รายงานผลการวจย

เร�อง

การศกษาสารออกฤทธ�ทางชวภาพจากแบคทเรยรดวสคลอเรตเพ�อใชประโยชน

ทางการเกษตร

Study on bioactive compounds from chlorate reducing bacteria for

agricultural uses

โดย

ศรกาญจนา คลายเรอง และคณะ

มหาวทยาลยแมโจ

2557

รหสงานวจย มจ.1-56-005

รายงานผลการวจย

เร�อง การศกษาสารออกฤทธ�ทางชวภาพจากแบคทเรยรดวสคลอเรตเพ�อใชประโยชน

ทางการเกษตร

Study on bioactive compounds from chlorate reducing bacteria for

agricultural uses

ไดรบการจดสรรงบประมาณวจย ประจาป 2556

จานวน 262,000 บาท

หวหนาโครงการ นางสาวศรกาญจนา คลายเรอง

ผรวมโครงการ นายฐปน ช�นบาล

นางปยะนช เนยมทรพย

นางสาวนลน วงศขตตยะ

งานวจยเสรจส�นสมบรณ

30 /09/2557

ก

สารบญ

หนา

สารบญตาราง ข

สารบญภาพ ค

บทคดยอ 1

Abstract 2

คานา 3

วตถประสงคของงานวจย 5

ประโยชนท�คาดวาจะไดรบ 5

การตรวจเอกสาร 6

อปกรณและวธการ 26

ผลการทดลองและวจารณ 35

สรปผล 64

เอกสารอางอง 65

ภาคผนวก 69

ข

สารบญตาราง

หนา

ตารางท� 1 การจาแนกเช�อราท�แยกไดจากตวอยางใบลาไยท�มอาการของโรค 36

ตารางท� 2 ผลการทดลองการยบย �งเช�อรา รหส L4.1B 37

ตารางท� 3 เช�อแบคทเรยคลอเรตท�สามารถยบย �งการเจรญของเช�อรา Meliola L4.4B 38

ตารางท� 4 ผลการทดลองการยบย �งเช�อรา รหส L5.2B 38

ตารางท� 5 ผลการทดลองการยบย �งเช�อรา รหส L5.2A 40

ตารางท� 6 ลกษณะทางสณฐานวทยาของแบคทเรยท�สามารถยบย �งเช�อรากอโรคในลาไย 42

ตารางท� 7 ลกษณะทางสณฐานวทยาของแบคทเรยท�สามารถยบย �งเช�อรากอโรคในลาไย 45

ตารางท� 8 ปรมาณ IAA ในอาหาร Nutrient broth (NB) และ Tryptic soy broth (TSB) 46

ตารางท� 9 ผลของ pH ตอการผลต IAA ของเช�อไอโซเลต 10-2.1 50

ตารางท� 10 ผลของ pH ตอการผลต IAA ของเช�อไอโซเลต 6-3.1 50

ตารางท� 11 ผลของ pH ตอการผลต IAA ของเช�อไอโซเลต 9-4C.2 50

ตารางท� 12 ผลของ pH ตอการผลต IAA ของเช�อไอโซเลต 9-4D.1 50

ตารางท� 13 ผลของ pH ตอการผลต IAA ของเช�อไอโซเลต C9-24.2 50

ตารางท� 14 ลกษณะทางสณฐานวทยาของแบคทเรยท�ผลต IAA 55

ตารางท� 15 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน McFarland 73

ตารางท� 16 คาการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 เล�ยงในอาหาร NB 75

ตารางท� 17 คาการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 เล�ยงในอาหาร TSB 76

ตารางท�18 คาการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 ท�ไมไดเตม tryptophan 77

ตารางท� 19 คาการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 ท�เตม tryptophan เขมขน 200 mg/ml 78

ตารางท� 20 คาการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 ท�เตม tryptophan เขมขน 400 mg/ml 79

ตารางท� 21 คาการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 ท�เตม tryptophan เขมขน 600 mg/ml 80

ตารางท� 22 คาการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 ท� pH 5 81

ตารางท� 23 คาการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 ท� pH 6 82

ตารางท� 24 คาการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 ท� pH 7 83

ตารางท� 25 คาการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 ท� pH 8 84

ตารางท� 26 คาการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 ท� pH 9 85

ตารางท� 27 การคดเลอกแบคทเรยท�ผลต IAA โดยเรยงลาดบจากมากไปนอย 90

ค

สารบญภาพ

หนา

ภาพท� 1 ปฏกรยาการรดวสคลอเรต 9

ภาพท� 2 โครงสรางออกซนธรรมชาต(Natural auxins) 16

ภาพท� 3 โครงสรางออกซนสงเคราะห (Synthetic auxins) 17

ภาพท� 4 ชววถการสงเคราะห indole-3-acetic acid (IAA) ในพช 18

ภาพท� 5 ชววถสงเคราะห Indole-3-Acetic acid (IAA) ในแบคทเรย 21

ภาพท� 6 ชววถท�เปนอสระตอ tryptophan ท�งในพชและแบคทเรย 22

ภาพท� 7 กลไกการทางานรวมกนระหวางพชกบแบคทเรยท�ผลต IAA และม

เอนไซม ACCdeaminase

25

ภาพท� 8 ตวอยางช�นสวนใบพชท�มอาการของโรคท�เกดจากเช�อราท�ใชในการ

แยกตวอยางเช�อบ (ก) ใบท�มจดสดา (ข) ใบท�มจดสสม

35

ภาพท� 9 การยบย �ง Collectrichum L5.2A และ Phomopsis L5.2B สาเหตโรคใบ

จดดาของเช�อแบคทเรยสลายคลอเรต

39

ภาพท� 10 แบคทเรยสลายคลอเรตท�มฤทธ� ยบย �งเช�อรากอโรคในลาไย โดยใชโดย

ใชวธการทดสอบแบบ Dual culture

40

ภาพท� 11 ลาดบนวคลโอไทดของเช�อแบคทเรย ไอโซเลท K5-3C (ความยาว 320

คเบส) เปรยบเทยบกบฐานขอมล NCBI โดยแสดงความเหมอนตอ

ลาดบนวคลโอไทดของเช�อPseudomonas mendocina strain B6-1

100%

44

ภาพท� 12 ผลของความเขมขน tryptophan ตอการผลต IAA ของเช�อแบคทเรย

สลายคลอเลต 5 ไอโซเลตคอ ก. 10-2.1, ข. 6-3.1, ค. 9-4C.2, ง. 9-

4D.1 และ จ. C9-24.2 แสดงความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต

ตาม Multiple Range Test (P<0.05)

48

ภาพท� 13 ผลของออกซเจนดวยการเขยา(shaking) ตอการผลต IAA ของเช�อท�ง 5

ไอโซเลตคอ ก.เช�อไอโซเลต 10-2.1, ข. เช�อไอโซเลต 6-3.1, ค. เช�อ

ไอโซเลต 9-4C.2, ง. เช�อไอโซเลต 9-4D.1 และ จ.เช�อไอโซเลต C9-

24.2

53

ง

สารบญภาพ (ตอ)

หนา

ภาพท� 14 ลาดบนวคลโอไทดของเช�อแบคทเรยไอโซเลท 10-2.1(ความยาว 561 ค

เบส) เม�อเทยบกบฐานขอมล NCBI โดยแสดงความเหมอนตอลาดบน

วคลโอไทดของเช�อ Pseudomonas sp. JC5 100%

56

ภาพท� 15 ลาดบนวคลโอไทดของเช�อแบคทเรยไอโซเลท 6-3.1 (ความยาว 531 ค

เบส) เม�อเทยบกบฐานขอมล NCBI โดยแสดงความเหมอนตอลาดบน

วคลโอไทดของเช�อ Pseudomonas sp. F15100%

57

ภาพท� 16 ลาดบนวคลโอไทดของเช�อแบคทเรยไอโซเลท 9-4C.2 (ความยาว 521 ค

เบส) เม�อเทยบกบฐานขอมล NCBI โดยแสดงความเหมอนตอลาดบน

วคลโอไทดของเช�อ Pseudomonas sp. I12B-00129 100%

58

ภาพท� 17 ลาดบนวคลโอไทดของเช�อแบคทเรยไอโซเลท 9-4D.1 (ความยาว 481 ค

เบส) เม�อเทยบกบฐานขอมล NCBI โดยแสดงความเหมอนตอลาดบน

วคลโอไทดของเช�อ Micrococcus sp. SubaUpMs28 100%

59

ภาพท� 18 ลาดบนวคลโอไทดของเช�อแบคทเรยไอโซเลท C9-24.2 (ความยาว 411

คเบส) เม�อเทยบกบฐานขอมล NCBI โดยแสดงความเหมอนตอลาดบน

วคลโอไทดของเช�อ Pseudomonas sp. JC5100%

60

ภาพท� 19 กราฟมาตรฐาน IAA เล�ยงในอาหาร NB 75

ภาพท� 20 กราฟมาตรฐาน IAA เล�ยงในอาหาร TSB 76

ภาพท� 21 กราฟมาตรฐาน IAA ท�ไมไดเตม tryptophan 77

ภาพท� 22 กราฟมาตรฐาน IAA ท�เตม tryptophan เขมขน 200 mg/ml 78

ภาพท� 23 กราฟมาตรฐาน IAA ท�เตม tryptophan เขมขน 400 mg/ml 79

ภาพท� 24 กราฟมาตรฐาน IAA ท�เตม tryptophan เขมขน 600 mg/ml 80

ภาพท� 25 กราฟมาตรฐาน IAA ท� pH 5 81

ภาพท� 26 กราฟมาตรฐาน IAA ท� pH 6 82

ภาพท� 27 กราฟมาตรฐาน IAA ท� pH 7 83

ภาพท� 28 กราฟมาตรฐาน IAA ท� pH 8 84

ภาพท� 29 กราฟมาตรฐาน IAA ท� pH 9 85

การศกษาสารออกฤทธ�ทางชวภาพจากแบคทเรยรดวสคลอเรตเพ�อใชประโยชนทาง

การเกษตร

Study on bioactive compounds from chlorate reducing bacteria for agricultural

uses

ศรกาญจนา คลายเรอง ฐปน ช�นบาล ปยะนช เนยมทรพย และนลน วงศขตตยะ

Srikanjana Klayraung, Tapana Cheunbarn, Piyanuch Niumsup, and Nalin Wongkattiya

คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยแมโจ จ.เชยงใหม 50290

-----------------------------------

บทคดยอ

เช�อแบคทเรยสลายคลอเรตจานวน 91 ไอโซเลตท�แยกไดจากดนสวนลาไยถกนามาศกษา

การผลตกรดอนโดลอะซตก (Indol-3-acitic acid; IAA) พบวาม 45 ไอโซเลต สามารถผลต IAA ได

ในอาหาร Tryptic soy broth ท�เตม tryptophan ท�สภาวะต�งไว ในจานวนน�ม 5 ไอโซเลต ท�สามารถ

ผลต IAA ไดปรมาณสง (>10 g/mL) ซ�งจากการจาแนกดวยการหาลาดบเบสยน 16SrRNA พบวา

อยในจนส Pseudomonas sp. และ Micrococcus sp. ย�งไปกวาน�นจากการศกษา พบวา ความเขมขน

ของ tryptophan และ pH มผลตอการผลต IAA ของเช�อแบคทเรย อยางมนยสาคญ โดย

Pseudomonas ผลต IAA ไดสงสดท� pH 7 ในขณะท� Micrococcus sp. ผลตไดสงท� pH9 และในการ

เพาะเล�ยงท�มการเขยา สงผลใหเช�อแบคทเรยสวนใหญผลต IAA ไดมากกวาสภาวะต�งไวถง 100%

คาสาคญ: แบคทเรยสลายคลอเรต, สารออกฤทธ� ทางชวภาพ, ฤทธ� ตานจลนทรย, ออกซน, การละลายฟอสเฟต

2

Abstract

A total of 91 isolates was investigated for indole-3-acetic acid (IAA) production in chlorate-

degrading bacteria from longan plantation soils. The forty five bacterial isolates produced IAA in

tryptic soy broth containing L-tryptophan at static condition. Among these, only 5 isolates

producing high amount of IAA (>10 µg/mL of IAA) were identified as Pseudomonas sp. and

Micrococcus sp. using 16S rRNA base sequencing technique. Further investigation was revealed

that concentration of tryptophan and pH influenced the IAA production significantly. In this

study, maximum IAA production of Pseudomonas sp. was observed at pH7 (13.6-31.4 µg/mL),

whereas Micrococcus sp. showed that highest IAA production (17.5 µg/mL) at pH9. Furthermore,

in condition of shaking flake gave higher concentration of IAA that in static condition with 100

%.

Keywords: Chlorate reducing bacteria, bioactive compound, antagonistic activity, auxin, phosphate solubilizing

คานา

ลาไยเปนท�สาคญอยางหน�งในภาคเหนอ โดยสามารถสงออกเปนสนคาเกษตรในรปลาไย

สด ลาไยกระปอง ลาไยแชแขงและลาไย ทารายไดจากการสงออกปละไมต�ากวา 5,000 ลานบาท

ปญหาหน�งท�เกษตรกรผปลกลาไยมกเผชญในอดต คอการออกดอกไมสม�าเสมอของตนลาไย

เน�องจากการออกดอกตดผลข�นอยกบความหนาวเยน จงไดมการนาสารโพแทสเซยมคลอเรต

สามารถกระตนใหลาไยออกดอกนอกฤดได ถงแมวาจะมรายงานวาไมมอนมลคลอเรตตกคางในผล

ลาไยสก และมความปลอดภยในการบรโภคกตาม แตในขณะเดยวกนสารโพแทสเซยมคลอเรต

สามารถท�จะใชในการเหน�ยวนาใหเช�อราใหเกดการกลายพนธในระดบหองปฏบตการ และม

รายงานการศกษาผลของการเตมคลอเรตตอลาไยในการทดลองระดบกระถางโดยดผลตอ

arbuscular mycorrhizal fungi การดดซมฟอสฟอรส และชวมวลของพช พบวาการเพ�มปรมาณของ

คลอเรตมผลในการลดจานวนเช�อรา mycorrhiza ดงกลาว อกท�งยงลดอตราการดดซมฟอสฟอรส

และชวมวลดวย (Li et al., 2008) ดงน�นการใชคลอเรตจงอาจสงผลกระทบตอระบบนเวศของ

จลนทรย ซ�งศรกาญจนา และคณะ ไดรบทนสนบสนนจากคณะกรรมการวจยแหงชาต ประจาป

งบประมาณ 2554 ในเร�อง “การสลายคลอเรตโดยแบคทเรยรดวสคลอเรตท�แยกไดจากดนและกาก

ตะกอนน� าเสย” เพ�อศกษาหาผลกระทบของการใชคลอเรตตอนเวศวทยาของจลนทรยในดน และ

เอนไซมท�เก�ยวของกบวฏจกรของสาร ซ�งแสดงถงความสมบรณของดน นอกจากน� ยง ทาการแยก

และจาแนกเช�อ chlorate reducing bacteria จากแปลงปลกลาไย และกากตะกอนน� าเสยจากโรงงาน

อตสาหกรรม เพ�อเปนแนวทางการใชประโยชนรวมกบการใชสารโพแทสเซยมคลอเรตในการ

กระตนการออกดอกนอกฤดของลาไย (อยระหวางดาเนนการวจย)

จากงานวจยดงกลาวขางตน output สาคญท�ได หลงจากดาเนนงานแลวเสรจมามากกวา 50

เปอรเซนต คอเช�อแบคทเรยในกลมของ chlorate reducing bacteria จานวนหน�งท�แยกได ซ�งผวจย

ตองการท�จะนามาใชใหเกดประโยชนสงสดในงานทางดานการเกษตร โดยมองจากมมมองปญหา

ท�วาส�งท�เกษตรกรตองการในการผลตผลไมคอ ตองการไดผลผลตท�มปรมาณมาก และไดราคาสง

ซ�งท�งสองประเดนน� จะไดมากตอเม�อเกษตรกรสามารถผลตผลไมนอกฤดกาลได ผลตโดยไมข�นกบ

ดนฟาอากาศ ตนไมตองเจรญเตบโตไดด และไมมโรคพชมาเบยดเบยน ซ�งสาหรบลาไยแลว

หลงจากท�เกษตรกรสามารถทาใหลาไยออกดอกนอกฤดกาลไดแลว ปญหาท�ยงคงมอยคอมรายงาน

4

การเกดโรคบางอยางมากข�นเชน Phytophthora foliage blight และ fruit rot ซ�งมสาเหตมาจากเช�อรา

Phytophthora และโรค Witches’ broom ท�มสาเหตมาจาก Phytoplasma นอกจากน� ยงมเช�อรากอ

โรคอ�นๆ ท�พบท�งในชวงกอนเกบ และหลงเกบเก�ยวผลผผลตซ�งอาจกอใหเกดความเสยหายไดเชน

Colletotrichum sp., Pestalotiosis sp., Cladosporium sp., Fusarium sp. และ Aspergillus niger

(Coates et al., 1999) โดยการควบคมปญหาโรคเหลาน� โดยสวนใหญเกษตรกรจะใชสารเคมในการ

กาจดซ�งอาจสงผลในทางลบตอสขภาพท�งตอผบรโภค และตวเกษตรกรผใช ดงน�นการควบคมโดย

ชววธจงไดรบความสนใจและมผศกษากนเพ�มข�น เชน การใชเช�อราเอนโดไฟตเพ�อควบคมโรคใบ

จดดาลาไย (วนพร และพภพ, 2552) แตยงมรายงานการศกษาการใชแบคทเรยเพ�อควบคมโรคลาไย

คอนขางนอย หรอไมมเลย โดยเฉพาะแบคทเรยในกลมของ chlorate reducing bacteria ซ�งจากการ

วจยพบวา chlorate reducing bacteria สวนหน�งเปนเช�อแบคทเรยในจนส Pseudomonas ซ�งเปนเช�อ

แบคทเรยท�มรายงานการยบย �งเช�อกอโรคพชได (Cozoria, 2006) ซ�งกลไกการยบย �งเช�อกอโรคพช

สวนหน�งมาจากการสรางสารปฏชวนะของเช�อแบคทเรย ในขณะเดยวกนเช�อ Pseudomonas น� ยงม

รายงานการผลตฮอรโมนพชในกลมของออกซน (Kang et al., 2006) ซ�ง ชรสนนท (2548) ได

รายงานไววาฮอรโมนพชมผลตอการเจรญเตบโตของผลลาไย ซ�งท�งสารปฏชวนะ และฮอรโมนพช

น� เปนสารออกฤทธ� ทางชวภาพท�สาคญท�สามารถนามาประยกตใชทางการเกษตรได นอกจากน� เช�อ

ดงกลาวยงมขอมลวาสามารถละลายฟอสเฟตอนนทรยใหอยในรปท�เปนประโยชนสาหรบการ

เจรญเตบโตของพช (Rodríguez and Fraga, 1999)

จากขอมลดงกลาวขางตนจะเหนไดวาเช�อดงกลาวมศกยภาพท�งในการควบคมโรค และ

สงเสรมการเจรญเตบโตของพช ซ�งเปนคณลกษณะท�เหมาะสมท�จะนาไปใชในทางการเกษตรได จง

เปนท�นาสนใจวาเช�อ chlorate reducing bacteria อ�นๆ ท�มอยมคณสมบตดงกลาวหรอไม ดงน�น

โครงการศกษาคร� งน� จงเปนการศกษาเพ�อเปนการใชประโยชนจากเช�อ chlorate reducing bacteria

ในทางการเกษตร เพ�อเปนทางเลอกท�จะไมตองใชสารเคม เปนพ�นฐานในการนาไปสการพฒนาให

อยในรปแบบท�เหมาะสมสาหรบการใชงาน และเตรยมความพรอมพรอมสการทาการผลตลาไยดวย

วถของเกษตรอนทรย รวมถงเปนการใชประโยชนจากทรพยากรจลนทรยท�มอยใหไดประโยชน

สงสด

5

วตถประสงคของงานวจย

1. เพ�อทดสอบความสามารถของเช�อ chlorate reducing bacteria ในการยบย �งเช�อจลนทรย

กอโรคในลาไย

2 เพ�อทดสอบความสามารถของเช�อ chlorate reducing bacteria ในการผลตฮอรโมนพช

3 เพ�อทดสอบความสามารถของเช�อ chlorate reducing bacteria ในการละลายฟอสเฟต

4 เพ�อศกษาปจจยบางประการท�มผลตอฤทธ� ตานเช�อจลนทรยกอโรค การผลตฮอรโมนพช

และความสามารถในการละลายฟอสเฟต

ประโยชนท�คาดวาจะไดรบ

1. ไดเช�อแบคทเรยรดวสคลอเรต และทราบชนดของแบคทเรยรดวซคลอเรตในตวอยางดนสวน

ลาไย

2. ทราบถงผลกระทบของคลอเรตตอนเวศวทยาของจลนทรยในดน

3. นาความรท�ไดไปใชวางแผนการใชคลอเรตรวมกบการใชแบคทเรยรดวซคลอเรตในการกระตน

การออกดอกนอกฤดของลาไยไดอยางมประสทธภาพ

4. สามารถนาความรท�ไดใชลดความขดแยง และสรางความเช�อม�นใหแกผบรโภคท�ตระหนกถง

ความสาคญของส�งแวดลอม

การตรวจเอกสาร

1. ขอมลพ�นฐานของลาไย และผลตลาไย

ลาไย เปนพชท�อยในตระกล Sapindaceae ช�อวทยาศาสตรไดแก Euphoria longana

Camb. Eu phoria longa Strend. Nephelium longana Camb. และ Dimocarpus longan Lour. เปนไม

