第十二第一节 概述 一、免疫测定分类 二、免疫测定原理 三、固相免疫测定 四、固相膜的特点 五、常用的固相膜 六、固相膜的技术要求

第十二章　固相膜免疫测定

第二节 免疫金标记技术 一、胶体金的制备第三节 膜载体免疫测定的种类与原理 一、膜固相免疫测定的特点 二、固相微孔膜测定种类 三、免疫渗滤试验和免疫层析试验 四、酶联免疫斑点试验 五、免疫印迹 六、放射免疫沉淀试验

思考题小结

随着免疫学技术和相关生物化学技术的发展，检测方法上派生出了多种类型的固相膜免疫快速检测试验。该类试验的最大特点是不需要大型设备，对检测人员稍加培训即能掌握操作要求和判定标准。

　第一节 概述

标记免疫测定

放射免疫测定 　 1960’酶免疫测定 　　 1970’荧光免疫测定 1980’－ 1990’化学发光免疫测定 1990’－膜固相免疫测定 1990’－

一、免疫测定分类

免疫浊度测定Ag + Ab AgAb + Ab

标记免疫测定 Ag + Ab* Ag Ab* + Ab* （ B）

（ F）

二、免疫测定原理

利用抗原抗体反应检测标本中微量物质

　抗原 +抗体 抗原抗体复合物

Ag +Ab 　 Ag * Ab

三、固相免疫测定

B 与 F 分离

Ab* Ab*Ag + Ag + Ab* Ab Ab

四、固相膜的特点

多孔性 毛细管作用

非共价键高度吸附抗体或抗原 高度敏感性

易于漂洗 操作简便

五、常用的固相膜

玻璃纤维素 (fiberglass) 膜

尼龙 (nylon) 膜

聚偏氟乙稀 ( polyvinylidene fluoride ， PVDF) 膜

硝酸纤维素（ nitrocellulose ， NC ）膜

六、固相膜的技术要求

孔径： 0.2~0.6 μm

流速：以 ml/cm2/min 表示

蛋白质结合力：吸附力很强，以μg/cm2表示

均一性

固相 NC 膜

第二节　免疫金标记技术

免疫金标记技术 (Immunogold labelling techiq

ue) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（ immunogold

silver staining ， IGSS ）。

一、胶体金制备

　胶体金（ colloidal gold ）的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶（ gold solution ）。

胶体金的制备及特性

胶体金粒径 1%柠檬酸钠加入量 胶体金特性

（ nm) （ ml)* 呈色 lmax(nm)

16 2.00 橙色 518

24.5 1.50 橙红色 522

41 1.00 红色 525

71.5 0.70 紫色 535

* 还原 100 ml0.01%HAuCl4 所需量

胶 体 金（ Colloidal Gold ）15~60 nm

优 质 劣 质

胶体金结合物（ Conjugate ）

膜固相免疫测定的特点

第三节　膜载体免疫测定的种类与原理

优点 不足之处简便，快速 敏感度略低，价格略高（与 ELISA比）单份测定 精密度较差，质控困难

保存期长（优质试剂） 稳定性较差（普通试剂）可测定物范围广（主要为定性试验） 不易制备定量、半定量试剂

感染性疾病的诊断妊娠、排卵的诊断

肿瘤标志心肌标志滥用药物

固相微孔膜测定种类

斑点金免疫渗滤试验 (dot immunogold filtration assay, DIGF

A)

免疫层析试验（ immunochromatography assay, ICA ）

斑点 ELISA (dot enzyme linked immunosorbent assay, Dot-E

LISA)

酶联免疫斑点试验 (enzyme linked immunospot , ELISPOT)

免疫印迹法 (immunoblotting test, IBT)

放射免疫沉淀试验 (radioimmunoprecipitation assay, RIPA)

一、免疫渗滤测定 (IFA)

IFA—— 双抗体夹心法测抗原

A B

IFA—— 结果判断

阳性阳性

InstantChekInstantChekHIV 1+2HIV 1+2的结果判断的结果判断

( ( 图图 像像 ))

