria

Mo

staz

a

Nar

anja

Salv

ia

Tom

illo

Rom

ero

++ ++ - - + + +++ +

MÉTODO 2. Pan de centeno contaminado por los hongos al efecto directo de los aceites volátiles en cámara con aire

Can

ela

Cla

vo d

e o

lor

Lim

on

aria

Mo

staz

a

Nar

anja

Salv

ia

Tom

illo

Rom

ero

Pan de centeno

P. roqueforti, P. corilofilum, A.

flavus,

++ ++ +++ +++ + + + +

Adaptado de Suhr y Nielsen, (2003). Antifungal activity of essential oils evaluated by two different application techniques against rye bread spoilage fungi. +++: Óptima efectividad. ++: Mediana efectividad. +: Baja efectividad. -: No mostraron ninguna actividad.

2.5. TRABAJOS ESPECÍFICOS CON Caléndula officinalis Y Tropaeolum majus Venikar y Jangle evaluaron en1992 extractos acuosos y etanólicos de las hojas y flores de Caléndula officinalis por el método de difusión para ver su capacidad antimicrobiana contra S. aureus y E. coli. Cuatro extractos obtenidos en total (hojas en agua, hojas en etanol, flores en agua y flores en etanol) se probaron contra las bacterias. Cada disco de papel fue impregnado con 60 μg de extracto y puesto en contacto con los microorganismos por 24 horas a 37 °C. Se concluyó que los extractos acuosos y etanólicos obtenidos a partir de las hojas no tuvieron efecto significativo contra S. aureus. Sin embargo, los extractos acuosos y etanólicos de las

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flores tuvieron efectos significativos contra la misma cepa comparándolo con el blanco (etanol). Por otro lado, todos los extractos tuvieron un efecto significativo contra E. coli, se observó que las flores tienen mayor actividad que las hojas, específicamente más efectivas sobre bacterias Gram negativas. Se reporta el poder antimicrobiano posiblemente a la presencia de saponinas, flavonoides y aceites esenciales. También se evaluó la actividad antifúngica de cuatro extractos a partir de flores de Caléndula officinalis, a partir de éter de petróleo (60-80 %), cloroformo, acetona y etanol de 95%. Los cuatro extractos mostraron efectos inhibitorios contra Aspergillus niger, Rhizopus japonicu, Candida albicans, Candida tropicallis y Rhodotorula glutinis, permitiendo comparar su efecto con las magnitudes obtenidas por las sustancias inhibitorias patrón. No se conoce con seguridad la o las sustancias implicadas en la actividad pero se presume por estudios preliminares que su principio activo se deba a los glicósidos, los esteroles o los flavonoides (Kasiram y Sakharkar, 2000). En la evaluación preliminar de un extracto acuoso de Caléndula officinalis se comprobó analíticamente el contenido de los compuestos que reporta la literatura, obteniendo la siguiente tabla de determinaciones (Aguila et al., 2000). Tabla 8. Determinaciones analíticas del contenido del extracto acuoso de Caléndula officinalis.

Tipo de ensayo Resultados Descripción Liquido ámbar oscuro de olor a flores Sólidos totales (%) 3,495 pH 5,4 Saponinas Presenta Polisacáridos Presenta Flavonoides Presenta Aminoácidos Presenta Taninos Presenta Adaptado de Águila et al., (2000). Extracto acuoso de Caléndula officinalis. Estudio preliminar de sus propiedades. Se ha analizado en la literatura que la Caléndula officinalis se destaca en dos aspectos: químicos y farmacológicos. Lastra y Piquet (1999) aseguraron que “ni la fecha de plantación, ni el tipo de secado; ya sea solar o por aire; inciden en la presencia de los metabolitos reportados para la especie”. Sin embargo, Olaya y Méndez (2003) insisten en que el tipo de secado es de gran importancia para preservar los principios activos, además que el almacenamiento debe ser en bolsas de papel o polietileno. Es importante que en los procesos extractivos no se lleven a cabo tratamientos a temperaturas mayores a 100°C ya que tiende a reducirse la cantidad de sustancias activas (Lastra y Piquet, 1999). Respecto a la farmacología, el uso de la Caléndula officinalis en la medicina tradicional se ha planteado en

38

decocciones de las flores (Carreño, 2000) para el tratamiento de heridas, por sus propiedades cicatrizantes, antiinflamatorias, antibacterianas y tranquilizantes, lo cual hace de ésta una materia prima natural de interés para la industria farmacéutica. Algunos estudios experimentales plantean que los extractos etanólicos al 80% muestran actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus y S. fecalis (Dumenil, 1980). El primer reporte de su uso en cosmetología ocurrió en 1977, cuando los extractos vegetales empezaron a aparecer en productos como cremas, emulsiones, champúes, lociones de baño, cremas dentales, entre otros (Lastra y Piquet, 1999). Sin embargo, la información sobre la obtención de extractos de plantas para el uso en cosmetología es muy escasa y la que se encuentra disponible es muy pobre en su profundización. En relación con esto Avramova (1988), plantea la obtención de extractos de Calendula con éter de petróleo, alcohol y propilenglicol, dando ciertas condiciones de preparación y afirmando que los principios activos son los carotenoides y flavonoides. Además, demostró que dichos extractos no mostraron propiedades carcinogénicas, ni toxicidad crónica en un período de 18 meses. Coello (1999) plantea el uso de las flores de Calendula en el tratamiento del acné y resalta las propiedades antisépticas de su aceite esencial. De la bibliografía consultada se concluye que las flores de Caléndula officinalis presentan un amplio espectro debido a los compuestos presentes en ellas; entre los más investigados dado su interés farmacológico están los carotenoides y los flavonoides. Entre los carotenoides identificados se encuentran: caroteno, violaxantina, rubixantina, citroxantina, flavocromo, flavoxantina, galenina, luteína, licopeno, valentiaxantina, auroxantina, microxantina, epoxicaroteno, zeacaroteno, mutatoxantina y luteína (Lastra y Piquet, 1999). En relación con los flavonoides, los compuestos identificados son: isorhamnetina, rutinósido, isorhamnetina neohesperidósido, calendoflosido, calendoflavosido, calendoflavobiosido, narcisina, isoquercetina, quercetina, rutósido y kaempferol (Lastra y Piquet, 1999).

Otros compuestos de interés en las flores de Calendula son las saponinas y los triterpenos, de los cuales han sido identificados los siguientes: trihidroxi-ursaeno, ursadiol, heliantriol, loliolido, calendulósido (Lastra y Piquet, 1999).

También se reporta la presencia de ácidos fenólicos de los cuales se pueden señalar los siguientes: coumárico, gentísico, vainíllico, caféico, siríngico, o-hidroxifenilacético, protocatequínico, ferúlico, p-hidroxibenzoico, salicílico, clorgénico, verátrico. También se encuentran presentes en la Caléndula los taninos (Aguila et al., 2000). Por otro lado, Tropaeolum majus, no reporta ningún estudio profundo, algunos estudios menores indican que contiene un glucotropaeolósido: isotiocinato de benzilo que se manifiesta como vasodilatador coronario. Además se ha usado como expectorante y antibiótico específico para E. coli y S. aureus. Posee

39

carotenoides, ácidos-fenoles y heterósidos flavonicos, quercetina en las hojas y kaempferol en las flores (Perry, 2004)

2.6. REGULACIÓN, SEGURIDAD Y ESTANDARIZACIÓN DE PRODUCTOS DE ORIGEN BOTÁNICO

La administración para drogas y alimentos, FDA, por sus siglas en inglés, Food and Drug Administration, define qué factores hay que tener en cuenta para la regulación, estandarización y seguridad de este tipo de productos.

2.6.1. Regulación

Los suplementos dietéticos están regulados bajo la Ley de educación y Salud de 1994 (DSHEA: Dietary Supplement Health and Education Act); esta ley enmendó el estatuto federal para alimentos, medicamentos y productos cosméticos y creó un marco regulador para la seguridad y rotulado de suplementos dietéticos en donde se incluyen vitaminas, minerales, productos botánicos, aminoácidos, enzimas específicas, concentrados, metabolitos, y extractos (Draughon, 2004). Los productos que se consideran suplementos alimenticios deben ser Reconocidos Generalmente como Seguros (GRAS: Generally Recognized as Safe). Bajo la DSHEA, un producto de origen botánico no puede ser considerado categóricamente como aditivo alimentario, por lo cual debe someterse a la distinción de GRAS como evidencia de seguridad, excepto sí ese ingrediente estuvo en el mercado antes del mes de octubre de 1994 (Draughon, 2004). El 30 de enero de 2001, la FDA lanzó un comunicado a los productores de alimentos donde se pronunció que la adición de nuevos ingredientes como agregados o extractos botánicos, los cuales no se hubieran usado previamente como ingredientes en alimentos, deben exponerlos a una aprobación de “premarket”; es decir, que el fabricante debe someterlos a prueba como categoría GRAS y así demostrar su seguridad para consumo ante la FDA (FDA, 1997). Las sustancias exentas de la definición como aditivo alimentario, y calificadas como seguras por los expertos, están exentas de la aprobación de “premarket” (FDA, 2003).

Suelen presentarse problemas por la interpretación que se da de las condiciones para el uso de especias y productos botánicos. Es decir, cuando estos últimos se utilizan como saborizantes o condimentos en niveles bajos o en “uso intencional” (Cantidad normalmente usada para el sabor), no se requiere de una pre-aprobación de uso, pero, cuando se utilizan como conservantes naturales, ya que se requieren niveles más altos de concentración que la normal, se activa el requisito para la sumisión de un GRAS (FDA, 2003).

40

“El axioma en toxicología: - la dosis hace el veneno -” (Draughon, 2004), define bien que sí una sustancia se consume seguramente en la dieta a bajos niveles puede ser insegura sí se consume a niveles más altos. Por consiguiente, un segundo requisito para la obtención de la calificación como GRAS de un producto botánico, es que los datos deben proporcionarse de la literatura o de otras fuentes que demuestren un consumo seguro de la sustancia a altos niveles en la dieta. Las causas más comunes para reprobar la calificación GRAS en la aprobación “premarket” de productos botánicos incluyen los siguientes (FDA, 2003b):

1. La no estimación de la exposición dietética al producto. 2. El no cumplimiento de las Buenas Prácticas de Manufactura. 3. La no existencia de características técnicas de calidad para describir al

alimento. 4. Los estudios clínicos citados sean para una preparación y especificaciones

diferentes del producto. 5. La adición del producto viola las normas de identidad del mismo. 6. Que los estudios presentados no estén publicados y disponibles para la

comunidad científica experta y por lo tanto no haya base para determinar la calidad de GRAS.

7. Que el producto no proporcione una historia sustancial de consumo del mismo como alimento.

8. Las referencias proporcionadas señalan que el consumo del producto debe ser ocasional.

9. Los ingredientes activos en el producto mostraron ser mutagénicos y carcinogénicos al nivel de su concentración en el producto.

La FDA ha tomado una firme posición frente al uso de aditivos alimentarios a partir de plantas y ha emitido varias reglamentaciones para ayudar a las industrias de alimentos y cosméticas a producir apropiadamente sus productos. Por ello cualquier alimento que contenga un ingrediente botánico que no sea GRAS causará al producto adulteración y el alimento no podrá ser importado legalmente o comercializado en los Estados Unidos. El marcado interés del uso de ingredientes botánicos como bioconservantes ha ido incrementándose en EE.UU., por ello las ventas de los productos botánicos como suplementos nutricionales disminuyó hasta el 13% en 2003 al igual que en algunos países europeos como Alemania (Blumenthal, 2003).

Las razones para tal disminución en ventas son varias, pero la más importante es que el consumo de estos productos botánicos específicos muestra datos contradictorios en su eficacia probada en ensayos clínicos.

41

Como EE.UU. ha venido tomando una posición más estricta frente al uso de suplementos y aditivos alimentarios, la comunidad europea lo ha hecho bajo la Dirección de Suplementos Alimentarios de la Unión Europea, entidad que trasladó su legislatura nacional de los 15 países miembro a la de EE.UU. en el 2003; ésta ley afecta hoy en día aproximadamente a 5.000 productos presentes en los mercados europeos (Verkerk, 2003).

2.6.2. Estandarización

La importancia de la estandarización radica en el uso de los nombres científicos de las plantas, ya que al etiquetar un producto con el nombre común o el que culturalmente se conoce no se da uniformidad en los productos presentes en el mercado. El Código Internacional Botánico “Louis Code” (Greuter et al., 2000) es una guía útil de la nomenclatura de productos a partir de especies botánicas, éste código establece las reglas internacionales aceptadas que gobiernan la denominación científica de las plantas.

La estandarización del nombre común de cada planta se encuentra en “Las hierbas de Comercio” – “Herbs of commerce” (McGuffin et al., 2000). Esta referencia es citada específicamente por la FDA para los alimentos y cosméticos que contienen suplementos dietéticos a partir de especies vegetales (FDA, 2003). Los extractos botánicos normalmente contienen una cantidad definida de un compuesto particular. Un aspecto importante de la estandarización de los ingredientes botánicos es asegurar que la variación de lote a lote del compuesto esté dentro de los límites aceptables. Un extracto, en preparación seca, o el aceite esencial de una planta contienen centenares de otros químicos que pueden afectar la calidad y estandarización del extracto (Bisset, 1994). La falta de uniformidad en la composición de los ingredientes botánicos sucede ya que el componente en los productos botánicos no es afectado sólo por la variedad de la planta sino también por el origen geográfico, la parte de la planta que se usa, edad y las condiciones de crecimiento de la planta, el método de extracción y el método de secado, la preparación, empaque y almacenamiento. Dentro del estudio y uso de una planta debe incluirse la siguiente información: sitio de recolección, tipo de cultivo: silvestre o espontáneo, manejo y prácticas de secado, condiciones de almacenamiento y prácticas de desinfección (Draughon, 2004).

42

2.6.3. Seguridad

La mayoría de los conservantes botánicos que se han usado en alimentos no han representado ningún peligro en su consumo. Sin embargo, es casi imposible encontrar información toxicológica al respecto. Para calcular los niveles permitidos de un nuevo aditivo de alimentos se han definido dos niveles de estudio: Ingesta Diaria Aceptable (ADI) y Nivel de No Efecto (NOEL) (Draughon, 2004). Otro factor que puede afectar el uso de bioconservantes botánicos es la sensibilidad de cierto grupo de una población frente a compuestos o ingredientes aromáticos fuertes. La interacción de algunos conservantes botánicos con la prescripción de las medicaciones ha demostrado en varios casos sensibilidades importantes causando alergias. Aunque el manejo de estas excepciones puede ser similar al que se le da a los alimentos que producen las mismas reacciones, como es el caso del maní, ya que no todos los organismos humanos son iguales, existirá siempre una limitación de consumo (Draughon, 2004).

2.7. MICROORGANISMOS INDICADORES Los microorganismos indicadores, son organismos habitualmente asociados a la presencia de patógenos. En las pruebas de inhibición se utilizan para evaluar la capacidad inhibitoria de las sustancias antimicrobianas estudiadas. Para el caso que se estudia en éste proyecto, se utilizaron dos microorganismos indicadores: E. coli y S. aureus. Cada uno representa a un grupo de bacterias Gram negativas y Gram positivas, respectivamente, con el fin de evaluar el efecto inhibitorio de las sustancias antimicrobianas obtenidas, ante microorganismos con paredes celulares estructuralmente distintas. Las bacterias Gram negativas presentan 10% de peptidoglicano en la pared celular, poseen una capa adicional que está compuesta de lipopolisacáridos. Esta capa representa de hecho una segunda bicapa lipídica, que contienen además polisacáridos y proteínas (Madigan et al., 2001). Las bacterias Gram positivas presentan a menudo polisacáridos ácidos unidos a la pared celular denominados ácidos teicoicos, que incluye a toda la pared, membrana o polímeros capsulares que contienen glicerolfosfato o residuos de fosfato de ribitol. Estos polialcoholes están unidos por ésteres de fosfato, y generalmente se les unen otros azúcares y D-alanina. La carga negativa neta de la superficie celular es aportada por los ácidos teicoicos y puede servir para el trasiego de iones a través de la pared celular. Además presenta una capa de peptidoglicano que representa hasta el 90% de la pared y es la responsable de su rigidez (Madigan et al., 2001).

43

La levadura Saccharomyces cerevisiae se utilizó para observar el posible efecto antimicrobiano sobre un organismo Eucariota a diferencia de las dos especies anteriores que corresponden a Procariotas. Esta especie es un hongo unicelular y la mayoría son ascomicetos. Normalmente son células ovales o cilíndricas y la división es habitualmente por gemación. Las levaduras normalmente no desarrollan un micelio, sino que permanecen en estado unicelular durante todo el ciclo de crecimiento; sin embargo algunas pueden filamentar. Las células de levaduras son mucho mas grandes que las bacterianas y pueden distinguirse no solo por su tamaño sino por la presencia de elementos intracelulares tales como el núcleo (Madigan et al., 2001). Las levaduras normalmente prosperan en un hábitat con abundante azúcar, tales como frutas, flores e incluso las cortezas de árboles. Las levaduras más importantes desde el punto de vista comercial son las cepas cerveceras y panaderas de la especie Saccharomyces cerevisiae, que es el hongo mejor conocido por ser fácilmente manipulable y constituir un modelo excelente para el estudio de problemas importantes que conciernen a la biología de eucariotas (Madigan et al., 2001).

