รายงานผลการวจย เร�อง

การใชยนสรางแอนโทไซยานนเปนยนเคร�องหมายสาหรบการถายยนในพชและ

เปนยนเปาหมายเพ�อเพ�มมลคาพชเศรษฐกจ

The use of a gene for production of anthocyanin pigment as a marker

gene in plant transformation and as a target gene

for increased value in crop plants

โดย

ชอทพา สกลสงหาโรจน และคณะ

มหาวทยาลยแมโจ 2555

รหสโครงการวจย มจ.1-54-036

รายงานผลการวจย

เร�อง การใชยนสรางแอนโทไซยานนเปนยนเคร�องหมายสาหรบการ

ถายยนในพชและเปนยนเปาหมายเพ�อเพ�มมลคาพชเศรษฐกจ

The use of a gene for production of anthocyanin pigment as a

marker gene in plant transformation and as a target gene for

increased value in crop plants

ไดรบการจดสรรงบประมาณวจย ประจาป 2554

จานวน 333,000 บาท

หวหนาโครงการ ผศ.ดร. ชอทพา สกลสงหาโรจน

ผรวมโครงการ อ.ดร. ศรเมฆ ชาวโพงพาง

ผศ.ดร. แสงทอง พงษเจรญกต

ผศ.ดร. วราภรณ แสงทอง

งานวจยเสรจส�นสมบรณ

24 / 12 / 2555

กตตกรรมประกาศ

ขอขอบพระคณสานกวจยและสงเสรมวชาการการเกษตร มหาวทยาลยแมโจ ท�ไดให

ทนอดหนนการวจยแกคณะผวจย ในปงบประมาณ 2554 ขอขอบพระคณ Professor Dr. Thomas W.

Okita จาก Institute of Biological Chemistry, Washington State University ประเทศสหรฐอเมรกา

ท�ใหความอนเคราะหเช�ออะโกรแบคทเรยม และ binary vector และขอขอบพระคณ ดร.เจษฎาพร

พทกษสธพงศ จากศนยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยชวภาพแหงชาต สาหรบการเปนท�ปรกษา

โครงการวจยท�ใหคาแนะนาเปนอยางด

ขอขอบพระคณสาขาวชาพนธศาสตร คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยแมโจ ท�ใหการ

สนบสนนดานสถานท�และเคร� องมอสาหรบการทาวจยเปนอยางด และขอขอบพระคณศนย

เทคโนโลยชวภาพ มหาวทยาลยแมโจ สาหรบการใหใชบรการโรงเรอนกระจกสาหรบปลกพช

นอกจากน�ขอขอบคณนายธวชชย บญกลาง และนายพงศกร คนธรส นกศกษาปรญญาตร

สาขาเทคโนโลยชวภาพ นางสาววารณ เหมหาญ นกศกษาปรญญาโท สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ

และนางสาวพนศร อนตะ นกศกษาปรญญาโท สาขาวชาพนธศาสตร คณะวทยาศาสตร

มหาวทยาลยแมโจ ท�มสวนสาคญทาใหงานวจยน�สาเรจลลวงไปได

คณะผวจย

ธนวาคม 2555

สารบญ

หนา

สารบญตาราง ข

สารบญภาพ ค

บทคดยอ 1

Abstract 2

คานา 4

วตถประสงคของการวจย 4

ประโยชนท�คาดวาจะไดรบ 4

ตรวจเอกสาร 5

อปกรณและวธการ 20

ผลการวจยและวจารณผล 39

สรปผลการวจย 65

เอกสารอางอง 67

ข

สารบญตาราง

หนา

ตารางท� 1 องคประกอบของการตดพลาสมดดวยเอนไซมตดจาเพาะ 23

ตารางท� 2 องคประกอบของปฏกรยา PCR ในการเพ�มปรมาณช�นยน pap1 24

ตารางท� 3 องคประกอบของการตด PCR product ดวยเอนไซมตดจาเพาะ 25

ตารางท� 4 องคประกอบของปฏกรยาการเช�อมตอดเอนเอ (ligation) 26

ตารางท� 5 องคประกอบของปฏกรยาพซอาร สาหรบใชตรวจสอบตนขาวท�ไดรบการถาย

ยน

32

ตารางท� 6 องคประกอบของพซอาร ในการวเคราะหตนยาสบท�ไดรบการถายยน pap1

โดยใชไพรเมอรท�จาเพาะตอยน pap1

35

ตารางท� 7 การทดสอบ competent cell บนอาหารแขง LB ท�เตมแอมพซลน 100 มลลกรม

ตอลตร

38

ตารางท� 8 การถายฝากพลาสมดสายผสม (pKL1) เขาส competent cell และคดเลอกโคลน

บนอาหารแขง LB ท�เตม แอมพซลน 100 มลลกรมตอลตร

43

ตารางท� 9 ประสทธภาพการถายยน pap1 เขาสแคลลสขาวพนธ Kitaake แสดงกลม

แคลลสท�รอดบนอาหารคดเลอก และการเกดตน

48

ตารางท� 10 สรปผลการทาพซอารของตนขาวท�ผานการถายยน เพ�อตรวจสอบการแทรกตว

ของยน pap1 ในจโมนขาว

52

ตารางท� 11 ประสทธภาพการถายยนเขาสช�นสวนใบยาสบดวยอะโกรแบคทเรยมสายพนธ

AGL1 ท�มพลาสมด pPAP1

54

ตารางท� 12 สรปผลการทาพซอารของตนยาสบท�ไดรบการถายยน เพ�อตรวจสอบการ

แทรกตวของยน pap1 ในจโนมยาสบ

60-

61

ค

สารบญภาพ

หนา

ภาพท� 1 ลกษณะของตนและรวง ของขาวเจาหอมนล (ก.) และลกษณะเมลดขาว (ข.) 7

ภาพท� 2 กระบวนการสงเคราะหฟลาโวลนอยด 8

ภาพท� 3 ลกษณะของตนขาวเหนยวดา และเมลด 9

ภาพท� 4 ตวอยางโครงสรางและโมเลกลของสารกลมฟลาโวนอยด (Flavonoids) 10

ภาพท� 5 รปภาพท�วไปของตนยาสบ 16

ภาพท� 6 วถการสงเคราะหสารแอนโทไซยานน

ภาพท� 7 แผนท�พลาสมด pRTL2 แสดง 35S promoter with dual enhancer ตอกบ TEV

Leader coding sequence และ 35S terminator เพ�อใชสาหรบโคลนยน pap1 เขาท�

NcoI/SacI sites โดยแทนท� coding sequence นอกจากน� ยงมยนตานยาแอมพซลน

(ApR) เพ�อใชในการคดเลอกแบคทเรยท�ไดรบพลาสมด

19

ภาพท� 8 แผนท�พลาสมด 3PAP-Red 20

ภาพท� 9 แผนท�พลาสมด pCAMBIA 1390 27

ภาพท� 10 แผนท� T – DNA ของพลาสมด pCAMBIA 1390 28

ภาพท� 11 การวเคราะหพลาสมด pRTL2 ท�สกดดวยวธ Alkaline lysis method 38

ภาพท� 12 การวเคราะหพลาสมด pRTL2 ท�ตดดวยเอนไซม NcoI และ SacI เปรยบเทยบกบ

พลาสมด pRTL2 ท�ยงไมไดตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ (uncut pRTL2) ก) กอนตด

เจล และ ข) หลงตดเจลท�มแถบดเอนเอ

39

ภาพท� 13 การวเคราะหพลาสมด pRTL2 ท�ตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ NcoI และ SacI แลว

ทาการแยกบรสทธ� โดยใชชด PCR clean-up Gel extraction

39

ภาพท� 14 การวเคราะหช�นยน pap1 ท�ไดจากเทคนค PCR 40

ภาพท� 15 การวเคราะหยน pap1 ท�ตดดวยเอนไซม NcoI และ SacI เปรยบเทยบกบยน pap1

ท�ยงไมไดตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ (uncut pap1) ก) กอนตดเจล และ ข) หลงตด

เจลท�มแถบดเอนเอ

41

ภาพท� 16 การวเคราะหช�นยน pap1 ท�ตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ NcoI และ SacI แลวทาการ

การแยกบรสทธ� โดยใชชด PCR clean-up Gel extraction

41

ภาพท� 17 แผนท�พลาสมด pKL1 42

ภาพท� 18 การวเคราะหพลาสมดท�สกดไดจาก 1:5 โคโลนท� 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 และ 1:3 44

ง

หนา

โคโลนท� 1 โดยเปรยบเทยบขนาดกบดเอนเอมาตรฐาน 1kb Ladder Plus ดวย

เทคนคอะกาโรสเจลอเลกโทรฟอรซส

ภาพท� 19 การวเคราะหโคลนท�มพลาสมดสายผสม pKL1 โดยตดพลาสมดท�สกดไดจาก 1:5

โคโลนท� 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 และ 1:3 โคโลนท� 1 ดวยเอนไซม NcoI และ SacI