阴性阴性 测定无效测定无效

二、免疫层析测定（ ICA ）

ICA 试剂条

样品垫

结合物垫

NC膜

吸水垫

ICA—— 双抗体夹心法测抗原

ICA—— 间接法测抗体

ICA 结果观察

阳性

阴性

无效

IFA 与 ICA 的比较

IFA ICA

试剂形式 渗滤装置及附加试剂

试剂条

试剂保存 4~8℃ 6个月 室温一年

操作步骤 3~5 1

观察时间 3 min 3~20 min

阳性反应颜色浓度

操作结束颜色不变

颜色逐渐加深

IFA 穿流（ FLOW THROUGH）

ICA 横流（ LATERAL FLOW）

GIFA 技术的发展（间接法测抗体）

阳性

阴性

固相膜 固相抗原

待测抗体

金标记抗人IgG抗体

人IgG

固相抗人IgG抗体

快速检测（渗滤法）原理图

GIFA 技术的发展

第一代 1988

HIVCHEK（ DuPont）

单点，5~10 分钟，血清，金标试剂瓶装冻干品

改进抗原 HIV 1+2 ，提高敏感度和特异性，缩短反应时间，减少步骤，样品多样化 。

第八代 INSTANTCHEK HIV 1+22 点（测试 +控制）金标试剂：单人份、液体样品：血清、血浆、全血、 尿液

第九 ~十二代

研制中 单一试剂

ICA 技术的发展

1990年 ABBOTT 公司 胶体硒标记 ICA

Unipath 公司 CLEARVIEW 立明衣原体 彩色胶乳标记 ICA

ROCHE Cardiac Reader TnT 定量 0.1~3 ng/ml 合成 TnT质控点

IFA肌红蛋白双孔法

S：测定孔 C：定量质控 100μg/L

IFA微量白蛋白单孔法

T：测定孔 C1 ：定量质控 30 mg/L C2 ：定量质控 200 mg/L 结果判定：（ -） <30（ +） 30~100 、（ ++ ） 100～ 200（ +++ ） >200 mg/L

ICA甲胎蛋白（ AFP）

参考值： 30 μg/L肝癌诊断值： >400 μg/L

结果判定：（ -） <30 （ +） 30~200 （ ++ ） 200~400 （ +++ ） >400 μg/L

S CT

C2 C1

测定线

对照线

半定量测定

三、斑点酶免疫吸附试验 —— Dot-ELISA

四、酶联免疫斑点试验—— ELISPOT

• 20 世纪 80 年代，国外的科研工作者根据 ELI

SA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌 B 细胞和细胞因子分泌 T 细胞的酶联免疫斑点试验 (enzyme linked immunospot ,

ELISPOT) 。

ELISPOT 检测原理

细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后， 被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。 BCIP/NBT 底物孵育后， PVDF 孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过 CTL 公司生产的 ELISP

OT 酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。

ELISPOT 分析仪解决以下问题

哪些斑点是抗原特异性 T 细胞产生的（此斑点具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没有 T 细胞研究价值）

斑点大小的意义 在对不同细胞因子计数和分析时，如何定义斑点最大

和最小尺寸 如何从单个细胞基础上分析 实验精确度有多高？如果一个细胞产生相似的细胞因

子，在多大程度上会干扰分析结果？ 几次重复实验才能使结果更有意义？

ELISAPOT

ELISPOT 结果判断

方法学评价

五、免疫印迹法—— Westernblot法

原理

Westernblot—— 抗原表位可能被破坏而漏检

六、放射免疫沉淀试验

原理

放射免疫沉淀试验——抗原表位不会破坏

思考题1. 叙述固相膜免疫测定概念。

2 ．膜的种类与特性是什么？

3 ．膜载体免疫测定的种类有哪些？

4 ．斑点金免疫渗滤试验 (dot immunogold filtration assay,

DIGFA) 的原理是什么？

5 ．免疫层析试验（ immunochromatography assay, IC

A ）的原理是什么？

6 ．斑点 ELISA (dot enzyme linked immunosorbent assay, D

ot-ELISA) 原理是什么？

7 ．酶联免疫斑点试验 (enzyme linked immunospot , ELISP

OT) 原理是什么？

8 ．免疫印迹法 (immunoblotting test, IBT) 原理是什么？

9 ．免疫印迹法 (immunoblotting test, IBT) 注意事项是什么？

10 ．放射免疫沉淀试验 (radioimmunoprecipitation assay, R

IPA) 原理是什么？

小 结

固相膜免疫测定与 ELISA 相类似，其特点是以微孔膜作为固相。固相膜的特点在于其多孔性，像滤纸一样，固相膜可被液体穿过流出，液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行，利用这种性能建立了多种类型的快速检验方法。固相膜免疫测定包括了斑点金免疫渗滤试验、免疫层析试验、斑点 ELISA 、酶联免疫斑点试验、免疫印迹法、放射免疫沉淀试验。