44

3. MATERIALES Y MÉTODOS

El trabajo experimental se llevó a cabo en tres fases:

3.1. FASE I: OBTENCIÓN DE EXTRACTOS

3.1.1. Material vegetal Se estudiaron las especies Caléndula officinalis (Figura 1) y Tropaeolum majus (Figura 2). Caléndula officinalis se adquirió en un supermercado local: Carulla, de la ciudad de Bogotá – Colombia. La planta se adquirió seca. Tropaeolum majus: Se recolectó en Bogotá – Colombia, Humedal de Torca, perteneciente a la localidad de Usaquén. Limita al oriente con la Compañía Nacional de Reforestación, al Sur con el Cementerio de la Paz, al Occidente con la Autopista Norte, Calle 205 y al Norte con la escuela de Fútbol Alejandro Brand (DAMA, 2006). Para la realización del experimento se emplearon las hojas, tallos y flores de cada una de las plantas. Para lograr una comparación y uniformidad entre las dos especies, Tropaeolum majus se llevó a secado en estufa por 15 horas a 50°C, temperatura que no pudiera afectar los principios activos de la planta (Olaya y Méndez, 2003), de esta manera las dos plantas se trabajaron secas.

Figura 1. Caléndula officinalis

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45

Figura 2. Tropaeolum majus

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3.1.2. Método de extracción

Las flores, ramas y hojas secas de las dos plantas mantenidas en bolsas de papel (Olaya y Méndez, 2003), se trituraron en un procesador de alimentos, con el fin de lograr mayor contacto de las partículas con el solvente (Naidu, 2000). El procedimiento de elaboración se muestra en la Figura 3. La preparación de los extractos se llevó a cabo teniendo como referencia las recomendaciones de elaboración de productos homeopáticos de las farmacopeas brasileña, alemana y francesa (Carreño, 2000) y las experiencias previas de preparaciones populares (Olaya y Méndez, 2003).

46

FIGURA 3. Obtención de los extractos vegetales.

5 g de planta seca y triturada.

Macerar con 100 ml. de solvente Para el extracto de aceite se utilizaron 25 ml

de solvente.

Agitar las muestras a 200 rpm durante 24 horas, a 25 °C y 50 °C.

Filtrar a vacío con filtro Whatman No. 2.

Concentrar en Rotoevaporador hasta un volumen de 20 ml, tanto el extracto

de Agua como el de Etanol.

Almacenar en tubos a 8 °C hasta su aplicación.

Los extractos elaborados se obtuvieron con tres solventes:

Agua potable Aceite vegetal, Aceite de cocina de girasol almacenado en la oscuridad a

21°C. Etanol al 95%, ya que experimentalmente a ésta concentración el etanol no

muestra resultados inhibitorios efectivos. Las temperaturas de extracción fueron:

25°C 50°C

Y el tiempo de extracción fue de 24 horas con frecuencia de agitación constante a 200 revoluciones por minuto (rpm). Los extractos acuosos y etanólicos se rotoevaporaron en Rotoevaporador Heidolph hasta obtener un volumen de 20 ml.

3.1.3. Diseño experimental Fase I El modelo experimental está basado en un diseño factorial 3x2 para cada experimento. Para cada especie vegetal o experimento, el primer factor se dio en tres niveles correspondientes a los solventes de extracción, etanol al 95%, agua y

47

aceite vegetal. El segundo factor se dividió en dos niveles, la temperatura de extracción, 25°C y 50°C. Cada tratamiento fue replicado cuatro veces. Las condiciones experimentales se observan en la Tabla 9 y en la Figura 4. Las muestras analizadas fueron 48 extracciones (24 extractos de cada planta). Tabla 9. Tabla de muestras obtenidas. Frecuencia de agitación: 200 rpm. Tiempo de extracción: 24 horas.

ESPECIES VEGETALES TEMPERATURA DE EXTRACCIÓN

Caléndula officinalis Tropaeolum majus Caléndula officinalis + Etanol al 95% Tropaeolum majus + Etanol al 95% Caléndula officinalis + Agua potable Tropaeolum majus + Agua potable 25°C Caléndula officinalis + Aceite vegetal Tropaeolum majus + Aceite vegetal Caléndula officinalis + Etanol al 95% Tropaeolum majus + Etanol al 95% Caléndula officinalis + Agua potable Tropaeolum majus + Agua potable 50°C Caléndula officinalis + Aceite vegetal Tropaeolum majus + Aceite vegetal

FIGURA 4. Diseño experimental de la Fase I: Obtención de extractos.

T1: 25°C T2: 50°C

S1 S2 S3

Calendula officinalis Tropaeolum majus

S1 S2 S3

T1T2T1 T2T1

S3: Aceite VegetalS1: Agua potable S2: Etanol al 95%

T2T1T2T1T2T1 T2

3.1.4. Cuantificación de los extractos

Después de los tratamientos descritos se obtuvieron tres concentraciones: 250 μg/ml, 125 μg/ml y 62.5 μg/ml, las cuales se calcularon así (Mukhopadhyay et al., 2003):

3.1.4.1. Maceración

5g. planta + 100ml. C2H5OH [ ] Extracto etanólico

5g. planta + 100ml. H2O [ ] Extracto acuoso

48

Pasadas las 24 horas de maceración, el rendimiento aproximado del etanol y el agua fue del 50%. Por lo tanto, la primera concentración obtenida para los extractos se calculó teniendo en cuenta que no se parte de una sustancia pura sino de la planta seca: PE = Peso de la planta seca.

V1 x [ ]1 = V2 x [ ]2

100 ml. Solvente x 5 g.PE = (100 ml. Solvente x 50 %) x [ ]2

100 ml. [ ]2 = 0.1 g.PE ml

3.1.4.2. Rotoevaporación Los extractos obtenidos se llevaron a rotoevaporación hasta un volumen de 20 ml. La concentración final de los extractos etanólicos y acuosos fue:

V1 x [ ]1 = V2 x [ ]2

50 ml. Solvente x 0.1 g.PE = 20 ml. Solvente x [ ]2

ml [ ]2 = 0.25 g.PE

ml [ ]2 = 250 μg.PE

ml Extracto de aceite

5g. planta + 100ml. Aceite vegetal [ ] Extracto oleoso Como el rendimiento del aceite fue casi del 100%, este no se llevó al rotoevaporador:

V1 x [ ]1 = V2 x [ ]2

20 ml. Solvente x 5 g.PE = 20 ml. Solvente x [ ]2

20 ml. [ ]2 = 0.25 g.PE

ml [ ]2 = 250 μg.PE

ml

49

De modo que la concentración de la que se parte para todos los extractos es de 250 μg/ml, las otras dos concentraciones, 125 μg/ml y 62.5 μg/ml, se lograron completando volúmenes con el solvente correspondiente (Mukhopadhyay et al., 2003).

3.2. FASE II: EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA Y DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD BACTERICIDA O BACTERIOSTÁTICA Y FUNGICIDA DE LOS EXTRACTOS

3.2.1. Microorganismos Indicadores Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Saccharomyces cerevisiae

Los microorganismos se seleccionaron teniendo en cuenta su representatividad en ensayos de susceptibilidad a antibióticos, su importancia en áreas clínicas, cosméticas y alimentarias y, la representación de grupos de microorganismos como son las bacterias: Gram positivas y Gram negativas y las levaduras. Características de los microorganismos empleados para la evaluación de la actividad antimicrobiana de los extractos de Caléndula officinalis y Tropaeolum majus.

MICROORGANISMO PROCEDENCIA CLASIFICACIÓN PATOLOGÍAS

Staphylococcus aureus ATCC 460716

Coco Gram positivo

Intoxicación alimentaria (Pascual, M. 199x)

Escherichia coli ATCC 25922

Bacilo Gram positivo

Intoxicación alimentaria (Pascual, M. 199x)

Saccharomyces cerevisiae FERMIVIN® No. 7013 INRA

Narbonne Gist-Brocades, Francia

Levadura Ninguna Conocida

Las bacterias y la levadura se mantuvieron en placas de Agar Muller - Hinton y placas de Agar Sabouraud – Dextrosa 2 %, respectivamente; ésto con el fin de garantizar el trabajo homogéneo con los microorganismos nombrados. A este cepario se le llamó cepas de mantenimiento y se conservaron a 4°C (Modificado de Garzón y Quintero, 1996).

3.2.2. Ensayo microbiológico

Para la preparación de los inóculos de Escherichia coli y Staphylococcus aureus, se trabajó con una concentración de 108 células bacterianas, tomadas al finalizar su fase logarítmica (Ver Figuras 5 y 6) mientras que Saccharomyces cerevisiae se trabajó con una concentración de 106 células, tomada también al finalizar la fase

50

logarítmica (Ver Figura 7). La razón por la cual se determinó aplicar los tratamientos de los diferentes extractos al finalizar la fase logarítmica del crecimiento de los microorganismos se debió al uso de los extractos como lo plantea Ceylan (2004) en su articulo “Antimicrobial Activity and Synergistic Effect of Cinnamon with Sodium benzoate or Potassium Sorbate in Controlling Escherichia coli O157:H7 in Apple Juice. Las figuras muestran la curva de crecimiento para cada una de las cepas de los microorganismos ensayados la cual sirvió para ubicar en qué lapso de tiempo alcanzaban su fase exponencial. Figura 5. Curva de crecimiento de Escherichia coli.

Curva de Crecimiento de Escherichia coli *

0

2

4

6

8

10

0 4 8 12 16 20 24 28 32

Tiempo (horas)

Log

(U

FC

/ml)

Fase Logarítmica

Fuente: Curvas de crecimiento y Turbidez elaboradas por Henao A.L. y Trujillo S. en los laboratorios de la Universidad de La Sabana..

51

Figura 6. Curva de crecimiento de Staphylococcus aureus.

Curva de Crecimiento de Staphylococcus aureus

0

2

4

6

8

10

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36

Tiempo (horas)

Log

(U

FC/m

l)

Fase Logarítmica

Fuente: Curvas de crecimiento y Turbidez elaboradas por Henao A.L. y Trujillo S. en los laboratorios de la Universidad de La Sabana.. Figura 7. Curva de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae.

Curva de crecimiento Saccaromyces cerevisiae *

4

4,5

5

5,5

6

6,5

7

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52

Tiempo (horas)

Log

(U

FC

/ml)

Fase Logarítmica

Fuente: Curvas de crecimiento y Turbidez elaboradas por Henao A.L. y Trujillo S. en los laboratorios de la Universidad de La Sabana. Luego, se elaboró una curva estándar de turbidez para cada microorganismo, Ver Figuras 8 y 9 para Escherichia coli y Staphylococcus aureus, respectivamente y

52

Figura 10 para Saccharomyces cerevisiae, bajo el principio de que la turbidez es proporcional a la cantidad de células.

La turbidez es la propiedad óptica que causa que los rayos de luz sean dispersados y absorbidos en lugar de ser transmitidos en línea recta a través de una muestra, por lo tanto, en una muestra de un cultivo microbiano, cada célula microbiana dispersará la luz, y a medida que estas células se multipliquen, más luz dispersará. La turbidez se expresa en NTU (Unidades de turbidez Nefelométricas). Las mediciones para construir y luego estandarizar las muestras se hicieron en un Turbidímetro Termo ELECTRON CORPORATION. AQUAfast II. Turbidity. Orion AQ2010. (λ = 875 nm).

Figura 8. Curva estándar de Turbidez para Escherichia coli

Fuente: Curvas de crecimiento y Turbidez elaboradas por Henao A.L. y Trujillo S. en los laboratorios de la Universidad de La Sabana.

TURBIDEZ VS UFC/ml Escherichia coli

1,9

4,3

12,7

81,1

y = 0,6915Ln(x) + 5,3382R2 = 0,95444,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

0 20 40 60 80 100

TURBIDEZ (NTU)

Log

(UFC

/ml)

Línea deexperimentación

Línea deexperimentación contendencia logarítmica

Cálculo de la turbidez para Escherichia coli correspondiente a 108 células bacterianas. Y – 5.3382

0.6915

X = e

8 – 5.3382

0.6915

X = e

53

3.8493

X = e X = 46.96 NTU Figura 9. Curva estándar de turbidez para Staphylococcus aureus


TURBIDEZ Vs UFC/mlStaphylococcus aureus

11

26,8


4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

5,5 10,5 15,5 20,5 25,5 30,5

TURBIDEZ (NTU)

Log

(UFC

/ml)


y = 1,0979Ln(x) + 4,2654R2 = 0,9955

Cálculo de la turbidez para Staphylococcus aureus correspondiente a 108 células bacterianas. Y – 4.2654

1.0979

X = e

8 – 4.2654

1.0979

X = e 3.4016

X = e

54

X = 30.01 NTU Figura 10. Curva estándar de turbidez para Saccharomyces cerevisiae


TURBIDEZ Vs UFC/ml Saccharomyces cerevisiae

2,416,0

27,385,0

y = 0,2566Ln(x) + 5,1614R2 = 0,96884

5

6

7

8

9

0 20 40 60 80 100

TURBIDEZ (NTU)

Log

(UFC

/ml)



Cálculo de la turbidez para Saccharomyces cerevisiae correspondiente a 106 células. Y – 5.1614

0.2566

X = e

6 – 5.1614

0.2566

X = e

3.2681

X = e X = 26.26 NTU El procedimiento descrito en la Figura 11 resume la manera como se preparó el inóculo, es el protocolo de estandarización de cada microorganismo indicador para someterlo a la exposición de los extractos obtenidos en la Fase I..

55

FIGURA 11. Preparación del inóculo. CEPA DE MANTENIMIENTO

Realizar diluciones de los microorganismos con el caldo de cultivo

correspondiente hasta ajustar la concentración de células de cada cepa

según lectura del turbidímetro.

Bacterias: 108 Levadura: 106

Sembrar por estrías en placas Muller – Hinton las bacterias y en Sabouraud –

Dextrosa 2% la levadura.

Incubar a 37°C por 24 horas las bacterias y a 25°C por 48 horas la levadura.

Tomar una colonia y resembrar en 10 ml de caldo Muller – Hinton ó Sabouraud –

Dextrosa 2% según corresponda.

Incubar a 37°C las bacterias y a 25°C la levadura por el tiempo que indique la curva

hasta alcanzar su fase logarítmica.

Resembrar 1 ml en 10 ml de caldo Muller – Hinton ó Sabouraud – Dextrosa 2% según

corresponda.

Incubar a 37°C por 24 horas las bacterias y a 25°C por 24 horas la levadura.

3.2.3. Diseño experimental Fase II

Para cada experimento obtenido de cada extracto preparado se evaluó su capacidad antimicrobiana según diseño factorial 3x3, donde cada tratamiento se probó por triplicado. Ver Figura 12.

56

FIGURA 12. Diseño experimental de la Fase II: Evaluación de la actividad antimicrobiana y determinación de la capacidad bactericida o bacteriostática y fungicida o fungistática.

Z2

C1: 62,5 ug/ml C2: 125 ug/ml C3: 250 ug/ml

Z1 Z2 Z3 Z1

C2 C3

Calendula officinalis y/o Tropaeolum majus

Z1: Escherichia coli Z2: Staphylococcus aureus Z3: Saccharomyces cerevisiae

S1: Agua potable S2: Etanol al 95%

T1: 25°C T2: 50°C

T1 T2 T1 T2

C2C1 C1 C2

Z3Z3 Z1 Z2 Z3

S1 S2

Z1 Z2

C3 C3 C1 C2 C3 C1

3.2.4. Evaluación de la actividad antibacteriana y antifúngica Obtenidos los extractos se procedió a su evaluación antimicrobiana contra las dos bacterias, E. coli y S. aureus y contra la levadura, S. cerevisiae, por los métodos que se describen a continuación:

3.2.4.1. Método de difusión por disco Este método permitió determinar la sensibilidad de cada cepa a los antimicrobianos, ver Figura 13. Para evaluar la actividad antimicrobiana de los distintos extractos se obtuvieron discos de papel absorbente de 6 mm. de diámetro, se esterilizaron como todo material seco, a 200°C por una hora, y se impregnaron con los extractos a las tres concentraciones obtenidas: 250 μg/ml, 125 μg/ml, 62.5 μg/ml. Los medios de cultivo empleados fueron Muller – Hinton para bacterias y la sustancia patrón utilizada fue Sulfato de estreptomicina, usada en trabajos preliminares por su amplio espectro (Garzón y Quintero, 1996) a una concentración de 500 μg/ml. Para la levadura, el medio de cultivo utilizado fue Sabouraud – Dextrosa 2% y la sustancia patrón fue Nitrato de isoconazol, escogido

57

por su aplicación en trabajados preliminares contra levaduras del mismo tipo (Garzón y Quintero, 1996). En cada placa se inocularon por extensión 0.1 ml del microorganismo indicador y transcurridos 15 minutos se colocó un disco de cada concentración sobre la siembra. Este lapso de tiempo se consideró según recomendaciones del Comité Americano de Estandarización de Laboratorios Clínicos (NCCLS, 1996). Luego, se procedió a la incubación de las placas dentro de los 15 minutos posteriores a la colocación de los discos, las bacterias a 37°C por 24 horas y la levadura a 25°C por 48 horas. Cabe resaltar que la variación de los tiempos anteriormente nombrados puede ocasionar un desplazamiento de los resultados traduciéndose en errores en el tamaño de la zona de inhibición; también se tuvo en cuenta que la difusión del disco comienza instantáneamente después de apoyado sobre el agar, por lo tanto estos nunca deben levantarse para cambiarlos de lugar pues el disco ya no tendrá la carga antimicrobiana original y el resultado del antibiograma de desviará (Pasterán et al., 2003). Pasado el tiempo de incubación se tomó la medida en milímetros, por medio de regleta milimetrada, del halo formado alrededor del disco, dependiendo de su medida se logró determinar el nivel de sensibilidad del microorganismo frente al extracto. Para aquellos halos en los que el diámetro no se formó homogéneamente se promediaron los diámetros mínimos y máximos del halo de cada disco.