โดยเปรยบเทยบขนาดกบดเอนเอมาตรฐาน 1kb Ladder Plus ดวยเทคนคอะกาโรส

เจลอเลกโทรฟอรซส

44

ภาพท� 20 การวเคราะหพลาสมด pKL1 ท�ไดจากโคลน A1, A2, B1 และ B2 โดยตดดวย

เอนไซม NcoI และ SacI เปรยบเทยบขนาดกบดเอนเอมาตรฐาน 1kb Ladder Plus

ดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโทรฟอรซส

45

ภาพท� 21 การวเคราะหพลาสมด pKL1 โคลน A1 Elute 1, A1 Elute 2, B1 Elute 1 และ B1

Elute 2 ท�ไดจากการสกดดวยชดkit โดยเปรยบเทยบขนาดกบดเอนเอมาตรฐาน

1kb Ladder Plus ดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโทรฟอรซส

46

ภาพท� 22 ลกษณะการเกดแคลลสของเมลดขาวพนธ Kitaake ท�เพาะเล�ยงบนอาหารสตร

N6D ระยะเวลา 4 สปดาห

48

ภาพท� 23 ลกษณะของแคลลสภายหลงการปลกถายเช�อและเพาะเล�ยงรวมเปนระยะเวลา 3

วน

48

ภาพท� 24 ลกษณะแคลลสท�รอดตายบนอาหารคดเลอกสตร N6D ดดแปลง คร� งท� 2 หลงการ

เพาะเล�ยงเปนเวลา 2 สปดาห

49

ภาพท� 25 25 ลกษณะกลมแคลลสท�เกดเปนตายอดบนอาหารสตรชกนาใหเกดตนคร� งท� 2

หลงเพาะเล�ยงเปนเวลา 2 สปดาห (ก) ลกษณะของแคลลสท�ตานทานสารปฏชวนะ

และเกดการแบงตว (ข) ลกษณะของแคลลสท�เกดตายอดสเขยว (ค) ลกษณะของ

แคลลสท�เกดตายอดสขาว

49

ภาพท� 26 ลกษณะของแคลลสท�เจรญเปนตนบนอาหารสตรชกนาใหเกดตนคร� งท� 3 หลงการ

เพาะเล�ยงเปนเวลา 2 สปดาห

49

ภาพท� 27 ลกษณะของตนขาวพนธ Kitaake ท�ผานการถายยนและเพาะเล�ยงบนอาหารสตร

MS ระยะเวลา 3 สปดาห (ก) ตนขาวปกต (ข) ตนขาวสขาว

50

ภาพท� 28 ลกษณะของตนขาวพนธ Kitaake ท�ผานการถายยน เพาะเล�ยงในโรงเรอนกระจก

(ก) เพาะลงดนอาย 2 สปดาห (ข) เพาะลงดนอาย 5 สปดาห

50

จ

หนา

ภาพท� 29 ผลการสกดจโนมกดเอนเอจากใบขาวพนธ Kitaake ท�ไดรบการถายยน pap1 คร� ง

ท� 1จานวน 9 ตน M คอ Lambda DNA/EcoRl+Hindlll Marker, C คอ ตนขาวพนธ

Kitaake ท�ไมผานการถายยน (Control) และ 1 – 9 คอตนขาวท�ผานการถายยนและ

ตานทานตอสารปฏชวนะไฮโกรมยซน ไดแก ตนท� 3.1(1.1), 3.1(1.2), 3.1(1.3),

3.1(2.1), 3.1(3.1), 5.1(1.1), 5.1(1.1w), 3.1(1.4) และ 3.1(1.4w) ตามลาดบ

51

ภาพท� 30 การตรวจสอบการแทรกตวของยน pap1 ในจโนมขาวดวยเทคนคพซอารคร� งท� 1

โดยใชไพรเมอรท�จาเพาะตอยน pap1 โดย M คอ ดเอนเอมาตรฐาน 100 bp

DNA Ladder, N คอ ตนขาวพนธ Kitaake ท�ไมผานการถายยน (Negative

control), P คอ พลาสมด pPAP1 (Positive control), 1 – 9 คอ ตนขาวท�ผาน

การถายยนและตานทานตอสารปฏชวนะไฮโกรมยซน ไดแก ตนท� 3.1(1.1),

3.1(1.2), 3.1(1.3), 3.1(2.1), 3.1(3.1), 5.1(1.1), 5.1(1.1w), 3.1(1.4) และ 3.1(1.4w)

ตามลาดบ และ W คอ น� ากล�น

52

ภาพท� 31 ลกษณะของช�นสวนใบยาสบท�ผานการถายยน แลวนาไปวางบนอาหารคดเลอก

สตร MS ดดแปลง ท�ประกอบดวย BA 1 มลลกรมตอลตร NAA 0.1 มลลกรมตอ

ลตร ซโฟแทคซม 200 มลลกรมตอลตร และไฮโกรมยซน 50 มลลกรมตอลตร

เปนเวลา 2 สปดาห จะสงเกตเหนวา ช�นสวนของใบยาสบมลกษณะสเขยว

55

ภาพท� 32 ลกษณะช�นสวนใบยาสบบนอาหารคดเลอกสตร MS ดดแปลง ท�ประกอบดวย BA

1 มลลกรมตอลตร NAA 0.1 มลลกรมตอลตร ซโฟแทกซม 200 มลลกรมตอ

ลตร และไฮโกรมยซน 30 มลลกรมตอลตร เปนเวลา 4 สปดาห

(ก) ลกษณะช�นสวนของใบยาสบท�สามารถตานตอสารปฏชวนะไฮโกร

มยซนได ซ�งจะมลกษณะเปนสเขยว

(ข) ลกษณะช�นสวนของใบยาสบท�รอดและตายบนอาหารคดเลอก

55

ภาพท� 33 ลกษณะช�นสวนใบยาสบบนอาหารคดเลอกสตร MS ดดแปลง ท�ประกอบดวย

BA 1 มลลกรมตอลตร NAA 0.1 มลลกรมตอลตร ซโฟแทกซม 200 มลลกรมตอ

ลตร และไฮโกรมยซน 30 มลลกรมตอลตร เปนเวลา 4 สปดาห

(ก) ลกษณะการเกดตายอดจากช�นสวนของใบยาสบ ซ�งจะมลกษณะเปน

ตมเลกๆ สเขยว ตามขอบของช�นสวนใบยาสบ

(ข) ลกษณะการเกดตายอดสแดงจากช�นสวนของใบยาสบ ซ�งจะม

ลกษณะเปนตมเลกๆ สแดงตามขอบของช�นสวนใบยาสบ

56

ฉ

หนา

ภาพท� 34 ลกษณะของตนยาสบท�ผานการถายยนดวยอะโกรแบคทเรยมท�มพลาสมด pPAP1

เพาะเล�ยงเน�อเย�อในขวดท�มอาหารคดเลอกสตร MS ดดแปลง ท�ประกอบดวย BA

1 มลลกรมตอลตร NAA 0.1 มลลกรมตอลตร ซโฟแทคซม 200 มลลกรมตอ

ลตร และไฮโกรมยซน 30 มลลกรมตอลตร เปนเวลา 8 สปดาห

(ก) ตนยาสบท�ไมผานการถายยน (ตนควบคม)

(ข) ตนยาสบท�ไดรบการถายยน แสดงตนท�มสเขยว

(ค) ตนยาสบท�ไดรบการถายยน แสดงตนท�มสเขยวปนแดง

(ง) ตนยาสบท�ไดรบการถายยน แสดงตนท�มสแดง

56

ภาพท� 35 ลกษณะของตนยาสบท�ผานการถายยนดวยอะโกรแบคทเรยมท�มพลาสมด pPAP1

แตตนไมสมบรณ เพาะเล�ยงเน�อเย�อในขวดท�มอาหารคดเลอกสตร MS ดดแปลง ท�

ประกอบดวย ซโฟแทคซม 200 มลลกรมตอลตร และไฮโกรมยซน 30 มลลกรม

ตอลตร

(ก) ตนยาสบท�ไมผานการถายยน (ตนควบคม) เพาะเล�ยงเปนเวลา 1

เดอน

(ข) ตนยาสบสเขยวท�ไดรบการถายยน แสดงตนท�ปกต เพาะเล�ยงเปน

เวลา 8 สปดาห

(ค) ตนยาสบสแดงท�ไดรบการถายยน แสดงตนท�ผดปกต เพาะเล�ยงเปน

เวลา 8 สปดาห

(ง) ตนยาสบสแดงท�ไดรบการถายยนและพฒนาเปนตนสเขยว เพาะเล�ยง

เปนเวลา 10 – 12 สปดาห แสดงตนท�ปกต

57

ภาพท� 36 การเกดตนยาสบท�ไดรบการถายยน pap1 แสดงการเกดตนสเขยว ตนสเขยวปน

แดง และตนสแดง จากการถายยน 5 คร� ง

58

ภาพท� 37 ชอง M คอ ดเอนเอมาตรฐาน λ/ EcoRI + HindIII ชอง C คอ ตนยาสบท�ไมได

รบการถายยน ชองท� 1 - 5 คอ ตนยาสบท�ไดรบการถายยน ตน 7.1.11, 7.1.14,

7.2.9, 7.1.3 และ 7.4.5 ตามลาดบ

59

ภาพท� 38 ชอง M คอ ดเอนเอมาตรฐาน 100 bp DNA Ladder ชอง P คอ พลาสมด

pPAP1 (Positive control) ชอง N คอตนยาสบท�ไมไดรบการถายยน (Negative

control) ชองท� 1-5 คอ ตนยาสบท�ไดรบการถายยน pap1 ตนท� 7.1.11, 7.1.14,

7.2.9, 7.1.3 และ 7.4.5ตามลาดบ และชอง H คอ น� ากล�น

59

ช

1

การใชยนสรางแอนโทไซยานนเปนยนเคร�องหมายสาหรบการถายยนในพชและ

เปนยนเปาหมายเพ�อเพ�มมลคาพชเศรษฐกจ

The use of a gene for production of anthocyanin pigment as a marker gene in

plant transformation and as a target gene for increased value in crop plants

ชอทพา สกลสงหาโรจน1 ศรเมฆ ชาวโพงพาง2 แสงทอง พงษเจรญกต1

และ วราภรณ แสงทอง แสงทอง1

Chotipa Sakulsingharoj1, Srimek Chowpongpang2, Saengtong Pongjaroenkit1

and Varaporn Sangtong1

1สาขาวชาพนธศาสตร คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยแมโจ จ.เชยงใหม 50290 2ภาควชาโรคพช คณะเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร บางเขน กทม. 10900