ผลก�งเมองรอนมถ�นกาเนดในประเทศจนตอนใตทางแถบอนเดยตอนใต และประเทศไทยตอนบน

ปจจบนมการกระจายการปลกไปสทวปออสเตรเลย อเมรกาเหนอ และเอเชยใต (พาวนและคณะ,

2547)

ลาไยจดเปนไมผลเศรษฐกจสาคญในการสรางสภาวะเศรษฐกจใหแกเกษตรกร

โดยเฉพาะเกษตรกรในจงหวดภาคเหนอของประเทศไทย เชน จงหวดเชยงใหม และลาพน โดยม

รายไดจากการสงออกไมต �ากวา 5,000 ลานบาทตอป รฐบาลจงมนโยบายในการสงเสรม สนบสนน

การปลกและผลตลาไย โดยกาหนดใหลาไยเปนผลไมยอดเย�ยม 1 ใน 4 ชนดท�ตองผลกดนให

เกษตรกรขยายการปลกและการผลตใหเพ�มมากข�น (พงษศกด� และคณะ, 2542)

ในป พ.ศ.2554 ไดมรายงานการขยายการเพาะปลกลาไยในประเทศไทยไปท�งส�น 27

จงหวด ครอบคลมพ�นท�ในภาคเหนอ ภาคตะวนออกเฉยงเหนอ และภาคกลาง รวมเน�อท�การ

เพาะปลกท�งส�น 966,589 ไร (สานกงานเศรษฐกจการเกษตร, 2555) ซ�งโดยปกตในการออกของ

ลาไยจะตองอาศยความหนาวเยน ดงน�นจงมการใชวธการบงคบใหลาไยออกดอกฤดกนเปนอยาง

มาก จากรายงานการผลตของ สภาภรณ และคณะ (2553) ในพ�นท� 3 จงหวด คอ เชยงใหม ลาพน

และจนทบร มการบงคบใหออกดอกนอกฤดถง 60.9%

การผลตลาไยนอกฤดเพ�อเปนการแกปญหาการผลผลตลนตลาดและการขาดแคลน

แรงงานในการเกบเก�ยวผลผลตรวมท�งสภาพอากาศท�แปรปรวนมผลตอการออกดอกตดผลของ

ลาไย วธการท�เกษตรกรนามาใชในการบงคบใหลาไยออกดอกท�เกษตรกรใชมากท�สด คอ การใช

สารโพแทสเซยมคลอเรต (พาวนและคณะ, 2547)

การใชสารโพแทสเซยมคลอเรตในการกระตนใหลาไยออกดอกเพ�อการผลตลาไยจะใช

การพนทางใบ และการฉดเขาตนลาไย ซ�งการใชปรมาณท�ใหผลจะข�นอยกบความเขมขนของสารท�

ใช นอกจากน� ยงข�นอยกบฤดกาล รวมท�งอายของใบ แตวธการท�ทาไดงายคอการผสมน� าราดบนดน

บรเวณใตทรงพม หรอการหวานสารน�บรเวณใตทรงพมแลวรดน� าตาม โดยปรมาณสาร

7

โพแทสเซยมคลอเรตท�จะใหกบตนลาไยจะข�นอยกบพนธของลาไย และขนาดทรงพมของลาไย

โดยความเขมขนของโพแทสเซยมคลอเรตท�ใชอยท� 10-900 กรมตอตน ซ�งเปนแนวทางเทาน�น

จะตองมการปรบเปล�ยนใหเหมาะสมกบพ�นท�เพาะปลกดวย (นพดลและคณะ, 2543; พาวนและ

คณะ, 2547; Manochai et al., 2005)

2. สารโพแทสเซยมคลอเรต

สารโพแทสเซยมคลอเรต (potassium chlorate; KClO3) คอสารเคมท�มลกษณะเปน

ของแขง สขาว ละลายน� าได เม�ออยในรปผลกของสารบรสทธ� จะไมมส มสมบตเปนสาร

ออกซไดซ (oxidizing agent) ท�รนแรง โดยสามารถใหออกซเจนในปรมาณท�มาก และรวดเรว

กวาสารตวอ�น สารน� แตกตวไดงายเม�อถกแรงกระแทก แรงเสยดส หรอถกความรอน ถกนามาใช

อยางกวางขวางท�งในทาง อตสาหกรรมกระดาษ และการฟอกยอม (Germgard et al., 1981) การ

ผลตวตถระเบด ใชเปนสารฆาเช�อ รวมถงในทางการเกษตรซ�งนามาใชเปนสารเรงการออกดอก

ของตนลาไย

3. ผลกระทบของสารประกอบคลอเรตตอส�งมชวต

เน�องจากมการใชสารโพแทสเซยมคลอเรตการอยางแพรหลายในพ�นท�เพาะปลกลาไย

ทาใหมผวจยถงผลกระทบของสารน� ตอส�งมชวตอ�นไวเชน

มการรายงานวาการมปรมาณคลอเรตตกคางในดนมากเกนไป สามารถทาลายระบบ

นเวศของดน และสงผลตอการเจรญของพชได อยางเชน ขาว (Borges et al., 2004)

กนกวรรณ (2446) รายงานถงผลของโพแทสเซยมคลอเรตตอเช�อราอาบสคลาร ไมคอร

ไรซา ซ�งเปนเช�อราท�เปนประโยชนตอพช ไววา สารโพแทสเซยมคลอเรตมผลตอปรมาณสปอรของ

เช�อรา Glomus pustulatum และทาใหความสามารถในการเขาอยอาศยในรากพชลดลง

ปรศนา (2547)ไดทาการศกษาผลกระทบของสารโพแทสเซยมคลอเรตท�มตอเช�อรา

Fusarium ในสวนลาไย พบวา เช�อราขนดน� ท�แยกไดจากสวนลาไยท�มการใชสารโพแทสเซยมคลอ

เรตมการกลายพนธเกดข�น

Li et al. (2008) ไดรายงานถงปรมาณคลอเรตในดนท�สง ไดแก 200-400 มลลกรม/

กโลกรม สามารถยบย �งการ colonize ของเช�อรา arbuscular mycorrhiza อกท�งยงสามารถยบย �งการ

8

การดดซมฟอสฟอรส และการเจรญเตบโตของพชท�ทดสอบ 3 ชนดคอ bermudagrass, bahiagrass

และเมลดลาไยดวย

น�นคอคลอเรตท�ตกคางในดนเม�อสงผลกระทบตอส�งมชวตอ�น หมายถงสงผลตอ

คณภาพดน (soil quality) ดวย

4. แบคทเรยรดวสคลอเรต (Chlorate reducing bacteria)

แบคทเรยรดวสคลอเรต (chlorate reducing bacteria; CRB) คอ แบคทเรยท�สามารถใช

chlorate (ClO3-) เปนตวรบอเลคตรอนในกระบวนการหายใจ โดยแบคทเรยจะสามารถรดวส

chlorate ไปเปน chlorite โดยเอนไซม chlorate reductase ในข�นแรก จากน�นในข�นท� 2 chlorite

จะแตกตวเปน chloride และ ออกซเจน โดยม chlorite dismutase เปนตวเรง (Oltmann et al.,

1976 และ Rikken et al., 1996) โดยปฏกรยาน� จะเกดข�นบรเวณ periplasm ดงแสดงในภาพท�

โดยท�วไปแบคทเรยท�สามารถรดวส chlorate ไดจะอยในกลมของ facultative anaerobe (Logan,

1998) นอกจากน� denitrifying bacteria บางกลมยงสามารถรดวส chlorate ไดอกดวย (Oltmann

et al., 1976) ตวอยางของแบคทเรยท�มการรายงานวาสามารถรดวสคลอเรต ไดแก Vibrio

dechloraticans, Acinetobacter thermotoleranticus (Ginkel et al., 1995) และ Ideonella

dechloratans (Thorell et al., 2003) ซ�งแยกไดจากกากตะกอนน� าเสยจากระบบบาบดน� าเสย

นอกจากน� Steinberg et al. (2005) ไดศกษาความแตกตางในการรดวส chlorate ของ Pseudomonas

sp. กบการรดวส perchlorate ของ Azospira sp. พบวามความแตกตางกนของเอนไซม chlorate และ

perchlorate reductase ภายใตสภาวะท�มออกซเจน

9

ภาพท� 1 ปฏกรยาการรดวสคลอเรต (Oltmann et al., 1976 และ Rikken et al., 1996)

. โรคของลาไยท�มสาเหตมาจากเช�อรา

4.1 โรคใบจดของลาไย (Black spot of longan leaf)

เช�อสาเหต : เกดจากเช�อรา Collectotrichum sp.

พบระบาดตามสวนลาไยท�วไป โดยเฉพาะอยางย�งชวงท�มฝนตกสภาพอากาศช�น หาก

ระบาดรนแรงเปนผลทาใหใบสญเสยพ�นท�การสงเคราะหแสง สภาพตนทรดโทรมผลผลตต�า เช�อรา

ท�แยกไดแจกแผลจดดาจากแหลงตางๆ สามารถตรวจพบเช�อราหลายชนด เชน Collectotrichum sp.,

Pestalotiopsis sp., Helminthosporium sp., Phomopsis sp. และ Zygosporium sp. แตพบวาเช�อรา

Collectotrichum sp. เปนเช�อราท�แยกไดมากท�สดจากอาการใบจดดาลาไยท�เกบมาจากแหลงตางๆ

และไดพสจนวาเช�อสาเหตท�แทจรงของโรคเกดจากเช�อรา Collectotrichum sp. ผลจากการกระตน

แผล (latent infection) ดวยสารละลายของสารเคมกาจดวชพชพาราควอต เขมขน 0.05 เปอรเซนต

หลงจากบมไว 3 ว น ม เสนใยสขาว และกลมสปอรสสมของเช�อรา Collectotrichum sp.

สาเหตของโรคใบจด : อาการแผลจดดาท�เกดข�นบนใบจะปรากฏเฉพาะชดของใบแก

เทาน�น ในขณะท�ใบออนท�เพ�งแตกออกใหมจะไมปรากฏอาการของใบจดเลย แตอาจจะพบรองรอย

10

จดเขมในเน�อใบเม�อสองใบกบแสงแดด เม�อใบแกเกดอาการแผลจดดาแลวกมโอกาสท�จะถกเช�อรา

ชนดอ�นเขาทาลายซ�าเตม จะเหนไดจากลกษณะแผลบนใบของลาไยแตละสวนมขนาดไมแนนอน

ข�นอยกบจานวน และชนดของเช�อราท�เขาทาลาย

อาการท�ปรากฏบนใบแกเร� มแรกจะเปนจดสน� าตาลออน ตอมาแผลจะเร� มแหงและ

เปล�ยนเปนสน� าตาลเขมหรอดาและบางคร� งถาสภาพอากาศมความช�นสมพทธสงๆ อาจพบเสนใย

หรอสวนขยายพนธของเช�อรา นอกจากน� ใตใบบรเวณท�เปนรอยแผลจดดาน�มกจะพบเสนใยเปนขย

สขาวเจรญอย จากการตรวจสอบพบวาเปนเช�อราอกชนดหน�งคอเช�อ Zygosporium sp. ท�เขาทาลาย

ในระยะหลงจากท�เกดอาการจดดาแลว ซ�งเช�อน� เจรญอยบรเวณแผลจดดาในสวนใตใบ สปอรของ

เช�อราสามารถแพรกระจายไปตามลม และละอองของน� าฝน ในสวนท�พบวาโรคน� ระบาดรนแรงจะ

ทาใหสภาพตนทรดโทรม และใหผลผลตต�าเน�องจากใบสญเสยพ�นท�ในการสงเคราะหแสง (กรม

วชาการเกษตร, 2552)

4.2 โรคยอดไหม ใบไหมของลาไย (longan apical, leaf blight)

เช�อสาเหต : เกดจากเช�อราในกลม Mycelia sterilia ซ�งจะระบาดรนแรงในสภาพท�มอากาศ

เร�มหนาวเยน มหมอกลงจดในตอนเชา

จากการสารวจพ�นท�แหลงปลกลาไยในเขตอาเภอล� จงหวดลาพน พบลาไยในพ�นท�แสดง

อาการยอดไหมท�วทรงพมของตนโดยเฉพาะในชวงเดอนพฤศจกายนเปนตนไป ซ�งเขาสฤดหนาว ม

หมอกลงจดจะเปนโรคน�มการระบาด สาหรบตนท�มอาการรนแรง ใบจะไหมแหงเปนสน� าตาลและ

หลดรวงจากข�วไดงาย สามารถมองเหนอาการยอดไหมรอบทรงพมของตนจากระยะไกลไดชดเจน

ถาหากสภาพอากาศมความช�นและเยน จะพบเสนใยสขาวของเช�อราเจรญตามก�งและกานใบ (กรม

วชาการเกษตร, 2552)

4.3 โรคจดสนม โรคจดสาหราย (Algal leaf spot)

เช�อสาเหต : เกดจากเช�อรา Cephaleuros virescens

พบระบาดตามสวนลาไยท�วไป โดยเฉพาะบรเวณทรงพมท�มรมเงา และความช�นสง

โดยท�วไปแลวไมทาความเสยหายใหกบลาไยเทาใดนก ถามการระบาดรนแรงจะทาใหลาไยสญเสย

พ�นท�ใบในการสงเคราะหแสง ซ�งจะมผลตอคณภาพและผลผลตของลาไย

11

อาการใบจดสนมเปนอาการท�พบบรเวณหนาใบลาไย มอาการเปนจดสน� าตาลแดงคลาย

สนมเหลก อาการจะเกดบรเวณใบเปนจดคอนขางกลมขนาดเสนผานศนยกลาง 0.5-1.0 เซนตเมตร

โดยอาการเร�มจากลกษณะเปนขยสเขยวคลายขยกามะหย� และจะเปล�ยนเปนสแดงคลายสนมเหลก

บางชนดพบวามสเหลองหรอ สสม ลกษณะของสาหรายท�พบบนใบ สามารถแบงการเจรญได 2

แบบ คอ

1)เจรญเปนกอหรอกระจกของโคโลนสสมอยท�หลงใบ (ผวใบดานบน) แผลมขนาด 2-4

มลลเมตร

2)เจรญดานทองใบ (ใตใบ) โดยมแผลลกษณะเน�อเย�อตายเปนสน� าตาลดา (necrosis)

บรเวณโดยรอบแผลมลกษณะฉ�าน� า แผลท�พบมขนาดเสนผานศนยกลางต�งแต 5 มลลเมตรข�นไป

บางแผลอาจกวางถง 1 เซนตเมตร

นอกจากน� ยงพบวาสามารถเกดท�ก�งไดอกดวย โดยท�วไปโรคน�มกทาใหบรเวณใบท�เกดจด

สาหราย เน�อเย�อเปล�ยนเปนสน� าตาล ถาเปนรนแรงมากๆอาจทาใหใบแหงและรวง เปนผลใหตน

ลาไยทรดโทรม การแพรระบาดของโรคน� เกดไดทกฤด โดยเฉพาะในสภาพอากาศช�นและคอนขาง

เยนมกจะพบวามการระบาดรนแรง ทาใหใบสญเสยพ�นท�ในการสงเคราะหแสง เน�อเย�อของพชถก

ทาลายเปนผลใหใบแหงและหลดรวงแตพบวาในสภาพอากาศท�แหงแลงบางคร� งโคโลนของ

สาหรายน� จะฝอและยบตวไปเอง (กรมวชาการเกษตร, 2552)

4.4 โรคราน� าฝน โรคก�งออนและใบไหม โรคผลเนา

เช�อสาเหต : เกดจากเช�อรา Phytophthora mirabilis Galido and Hohl

ลกษณะอาการ : ก�งออนหรอยอดออน มอาการไหมหรอเนาจากการเขาทาลายของราสาเหต

ของโรค เม�อก�งออนถกทาลายจงทาใหใบออนรวง แลวเกดอาการชอดอกไหม และผลเนาตามมาใน

ภายหลง ก�งออนและใบออนท�เปนโรคจะมสน� าตาลคล�า ในชวงท�มอากาศเยน ความช�นสงจะพบ

ราสชมพข�นท�ก�งออน เสนกลางใบออนและผวเปลอกผลท�เปนโรค

การแพรระบาด : ภายหลงการตดแตงก�ง ตนลาไยจะแตกใบออนและยอดออนท�วท�งทรง

พม หากชวงเวลาดงกลาวเปนชวงท�ยงมฝนตกชก จะเกดการแพรกระจายของราสขาวฟข�นบนก�ง

ออน เสนกลางใบ และผวเปลอกผล ราสาเหตสรางสปอรแรงเจยม (sporangium) เปนจานวนมาก

ซ�งจะปลวไปตามลม หรอตดไปกบน� าฝนและเขาทาลายลาไยตนใกลเคยง ภายในสปอรแรงเจยมน�

12

สามารถสรางสปอรท�มหาง (zoospore) ซ�งวายน� าได เม�อสปอรถกปลอยออกมาและเขาทาลายผล

ลาไยทาใหเกดอาการเนาเสยหายอยางรนแรง การระบาดของโรคเกดมากในชวงเวลาท�มอากาศเยน

ความช�นสง สาหรบโรคผลเนาน�น เกดกบผลลาไยท�มอายกอนเกบเก�ยวประมาณ 1 เดอน หากโรค

เกดรนแรงผลจะเนาและรวงทาใหผลผลตเสยหาย (กรมวชาการเกษตร, 2552)

4.5 โรครากเนาโคนโคนเนาลาไย

เช�อสาเหต : เกดจากเช�อรา Phytophthora palmivora (Butler) Butler

ลกษณะอาการ : อาการปรากฏทางใบ ใบลาไยมสเหลองซด เม�อขดดบรเวณรากตอโคนตน

พบอาการเนาบรเวณรอยตอระหวางรากและลาตนสวนท�อยใตระดบผวดนมสน� าตาล รากไม

สามารถดดน� าและอาหารได ทาใหลาไยยนตนตาย

การแพรระบาด : ราเขาทาลายทางราก ลกลามสโคนตน ในสภาพดนท�มการระบายน� าไมด

มน� าขง ดนมความช�นและแฉะอยตลอดเวลา ในสภาพท�มฝนตกชกและอากาศมความช�นสง เปน

สภาพแวดลอมท�เหมาะกบการเจรญของราสาเหตโรค เช�อจะสรางเสนใยสขาว พรอมท�งสรางสปอร

แรงเจยมภายในสรางสปอรจานวนมาก สปอรจะตดไปกบหยดน� าฝนท�กระเซน หรอไหลตามน� าฝน

หรอแพรระบาดทางลม เช�ออาจตดไปกบดน น� า และซากพชสวนท�เปนโรค การใชก�งตอนลาไยจาก

แหลงท�มการระบาดของโรค เปนการนาเช�อสาเหตซ�งอยในดนตดมาดวย การใชสารโพแทสเซยม

คลอเรตเพ�อชวยบงคบใหตนลาไยออกดอกตดผลนอกฤด อาจทาใหเกดโรครากเนาระบาดมากข�น

(กรมวชาการเกษตร, 2552)

4.6 โรคราดาของลาไย (Sooty mold of longan)

เช�อสาเหต : เกดจากเช�อรา Meliola euphoria ; Capnodium ramosum

เช�อราแพรกระจายอยในอากาศ ปลวมาตกลงบนสวนของพชท�มน� าหวานท�แมลงปากดด

จาพวก เพล�ยแปง เพล�ยหอย เพล�ยจกจ�น และเพล� ยออน ขบถายออกมา ทาใหเหมาะสมตอการ

เจรญเตบโตของเช�อราชนดน� เจรญเปนคราบสดาข�นปกคลมซ�งเกดข�นไดท�งบรเวณใบ ก�ง และชอ

ดอก รวมท� งผวของผลเช�อราไมไดทาลายพชโดยตรง แตถาปรากฏบนใบจะไปลดอตราการ

สงเคราะหแสง หากเกดท�ชอดอกจะเคลอบสวนเกสรท�งหมด ไมสามารถผสมเกสรได และดอก

หลดรวง เม�อตดผลทาใหผลมสดาไมสวยงามราคาจาหนายตก

13

การระบาดของเช�อราน� เกดจากการทาลายของแมลงปากดด ท�ดดกนสวนยอดออนของ

ลาไยแลวถายน� าหวานออกมาปกคลมสวนตางๆของลาไย จากน�นกจะมเช�อราเจรญข�นบนยอด

น� าหวานเหลาน� รวมท�งสามารถแพรกระจายไปตามลมบนหลงใบซ�งไดรบแสงแดดโดยตรงเช�อจะ

เจรญไดไมดจงทาใหเหนเปนคราบดาคลายเขมา หรอเปนจดดาเลกๆสามารถใชมอถแลวหลดออก

ไดงาย สวนใตทองใบเช�อจะเจรญฟ เหนเปนวงกลมกระจาย ขนาดเสนผาศนยกลางของวงเช�อรา

บางแหงพบวาเกน 1 เซนตเมตร เม�อตรวจดดวยกลองจลทรรศน พบวาเสนใยของเช�อราเจรญอย

เฉพาะบรเวณผวแตไมลกลามลกเขาไปทาลายเซลลพช บางคร� งจะพบแมลงปากดดขนาดเลกเปนจด

ขาวๆปะปนอยกบเสนใยสดาของเช�อราท�เจรญอยตามสวนตางๆ เชน ใบและผล (จรยา และคณะ,

2545)

5. วธการควบคมโรค

5.1 การควบคมโรคใบจดของลาไย (Black spot of longan leaf)

เช�อสาเหต : เกดจากเช�อรา Collectotrichum sp.