58

Figura 13. Evaluación antimicrobiana por el Método de difusión por disco.

Tubos con 20 ml del Agar correspondiente a cada cepa. Mantenido a 45 ±

2°C.

Muestras de extractos a diferentes concentraciones, blanco y sustancia patrón.

Verter en cajas de Petri estériles de 9 cm de

diámetro.

Inocular por extensión 0,1 ml del microorganismo.

Impregnar los discos de papel (φ=6 mm) con cada muestra durante 15 min.

Dejar solidificar

Realizar lecturas a las 24 horas para las bacterias y 48 horas para la levadura.

Homogenizar la dilución indicada del

microorganismo correspondiente.

Esperar 15 minutos a temperatura ambiente

Colocar sobre la superficie del agar.

Esperar 15 minutos a temperatura ambiente

Incubar a 37°C o 25°C.

3.2.5. Determinación de la actividad bactericida o bacteriostática y fungicida o fungistática

3.2.5.1. Método del tubo pequeño Este método permitió medir la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de los extractos. Los tubos empleados fueron viales de 5 cm de altura por 2 cm de diámetro en la base. A cada tubo con 2 ml de agar Muller – Hinton para bacterias ó agar Sabouraud – Dextrosa 2% para la levadura, se añadieron 2 ml de extracto a evaluar, según las concentraciones ya nombradas. Para realizar este procedimiento se mantuvo el agar a baño de María entre 45 ± 5°C para evitar su solidificación en el momento de preparar las muestras (Mukhopadhyay et al., 2003). Después de solidificado el medio, fueron inoculados 50 μl del microorganismo a ensayar. El procedimiento se ve en la Figura 14. El método se llevó a cabo para cada réplica en sus tres concentraciones por triplicado. A aquellos tubos con la mínima concentración de sustancia donde no se detectó crecimiento, se les realizó un raspado superficial con asa estéril para luego

59

inocular en placa de agar Muller – Hinton ó agar Sabouraud – Dextrosa 2%, según el microorganismo. Estas placas se incubaron por 24 horas a 37°C para las bacterias y 48 horas a 25°C para la levadura, pasado el tiempo mínimo de incubación se procedió a observar si se presentaba crecimiento o no del microorganismo en la superficie de la placa; de esta manera se determinó la actividad bactericida y/o fungicida de los extractos que no generaron nuevo crecimiento del microorganismo y la actividad bacteriostática y/o fungistática para aquellos sí permitieron el crecimiento del microorganismo. Figura 14. Evaluación de la actividad antimicrobiana por el Método del tubo pequeño.

Viales con 2 ml del Agar correspondiente

mantenido a 50 ± 5°C.

Muestras de extractos a diferentes concentraciones, blanco y sustancia patrón.

Homogeneizar la mezcla en Vortex.

Homogeneizar la dilución indicada del

microorganismo.

Añadir 50 µl y distribuir homogéneamente sobre

la superficie.

Agregar 2 ml al agar fundido

Dejar solidificar

Incubar a 37°C o 25°C

Realizar lecturas a las 24 horas para las bacterias y 48

horas para la levadura.

3.3. FASE III: APLICACIÓN DE LOS EXTRACTOS EN SISTEMAS IN VIVO

3.3.1. Materiales de ensayo

Pulpa de fruta: Guanábana La pulpa de Guanábana marca SAS, en presentación de 230 g. se obtuvo en el supermercado local Carulla. La pulpa 100% natural, libre de conservantes, se mantuvo refrigerada a 8°C.

60

Jabón – gel Se obtuvo el gel base de preparación de jabón en laboratorio químico local. Al gel se le realizaron pruebas preliminares de sensibilidad sobre los microorganismos de ensayo y reveló una inhibición de crecimiento microbiano, por lo tanto se decidió utilizar el extracto diluido en agua en un porcentaje de 50% agua - 50% extracto, para demostrar directamente su actividad.

3.3.2. Métodos de aplicación Para explorar el comportamiento de los extractos en matrices alimentarias y no alimentarias se realizó la aplicación de los extractos así:

3.3.2.1. Aplicación de los extractos acuosos como conservantes naturales en pulpa de frutas

La muestra de pulpa inicial se dividió en dos, cada una de ellas correspondiente a un volumen de 500 ml, al cual se inocularon 12.5 ml de E. coli y 12.5 ml S. aureus; esta cantidad replica el porcentaje de microorganismo indicador que se inoculó en la fase II, el cual hace referencia al 2.5% de microorganismo respecto del volumen de la pulpa. A la pulpa contaminada con E.coli se añadieron 250 ml del extracto acuoso de Caléndula officinalis rotoevaporado con una concentración de 250 μg de PEq/ml de la planta y a la pulpa contaminada con S. aureus, se añadieron 250 ml del extracto acuoso de Tropaeolum majus también rotoevaporado y con una concentración de 250 μg de PEq/ml de la planta. Luego, se porcionaron muestras de pulpa de 20 ml cada una, se refrigeraron a 8°C durante 8 días, cada día se realizó siembra en placa de agar de conteo (PCA), incluyendo la muestra blanco (Pulpa contaminada sin extracto).

3.3.2.2. Aplicación de los extractos etanólicos en jabón - gel antibacterial para uso sin enjuague

Para determinar el efecto de la solución de agua-extracto etanólico sobre un sistema in vivo se realizaron frotis de manos de 2 individuos, haciendo colocar sus manos después de ejecutar actividades cotidianas sobre los siguientes medios selectivos: Agar Placa de Conteo (PCA) para identificar microorganismos en

61

general, Agar MacConkey (MC) para enterobacterias y Agar de papa dextrosa (PDA) para hongos y levaduras. Las actividades cotidianas de los dos individuos fueron: a) Tomaron un baño completo. b) Ingirieron su desayuno y posteriormente lavaron sus manos con jabón de tocador. c) Tomaron un bus de transporte público. d) Arribaron al laboratorio de microbiología para someterse al frotis anteriormente mencionado. A los individuos que se analizaron se les aplicó la loción sobre las manos y sin enjuagar se realizó posteriormente un nuevo frotis, con el fin de comparar la reducción en el número de microorganismos identificados previamente.

62

4. RESULTADOS Y ANÁLISIS

4.1. FASE I: OBTENCIÓN DE EXTRACTOS Para cada extracto, a partir de 5 g de material seco y triturado de cada planta y de 100 ml de solvente puro se obtuvo aproximadamente el 50% de rendimiento. Luego, al concentrar en un Rotoevaporador Heidolph se obtuvieron 20 ml de cada extracto, de concentración calculada 250 μg/ml. A los extractos obtenidos se les determinó el valor de pH, medidas que se resumen en la Tabla 10. El agua se eligió como solvente teniendo en cuenta que es un solvente puro y de baja reactividad (Ghisalberti, 1993). El etanol al 95% es un solvente ideal para extraer gran cantidad de sustancias naturales antimicrobianas solubles en solventes orgánicos (William y Harborne, 1989), (Kyung et al., 1997), (Shofran et al., 1998). A pesar de que la utilización del metanol se recomienda para la extracción de fitoantimicrobianos, este procedimiento tiene como desventaja que las saponinas pueden llegar a degradarse, más aún sí se utiliza una solución de metanol caliente (Massiot et al., 1996). Por último, el aceite se eligió para la obtención de sustancias lipofílicas que pudieran presentar actividad antimicrobiana (Naidu, 2000), como es el caso de los flavonoides y algunos aceites esenciales (Harborne, 1983). Otra razón para escoger el etanol como solvente de extracción fue el planteamiento de Hirasa & Takemasa (1998), quienes aseguraron que a pesar de que las especias son comercializadas frescas o secas, a las secas se les deben extraer los componentes activos con solventes como el etanol ya que al utilizar solventes puros se logra arrastrar la mayor cantidad de componentes antimicrobianos (Ghisalberti, 1993). Para el desarrollo de esta fase se escogieron solventes de baja reactividad (Ghisalberti, 1993) y los solventes se obtuvieron en condiciones de extracción moderadas con el fin de evitar una posible inactivación de las sustancias antimicrobianas.

63

Tabla 10. pH de extractos vegetales de Caléndula officinalis y Tropaeolum majus.

EXTRACTOS VEGETALES pH Caléndula officinalis

Caléndula officinalis + Etanol al 95 % 4.0 Caléndula officinalis + Agua potable 5.5 Caléndula officinalis + Aceite vegetal 3.5 Caléndula officinalis + Etanol al 95 % 4.0 Caléndula officinalis + Agua potable 5.5 Caléndula officinalis + Aceite vegetal

3.5

Tropaeolum majus Tropaeolum majus + Etanol al 95 % 4.5 Tropaeolum majus + Agua potable 6.0 Tropaeolum majus + Aceite vegetal 3.5 Tropaeolum majus + Etanol al 95 % 4.5 Tropaeolum majus + Agua potable 6.0

Tropaeolum majus + Aceite vegetal 3.5 Un análisis previo de estos resultados indicaron teóricamente que los extractos que tendrían un mayor efecto inhibitorio sobre los microorganismos de ensayo serían aquellos con pH más ácido, en este caso los que se obtuvieron con aceite vegetal, los cuales se valoraron en pH de 3.5. Sin embargo, en la segunda fase de los ensayos preliminares de la investigación se observó que estos extractos no inhibieron crecimiento microbiano, una explicación a este resultado es el hecho de que el aceite formó micelas, y estas encapsularon a las sustancias activas de las plantas, dejando a los extractos acuosos y etanólicos como los solventes que participaron en la ejecución de la Fase II y Fase III. No se planteó la neutralización de los extractos con el fin de conferir atributos sinérgicos entre los solventes, los fito-antimicrobianos y sus respectivas características fisicoquímicas (Garzón y Quintero, 1996). En el Anexo 1 se observa el análisis de inhibición inicial de cada uno de los extractos frente a los tres microorganismos indicadores.

4.2. FASE II: EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA Y DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD BACTERICIDA O BACTERIOSTÁTICA Y FUNGICIDA O FUNGISTÁTICA

4.2.1. Evaluación de la actividad antibacteriana y antifúngica

4.2.1.1. Método de difusión por disco

64

Este método permitió determinar la sensibilidad de los extractos contra los microorganismos indicadores: E. coli, S. aureus y S. cerevisiae. La actividad antimicrobiana de los distintos extractos se obtuvo mediante la medición de los diámetros formados sobre las placas de agar, resultado de la inhibición aparente de cada extracto. Para cada extracto se evaluaron tres concentraciones: 250 μg/ml, 125 μg/ml y 62.5 μg/ml. Los resultados de las mediciones de los diámetros de los halos de inhibición de esta evaluación se pueden observar en el Anexo 2 y en la Figura 15. Los extractos acuosos de Caléndula officinalis obtenidos a 25°C y los extractos acuosos de Tropaeolum majus obtenidos a 25°C, no presentaron actividad antimicrobiana, en ninguna de sus concentraciones, ya que alrededor de los discos no se evidenció ningún tipo de formación de halo, lo que permitió determinar que las sustancias activas presentes en estas plantas, que pudiesen inhibir crecimiento microbiano, fueron de difícil extracción a temperaturas medias con el agua como solvente. La presencia de fitofenoles puede darse en este tipo de extractos debido a la naturaleza de la Caléndula officinalis, por presentar en su composición una fracción de aceites esenciales, sin embargo, ya que ciertos componentes de éstas son hidrófobos puede que el método de difusión por disco no fuese el apropiado para evaluar su actividad (Hammer et al., 1999), además, la temperatura de extracción, el pH y la coexistencia con otras sustancias como proteínas, lípidos y minerales puede afectar la actividad biológica de los fenoles. De los 29 tratamientos aplicados, de los cuales 24 son directamente la aplicación de los extractos sobre los microorganismos indicadores, la cepa que más fue afectada fue la levadura Saccharomyces cerevisiae. Sin embargo, los resultados obtenidos para las bacterias también mostraron resultados con diferencias significativas entre las variables planteadas desde la variación del solvente hasta la reducción de la concentración del soluto en el extracto, pasando por dos temperaturas, que sin ser extremas también determinaron diferencias significativas, según el ANOVA aplicado a los datos experimentales, Ver Anexo 3.

65

Figura 15. Comparación de Promedios de diámetros de halos de inhibición por cada tratamiento aplicado a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae.

Comparación de diámetros promedio de los halos de inhibición por tratamiento aplicado a cada microorganismo

0

5

10

15

20

25Tr

atam

ient

o 1

Trat

amie

nto

2

Trat

amie

nto

3

Trat

amie

nto

4

Trat

amie

nto

5

Trat

amie

nto

6

Trat

amie

nto

7

Trat

amie

nto

8

Trat

amie

nto

9

Trat

amie

nto

10

Trat

amie

nto

11

Trat

amie

nto

12

Trat

amie

nto

13

Trat

amie

nto

14

Trat

amie

nto

15

Trat

amie

nto

16

Trat

amie

nto

17

Trat

amie

nto

18

Trat

amie

nto

19

Trat

amie

nto

20

Trat

amie

nto

21

Trat

amie

nto

22

Trat

amie

nto

23

Trat

amie

nto

24

Trat

amie

nto

25

Trat

amie

nto

26

Trat

amie

nto

27

Trat

amie

nto

28

Trat

amie

nto

29

Tratamiento

Diá

met

ro d

e in

hibi

ción

(mm

)

E. coliS. aureusS. cerevisiae

TRAT SOLVENTE PLANTA T °C CONC mg/ml

1 Agua C. officinalis 25 2502 Agua C. officinalis 25 1253 Agua C. officinalis 25 62,54 Agua C. officinalis 50 2505 Agua C. officinalis 50 1256 Agua C. officinalis 50 62,57 Agua T. majus 25 2508 Agua T. majus 25 1259 Agua T. majus 25 62,5

10 Agua T. majus 50 25011 Agua T. majus 50 12512 Agua T. majus 50 62,513 Etanol C. officinalis 25 25014 Etanol C. officinalis 25 12515 Etanol C. officinalis 25 62,516 Etanol C. officinalis 50 25017 Etanol C. officinalis 50 12518 Etanol C. officinalis 50 62,519 Etanol T. majus 25 25020 Etanol T. majus 25 12521 Etanol T. majus 25 62,522 Etanol T. majus 50 25023 Etanol T. majus 50 12524 Etanol T. majus 50 62,525 Agua unica26 Etanol unica27 Patrón 50028 Patrón 25029 Patrón 125

La Figura 15 es una representación de los promedios de los diámetros de inhibición de crecimiento de las cepas, obtenidos en cada tratamiento. Los espacios en blanco hacen referencia a diámetros de valor cero milímetros, para el caso de los tratamientos con agua a 25°C para las dos plantas y para el blanco del agua como solvente.

66

Desde la Figura 16 hasta la Figura 20 se presentan las gráficas comparativas entre las variables: solventes, plantas y temperaturas del experimento en la fase I para determinar el extracto o extractos con mejores resultados según el método de difusión por disco. Figura 16. Comparación de promedios por solventes de extractos aplicados a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae.

Comparación de promedios por solventes de los extractos aplicados a cada microorganismo

0,000

2,000

4,000

6,000

8,000

10,000

12,000

14,000

Microorganismo

Diá

met

ro d

e in

hibi

ción

(mm

)

Agua mm 3,604 3,792 5,625

Etanol mm 11,854 11,583 12,042

E. coli S. aureus S. cerevisiae

En la Figura 16 se observan los resultados evaluados comparativamente por solvente, en donde se determinó que el etanol como solvente mostró resultados más significativos que los obtenidos con el agua y determinaron una diferencia significativa según ANOVA, ver Anexo 3, respecto a todos los tratamientos revisados individualmente. Específicamente, para S. cerevisiae los extractos acuosos y etanólicos muestran mayor poder antimicrobiano que para las bacterias.

67

Figura 17. Comparación de promedios por plantas de extractos aplicados a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae.

Comparación de promedios por plantas de los extractos aplicados a cada microorganismo

6,500

7,000

7,500

8,000

8,500

9,000

9,500

Microorganismo

Diá

met

ro d

e in

hibi

ción

(mm

)

Calendula officinalis (mm) 7,979 7,667 8,750

Tropaleoum majus (mm) 7,479 7,708 8,917


Los resultados de los promedios obtenidos comparados por planta, Figura 17, demostraron que para E. coli los tratamientos con C. officinalis y T. majus tienen diferencias significativas entre sí según ANOVA, ver Anexo 3; siendo la Caléndula más efectiva sobre esta bacteria, posiblemente debido a la presencia de saponinas. Para S. aureus y S. cerevisiae la comparación de los tratamientos sólo teniendo en cuenta la planta permite concluir que no hay diferencia significativa en los resultados obtenidos entre Caléndula y Capuchina, esto mismo puede observarse en la Figura 17 al comparar que los valores promedio de los diámetros de halos formados no se alejan entre una planta y otra.

68

Figura 18. Comparación de promedios de la interacción entre solvente y planta de extractos aplicados a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae.