บทคดยอ

การถายยนเขาสพชสวนใหญมการใชยนตานสารปฏชวนะเขามาชวยในการคดเลอก

ช�นสวนพชท�ไดรบยน ซ� งทาใหเกดความวตกกงวลในเร� องการถายทอดยนออกสส�งแวดลอม

งานวจยน� จงไดทดลองใชยนสรางสมาชวยคดเลอกพชท�ไดรบการถายยน โดยไดทาการถายยน

ควบคมการสรางแอนโทไซยานน ซ�งคอยน pap1 เขาสขาวพนธ Kitaake โดยใชอะโกรแบคทเรยม

จากการทดสอบประสทธภาพการถายยน พบวา กลมแคลลสท�ไดรบการถายยนสามารถรอดบน

อาหารคดเลอกไดเปน 98 เปอรเซนต หลงเพาะเล�ยงบนอาหารสตรชกนาใหเกดตนกลมแคลลส

สามารถเกดยอดสงสดคดเปน 11 เปอรเซนต ซ�งยอดพฒนาเกดตนสงสดคดเปน 13 เปอรเซนต เม�อ

นาตนท�ได 18 ตนมาทาการสกดจโนมกดเอนเอ และตรวจวเคราะหดวยเทคนคพซอารโดยใชไพร

เมอรท�จาเพาะตอยน pap1 พบวา ม 4 ตนท� เกดแถบดเอนเอขนาด 400 ค เบส แสดงวาเปนขาว

ดดแปลงพนธกรรมท�มยน pap1 แทรกอยในจโนม

นอกจากน� ไดใชยน pap1 ถายเขาสยาสบพนธเบอรเลย ดวยอะโกรแบคทเรยม และมสาร

ปฏชวนะไฮโกรมยซนเปนสารคดเลอก พบวาช�นสวนใบยาสบรอดบนอาหารคดเลอกหลงจาก

เพาะเล�ยงเปนเวลา 4 สปดาหสงสด คดเปน 50 เปอรเซนต ช�นสวนของใบยาสบท�สามารถตานทาน

2

ตอสารปฏชวนะไฮโกรมยซนจะมลกษณะเปนสเขยว และบรเวณขอบของช�นสวนใบมตายอด

เกดข� นสงสดคดเปน 50 เปอรเซนต ในบางช�นสวนมตายอดสแดงเกดข� นสงสดคดเปน 44.44

เปอรเซนต และเม�อเพาะเล�ยงเปนเวลา 8 สปดาห พบวาตายอดท�เกดตามขอบของช�นสวนใบยาสบ

พฒนาเปนตนสมบรณท�งหมดจานวน 53 ตน โดยแยกเปนตนสเขยวจานวน 37 ตน ตนสเขยวปน

แดงจานวน 11 ตน และตนท�แดงจานวน 5 ตน สาหรบตนท�ผานการถายยนและตานทานตอสาร

ปฏชวนะท�งหมดจานวน 26 ตน เม�อนาไปวเคราะหดวยเทคนคพซอารเพ�อตรวจสอบการแทรกตว

ของยน pap1 ในจโนมตนยาสบ มจานวน 12 ตนท�ใหผลพซอารบวก คอตนสเขยวจานวน 7 ตน ตน

สเขยวปนแดงจานวน 2 ตน และตนสแดงจานวน 3 ตน คดเปน 46.15 เปอรเซนต จากงานวจยน�

พบวา สามารถนายน pap1 ซ� งควบคมการสรางแอนโทไซยานนไปใชคดเลอกยาสบท�ไดรบยน

แทนการใชยนตานสารปฏชวนะได

คาสาคญ: ขาว, ยาสบ, ยน pap1, แอนโทไซยานน, ยนเคร�องหมาย, การถายยน

Abstract

Antibiotic resistant genes were generally used in plant gene transfer system to select

transgenic cells or tissues. There are public concerns about those genes in human health and

environments. In this research, a gene for production of anthocyanin pigment (pap1) was

investigated for the use as selectable marker gene in transformation of rice. Transformation of

rice CV. Kitaake with pap1 gene was conducted by Agrobacterium. The results showed 98% of

hygromycin – resistant calli after 2 cycles of selection. The surviving calli were regenerated to

shoots at 11% 4 -5 weeks after culture on regeneration medium. The transformed rice plants were

developed at 13%. Leaf genomic DNA from the transformed plants were extracted and subjected

to PCR technique using primers specific to pap1 gene. Three out of eighteen transformed plants

showed PCR products of 400 bp, indicating the presence of pap1 gene in their plant genome.

In this study, leaf explants of tobacco cv. burley were transformed with pap1 gene by

Agrobacterium method. After 4 week-culture, the percentage of surviving leaf explants on

selection medium containing hygromycin was 50%. The hygromycin resistant explants appeared

green and all surviving explants generated shoot buds around the leaf edges. Some explants had

red buds at 44.44%. After 8 week-culture, the shoot buds developed to 53 plantlets. The

3

transformed tobacco plants were green (like control untransformed plants) and red, which

consisted of 37 green plants, 14 green plants with pink or red at leaf edges and 5 dark red plants.

These transformed tobacco plants were analyzed by PCR technique to investigate the integration

of pap1 gene in plant genome. There were 12 plants that showed PCR positive results which

consisted of 7 green plants, 2 green-red plants and 3 red plants. This research showed that the

pap1 gene ,which controls anthocyanin production, can be used as a selectable marker gene in

transformation of tobacco.

Keywords: rice, tobacco, pap1 gene, anthocyanin, marker gene, transformation

4

คานา

ระบบการสงถายยนในปจจบน มการใชยนตานสารปฏชวนะและยนตานสารปราบวชพช

มาใชเปนยนเคร�องหมายคดเลอกอยางกวางขวางซ�งมขอกงวลในหลายดาน เชน การบรโภคยนตาน

สารปฏชวนะ และยนตานสารปราบวชพชอาจเปนอนตรายตอมนษย สตว และระบบนเวศตาง ๆ

ดงน�นจงมการพฒนาระบบการถายยนเพ�อหลกเล�ยงการใชยนตานสารปฏชวนะและยนตานสาร

ปราบวชพช เชน การใชยนสรางสเพ�อชวยในการคดเลอกเซลลพชท�ไดรบยน

แอนโทไซยานน คอรงควตถท�สงเคราะหโดย secondary metabolic pathway จากกรดอะม

โน phenylalanine ทาใหเกดสตาง ๆ ในพช ในกระบวนการของการสงเคราะหแอนโทไซยานน ม

ยนท� เก�ยวของหลายยน ยน pap1 (production of anthocyanin pigment) เปนยนสราง MYB

transcription factor ซ� งควบคมการสงเคราะหแอนโทไซยานน และยงมผลทาใหสงเสรมการ

แสดงออกของยนหลายยนท�เก�ยวของกบการสงเคราะหฟลาโวนอยด

การพฒนาในสวนของยนคดเลอก ในการถายยนอาจใชยนสรางแอนโทไซยานนซ�งกคอยน

สเขามาชวยในการคดเลอกเน�อเย�อท�ไดรบยน แทนการใชยนตานสารปฏชวนะและยนตานสาร

ปราบวชพชเปนยนคดเลอก ซ� งจะเปนการลดขอวตกกงวลในเร�องของการถายทอดยนตานสาร

ปฏชวนะและสารปราบวชพช ในพชท�ทาการดดแปลงพนธกรรมออกไปสส�งแวดลอม

ในการทดลองน� จงไดทาการถายยน pap1 ซ�งเปนยนควบคมการสรางแอนโทไซยานนเขาส

ขาวพนธ Kitaake และยาสบพนธเบอรเลยดวยอะโกรแบคทเรยม เพ�อใชเปนยนเคร�องหมายในการ

คดเลอกพชดดแปลงพนธกรรมไดโดยงาย โดยดไดจากการเกดสของแอนโทไซยานน และเปนยน

รายงานผลสาหรบการถายยนเขาสขาวและยาสบ

วตถประสงคของการวจย

เพ�อศกษาการใชยนสรางแอนโทไซยานนเปนยนเคร�องหมายในการคดเลอกพชท�ไดรบการ

ถายยน

ประโยชนท�คาดวาจะไดรบ

สามารถใชยน pap1 เปนยนเคร�องหมายสาหรบการคดเลอกพชท�ไดรบยนไดโดยงายจาก

การเกดสแดง

5

การตรวจเอกสาร

ขาว

ขาวเปนพชอาหารท�สาคญชนดหน�งของโลก โดยเฉพาะประเทศในภมภาคเอเชยท�นยมรบประทาน

ขาวเปนอาหารประจาวนมากกวาในภมภาคอ�นๆของโลก การผลต บรโภคและการคาขาวสวนใหญ

จงกระจกตวอยในทวปเอเชย แตขาวท�ผลตไดสวนใหญจะใชในการบรโภคภายในประเทศ ทาให

มขาวเพยงรอยละ 6 เทาน�นท�เขาสตลาดการคาขาวระหวางประเทศ โดยประเทศท�มบทบาทมาก

ท�สดในการสงออกขาว คอประเทศไทย รองลงมาคอ อนเดย เวยดนาม จนและพมา ตามลาดบ โดย

ไทยสงออกขาวปละประมาณ 7 ลานตน เปนสดสวนประมาณรอยละ 30 ของการสงออกขาว

ท�งหมดท�วโลก

พนธขาว (เศรษฐกจการเกษตร,2542: ระบบออนไลน)