แนวทางในการปองกนกาจด :

1)ตดแตงก�งและทรงพมใหโปรงหลงเกบผลและเกบใบท�เปนโรคไปเผาทาลายเพ�อไมให

เปนแหลงสะสมของเช�อสาหรบฤดกาลตอไป

2)มสารเคมปองกนกาจดเช�อราหลายชนดท�สามารถยบย �งการแพรระบาดของโรคน� เชน

เบนโนมล คารเบนดาซม แคปแทน แมนโคเซบ คอปเปอรออกซ�คลอไรด และเมตาแลกซล โดย

สามารถเลอกไดมากกวา 1 ชนดฉดพนสลบกนทก 2 สปดาหในชวงฤดฝน ควรหลกเล�ยงการฉดพน

สารในระยะท�ลาไยใหผลผลต โดยเฉพาะอยางย�งสารคอปเปอรออกซ�คลอไรด เพราะจากการ

ทดสอบนาผลลาไยท�แชสารคอปเปอรออกซ�คลอไรดแลวนาไปรมดวยซลเฟอรไดออกไซดจะมผล

ทาใหลาไยมเปลอกเปล�ยนเปนสดาคล �า เน�องจากผลของสารเคมประเภทสารประกอบของทองแดง

หรอคอปเปอรตกคางท�เปลอกลาไยจะทาปฏกรยากบซลเฟอรไดออกไซดทาใหเกดเปนคอปเปอร

ซลไฟด เปนผลใหเกดสดาข�นบรเวณเปลอกลาไย

5.2 การควบคมโรคจดสนม โรคจดสาหราย (Algal leaf spot)

14

เช�อสาเหต : เกดจากเช�อรา Cephaleuros virescens

แนวทางในการปองกนกาจด :

1) ฉดพนดวยสารเคม คอปเปอรออกซคลอไรดในอตรา 50 กรมตอน� า 20 ลตร

2) กรณท�มโรคระบาด หรอข�นปกคลมผวใบหนาแนน ใหฉดพนดวยไตรเฟนทนอะซเตด

อตรา 40 กรมตอน� า 20 ลตร พนใหท�วทก 25 วน หรอ คารเบนดาซม (เดอโรซาล) ผสมแมนโคเซบ

(ลลาเอม) อตราท�แนะนาขางฉลาก อยางใดอยางหน�ง

5.3 การควบคมโรคราน� าฝน โรคก�งออนและใบไหม โรคผลเนา

เช�อสาเหต : เกดจากเช�อรา Phytophthora mirabilis Galido and Hohl

แนวทางในการปองกนกาจด : โดยการควบคมโรคดวยวธผสมผสาน มการจดการดานเขต

กรรม ในรอบ 1 ป หลงเกบผลผลต ตดแตงก�งลาไยใหโปรง ไมใหเปนแหลงสะสมเช�อ และตดแตง

ชอดอก ตดแตงชอผล ไมใหมชอดอก ชอผล มากเกนไป หรอชอท�ไมสมบรณ แลวพนดวยสาร

ปองกนกาจดโรคพช สารเมทาแลกซล 25เปอรเซนตWP อตรา 20 กรม/น� า 20 ลตร ใหท�วทรงพม

ของตนลาไย ทกคร� งภายหลงการตดแตงก�ง เกบทาลายใบออน ก�ง หรอผลท�เปนโรค ดวยการฝง

หรอเผา

5.4 การควบคมโรครากเนาโคนโคนเนาลาไย

เช�อสาเหต : เกดจากเช�อรา Phytophthora palmivora (Butler)Butler

แนวทางในการปองกนกาจด : ตนลาไยท�เร�มเปนโรค ใหใชสารเมทาแลกซล 25เปอรเซนต

WP ละลายน� าราดดนบรเวณโคนตน อาจชวยใหรอดพนจากการตายได หากตนใดเปนโรคแลวถอน

ทาลาย แลวขดดนบรเวณหลมปลกออก ตากแดดหลายๆคร� ง ระวงอยาใหน� าทวมขงบรเวณโคนตน

โดยเฉพาะชวงฤดฝน (กรมวชาการเกษตร, 2552)

5.5 การควบคมโรคราดาของลาไย (Sooty mold of longan)

เช�อสาเหต : เกดจากเช�อรา Meliola euphoria ; Capnodium ramosum

แนวทางในการปองกนกาจด :

1)ใชสารเคมฆาแมลงฉดพนกาจดพวกแมลงปากดด ไดแก เพอรเมทรน ไซเพอรเมทรน ไซ

ฟลทรน เดลทาเมทรน และคารบารล เปนตน

15

2) โดยปกตคราบหรอแผนราดาบางชนดท�ปกคลมสวนพชอาจจะหลดรวงไปเอง เม�อเช�อรา

ใชอาหารและความช�นในบรเวณน�นจนหมดกจะคอยๆแหงและหลดรวง จงไมมความจาเปนตองใช

สารเคมปองกนกาจดเช�อรา ยกเวนในกรณท�มการระบาดรนแรงอาจใชสารคอปเปอรออกซคลอไรด

แมนโคเซบ คารเบนดาซม ฉดพนซ�งสามารถใชควบคกบสารเคมฆาแมลงได

3) สวนท�มการตดแตง ใหปยท�งทางรากและทางใบจนพชเจรญด และหากมการใชสารเคม

กาจดแมลงอยางสม�าเสมอแลว จะพบเช�อราน� ระบาดนอยหรอไมพบเลย (จรยา และคณะ, 2545)

5.6 การควบคมโรคยอดไหม ใบไหมของลาไย (longan apical, leaf blight)

เช�อสาเหต : เกดจากเช�อราในกลม Mycelia sterilia

แนวทางในการปองกนกาจด : พนสารกาจดเช�อราเพ�อยบย �งการแพรระบาดของโรคโดยใชเมตา

แลกซล (metalaxyl) 25เปอรเซนตWP อตรา 20 กรมตอน� า 20 ลตร พนใหท�วท�งทรงพม (พาวน,

2543)

6. ออกซน (Auxin)

ออกซน เปนกลมของฮอรโมนพชท�กระตนการเจรญเตบโต ทาใหมการแบงเซลลและยด

ตวของเซลล การขนสงออกซนภายในพชเปนการขนสงอยางมทศทาง ออกซนซ�งในปจจบนพบใน

พชช�นสงท�วๆ ไป และมความสาคญตอการเจรญเตบโตของพช สงเคราะหไดจากสวนเน�อเย�อเจรญ

ของลาตน ปลายราก ใบออน ดอกและผล และพบมากท�บรเวณเน�อเย�อเจรญ โคลออพไทด

(Coleoptile) และคพภะ (embryo) รวมท�งใบท�กาลงเจรญดวย (Arteca, 1996)

สารควบคมการเจรญเตบโตของพช (plant growth regulating chemicals : PGRC) ท�จดอย

ในกลมออกซน มอยหลายชนดและเปนท�รจกกนดสาหรบเกษตรกรในประเทศไทย สารออกซน

ชนดแรกท�คนพบคอ indole-3-acetic acid (IAA) ซ�งเปนสารท�พชสรางข�นเอง โดยมคณสมบตเปน

สารเรงการเจรญเตบโต มผลกระตนการขยายขนาดของเซลล การยดตวของเซลล และยงมผล

กระตนการเกดราก รวมถงมคณสมบตในการสงเสรมการเจรญเตบโตในสวนตาง ๆ ของพชซ� ง

16

สามารถพสจนไดหลายวธกบพชท�งตน (intact plant) รวมท�งวธท�ตดอวยวะเฉพาะสวนมาทดสอบ

(excised part) (Ahmad et.al., 2006)

เน�องจากความสามารถในการควบคมกระบวนการเจรญเตบโตของพชดงกลาวขางตน จง

ทาใหมการสงเคราะหสารตางๆ ท�มคณสมบตคลายออกซนเพ�อนาไปใชประโยชนทางการเกษตร

สารสงเคราะหเหลาน� มอยหลายชนด แตท�นยมใชกนท�วไปมอยเพยงไมก�ชนด ไดแก NAA (1-

naphthylacetic acid), IBA 4-(indol-3-butyric acid), 2, 4-D (2, 4-dichlorophenoxy- acetic acid)

และ 4-CPA (4-chlorophenoxyacetic acid) ( Arteca, 1996)

6.1 ประเภทของออกซน

6.1.1 ออกซนธรรมชาต (Natural auxins) คอ ออกซนท�พชและจลนทรยสามารถสรางข�น

ไดโดยอาศยสารต�งตน (precursor) คอ ทรปโตแฟน (tryptophan) เชน Indole-3-acetic acid (IAA),

Indole-3-butyric acid (IBA), 4-chloroindole-3-acetic acid (4-Cl-IAA) และ 2-phenylacetic acid

(PAA) ซ�งโครงสรางแสดงดงภาพท� 2

ภาพท� 2 โครงสรางออกซนธรรมชาต (Natural auxins)

6.1.2 ออกซนสงเคราะห (Synthetic auxins) เปนสารประกอบท�ออกฤทธ� ไดเชนเดยวกบ

IAA แตมโครงสรางทางเคมท�แตกตางกนจากสงเคราะหข�นมา เชน 2, 4-Dichorophenoxyacetic

acid (2, 4-D), α-Naphthalene acetic acid (α-NAA), 2-Methoxy-3,6-dichlorobenzoic acid และ 4-

Amino-3,5,6-trichloropicolonic acid (TORDON หรอ PICORAM) ซ�งโครงสรางแสดงดงภาพท� 3

17

ภาพท� 3 โครงสรางออกซนสงเคราะห (Synthetic auxins)

6.2 ชวสงเคราะหของออกซน (Davies, 1995; Salisbury and Ross, 1992)

ออกซนมลกษณะทางเคมเปนสาร indole-3-acetic acid หรอ เรยกยอๆ วา IAA ซ� งใน

ปจจบนเช�อวาเปนออกซนสวนใหญท�พบในพชและในสภาพธรรมชาต อยในรป indole ท�งส�น โดย

ท� IAA เปนสารท�สาคญท�สด นอกจากน�นยงพบในรปของ indole-3-acetaldehyde (IAAld), indole-

3-pyruvic acid (IPyA) และ indole-3-acetonitrile (IAN) ซ�งสารท�ง 3 ชนดน� สามารถเปล�ยนแปลง

เปน IAA ได

การสงเคราะหออกซนน�น มกรดอะมโน tryptophan เปนสารต�งตน (Precursor) ซ� ง

tryptophan เปนกรดอะมโนท�มโครงสรางของ indole อยโดยในการสงเคราะห IAA น�นจะม IAAld

และ IPyA เปนสารท�พบในระหวางการสงเคราะห ในพชบางชนด เชน ขาวโอต ยาสบ มะเขอเทศ

ทานตะวน และขาวบารเลย พบวา tryptophan สามารถเปล�ยนเปน tryptamine ไดในพชตระกล

กะหล�า tryptamine จากน�นเปล�ยนไปเปน indole acetaldoxime แลวเปล�ยนไปเปน IAN แลวจง

เปล�ยนเปน IAA

การศกษาเร�องการสงเคราะหออกซนมกศกษาจากเน�อเย�อปลายรากหรอปลายยอด และ

พบวา IAA น�สงเคราะหไดท�งในสวนไซโตซอล (cytosol) ไมโตคอนเดรย (mitochondria) และคลอ

โรพลาสต (chloroplast) ในการศกษาในปจจบนพบวา phenylacetic acid หรอ PAA มคณสมบต

ของออกซนดวย และสามารถสงเคราะหไดจาก L-phenylalanine โดยพบในคลอโรพลาสต และไม

โตคอนเดรยของทานตะวน

18

6.2.1 ชวสงเคราะหของ Indole-3-Acetic Acid (IAA) ในพช

วถการสงเคราะห IAA เปนท�ยอมรบกนโดยท�วไปแลววา tryptophan เปนสารต�งตน

(precursor) สาหรบการสงเคราะห IAA ดงแสดงในภาพท� 4 ซ�งเกดจากการรวบรวมงานวจยท�

เก�ยวของ ไดแก tryptophan สามารถเปล�ยนรปไปเปน IAA ในรา และพบเอนไซมชนดหน� งใน

ระบบท�สามารถเปล�ยนรป tryptophan ไปเปน IAA ในใบผกโขม ตอมานกวจยจานวนมากไดแสดง

ใหเหนวา tryptophan เปนสารต�งตนของ IAA ในพชช�นสงดวย อยางไรกตามไดเกดความสบสนข�น

เม�อมนกวจยบางคนเสนอวา ข�นตอนของปฏกรยาเคมน� อาจไมถกตอง เน�องจากมการ ปนเป� อนของ

แบคทเรยสราง IAA ข�น (Lippert et al., 1966)

ภาพท� 4 ชววถการสงเคราะห indole-3-acetic acid (IAA) ในพช (Mano and Nemoto, 2012)

19

ข�นตอนท� 1 จะเปนการเปล�ยนรป tryptophan ไปเปน indole-3-pyruvic acid โดยเอนไซม

tryptophan transaminase จากน� จะเกดกระบวนการ decarboxylation โดยเอนไซม indolepyruvate

decarboxylase ไปเปน indole-3-acetaldehyde (IAAld) ซ� งตอมาจะเปล�ยนรปไปเปน IAA โดย

เอนไซม indoleacetaldehyde dehydrogenase (ภาพท� 4)

ข�นตอนท�2 ซ� งจะเก�ยวของกบกระบวนการ decarboxylation ของ tryptophan ไปเปน

tryptamine โดยเอนไซม tryptophan decarboxylase จากน�นเปล�ยนรปไปเปน IAAld โดยเอนไซม

amine oxidase และในท�สดเปล�ยนไปเปน IAA โดยเอนไซม IAAld dehydrogenase (ภาพท� 4)

6.2.2 ชวสงเคราะหของ Indole-3-Acetic Acid (IAA) ในแบคทเรย

Spaepen และ Vanderleyden (2011) ไดสรปไววา 80 เปอรเซนต ของแบคทเรยท�แยกได

จากรากพชสามารถสงเคราะห IAA ได สาหรบสารต�งตนในการสงเคราะห IAA คอ tryptophan ด�ง

น�นการเพ�ม tryptophan ลงในอาหารเล�ยงเช�อจงสงผลทาใหเช�อแบคทเรยมความสามารถในการผลต

IAA ไดสงข�น

ในการสงเคราะห tryptophan น�นสารประกอบต�งตนคอ chorismate โดยถกควบคมโดย

trp genes สงเคราะหจาก phosphoenolpyruvate และ erythrose 4-phosphate ในชววถ Shikimate ซ�ง

เปนชววถท�วไปในชวสงเคราะหของ aromatic amino acid และ สารทตยภมอกหลายตว และ

ข�นตอนสดทายคอได trpytophan เปนสารต�งตนในวถการสงเคราะห IAA ตอไป ดวยวถท�แตกตาง

กน ดงภาพท� 5

วถ Indole-3-Acetamide (IAM) วถ IAM ประกอบดวยสองข�นตอน ข�นตอนแรก เอนไซม

tryptophan monoxygenase (สงเคราะหจากยน iaaM) เปล�ยน tryptophan ไปเปน IAM และข�นตอน

ตอมา IAM จะถกไฮโดรไลซไปเปน IAA และ ammonia (NH3 ) ดวยเอนไซม IAM Hydrolase

(สงเคราะหจากยน iaaH) ซ�งจากยนท�สรางเอนไซมท�งสองน�นเปนลกษณะของยนท�อยในแบคทเรย

กอโรคในพช เชน Agrobacterium tumefacieng, Pseudomonas savastanoi, Pseudomonas syringae,

Pantoea agglomerans และในแบคทเรยตรงไนโตเจน(nitrogen fixing bacteria) เชน Rhizobium

และ Bradyrhizobium sp. เปนตน

20

วถ Indole-3 pyruvate (IPA) วถการสงเคราะห IPA ประกอบดวย 3 ข�นตอน โดยข�นตอน

แรก tryptophan จะถกเปล�ยนไปเปน IPA ดวย เอนไซม aminotransferase ข�นตอนท� 2 ปฏกรยาการ

ปลดปลอยหมคารบอกซลของ IPA โดยเอนไซมท�ทาหนาท� เรงปฏกรยาคอ indole-3-pyruvate

decarboxylase (สงเคราะหจากยน ipdC) ไปเปน indole-3-acetaldehyde (IAAld) และข�นตอน

สดทาย IAAld เปล�ยนไปเปน IAA ดวยเอนไซม IAAld dehydrogenase

IPA สวนใหญเปนวถการสงเคราะหออกซนในพชแตวถ IPA แตกยงพบในแบคทเรยหลาย

กลม เชน กลมของแบคทเรยกอโรคในพช เชน P. agglomerans กลมแบคทเรยท�มประโยชนตอ

พช เชน Azospirillum, Bacillus, Bradyrhizobiums, Enterobacter cloacae, Paenibacillus,

Pseudomonas และ Rhizobium และยงพบในกลมของ Cyanobacteria เปนตน

วถ tryptamine (TAM) ซ�ง tryptophan จะเปล�ยนเปน tryptamine ดวยเอนไซม tryptophan

decarboxylase และ tryptamine เปล�ยนเปน IAAld ดวยเอนไซม amino-oxidase พบ Bacillus cereus

และ Azospirillum

วถ indol-3-acetonitrile (IAN) โดย IAN จะเปล�ยนไปเปน IAA โดยตรงดวยเอนไซม

nitrilase พบใน A. tumefaciens และ ทางออมโดย IAN เปล�ยนไปเปน IAM ดวยเอนไซม nitrile

hydratase พบใน Agrobacterium และ Rhizobium spp.