Comparación de promedios de la interacción entre solvente y planta de extractos aplicados a cada microorganismo

0,000

2,000

4,000

6,000

8,000

10,000

12,000

14,000

Microorganismo

Diá

met

ro d

e in

hibi

ción

(mm

)

Agua - Calendula officinalis (mm) 4,375 3,875 5,833

Agua - Tropaleoum majus (mm) 2,833 3,708 5,417

Etanol - Calendula officinalis (mm) 11,583 11,458 11,667

Etanol - Tropaleoum majus (mm) 12,125 11,708 12,417


La interacción entre el solvente y la planta en cada extracto reveló que los extractos etanólicos, como previamente se evidenció en la comparación de solventes, logró obtener mayores diámetros de inhibición frente a todos los microorganismos indicadores, sin embargo, los extractos acuosos de C. officinalis comparados con los extractos acuosos de T. majus lograron diámetros de inhibición mayores tanto en la bacterias como en la levadura, siendo más efectivo sobre S. cerevisiae. Por otro lado, como se observó en la Figura 18, los extractos etanólicos de T. majus fueron más efectivos, sobre los tres microorganismos que los obtenidos con este mismo solvente a partir de C. officinalis. Sin embargo, ésta diferencia entre los diámetros de inhibición obtenidos para cada juego de solvente y extracto vegetal evaluados sobre cada microorganismo, no revela diferencias significativas ni para S. aureus, ni para S. cerevisiae, mientras que la sinergia entre solvente y extracto vegetal frente a E. coli sí presenta diferencias significativas en sus resultados según ANOVA, ver Anexo 3.

69

Figura 19. Comparación de promedios de la interacción entre temperatura y planta de extractos aplicados a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae.

Comparación de promedios de la interacción entre temperatura y planta de extractos aplicados a cada microorganismo

0,000

2,000

4,000

6,000

8,000

10,000

12,000

14,000

Microorganismo

Diá

met

ro d

e in

hibi

ción

(mm

)

25 °C - Calendula officinalis (mm) 5,083 4,917 5,792

25 °C - Tropaleoum majus (mm) 5,958 6,000 5,833

50 °C - Calendula officinalis (mm) 10,875 10,417 11,708

50 °C - Tropaleoum majus (mm) 9,000 9,417 12,000


En la Figura 19 se observa que los extractos obtenidos a 25°C a partir de T. majus lograron inhibir crecimiento microbiano en mayor proporción que los obtenidos bajo las mismas condiciones a partir de C. officinalis. Aquellos extractos obtenidos incrementando la temperatura hasta 50°C, resaltando los que se obtuvieron a partir de C. officinalis, revelaron mejores y mayores diámetros de inhibición, esta actividad pudo deberse al incremento de la temperatura, la cual permitió la extracción de fracciones de aceites esenciales, representados por los terpenos y la obtención de compuestos fenólicos que al reaccionar con las proteínas de la membrana citoplasmática de los microorganismos causa un cambio en su permeabilidad, produciendo la fuga de solutos (Juven et al., 1994). Es importante aclarar que tanto para E.coli como para S. aureus los resultados de las comparaciones entre tratamientos en cuanto a la interacción entre planta y temperatura tienen diferencias significativas según ANOVA, ver Anexo 3, mientras que para S. cerevisiae no la existen tales diferencias.

70

Figura 20. Comparación de promedios de la interacción entre temperatura, planta y solvente de extractos aplicados a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae.

Comparación de promedios de la interacción entre temperatura, planta y solvente de extractos aplicados a cada microorganismo

0,000

2,000

4,000

6,000

8,000

10,000

12,000

14,000

Microorganismo

Diá

met

ro d

e in

hibi

ción

(mm

)

25 °C - Calendula off icinalis - Agua (mm) 0,000 0,000 0,000

25 °C - Tropaleoum majus - Agua (mm) 0,000 0,000 0,000

50 °C - Calendula off icinalis - Agua (mm) 8,750 7,750 11,667

50 °C - Tropaleoum majus - Agua (mm) 5,667 7,417 10,833

25 °C - Calendula off icinalis - Etanol (mm) 10,167 9,833 11,583

25 °C - Tropaleoum majus - Etanol (mm) 11,917 12,000 11,667

50 °C - Calendula off icinalis - Etanol (mm) 13,000 13,083 11,750

50 °C - Tropaleoum majus - Etanol (mm) 12,333 11,417 13,167


Al analizar en la Figura 20 la interacción de todas las variables se observa que la actividad del extracto etanólico de T. majus obtenido a 50°C se destacó obteniendo sobre S. cerevisiae el mayor diámetro de inhibición, debido probablemente a la presencia de ácidos fenólicos, carotenoides y flavonoides dentro de este extracto (Perry, 2004). Para E. coli el extracto de mayor actividad fue el de C. officinalis en etanol obtenido a 50°C. El mecanismo de acción de la actividad antimicrobiana de los bioconservantes no se entiende totalmente. Sin embargo, se piensa que los terpenoides y fenoles poseen acción inhibitoria contra microorganismos ya que causan la ruptura de la membrana (Cichewicz y Thorpe, 1996); (Lambert et al., 2001). Los fenoles simples y flavonoides parecen inhibir el crecimiento ligando el bioquímico esencial al metabolismo. Se piensa que las cumarinas y alcaloides pueden inhibir el crecimiento de microorganismos a nivel genético (Hoult y Paya, 1996); (Rahman y Choudhary, 1995). Para S. aureus el mayor diámetro de inhibición lo tuvo también el extracto de C. officinalis obtenido a 50°C en etanol, seguido por el extracto de T. majus obtenido a 25°C en etanol, cabe resaltar que se esperaba tener resultados significativos con el extracto etanólico de T. majus obtenido a 50°C, sin embargo a esta temperatura y con este solvente los componentes responsables de la actividad antimicrobiana de Tropaleoum se presume que se inactivaron .

71

Los diámetros obtenidos para cada uno de los extractos en las tres concentraciones se observan a continuación en las fotografías resultantes de la aplicación del método de difusión por disco, desde la Figura 21 hasta la Figura 32. Figura 21. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de E. coli, obtenidos a partir de un extracto de Caléndula officinalis en Agua a una temperatura de 50°C.

Figura 22. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de E. coli, obtenidos a partir de un extracto de Caléndula officinalis en Etanol al 95% a una temperatura de 50°C.

72

Figura 23. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de S. aureus, obtenidos a partir de un extracto de Caléndula officinalis en Agua a una temperatura de 50°C.

Figura 24. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de S. aureus, obtenidos a partir de un extracto de Caléndula officinalis en Etanol al 95% a una temperatura de 50°C.

73

Figura 25. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de S. cerevisiae, obtenidos a partir de un extracto de Caléndula officinalis en Agua una temperatura de 50°C.

Figura 26. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de S. cerevisiae, obtenidos a partir de un extracto de Caléndula officinalis en Etanol al 95 % a una temperatura de 50°C.

74

Figura 27. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de E. coli, obtenidos a partir de un extracto de Tropaeolum majus en Agua a una temperatura de 50°C.

Figura 28. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de E. coli, obtenidos a partir de un extracto de Tropaeolum majus en Etanol al 95 % a una temperatura de 50°C.

75

Figura 29. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de S. aureus, obtenidos a partir de un extracto de Tropaeolum majus en Agua a una temperatura de 50°C.

Figura 30. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de S. aureus, obtenidos a partir de un extracto de Tropaeolum majus en Etanol al 95 % a una temperatura de 50°C.

76

Figura 31. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de S. cerevisiae, obtenidos a partir de un extracto de Tropaeolum majus en Agua a una temperatura de 50°C.

Figura 32. Fotografía de los diámetros de inhibición de crecimiento de S. aureus, obtenidos a partir de un extracto de Tropaeolum majus en Etanol al 95 % a una temperatura de 50°C.

77

78

Las sustancias activas de la Caléndula officinalis reportadas en la bibliografía comprenden aceites esenciales, mucílagos, glucósidos, xantofilas, saponinas, (Carreño, 2000). Las saponinas presentes en la caléndula, son compuestos que protegen a la planta del estrés biótico y promueven actividades antibacteriales y antifúngicas, demostrando su amplio espectro y postulándose como conservantes de alimentos (Naidu, 2000).

Las saponinas de la caléndula pudieron haber actuado sobre las bacterias por medio de la interacción con la membrana de esteroles. Las membranas que son bajas en colesterol no presentan sensibilidad a las saponinas (Tayeka, 1997), en este caso el microorganismo más sensible a las saponinas fue S. cerevisiae, y teniendo en cuenta que el extracto más efectivo fue el de Capuchina, esta planta podría tener mayor contenido de saponinas. Saccharomyces al pertenecer a los eucariota y presentar en su membrana citoplasmática esteroles, tales como el colesterol, la hace más rígida que los procariota. Esto permitió afirmar que las membranas plasmáticas de las bacterias, las cuales carecen de esteroles fueron menos sensibles a los extractos de Capuchina que a los de Caléndula. El grado de actividad de las saponinas depende de la estructura de la misma y el microorganismo objetivo (Masamitsu et al., 1998). La saponina más común y más efectiva encontrada hasta el momento contra las Gram positivas es la de la hiedra (Kiim et al., 1987). El efecto producido por las saponinas sobre las bacterias es la liberación de proteínas y enzimas de las bacterias (Zablotowicz et al., 1996). Y aunque su efecto no es específico, las saponinas actúan sobre la membrana de los microorganismos con las proteínas, esteroles y fosfolípidos causando una predisposición a ella. Las saponinas triterpenas y esferoidales comúnmente demuestran actividades antifúngicas (Gruiz, 1996). Venikar y Jangle (1992), evaluaron extractos acuosos y etanólicos de las hojas y flores de Caléndula officinalis contra S. aureus y E.coli concluyendo que los extractos acuosos y etanólicos obtenidos a partir de las hojas no tuvieron efectos significativos contra S. aureus, mientras que los extractos acuosos y etanólicos de las flores tuvieron efectos significativos contra la misma cepa. Por otro lado, todos los extractos tuvieron efectos significativos contra E. coli, definiendo una mayor actividad contra las bacterias Gram negativas. Kasiram y Sakharkar (2000), evaluaron la actividad antifúngica de un extracto de flores de caléndula a partir de éter de petróleo, cloroformo, acetona y etanol al 95%. Los cuatro extractos mostraron efectos inhibitorios contra: Aspergillus niger, Rhizopus, Candida albicans, Candida tropicales y Rhodotorula glutinis.

79

En cuanto a los flavonoides que se presentan en las flores, raíces y cortezas de color amarillo, característica que le permite a la planta protegerse de la radiación UV producida por el sol (Swain, 1979), también hicieron parte de los fitoanimicrobianos responsables de la inhibición causada por los extractos de las plantas obtenidos. Los flavonoides suceden como glicósidos y los más conocidos como antimicrobianos son la mircetina la quercetina y el kaempferol, estos últimos contenidos en Tropaleoum majus al igual que en Caléndula officinalis (Cheynier y Rigaud, 1986). Por la inestabilidad de los flavonoides y su posible degradación se tuvo en cuenta ser cuidadoso en el procesamiento de las plantas, pues la acción de las enzimas de la planta fresca causan la degradación, tanto en el secado de la planta, como en el almacenamiento se consideró controlar la temperatura por la presencia de taninos o antocianinas. La actividad enzimática pudo evitarse incluyendo alcohol como solvente de extracción (Naidu, 2000). Cabe aclarar que la determinación de las sustancias responsables de la inhibición de crecimiento de los microorganismos indicadores y estructura química de las plantas de esta investigación, no son objeto de este estudio; sin embargo la actividad antimicrobiana evaluada de C. officinalis y T. majus podría deberse a la presencia de alguno o varios de los fito-antimicrobianos mencionados en el marco teórico entre los que se destacan los siguientes:

- Flavonoides: Wyman y Van Etten (1977) observaron la actividad antimicrobiana de los flavonoides contra Pseudomonas, Xantomona y Acromobacter, los resultados mostraron un efecto leve a moderado contra las pseudomonas pero una fuerte actividad contra Acromobacter.

- Extractos etanólicos de las hojas de Psiadia trinervia, especie del

género de las Compuestas, al cual pertenece la capuchina, fueron evaluados por Wang et al. (1983), quienes midieron la actividad antibacterial contra Bacillus cereus dando resultados positivos y planteando la responsabilidad del efecto antimicrobiano a los glucosinolatos.

Los glucosinolatos tales como los Isotocianatos han mostrado un amplio rango de efectos antibacteriales y antifúngicos, sin embargo ciertos estudios con animales revelan toxicidad en algunos de ellos cuando los glucosinolatos están purificados (Naidu, 2000). Los glucosinolatos están presente en la familia de las Tropaeolaceae, que además presentan un tipo de aceite de mostaza. Estos fito-antimicrobianos se producen dentro de la planta cuando está amenazada por insectos (Olsson y Jonasson, 1994).

80

Existen varios tipos de glucosinolatos que pueden extraerse por simple lixiviación con agua hasta utilizar solvente como etanol al 95%. El extracto obtenido se debe mantener a bajas temperaturas (Kyung et al., 1997) (Shofran et al., 1998). Shofran et al., (1998) reportó el efecto inhibidor de un glucosinolato contra E. coli, S. aureus, B. subtilis, entre otras. Delaquis y Sholberg (1997), probaron alilisotiocioanato (AITC) gaseoso contra E. coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas y Penicillium expansun, confirmando la actividad inhibidora sobre los microorganismos nombrados.

- Los terpenos presentes en los aceites esenciales son los principales antimicrobianos, así lo demuestran estudios de los mecanismos por los cuales las especias inhiben el crecimiento de diferentes microorganismos.

4.2.2. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria, la actividad bactericida o bacteriostática y fungicida o fungistática

4.2.2.1. Determinación de la actividad bactericida o bacteriostática y fungicida o fungistática por medio del método del tubo pequeño

Este método permitió determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI), la cual se define como la concentración de agente antimicrobiano que inhibe la división celular de una célula de un microorganismo normal (Garzón y Quintero, 1996). La menor concentración del tubo donde se produjo inhibición total se consideró como la CMI; ésta última puede estar entre la concentración que produce la inhibición total y la mitad de ésta (Kavanagh, 1979). Las tablas desde la 11 hasta la tabla 18 muestran los resultados de la aplicación de este método, e indican la capacidad bactericida o bacteriostática y fungicida o fungistático de los extractos. Los resultados de la aplicación de este método en las otras 3 réplicas se pueden ver en el Anexo 4. Es importante anotar que los siguientes valores representan el comportamiento de cada extracto sobre cada microorganismo de ensayo: 0: Representa inhibición total de crecimiento. 1: Representa crecimiento intermedio entre el blanco y el patrón. 2: Representa el blanco de crecimiento del microorganismo.

Tabla 11. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto acuoso de Caléndula officinalis a diferentes concentraciones, obtenido a 25 °C, por el método de tubo pequeño.

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

0 2 1 2 2 2 2 20 2 1 2 2 2 2 20 2 1 2 2 2 2 2

PATRÓN BLANCO

CONCENTRACIÓN μg/ml250 125 62,5

Escherichia coliStaphilococcus aureusSaccaromyces cerevisiae

MICROORGANISMO

h*: Horas Nota: Las lecturas para las bacterias se realizaron a las 24 horas (h) y 48 h; para las levaduras las lecturas se realizaron a las 48 h y 72 h. Tabla 12. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto acuoso de Caléndula officinalis a diferentes concentraciones obtenido a 50 °C por el método de tubo pequeño.

24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*

0 2 0 1 1 2 2 20 2 0 1 1 1 2 20 2 0 1 1 1 2 2


MICROORGANISMO PATRÓN BLANCO


h*: Horas Nota: Las lecturas para las bacterias se realizaron a las 24 horas (h) y 48 h; para las levaduras las lecturas se realizaron a las 48 h y 72 h. Tabla 13. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto acuoso de Tropaeolum majus a diferentes concentraciones obtenido a 25 °C por el método de tubo pequeño.

24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*

0 2 1 1 2 2 2 20 2 1 1 2 2 2 20 2 1 1 2 2 2 2




h*: Horas Nota: Las lecturas para las bacterias se realizaron a las 24 horas (h) y 48 h; para las levaduras las lecturas se realizaron a las 48 h y 72 h.

81

Tabla 14. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto acuoso de Tropaeolum majus a diferentes concentraciones obtenido a 50 °C por el método de tubo pequeño.

82

112

24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*

0 2 0 0 1 1 10 2 0 0 1 1 10 2 0 0 1 1 2

PATRÓN BLANCO



MICROORGANISMO

h*: Horas Nota: Las lecturas para las bacterias se realizaron a las 24 horas (h) y 48 h; para las levaduras las lecturas se realizaron a las 48 h y 72 h. Tabla 15. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae del extracto etanólico de Caléndula officinalis a diferentes concentraciones obtenido a 25 °C, por el método de tubo pequeño.

24/48 h*48/72

h*24/48

h*48/72

h*24/48

h*48/72

h*0 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 2

PATRÓN BLANCO



MICROORGANISMO

h*: Horas Nota: Las lecturas para las bacterias se realizaron a las 24 horas (h) y 48 h; para las levaduras las lecturas se realizaron a las 48 h y 72 h. Tabla 16. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto etanólico de Caléndula officinalis a diferentes concentraciones obtenido a 50 °C, por el método de tubo pequeño.

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

0 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 2





Tabla 17. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto etanólico de Tropaeolum majus a diferentes concentraciones obtenido a 25°C, por el método de tubo pequeño.

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

0 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 2

PATRÓN BLANCO



MICROORGANISMO

h*: Horas Nota: Las lecturas para las bacterias se realizaron a las 24 horas (h) y 48 h; para las levaduras las lecturas se realizaron a las 48 h y 72 h. Tabla 18. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto etanólico de Tropaeolum majus a diferentes concentraciones obtenido a 50 °C, por el método de tubo pequeño.