ขาวท�นามาปลกเปนอาหารน�นแบงออกไดเปน 2 ชนด คอ ขาว Oryza saiva ปลกในทวปเอเชยและ

Oryza glaberrima ปลกในทวปแอฟรกา แตขาวท�คาขายกนในตลาดโลกเกอบท�งหมดเปนขาวท�

ปลกจากแถบเอเชย ซ�งขาวชนดดงกลาวยงสามารถแบงไดตามแหลงปลกอก คอ

1.) ขาวอนดกา (Indica) มลกษณะเมลดยาวร ตนสง เปนขาวท�ปลกในเอเชยเขตมรสม ต�งแต จน

เวยดนาม ฟลปปนส ไทย อนโดนเซย อนเดย และศรลงกา ขาวพนธน� คนพบคร� งแรกในอนเดยและ

ตอมาไดพฒนาไปปลกท�ทวปอเมรกา

2.) ขาวจาปอนกา (Japonica) เปนขาวท�ปลกในเขตอบอน เชน จน ญ�ปน เกาหล มลกษณะเมลดปอม

กลมร ตนเต�ย

3.) ขาวจาวานกา (Javanica) ปลกในอนโดนเซยและฟลปปนส มเมลดปอมใหญ แตไมไดรบความ

นยมเพราะใหผลผลตต�า

สาหรบขาวท�ปลกในไทยเปนพนธขาวเมลดยาว คอ ขาวอนดกา แตประกอบดวยหลายพนธท�งท�ม

การพฒนาข�นใหม และขาวพนธพ�นเมองซ�งมอยประมาณ 3,500 พนธ ซ�งมขาวปา ขาวพ�นเมอง และ

ขาวท�ผสมโดยมนษยข�นมาใหม

ลกษณะท�สาคญของขาว (สารานกรมไทยสาหรบเยาวชน เลม 3: ระบบออนไลน)

ลกษณะท�สาคญของขาวแบงออกไดเปนลกษณะท�เก�ยวกบการเจรญเตบโต และลกษณะท�เก�ยวกบ

การขยายพนธ ดงน�

1. ลกษณะท�เก�ยวกบการเจรญเตบโต

ลกษณะท�มความสมพนธกบการเจรญเตบโตของตนขาว ไดแก ราก ลาตน และใบ

6

1.1 ราก รากเปนสวนท�อยใตผวดน ใชยดลาตนกบดนเพ�อไมใหตนลม แตบางคร� งกมรากพเศษ

เกดข�นท�ขอซ�งอยเหนอพ�นดนดวย ตนขาวไมมรากแกว แตมรากฝอยแตกแขนงกระจายแตกแขนง

อยใตผวดน

1.2 ลาตน มลกษณะเปนโพรงตรงกลางและแบงออกเปนปลองๆ โดยมขอก�นระหวางปลอง ความ

ยาวของปลองน�นแตกตางกน จานวนปลองจะเทากบจานวนใบของตนขาว ปกตมประมาณ 20-25

ปลอง

1.3 ใบ ตนขาวมใบไวสาหรบสงเคราะหแสง เพ�อเปล�ยนแรธาต อาหาร น� า และคารบอนไดออกไซด

ใหเปนแปง เพ�อใชในการเจรญเตบโตและ สรางเมลดของตนขาว ใบประกอบดวย กาบใบและแผน

ใบ

2. ลกษณะท�เก�ยวกบการขยายพนธ

ตนขาวมการขยายพนธดวยเมลดซ�งเกดจากการผสมระหวางเกสรตวผและเกสรตวเมย เพราะฉะน�น

ลกษณะท�สาคญเก�ยวกบการ ขยายพนธ ไดแก รวง ดอกขาวและเมลดขาว

2.1 รวงขาว (panicle) หมายถงชอดอกของขาว (inflorescence) ซ�งเกดข�นท�ขอของปลองอนสดทาย

ของตนขาว ระยะระหวางขออนบนของปลองอนสดทายกบขอตอของใบธง เรยกวา คอรวง

2.2 ดอกขาว หมายถง สวนท�เกสรตวผและเกสรตวเมยสาหรบผสมพนธ ดอกขาวประกอบดวย

เปลอกนอกใหญสองแผนประสานกน เพ�อหอ หมสวนท�อยภายในไว เปลอกนอกใหญแผนนอก

เรยกวา เลมมา (lemma) สวนเปลอกนอกใหญแผนใน เรยกวา พาเลย (palea) ท�งสองเปลอกน�

ภายนอกของมนอาจมขนหรอไมมขนกได

2.3 เมลดขาว หมายถง สวนท�เปนแปงท�เรยกวา เอนโดสเปรม (endosperm) และสวนท�เปนคพภะ

ซ�งหอหมไวโดยเปลอกนอกใหญสองแผน เอน โดสเปรมเปนแปงท�เราบรโภค คพภะเปนสวนท�ม

ชวตและงอกออกมาเปนตนขาวเม�อเอาไปเพาะ

ขาวพนธ Kitaake

ขาวพนธ Kitaake จดอยในสายพนธจาปอนกา (Toki, 1997) มโครโมโซมเปน 2n = 2x = AA = 24

(สมศกด� และคณะ, 2542) ลาตนเต� ย ความสงประมาณ 60 – 100 เซนตเมตร ใบส�นและแคบ เมลด

ปอมส�น ลกษณะพเศษของขาวญ�ปน คอ ขาวสารสกไดอณหภมต�าประมาณ 65 – 85 องศาเซลเซยส

ปรมาณอะไมโลสต�า ทาใหขาวสกนม นวล ยดหยน และเหนยวคลายมยาง เมลดขาวสกจะเกาะกน

ตางจากขาวอนดกาท�ปรมาณอะไมโลสสง เม�อหงเสรจขอนขางรวนซย ขาวญ�ปนใชเวลาเพาะปลก

7

จนถงเกบเก�ยวเพยง 3 เดอน เปนขาวท�ไมตองการใชน� ามากจงเหมาะสาหรบท�เพาะปลกท�ขาดแคลน

น� าและอายเพาะปลกส�น

ขาวท�เก�ยวของกบการสรางส

ขาวเจาหอมนล (บรษท สนลไรซ จากด : ระบบออนไลน)

เปนขาวท�กลายพนธจากขาวเหนยวดาตนเต�ยของจน โดยมความสงประมาณ 60-75 เซนตเมตร อาย

วนเกบเก�ยว 95-105 วน แตกกอด ลาตนและใบสเขยวปนมวง เมลดยาวมสมวงเขม (ภาพท� 1) กล�น

หอม ผลผลตประมาณ 400-700 กโลกรมตอไร จากการศกษาเอกลกษณพนธกรรม โดยใช

microsatellite จานวน 48 ตาแหนง ช� ใหเหนวา ขาวเจาหอมนลมความแตกตางขาว Hei Bao และ

Xua Bue Huq จากจน แสดงใหเหนวา ขาวท�ง 3 ไมไดเปนขาวพนธเดยวกน

ภาพท� 1 ลกษณะของตนและรวง ของขาวเจาหอมนล (ก.) และลกษณะเมลดขาว (ข.)

ท�มา: บรษท สนลไรซ จากด, 2553: ระบบออนไลน

ขาวเจาหอมนลนบเปนขาวท�มโภชนาการสง โดยมโปรตนอยในชวงประมาณ 10-12.5 % ม

แคลเซยม 4.2 มลลกรมตอ100 กรม ธาตเหลกแปรปรวนระหวาง 2.25-3.25 มลกรมตอ 100 กรม

และธาตสงกะสประมาณ 2.9 มลลกรม มปรมาณ antioxidation สงประมาณ 293 ไมโครโมลตอกรม

จากขอมลทางโภชนาการนบไดวาขาวเจาหอมนล เปนขาวท�มศกยภาพในการแปรรปทาง

อตสาหกรรมอาหารสง เชน cracker หรอ cooky

คณประโยชนของสมวงในขาวเจาหอมนล

ขาวเจาหอมนลมเมลดสมวงดา เม�อวเคราะหปรมาณสของเมลด สมวงดาประกอบไปดวย ส

มวงเขม (cyanidin) สชมพออน (peonidin) และสน� าตาล (procyanidin) ผสมกน ซ�งสท�เหนน�นเปน

สารประกอบกลม flavonoid ท�เรยกวา สารแอนโทไซยานน (anthocyanin) ท�ประกอบไปดวยสาร

(ก.) (ข.)

8

cyanidin กบ สาร peonidin สารโปรแอนโทไซยานดน (proanthocyanidin) ประกอบดวยสาร

procyanidin (ภาพท� 2) ซ�งสารดงกลาวท�งหมดน� เปนสาร antioxidant ท�ทาหนาจบกบอนมลอสระ

แลวชวยทาใหกลไกลการทางานของรางกายมประสทธภาพมากข�นกวาปกต

สารแอนโทไซยานน มรายงานวจยพบวา สามารถชวยลดการอกเสบของเน�อเย�อ ชวยลด

ไขมนอดตนในเสนเลอดท�หวใจ และสมอง บรรเทาโรคเบาหวาน ชวยบารงสายตาเพ�อเพ�ม

ประสทธภาพการมองเหนเวลามองตอนกลางคน สาร cyanidin มประสทธภาพในการ antioxidation

ไดดกวาวตามนอ หลายเทา และยงยบย �งการเจรญเตบโตของ epidermal growth factor receptor ใน

เซลลมะเรง สารโปรแอนโทไซยานดน หรอเรยกวาสาร condensed tannins มรายงานวจยพบวา สาร

โปรแอนโทไซยานดน ทาการ antioxidation ไดดกวาวตามนซ วตามนอ และ เบตาแคโรทน (beta-

carotene) สาร โปรแอนโทไซยานดน ยงไปจบกบอนภาคของกมมนตภาพรงสทาใหเซลลใน

รางกายทางานไดอยางปกต และชวยลดไขมนอดตนในเสนเลอดปองกนโรคหวใจ และโรคความ

ดนโลหตสง ยงยบย �งการเจรญเตบโตของเซลลมะเรงเตานม ปอด กระเพาะอาหาร และเมดเลอดขาว

และยงปองกนไวรส HSV-1 และยบย �งการทางานของเอนไซม reverse transcriptase ใน ไวรส HIV