วถ tryptophan side-chain oxidase (TSO) ในวถน� tryptophan จะถกเปล�ยนเปน IAAld

ดวยเอนไซม tryptophan side-chain oxidase แลว IAAld เปล�ยนเปน IAA ดวยเอนไซม IAAld

dehydrogenase ซ�งจะพบแตใน Pseudomonas fluorescens CHA0

21

ภาพท� 5 ชววถสงเคราะห Indole-3-Acetic acid (IAA) ในแบคทเรย ( Spaepen and Vaanderleyden,

2010)

วถท�เปนอสระตอ tryptophan (Tryptophan-independent pathway) การสงเคราะห IAA

วถน� จะพบในพชท�เกดการกลายพนธโดยจะไมใช tryptophan เปนสารต�งตนในการสงเคราะห IAA

แตการสงเคราะห IAA เกดจาก indole-3-glycerol phosphate หรอ indole แตในแบคทเรยมรายงาน

การพบใน Azospirillum brasilense แตไมมหลกฐานทางพนธกรรมหรอชวเคม ท�ใหการสนบสนน

วถน� ชดเจนดงภาพท� 6

22

ภาพท� 6 ชววถท�เปนอสระตอ tryptophan ท�งในพชและแบคทเรย (Bartel, 1997)

6.3 การสลายตวของ IAA

ปรมาณของ IAA ในพชน�นไมเพยงแตข�นอยกบอตราการสงเคราะหเทาน�น แตยงข�นอย

กบอตราการสลายตว ซ�งการสลายตวของ IAA น�น สามารถเกดข�นไดหลายวถ

23

6.3.1 โฟโตออกซเดชน (Photo-oxidation) IAA ท�อยในสภาพสารละลายจะสลายตวได

เม�อไดรบแสง การเกด photo-oxidation ของ IAA จะถกเรงโดยการปรากฏของรงควตถตาม

ธรรมชาต หรอท�สงเคราะหได จงอาจจะเปนไปไดวาการท�รงควตถของพชดดซบพลงงานจากแสง

แลวทาใหเกดการออกซไดซ IAA ซ� งรงควตถท�เก�ยวของ คอ ไรโบฟลาวนและไวโอลาแซนธน

(Riboflavin และ Violaxanthin) สารท�เกดข�นเม�อ IAA สลายตวโดยแสงคอ 3-methylene-2-oxindole

และ Indoleacetaldehyd

6.3.2 การออกซไดซ IAA โดยเอนไซม (Enzymic Oxidation of IAA) พชหลายชนดม

เอนไซมเรยกวา IAA-oxidase ซ�งจะเรงปฏกรยาการสลาย IAA ไดคารบอนไดออกไซด และเปน

ปฏกรยาท�ใชออกซเจน IAA-oxidase ม คณสมบตคลายเอนไซมประเภทเพอรออกซเดส

(peroxidase) และเปนเอนไซมท�ตองการแมงกานสเปนโคแฟคเตอร กระบวนการออกซไดซ โดย

IAA-oxidase ยงไมเปนท�เขาใจกนมากนก จากการทดลอง In vitro พบวาผลตภณฑท�ได คอ 3-

methylene-2-oxindole และถกเมตาโบไลซตอไป เปน 3-methyl-2-oxindole

มการทดลองหลายคร� งท�ยนยนวา IAA-oxidase จะเพ�มข� นเม�ออายของพชเพ�มมากข� น

นอกจากน�นยงมความสมพนธแบบผกผนระหวางอตราการเจรญเตบโตและปรมาณของ IAA-

oxidase ในเน�อเย�อของรากจะม IAA ในปรมาณต�า แตม IAA-oxidase เปนจานวนมาก

6.3.3 รวมกบสารชนดอ�นในไซโตพลาสต หรอ เปล�ยนเปนอนพนธชนดอ�น

6.4 การวดปรมาณออกซน

6.4.1 Bioassay คอ การวดปรมาณออกซนโดยใชช�นสวนของพช เชน โคลออพไทลของ

ขาวโอตหรอพชใบเล� ยงเด�ยวอ�นๆ แลววดความโคงของยอดโดยการวางออกซนท�ตองการวด

ปรมาณลงบนสวนของโคลออพไทลซ�งตดยอดออกแลว มมท�โคงจะบอกปรมาณของออกซนได

โดยเปรยบเทยบจากเสนมาตรฐาน (Standard Curve)

6.4.6 การวดจากคณสมบตทางฟสกส คอ การวดปรมาณของออกซนโดยใชการดดกลน

แสงของ IAA ซ�งเม�อมความเขมขนตางกนจะดดกลนแสงไดตางกน โดยใชความยาวคล�นแสงท�

24

280 nm หรอสกดจนเปนสารบรสทธ� แลวจงใชเคร� อง Gas Chromatograph รวมกบ Mass

Spectrometry ในการจาแนกและหาปรมาณ

6.4.7 การวดโดยวธเคม โดยใหออกซนทาปฏกรยากบ Salkowski's Reagent (acidified

ferric chloride) หรอใช Ehrllch's Reagent ซ� งจะเกดสข� นมา จากน�นวดความเขมของสแลว

เปรยบเทยบกบเสนมาตรฐาน

6.4 บทบาทดานการผลตฮอรโมนพชของแบคทเรย

แบคทเรยกลมสนบสนนการเจรญท�งพวกท�อาศยบรเวณรากพช อาศยอยางอสระอาศยท�ง

ในพชและบนพชมความสามารถในการผลตฮอรโมนพชได (Tsavkelova et al., 2006) แบคทเรย

กลมน�มปรมาณสงถงรอยละ 80 ของแบคทเรยท�งหมดในดน โดยฮอรโมนพชท�มบทบาทสาคญใน

การควบคมการเจรญและพฒนาการของพชแบงออกไดเปน 5 กลม ไดแกออกซน จบเบอเรลลน ไซ

โทไคนน เอทลน และกรดแอบไซซก (Hayat et al., 2010) Indole-3-Acetic Acid (IAA) เปน

ฮอรโมนพชกลมออกซนมบทบาทตอการยดยาวและการแบงเซลล รวมท�งชวยกระตนการเจรญและ

พฒนาการเก�ยวกบกลไกการปองกนตนเองของพช การกระตนการสราง IAA จากแบคทเรย ดวย

เอนไซม ACC deaminase จากพช ดงภาพท� 7

จากจลนทรยหลายชนดสามารถผลตออกซนได เชนแบคทเรยในสกล Pseudomonas,

Bacillus, Flavobacterium, Acetobacter, Klebsiella, Enterobacter และXanthomonas เปนตน

(Tsavkelova et al., 2006; Ahmad et al., 2008) ไซยาโนแบคทเรยในสกล Nostoc, Calothrix,

Anabeana เปนตน นอกจากแบคทเรยแลว ยคารโอตท�งยสตและราหลายสกล เชน Saccharomyces,

Fusarium, Rhizopus, Aspergillus และ Trichoderma เปนตน กมความสามารถในการผลต IAA

เชนกน (Tsavkelova et al., 2006)

25

ภาพท� 7 กลไกการทางานรวมกนระหวางพชกบแบคทเรยท�ผลต IAA และมเอนไซม

ACCdeaminase (Glick et al., 2007)

อปกรณและวธการ

1. อปกรณ

1.1 ตปลอดเช�อชนด Bioharzard (Microflow, USA)

1.2 ตบมควบคมอณหภม (Binder, Germany)

1.3 ตอบลมรอน (Binder, Germany)

1.4 เคร�องฆาเช�อความดนไอ (Astell, England)

1.5 เคร�องช�ง 2 ตาแหนง (Mettler-Toledo, Switzerland)

1.6 เคร�องช�ง 4 ตาแหนง (Mettler-Toledo, Switzerland)

1.7 กลองจลทรรศนเลนสประกอบ (Olympus, Japan)

1.8 เคร�องป�นเหว�ยง Spectrafuge™ 7M Microcentrifuge (Labnet Hermle, USA)

1.9 เคร�องวดคาการดดกลนแสง GENESYS™ 20 (Thermo Scientific, USA)

1.10 PCR Mastercycler Personal (Eppendorf, Canada)

1.11 Electrophoresis (Labnet, USA)

1.12 Transluminator (Bio-rad, USA)

1.13 ชดสกดดเอนเอสาเรจรป Genomic DNA Mini Kit (Geneaid, Taiwan)

1.14 ชดทา PCR Product ใหบรสทธ� สาเรจรป GEL/PCR DNA

Fragments Extraction Kit

(RBC Bioscience, Taiwan)

1.15 อปกรณอ�นๆ ไดแก

- จานอาหารเล�ยงเช�อ

- หลอดทดลอง

- บกเกอร

- ปเปต

- กระบอกตวง

- ขวดใสอาหารเล�ยงเช�อ

- กระดาษกรอง เบอร 1, 42

- เคร�องวดพเอช

- หวงถายเช�อ

- เขมเข�ยเช�อ

27

- ปากคบ

- สไลด

- Microcentrifuge tube

- PCR reaction tube

- Micropipette

2. สารเคม

สารเคม บรษท

2.1 Glacial acetic acid Merck, Germany

2.2 Ammonium dihydrogen phosphate J.T. baker, USA

2.3 Ammonium sulfate Merck, Germany

2.4 Boric acid Merck, Germany

2.5 Carboxymethyl cellulose (CMC) Union Science, Thailand

2.6 Calcium chloride Merck, Germany

2.7 Citric acid BDH, England

2.8 Cobalt chloride UNIVAR, Australia

2.9 Copper sulfate J.T. baker, USA

2.10 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) J.T. baker, USA

2.11 Ferric ammonium sulphate UNIVAR, Australia

2.12 Ferrous sulphate J.T. baker, USA

2.13 Folin-Ciocalteu reagent Merck, Germany

2.14 Glucose monohydrate Merck, Germany

2.15 Hydrochloric acid UNIVAR, Australia

2.16 Indigo carmine Sigma, USA

2.17 Magnesium sulphate UNIVAR, Australia

2.18 Maleic acid QRec, New Zealand

2.19 Manganese chloride UNIVAR, Australia

2.20 Methanol LAB-SCAN

2.21 p-nitrophenyl Fluka, Japan

2.22 p-nitrophenyl phosphate di sodium salt Sigma, Austria

28

2.23 Phenol Fisher Scientific, UK

2.24 Potassium chlorate Merck, Germany

2.25 Potassium chloride EMSURE, Germany

2.26 Potassium cyanide J.T. baker, USA

2.27 Potassium ferrocyanide Fisher Scientific, UK

2.28 di-potassium hydrogen phosphate BDH, England

2.29 Potassium sodium tartrate CARLO ERBA REAGENTI

2.30 Sodium acetate Merck, Germany

2.31 Sodium carbonate Fisher Chemicals, UK

2.32 Sodium dihydrogen phosphate Merck, Germany

2.33 Sodium dodecyl sulphate Fisher Chemicals, UK

2.34 Disodium hydrogen phosphate Fisher Chemicals, UK

2.35 Sodium hydroxide LABSCAN

2.36 Sodium hypochlorite Union Science, Thailand

2.37 Disodium molybdate J.T. baker, USA

2.38 Sodium nitroprusside Merck, Germany

2.39 Sulfuric acid LABSCAN

2.40 Trichloroacetic acid Merck, Germany

2.41 Triphenyl formazan Sigma, Japan

2.42 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride Merck, Germany

2.43 Tris (hydroxyl methyl) amino methane Vivantis, USA

2.44 Tyrosine Fluka Biochemike, Switzerland

2.45 Urea CODEX CARLOERBA

2.46 Zinc sulphate J.T. baker, USA

2.47 สารเคมท�ใชในการยอมแกรม (Bio-Medical Laboratory, ประเทศไทย)

2.48 สารละลาย/สารเคม ท�ใชในการสกดดเอนเอ (Geneaid, Taiwan)

2.49 สารเคม สาหรบการเพ�มปรมาณดเอนเอ

- PCR Master Mix

- 16S rDNA primer คอ 27F และ 1522R

(Fermentas, USA)

(Operon, Germany)

2.50 สารเคมท�ใชในการทา electrophoresis

29

- Loading dye

- GeneRuler ™100 bp Plus DNA Ladder

- สารละลาย Gel star

- Agarose gel

( Fermentas, USA)

( Fermentas, USA)

(Lonza, Switzerland)

Vivantis, USA

2.51 สารเคมท�ใชในการทา PCR purification (BC Bioscience, Taiwan)

3. อาหารเล�ยงเช�อจลนทรย (ภาคผนวด ข)

3.1. mineral salts medium (Ginkel et al., 1995)

3.2 nutrient broth (Criterion, Hardy Diagnostic, USA)

3.3 nutrient agar (Criterion, Hardy Diagnostic, USA)

3.4 Starch casein agar

3.5 Streptomycin rose Bengal agar

4. วธการทดลอง

4.1 การสารวจและเกบตวอยางดนจากสวนลาไย

เกบตวอยางดนจากสวนลาไยในพ�นท� จ.เชยงใหม โดยเปนสวนท�มการใชสารคลอเรต

เพ�อเรงการออกดอกนอกฤดกาลของลาไย

4.2 คดแยก chlorate reducing bacteria จากดนในสวนลาไย

นาตวอยางดนมาผานข�นตอน enrichment โดยการดดแปลงวธของ Ginkel et al. (1995)

และแยกเช�อโดยการทา serial dilution ใน agar tube และบน agar plate (Bruce et al., 1999) นาเช�อ

แบคทเรยท�เจรญข�นมาไปทาใหบรสทธ� และเกบไวศกษาในข�นตอนตอไป

4.3 การทดสอบการสลายคลอเรต โดยแบคทเรยรดวสในระดบหลอดทดลอง

4.3.1 นาเช�อแบคทเรยรดวสท�บรสทธ� ท�แยกไดจากดน มาเพาะเล�ยงในอาหารเหลวท�มความ

เขมขนของโพแทสเซยมคลอเรต 200 มลลกรม/ลตร และมคาพเอชของอาหารท�แตกตางกนคอ 5, 7

และ 8 นาน 24 ช�วโมง นาน� าเล�ยงเช�อไปวเคราะหปรมาณคลอเรต

30

4.3.2 นาเช�อแบคทเรยรดวสท�บรสทธ� ท�แยกไดจากดน มาเพาะเล�ยงในอาหารเหลวท�มความ

เขมขนของโพแทสเซยมคลอเรต 200 มลลกรม/ลตร และน� าตาลกลโคส 200 มลลกรม/ลตร โดยม

คาพเอชของอาหารเทากบ 7 นาน 24 ช�วโมง นาน� าเล�ยงเช�อไปวเคราะหปรมาณคลอเรต

4.4 การจาแนกชนดของแบคทเรยรดวสคลอเรต

นาเช�อแบคทเรยท�มประสทธภาพสงในการสลายคลอเรต มาจาแนกชนดโดยใชคณสมบต

ทางสรรวทยา และการใชเทคนคทางอณชววทยา

4.4.1 การศกษาลกษณะทางสณฐานวทยาเบ�องตน

นาเช�อแบคทเรยบรสทธ� ท�ไดมาทาการยอมสแบบแกรม (Gram’s staining) เพ�อศกษา

ลกษณะสณฐานวทยา รปราง และการตดสแกรม ภายใตกลองจลทรรศนแบบเลนสประกอบ

(Compound microscope) กาลงขยายของภาพ 1000 เทา

4.4.2 การจาแนกชนดเช�อแบคทเรย โดยการหาลาดบเบส 16S rRNA

1) การสกดดเอนเอของเช�อแบคทเรย

นาเช�อบรสทธ� เพาะเล�ยงในอาหารเหลวสตร NB แลวนาไปบมท�อณหภม 37 องศาเซลเซยส

นาน 24 ช�วโมง จากน�นแยกเซลลแบคทเรยออกจากอาหาร NB โดยการนาไปป�นเหว�ยง 10,000

รอบ/นาท เปนเวลา 5 นาท เซลลแบคทเรยจะตกตะกอนอยท�กน Microcentrifuge tube ทาการสกดด

เอนเอของเช�อแบคทเรยดวยชดสกดดเอนเอสาเรจรป Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured

Cell) (Geneaid, Taiwan)

2) การเพ�มปรมาณดเอนเอดวยเทคนค PCR (Polymerase chain reaction) และตรวจสอบ

ความบรสทธ� ของผลตภณฑ PCR (PCR product) ดวยอะกาโรสเจลอเลกโทรโฟรซส (agarose gel

electrophoresis)

นาดเอนเอของเช�อแบคทเรยมาเพ�มปรมาณดวยเทคนค PCR ดวยเคร�อง PCR Mastercycler

Personal โดยใช primer คอ 27F (5'AGAGTTTGATCMTGG CTCAG-3') และ1522R (5'-

AAGGAGGTGATCCRCCGCA -3') จากน� นตรวจสอบ PCR product ดวย agarose gel

electrophoresis โดยนาเจลไปสองภายใตแสงอลตราไวโอเลตดวยเคร� อง Dark readerทาให

สงเกตเหนแถบของดเอนเอปรากฏข�น จากน�นนา PCR product ของช�นสวน 16S rDNA ท�ไดมาทา

ใหบรสทธ� ดวยชด GEL/PCR DNA Fragments Extraction Kit (RBC Bioscience, Taiwan) ดเอนเอ

บรรจอยภายใน Microcentrifuge tubeและนาไปเกบไวท� -20 องศาเซลเซยส

31

3) การจาแนกชนดของเช�อแบคทเรย โดยการหาลาดบเบสในสวนของยน 16S rRNA

นา PCR product ท�ทาใหบรสทธ� แลววเคราะหหาลาดบเบสในสวนของยน 16S rRNA โดย

ในการวจยคร� งน� ไดจดสงไปหาลาดบเบสท�บรษท First BASE Laboratories ณ ประเทศมาเลเซย

แลวนาลาดบเบสท�ไดไปเปรยบเทยบกบฐานขอมล โดยใชโปรแกรม BLAST ของ The National

Center for Biotechnology Information (NCBI) (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov) เพ�อระบสายพนธ

ของเช�อแบคทเรย

4.5 ทดสอบความสามารถการเปนจลนทรยปฏปกษของเช�อ chlorate reducing bacteria ตอ

ของเช�อจลนทรยกอโรคลาไย

4.5.1 การแยกเช�อสาเหตโรคและบงชนด

เกบตวอยางลาไยท�เปนโรคจากแหลงปลกในพ�นท�อาเภอสนทราย ดวยวธการเล�ยงเน�อเย�อท�

เปนโรคโดยตดเน�อเย�อบรเวณคาบเก�ยวเน�อเย�อปกตและเน�อเย�อเปนโรคใหเปนช�นส� เหล�ยมขนาด

ประมาณ 3x3 มลลเมตร ใชปากคบนาไปวางบนผวหนา Potato Dextrose Agar (PDA) plate ท�ผสม

ยาปฏชวนะ บมท�อณหภมหอง จนมเสนใยของเช�อราปรากฏบนจานอาหาร แลวใชเขมเข�ยตด

อาหารวนบรเวณปลายเสนใยไปเล�ยงบน PDA plate ใหมท�เตรยมไว บมท�อณหภมหองจนเช�อรา

ออกเสนใยใหมอกคร� งจนไดเช�อบรสทธ� ตามวธ Hyphal tip isolation เกบบรเวณปลายสดของเสน

ใยมาเกบเปน stock culture บน PDA slant

4.5.2 การคดเลอกแบคทเรยท�แยกมาจากบรเวณผวใบลาไยและผลลาไย ในการยบย �งเช�อรา

กอโรคในลาไย โดยใชวธการทดสอบแบบ Dual culture (Mostapha, 2004)

เพาะเล�ยงเช�อราบนอาหาร PDA แลวเจาะดวย cork borer ท�มขนาดเสนผานศนยกลาง 0.5

เซนตเมตร นามาวางบนจานอาหาร PDA แลวนาแบคทเรยท�ตองการทดสอบมาขดเปนเสนขนาน

กบเช�อราดานตรงขาม บมท�อณหภมหองประมาณ 2 วน วดความยาวรศมของโคโลนเช�อรา เทยบ

กบเช�อราท� เจรญบนจานอาหารท�ไมปลกเช�อแบคทเรยทดสอบ (control) จากน�นนามาหาคา

เปอรเซนตการยบย �งการเจรญของเสนใยตามกรรมวธของ Mostapha (2004)

32

4.6 ทดสอบความสามารถในการผลตฮอรโมนพชโดยเฉพาะออกซนของ chlorate reducing

bacteria

4.6.1 การทดสอบการผลต Indole-3-adetic acid (IAA) จากแบคทเรยสลายคลอเรต

1) นาเช�อแบคทเรยสลายคลอเลตท�ง 91 ไอโซเลต คดแยกจากดนสวนลาไยท�ได มาเพาะเล�ยงใน

อาหาร Tryptone Soy Broth (TSB)

2) นาไปบมไวท�อณหภม 37 องศาเซลเซยสองศาเซลเซยส เปนเวลา 24-48 ช�วโมง

3) จากน�นนามา Streak ลงบนอาหาร Tryptone Soy Agar (TSA) นาไปบมไวท�อณหภม 37

องศาเซลเซยสองศาเซลเซยส เปนเวลา 24-48 ช�วโมง

4) นามาเพาะเล� ยงเช�อในอาหารเอยง TSA นาไปบมไวท�อณหภม 37 องศาเซลเซยสองศา

เซลเซยส เปนเวลา 24-48 ช�วโมง

5) นาเช�อแบคทเรยสลายคลอเรตท�อยในอาหารเอยง TSA ม า เ ล� ย ง ใ น อ า ห า ร Nutrent

broth (NB) และ Trypton soy broth (TSB) ท�เตม tryptophan 200 mg/ml บมไวท�อณหภม 37 องศา

เซลเซยสองศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ช�วโมง

6) นาไปวเคราะหปรมาณ IAA ตามวธมาตรฐาน (Ahmad et al, 2008) ในภาคผนวก ข

4.6.2 การทดสอบผลของความเขมขน tryptophan ตอการผลต IAA

1) คดเลอกเช�อแบคทเรยท�ผลต IAA ไดสง 30% แรกและนามาเพาะเล�ยงในอาหาร TSB ท�

อณหภม 37 องศาเซลเซยส เวลาประมาณ 24-72 ช�วโมง

2) ปรบปรมาตรเช�อแบคทเรยใหมความขน เทากบ McFarland No. 0.5 (ภาคผนวก ค)

(1.5x108 cell/ml)โดยใช 0.85% NaCl

3) ถายเช�อแบคทเรยปรมาตร 0.2 ml ลงในอาหารเล�ยงเช�อ TSB ท�มปรมาณ tryptophan

ความเขมขน 0, 200, 400 และ 600 mg/ml

เปอรเซนตยบย �ง = ( Control growth - Fungal growth )