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

0 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 2

PATRÓN BLANCO

CONCENTRACIÓN μg/ml

250 125 62,5

Escherichia coliStaphilococcus aureus

Saccaromyces cerevisiae

MICROORGANISMO

h*: Horas Nota: Las lecturas para las bacterias se realizaron a las 24 horas (h) y 48 h; para las levaduras las lecturas se realizaron a las 48 h y 72 h. La evaluación se llevó a cabo teniendo en cuenta que aquellos tubos donde la concentración de extracto no permitió crecimiento a las 24 horas ó 48 horas para la levadura y posteriormente, al raspar la superficie del tubo e inocular nuevamente por 24 horas ó 48 horas para el caso de la levadura; y no se produjo nuevamente crecimiento se definieron preliminarmente como extractos bactericidas ó fungicidas según el caso. Dentro de este último grupo se presentaron como bactericidas, tanto para E. coli como para S. aureus, y como fungicida para S. cerevisiae, los siguientes extractos:

Extracto acuoso de Tropaeolum majus obtenido a 50°C Extracto etanólico de Caléndula officinalis obtenido a 25°C Extracto etanólico de Tropaeolum majus obtenido a 25°C Extracto etanólico de Caléndula officinalis obtenido a 50°C Extracto etanólico de Tropaeolum majus obtenido a 50°C

83

Mientras que el único extracto que resultó bacteriostático para los tres microorganismos: E. coli, S. aureus y S. cerevisiae fue:

Extracto acuoso de Caléndula officinalis obtenido a 50°C Tabla 19. Evaluación preliminar de la Actividad Bactericida o Bacteriostática y Fungicida o Fungistática de los Extractos acuoso y etanólicos de Tropaeolum majus y Extractos etanólicos de Caléndula officinalis.

MICROORGANISMO CONCENTRACIÓN

μ/ml BACTERICIDA BACTERIOSTÁTICO FUNGICIDA FUNGIESTÁTICO

Escherichia coli 250 X

Staphylococcus aureus 250 X

Saccharomyces cerevisiae 250 X

Tabla 20. Evaluación preliminar de la Actividad Bactericida o Bacteriostática y Fungicida o Fungistática del Extracto acuoso de Caléndula officinalis obtenido a 50°C

MICROORGANISMO CONCENTRACIÓN

μ/ml BACTERICIDA BACTERIOSTÁTICO FUNGICIDA FUNGIESTÁTICO

Escherichia coli 250 X

Staphylococcus aureus 250 X

Saccharomyces cerevisiae 250

X

4.2.2.2. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria

(CMI) Los resultados experimentales de la Concentración mínima inhibitoria

de las sustancias químicas usadas teóricamente como control: Sulfato de estreptomicina para Staphylococcus aureus y de Nitrato de isoconazol para Candida albicans (Garzón y Quintero, 1996), la cual a pesar de ser patógena representa una relativa proximidad filogenética

84

85

con Saccharomyces cerevisiae (Hernáez et al., 1997), se presentan a continuación:

CMI: Sulfato de estreptomicina: 500 y 250 μg/ml para S. aureus. CMI: Nitrato de isoconazol: está entre 62.5 y 31.75 μg/ml para C.

albicans.

Para el extracto acuoso de Caléndula officinalis obtenido a 25°C y para el extracto acuoso de Tropaeolum majus obtenido también a 25°C no se detectó ningún tipo de inhibición. Tabla 21. Intervalos de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de los extractos de Caléndula officinalis y Tropaeolum majus .

Concentración Mínima Inhibitoria μg/ml

Planta Caléndula officinalis Tropaeolum majus Solvente Agua Etanol Agua Etanol

Temperatura 25°C 50°C 25°C 50°C 25°C 50°C 25°C 50°C Microorganismo

E. coli 250-500 250-125 250-125 250-500 250-125 250-125

S. aureus 250-500 250-125 250-125 250-500 250-125 250-125

S. cerevisiae 250-500 250-125 250-125 250-500 250-125 250-125

Esta similitud de CMI significa básicamente que el valor real de la concentración mínima inhibitoria está dentro de estos rangos, que comparándolos con los valores experimentales del trabajo de Garzón y Quintero (1996), da muestra que los extractos que inhibieron el crecimiento de S. aureus tienen una actividad ligeramente mayor que la que tiene el Sulfato de estreptomicina. Por el contrario, los extractos que inhibieron el crecimiento de S. cerevisiae tienen una CMI mayor a la que presenta el Nitrato de isoconazol sobre C. albicans, lo cual da razón a pensar que podría ser una alternativa de antimicótico natural. Después de obtener los resultados anteriormente analizados se determinó para la aplicación de la Fase III que, los extractos acuosos obtenidos a 50°C, que resultaron inhibidores de crecimiento fuesen aplicados sobre una matriz alimentaria y que los extractos etanólicos obtenidos a 50°C fuesen aplicados como solución desinfectante.

86

4.3. FASE III: APLICACIÓN DE LOS EXTRACTOS

4.3.1. Aplicación de los extractos acuosos como conservantes naturales en pulpa de frutas natural sin aditivos

Previamente a la pulpa de guanábana se le hizo un recuento de mesófilos y se le midió el pH, obteniendo los siguientes valores:

Mesófilos: 63 UFC/ml pH: 4.5

El conteo de microorganismos realizado durante 8 días se representa a continuación en las Figuras 33 y 34, se tuvo un lote de pulpa contaminado con 12.5 ml de E. coli en su fase logarítmica, replicando las condiciones de la fase II, y otro lote de pulpa, contaminado con 12.5 ml de S. aureus. Al primer lote se lo trató con 250 ml extracto acuoso de Caléndula officinalis obtenido a 50°C y al segundo, se añadieron 250 ml de extracto acuoso de Tropaeolum majus obtenido a 50°C. La concentración lograda en cada uno de los extractos fue de 250 μg PEq/ml de cada planta, esto significa que en el volumen de 500 ml de cada lote de pulpa se tuvieron 125 μg PEq/ml de C. officinalis para un lote y 125 μg PEq/ml de T. majus para otro lote. Según las Normas y Procedimientos Reglamentarios de la Industria de Alimentos (2000), emitida por el Ministerio de Salud de Colombia la cantidad máxima de sustancias conservantes, ya sean ácido benzoico o ácido sórbico, que se pueden añadir a pulpas no congeladas es de 1000 mg/kg. Siendo la concentración de los extractos mucho menor que la norma para evitar el sabor amargo en la pulpa, sabor que pueden conferir las plantas por sus principios amargos.

Figura 33. Comparación del efecto bioconservante del extracto acuoso de Caléndula officinalis contra E.coli y un Blanco de crecimiento de E.coli.

Curva del efecto bioconservante en pulpa de fruta del extracto acuoso de Calendula officinal is contra

E.col i y un Blanco de crecimiento de E.col i

0

50

100

150

200

250

300

350

1 2 3 4 5 6 7 8

Días

UF

C/m

l.

C . offic inalis vs E. coli Blanco Los resultados de la Figura 33 evidenciaron una disminución de la carga microbiana en el segundo día debido a la presencia del extracto de C. officinalis. Esta disminución fue de 35 UFC. A partir del tercer día se reveló nuevamente crecimiento microbiano. El incremento en la masa microbiana se dio de manera reducida comparándolo con el blanco de crecimiento. Se mantuvo hasta el sexto día, pero a partir del séptimo día se elevó la rata de crecimiento bacteriano, concluyendo que la cantidad de extracto pudo no ser suficiente para demostrarse efectivo por un tiempo mayor.

87

Figura 34. Comparación del efecto bioconservante del extracto acuoso de Tropaleoum majus contra S. aureus y un Blanco de crecimiento de S. aureus.

Curva del efecto bioconservante en pulpa de fruta del extracto acuoso de Tropaeolum majus contra S.

aureus y un Blanco de crecimiento de S. aureus

0

50

100

150

200

250

300

350

1 2 3 4 5 6 7 8

Días

UF

C/m

l.

T. majus vs S . aureus Blanco Los resultados presentado en la Figura 34 evidenciaron una disminución de la carga microbiana en el segundo día gracias a la presencia del extracto de Tropaeolum majus, la disminución de la carga microbiana fue de 37 UFC. A partir del tercer día se reveló nuevamente crecimiento microbiano, sin embargo se mantuvo por debajo del blanco de crecimiento de la bacteria, permitiendo determinar la posibilidad de uso como bioconservante complementando la adición de conservante actuales. Según las Normas y Procedimientos Reglamentarios de la Industria de Alimentos (2000), emitida por el Ministerio de Salud de Colombia, una pulpa de fruta debe cumplir con las siguientes características microbiológicas: Tabla 22. Características microbiológicas de una pulpa de frutas congelada. n m M c

Recuento de microorganismos mesófilos/g 3 20.000 50.000 1 NMP coliformes totales/g 3 9 29 1 NMP coniformes fecales/g 3 <3 - 0 Recuento de esporas clostridium sulfito reductor/g 3 <10 - 0 Recuento de hongos y levaduras 3 1.000 3.000 1 NMP: Número más probable n: Número de muestras a examinar. m: Índice máximo permisible para identificar nivel de buena calidad. M: Índice máximo permisible para identificar nivel aceptable de calidad. c: Número máximo de muestras permisibles con resultado entre m y M.

Los agentes antimicrobianos pueden llegar a tener una aplicación muy provechosa en la industria de alimentos, tal es el caso de los fito-fenoles, tales como las oleorosinas del aceite de oliva que han demostrado aportar beneficios fisiológicos al consumidor y por lo tanto, un atractivo favorable para la industria de la comida saludable (Naidu, 2000). Las saponinas se

88

89

hallan en los glicósidos y se encuentran en hojas, flores, semillas y raíces, en plantas comestibles como el fríjol, el tomate, la avena, el té, el maní, la mora y en general en plantas usadas como saborizantes (Price et al., 1987). Los flavonoides son ácidos fenólicos de gran interés en la industria de alimentos porque contribuyen a la calidad sensorial y nutritiva de las frutas y de los productos derivados de ellos, además son responsables de mejorar la estabilidad del color en los productos derivados de las frutas (Mazza y Miniati, 1993). La gran limitante ha sido hallar la concentración ideal de estos componentes antimicrobianos que resultan muy bajas para ser usadas efectivamente sin afectar las características sensoriales de los alimentos (Naidu, 2000). En el caso de la Caléndula officinalis, que al ser agregada en ensaladas aporta cierto sabor amargo.

4.3.2. Aplicación de los extractos etanólicos en jabón - gel antibacterial para uso sin enjuague

Se tomaron los frotis de dos individuos, a estos frotis se le realizó un recuento e identificación mediante Tinción de Gram para reconocer a las bacterias presentes y Tinción con Azul de Metileno para distinguir a los hongos desarrollados en los medios de siembra. En el Anexo 4, se presenta la clasificación y descripción de los microorganismos identificados en los frotis de manos, se puede observar la descripción de los microorganismos encontrados. En la Tabla 23 se encuentra el conteo de los frotis, realizados por conteos previos para cuantificar la carga microbiana existente antes de aplicar la solución desinfectante y un conteo posterior a la aplicación para determinar la reducción de esa carga microbiana por la presencia de los extractos etanólicos.

Tabla 23. Conteo previo y conteo posterior de la carga microbiana presente en las manos de dos individuos a los cuales se les aplicaron dos soluciones desinfectantes.

MUESTRA 1 MUESTRA 2 MUESTRA 1 MUESTRA 2

30 29 27 31

1 0 11 18

36 21 22 11

1 2 0 8

1 0 0 0

0 0 0 0

Extracto de Caléndula en Etanol al 95% a 50°C Extracto de Capuchina en Etanol al 95% a

50°C

CONTEO DE FROTIS DE MANOS

PRECONTEO PDA UFC PRECONTEO PDA UFC

PRECONTEO PCA UFCPRECONTEO PCA UFC

POSTCONTEO PCA UFC POSTCONTEO PCA UFC

POSTCONTEO AGAR McKY UFC POSTCONTEO AGAR McKY UFC

POSTCONTEO PDA UFC POSTCONTEO PDA UFC

PRECONTEO AGAR McKY UFC PRECONTEO AGAR McKY UFC

La aplicación de los extractos de Caléndula officinalis obtenido en etanol al 95% a 50°C y Tropaeolum majus obtenido en etanol al 95% a 50°C se llevó a cabo por duplicado para confirmar los resultados de la primera muestra. Del primer experimento, la aplicación del extracto etanólico de C. officinalis dio como resultado los siguientes valores, en el conteo previo de las placas de conteo resultaron 30 UFC en la muestra 1 y 29 UFC en la muestra 2, luego de la aplicación de la solución se redujo a 1 UFC en la muestra 1 y a cero UFC en la muestra 2. en el segundo conteo previo realizado en las placas de papa dextrosa se hallaron, 36 UFC en la muestra 1 y 21 UFC en la muestra 2, mientras que en el conteo posterior se redujo esta cantidad a 1 UFC en la muestra 1 y a 2 UFC en la muestra 2. Por último, del conteo previo de las placas de agar MC resultaron, 1 UFC en la muestra 1 y 0 UFC en la muestra 2. En el conteo posterior se redujo totalmente la carga microbiana encontrándose las dos muestras con 0 UFC. Del segundo experimento, la aplicación del extracto etanólico de T. majus reveló los siguientes resultados con los siguientes valores, en el conteo previo de las placas resultaron 27 UFC en la muestra 1 y 31 UFC en la muestra 2,, luego de la aplicación de la solución se redujo a 11 UFC en la muestra 1 y a 18 UFC en la muestra 2. En el segundo conteo previo realizado en las placas de papa dextrosa se hallaron, 22 UFC en la muestra 1 y 11 UFC en la muestra 2, mientras que en el conteo posterior se redujo esta cantidad a 0 UFC en la muestra 1 y a 8 UFC en la muestra 2. Por último, del conteo posterior de las placas de agar MC resultaron, 0 UFC en la muestra 1 y 0 UFC en la muestra 2.

90

Los datos anteriores pueden observarse en las figuras 35 a la 38 donde se evidencia la reducción de la carga microbiana hallada antes de la aplicación de la loción. Cabe anotar que en los resultados obtenidos con los extractos etanólicos hay una actividad sinérgica que tienen las sustancias activas de las plantas con el solvente, como se observó en la fase previa del proyecto. Figura 35. Aplicación del extracto etanólico de Caléndula officinalis obtenido a 50°C, en la manos como loción antibacterial después de un frotis. Muestra 1.

130

136

01

0 5 10 15 20 25 30 35 40

UFC

1

2

3

Med

io d

e cr

ecim

ient

o

Efecto de la aplicación del extracto etanólico de Calendula officinalis como loción antibacterial

Pre conteo Muestra 1Post conteo Muestra 1

Figura 36. Aplicación del extracto etanólico de Caléndula officinalis obtenido a 50°C, en la manos como loción antibacterial después de un frotis. Muestra 2.

0

29

221

00

0 5 10 15 20 25 30

UFC

1

2

3

Med

io d

e cr

ecim

ient

o

Efecto de la aplicación del extracto etanólico de Calendula officinalis como loción antibacterial


91

Figura 37. Aplicación del extracto etanólico de Tropaeolum majus obtenido a 50°C, en la manos como loción antibacterial después de un frotis. Muestra 1.

11

27

022

00

0 5 10 15 20 25 30

UFC

Efecto de la aplicación del extracto etanólico de Trpoaeolum majus como loción antibacterial


Figura 38. Aplicación del extracto etanólico de Tropaeolum majus obtenido a 50°C, en la manos como loción antibacterial después de un frotis. Muestra 2.

1831

811

00

0 5 10 15 20 25 30 35

UFC

Efecto de la aplicación del extracto etanólico de Trpoaeolum majus como loción antibacterial


Las fotografías de ésta fase, correspondientes las placas de agar con las muestras previas y posteriores a la aplicación de la loción pueden verse en los Anexos 6 y 7.

92

93

5. CONSIDERACIONES FINALES El presente estudio mediante la obtención de extractos a partir de especies botánicas demuestra que estas especies, que brotan de manera silvestre, tienen potencial para ser conservantes eficaces, aunque el desarrollo del producto debe perfeccionarse para su óptima funcionalidad, el tema del sabor es todo un desafío, es necesario realizar más estudios que demuestren aplicaciones de conservantes de origen vegetal para perfeccionar su uso, además es necesario ampliar los aportes en investigación básica de apoyo para la industria alimenticia y cosmética. Se hace evidente que debe potencializarse el método de extracción para lograr obtener las sustancias responsables de la actividad antimicrobiana de manera más efectiva. La Caléndula officinalis es una planta rica en aceites esenciales, además al igual que el tomillo, contiene múltiples compuestos activos que representan a las diferentes familias químicas. Los aceites esenciales son a menudo los compuestos más inhibitorios (Cate, 2000) por lo que resultaría interesante evaluar directamente la acción biológica de estos fotoquímicos aislándolos de la planta. Debido al contenido de aceites esenciales debe monitorearse la volatilidad y estabilidad del producto asegurando un producto de alta calidad. La caléndula no sólo tiene aplicaciones culinarias, se destaca por su amplio uso en la industria cosmética y en la medicina homeopática como alternativa a tratamientos médicos con consecuencias no deseadas en la salud Dentro de los usos terapéuticos se encuentra que la flor de Caléndula officinalis es cicatrizante y desinflamante. Es utilizada para aliviar los síntomas posteriores a las picaduras de insectos entre otros. En su composición se resalta la presencia de saponinas y glucósidos (Carreño, 2000). La capuchina, planta originaria del Perú, tiene la característica de segregar una esencia picante que inmuniza a las plantas cercanas a ella. No se conocen estudios de extracción fina que reporten puntualmente su contenido, sin embargo de la presente investigación de presume la presencia de glucosinolatos, carotenoides y flavonoides, entre otros compuestos fenólicos, los cuales podrían ser los responsables del efecto antibiótico. El uso de Tropaeolum majus se conoce en la cocina típica de la India, en donde se utiliza como condimento y donde han realizado la mayor cantidad de estudios de esta planta aportando información relevante para esta investigación. Dentro de los usos planteados en la medicina popular están su aplicación en decocciones de las ramas y flores para tratar infecciones (Carreño, 2000). Los resultados de la inhibición de crecimiento de los microorganismos en la aplicación In vivo de los extractos en la fase III, en la matriz alimentaria, permite

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plantear dos posibles aplicaciones: primero, la utilización de ellos en barras de alimentos en donde el consumo de los alimentos se lleva a cabo en menos de 48 horas, tiempo en el cual fueron efectivos los extractos en la pulpa de frutas. Segundo, incluye la aplicación de los extractos en combinación con otras metodologías como parte de una tecnología de barreras. En la misma fase III, los resultados obtenidos con la loción son muy efectivos, planteando su utilización en la industria de alimentos y cosmética, como agente antimicrobiano para el cumplimiento de las Buenas Prácticas de Manufactura de los trabajadores. También, como ingrediente antimicrobiano en productos cosméticos, como agente antibacterial en jabones lavalosa, jabones de manos y cuerpo, shampoo, etc.