การศกษายนท�ควบคมการสงเคราะหสในเมลดขาวเจาหอมนล

ขาวเจาหอมนลมเมลดขาวกลองสดา แตท�จรงคอสมวงเขมท�สะสมอยในสวนของรา

(pericarp) ซ�งประกอบไปดวยท�งหมดสามส คอ สน� าตาลออน (procyanidin), สแดง (peonidin),

และสมวง (cyanidin) (ภาพท� 2) สท�งหมดของขาวเปนรงควตถ (pigments) ท�ไดจากกระบวนการ

สงเคราะห flavonoid ในตนขาวซ�งอาศย 2 ปจจยหลกคอ

1.) ปจจยของพนธกรรม (genetic factor) เชน ระบบการทางานของยนควบคม (regulatory

genes) และยนโครงสราง

2.) ปจจยของสภาพแวดลอม (Environment factor) เชน สภาพของดน แรธาต สารอาหาร pH

อณหภม และแสง

9

ภาพท� 2 กระบวนการสงเคราะหฟลาโวลนอยด

ท�มา: บรษท สนลไรซ จากด, 2553: ระบบออนไลน

ในขาวสดาจะมการแสดงออกของยนควบคมการสงเคราะหส OSB1 ถกแปลรหสสารพนธกรรม

(translational) ไปเปนโปรตนท�ควบคม การแสดงออกยนโครงสราง (transcriptional activator)

สวนในขาวสขาวไมมการแสดงออกยนน�

ขาวเหนยวดาหรอขาวก�า

ขาว เหน ยวดาหร อขา วก�า (ภ าพท� 3) คอข าว เ หนย วท�มเย�อหมเมลด (pericarp) ส

มวงแดงจนถงสดา รวมท�งการมรงควตถ (pigment) ท�ปรากฏสในสวนตางๆ ของตนขาว ซ�งเปน

ลกษณะประจาพนธของขาวชนดน� รงควตถท�มสสวนใหญพบในสวนของลาตน ใบ และเกอบทก

สวนของชอดอก (floral part) ยกเวนในสวนของ embryo หรอ endosperm ท�ไมพบการกระจายตว

ของรงควตถ

10

ภาพท� 3 ลกษณะของตนขาวเหนยวดา และเมลด

ท�มา: ลดดาวลย กรรณนช, 2553: ระบบออนไลน

โดยท�วไปขาวเหนยวดาท�เกษตรกรปลกเปนขาวพนธพ�นเมอง ท�มการปลกเฉพาะพ�นท�มา

เปนเวลานานแลว และเกษตรกรจะเกบเมลดพนธไวสาหรบปลกในฤดปลกตอไปเอง พนธขาว

เหนยวดาท�เกษตรกรใชปลกเปนพนธท�ใหผลผลตตอพ�นท�คอนขางต�าเม�อเทยบกบขาวพนธอ�นๆ

นอกจากน� ยงรวมถงคณภาพการหงตมของขาวเหนยวดายงไมดพอ เชน หลงจากหงตมแลวขาว

แขงและรวนจนเกนไป และกล�นไมหอม เปนตน ดงน�นการปรบปรงพนธ เพ�อเพ�มผลผลตและ

คณภาพผลผลตของขาวเหนยวดา โดยเฉพาะคณภาพการหงตมจงมความจาเปน การรวบรวมพนธ

ขาวเหนยวดาและนามาปลกเพ�อประเมนลกษณะทางสณฐานวทยาและการใหผลผลตของขาว

เหนยวดาพนธพ�นเมองจงมความสาคญ เพราะขอมลจากการศกษาจะเปนประโยชนสาหรบการ

ปรบปรงพนธขาวเหนยวดาตอไป

ขาวเหนยวดามสารประกอบท�มประโยชนตอรางกายท�สงกวาขาวขาวกลาวคอ มสาร

แกมมา-โอไรซานอล (gamma oryzanol) ซ�งเปนสารประกอบท�พบในราขาวเหนยวดาปรมาณสงถง

2.70 เปอรเซนต เม�อเทยบกบราขาวขาวซ�งมประมาณ 1.12 เปอรเซนต (Teltathum, 2004) ตามภม

ปญญาทองถ�นเช�อกนวาขาวเหนยวดาเปนสมนไพร สารแกมมา-โอไรซานอลในน� ามนราขาวม

คณสมบตเปนสารแอนตออกซแดนท ท�ดกวาวตามนอ วตามนซและเบตาแคโรทน (สมวงษ, 2546)

นอกจากน� ยงพบวาสามารถลดการดดซมคอเรสเตอรอลจากอาหารสรางกาย ลดการสงเคราะหคอ

เรสเตอรอลในตบ ลดปรมาณคลอเรสเตอรอลในพลาสมา ( DeJian et al., 2002) ลดอาการผดปกต

ในสตรวยท�กาลงจะหมดประจาเดอน ( Zu et al., 2001)

นอกจากน�นแลว ขาวเหนยวดายงมรงควตถท�สาคญคอ แอนโทไซยานน (anthocyanin) ซ�ง

มคณสมบตในการตานการเกดปฏกรยาออกซเดชน (antioxidation) ชวยการหมนเวยนของกระแส

โลหต ชะลอการเส�อมของเซลลรางกาย โดยเฉพาะแอนโทไซยานนชนดท�พบในขาวสมวงกลม

อนดกา (indica type) (ซ�งกรวมขาวเหนยวดาไทย) คอ cyanindin 3-glucoside มคณสมบตในการ

ยบย �งการเจรญเตบโตของเซลลมะเรงปอดไดอกดวย

ฟลาโวนอยด (Flavonoids) (นตนช สดหนองบว. 2553, ระบบออนไลน)

ฟลาโวนอยด (Flavonoid) เปนสารกลมท�รจกกนท�วไปเก�ยวกบความสามารถในการเปน

สารตานอนมลอสระ (สารประกอบท�สามารถปองกนหรอชะลอการเกดกระบวนการออกซเดชน)

11

พบในธรรมชาตโดยเฉพาะในผลไมตระกลสม เบอร� หวหอม ชา โดยเฉพาะชาขาวและชาเขยว ไวน

แดง เปนตน

ภาพท� 4 ตวอยางโครงสรางและโมเลกลของสารกลมฟลาโวนอยด (Flavonoids)

ท�มา: นตนช สดหนองบว. 2553, ระบบออนไลน

ตวอยางสารฟลาโวนอยด (ภาพท� 4)

สารฟลาโวนอยดท�นาสนใจหลายกลมท�มบทบาทท�สาคญ Anthocyanidins, Catechins,

Flavones, Isoflavones, Lignin, Tannins

สาหรบฟลาโวนอยดหลายชนดท�มส ท�จดอยในกลมฟลาโวนอยดจะมสตรโครงสราง

คลายคลงกน แตกมคณสมบตแตกตางกนมาก อาจแบงฟลาโวนอยดออกเปนกลม 3 กลม คอ

1.) แอนโธซานตน มสเหลองนวล

2.) แอนโทไซยานน มสมวงแดง

3.) แทนนน ไมมสแตเปล�ยนเปนสน� าตาลไดงาย

กลมสารฟลาโวนอยด (Flavonoid)

เปนสารท�มอยในกลมโพลฟนอล (สารประกอบฟโนลก) มบทบาทในการชวยชะลอความแก

ตอตานการเกดมะเรง และหวใจได

สมบตเฉพาะของสารฟลาโวนอยด (Flavonoid)

เปนกลมสารท�ใหสสนแกพช รวมถงสสนสวยงามของกลบดอกไม สารกลมน�สามารถดดซบ

12

รงสอลตราไวโอเลตไดดและเปลงออกมา เปนแสงสตางๆของดอกไม พชไดพฒนากระบวนการ

สรางฟลาโวนอยดข�นเพ�อปองกนอนตรายจากรงสอลตราไวโอเลต

การทางานของสารกลมฟลาโวนอยด

สามารถทางานรวมกบวตามนซ โดยสามารถเปล�ยนใหเปนรปแบบท�ออกฤทธ� ในการตาน

อนมลอสระท�ดได นอกจากน�ฟลาโวนอยดยงสมพนธกบการควบคมการสรางไนตรกออกไซด

(Nitric Oxide) ท�จาเปนตอการไหลเวยนโลหต รวมท�งการสงผานสารอาหารใหกบเซลลประสาท

อกดวยโดยปกตธรรมชาตอาจพบอนพนธ ฟลาโวนอยดในรปของโพแอนโทไซยานดน

(Proanthocyanidin) ในบลเบอรร� ซ�งจะชวยปองกนการทาลายหลอดเลอดในดวงตา รวมท�งยงชวย

สงเสรมระบบไหลเวยนโลหตอกดวยขณะท�ในชาเขยวจะพบสารฟลาโวนอยดท�มบทบาทสาคญใน

การปองกนการทาลายเซลลจากปฏกรยาออกซเดชนของไขมนแอลดแอล

การตานอนมลอสระ

สามารถปองกนความเส�อมของเซลลตาง ๆ อนเน�องมาจากอนมลอสระท�ไดมาจากปฏกรยา

Oxidation โดยสามารถเลอกทานผกและผลไมสด ชา หวหอม ถ�วเหลอง ไวนแดง ซ�งอดมไปดวย

สารฟลาโวนอยด หรออาจรบประทานสารสกดฟลาโวนอยดเสรมรวมไปกบสารสกดเมลดองน,

สารสกดเปลอกสนฝร�งเศส, ไลโคปน หรอสารสกดชาเขยว กไดขนาดรบประทานท�แนะนา สารฟ

ลาโวนอยด 2-6 กรม รวมกบสารสกดเมลดองนหรอสารสกดเปลอกสนฝร�งเศส 50 มลลกรม และ

น� าชาเขยว 3 ถวย หรอชาเขยวสกด 300-400 มลลกรม ทกวน

แอนโทไซยานน

สาร Anthocyanin (แอนโทไซยานน) เปนสารท�มสต�งแตสน� าเงนเขมในสภาพวะเปนดาง

(pH>7) มสมวงเม�อเปนกลาง (pH 7) และจะเปล�ยนเปนสแดงถงสมไดในสภาวะเปนกรด (pH< 7)