X 100 Fungal growth

33

4) นาไปบมท�อณหภม 37 องศาเซลเซยส เวลา 24, 48 และ 72 ช�วโมง

5) นาไปวเคราะหปรมาณ IAA ในภาคผนวก ง

4.6.3 ผลของ pH ตอการผลต IAA

1) เตรยมเช�อแบคทเรยเชนเดยวกบท�ทดสอบผลของความเขมขนของ tryptophan ตอการ

ผลต IAA ของเช�อแบคทเรย

2) ถายเช�อปรมาตร 0.2 ml ใสลงในอาหาร TSB ท�มปรมาณ tryptophan 200 mg/ml ท�ม

pH ตางๆ คอ 5, 6, 7, 8 และ 9 นาไปบมท�อณหภม 37 องศาเซลเซยส เวลา 24, 48 และ 72 ช�วโมง

3)วเคราะหปรมาณ IAA ในภาคผนวก ง

4.6.4 ผลของการใหอากาศโดยการเขยาตอการผลต IAA

1) เตรยมสารละลายเช�อแบคทเรยตามวธการในขอ 3

2) ถายสารละลายเช�อแบคทเรย 4 ml ลงในอาหาร TSB ซ�งเตม tryptophan เทากบ 200

mg/ml ปรมาตร 100 ml เกบตวอยางท�ระยะเวลา 1, 2, 3, 5 และ 7 วน

3) วเคราะหปรมาณ IAA ในภาคผนวก ง

4.7 ทดสอบความสามารถของเช�อ chlorate reducing bacteria ในการละลายฟอสเฟต

4.7.1 ทดสอบความสามารถของเช�อ chlorate reducing bacteria ในการละลายฟอสเฟต

เบ�องตนบนอาหารแขง Pikovskaya (PVK) medium และ National Botanical Research Institute’s

(NBRI) phosphate growth medium โดยวธการ point inoculation (Nautiyal, 1999)

4.7.2 จากน�นนามาทดสอบโดยละเอยดในเชงปรมาณในอาหารเหลวตามวธการของ

Pandey et al. (2006) โดยเพาะเล�ยงเช�อ chlorate reducing bacteria ในอาหารเหลวปรมาตร 100

มลลลตร เกบตวอยางทก 3 วน นาน 15 วน โดยนาไปวเคราะหปรมาณฟอสเฟต (พชร, 2550)

4.8 การศกษาปจจยบางประการท�มผลตอฤทธ� ยบย �งเช�อจลนทรยกอโรคในลาไย การผลต

ฮอรโมนพช และความสามารถในการละลายฟอสเฟตของเช�อ chlorate reducing bacteria

34

4.9 ปจจยในการออกฤทธ� ยบย �งเช�อจลนทรยกอโรคในลาไย

ตรวจสอบการผลตเอนไซม chitinase โดยนาเช�อ chlorate reducing bacteria ท�มฤทธ�

ยบย �งเช�อจลนทรยกอโรคในลาไย มาตรวจสอบการผลตเอนไซม chitinase บนอาหารแขงโดยวธ

ของ Cherni et al. (1995)

35

ผลการทดลองและวจารณ

1. ผลการคดแยกเช�อรากอโรคในลาไย จากตวอยางลาไย

ผลการแยกเช�อราสาเหตโรคของลาไย ตามวธ Hyphal tip isolation ลงในอาหาร Potato

Dextrose Agar (PDA) ในพ�นท�อาเภอสนทราย จงหวดเชยงใหม ท�แสดงอาการโรคท�มสาเหตจาก

เช�อรา 2 ลกษณะคอจดสดา และจดสสมท�ใบ (ภาพท� 1) ไดเช�อราจานวนท�งส�นจานวน 10 ไอโซเลต

โดยใหเช�อรารหส L4.4B, L5.3B, L5.2A และรหส L4.1B และตวแทนของเช�อราท�งหมด จาก

ลกษณะโคโลนท�เหมอนกนโดยแบงออกเปน 4 ลกษณะ คอ 1)โคโลนสเทา เสนใยไมฟและกระจาย

ขอบโคโลนเรยบ ใหเช�อรารหส L4.1B เปนตวแทนของเช�อรา 2) โคโลนสเทา เสนใยฟและกระจาย

สปอรสดา ใหเช�อรารหส L4.4B เปนตวแทนของเช�อรา 3)โคโลนสขาว เสนใยมลกษณะฟและ

กระจาย ใหเช�อรารหส L5.2A เปนตวแทนของเช�อราในลกษณะน� 4)โคโลนสขาว เสนใยไมข�นฟ

และกระจาย ใหเช�อรารหส L5.2B เปนตวแทนของเช�อรา 3) และ 4) ดงแสดงในตารางท� 4 จากการ

จาแนกชนดโดยอาศยหลกการของ Alexopoulos และคณะ (1996) และ วรวรรณและวชชา (มปป.)

พบวา L4.1B เปนเช�อราท�ไมมการเปล�ยนแปลงโครงสรางของเสนใยไปเปน asexual spores เรยกวา

เปน mycelia sterilia ในขณะท� L4.4B, L5.2A และ L5.2B เปนเช�อราในจนส Meliola,

Collectrichum และ Phomopsis ตามลาดบ

ก. ข.

ภาพท� 8 ตวอยางช�นสวนใบพชท�มอาการของโรคท�เกดจากเช�อราท�ใชในการแยกตวอยางเช�อบ (ก)

ใบท�มจดสดา (ข) ใบท�มจดสสม

ตารางท� 1 การจาแนกเช�อราท�แยกไดจากตวอยางใบลาไยท�มอาการของโรค

ตวอยางเช�อรา ลกษณะโคโลนบนอาหาร PDA ลกษณะภายใตกลองจลทรรศน

L4.1B

(400x)

L4.4B

(400x)

L5.2A

(400x)

L5.2B

(400x)

2. การทดสอบฤทธ�การยบย�งเช�อรากอโรคในลาไย โดยใชแบคทเรยสลายคลอเรตโดยใชวธการ Dual

culture

37

เม�อนาแบคทเรยสลายคลอเรตจานวน 91 ไอโซเลต มาทดสอบประสทธภาพการยบย �งการ

เจรญของเสนใยเช�อรา บนอาหาร Potato Dextrose Agar (PDA) หลงจากเล�ยงเช�อรวมกนเปนเวลา 3

– 5 วน พบวาแบคทเรยสลายคลอเรต สามารถยบย �งการเจรญของเสนใยเช�อรากอโรคลาไยได

จานวน 11 ไปโซเลต และพบบรเวณใส (clear zone) ระหวางโคโลนของเช�อแบคทเรยสลายคลอเรต

และเช�อรากอโรคลาไย (ภาพท� 2) โดยจะใหเปอรเซนตการยบย �งเช�อแตกตางกนไป โดยเช�อ

แบคทเรยสลายคลอเรตท�สามารถยบย �งการเจรญของเช�อรา mycelia sterilia L4.1B มเพยง 1 ไอโซ

เลต คอ ไอโซเลต 1-2D โดยสามารถยบย �งการเจรญได 25 เปอรเซนต เม�อเปรยบเทยบกบการ

ทดลองควบคม

สาหรบการทดสอบฤทธ� ยบย �งเช�อรา Meliola L4.4B มเช�อแบคทเรยท�สามารถยบย �งได 2

ไอโซเลตคอ K7-1A.1.3 และ 7.2.1 โดยยบย �งการเจรญของเช�อราได 28.3 และ 30.6 เปอรเซนต

ตามลาดบ (ตารางท� )

ตารางท� 2 ผลการทดลองการยบย �งเช�อรา รหส L4.1B

รหสเช�อแบคทเรย เสนผานศนยกลาง

(มลลเมตร)

คาการยบย �ง

(มลลเมตร)

เปอรเซนตการยบย �ง

เช�อรา รหส L4.1B

control 53.72

1-2D 40.29 10.12 25.00

ตารางท� 3 เช�อแบคทเรยคลอเรตท�สามารถยบย �งการเจรญของเช�อรา Meliola L4.4B

รหสเช�อแบคทเรย เสนผานศนยกลาง

(มลลเมตร)

คาการยบย �ง

(มลลเมตร)

เปอรเซนตการยบย �ง

เช�อ

control 66.77

38

K7-1A.1.3 47.89 3.33 28.27

7.2.1* 46.37 7.92 30.55

ตารางท� 4 ผลการทดลองการยบย �งเช�อรา รหส L5.2B

เช�อแบคทเรย เสนผานศนยกลาง

(มลลเมตร)

คาการยบย �ง

(มลลเมตร)

เปอรเซนตการยบย �ง

เช�อ

control 51.72

10-2.2 37.52 5.67 27.45

9.3B.1 39.66 6.65 23.32

1-2D 36.62 11.93 29.19

9-5E 35.52 5.77 31.31

3-1A.1 35.81 4.30 30.76

9-3-2 30.81 7.37 40.43

9-2.1 36.22 3.46 29.97

7.2.1* 30.20 8.29 41.60

1-2A 34.33 6.78 33.61

5.1.1 28.34 5.74 45.20

C2-3.1 29.40 4.18 43.15

1-1E.2.1 31.40 5.97 39.29

K73.1.1 31.64 4.19 38.82

สาหรบการทดสอบกบเช�อรา Collectrichum L5.2A และ Phomopsis L5.2B ซ�งเช�อราในท�ง 2 จนส

น� เปนสาเหตของโรคใบจดดา พบวามเช�อแบคทเรยสลายคลอเรตจานวน 17 ชนดท�แสดงการยบย �ง

การเจรญของเช�อราดงกลาว ไดในชวง 20.7-49.4 เปอรเซนต (ตารางท� และ ) โดยมเช�อแบคทเรย

เพยง 6 ไอโซเลตท�มฤทธ� ยบย �งการเจรญของเช�อราไดท�ง 2 ชนด ไดแก 1-2A, 1-2D, 5.1.5, 9.3B.1,

10-2.2 และ K7-1A.1.3 (ภาพท�)

39

ภาพท� 9 การยบย �ง Collectrichum L5.2A และ Phomopsis L5.2B สาเหตโรคใบจดดาของเช�อ

แบคทเรยสลายคลอเรต

ตารางท� 5 ผลการทดลองการยบย �งเช�อรา รหส L5.2A

รหสเช�อแบคทเรย เสนผานศนยกลาง

(มลลเมตร)

คาการยบย �ง

(มลลเมตร)

เปอรเซนตการยบย �ง

เช�อรา รหส L5.2A

control 54.20

3-2D.1.2 38.54 6.49 28.89

9-5.1 32.91 7.67 39.27

9-3B.1 39.35 48.05 27.40

1-2D 42.97 3.37 20.72

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1-2A 1-2D 5.1.1 9.3B.1 10-2.2 K7-1A.1.3

เปอร

เซนต

การย

บย �งก

ารเจ

รญ

เช�อแบคทเรยสลายคลอเรต

Phomopsis Colletrichum

40

10-2.2 38.99 4.32 28.06

5.1.1 38.84 2.31 28.34

C7-1B.2 27.42 9.14 49.40

1-2A 30.77 5.02 43.22

K7-1A.1.3 37.04 6.21 31.66

ภาพท� 10 แบคทเรยสลายคลอเรตท�มฤทธ� ยบย �งเช�อรากอโรคในลาไย โดยใชโดยใชวธการทดสอบ

แบบ Dual culture

3. การจาแนกชนดของแบคทเรยสลายคลอเรตท�สามารถยบย�งเช�อรากอโรคในลาไย

3.1 การศกษาลกษณะทางสณฐานวทยาของแบคทเรย

จากการจาแนกชนดของเช�อแบคทเรยสลายคลอเรต โดยการศกษาลกษณะพ�นฐานทาง

สรรวทยา พบวาท�ง 11 ไอโซเลตน� เปนแบคทเรยแกรมลบ รปทอน ดงแสดงในตารางท�

3.2 ผลการจาแนกชนดของเช�อแบคทเรยสลายคลอเรตดวยเทคนคทางอณวทยาดวยวธการหาลาดบ

เบสของ 16S rRNA

เม�อนาเช�อแบคทเรยสลายคลอเรตท�สามารถยบย �งการเจรญของเช�อราท�นามาทดสอบท�ง 11

ไอโซเลต ไปจาแนกโดยเร� มจากการสกดดเอนเอ ดวยชดสาเรจรป GEL/PCR DNA Fragments

41

Extraction Kit และนามาทาปฏกรยา Polymerase Chain Reaction โดยใช Universal Primer 27F

และ 1522R เปน primer เม�อนามา run gel – electrophoresis พบวา เช�อแบคทเรยสลายคลอเรต

ผลตภณฑเกดข�นใหแถบดเอนเอท�มขนาด 1500 คเบส จากน�นสงผลตภณฑท�ไดไปหาลาดบเบสท�

บรษท First BASE Laboratories ณ ประเทศมาเลเซย

หลงจากการจาแนกชนดของเช�อแบคทเรยสลายคลอเรตโดยนาลาดบเบสท�ไดไปเทยบกบ

ฐานขอมลของ The National Center for Biotechnology Information (NCBI)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov ) ดงแสดงตวอยางการเปรยบเทยบลาดบเบสในภาพท� 3 พบวา เช�อ

รหส 9-5E, 7.2.1, 9-5.1, K7-1A.1.3 และเช�อรหส 10-2.2 มความเหมอนกบ Bacillus

amyloliquefaciens strain EGY-SCJ1 ท�ม GenBank Accession no. คอ KF576648.1 เทากบ 100%

ในขณะท�เช�อรหส K5-3C มความเหมอนกบ Pseudomonas mendocina strain B6-1ท�ม GenBank

Accession no. คอ EU100399.1 เทากบ 100% เช�อรหส 1-2D มความเหมอนกบ Bacillus subtilis

strain 2B ท�ม GenBank Accession no. คอ KF112078.1 เทากบ 100% เช�อรหส 10-5.1 มความ

เหมอนกบ Pseudomonas sp. AKM-L5 ท�ม GenBank Accession no. คอ KF649130.1 เทากบ 100%

เช�อรหส 9-2.1 มความเหมอนกบ Alcaligenaceae bacterium KAs3-R3 ท�ม GenBank Accession

no. คอ JX110531.1 เทากบ 100% เช�อรหส 1-2A มความเหมอนกบ Staphylococcus epidermidis

strain G0242 ท�ม GenBank Accession no. คอ KF575163.1 เทากบ 100% และสดทายเช�อรหส

5.1.1 มความเหมอนกบ Pseudomonas putida strain L39 ท�ม GenBank Accession no. คอ

KF42930.1 เทากบ 100% (ตารางท� 11 ) ซ�งเช�อท�ง 11 ไอโซเลตน�แยกไดจากดนและกากตะกอนน� า

เสย

ตารางท� 6 ลกษณะทางสณฐานวทยาของแบคทเรยท�สามารถยบย �งเช�อรากอโรคในลาไย

ไอโซ

เลต โคโลนแบคทเรย เซลลแบคทเรย

แกรม/

รปราง ชนดของเช�อแบคทเรย

K5-3C

ลบ/

rods

Pseudomonas mendocina

strain B6-1

42

1-2D

บวก/

ทอน Bacillus subtilis

strain 2B

10-5.1 ลบ/

rods

Pseudomonas sp.

AKM-L5

9-5E

บวก/

ทอน Bacillus amyloliquefaciens

strain EGY-SCJ1

7.2.1

บวก/

ทอน Bacillus amyloliquefaciens

strain EGY-SCJ1

ตารางท� 6 (ตอ)

ไอโซ

เลต โคโลนแบคทเรย เซลลแบคทเรย

แกรม/

รปราง ชนดของเช�อแบคทเรย

9-2.1

ลบ/

rods Pseudomonas putida

strain L39

1-2A

บวก/

กลม Stapphylococcus

9-5.1

บวก/

ทอน Bacillus amyloliquefaciens

strain EGY-SCJ1

43

K7-

1A.1.3

บวก/

ทอน Bacillus amyloliquefaciens

strain EGY-SCJ1

5.1.1 ลบ/

rods

Pseudomonas putida

strain L39

10-2.2

บวก/

ทอน Bacillus amyloliquefaciens

strain EGY-SCJ1

ภาพท� 11 ลาดบนวคลโอไทดของเช�อแบคทเรย ไอโซเลท K5-3C (ความยาว 320 ค เบส)

เปรยบเทยบกบฐานขอมล NCBI โดยแสดงความเหมอนตอลาดบนวคลโอไทดของเช�อ

Pseudomonas mendocina strain B6-1 100%

44

ตารางท� 7 การจาแนกชนดของเช�อแบคทเรยสลายคลอเรตดวยเทคนคทางอณชววทยา โดยการเทยบ

กบ National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)

No. Isolate Length

(bp) Nearest relative

Malty

(%)

1 K5-3C 320 Pseudomonas mendocina strain B6-1 100

2 1-2D 350 Bacillus subtilis strain 2B 100

3 10-5.1 360 Pseudomonas sp. AKM-L5 100

4 9-5E 250 Bacillus amyloliquefaciens strain EGY-SCJ1 100

5 7.2.1 320 Pseudomonas mendocina strain B6-1 100

6 9-2.1 280 Bacillus subtilis strain 2B 100

7 1-2A 340 Pseudomonas sp. AKM-L5 100

8 9-5.1 280 Bacillus amyloliquefaciens strain EGY-SCJ1 100

9 K7-1A.1.3 310 Bacillus amyloliquefaciens strain EGY-SCJ1 100

10 5.1.1 261 Pseudomonas putida strain L39 100

11 10-2.2 330 Bacillus amyloliquefaciens strain EGY-SCJ1 100

4. การทดสอบการผลต Idole-3-acetic acid (IAA) จากแบคทเรยสลายคลอเรต

45

จากการนาแบคทเรยท�มความสามารถในการสลายคลอเลตจานวน 91 ไอโซเลต

(ศรกาญจนา,2555) ซ�งท�งหมดน�แยกไดจากดนสวนลาไยมาทดสอบความสามารถในการผลต IAA

โดยการเพาะเล�ยงในอาหาร Tryptic soy broth (TSB) จนพบการเจรญของเช�อ กอนนาไปเล�ยงใน

Nutrient broth (NB) และ TSB ซ�งเตม L-tryptophan ความเขมขน 200 mg/ml โดยใชปรมาณของ

เช�อเร�มตนเทากบ 0.2 ml พบวาในอาหาร NB มเช�อแบคทเรยท�สามารถผลต IAA ท�งส�น 47 ไอโซ

เลต โดยปรมาณท�ผลตไดเทากบ 1.2 - 45.8 µg/ml สาหรบในอาหาร TSB น�นมเช�อแบคทเรย

จานวน 63 ไอโซเลตท�พบการผลต IAA โดยผลตไดในความเขมขน 1.1-57.6 µg/ml

เม�อนาผลการทดลองใน 2 อาหารดงกลาวขางตน คดเลอกเช�อแบคทเรยท�มความสามารถ

ในการผลต IAA ไดสงจานวน 5 ไอโซเลต พบวาเช�อแบคทเรยท�ผลต IAA ไดสงในอาหาร NB ท�งน�

สบเน�องมาจาก NB ท�ใชในคร� งน� เปนอาหารสาเรจรปท�มการเตม (LAB M Limited, UK) yeast

extract จงมความสมบรณมากกวา NB ปกต ท�มสวนประกอบเพยง beef extract และ peptone

รวมท�ง TSB ดวย

ตารางท� 8 ปรมาณ IAA ในอาหาร Nutrient broth (NB) และ Tryptic soy broth (TSB)

ไอโซเลต IAA(µg/ml)

NB TSB

10-2.1 32.2ab 32.4d

6-3.1 35.7abc 28.3c

9-4C.2 37.5ab 14.1b

9-4D.1 43.6c 11.4a

C9-24.2 45.8d 57.6e

5. ผลของความเขมขน tryptophan ตอการผลต IAA ของเช�อแบคทเรยท�คดเลอก

หลงจากคดเลอกเช�อได 5 ไอโซเลตแลว นามาทดสอบการผลต IAA ในอาหาร TSB

เน�องจาก NB เตม yeast extract มราคาสงกวา นอกจากน� ยงมการปรบปรมาณเช�อเร� มตน และ

46

ระยะเวลาเพาะเล�ยงใหเทากน คอ เตรยมเช�อเร�มตนใหมความขนมาตรฐาน McFarland No. 0.5 และ

ใชปรมาณเช�อเทากบ 0.2 ml

ในการทดลองท�ทดสอบความเขมขนของ tryptophan โดยใชความเขมขนเทากบ 0, 200,

400 และ 600 µg/ml บมท�อณหภม 37 องศาเซลเซยส โดยไมเขยาพบวา ผลการทดลองดงรปท� 1 จะ

เหนวาเม�อเพ�มความเขมขนของ tryptophan เช�อท�ง 5 ไอโซเลต ผลต IAA ไดมากข�นดวย คอ สวน

ใหญในอาหาร TSB ท�เตม tryptophan 600 mg/ml จะไดปรมาณ IAA สงกวาในอาหารท�เตม

tryptophan 200 และ 400 mg/ml โดยไอโซเลต 10-2.1 ผลตไดสงสดท�ระยะเวลา 72 ช�วโมง และ

แตกตางจาก 24 และ 48 ช�วโมงอยางมนยสาคญ ในขณะท� 6-3.1 ในอาหาร TSB ท�เตม tryptophan

600 mg/ml ผลตไดสงสดเชนกนโดยระยะเวลา 24, 48 และ 72 ช�วโมง อยางไมมนยสาคญ สวนเช�อ

9-4C.2, 9-4D.1 และ C9-24.2 สามารถผลต IAA ไดในอาหาร TSB ท�เตม tryptophan 600 mg/ml

เชนกน ท�ระยะเวลา 48 ช�วโมง ดงภาพท� 8

6. ผลของ pH ตอการผลต IAA

ในการทดสอบผลของ pH ในชวง 5-9 ตอการผลต IAA ในอาหาร TSB ท�เตม tryptophan

200 mg/ml พบวามเช�อแบคทเรย 3 ไอโซเลตคอ 10-2.1, 6-3.1 และ C9-24.2 ผลต IAA ไดสงท� pH 7

ในขณะท� 9-4C.2 ผลตไดสงท� pH 8 และ 9-4D.1 ผลตไดสงท� pH 9 แสดงดงตารางท� 9-13

จากผลการทดลองแสดงใหเหนวาเช�อแบคทเรยสลายคลอเรตสวนใหญสามารถผลต IAA

ไดสงในชวงท�ม pH 7-9 ซ�งเปนชวง pH ท�เช�อมการเจรญด ดงน�นจงสงผลทาใหสามารถผลต IAA

ไดสงตามมา แตในชวงท�ม pH เปนกรดซ�งเช�อแบคทเรยสวนใหญไมสามารถเจรญไดจงทาใหไมม

การผลต IAA หรอ ผลต IAA ไดนอย

47

bc

de

ff

bcd

e

g

ab

bc

f

h

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

0 200 400 600

IAA(

µg/m

l)

Trytophan concentration(mg/ml) ก.

bb

cd

fg

a

c

def

g

aa

deefg

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

0 200 400 600

IAA(

µg/m

l)

Trytophan concentration(mg/ml)ข.

aabc

d cd

ab ab

d

f

a

dbcd bcd

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

0 200 400 600

IAA(

µg/m

l)

Trytophan concentration(mg/ml)ค.

abc a cd

ababcd abcd abcd

dbcd cd bcdcd

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

0 200 400 600

IAA(

µg/m

l)

Trytophan concentration(mg/ml)ง.