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6. CONCLUSIONES

En la obtención de los extractos acuosos el incremento de la temperatura

permitió mejor extracción de los componentes activos de Caléndula officinalis y Tropaeolum majus.

El etanol como solvente y por su acción antimicrobiana resultó más

eficiente que el agua y el aceite vegetal en la extracción de las sustancias activas de las dos especies vegetales, al obtener mejores resultados inhibitorios respecto a los extractos obtenidos con los otros solventes.

El extracto más efectivo contra E. coli fue el de Caléndula officinalis en

etanol obtenido a 50°C obteniéndose en promedio 13 mm de diámetro de inhibición.

El extracto más efectivo contra S. aureus fue el de Caléndula officinalis en

etanol obtenido a 50°C con un promedio de 13.1 mm de diámetro de inhibición,

El extracto más efectivo contra Saccharomyces cerevisiae fue el de

Tropaleoum majus en etanol obtenido a 50°C con 13.17 mm de diámetro de inhibición.

El extracto que demostró tener amplio espectro, obteniendo en

promedio un diámetro de inhibición de crecimiento de 12.61 mm contra los tres microorganismos indicadores fue el de Caléndula officinalis en etanol obtenido a 50 °C.

La actividad antimicrobiana de los extractos de Caléndula officinalis y

Tropaeolum majus contra los tres microorganismos indicadores no mostraron diferencias significativas entre ellos.

Los extractos con actividad bactericida contra E. coli y S. aureus, y fungicida

para S. cerevisiae fueron: o Extracto acuoso de Tropaeolum majus obtenido a 50 °C o Extractos etanólicos de Caléndula officinalis y Tropaeolum majus

obtenidos a 25°C. o Extractos etanólicos de Caléndula officinalis y Tropaeolum majus

obtenidos a 50°C. o El único extracto con actividad bacteriostática para los tres

microorganismos: E. coli, S. aureus y S. cerevisiae fue el extracto acuoso de Caléndula officinalis obtenido a 50 °C

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Los extractos acuosos de Caléndula officinalis y Tropaeolum majus aplicados como conservantes naturales en la pulpa de guanábana contaminada con E.coli y S. aureus fueron efectivos hasta el segundo día de interacción dentro de la matriz alimentaria, ya que los extractos disminuyeron la carga microbiana en 35 UFC y 37 UFC, respectivamente. A partir del tercer día se evidenció nuevamente crecimiento microbiano en las dos matrices alimentarias.

El extracto etanólico de Caléndula officinalis y el extracto etanólico de

Tropaeolum majus fueron efectivos en la aplicación como loción antibacterial al reducir la carga microbiana presente en las manos de dos individuos.

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RECOMENDACIONES

Debe desarrollarse un protocolo formal para que cada lote de material vegetal crudo presente la composición de interés, además de un análisis cuantitativo para enfocar el uso de los compuestos que puedan afectar la actividad del ingrediente antimicrobiano y la aceptabilidad de la preparación, como aspectos asociados con la toxicidad del producto.

También debe presentarse información detallada sobre el proceso industrial,

incluyendo diagrama de flujo, y tratarse con especial atención las actividades y factores medioambientales que pueden afectar la estabilidad, actividad y calidad de la preparación botánica (FDA, 2003). La preparación de conservantes de origen botánico debe hacerse bajo las estrictas buenas prácticas de manufactura, de esta manera permitirán a la industria de alimentos utilizar las preparaciones botánicas eficazmente como bioconservantes y poder producir alimentos de buena calidad.

Las compañías que compran las preparaciones botánicas para el uso en su

producto como bioconservantes deben establecer las especificaciones mínimas de variación de lote a lote, los niveles de ingredientes activos, las características técnicas, el tipo de preparación, el equivalente a la concentración, el almacenamiento, los niveles de toxicidad o los compuestos biológicamente activos, tener la seguridad que el producto es puro y que no contiene niveles de microorganismos, solventes residuales, pesticidas, metales pesados u otro contaminante medioambiental.

La preparación de productos cosméticos de calidad a partir de extractos de

Calendula officinalis y Tropaeolum majus podría llegar a compararse con la obtención de fitofármacos presentes en el mercado, llegando a plantear una colaboración e investigación conjunta entre la industria cosmética y farmacéutica para explorar a fondo el uso extensivo de estos productos.

Los extractos de C. officinalis y en particular los de sus flores muestran un

amplio espectro de acciones farmacológicas, entre las que sobresalen: antibacteriana, anti-inflamatoria y cicatrizante, de ahí la gran importancia de los extractos de Calendula en la cosmetología moderna. Otras propiedades son inmunoestimulante, antitumoral, todo lo cual apoya el amplio uso de esta planta en la medicina tradicional mundial. Según estudios químicos, la Calendula posee un extenso número de familias químicas, entre las cuales sobresalen los carotenoides, los flavonoides, triterpenos, saponinas, ácidos fenólicos, taninos, cumarinas, polisacáridos, sustancias pectídicas, hemicelulosas, aceite esencial, etc. Todo lo anterior está en concordancia con la variedad de propiedades farmacológicas presentadas por dicha planta.

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Teniendo en cuenta que la Calendula de producción nacional se adapta bien a las condiciones de cultivo con buenos resultados aerotécnicos y que las evaluaciones farmacognósticas corresponden a información en la bibliografía internacional, podemos afirmar que la Calendula que crece en nuestro país tiene las condiciones necesarias para su comercialización y puede ser base para la obtención de diferentes extractos (etéreos, etanólicos, propilénicos, etcétera), que se utilizan en la confección de fitofármacos y fitocosméticos de amplia demanda y de muy buenas potencialidades económicas.

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ANEXOS

Anexo 1

Tabla 24. Evaluación preliminar de la capacidad antimicrobiana de los extracto acuosos y etanólicos a partir de Caléndula officinalis y Tropaeolum majus contra E.coli, S. aureus y S. cerevisiae.

FASE I 0 = INHIBE CRECIMIENTO 1 = NO INHIBE CRECIMIENTO MICROORGANISMO

EXTRACTOS Escherichia coli Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisiae REPLICA1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 3

25 °C

1 1 1 4 0 0 0 1 1 0 0 2 0 0 0 3

Agua Caléndula officinalis

50 °C

0 0 0 4 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 3

25 °C

0 0 0 4 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 3

Etanol Caléndula officinalis

50 °C

0 0 0 4 1 1 1 1 Agua Tropaeolum

majus 25 °C

1 1 1 2

106

1 1 1 3 1 1 1 4 0 0 0 1 0 0 0 2 1 1 0 3

50 °C

0 0 0 4 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 3

25 °C

0 0 0 4 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 3

Etanol Tropaeolum majus

50 °C

0 0 0 4

107

Anexo 2 Tabla 25. Resultados de las mediciones de los diámetros de los halos de inhibición formados por cada sendidisco impregnado con el extracto correspondiente a cada tratamiento. Diámetro halos de inhibición mm

TRATAMIENTO SOLVENTE PLANTA TEMPERATURA °C

CONCENTRACIÓN mg/ml REPLICA E. coli S. aureus S. cerevisiae

agua Caléndula officinalis 25 250 1 0 0 0



1





2


agua Caléndula officinalis 25 62,5 1 0 0 0



3



4

agua Caléndula

50 250 2 9 12 16

108

officinalis






5





6


agua Tropaleoum majus 25 250 1 0 0 0



7





8

agua Tropaleoum 25 125 4 0 0 0

109

majus

agua Tropaleoum majus 25 62,5 1 0 0 0



9





10





11





12


etanol Caléndula officinalis 25 250 1 17 12 16

13

etanol Caléndula

25 250 2 16 15 17

110

officinalis






14


etanol Caléndula officinalis 25 62,5 1 7 7 9



15





16





17

etanol Caléndula 50 125 4 16 14 15

111

officinalis




18


etanol Tropaleoum majus 25 250 1 15 14 19



19





20


etanol Tropaleoum majus 25 62,5 1 8 7 9



21



22

etanol Tropaleoum

50 250 2 17 14 17

112

majus






23





24


agua unica unica 0 0 0 25

agua unica unica 0 0 0 etanol unica unica 15 15 15

26 etanol unica unica 16 16 16

27 Patrón 500 unica 21 22 23 28 Patrón 250 unica 20 20 21 29 Patrón 125 unica 19 18 19

113

Anexo 3

Análisis de Varianza ANOVA – Elaborado por Zimmerman, F.

The SAS System 11:40 Monday, March 7, 2005 Obs SOLV PLANTA TEMP CONC TRAT REP E_COLI S_AUREUS S_CEREV 1 agua Calendula officinalis 25 250.0 1 1 0 0 0 2 agua Calendula officinalis 25 250.0 1 2 0 0 0 3 agua Calendula officinalis 25 250.0 1 3 0 0 0 4 agua Calendula officinalis 25 250.0 1 4 0 0 0 5 agua Calendula officinalis 25 125.0 2 1 0 0 0 6 agua Calendula officinalis 25 125.0 2 2 0 0 0 7 agua Calendula officinalis 25 125.0 2 3 0 0 0 8 agua Calendula officinalis 25 125.0 2 4 0 0 0 9 agua Calendula officinalis 25 62.5 3 1 0 0 0 10 agua Calendula officinalis 25 62.5 3 2 0 0 0 11 agua Calendula officinalis 25 62.5 3 3 0 0 0 12 agua Calendula officinalis 25 62.5 3 4 0 0 0 13 agua Calendula officinalis 50 250.0 4 1 10 10 17 14 agua Calendula officinalis 50 250.0 4 2 9 12 16 15 agua Calendula officinalis 50 250.0 4 3 11 12 16 16 agua Calendula officinalis 50 250.0 4 4 11 11 15 17 agua Calendula officinalis 50 125.0 5 1 9 8 13 18 agua Calendula officinalis 50 125.0 5 2 9 9 11 19 agua Calendula officinalis 50 125.0 5 3 9 9 11 20 agua Calendula officinalis 50 125.0 5 4 9 8 10 21 agua Calendula officinalis 50 62.5 6 1 7 7 7 22 agua Calendula officinalis 50 62.5 6 2 7 7 7 23 agua Calendula officinalis 50 62.5 6 3 7 0 8 24 agua Calendula officinalis 50 62.5 6 4 7 0 9 25 agua Tropaleoun majus 25 250.0 7 1 0 0 0 26 agua Tropaleoun majus 25 250.0 7 2 0 0 0 27 agua Tropaleoun majus 25 250.0 7 3 0 0 0

114

28 agua Tropaleoun majus 25 250.0 7 4 0 0 0 29 agua Tropaleoun majus 25 125.0 8 1 0 0 0 30 agua Tropaleoun majus 25 125.0 8 2 0 0 0 31 agua Tropaleoun majus 25 125.0 8 3 0 0 0 32 agua Tropaleoun majus 25 125.0 8 4 0 0 0 33 agua Tropaleoun majus 25 62.5 9 1 0 0 0 34 agua Tropaleoun majus 25 62.5 9 2 0 0 0 35 agua Tropaleoun majus 25 62.5 9 3 0 0 0 36 agua Tropaleoun majus 25 62.5 9 4 0 0 0 37 agua Tropaleoun majus 50 250.0 10 1 10 11 15 38 agua Tropaleoun majus 50 250.0 10 2 9 10 16 39 agua Tropaleoun majus 50 250.0 10 3 10 11 15 40 agua Tropaleoun majus 50 250.0 10 4 10 11 15 41 agua Tropaleoun majus 50 125.0 11 1 7 9 11 42 agua Tropaleoun majus 50 125.0 11 2 7 8 12 43 agua Tropaleoun majus 50 125.0 11 3 7 7 12 44 agua Tropaleoun majus 50 125.0 11 4 8 8 11 45 agua Tropaleoun majus 50 62.5 12 1 0 0 8 46 agua Tropaleoun majus 50 62.5 12 2 0 0 0 47 agua Tropaleoun majus 50 62.5 12 3 0 7 7 48 agua Tropaleoun majus 50 62.5 12 4 0 7 8 49 etanol Calendula officinalis 25 250.0 13 1 17 12 16 50 etanol Calendula officinalis 25 250.0 13 2 16 15 17 51 etanol Calendula officinalis 25 250.0 13 3 16 15 16 52 etanol Calendula officinalis 25 250.0 13 4 16 13 14 53 etanol Calendula officinalis 25 125.0 14 1 14 8 16 54 etanol Calendula officinalis 25 125.0 14 2 10 8 14 55 etanol Calendula officinalis 25 125.0 14 3 12 7 15 56 etanol Calendula officinalis 25 125.0 14 4 7 9 13 57 etanol Calendula officinalis 25 62.5 15 1 7 7 9 58 etanol Calendula officinalis 25 62.5 15 2 0 8 9 59 etanol Calendula officinalis 25 62.5 15 3 7 8 0 60 etanol Calendula officinalis 25 62.5 15 4 0 8 0 61 etanol Calendula officinalis 50 250.0 16 1 17 18 17 62 etanol Calendula officinalis 50 250.0 16 2 15 17 16 63 etanol Calendula officinalis 50 250.0 16 3 17 18 18 64 etanol Calendula officinalis 50 250.0 16 4 17 15 17 65 etanol Calendula officinalis 50 125.0 17 1 14 13 14 66 etanol Calendula officinalis 50 125.0 17 2 13 14 14

115

67 etanol Calendula officinalis 50 125.0 17 3 13 14 14 68 etanol Calendula officinalis 50 125.0 17 4 16 14 15 69 etanol Calendula officinalis 50 62.5 18 1 8 8 8 70 etanol Calendula officinalis 50 62.5 18 2 9 9 0 71 etanol Calendula officinalis 50 62.5 18 3 9 9 0 72 etanol Calendula officinalis 50 62.5 18 4 8 8 8 73 etanol Tropaleoun majus 25 250.0 19 1 15 14 19 74 etanol Tropaleoun majus 25 250.0 19 2 17 16 17 75 etanol Tropaleoun majus 25 250.0 19 3 15 15 17 76 etanol Tropaleoun majus 25 250.0 19 4 17 16 17 77 etanol Tropaleoun majus 25 125.0 20 1 12 12 11 78 etanol Tropaleoun majus 25 125.0 20 2 11 14 13 79 etanol Tropaleoun majus 25 125.0 20 3 12 12 15 80 etanol Tropaleoun majus 25 125.0 20 4 12 11 14 81 etanol Tropaleoun majus 25 62.5 21 1 8 7 9 82 etanol Tropaleoun majus 25 62.5 21 2 7 9 0 83 etanol Tropaleoun majus 25 62.5 21 3 9 9 8 84 etanol Tropaleoun majus 25 62.5 21 4 8 9 0 85 etanol Tropaleoun majus 50 250.0 22 1 19 14 19 86 etanol Tropaleoun majus 50 250.0 22 2 17 14 17 87 etanol Tropaleoun majus 50 250.0 22 3 18 15 19 88 etanol Tropaleoun majus 50 250.0 22 4 17 16 18 89 etanol Tropaleoun majus 50 125.0 23 1 12 12 15 90 etanol Tropaleoun majus 50 125.0 23 2 11 11 15 91 etanol Tropaleoun majus 50 125.0 23 3 12 11 16 92 etanol Tropaleoun majus 50 125.0 23 4 11 11 14 93 etanol Tropaleoun majus 50 62.5 24 1 8 8 8 94 etanol Tropaleoun majus 50 62.5 24 2 8 9 8 95 etanol Tropaleoun majus 50 62.5 24 3 7 8 9 96 etanol Tropaleoun majus 50 62.5 24 4 8 8 0 97 agua . . . 25 1 0 0 0 98 agua . . . 25 2 0 0 0 99 etanol . . . 26 1 15 15 15 100 etanol . . . 26 2 16 16 16 101 ampicilina . . 500 27 1 21 22 23 102 ampicilina . . 250 28 1 20 20 21 103 ampicilina . . 125 29 1 19 18 19

116

The GLM Procedure

Class Level Information Class Levels Values TRAT 29 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Number of observations 103

The GLM Procedure Dependent Variable: E_COLI E_COLI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 28 4067.713592 145.275485 104.88 <.0001 Error 74 102.500000 1.385135 Corrected Total 102 4170.213592 R-Square Coeff Var Root MSE E_COLI Mean 0.975421 14.55252 1.176918 8.087379 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F TRAT 28 4067.713592 145.275485 104.88 <.0001 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