เปนสารสท�พบไดท�วไปในดอกไม ผลไมบางชนด ใบหรอลาตนของพชบางชนดท�มสจด ใน

ปรมาณเพยงนอยนดกสามารถแสดงสไดในความเขมสง มนษยในบางพ�นท�รจกใชสารตวน�มาเปน

เวลานานแลวในกจกรรมตางๆ เชน ไทยใชสจากดอกอญชนทาขนม จนใชสของเปลอกไมและ

ใบไมบางชนดในการยอมผาใหมสตางๆ ยโรปใชผลไมปา (Wild Berry) ในการทาเคร�องสาอางและ

ทาขนม ซ�งสวนใหญแลวจะเปนอนพนธหน�งของ Anthocyanin ท�พบไดในธรรมชาตซ�งใหสน� าเงน

สมวง และสแดงบางชนด เกดจากสารกลมแอนโทไซยานน (Anthocyanin) เปนโมเลกลใหสท�ม

สวนประกอบสองสวนคอ แอนโทไซยานดน (Anthocyanidin) และน� าตาล

13

แอนโทไซยานนมหนาท�ปกปองผกและผลไมจากการทาลายของรงสอลตราไวโอเลต ม

ฤทธ� ตานอนมลอสระ การวจยพบวาสารกลมแอนโทไซยานนมฤทธ� ตานออกซเดช�นของไขมนแอล

ดแอล (LDL) และยงทาใหเซลลบผนงหลอดเลอดมความออนน�ม การกนผกและผลไมท�มสน� าเงน

และสมวงจงสามารถชะลอการเกดโรคไขมนอดตน ในหลอดเลอดและโรคหลอดเลอดหวใจแขงตว

ได ในประเทศไทยมการใชน� าดอกอญชนชวยปลกผมปลกค�ว เช�อวาน� าค�นจากดอกอญชนทาใหผม

ดกดาไดสารแอนโทไซยานนในดอกอญชนเพ�มความสามารถในการมองเหนหรอชะลอความเส�อม

ของดวงตา เน�องจากสารดงกลาวเพ�มความสามารถในการไหลเวยนเลอดในหลอดเลอดเลกๆ สวน

ปลาย ทาใหมเลอดมาเล�ยงรากผมและดวงตาไดดข�นน�นเอง ดอกอญชนสามารถกนสดแกลมน� าพรก

หรอตมน� าด�มกได

แอนโทไซยานนสมวงจากพชตระกลบลเบอรร� ถกใชเพ�อเสรมสมรรถภาพการมองเหนและ

ลดปญหาท�เกดกบระบบหมนเวยนของเลอด ในลกษณะเดยวกบการใชน� าค�นอญชนมาเปน

เวลานาน มการใชในผปวยเบาหวานและแผลในกระเพาะอาหาร จงมคณสมบตตานการเกด

โรคมะเรง ทาใหเซลลมะเรงเมดเลอดขาวตายและตานการเกดสารกอมะเรงในสตวทดลอง พชท�ม

แอนโทไซยานนมกพบสารกลมโพลฟนอลดวย สารกลมน�มฤทธ� ตานอนมลอสระและชวยชะลอ

สภาวะเส�อมของเซลล อาหารท�มสน� าเงนและสมวง ไดแก กะหล�าปลมวง มนสมวง องนแดง ชมพ

มะเหม�ยว ชมพแดงอ�นๆ ลกหวา ลกไหน ลกพรน ลกเกด ขาวแดง ขาวนล ขาวเหนยวดา ถ�วแดงและ

ถ�วดา มะเขอมวง หอมแดง หอมหวใหญสมวง บลเบอรร� น� าดอกอญชน น� าวานกาบหอย มนตมส

มวง และเผอก

ยน pap1

ในการคดเลอกพชดดแปลงพนธกรรม โดยมการใชยนเคร� องหมายท�เปนยนตานสาร

ปฏชวนะ หรอยนตานสารปราบวชพช อาจทาใหสงผลตอการเจรญเตบโตของเน�อเย�อพชได และยง

เปนขอจากดในการกดกนทางดานการคา ดงน�นการนายนเคร�องหมายท�ไดจากพชมาใชเปนยน

คดเลอกเน�อเย�อท�ไดรบยน จงเปนอกทางเลอกหน�งซ�งจะไมสงผลตอการเจรญเตบโตของเน�อเย�อพช

และไมกระทบตอส�งแวดลอม รวมท�งยงลดขอกงวลตางๆ ท�เกดจากการใชสารปฏชวนะ หรอยน

ตานสารปราบวชพชอกดวย

ยน pap1 (production of anthocyanin pigment) เปนยนท�สงเสรมการสงเคราะหสารแอนโท

ไซยานนซ�งทาใหเกดสตางๆ ในพช หากนาไปใชเปนยนคดเลอกตนพชท�ไดรบยนจะทาใหงายตอ

การคดเลอก โดยการสงเกตจากสท�แสดงออก

14

ยน pap1 เปนยนสราง MYB75 transcription factor ท�ควบคมการสงเสรมการสงเคราะห

สาร anthocyanin ซ� งยน pap1 แยกไดจากตน mutant Arabidopsis ท�มการแสดงออกอยางมาก

(overexpression) ของยน pap1 การถายยน pap1 เขาส Arabidopsis ทาใหเกดตน transgenic ท�มการ

แสดงออกเปนสมวงออนจนถงสมวงเขม แสดงวายน pap1 สงเสรมการสราง anthocyanin และการ

overexpression ของยน pap1 ทาใหตน Arabidopsis แสดงออก phenotype เปนสมวงเขม และพบส

มวงในทกช�นสวนของตนพชตลอดการพฒนาการของพช (Borevitz et al., 2000)

การศกษาการใชยน pap1 เปนยนเคร�องหมายในการคดเลอกและรายงานผล เปนการสราง

องคความรใหมในการถายยน pap1 ท�สงเสรมการสงเคราะห anthocyanin เขาสพช เพ�อสามารถทา

ใหการคดเลอกพชดดแปลงพนธกรรมทาไดงายโดยดจากการเกดสของ anthocyanin และเพ�มความ

ปลอดภยทางชวภาพของการสรางพชดดแปลงพนธกรรม

งานวจยท�เก�ยวของ

Zuluaga et. al. (2008) ไดทาการศกษาการแสดงของยน MYB75/PAP1 (PRODUCTION

OF ANTHOCYANIN PIGMENT 1) ท�มผลการสรางแอนโทไซยานนในตนมะเขอเทศท�ผานการ

ดดแปลงพนธกรรม โดยไดทาการตดตอยนจาก Arabidopsis thaliana (L.) Heyhn. แลวสงถายเขา

สอะโกรแบคทเรยมสายพนธ GV3101 จากน�นกทาการสงถายเขาสเมลดมะเขอเทศ ผลท�ไดพบวาม

การแสดงออกของ AtMYB75 โดยมการเพ�มการสรางแอนโทไซยานนท�งในใบ ลาตน รากและดอก

รวมถงผลภายใตสภาวะการเจรญเตบโตตามปกต แตการแสดงออกน�จะแสดงออกเฉพาะในสวน

ของเซลลท�อยใน Epidermal หรอเปลอกหมดานนอก หรอในกลมของทอลาเลยงเทาน�น แตยงพบ

อกวามการสะสมของ DFR (dihydroflavonol 4-reductase) อกดวย

Zhou et. al. (2008) ไดศกษากระบวนการพฒนาของแคลลสของยาสบ ซ�งมการแสดงออก

ของยน PAP1/MYB75 ท�มผลตอการ transcription และการแสดงออกของลกษณะ โดยไดทาการ

ถายยน pap1 เขาสแคลลสทาใหแคลลสเกดเปน 2 ลกษณะ คอ แคลลสท�เปนสแดง และแคลลสท�

เปนสขาว จากน�นทาการตรวจสอบความคลายกนของแคลลสท�ไดดวยเทคนค RT – PCR เพ�อดการ

ตอบสนองตอการควบคมของยน pap1 เพาะเล� ยงแคลลสเปนระยะเวลา 25 วน จากน�นทาการ

วเคราะหดวยเคร� อง HPLC พบวาม cyanidin, pelargonidin และ peonidin ซ� งอยในกลมของ

anthocyanidins และในการทดลองคร� งน� ยงไดศกษาผลของ ความมด แหลงไนโตรเจน และออกซน

ตอการสรางแอนโทไซยานนในแคลลสดวย และยงนาไปสการศกษาความเหมาะสมในการทางาน

ของ PAP1 ตอการสงเคราะหแอนโทไซยายนนในระดบposttranscriptional ในเซลล

15

Kim et. al. (2007) ไดทาการศกษาการแสดงออกของยนท�เก�ยวของกบการสงเคราะหแอน

โทไซยานน และตรวจสอบอณหภมท�มผลตอการควบคมการสงเคราะหแอนโทไซยานน ในขาว 2

สายพนธ ไดแก พนธ llpum และพนธ Heugjinju ซ�งเขาพบวา ในพนธ llpum ไมมการสงเคราะห

แอนโทไซยานน สวนในพนธ Heugjinju พบวา มการสงเคราะหแอนโทไซยานนได 3 ประเภท คอ

cyanidin, cyanidin 3 - glucoside - O, และ peonidin 3 - glucoside – O นอกจากน� ย งไดทาการ

วเคราะหการแสดงออกของยนสรางแอนโทไซยานนในการสงเคราะหเอนไซมตาง ๆ เชน

phenylalanine ammonia lyase (PAL), chalcone synthase (CHS), flavanone 3[3-hydroxylase