48

ภ า พ ท� 1 2 ผ ล ข อ ง ค ว า ม เ ขม ข น

tryptophan ตอการผลต IAA ของเช�อ

แบคทเรยสลายคลอเลต 5 ไอโซเลตคอ

ก. 10-2.1, ข. 6-3.1, ค. 9-4C.2, ง. 9-

4D.1 และ จ. C9-24.2 แสดงความ

แตกตางอยางมนยสาคญทางสถตตาม

Multiple Range Test (P<0.05)

ตารางท� 9 ผลของ pH ตอการผลต IAA ของเช�อไอโซเลต 10-2.1

pH ปรมาณ IAA (g/ml) ท�ชวงเวลาตางๆ

24 48 72

5 5.6ab 4.5a 10.7cd

6 9.2c 8.5bc 12.6def

7 9.8cd 16.5ghi 17.9i

8 13.1def 15.7fghi 14.2efg

9 11.2cde 14.5efgh 17.7hi

ตารางท� 10 ผลของ pH ตอการผลต IAA ของเช�อไอโซเลต 6-3.1

pH ปรมาณ IAA (g/ml) ท�ชวงเวลาตางๆ

24 48 72

5 0.0a 3.7b 0.0a

6 11.2c 9.6c 25.0g

7 17.3def 17.5ef 31.5h

8 15.1de 8.3c 27.1g

9 14.9de 14.6d 18.1f

ab

b b bab ab

b

d

a

c

ab

c

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

0 200 400 600

IAA(

µg/m

l)

Trytophan concentration(mg/ml)

24 hrs 48 hrs 72 hrs จ.

49

ตารางท� 11 ผลของ pH ตอการผลต IAA ของเช�อไอโซเลต 9-4C.2

pH ปรมาณ IAA (g/ml) ท�ชวงเวลาตางๆ

24 48 72

5 7.3ab 5.7a 9.5cd

6 6.9ab 10.7d 10.2d

7 10.2d 11.3d 10.0cd

8 11.2d 18.1f 15.8e

9 8.1bc 10.4d 13.9e

ตารางท� 12 ผลของ pH ตอการผลต IAA ของเช�อไอโซเลต 9-4D.1

pH ปรมาณ IAA (g/ml) ท�ชวงเวลาตางๆ

24 48 72

5 2.5b 0.5a 3.4bc

6 4.4cd 6.2ef 6.1ef

7 7.5fg 12.9j 8.9gh

8 5.5de 9.0h 12.7j

9 8.8gh 10.6i 17.5k

ตารางท� 13 ผลของ pH ตอการผลต IAA ของเช�อไอโซเลต C9-24.2

pH ปรมาณ IAA (g/ml) ท�ชวงเวลาตางๆ

24 ช�วโมง 48 ช�วโมง 72 ช�วโมง

5 9.0bcde 7.0abc 6.1a

6 6.7ab 11.5fgh 10.9efg

7 7.7abcd 14.7i 13.6hi

8 8.2abcd 14.4i 13.4hi

9 9.8defg 11.7gh 9.2cdef

50

7. ผลของออกซเจนดวยการเขยาตอการผลต IAA

การศกษาผลของออกซเจนดวยการเขยาโดยเล�ยงเช�อท�ง 5 ไอโซเลตในอาหาร TSB ท�ม

tryptophan เขมขน 200 mg/ml เปนระยะเวลา 1-7 วน และ ศกษาการเจรญของเช�อแบคทเรยท�มการ

เพ�มออกซเจนโดยการเขยา กบระยะการเจรญของเช�อแบคทเรย ในการผลต IAA ซ�งจากการศกษา

พบวา

เช�อไอโซเลต 10-2.1 สามารถผลต IAA ไดสงในชวงระยะการเจรญท�คงท� (stationary

phase) โดยในวนท� 5 เช�อไอโซเลต 10-2.1 สามารถผลต IAA ไดเทากบ 51.8 µg/ml และ และใน

วนท� 7 สามารถผลต IAA ไดสงถง 94.7 µg/ml ซ�งในชวงท�มการผลต IAA ของเช�อแบคทเรยใน

วนท� 7 น�นพบวาการเจรญของเช�อลดลงเม�อพจารณาจากคาความขน ดงแสดงในภาพท� 9 ก.

เช�อไอโซเลต 6-3.1 สามารถผลต IAA เฉล�ยไมแตกตางกนมากนกในวนท� 1-3 คอ 28.1-

44.4 µg/ml แลวในวนท� 5 พบวาสามารถผลต IAA ไดเทากบ 119.9 µg/ml และในวนท� 7 สามารถ

ผลต IAA ไดสงถง144.4 µg/ml ซ�งชวงท�เช�อไอโซเลต 6-3.1 ผลต IAA ไดสงน�นคอวนท� 5-7 พบวา

เช�ออยในระยะการเจรญลดลงเชนกน ดงแสดงในภาพท� 9 ข.

เช�อไอโซเลต 9-4C.2 ใหปรมาณ IAA ไมแตกตางกนในวนท� 1 และ 2 คอ 15.9 และ 16.6

µg/ml ตามลาดบ และในวนท� 3 พบวาสามารถผลต IAA ไดเทากบ 43.7 µg/ml ซ�งพบวาเช�อเขาส

ระยะการเจรญคงท� และในวน 5 และ 7 พบวาเช�อแบคทเรยสามารถผลต IAA ไดสงถง 103.8 และ

113.0 µg/ml ซ�งใหคาเฉล�ยท�ไมตางกน ในชวงท�เช�อมการผลต IAA ในปรมาณท�สงน�นอยในระยะ

การเจรญของเช�อท�คงท� เชนกน ดงแสดงในภาพท� 9 ค.

เช�อไอโซเลต 9-4D.1 พบวาเปนเช�อแบคทเรยสลายคลอเรตท�สามารถผลต IAA ไดสงสด

เม�อเปรยบเทยบกบเช�อแบคทเรยไอโซเลตอ�นๆท�งหมดในงานวจย และจากการศกษาของงานวจย

หลายเร�องท�ผานมา ดงน�นเช�อไอโซเลต 9-4D.1 จงเปนเช�อท�นาสนใจท�จะศกษาถงกระบวนการผลต

วถการผลต IAA หรอแมกระท�งสภาวะท�เหมาะสมตอการเจรญของเช�อเพ�อใหไดปรมาณ IAA

สงสด เพ�อใชประโยชนทางการเกษตรตอไป โดยในการทดลองน� พบวาเช�อไอโซเลต 9-4D.1

สามารถผลต IAA ไดสงถง 0.1 mg/ml ภายในระยะเวลา 1 วน และมแนวโนมท�จะผลต IAA สงข�น

51

เร�อยๆ ซ�งพบวาสามารถผลต IAA ไดสงถง 2.3 mg/ml ภายในระยะเวลา 7 วน เม�อดการเจรญพบวา

เช�อสามารถผลต IAA ไดสงในชวงการเจรญเร�มลดลงดงแสดงในภาพท� 9 ง.

เช�อไอโซเลต C9-24.2 สามารถผลต IAA ไดสงเทากบ 62.4 µg/ml ในวนท� 5 คอระยะ

stationary ของการเจรญ และสามารถผลต IAA ไดสงสดเทากบ 69.7 µg/ml ในวนท� 7 ซ�งมคาไม

แตกตางกนมากเม�อเปรยบเทยบคาเฉล�ยดวยวธการทางสถต Multiple Range Taste ดงแสดงในภาพ

ท� 9 จ. ซ�งจากผลการทดลองทกไอโซเลตแสดงใหเหนวาเช�อสวนใหญจะผลตออกซนในระยะท�ไม

มการเจรญ น�นแสดงใหเหนวา IAA ไมใชสาระสาคญตอการเจรญของเช�อ ดงน�นการเพ�มออกซเจน

โดยการเขยาซ�งจะชวยใหเช�อมการเจรญมากกวาท�ต�งท�งไวทกไอโซเลตใหปรมาณ IAA มากกวา

อยางเหนไดชดเจน

8. ผลการจาแนกชนดของแบคทเรยสลายคลอเลตท�ผลต IAA

จากการจาแนกชนดของเช�อแบคทเรยสลายผลต IAA โดยการศกษาลกษณะพ�นฐานทาง

สรรวทยา พบวาท�ง 5 ไอโซเลตน� เปนแบคทเรยแกรมลบ รปทอน 4 ไอโซเลต และแกรมบวก รป

กลม 1 ไอโซเลต ดงแสดงในตารางท� 7 และเม�อจาแนกชนดโดยการหาลาดบเบสของยน 16S rRNA

เทยบความเหมอนกบฐานขอมลลาดบเบสใน GenBank โดยใชโปรแกรม BLAST ของ The

National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www. ncbi.nlm.nih.gov) พบวา

เช�อไอโซเลต 10-2.1 และ C9-24.3 มความคลายกบ Pseudomonas sp. JC5 ท�ม GenBank Accession

No.คอ KF263569.1 100% ดงภาพท� 10 และ 14 , เช� อไอโซเลต 6-3.1 มความคลายกบ

Pseudomonas sp. F15 ท�ม GenBank Accession No.คอ KF573430.1 100% ดงภาพท� 11, เช�อไอโซ

เลต 9-4C.1 มความคลายกบ Pseudomonas sp. I12B-00129 ท�ม GenBank Accession No.คอ

KC589282.1 100% ดงภาพท� 12 และเช�อไอโซเลต 9-4D.1 มความคลายกบ Micrococcus sp.

SubaUpMs28 ท�ม GenBank Accession No.คอ KF574795.1 100% ดงภาพท� 13

52

ภาพท� 13 ผลของออกซเจนดวยการเขยา

(shaking) ตอการผลต IAA ของเช�อท�ง 5

ไอโซเลตคอ ก.เช�อไอโซเลต 10-2.1, ข.

เช�อไอโซเลต 6-3.1, ค. เช�อไอโซเลต 9-

4C.2, ง. เช�อไอโซเลต 9-4D.1 และ จ.เช�อ

ไอโซเลต C9-24.2

abca

ab

efg

h

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

1 2 3 5 7G

rowt

h (O

.D. 6

00)

IAA

()µg/

ml)

Days ก.

abcd bcdedef

jk

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0.0

50.0

100.0

150.0

200.0

1 2 3 5 7

Gro

wth(

O.D

. 600

)

IAA

()µg/

ml)

Daysข.

ab ab

cdef

hihi

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

1 2 3 5 7

Gro

wth(

O.D

.600)

IAA

()µg/

ml)

Days ค.

ijl

m

n

o

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

1 2 3 5 7

Gro

wth (

O.D

.600

)

IAA

(mg/

ml)

Days ง.

ab ab

adcd

fgg

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

1 2 3 5 7

Gro

wth(

O.D

.600)

IAA

()µg/

ml)

Days

จ.IAA Growth

53

ตารางท� 14 ลกษณะทางสณฐานวทยาของแบคทเรยท�ผลต IAA

ไอโซเลต โคโลนแบคทเรย เซลลแบคทเรย (กาลงขยาย

1000 เทา)

แกรม/

รปราง

ชนดของเช�อแบคทเรย

10-2.1

ลบ/

rods Pseudomonas sp. JC5

6-3.1

ลบ/

rods Pseudomonas sp.

F15

9-4C.1

ลบ/

rods Pseudomonas sp. I12B-

00129

9-4D.1

บวก/

cocci Micrococcus sp.

SubaUpMs28

C9-24.2

ลบ/

rods Pseudomonas sp. JC5

54

ภาพท� 14 ลาดบนวคลโอไทดของเช�อแบคทเรยไอโซเลท 10-2.1(ความยาว 561 คเบส) เม�อเทยบกบ

ฐานขอมล NCBI โดยแสดงความเหมอนตอลาดบนวคลโอไทดของเช�อ Pseudomonas sp. JC5

100%

55

ภาพท� 15 ลาดบนวคลโอไทดของเช�อแบคทเรยไอโซเลท 6-3.1 (ความยาว 531 คเบส) เม�อเทยบกบ

ฐานขอมล NCBI โดยแสดงความเหมอนตอลาดบนวคลโอไทดของเช�อ Pseudomonas sp.

F15100%

56

ภาพท� 16 ลาดบนวคลโอไทดของเช�อแบคทเรยไอโซเลท 9-4C.2 (ความยาว 521 คเบส) เม�อเทยบ

กบฐานขอมล NCBI โดยแสดงความเหมอนตอลาดบนวคลโอไทดของเช�อ Pseudomonas sp. I12B-

00129 100%

57

ภาพท� 17 ลาดบนวคลโอไทดของเช�อแบคทเรยไอโซเลท 9-4D.1 (ความยาว 481 คเบส) เม�อเทยบ

กบฐานขอมล NCBI โดยแสดงความเหมอนตอลาดบนวคลโอไทดของเช�อ Micrococcus sp.

SubaUpMs28 100%

58

ภาพท� 18 ลาดบนวคลโอไทดของเช�อแบคทเรยไอโซเลท C9-24.2 (ความยาว 411คเบส) เม�อเทยบ

กบฐานขอมล NCBI โดยแสดงความเหมอนตอลาดบนวคลโอไทดของเช�อ Pseudomonas sp.

JC5100%

การคดเลอกแบคทเรยท�ผลต Indole-3-acetic acid (IAA) จากผลการทดลองพบวาเช�อ

แบคทเรยสลายคลอเรตใหความเขมขนของ IAA ในอาหาร Tryptic soy broth (TSB) และ Nutrient

broth (NB) ท�แตกตางกนอาจจะสบเน�องมาจากแหลงของคารบอนท�แตกตางกนเชนในอาหาร NB

ม Beef Extract สวน TSB ม dextrose เปนแหลงคารบอน ซ�งปรมาณสารอาหารท�เปนแหลงคารบอน

ท�เตมลงไปในอาหารแตละสตรท�ไมเทากนกอาจจะสงผลตอการเจรญ โดยมรายงานของ Ahmad

และคณะ(2008) และ Oberhänsli และคณะ (1991) พบวาเช�อ Pseudomonas sp. สามารถสงเคราะห

IAA ได และ Sahasrabudhe (2011) ยงพบวาแหลงคารบอนท�เช�อแบคทเรยสวนใหญชอบและ

สามารถผลต IAA ไดสงสดคอ ใน mannitol และ พบวาเช�อ Rhizobium loti สามารถผลต IAA

สงสดใน lactose และในระยะเวลา 24 ช�วโมงพบวา Rhizobium leguminosarum สามารถผลต IAA

สงสดใน glucose ด�งน�นจงสรปไดวาแหลงคารบอนและระยะเวลามผลตอการผลต IAA

59

การศกษาผลของความเขมขนของ tryptophan พบวา การผลต IAA ของเช�อท�ง 5 ไอโซเลต

พบวาไอโซเลต 10-2.1 สามารถผลต IAA ไดสงสด และ พบวามเช�อ 1 ไอโซเลตทความเขมขนของ

tryptophan ไมมผลตอการผลต IAA สวนเช�ออก 4 ไอโซเลตน�นสามารถผลต IAA ไดสงสดใน

อาหารท�ม tryptophan เทากบ 600 mg/ml ซ�งสอดคลองกบงานวจยของ Gravel และ คณะ(2007)

รายงานวาเช�อ Pseudomonas putida B สามารถผลต IAA และสารประกอบ ไดถง 3.3 µg/ml โดยใช

tryptophan เปนสารต�งตนในการสงเคราะห และ ยงพบอกวาถาให tryptamine เปนสารต�งตนใน

การส�งเคราะห IAA เช�อ Pseudomonas putida B กจะสามารถผลต IAA ไดสงถง 23.40 µg/ml ยงม

รายงาน การเพ�ม tryptophan ลงไปในอาหาร 0.2-1.6 g/L จะสงผลใหเช� อ Azotobacter

diazotrophicus L1 สามารถผลต IAA สงสดในอาหารท�ม tryptophan 1.2 g/L (Nitaการศกษาผลของ

ความเขมขนของ tryptophan พบวา การผลต IAA ของเช�อท�ง 5 ไอโซเลตพบวาไอโซเลต 10-2.1

สามารถผลต IAA ไดสงสด และ พบวามเช�อ 1 ไอโซเลตทความเขมขนของ tryptophan ไมมผลตอ

การผลต IAA สวนเช�ออก 4 ไอโซเลตน�นสามารถผลต IAA ไดสงสดในอาหารท�ม tryptophan

เทากบ 600 mg/ml ซ� งสอดคลองกบงานวจยของ Gravel และ คณะ(2007) รายงานวาเช� อ

Pseudomonas putida B สามารถผลต IAA และสารประกอบ ไดถง 3.3 µg/ml โดยใช tryptophan

เปนสารต�งตนในการสงเคราะห และ ยงพบอกวาถาให tryptamine เปนสารต�งตนในการสงเคราะห

IAA เช�อ Pseudomonas putida B กจะสามารถผลต IAA ไดสงถง 23.40 µg/ml ยงมรายงาน การเพ�ม

tryptophan ลงไปในอาหาร 0.2-1.6 g/L จะสงผลใหเช�อ Azotobacter diazotrophicus L1 สามารถ

ผลต IAA สงสดในอาหารท�ม tryptophan 1.2 g/L (Nita et al., 2011) ย�งไปกวาน�นเช�อแบคทเรยท�ง

5 ไอโซเลตสามารถผลต IAA ไดสงมากเม�อเปรยบเทยบกบงานวจยอ�นดงท�กลาวมาขางตน ดงน�น

จากการศกษาในข�นตอนน� ทาใหทราบวาความเขมขนของ tryptophan มผลตอการผลต IAA ซ� ง

เปนไปตามงานวจยของ Spaepen และคณะ(2011) ไดอธบายถงวถการสงเคราะห IAA วาแบคทเรย

ท�แยกไดจากรากพชกวา 80% สามารถผลต IAA ได และยงบอกอกวาการสงเคราะห IAA ใช

tryptophan เปนสารต�งตน การเพ�ม tryptophan ลงไปในอาหารทาใหสามารถพลอต IAA ไดสงข�น

และยงสอดคลองกบผลการทดลองของ พมพธดาและคณะ (2550) ท�ศกษาการสงเคราะห IAA ของ

แบคทเรยผลตฮอรโมน IAAแตละไอโซเลต โดยพบวามความสามารถสงเคราะหออกซนในปรมาณ

ท�แตกตางกน

60

การศกษาผลของ pH ตอการผลต IAA น�นพบวาสอดคลองกบงานวจยของ Oberhänsli และ

คณะ (1991) รายงานวาเช�อ Pseudomonas fluorescens สายพนธ CHA0 สามารถผลต IAA ไดสงสด

ท� pH 6 สวนสายพนธ CHA750 สามารถผลต IAA สงสดท� pH 7 และเช�อ A. diazotrophicus

สามารถผลต IAA สงสดท� pH 6 และ Pantoea agglomerans สามารถผลต IAA ไดสงสดท� pH 7

นอกจากน�การลดลงของปรมาณ IAA ในชวงวนหลงๆ อาจมสาเหตมาจากการนาไปใชในการเจรญ

ของเซลลจลนทรย และการลดลงของแหลงคารบอนท�เปนวตถดบในการสราง IAA ท�นาไปใชใน

การเจรญเตบโตของเซลลจลนทรย (Ositadinma et al., 2005)