117

TRAT 28 4067.713592 145.275485 104.88 <.0001 Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value Pr > F SOLVENTE 1 1633.500000 1633.500000 1179.31 <.0001 PLANTA 1 6.000000 6.000000 4.33 0.0409 TEMPERATURA 1 468.166667 468.166667 337.99 <.0001 CONC LINEAL 1 669.515625 669.515625 483.36 <.0001 CONC CUADRAT 1 4.380208 4.380208 3.16 0.0795 SOL X PLAN 1 26.041667 26.041667 18.80 <.0001 SOL X TEMP 1 187.041667 187.041667 135.03 <.0001 PLAN X TEMP 1 45.375000 45.375000 32.76 <.0001 FATOR X AGUA(BLANCO) 1 117.041667 117.041667 84.50 <.0001 FATOR X ETHANOL(BLANCO) 1 118.306973 118.306973 85.41 <.0001 FATOR X AMPICILINA 1 438.031566 438.031566 316.24 <.0001 AMPICILIA LIN 1 2.000000 2.000000 1.44 0.2333 AMPICILIA CUA 1 0.000000 0.000000 0.00 1.0000

The GLM Procedure Dependent Variable: S_AUREUS S_AUREUS Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 28 3549.757282 126.777046 68.48 <.0001 Error 74 137.000000 1.851351 Corrected Total 102 3686.757282 R-Square Coeff Var Root MSE S_AUREUS Mean 0.962840 16.90546 1.360644 8.048544

118

Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F TRAT 28 3549.757282 126.777046 68.48 <.0001 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F TRAT 28 3549.757282 126.777046 68.48 <.0001 Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value Pr > F SOLVENTE 1 1457.041667 1457.041667 787.02 <.0001 PLANTA 1 0.041667 0.041667 0.02 0.8812 TEMPERATURA 1 477.041667 477.041667 257.67 <.0001 CONC LINEAL 1 456.890625 456.890625 246.79 <.0001 CONC CUADRAT 1 0.046875 0.046875 0.03 0.8740 SOL X PLAN 1 1.041667 1.041667 0.56 0.4556 SOL X TEMP 1 234.375000 234.375000 126.60 <.0001 PLAN X TEMP 1 26.041667 26.041667 14.07 0.0003 FATOR X AGUA(BLANCO) 1 115.783163 115.783163 62.54 <.0001 FATOR X ETHANOL(BLANCO) 1 119.579082 119.579082 64.59 <.0001 FATOR X AMPICILINA 1 441.011364 441.011364 238.21 <.0001 AMPICILIA LIN 1 8.000000 8.000000 4.32 0.0411 AMPICILIA CUA 1 0.000000 0.000000 0.00 1.0000

The GLM Procedure Dependent Variable: S_CEREV S_CEREV Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 28 4892.815534 174.743412 36.32 <.0001 Error 74 356.000000 4.810811 Corrected Total 102 5248.815534

119

R-Square Coeff Var Root MSE S_CEREV Mean 0.932175 23.98256 2.193356 9.145631 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F TRAT 28 4892.815534 174.743412 36.32 <.0001 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F TRAT 28 4892.815534 174.743412 36.32 <.0001 Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value Pr > F SOLVENTE 1 988.166667 988.166667 205.41 <.0001 PLANTA 1 0.666667 0.666667 0.14 0.7108 TEMPERATURA 1 876.041667 876.041667 182.10 <.0001 CONC LINEAL 1 1130.640625 1130.640625 235.02 <.0001 CONC CUADRAT 1 61.880208 61.880208 12.86 0.0006 SOL X PLAN 1 8.166667 8.166667 1.70 0.1966 SOL X TEMP 1 651.041667 651.041667 135.33 <.0001 PLAN X TEMP 1 0.375000 0.375000 0.08 0.7809 FATOR X AGUA(BLANCO) 1 152.870748 152.870748 31.78 <.0001 FATOR X ETHANOL(BLANCO) 1 87.074830 87.074830 18.10 <.0001 FATOR X AMPICILINA 1 430.626263 430.626263 89.51 <.0001 AMPICILIA LIN 1 8.000000 8.000000 1.66 0.2012 AMPICILIA CUA 1 0.000000 0.000000 0.00 1.0000

The GLM Procedure

Least Squares Means

120

E_COLI LSMEAN TRAT LSMEAN Number 1 0.0000000 1 2 0.0000000 2 3 0.0000000 3 4 10.2500000 4 5 9.0000000 5 6 7.0000000 6 7 0.0000000 7 8 0.0000000 8 9 0.0000000 9 10 9.7500000 10 11 7.2500000 11 12 0.0000000 12 13 16.2500000 13 14 10.7500000 14 15 3.5000000 15 16 16.5000000 16 17 14.0000000 17 18 8.5000000 18 19 16.0000000 19 20 11.7500000 20 21 8.0000000 21 22 17.7500000 22 23 11.5000000 23 24 7.7500000 24 25 0.0000000 25 26 15.5000000 26 27 21.0000000 27 28 20.0000000 28 29 19.0000000 29

The GLM Procedure Least Squares Means

Least Squares Means for effect TRAT Pr > |t| for H0: LSMean(i)=LSMean(j) Dependent Variable: E_COLI

121

i/j 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1.0000 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 2 1.0000 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 3 1.0000 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 4 <.0001 <.0001 <.0001 0.1373 0.0002 <.0001 <.0001 <.0001 0.5498 5 <.0001 <.0001 <.0001 0.1373 0.0188 <.0001 <.0001 <.0001 0.3704 6 <.0001 <.0001 <.0001 0.0002 0.0188 <.0001 <.0001 <.0001 0.0015 7 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 1.0000 <.0001 8 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 1.0000 <.0001 9 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 1.0000 <.0001 10 <.0001 <.0001 <.0001 0.5498 0.3704 0.0015 <.0001 <.0001 <.0001 11 <.0001 <.0001 <.0001 0.0006 0.0389 0.7647 <.0001 <.0001 <.0001 0.0036 12 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 13 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 14 <.0001 <.0001 <.0001 0.5498 0.0389 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.2333 15 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 16 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 17 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 18 <.0001 <.0001 <.0001 0.0389 0.5498 0.0755 <.0001 <.0001 <.0001 0.1373 19 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 20 <.0001 <.0001 <.0001 0.0755 0.0015 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0188 21 <.0001 <.0001 <.0001 0.0085 0.2333 0.2333 <.0001 <.0001 <.0001 0.0389 22 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 23 <.0001 <.0001 <.0001 0.1373 0.0036 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0389 24 <.0001 <.0001 <.0001 0.0036 0.1373 0.3704 <.0001 <.0001 <.0001 0.0188 25 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 26 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 27 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 28 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 29 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 Least Squares Means for effect TRAT Pr > |t| for H0: LSMean(i)=LSMean(j) Dependent Variable: E_COLI i/j 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

122

1 <.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 2 <.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 3 <.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 4 0.0006 <.0001 <.0001 0.5498 <.0001 <.0001 <.0001 0.0389 <.0001 0.0755 5 0.0389 <.0001 <.0001 0.0389 <.0001 <.0001 <.0001 0.5498 <.0001 0.0015 6 0.7647 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0755 <.0001 <.0001 7 <.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 8 <.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 9 <.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 10 0.0036 <.0001 <.0001 0.2333 <.0001 <.0001 <.0001 0.1373 <.0001 0.0188 11 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.1373 <.0001 <.0001 12 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 13 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.7647 0.0085 <.0001 0.7647 <.0001 14 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0002 0.0085 <.0001 0.2333 15 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 16 <.0001 <.0001 0.7647 <.0001 <.0001 0.0036 <.0001 0.5498 <.0001 17 <.0001 <.0001 0.0085 0.0002 <.0001 0.0036 <.0001 0.0188 0.0085 18 0.1373 <.0001 <.0001 0.0085 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0002 19 <.0001 <.0001 0.7647 <.0001 <.0001 0.5498 0.0188 <.0001 <.0001 20 <.0001 <.0001 <.0001 0.2333 <.0001 <.0001 0.0085 0.0002 <.0001 21 0.3704 <.0001 <.0001 0.0015 <.0001 <.0001 <.0001 0.5498 <.0001 <.0001 22 <.0001 <.0001 0.0755 <.0001 <.0001 0.1373 <.0001 <.0001 0.0389 <.0001 23 <.0001 <.0001 <.0001 0.3704 <.0001 <.0001 0.0036 0.0006 <.0001 0.7647 24 0.5498 <.0001 <.0001 0.0006 <.0001 <.0001 <.0001 0.3704 <.0001 <.0001 25 <.0001 1.0000 <.0001 <.0001 0.0010 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 26 <.0001 <.0001 0.4642 <.0001 <.0001 0.3297 0.1453 <.0001 0.6252 0.0004 27 <.0001 <.0001 0.0006 <.0001 <.0001 0.0010 <.0001 <.0001 0.0003 <.0001 28 <.0001 <.0001 0.0057 <.0001 <.0001 0.0096 <.0001 <.0001 0.0033 <.0001 29 <.0001 <.0001 0.0401 <.0001 <.0001 0.0613 0.0003 <.0001 0.0255 <.0001

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Least Squares Means for effect TRAT Pr > |t| for H0: LSMean(i)=LSMean(j) Dependent Variable: E_COLI i/j 21 22 23 24 25 26 27 28 29 1 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 2 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 3 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 4 0.0085 <.0001 0.1373 0.0036 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 5 0.2333 <.0001 0.0036 0.1373 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 6 0.2333 <.0001 <.0001 0.3704 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 7 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 8 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 9 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 10 0.0389 <.0001 0.0389 0.0188 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 11 0.3704 <.0001 <.0001 0.5498 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 12 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 13 <.0001 0.0755 <.0001 <.0001 <.0001 0.4642 0.0006 0.0057 0.0401 14 0.0015 <.0001 0.3704 0.0006 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 15 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0010 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 16 <.0001 0.1373 <.0001 <.0001 <.0001 0.3297 0.0010 0.0096 0.0613 17 <.0001 <.0001 0.0036 <.0001 <.0001 0.1453 <.0001 <.0001 0.0003 18 0.5498 <.0001 0.0006 0.3704 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 19 <.0001 0.0389 <.0001 <.0001 <.0001 0.6252 0.0003 0.0033 0.0255 20 <.0001 <.0001 0.7647 <.0001 <.0001 0.0004 <.0001 <.0001 <.0001 21 <.0001 <.0001 0.7647 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 22 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0304 0.0158 0.0915 0.3452 23 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0002 <.0001 <.0001 <.0001 24 0.7647 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 25 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 26 <.0001 0.0304 0.0002 <.0001 <.0001 0.0003 0.0026 0.0176 27 <.0001 0.0158 <.0001 <.0001 <.0001 0.0003 0.5498 0.2333 28 <.0001 0.0915 <.0001 <.0001 <.0001 0.0026 0.5498 0.5498 29 <.0001 0.3452 <.0001 <.0001 <.0001 0.0176 0.2333 0.5498

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The GLM Procedure

Least Squares Means

S_AUREUS LSMEAN TRAT LSMEAN Number 1 0.0000000 1 2 0.0000000 2 3 0.0000000 3 4 11.2500000 4 5 8.5000000 5 6 3.5000000 6 7 0.0000000 7 8 0.0000000 8 9 0.0000000 9 10 10.7500000 10 11 8.0000000 11 12 3.5000000 12 13 13.7500000 13 14 8.0000000 14 15 7.7500000 15 16 17.0000000 16 17 13.7500000 17 18 8.5000000 18 19 15.2500000 19 20 12.2500000 20 21 8.5000000 21 22 14.7500000 22 23 11.2500000 23 24 8.2500000 24 25 0.0000000 25 26 15.5000000 26 27 22.0000000 27 28 20.0000000 28 29 18.0000000 29 Least Squares Means for effect TRAT

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Pr > |t| for H0: LSMean(i)=LSMean(j) Dependent Variable: S_AUREUS i/j 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1.0000 1.0000 <.0001 <.0001 0.0005 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 2 1.0000 1.0000 <.0001 <.0001 0.0005 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 3 1.0000 1.0000 <.0001 <.0001 0.0005 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 4 <.0001 <.0001 <.0001 0.0055 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.6048 5 <.0001 <.0001 <.0001 0.0055 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0221 6 0.0005 0.0005 0.0005 <.0001 <.0001 0.0005 0.0005 0.0005 <.0001 7 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 <.0001 0.0005 1.0000 1.0000 <.0001 8 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 <.0001 0.0005 1.0000 1.0000 <.0001 9 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 <.0001 0.0005 1.0000 1.0000 <.0001 10 <.0001 <.0001 <.0001 0.6048 0.0221 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 11 <.0001 <.0001 <.0001 0.0012 0.6048 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0055 12 0.0005 0.0005 0.0005 <.0001 <.0001 1.0000 0.0005 0.0005 0.0005 <.0001 13 <.0001 <.0001 <.0001 0.0113 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0026 14 <.0001 <.0001 <.0001 0.0012 0.6048 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0055 15 <.0001 <.0001 <.0001 0.0005 0.4382 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0026 16 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 17 <.0001 <.0001 <.0001 0.0113 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0026 18 <.0001 <.0001 <.0001 0.0055 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0221 19 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 20 <.0001 <.0001 <.0001 0.3020 0.0002 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.1232 21 <.0001 <.0001 <.0001 0.0055 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0221 22 <.0001 <.0001 <.0001 0.0005 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 23 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 0.0055 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.6048 24 <.0001 <.0001 <.0001 0.0026 0.7957 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0113 25 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 <.0001 0.0040 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 26 <.0001 <.0001 <.0001 0.0006 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0001 27 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 28 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 29 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001

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Least Squares Means for effect TRAT Pr > |t| for H0: LSMean(i)=LSMean(j) Dependent Variable: S_AUREUS i/j 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1 <.0001 0.0005 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 2 <.0001 0.0005 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 3 <.0001 0.0005 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 4 0.0012 <.0001 0.0113 0.0012 0.0005 <.0001 0.0113 0.0055 <.0001 0.3020 5 0.6048 <.0001 <.0001 0.6048 0.4382 <.0001 <.0001 1.0000 <.0001 0.0002 6 <.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 7 <.0001 0.0005 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 8 <.0001 0.0005 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 9 <.0001 0.0005 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 10 0.0055 <.0001 0.0026 0.0055 0.0026 <.0001 0.0026 0.0221 <.0001 0.1232 11 <.0001 <.0001 1.0000 0.7957 <.0001 <.0001 0.6048 <.0001 <.0001 12 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 13 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0012 1.0000 <.0001 0.1232 0.1232 14 1.0000 <.0001 <.0001 0.7957 <.0001 <.0001 0.6048 <.0001 <.0001 15 0.7957 <.0001 <.0001 0.7957 <.0001 <.0001 0.4382 <.0001 <.0001 16 <.0001 <.0001 0.0012 <.0001 <.0001 0.0012 <.0001 0.0730 <.0001 17 <.0001 <.0001 1.0000 <.0001 <.0001 0.0012 <.0001 0.1232 0.1232 18 0.6048 <.0001 <.0001 0.6048 0.4382 <.0001 <.0001 <.0001 0.0002 19 <.0001 <.0001 0.1232 <.0001 <.0001 0.0730 0.1232 <.0001 0.0026 20 <.0001 <.0001 0.1232 <.0001 <.0001 <.0001 0.1232 0.0002 0.0026 21 0.6048 <.0001 <.0001 0.6048 0.4382 <.0001 <.0001 1.0000 <.0001 0.0002 22 <.0001 <.0001 0.3020 <.0001 <.0001 0.0221 0.3020 <.0001 0.6048 0.0113 23 0.0012 <.0001 0.0113 0.0012 0.0005 <.0001 0.0113 0.0055 <.0001 0.3020 24 0.7957 <.0001 <.0001 0.7957 0.6048 <.0001 <.0001 0.7957 <.0001 <.0001 25 <.0001 0.0040 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 26 <.0001 <.0001 0.1418 <.0001 <.0001 0.2070 0.1418 <.0001 0.8326 0.0073 27 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0016 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 28 <.0001 <.0001 0.0001 <.0001 <.0001 0.0523 0.0001 <.0001 0.0026 <.0001 29 <.0001 <.0001 0.0066 <.0001 <.0001 0.5130 0.0066 <.0001 0.0747 0.0003

127

Least Squares Means for effect TRAT Pr > |t| for H0: LSMean(i)=LSMean(j) Dependent Variable: S_AUREUS i/j 21 22 23 24 25 26 27 28 29 1 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 2 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 3 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 4 0.0055 0.0005 1.0000 0.0026 <.0001 0.0006 <.0001 <.0001 <.0001 5 1.0000 <.0001 0.0055 0.7957 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 6 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0040 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 7 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 8 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 9 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 10 0.0221 <.0001 0.6048 0.0113 <.0001 0.0001 <.0001 <.0001 <.0001 11 0.6048 <.0001 0.0012 0.7957 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 12 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0040 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 13 <.0001 0.3020 0.0113 <.0001 <.0001 0.1418 <.0001 0.0001 0.0066 14 0.6048 <.0001 0.0012 0.7957 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 15 0.4382 <.0001 0.0005 0.6048 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 16 <.0001 0.0221 <.0001 <.0001 <.0001 0.2070 0.0016 0.0523 0.5130 17 <.0001 0.3020 0.0113 <.0001 <.0001 0.1418 <.0001 0.0001 0.0066 18 1.0000 <.0001 0.0055 0.7957 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 19 <.0001 0.6048 <.0001 <.0001 <.0001 0.8326 <.0001 0.0026 0.0747 20 0.0002 0.0113 0.3020 <.0001 <.0001 0.0073 <.0001 <.0001 0.0003 21 <.0001 0.0055 0.7957 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 22 <.0001 0.0005 <.0001 <.0001 0.5264 <.0001 0.0009 0.0360 23 0.0055 0.0005 0.0026 <.0001 0.0006 <.0001 <.0001 <.0001 24 0.7957 <.0001 0.0026 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 25 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 26 <.0001 0.5264 0.0006 <.0001 <.0001 0.0002 0.0086 0.1378 27 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0002 0.3020 0.0411 28 <.0001 0.0009 <.0001 <.0001 <.0001 0.0086 0.3020 0.3020 29 <.0001 0.0360 <.0001 <.0001 <.0001 0.1378 0.0411 0.3020