(F3H), dihydroflavonol reductase (DFR), และ anthocyanin synthase (ANS) ซ�งพบวาในใบและ

เมลดของขาวพนธ Heugjinju จะมการแสดงออกมากกวาในขาวพนธ llpum และยงพบอกวาขาว

พนธ Heugjinju มยน 2 ยน ท�มระดบการแสดงออกท�คอนขางสงและมความจาเพาะสาหรบการ

สงเคราะหแอนโทไซยานน น�นคอยน DFR และ ANS นอกจากน�การแสดงออกของยน CHS, F3H,

DFR, และ ANS ยงไดมการเพ�มข�นในระหวางการสกแกเมลดพนธ และมความสมพนธกบอณหภม

ในชวงการเจรญเตบโตของตนกลาอกดวย

Borevitz et. al. (2000) ไดทาการศกษาการตดแทกเพ�อระบตวควบคม MYB ของการ

สงเคราะห Phenylpropanoid โดยไดทาการใชการตดแทกโดยแทกท�ใชไดจากการตดตอยนอะโกร

แบคทเรยมเขากบ T – DNA ท�ประกอบ cauliflower mosaic virus 35S ซ�งเม�อตดแทกน� เขากบ

Arabidopsis เขากไดพบวามการแสดงออกของสมวงท�มความเขมขนสงมากในสวนตางๆของตน

น�น ผลจากการควบคมใหมการแสดงออกมากน� เองทาใหเกดลกษณะโดดเดน จงทาใหเกดการเปด

ใชงานยนในการสงเคราะห phenylpropanoid การเพ�มการสะสมของลกนน, hydroxycinnamic acid

esters และฟลาโวนอยด รวมถงแอนโทไซยานนตาง ๆ ท�สรางสมวงดวย ซ�งเขากลาววา ลกษณะท�

เกดข�นเหลาน� เกดจากการแทรกตวของโปรโมเตอรในตาแหนงยนท�ใกลกบ MYB transcription

แสดงวา การกระตนโดยการตดแทกสามารถควบคมลกษณะทางพนธกรรมท�เก�ยวของกบการสะสม

สารตาง ๆ ในระหวางการพฒนาของพช

Endo et. al. (2002) ไดศกษาการถายยนข�นตอนเดยวสาหรบการสรางขาวดดแปลง

พนธกรรมท�ปราศจากยนเคร�องหมายโดยใชระบบ MAT ชนด ipt พบวาระบบน� ไมเหมาะสาหรบ

พชท�มความสาคญทางเศรษฐกจมากท�สดเน�องจากกระบวนการสรางเอมบรโอจะข�นกบฮอรโมน

ออกซน ทาการทดลองโดยนาเน�อเย�อบรเวณ scutellum ของเมลดขาวท�มมการเพาะเล�ยงกอนแลว 5

วน มาทาการถายยน พบวาขาวดดแปลงพนธกรรมท�ปราศจากยนเคร�องหมายสามารถท�จะเกดเปน

ตนโดยตรงได 25.5 เปอรเซนต จากเน�อเย�อท�งหมดท�ทาการเพาะเล�ยงรวม โดยพบวาปราศจาก

รปแบบยอดกระจกภายใน 4 สปดาหหลงจากการเพาะเล�ยงรวม โดยลกษณะยอดกระจกท�หายไป

16

เกดจากการตดยน ipt ออกทาใหขาวดดแปลงพนธกรรมเกดเปนตนท�ปราศจากยนเคร�องหมายผาน

ทางเน�อเย�อเอมบรโอได ดงน�นระบบน� จงไมจาเปนตองมสารท�ใชในการคดเลอก และไมมการผสม

ขามของพชดดแปลงพนธกรรมท�ไมมยนเคร�องหมาย ระบบน� จะมประสทธภาพสงในการเร�มตน

สรางพชดดแปลงพนธกรรมท�ปราศจากยนเคร�องหมายในพชท�มความสาคญทางเศรษฐกจ

ToKi et.al (1997) ไดปรบปรงระบบการถายยนในขาว โดยทาการปรบปรงสตรอาหาร

สาหรบเพาะเล�ยงเน�อเย�อ ระยะเวลาการเพาะเล�ยงเน�อเย�อ พลาสมด สายพนธอะโกรแบคทเรยม

และข�นตอนการถายยนของ Hiei et.al (1994) และ Rashid et.al (1996) โดยใชอาหารสตร N6D

สาหรบชกนาเมลดขาวใหเกดแคลลส อาหาร 2N6-AS สาหรบเพาะเล�ยงรวมแคลลสกบอะโกร

แบคทเรยม อาหารสตร N6D ท�มไฮโกรมยซน 50 มลลกรมตอลตร เปนอาหารคดเลอกแคลลสท�

ไดรบยน อาหารสตร MS ดดแปลง ท�มสารควบคมการเจรญเตบโต kinetin ความเขมขน 2 มลลกรม

ตอลตร และ NAA ความเขมขน 0.02 มลลกรมตอลตร และไฮโกรมยซนความเขมขน 50 มลลกรม

ตอลตร สวนอาหารชกนาใหเกดรากเปนอาหารสตร MS ท�ไมเตมสารควบคมการเจรญเตบโต และ

มไฮโกรมยซน 50 มลลกรมตอลตร ซ�งวธการและสตรอาหารเหลาน� สามารถเพ�มประสทธภาพการ

ถายยนใหดข�น และสามารถชกนาใหแคลลสเปนยอดไดในระยะเวลาเพยง 2 เดอน

ยาสบ

ยาสบ หรอ จะว �ว เปนไมลมลก ลาตนมขนออนนมปกคลม สงประมาณ 1 - 1.5 เมตร ใบ

ลกษณะเปนรปไขกลบ โคนใบแคบ ใบโตหนามขนออนปกคลม (ภาพท� 1) ดอกออกเปนชอยาวท�

ปลายยอด สชมพออนหรอแดงเร�อ ออกผลลกษณะเปนแคปซล ใชใบตากแหงเปนสวนประกอบใน

บหร� หรอยาเสน

ช�อสามญ : Tobacco

ช�อวทยาศาสตร : Nicotiana tabacum L.

วงศ : ยาสบเปนพชในวงศโซลานาซอ (Solanaceae) เชนเดยวกบมะเขอเทศ พรก มนฝร�ง

ผกตางๆ ฯลฯ

สกล : ยาสบอยในสกลนโคเทยนา (Nicotiana)

ช�ออ�นๆ : จะว �ว (เขมร – สรนทร)

ชนด : ยาสบท�ปลกกนท�วไปมมากกวา 60 พนธ หรอ 60 ชนด แตท�ปลกเปนการคาเกอบ

ท�งหมดเปนพนธทาบาคม (tabacum) มบางท�ปลกพนธรสตกา (rustica) ทางแถบยโรปตะวนออก

และเอเชยไมเนอร

17

ภาพท� 5 รปภาพท�วไปของตนยาสบ

ท�มา Eco-agrotech, 2550 : ระบบออนไลน

ยาสบถกใชเปนพชตนแบบ (Model plant) ท�นามาใชในการทดลองอยางแพรหลาย เปนพช

ใบเล�ยงค ซ�งมประสทธภาพการถายยนท�สง ถายยนงาย เจรญเตบโตไดรวดเรว เพราะฉะน�นจง

เหมาะสมในการนามาถายยนในปจจบน

ลกษณะทางพนธกรรม

สามารถจาแนกยาสบออกเปน 60 สปชส ซ�ง 36 สปชส มการปลกอยในแถบอเมรกาใต 36

สปชส มการปลกอยในแถบอเมรกาเหนอ และ 9 สปชส มการปลกอยในแถบออสเตรเลย และหม

เกาะแปซฟกตอนใต ในจานวน 15 สปชส ท�งหมดของยาสบมอย 2 สปชส ท�นยมใชปลกเปนอยาง

กวางขวางในปจจบน คอ N. tabacum และ N. rustica ซ�งใชปลกเพ�อผลตเปนยาสบและยาเค�ยว

ยาสบท�งสองสปชส น�มการปลกกนท�วไปในแถบอเมรกาใต อเมรกากลาง หมเกาะอนเดยตะวนตก

บรเวณแถบตะวนตกเฉยงใตและภาคเหนอของเมกซโก

จานวนโครโมโซมของยาสบอยในระหวาง n = 9 ถง n = 24 แตสวนมากจะมโครโมโซม

n = 12 และ n = 24 ยาสบพวก N. tabacum และ N. rustica มจานวนโครโมโซม n = 24 (2n=4x=48)

วถการสงเคราะหสารแอนโทยานน

ยน pap1 เปนยนควบคมในการเปดการทางานของยนสรางเอนไซมตาง ๆ ในการ

สงเคราะหแอนโทไซยานน

18

ภาพท� 6 วถการสงเคราะหสารแอนโทไซยานน

ท�มา Jack Sullivan, 1998 : ระบบออนไลน

งานวจยท�เก�ยวของ

Geekiyanage et. al. (2007) ไดใชยน VlmybA2 ในองนใหแสดงออกในตนยาสบ และตน

Arabidopsis โดยทาการเพาะเล�ยงเน�อเย�อตนยาสบและตน Arabidopsis สาหรบอาหารเพาะเล�ยง

เน�อเย�อตนยาสบ มการเตมฮอรโมน BA และ NAA ดวย พบวาตนยาสบและตน Arabidopsis มส

มวงแดง ท�งตน ใบ ดอก เมลด และราก และยงพบวา การ over-expression ของ VlmybA2 เพยง

อยางเดยวใน tobacco และ Arabidopsis ท�ไดรบการถายยน สามารถสรางแอนโทไซยานนได

ดงน�น VlmybA2 อาจจะมความสามารถในการทางานอยางหลากหลายในพชใบเล�ยงค สาหรบการ

over-expression ของ VlmybA2 ใชในการแยกตนยาสบท�ไดรบการถายยนเขาไปไดซ� งเปนการ

แกไขขอกงวลท�เก�ยวกบการสารยนตานสารปราบวชพชและยนตานสารปฏชวนะได สวนสของ

เมลด Arabidopsis ทาใหเกด phenotype ท�แตกตาง จงใชในการแยกเมลดท�ไดรบการถายยนได

Xie et. al. (2006) ไดใช anthocyanidin reductase และ PAP1 MYB transcription factor ให