นอกจากน�นการเพ�มปรมาณออกซเจนดวยการเขยายงมผลตอการผลต IAA ของเช�อ

แบคทเรยทกไอโซเลต และผลต IAA ไดสงในระยะ stationary ของการเจรญ และสามารถผลต

IAA ไดมากกวาผลการทดลองท�ไมไดเขยาทกไอโซเลต ดงน�นออกซเจนมผลตอการเจรญเตบโต

ของเช�อ ถาเช�อแบคทเรยมการเจรญเตบโตด กจะสามารถผลต IAA ไดสงตามมาซ�งมรายงานยงพบ

อกวาเช�อ Pseudominas fluorescens CHA0 มการใชเอนไซม Tryp transaminase สงสดในระยะ

Stationary น�นแสดงใหเหนวาเช�อ เช�อ Pseudominas fluorescens CHA0 สามารถผลต IAA สงสด

ในระยะ Stationary น�นเอง(Nita et.al 2011) ยงสอดคลองกบงานวจยของ Khamna et al.(2010)

รายงานวาเช�อ Streptomyces CMUH009 ท�แยกไดจากรากของตะไคร(Cymbopogon citratus)

สามารถผลต IAA ไดสงสดในระยะ ของการเจรญชวง Stationary (143.97 µg/ml) และยงมรายงาน

พบวาเช�อ Micrococcus sp.MU1 สามารถผลต IAA ไดสงในระยะ stationary เชนกน อกท�งชวย

สงเสรมการเจรญของพชและสามารถนาแบคทเรยน� ไปประยกตใชในการสงเสรมประสทธภาพ

ของการนาพชมาใชในการบาบดดนท�ปนเป� อนโลหะหนก (เมษณและคณะ, 2011) Dastager และ

คณะ (2010) ยงพบวาเช�อ Microcuccus sp.N11-0909 ยงสงเสรมการเจรญเตบโตของพชโดยการ

สลายฟอสเฟต การผลตออกซน และยงผลต IAA ถง 109 mg/ml

เม�อนาเช�อแบคทเรยสลายคลอเรตท�ผลต IAA มาจาแนกดวยวธทางอณวทยาชววทยาพบวา

จดอยในสายพนธ Micrococcus sp. และ Pseudomonas sp. โดยเม�อศกษาลกษณะทางสญฐานวทยา

เบ�องตนพบวา ลกษณะท�วไปของเช�อ Micrococcus sp. เปนแบคทเรยแกรมบวก(gram positive

bacteria) มรปรางกลม (cocci) เคล�อนท�ไมได โคโลนสเหลอง บางคร� งกพบในสสม เซลลจะมการ

จดเรยงตวกนเปนค และ เด�ยว สามารถพบได ส�งแวดลอม เชน น� า ฝ น และดน เปนตน (Dastager

61

et.al, 2010) โดยการผลต IAA ของเช�อแบคทเรยชนดน� เมษณ และคณะ (2554) ไดเคยรายงานไววา

เช�อแบคทเรย Micrococcus sp.. MU1 ท�มความสามารถในการตานโลหะหนก ผลต IAA ไดสงสด

161 mg/l ท�ระยะการเจรญ 84 ช�วโมง ซ�งจากการวจยในคร� งน� เช�อ Micrococcus sp. 9-4D.1 ท�สลาย

คลอเรตสามารถผลต IAA ไดสงสด 100 mg/l ท�ชวงการเจรญ stationary phase เชนเดยวกน

สาหรบ Pseudomonas sp. คอเปนแบคทเรยท�ยอมตดสแกรมลบ (gram negative bacteria)

รปรางเปนทอน (rod shape) เคล�อนท�ได ไมสรางสปอร (non-spore forming bacteria) พบไดท�วไป

ในส�งแวดลอม ดน และน� า ซ�งเช�อแบคทเรย Pseudomonas มรายงานการวจยความสามารถการ

สงเสรมการเจรญของพช รวมถงผลต IAA ดวย โดย ท�แยกไดจากดนและสามารถผลต IAA ได เชน

Pseudomonas fluorescens (Upadhyay and Srivastava, 2010; Reetha et al., 2014) และ

Pseudomonas putida (Bharucha et al., 2013) โดย pH ท�เหมาะสมสาหรบการผลต IAA ของ

Pseudomonas ท�มรายงานคอ pH 7 –pH7.5 (Balaji et al., 2012; Bharucha et al., 2013) เชนเดยวกบ

Pseudomonas ท�ใชในการวจยคร� งน�

สรปผลการทดลอง

จากการศกษาความสามารถในการยบย �งเช�อรากอโรคในลาไยจากแบคทเรยสลายคลอเรต

สามารถสรปไดวา

1. การคดแยกเช�อรากอโรคในลาไย พบวาสามารถคดแยกเช�อราสาเหตของโรคในลาไยได

4 ชนด คอ เช�อ Meliola ซ�งเปนสาเหตของโรคราดาในลาไย เช�อ Mycelia sterilia เช�อราสาเหตของ

โรคใบไหมในลาไย เช�อ Collectrichum sp. สาเหตของโรคใบจดดาในลาไย และ เช�อ Phomopsis

สาเหตของโรคใบจดดาในลาไย

2. เช�อแบคทเรยสลายคลอเรตท�มฤทธ� ในการยบย �งเช�อรากอโรคในลาไย มจานวนท�งส�น 17

ไอโซเลต จากแบคทเรยสลายคลอเรต 91 ไอโซเลต

3. เม�อจาแนกเช�อแบคทเรยสลายคลอเรต ท�มฤทธ� ยบย �งเช�อรากอโรคในลาไย ดวยเทคนคทางชว

โมเลกลพบวา เช�อแบคทเรยสลายคลอเรตไดสวนใหญอยในจนส Bacillus sp. จากการศกษาการ

ผลต Indole-3-acetic acid (IAA) จากแบคทเรยสลายคลอเรต และ ผลของสภาวะบางประการตอการ

ผลต IAA สามารถสรปไดวา

1. การทดสอบการผลต IAA จากแบคทเรยสลายคลอเรต 91 ไอโซเลต พบวาในอาหาร NB

สามารถผลต IAA เทากบ 1.2-45.8 µg/ml (47 ไอโซเลต) และในอาหาร TSB ผลตเทากบ 1.1-57.6

µg/ml (62 ไอโซเลต)

2. เช�อแบคทเรยท�ทดสอบสามารถผลต IAA ไดสงสดในอาหารท�มความเขมขนของ

tryptophan เทากบ 600 mg/ml และ เช�อแบคทเรยจะผลต IAA ไดดท� pH 7 -9 อกท�งยงพบวา การให

อากาศในการเพาะเล� ยงสามารถทาใหเช�อแบคทเรยผลต IAA ไดเปน 2 เทาเม�อเทยบกบการ

เพาะเล�ยงในสภาพต�งน�ง

3. เม�อจาแนกแบคทเรยดวยเทคนคทางชวโมเลกลพบวา เช�อแบคทเรยสลายคลอเรตท�ผลต

IAA ไดสงอยในจนส Pseudomonas sp. และ Micrococcus sp.

เอกสารอางอง

พมพธดา เรองไพศาล, ฉววรรณ เหลองวฒวโรจน และดารารตน โฮตากา. 2550. การพฒนา

ผลตภณฑเช�อจลนทรยท�สรางฮอรโมนเพ�อสงเสรมการเจรญเตบโตของพช. กรมพฒนา

ท�ดน. หนา 33.

เมษณ ช�นประเสรฐ, เบญจภรณ ประภกดม, จารวรรณ วงคทะเนตร และวราวรรณ เอ�ยมพ�งพร.

2554. การแยกและคดเลอกแบคทเรยรอบรากพชท�สรางอนโดลอะซตกแอซดจากพ�นท�

ปนเป� อนโลหะหนก. การประชมวชาการคร� งท� 8 มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขต

กาแพงแสน จ.นครปฐม, 8-9 ธนวาคม 2554. 737-744.

นลน วงศขตตยะ และศรกาญจนา คลายเรอง. 2555. คมอปฏบตการจลชววทยา. มหาวทยาลยแมโจ.

หนา 92.

ศรกาญจนา คลายเรอง, ฐปน ช�นบาล, ปยะนช เนยมทรพย และนลน วงศขตตยะ. 2555. การสลาย

คลอเรตโดยแบคทเรยรดวสคลอเรตท�แยกไดจากดนและกากตะกอนน� าเสย.รายงานการ

วจยมหาวทยาลยแมโจ. 56น.

Ahmad, F., Ahmad, I. and Khan, M. S. 2008. Screening of free-living rhizospheric bacteria for

their multiple plant growth promoting activities. Microbiological Research. 163: 173-

181.

Ahmad, A., Hayat, S., Mobin, M., Hussain, A. and Fariduddin, Q. 2006. Photosynthetic rate,

growth and yield of mustard plants sprayed with 28-homobrassinolide. Photosynthetic.

38: 469-471.

Arteca, R.N. 1996. Plant Growth Substances: Principles and Applications. New York: Chapman

& Hall. 332 p.

Bartel, B. 1997. Auxin biosynthesis. Plant Biology. 48 : 51-66.

Balaji, N., Lavanya, S.S., Muthamizhselvi, S., Tamilarasan, K. 2012. Optamization of

fermentation condition for indole acetic acid production by Pseudomonas species.

International of Advanced Biotechnology and Research. 3 : 797-803.

Bharucha, U., Patei, K. 2013. Optimization of indole acetic acid production by Pseudomonas

putida UB1 and its effects as plant growth-promoting rhizobacteria on mustard (Brassica

nigra). Agricultural Research. 2 : 215-221.

64

Bruce, R.A., Achenbach, L.A., Coates, J.D. 1999. Reduction of (per)chlorate by novel organism

isolate from paper mill waste. Environmental Microbiology. 44: 319-329.

Chen, L., Luo, S., Xiao, X., Guo, H., Chen, J.,Wan, Y., Li, B., Xu, T., Xi, Q., Rao, C.,Liu, C. and

Zeng, G. 2010. “Application of plant growth-promoting endophytes(PGPE) isolated from

Solanum nigrum L. for phytoextractraction of Cd-polluted soils.” Applied Soil Ecology.

46: 383-389.

Davies, P.J. 1995. Plant Hormones: Physiology, Biochemistry and Molecular Biology. Kluwer.

833 p.

Dastager, S.G., Deepa, C.K. and Pandey, A. 2010. Isolation and characterization of novel plant

growth promoting Micrococcus sp. NII-0909 and its interaction with cowpea. Plant

Physiology and Biochemistry. 48: 987-992.

Ginkel, C.G, Plugge, C.M., Stroo, C.A. 1995. Reduction of chlorate with various energy

substrates and inocula under anaerobic. Chemosphere. 31: 4057-4066.

Glick, B.R., Penrose, D.M. and Li, J. 1998. A model for the lowering of plant ethylene

concentrations by plant growth-promoting bacteria. Journal of Theoretical Biology 190:

63-68.

Gravel, V., Antoun, H. and Tweddell, R.J. 2007. Growth stimulation and fruit yield improvement

of greenhouse tomato plants by inoculation with Pseudomonas putida or Trichoderma

atroviride: Possible role of indole acetic acid (IAA). Soil Biology and Biochemistry 39:

1968-1977.

Golubev, S.N., Muratova, A. Y., Wittenmayer,L., Bondarenkova, A. D., Hirche, F., Matora, L.Y.,

Merbach, W. and Turkovskaya, O.V. 2011. “Rhizosphere indole-3-acetic acid as a

mediator in the Sorgham bicolor-phenanthrene-Sinorhizobium meliloti interactions.”

Plant Physiology and Biochemistry. 49: 600-608.

Khamna, S., Yokota, A., Peterdy, J.F., Lumyong, S. 2010. Indole-3-acetic acid production by

Streptomyces sp. isolated from some Thai medicinal plant rhizosphere soils. EurAsian

Journal of BioScience. 4 : 23-32.

Lippert, L. F., Smith, P. G. and Bergh, B. O. 1966. Cytogenetics of the vegetable crops. Garden

pepper, Capsicum sp. Botanical Review. 32(1): 24-55.

65

Mano, Y. and Nemoto, K. 2012. The pathway of auxin biosynthesis in plants. Journal of

Experimental Botany: 2853-2872.

Nita, B.P., Gajbhiye, M., Ahiwale, S.S., Gunjal, A.B. and Kapadnis, B.P. 2011. Optimization of

indole-3-acetic acid (IAA) production by Azotobacter diazotrophicus L1 isolate from

sugarcane. International Journal of Environmental Sciences. 2: 295-301.

Oltmann, L.F., Reifnders, W.N., Stouthamar, A.H. 1976. The correlation between the protein

composition of cytoplasmic membranes and the formation of nitrate reductase A, chlorate

reductase C and tetrathionate reductase in Proteus mirabilis wild type and some chlorate

resistant mutants. Archives of Microbiol. 111: 25-35.

Ositadinma, O., Impe, J.V., Prinsen, E. and Vanderleyden, J. 2005. Growth and indole-3-acetic

acid biosynthesis of Azospirillum brasilense Sp245 is environmentally controlled. FEMS

Microbiology Letters. 246: 125-132.

Oberhänsli, T., Defago,G., and Haas, D.1991. Indole-3-acetic acid(IAA) systhesis in the

biocontrol strain CHA0 of Pseudomonas fluorescens: role of tryptophan side chain

oxidase. Journal of General Microbiology. 137: 2273-2279.

Reetha, S., Bhuvaneswari, G., Thamizhiniyan, P., Mycin, T.R. 2014. Isolation of indole acetic

acid (IAA) producing rhizobacteria of Pseudomonas fluorescens and Bacillus subtilis and

enhance growth of onion (Allim cepa L.) International Journal of Current Microbiology

and Applied Sciences. 3 : 568-574.

Sahasrabudhe, M.M. 2011. Screening of rhizobia for indole acetic acid production. Scholars

Research 2: 460-468.

Salisbury, F. B., and, Ross, C. W. 1992. Plant Physiology. Belmont, CA: Wadsworth. 357-407,

531-548.

Spaepen, S. and Vanderleyden, J. 2011. Auxin and plant-microbe interactions. Cold Spring

Harbor Perspectives in Biology 3: 1-4.

Steinberg, L.M., Trimble, J.J., Logan, B.E. 2005. Enzymes responsible for chlorate reduction by

Pseudomonas sp. are different from those used for perchlorate reduction by Azospira sp.

Federation of European Microbiological Societies. 247. 153-159.

Stijin Spaepen and Jos Vanderleyden. 2011. Auxin and Plant-Microbe Interactions. Cold Spring

Harbor Perspectives in Biology 3: 1-4.

66

Tsavkelova, E.A., Klimova, S. Y., Cherdyntseva, T.A. and Netrusov, A. I. 2006. Microbial

producers of plant growth stimulators and their practical use: A review. Applied

Biochemistry and Microbiology 42: 117-126.

Thorell, H.D., Stenklo, K., Karlsson, J., Nilsson, T. 2003. A gene cluster for chlorate metabolism

in Ideonella dechloratans. Applied and Environmental Microbiolgy. 69, 5585-5592.

Upadhyay, A. Srivastava. 2010. Evalution of multiple plant growth promoting traits of an isolate

of Pseudomonas fluorescens strain Psd. Indian Journal of Experimental Biology. 48 :

601-609.

ภาคผนวก

68

ภาคผนวก ก

อาหารเล�ยงเช�อจลนทรย

Mineral medium for enrichment chlorate reducing bacteria (Ginkel et al., 1995)

KClO3 1 กรม/ลตร

K2HPO4 1.55 กรม/ลตร

NaH2PO4 0.85 กรม/ลตร

NH4H2PO4 0.5 กรม/ลตร

MgSO4 0.1 กรม/ลตร

EDTA 10 มลลกรม/ลตร

ZnSO4 2 มลลกรม/ลตร

CaCl2 1 มลลกรม/ลตร

FeSO4 5 มลลกรม/ลตร

Na2MoO4 0.2 มลลกรม/ลตร

CuSO4 0.2 มลลกรม/ลตร

CoCl2 0.4 มลลกรม/ลตร

MnCl2 1 มลลกรม/ลตร

Starch Casein Agar

Soluble starch 10 กรม/ลตร

K2HPO4 2 กรม/ลตร

KNO3 2 กรม/ลตร

NaCl 2 กรม/ลตร

Casein 0.4 กรม/ลตร

MgSO4 0.5 กรม/ลตร

CaCO3 0.1 กรม/ลตร

FeSO4 0.01 กรม/ลตร

Agar 15 กรม/ลตร

69

Streptomycin Rose Bengal Agar

Glucose 10 กรม/ลตร

Peptone 5 กรม/ลตร

KH2PO4 1 กรม/ลตร

MgSO4 0.5 กรม/ลตร

Rose Bengal 30 มลลกรม/ลตร

Streptomycin 30 มลลกรม/ลตร

Agar 20 กรม/ลตร

70

ภาคผนวก ข

สารเคมท�ใชในการทดลอง

1.Salkowski reagent

7.9 M H2SO4 1 L

Iron (III) chloride (FeCl3) 12 g

71

ภาคผนวก ค

การเตรยมสารละลายมาตรฐาน

ตารางท� 15 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน McFarland (นลน และศรกาญจนา, 2555)

McFarland

number

1%Barium chloride

(มลลลตร)

1%Sulfuric acid

(มลลลตร)

ปรมาณเซลลโดย

เฉล�ย (x108)

0.5 0.05 9.95 1.5

1 0.1 9.9 3

2 0.2 9.8 6

3 0.3 9.7 9

4 0.4 9.6 12

5 0.5 9.5 15

6 0.6 9.4 18

7 0.7 9.3 21

8 0.8 9.2 24

9 0.9 9.1 27

10 1.0 9.0 30

72

ภาคผนวก ง

วธวเคราะหปรมาณ Indole-3-acetic acid (IAA)

1.วธการเตรยมกราฟมาตรฐาน IAA (Ahmad, 2008)

1. ช�ง IAA 10 mg

2. เตม Ethanol 500 µl เพ�อละลาย IAA

3. แลวใช dH2O ปรบปรมาตรใหได 10 ml จะได stock สารละลาย IAA ท�มความเขมขน 1000

µg/ml

4. ทาการ dilution stock IAA ใหมความเขมขนเทากบ 0, 20, 40, 60, 80 และ 100 µg/ml ท�งใน

อาหาร TSB และ NB โดยปรมาตรรวมเทากบ 5 ml

5. ดดสารละลายท�ความเขมขนตางๆมา 500 µl ทา 3 ซ�า

6. เตม Salkowski reagent 500 µl ต�งท�งไว 30 นาท

7. นาไปวดคาการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 nm

4. นาคาท�ไดไปพอรตกราฟระหวางความเขมขนของ IAA ในหนวย µg/ml กบคาการดดกลนแสงท�

ความยาวคล�น A535 nm

2. กราฟมาตรฐาน IAA ในอาหาร Nutrient broth (NB) และ Tryptic soy broth (TSB)

73

ตารางท� 16 คาการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 เล�ยงในอาหาร NB

IAA A535

คาเฉล�ย concentration(µg/ml) ซ�า 1 ซ�า 2 ซ�า 3

0 0 0 0 0

20 0.208 0.207 0.209 0.208

40 0.372 0.374 0.376 0.374

60 0.527 0.528 0.524 0.526

80 0.726 0.731 0.722 0.726

100 0.832 0.843 0.829 0.835

ภาพท� 19 กราฟมาตรฐาน IAA เล�ยงในอาหาร NB

y = 0.0084x + 0.025

R² = 0.9943

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 20 40 60 80 100 120

A535

IAA(µl/ml)

74

ตารางท� 17 คาการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 เล�ยงในอาหาร TSB

IAA A535

คาเฉล�ย concentration(µg/ml) ซ�า 1 ซ�า 2 ซ�า 3

0 0 0 0 0

20 0.155 0.159 0.165 0.160

40 0.306 0.314 0.313 0.311

60 0.411 0.446 0.442 0.433

80 0.578 0.582 0.580 0.580

100 0.721 0.731 0.732 0.728

ภาพท� 20 กราฟมาตรฐาน IAA เล�ยงในอาหาร TSB

y = 0.0072x + 0.0096

R² = 0.9989

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0 20 40 60 80 100 120

A535

IAA(µl/ml)