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The GLM Procedure Least Squares Means

S_CEREV LSMEAN TRAT LSMEAN Number 1 0.0000000 1 2 0.0000000 2 3 0.0000000 3 4 16.0000000 4 5 11.2500000 5 6 7.7500000 6 7 0.0000000 7 8 0.0000000 8 9 0.0000000 9 10 15.2500000 10 11 11.5000000 11 12 5.7500000 12 13 15.7500000 13 14 14.5000000 14 15 4.5000000 15 16 17.0000000 16 17 14.2500000 17 18 4.0000000 18 19 17.5000000 19 20 13.2500000 20 21 4.2500000 21 22 18.2500000 22 23 15.0000000 23 24 6.2500000 24 25 0.0000000 25 26 15.5000000 26 27 23.0000000 27 28 21.0000000 28 29 19.0000000 29

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The GLM Procedure Least Squares Means Least Squares Means for effect TRAT Pr > |t| for H0: LSMean(i)=LSMean(j) Dependent Variable: S_CEREV i/j 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1.0000 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 2 1.0000 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 3 1.0000 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 4 <.0001 <.0001 <.0001 0.0031 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.6301 5 <.0001 <.0001 <.0001 0.0031 0.0270 <.0001 <.0001 <.0001 0.0119 6 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0270 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 7 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 1.0000 <.0001 8 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 1.0000 <.0001 9 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 1.0000 1.0000 <.0001 10 <.0001 <.0001 <.0001 0.6301 0.0119 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 11 <.0001 <.0001 <.0001 0.0049 0.8724 0.0181 <.0001 <.0001 <.0001 0.0181 12 0.0004 0.0004 0.0004 <.0001 0.0007 0.2012 0.0004 0.0004 0.0004 <.0001 13 <.0001 <.0001 <.0001 0.8724 0.0049 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.7481 14 <.0001 <.0001 <.0001 0.3366 0.0395 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.6301 15 0.0049 0.0049 0.0049 <.0001 <.0001 0.0395 0.0049 0.0049 0.0049 <.0001 16 <.0001 <.0001 <.0001 0.5211 0.0004 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.2628 17 <.0001 <.0001 <.0001 0.2628 0.0569 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.5211 18 0.0119 0.0119 0.0119 <.0001 <.0001 0.0181 0.0119 0.0119 0.0119 <.0001 19 <.0001 <.0001 <.0001 0.3366 0.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.1511 20 <.0001 <.0001 <.0001 0.0803 0.2012 0.0007 <.0001 <.0001 <.0001 0.2012 21 0.0077 0.0077 0.0077 <.0001 <.0001 0.0270 0.0077 0.0077 0.0077 <.0001 22 <.0001 <.0001 <.0001 0.1511 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0569 23 <.0001 <.0001 <.0001 0.5211 0.0181 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.8724 24 0.0001 0.0001 0.0001 <.0001 0.0019 0.3366 0.0001 0.0001 0.0001 <.0001 25 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 <.0001 0.0001 1.0000 1.0000 1.0000 <.0001 26 <.0001 <.0001 <.0001 0.7931 0.0283 0.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.8956 27 <.0001 <.0001 <.0001 0.0056 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0023 28 <.0001 <.0001 <.0001 0.0450 0.0002 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.0217 29 <.0001 <.0001 <.0001 0.2251 0.0023 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.1305

130

Least Squares Means for effect TRAT Pr > |t| for H0: LSMean(i)=LSMean(j) Dependent Variable: S_CEREV i/j 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1 <.0001 0.0004 <.0001 <.0001 0.0049 <.0001 <.0001 0.0119 <.0001 <.0001 2 <.0001 0.0004 <.0001 <.0001 0.0049 <.0001 <.0001 0.0119 <.0001 <.0001 3 <.0001 0.0004 <.0001 <.0001 0.0049 <.0001 <.0001 0.0119 <.0001 <.0001 4 0.0049 <.0001 0.8724 0.3366 <.0001 0.5211 0.2628 <.0001 0.3366 0.0803 5 0.8724 0.0007 0.0049 0.0395 <.0001 0.0004 0.0569 <.0001 0.0001 0.2012 6 0.0181 0.2012 <.0001 <.0001 0.0395 <.0001 <.0001 0.0181 <.0001 0.0007 7 <.0001 0.0004 <.0001 <.0001 0.0049 <.0001 <.0001 0.0119 <.0001 <.0001 8 <.0001 0.0004 <.0001 <.0001 0.0049 <.0001 <.0001 0.0119 <.0001 <.0001 9 <.0001 0.0004 <.0001 <.0001 0.0049 <.0001 <.0001 0.0119 <.0001 <.0001 10 0.0181 <.0001 0.7481 0.6301 <.0001 0.2628 0.5211 <.0001 0.1511 0.2012 11 0.0004 0.0077 0.0569 <.0001 0.0007 0.0803 <.0001 0.0002 0.2628 12 0.0004 <.0001 <.0001 0.4228 <.0001 <.0001 0.2628 <.0001 <.0001 13 0.0077 <.0001 0.4228 <.0001 0.4228 0.3366 <.0001 0.2628 0.1112 14 0.0569 <.0001 0.4228 <.0001 0.1112 0.8724 <.0001 0.0569 0.4228 15 <.0001 0.4228 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.7481 <.0001 <.0001 16 0.0007 <.0001 0.4228 0.1112 <.0001 0.0803 <.0001 0.7481 0.0181 17 0.0803 <.0001 0.3366 0.8724 <.0001 0.0803 <.0001 0.0395 0.5211 18 <.0001 0.2628 <.0001 <.0001 0.7481 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 19 0.0002 <.0001 0.2628 0.0569 <.0001 0.7481 0.0395 <.0001 0.0077 20 0.2628 <.0001 0.1112 0.4228 <.0001 0.0181 0.5211 <.0001 0.0077 21 <.0001 0.3366 <.0001 <.0001 0.8724 <.0001 <.0001 0.8724 <.0001 <.0001 22 <.0001 <.0001 0.1112 0.0181 <.0001 0.4228 0.0119 <.0001 0.6301 0.0019 23 0.0270 <.0001 0.6301 0.7481 <.0001 0.2012 0.6301 <.0001 0.1112 0.2628 24 0.0011 0.7481 <.0001 <.0001 0.2628 <.0001 <.0001 0.1511 <.0001 <.0001 25 <.0001 0.0034 <.0001 <.0001 0.0204 <.0001 <.0001 0.0386 <.0001 <.0001 26 0.0386 <.0001 0.8956 0.6001 <.0001 0.4322 0.5125 <.0001 0.2958 0.2400 27 <.0001 <.0001 0.0042 0.0009 <.0001 0.0168 0.0006 <.0001 0.0279 0.0002 28 0.0002 <.0001 0.0356 0.0098 <.0001 0.1071 0.0074 <.0001 0.1577 0.0023 29 0.0031 <.0001 0.1891 0.0705 <.0001 0.4174 0.0566 <.0001 0.5426 0.0217

131

Least Squares Means for effect TRAT Pr > |t| for H0: LSMean(i)=LSMean(j) Dependent Variable: S_CEREV i/j 21 22 23 24 25 26 27 28 29 1 0.0077 <.0001 <.0001 0.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 2 0.0077 <.0001 <.0001 0.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 3 0.0077 <.0001 <.0001 0.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 4 <.0001 0.1511 0.5211 <.0001 <.0001 0.7931 0.0056 0.0450 0.2251 5 <.0001 <.0001 0.0181 0.0019 <.0001 0.0283 <.0001 0.0002 0.0023 6 0.0270 <.0001 <.0001 0.3366 0.0001 0.0001 <.0001 <.0001 <.0001 7 0.0077 <.0001 <.0001 0.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 8 0.0077 <.0001 <.0001 0.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 9 0.0077 <.0001 <.0001 0.0001 1.0000 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 10 <.0001 0.0569 0.8724 <.0001 <.0001 0.8956 0.0023 0.0217 0.1305 11 <.0001 <.0001 0.0270 0.0011 <.0001 0.0386 <.0001 0.0002 0.0031 12 0.3366 <.0001 <.0001 0.7481 0.0034 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 13 <.0001 0.1112 0.6301 <.0001 <.0001 0.8956 0.0042 0.0356 0.1891 14 <.0001 0.0181 0.7481 <.0001 <.0001 0.6001 0.0009 0.0098 0.0705 15 0.8724 <.0001 <.0001 0.2628 0.0204 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 16 <.0001 0.4228 0.2012 <.0001 <.0001 0.4322 0.0168 0.1071 0.4174 17 <.0001 0.0119 0.6301 <.0001 <.0001 0.5125 0.0006 0.0074 0.0566 18 0.8724 <.0001 <.0001 0.1511 0.0386 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 19 <.0001 0.6301 0.1112 <.0001 <.0001 0.2958 0.0279 0.1577 0.5426 20 <.0001 0.0019 0.2628 <.0001 <.0001 0.2400 0.0002 0.0023 0.0217 21 <.0001 <.0001 0.2012 0.0283 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 22 <.0001 0.0395 <.0001 <.0001 0.1519 0.0566 0.2657 0.7606 23 <.0001 0.0395 <.0001 <.0001 0.7931 0.0017 0.0168 0.1071 24 0.2012 <.0001 <.0001 0.0015 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 25 0.0283 <.0001 <.0001 0.0015 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 26 <.0001 0.1519 0.7931 <.0001 <.0001 0.0067 0.0442 0.1966 27 <.0001 0.0566 0.0017 <.0001 <.0001 0.0067 0.5211 0.2012 28 <.0001 0.2657 0.0168 <.0001 <.0001 0.0442 0.5211 0.5211 29 <.0001 0.7606 0.1071 <.0001 <.0001 0.1966 0.2012 0.5211

132

Anexo 4

Tabla 26. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto acuoso de Caléndula officinalis a diferentes concentraciones, obtenido a 25°C, por el método de tubo pequeño.

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

0 2 2 2 2 2 2 20 2 2 2 2 2 2 20 2 2 2 2 2 2 2






24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

0 2 2 2 2 2 2 20 2 1 2 2 2 2 20 2 2 2 2 2 2 2




h*: Horas

133

Nota: Las lecturas para las bacterias se realizaron a las 24 horas (h) y 48 h; para las levaduras las lecturas se realizaron a las 48 h y 72 h.


24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

0 2 1 2 2 2 2 20 2 2 2 2 2 2 20 2 2 2 2 2 2 2





Tabla 29. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto acuoso de Caléndula officinalis a diferentes concentraciones obtenido a 50°C por el método de tubo pequeño.

24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*

0 2 0 1 1 2 2 20 2 0 1 1 2 2 20 2 0 1 1 2 2 2

PATRÓN BLANCO



MICROORGANISMO


134


24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*

0 2 0 1 1 2 2 20 2 0 1 1 1 2 20 2 0 1 1 2 2 2

PATRÓN BLANCO



MICROORGANISMO



24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*

0 2 0 1 1 2 2 20 2 0 1 1 1 2 20 2 0 1 1 1 2 2





135


24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*

0 2 0 1 1 2 2 20 2 0 1 1 2 2 20 2 0 1 1 2 2 2

PATRÓN BLANCO



MICROORGANISMO


Tabla 33. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto acuoso de Tropaeolum majus a diferentes concentraciones obtenido a 25°C por el método de tubo pequeño.

24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*

0 2 1 1 1 2 2 20 2 1 1 2 2 2 20 2 1 1 2 2 2 2

PATRÓN BLANCO



MICROORGANISMO


136


24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*

0 2 1 1 2 2 2 20 2 1 1 2 2 2 20 2 1 1 2 2 2 2






24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*

0 2 1 1 2 2 2 20 2 1 1 2 2 2 20 2 1 1 2 2 2 2





137


24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*

0 2 1 1 2 2 2 20 2 1 1 2 2 2 20 2 1 1 2 2 2 2

PATRÓN BLANCO



MICROORGANISMO



24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*

0 2 0 0 1 1 1 20 2 0 0 1 1 2 10 2 0 0 1 1 2 2




h*: Horas. Nota: Las lecturas para las bacterias se realizaron a las 24 horas (h) y 48 h; para las levaduras las lecturas se realizaron a las 48 h y 72 h.

138

Tabla 38. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto acuoso de Tropaeolum majus a diferentes concentraciones obtenido a 50 °C por el método de tubo pequeño.

24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*

0 2 0 0 1 1 1 20 2 0 0 1 1 1 10 2 0 0 1 1 2 2






24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*

0 2 0 0 1 1 1 20 2 0 0 1 1 1 10 2 0 0 1 1 2 2





139


24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h* 24/48 h* 48/72 h*

0 2 0 0 1 1 1 10 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 2





Tabla 41. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae del extracto etanólico de Caléndula officinalis a diferentes concentraciones obtenido a 25°C, por el método de tubo pequeño.

24/48 h*48/72

h*24/48

h*48/72

h*24/48

h*48/72

h*0 2 0 0 1 1 1 20 2 0 0 1 1 1 20 2 0 0 1 1 2 2





140


24/48 h*48/72

h*24/48

h*48/72

h*24/48

h*48/72

h*0 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 1 20 2 0 0 1 1 1 2






24/48 h*48/72

h*24/48

h*48/72

h*24/48

h*48/72

h*0 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 1 20 2 0 0 1 1 2 2





141


24/48 h*48/72

h*24/48

h*48/72

h*24/48

h*48/72

h*0 2 0 0 1 1 1 20 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 1 2





Tabla 45. Aplicación a E. coli, S. aureus y S. cerevisiae, del extracto etanólico de Caléndula officinalis a diferentes concentraciones obtenido a 50°C, por el método de tubo pequeño.

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

0 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 2

PATRÓN BLANCO



MICROORGANISMO


142


24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

0 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 2






24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

0 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 2





143


24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

0 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 2






24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

0 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 1 20 2 0 0 1 1 1 2





144


24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

0 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 1 20 2 0 0 1 1 2 2






24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

0 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 2

PATRÓN BLANCO



MICROORGANISMO


145


24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

0 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 2

PATRÓN BLANCO



MICROORGANISMO



24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

0 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 2

PATRÓN BLANCO


250 125 62,5



MICROORGANISMO


146


24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

0 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 2

PATRÓN BLANCO


250 125 62,5



MICROORGANISMO



24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

0 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 2

PATRÓN BLANCO


250 125 62,5



MICROORGANISMO


147


148

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

24/48 h*

48/72 h*

0 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 20 2 0 0 1 1 2 2

PATRÓN BLANCO


250 125 62,5



MICROORGANISMO


Anexo 5

Tabla 57. Clasificación y Descripción de los microorganismos identificados en los

frotis de manos.

MICROORGANISMO CLASIFICACIÓN MACRO DESCRIPCIÓN MICRO DESCRIPCIÓN

I Bacteria filamentosa Color blanco, forma redondeada. Filamentos alargados, semejantes alas hifas de un hongo.

II Levadura Color rosado cremoso, formaredondeada.

Pseudomicelio.

III Levadura Color rojo, forma redondeada,consistencia cremosa.

Pseudomicelio compuesto depequeñas hifas.

IV Moho Color rojo - naranja y marrón, decentro firme y cuerpo algodonoso.

Presencia de largas hifas en suestructura.

V Moho (Aspergillus niger )

Color negro verdoso, centro sólido ycuerpo algodonoso.

Presencia de hifas y pequeñasesporas.

VI Bacteria Color amarilo - crema, de formaredondeada, apariencia mucoide.

Se distinguen cocos Gram positivos.

VII Bacteria Color roja, apariencia mucoide. Enterobacteria, bacilos Gramnegativos.

149

Anexo 6

MUESTRA 1 Extracto de Caléndula officinalis en Etanol al 95% - T (°C): 50 - Placa de agar PCA

PRE CONTEO POST CONTEO

MUESTRA 2 Extracto de Caléndula officinalis en Etanol al 95% - T (°C): 50 - Placa de agar PCA


MUESTRA 1 Extracto de Caléndula officinalis en Etanol al 95% - T (°C): 50 - Placa de agar PDA


150

MUESTRA 2

Extracto de Caléndula officinalis en Etanol al 95% - T (°C): 50 - Placa de agar PDA PRE CONTEO POST CONTEO

MUESTRA 1 Extracto de Caléndula officinalis en Etanol al 95% - T (°C): 50 - Placa de agar MC PRE CONTEO POST CONTEO

MUESTRA 2 Extracto de Caléndula officinalis en Etanol al 95% - T (°C): 50 - Placa de agar MC


151

Anexo 7

MUESTRA 1 Extracto de Tropaeolum majus en Etanol al 95% - T (°C): 50 - Placa de agar PCA


MUESTRA 2 Extracto de Tropaeolum majus en Etanol al 95% - T (°C): 50 - Placa de agar PCA PRE CONTEO POST CONTEO

MUESTRA 1 Extracto de Tropaeolum majus en Etanol al 95% - T (°C): 50 - Placa de agar PDA PRE CONTEO POST CONTEO

152

MUESTRA 2 Extracto de Tropaeolum majus en Etanol al 95% - T (°C): 50 - Placa de agar PDA PRE CONTEO POST CONTEO

MUESTRA 1 Extracto de Tropaeolum majus en Etanol al 95% - T (°C): 50 - Placa de agar MC PRE CONTEO POST CONTEO

MUESTRA 2 Extracto de Tropaeolum majus en Etanol al 95% - T (°C): 50 - Placa de agar MC PRE CONTEO POST CONTEO

153