75

3. กราฟมาตรฐาน IAA ท�ความเขมขนตางๆ

ตารางท� 18 คาการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 ท�ไมไดเตม tryptophan

IAA A535

คาเฉล�ย concentration(µg/ml) ซ�า 1 ซ�า 2 ซ�า 3

0 0 0 0 0

20 0.133 0.135 0.135 0.134

40 0.255 0.262 0.263 0.260

60 0.372 0.383 0.384 0.380

80 0.496 0.502 0.501 0.500

100 0.644 0.650 0.657 0.650

ภาพท� 21 กราฟมาตรฐาน IAA ท�ไมไดเตม tryptophan

y = 0.0064x + 0.0016

R² = 0.9988

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0 20 40 60 80 100 120

A535

IAA (µg/ml)

76

ตารางท� 19 คาการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 ท�เตม tryptophan เขมขน 200 mg/ml

IAA A535

คาเฉล�ย concentration(µg/ml) ซ�า 1 ซ�า 2 ซ�า 3

0 0 0 0 0

20 0.148 0.152 0.155 0.152

40 0.291 0.294 0.296 0.294

60 0.411 0.422 0.418 0.417

80 0.555 0.570 0.584 0.570

100 0.694 0.679 0.695 0.689

ภาพท� 22 กราฟมาตรฐาน IAA ท�เตม tryptophan เขมขน 200 mg/ml

y = 0.0069x + 0.009

R² = 0.9989

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0 20 40 60 80 100 120

A535

IAA(µg/ml)

77

ตารางท� 20 คาการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 ท�เตม tryptophan เขมขน 400 mg/ml

IAA A535

คาเฉล�ย concentration(µg/ml) ซ�า 1 ซ�า 2 ซ�า 3

0 0 0 0 0

20 0.160 0.160 0.152 0.157

40 0.286 0.292 0.298 0.292

60 0.423 0.425 0.440 0.429

80 0.569 0.581 0.570 0.573

100 0.703 0.699 0.691 0.698

ภาพท� 23 กราฟมาตรฐาน IAA ท�เตม tryptophan เขมขน 400 mg/ml

y = 0.007x + 0.0102

R² = 0.9991

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0 20 40 60 80 100 120

A535

IAA (µg/ml)

78

ตารางท� 21 คาการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 ท�เตม tryptophan เขมขน 600 mg/ml

IAA A535

คาเฉล�ย concentration(µg/ml) ซ�า 1 ซ�า 2 ซ�า 3

0 0 0 0 0

20 0.150 0.150 0.151 0.150

40 0.279 0.290 0.286 0.285

60 0.423 0.423 0.431 0.426

80 0.554 0.555 0.563 0.557

100 0.688 0.695 0.703 0.695

ภาพท� 24 กราฟมาตรฐาน IAA ท�เตม tryptophan เขมขน 600 mg/ml

y = 0.0069x + 0.0067

R² = 0.9997

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0 20 40 60 80 100 120

A535

IAA(µg/ml)

79

4.กราฟมาตรฐาน IAA ท� pH ตางๆ

ตารางท� 22 คาการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 ท� pH 5

IAA A535

คาเฉล�ย concentration(µg/ml) ซ�า 1 ซ�า 2 ซ�า 3

0 0 0 0 0

20 0.163 0.166 0.167 0.165

40 0.36 0.372 0.371 0.368

60 0.494 0.521 0.511 0.509

80 0.685 0.676 0.699 0.687

100 0.818 0.827 0.82 0.822

ภาพท� 25 กราฟมาตรฐาน IAA ท� pH 5

y = 0.0083x + 0.0098

R² = 0.9972

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 20 40 60 80 100 120

A535

IAA concentration (µg/ml)

80

ตารางท� 23 คาการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 ท� pH 6

IAA A535

คาเฉล�ย concentration(µg/ml) ซ�า 1 ซ�า 2 ซ�า 3

0 0 0 0 0

20 0.154 0.152 0.157 0.154

40 0.325 0.336 0.335 0.332

60 0.5 0.499 0.507 0.502

80 0.654 0.678 0.675 0.669

100 0.814 0.823 0.812 0.816

ภาพท� 26 กราฟมาตรฐาน IAAท� pH 6

y = 0.0083x - 0.0017

R² = 0.9993

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 20 40 60 80 100 120

A535

IAA concentration (µg/ml)

81

ตารางท� 24 คาการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 ท� pH 7

IAA A535

คาเฉล�ย concentration(µg/ml) ซ�า 1 ซ�า 2 ซ�า 3

0 0 0 0 0

20 0.138 0.15 0.141 0.143

40 0.31 0.313 0.309 0.311

60 0.455 0.449 0.439 0.448

80 0.614 0.613 0.603 0.610

100 0.727 0.752 0.75 0.743

ภาพท� 27 กราฟมาตรฐาน IAA ท� pH 7

y = 0.0075x + 0.0005

R² = 0.9992

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0 20 40 60 80 100 120

A535

IAA concentration(µg/ml)

82

ตารางท� 25 คาการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 ท� pH 8

IAA A535

คาเฉล�ย concentration(µg/ml) ซ�า 1 ซ�า 2 ซ�า 3

0 0 0 0 0

20 0.118 0.111 0.108 0.112

40 0.256 0.252 0.238 0.249

60 0.395 0.395 0.382 0.391

80 0.545 0.521 0.516 0.527

100 0.656 0.668 0.658 0.661

ภาพท� 28 กราฟมาตรฐาน IAA ท� pH 8

y = 0.0067x - 0.0117

R² = 0.999

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0 20 40 60 80 100 120

A535

IAA concentration (µg/ml)

83

ตารางท� 26 คาการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 ท� pH 9

IAA A535

คาเฉล�ย concentration(µg/ml) ซ�า 1 ซ�า 2 ซ�า 3

0 0.000 0.000 0.000 0.000

20 0.095 0.088 0.09 0.091

40 0.214 0.202 0.205 0.207

60 0.312 0.306 0.283 0.300

80 0.392 0.411 0.448 0.417

100 0.53 0.525 0.531 0.529

ภาพท� 29 กราฟมาตรฐาน IAA ท� pH 9

y = 0.0053x - 0.008

R² = 0.9987

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 20 40 60 80 100 120

A535

IAA concentration(µg/ml)

84

ภาคผนวก ง

การวเคราะหปรมาณ IAA

1.ข�นตอนการวเคราะหหาปรมาณ IAA เทยบกบกราฟมาตรฐาน

1. นาเช�อท�บมมา vortex

2. ดดเช�อมาใสในหลอด centrifuge ประมาณ 2.6 ml

3. นาไปป�นเหว�ยงท� 12000 รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท

4. ดดสวนใส(supernatant) ท�งหมดลงในหลอด centrifuge ใหม

5. นาสวนใสมาทดสอบปฏกรยา 0.5 ml ทา 3 ซ�า

6. เตม Salkowski reagent 0.5 ml ทาปฏกรยากบสวนใส

7. ต�งท�งไวท�อณหภมหองเปนเวลา 30 นาท

8. นาไปวดการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น A535 nm

9. เทยบกบกราฟมาตรฐาน

10. และคานวณหาปรมาณ IAA µg/ml

2.การคานวณหาปรมาณ IAA

ปรมาณ IAA (µg/ml) = A535 / slope

85

ภาคผนวก จ

ข�นตอนการจาแนกชนดของเช�อแบคทเรย

การจาแนกชนดของเช�อแบคทเรย ดวยเทคนคทางอณชววทยา ตามวธการของผผลต Geneai ประเทศ

Taiwan

ข�นตอนการทา PCR

1. วธการสกด DNA ดวยชดสกดสาเรจรป Genomic DNA Mini Kit

เตม culture broth ลงใน eppendrof

นาไป centrifuge 5 นาท 10000 rpm เท supernatant ท�ง

เตม 200 µl ของ 10 mg lysozme/ml TEN buffer + RNAase 2 µl/ml

ต�งท�งไวท�อณหภมหอง 10 นาท (กลบหลอดไปมาทก 3 นาท)

เตม GB buffer 200 µl (ทาใหเซลลแตก) แลว Vortex

นาไปบมท� 70 ℃ นาน 10 นาท (จนกวาตะกอนละลายใส กลบหลอดทก 3 นาท)

เตม ethanol (ABS) 200 µl แลว Vortex 3-10 วนาท

เตมท�งหมดลงใน GD column

นาไป centrifuge 5 นาท 10000 rpm เทของเหลวในหลอดท�ง

เตม w1 buffer 400 µl

นาไป centrifuge 5 นาท 10000 rpm เทของเหลวในหลอดท�ง

เตม wash buffer 600 µl

นาไป centrifuge 5 นาท 10000 rpm เทของเหลวในหลอดท�ง

1.1) เตม wash buffer 600 µl

1.2) นาไป centrifuge 5 นาท 10000 rpm เทของเหลวในหลอดท�ง

1.3) ยาย GB column ลงหลอด eppendorf ใหม

1.4) เตม elution ท�บมท�งไวท� 70 ℃ เปน 50 µl

86

1.5) ต�งท�งไวท�อณหภมหอง 5 นาท

1.6) นาไป centrifuge 5 นาท 10000 rpm ท�ง GB column

1.7) เกบสวนใสของ DNA ท�อยใน eppendorf ไวท� -20 ℃

2. การทา PCR

สวนประกอบของปฏกรยา ปรมาตรตอปฏกรยา (ไมโครลตร) คณจานวนตวอยาง +1

PCR MasterMix 25 25x6 = 150

Primer I 4 4x6 = 24

Primer II 4 4x6 = 24

dH2O 12 12x6 = 72

DNA 5 -

Total 50 -

Universal Primer ท�ใช คอ 27F และ 1522R (สาหรบเช�อแลคตกแอซดแบคทเรย)

การนา primer มาใชในการทา PCR จะใช primer ความเขมขนเร�มตน 10 pmol/µl

เม�อใสสวนประกอบลงใน eppendrof ครบแลว กนาไปใสเคร�อง PCR ซ�งโปรแกรม PCR reaction จะรนตาม

ระบบของตวเคร�อง คอ

1. Initial Denaturation 95 ℃ นาน 5 นาท 4. Extension 72 ℃ นาน 1 นาท

2. Denaturation 95 ℃ นาน 1 นาท 5. Final Extension 72 ℃ นาน 1 นาท

3. Annealing 55 ℃ นาน 1 นาท 6. Set Hold 20 ℃

3. การทา PCR Product ใหบรสทธ�ดวยชดสาเรจรป GEL/PCR DNA Fragments Extraction Kit

3.1) นา PCR product ท�ไดใสลงไป eppendrof ท�งหมด

3.2) เตม 500 µl DF buffer แลว Vortex

= 45 ul

87

3.3) บมท� 55 ℃ นาน 10-15 นาท กลบหลอดไปมาทก 2-3 นาท

3.4) เอา FD column ใสลงใน collection tube

3.5) นาตวอยางใสลงใน DF column

3.6) นาไป centrifuge 30 นาท 10000 rpm เทของเหลวท�ง

3.7) เตม 500 µl wash buffer

3.8) นาไป centrifuge 30 นาท 13000 rpm เทของเหลวท�ง

3.9) นาไป centrifuge 2 นาท 10000 rpm

3.10) เตม elution buffer 30 µl ท�งไวท�อณหภมหองเปนเวลา 2 นาท

3.11) นาไป centrifuge 2 นาท เตม speed

3.12) เกบ purified DNA ท�ไดไปทาการ run gel และสง sequence

4. ตรวจสอบ PCR Product ดวยวธการ run gel-electrophoresis

4.1) นา 1.5% agarose gel 30 ml ไปหลอมดวยไมโครเวฟ

4.2) ต�งท�งไวใหเจลมอณหภมประมาณ 50 ℃

4.3) ใส gel star 1 µl/10 ml

4.4) เทเจลลงในแมพมพและเสยบหวลงไป เพ�อใหเกดชองสาหรบหยอดตวอยาง

4.5) รอใหเจลแขงและตองนาเจลไปบมไวท�มด

4.6) เม�อเจลแขงตวคอยๆดงหวออกแลวนาแผนเจลไปวางไวในเคร�อง electrophoresis

4.7) เตม TAE buffer ลงไปใหทวมเจล นา marker และตวอยางมาหยอดลงในแตละชองดงน�

- Marker : marker 1 µl + TAE buffer 4 µl + loading dye 2 µl

- Sample : DNA ตวอยาง 2 µl + loading dye 2 µl

4.8) ปดฝาเคร�อง electrophoresis โดยต�งคาไวท� 100 v เคล�อนท�จาก - +

4.9) ท�งไวประมาณ 30-45 นาท จากน�นปดเคร�อง electrophoresis

4.10) นาแผนเจลไปวางไวบนเคร�องตรวจสอบแถบดเอนเอ

88

ภาคผนวก ฉ

ผลการทดลองการคดเลอกแบคทเรยท�ผลต IAA

ตารางท� 27 การคดเลอกแบคทเรยท�ผลต IAA โดยเรยงลาดบจากมากไปนอย

ลาดบ ไอโซเลต

A535 IAA (µg/ml)

TSB NB เฉล�ย TSB NB เฉล�ย

1 9-4D.1 0.425 0.340 0.382 57.648 37.460 47.554

2 10-2.1 0.243 0.242 0.242 32.440 25.794 29.117

3 6-3.1 0.214 0.267 0.240 28.319 28.770 28.545

4 C9-24.2 0.092 0.324 0.208 11.398 35.575 23.487

5 9-4C.2 0.111 0.280 0.195 14.060 30.298 22.179

6 8-2.1 0.187 0.132 0.160 24.685 12.738 18.712

7 9-5E 0.104 0.212 0.158 13.111 22.302 17.706

8 9-3B.2 0.108 0.197 0.153 13.690 20.516 17.103

9 C2-3 0.127 0.152 0.139 16.236 15.119 15.678

10 5.3.2 0.123 0.124 0.124 15.750 11.786 13.768

11 9-3.2 0.126 0.116 0.121 16.120 10.873 13.497

12 9-4A.2 0.104 0.133 0.119 13.157 12.857 13.007

13 2-2.1 0.082 0.118 0.100 9.986 11.091 10.539

14 1-2C.1.1 0.107 0.093 0.100 13.458 8.115 10.787

15 9-5.1 0.079 0.115 0.097 9.639 10.694 10.167

16 9-3D.1 0.087 0.098 0.093 10.773 8.710 9.742

17 9-4D 0.157 0.028 0.093 20.495 0.357 10.426

18 3-1A.1* 0.091 0.091 0.091 11.282 7.817 9.550

19 9-4E 0.112 0.058 0.085 14.269 3.889 9.079

20 9-4B.2 0.068 0.102 0.085 8.088 9.167 8.627

21 3-3 0.058 0.104 0.081 6.676 9.425 8.050

22 10-3.1 0.065 0.095 0.080 7.625 8.313 7.969

23 CA.2B 0.084 0.047 0.065 10.264 2.560 6.412

24 11-2.1.1 0.046 0.081 0.063 5.009 6.627 5.818

89

ตาราง 27 (ตอ)

ลาดบ ไอโซเลต

A535 IAA (µg/ml)

TSB NB เฉล�ย TSB NB เฉล�ย

25 C7-3B.1 0.080 0.044 0.062 9.755 2.282 6.018

26 3-2D.1.1 0.090 0.029 0.059 11.097 0.496 5.797

27 2.4.1 0.044 0.072 0.058 4.801 5.536 5.168

28 1-1B.2 0.083 0.029 0.056 10.194 0.476 5.335

29 1-3A 0.076 0.035 0.055 9.222 1.131 5.177

30 4-1.1 0.050 0.047 0.048 5.611 2.579 4.095

31 C7-1B.2 0.035 0.059 0.047 3.574 4.067 3.821

32 1-3E 0.049 0.045 0.047 5.495 2.381 3.938

33 9-2.1 0.062 0.028 0.045 7.278 0.377 3.827

34 C1-2A 0.050 0.036 0.043 5.542 1.329 3.436

35 10-2.2 0.073 0.005 0.039 8.736 0.000 4.368

36 10-1.1 0.032 0.040 0.036 3.157 1.726 2.442

37 9-4.1 0.047 0.023 0.035 5.125 0.000 2.563

38 7-3.1 0.024 0.043 0.033 1.977 2.103 2.040

39 1-2B.1 0.047 0.020 0.033 5.125 0.000 2.563

40 1-2B.2 0.023 0.043 0.033 1.838 2.143 0.000

41 5.3.1 0.050 0.013 0.032 5.565 0.000 0.000

42 3-3B.1 0.025 0.038 0.031 2.116 1.528 0.000

43 4-1.2 0.055 0.007 0.031 6.282 0.000 0.000

44 1-2D 0.050 0.009 0.029 5.611 0.000 0.000

45 1-1B.1.2 0.039 0.015 0.027 4.083 0.000 0.000

46 7-2.1 0.003 0.049 0.026 0.000 2.817 0.000

47 3-3D.2 0.047 0.004 0.025 5.171 0.000 0.000

48 K5-3C 0.018 0.030 0.024 1.144 0.575 0.000

49 9-3B.1 0.034 0.013 0.023 3.343 0.000 0.000

50 5.3.1 0.034 0.012 0.023 3.389 0.000 0.000

90

ตาราง 27 (ตอ)

ลาดบ ไอโซเลต

A535 IAA (µg/ml)

TSB NB เฉล�ย TSB NB เฉล�ย

51 1-1E.2.1 0.040 0.006 0.023 4.176 0.000 0.000

52 1-1B.1.2* 0.029 0.017 0.023 2.694 0.000 0.000

53 3-3A.1 0.023 0.019 0.021 1.815 0.000 0.000

54 3.3C.1 0.034 0.007 0.020 3.366 0.000 0.000

55 9-4C.3 0.007 0.031 0.019 0.000 0.734 0.000

56 9-4B.1 0.024 0.014 0.019 1.977 0.000 0.000

57 1-1E.2.2 0.028 0.007 0.017 2.532 0.000 0.000

58 1-1D 0.014 0.018 0.016 0.634 0.000 0.000

59 7.4.1 0.007 0.025 0.016 0.000 0.000 0.000

60 3-3B.2 -0.001 0.032 0.015 0.000 0.774 0.000

61 K7-1A.1.3 0.021 0.010 0.015 1.514 0.000 0.000

62 9-3A-2.2 0.001 0.029 0.015 0.000 0.516 0.000

63 3.1.1 0.029 0.001 0.015 2.718 0.000 0.000

64 1-3B 0.026 0.002 0.014 2.255 0.000 0.000

65 5-2.1 0.023 0.005 0.014 1.815 0.000 0.000

66 1-2A 0.015 0.012 0.014 0.773 0.000 0.000

67 9-3E 0.014 0.009 0.011 0.542 0.000 0.000

68 11-2.2 0.013 0.008 0.010 0.449 0.000 0.000

69 7.2.1 0.019 -0.002 0.009 1.282 0.000 0.000

70 K7-14-1.2 0.021 -0.004 0.009 1.583 0.000 0.000

71 K7-1F 0.016 0.001 0.008 0.819 0.000 0.000

72 3-2D.2 0.014 0.002 0.008 0.611 0.000 0.000

73 3-2D.1.2 0.017 -0.003 0.007 1.074 0.000 0.000

74 1-3B 0.002 0.013 0.007 0.000 0.000 0.000

75 3.2C 0.006 0.009 0.007 0.000 0.000 0.000

76 8-1.1 0.018 -0.004 0.007 1.167 0.000 0.583

91

ตาราง 27 (ตอ)

ลาดบ ไอโซเลต

A535 IAA (µg/ml)

TSB NB เฉล�ย TSB NB เฉล�ย

77 3-3A.3 0.009 0.003 0.006 0.000 0.000 0.000

78 K7-1.1 0.004 0.007 0.006 0.000 0.000 0.000

79 3-1A.2.2 0.003 0.007 0.005 0.000 0.000 0.000

80 K7-3.1.1 0.000 0.008 0.004 0.000 0.000 0.000

81 3-2B.1 0.004 0.004 0.004 0.000 0.000 0.000

82 3-3A.2 0.007 0.000 0.004 0.000 0.000 0.000

83 1-3D.2 0.005 0.002 0.003 0.000 0.000 0.000

84 1-1B.1.1 0.005 -0.002 0.002 0.000 0.000 0.000

85 9-3A-2.1 0.009 -0.007 0.001 0.000 0.000 0.000

86 3-2D.1.2* -0.014 0.013 0.000 0.000 0.000 0.000

87 K7-3.1.2 -0.012 0.006 -0.003 0.000 0.000 0.000

88 3-3D.1 -0.001 -0.007 -0.004 0.000 0.000 0.000

89 1-1E.1 -0.015 0.005 -0.005 0.000 0.000 0.000

90 3-1A.1 -0.013 0.001 -0.006 0.000 0.000 0.000

91 9-4C.1 -0.015 -0.004 -0.009 0.000 0.000 0.000