แสดงออกรวมกนใน metabolic engineering ของ proanthocyanidins พบวา ตนท�มเฉพาะยน pap1

มการแสดงออกของฟโนไทปมากกวา ซ�งจะเหนเปนสมวงแดงมากกวา ไมวาจะเปนใบ ลาตน ดอก

และราก กมสมวงแดง สาหรบตนท�มการแสดงออกรวมกนของ anthocyanidin reductase และ

PAP1 MYB transcription factor จะใหสมวงแดงนอยกวาซ�งจะมสเขยวปนดวย สวนตนท�มแตยน

anthocyanidin reductase จะใหตนท�มสเขยวเหมอนตนควบคม (control)

Zhang et. al. (2009) ไดใชยน AtCPC จากตน Arabidopsis thaliana ใหแสดงออกในยาสบ

โดยใช ใชยาสบพนธ Xanthi ในการถายยน Agrobacterium สายพนธ EHA 105 และใช

hygromycin เปนสารคดเลอกบนอาหาร ซ�งผลท�ไดคอ ยาสบจะมสเขยว สเขยวอมชมพ และสชมพ

19

ซ�งสรปไดวา โปรตน MYB ถงจะมาจากหลายพชท�แตกตางสปชสกน แตกมสวนในการควบคม

phenylpropanoid metabolism และ pathways ท� เปนก�งกานสาขา เปนพวกท�มการสงเคราะห

flavonoid งานวจยน� แสดงใหเหนวา AtCPC สามารถท�จะควบคมการผลต anthocyanin ได

20

อปกรณและวธการ

สายพนธแบคทเรยและพลาสมดท�ใชในการทดลอง

1. E. coli สายพนธ DH5 ท�มพลาสมด pRTL2 (ภาพท� 7)

2. E. coli สายพนธ DH5 ท�มพลาสมด 3PAP-Red (ภาพท� 8)

ยน pap1 เปนยนท�ไดจาก Arabidopsis thaliana ไดรบความอนเคราะหจาก ดร.เจษฎาพร

พทกษสธพงษ ศนยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยชวภาพแหงชาต จ.ปทมธาน

พลาสมด 3PAP-Red ไดมาจากการนายน Ds-Red ท�ไดมาจากปะการง โคลนเขาท� EcoRI

และ HindIII sites ของพลาสมด pCAMBIA 2300 ทาใหไดพลาสมดท�ช�อ 23 Red จากน�นนายน

pap1 ขนาด 747 bp ซ�งไดมาจาก Arabidopsis โคลนเขาท� XhoI site โดยแทนท�ยน nptII ใน พลาส

มด 23 Red ทาใหไดพลาสมดช�อ 3PAP-Red

เน�องจากพลาสมด 3PAP-Red มยน 2 ยน ไดแก Ds-Red และ pap1 แตยนท�ตองการ

นาไปใชในการถายยนเขาสสบดา คอ ยน pap1 จงตองมการสรางชดยนข�นใหม โดยนายน pap1

จากพลาสมด 3PAP-Red โคลนเขาไปในพลาสมด pRTL2 เพ�อสรางชดยนท�ทางานภายใตการ

ควบคมของ 35S dual promoter, TEV Leader และ 35S terminator ซ�งจะทาใหยน pap1 มการ

แสดงออกอยางมากตลอดเวลาในทกเน�อเย�อ

ภาพท� 7 แผนท�พลาสมด pRTL2 แสดง 35S promoter with dual enhancer ตอกบ TEV Leader

coding sequence และ 35S terminator เพ�อใชสาหรบโคลนยน pap1 เขาท� NcoI/SacI sites โดย

แทนท� coding sequence นอกจากน� ยงมยนตานยาแอมพซลน (ApR) เพ�อใชในการคดเลอกแบคทเรย

ท�ไดรบพลาสมด

21

ภาพท� 8 แผนท�พลาสมด 3PAP-Red

วธการทดลอง

งานวจยน� ไดแบงเปน 3 การทดลอง ไดแก

การทดลองท� 1 การสรางชดยน pap1 สาหรบถายยนในพช

การทดลองท� 2 การถายยนเขาสขาว

การทดลองท� 3 การถายยนเขาสยาสบ

การทดลองท� 1 การสรางชดยน pap1 สาหรบถายยนในพช

ข�นตอนในการสรางชดยน pap1 มดงน�

1.1. การเตรยม competent cell

1.2. การเตรยมพลาสมดเวกเตอร (pRTL2) ดวยวธ Alkaline lysis method

1.3. การเพ�มปรมาณช�นยน pap1 จากพลาสมด 3PAP-Red ดวยเทคนค PCR

1.4. การโคลนยน pap1 เขาสเวกเตอร pRTL2

1.5. การฝากถายพลาสมดสายผสม (pKL1) ท�ไดจากการเช�อมตอช�นยน pap1 กบเวกเตอร

pRTL2 เขาส competent cell ของ E. coli สายพนธ DH5α ดวยวธ Heat shock

วธทา

1.1. การเตรยม competent cell

1. นา E. coli สายพนธ DH5α มา streak บนอาหารแขง LB นาไปเล�ยงท�อณหภม 37

องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 – 17 ช�วโมง

22

2. นาโคโลนเด�ยวของ E. coli สายพนธ DH5α เล�ยงในอาหารเหลว LB ปรมาตร 3

มลลลตร ท�อณหภม 37 องศาเซลเซยส เขยาท� 150 รอบตอนาท เปนเวลา 15 – 17

ช�วโมง

3. นา E. coli ท�เล�ยงไดปรมาตร 1 มลลลตร ใสในอาหารเหลว LB ปรมาตร 50 มลลลตร

เล�ยงท�อณหภม 37 องศาเซลเซยส เขยาท� 150 รอบตอนาท วดคาดดกลนแสงทกช�วโมง

จนกวาจะไดคาดดกลนแสง (OD600) อยในชวง 0.2 – 0.5

4. เทเช�อท�ไดลงในหลอดท�ใชในการป�นเหว�ยงขนาด 50 มลลลตร (แชเยน) ป�นเหว�ยงท�

ความเรว 6,000 รอบตอนาท อณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท

5. เทอาหารออก นาตะกอนมาละลายดวย CaCl2 เขมขน 50 มลลลตร (แชเยน) ปรมาตร 4

มลลลตร ผสมดวยการปเปตข�นลง

6. จากน�นเตม CaCl2 เขมขน 50 มลลลตร (แชเยน) ลงไปอก 16 มลลลตร ผสมดวยการ ป

เปตข�นลง บมในน� าแขงนาน 20 นาท

7. ป�นเหว�ยงเกบเซลลท�ความเรว 6,000 รอบตอนาท อณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 10

นาท

8. เทสวนใสท�ง แลวละลายตะกอนกลบดวย CaCl2 เขมขน 50 มลลลตร (แชเยน)

ปรมาตร 2 มลลลตร

9. เตม 80% glycerol ท�ฆาเช�อแลว ปรมาตร 0.5 มลลลตร ผสมดวยการปเปต

10. แบง competent cell ท�ไดใสในหลอดขนาด 1.5 มลลลตร หลอดละ 200 ไมโครลตร

11. เกบ competent cell ท�ตเกบความเยนท� -80 องศาเซลเซยส จนกวาจะใชงาน

1.2. การเตรยมพลาสมดเวกเตอร pRTL2 ดวยวธ Alkaline lysis method

การเตรยมเช�อ E. coli สายพนธ DH5α ท�มพลาสมด pRTL2

1. นา glycerol stock ของ E. coli สายพนธ DH5α ท�มพลาสมด pRTL2 มา streak บน

อาหารแขง LB ท�เตมยาปฏชวนะแอมพซลน 100 มลลกรมตอลตรนาไปเล�ยงท�อณหภม

37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 – 17 ช�วโมง

23

2. นาโคโลนเด�ยวของ E. coli มาเล�ยงในอาหารเหลว LB ท�เตมยาปฏชวนะแอมพซลน 100

มลลลตร เล�ยงท�อณหภม 37 องศาเซลเซยส เขยาท� 150 รอบตอนาท เปนเวลา 15 – 17

ช�วโมง

3. นา E. coli ท�เล�ยงไดปรมาตร 1.5 มลลลตร ใสในหลอดขนาด 1.5 มลลลตร นาไปป�น

เหว�ยงท�ความเรว 12,000 รอบตอนาท นาน 30 วนาท

4. ปเปตสวนใสท�ง เกบเฉพาะสวนตะกอนไว ทาซ�าอกคร� ง

การสกดพลาสมด pRTL2 ดวยวธ Alkaline lysis method

1. ละลายตะกอนเซลลท�ได ดวย Alkaline lysis solution I (แชเยน) ปรมาตร 100

ไมโครลตร ผสมโดยการนาไป vortex

2. เตม Alkaline lysis solution II (เตรยมใหมทกคร� งกอนใช) ปรมาตร 200 ไมโครลตร

ผสมดวยการพลกหลอดกลบไปมา 5 คร� ง บมท�อณหภมหอง 10 นาท

3. เตม Alkaline lysis solution III (แชเยน) ปรมาตร 150 ไมโครลตร ผสมดวยการพลก

หลอดกลบไปมา 5 คร� ง นาไปแชท� -20 องศาเซลเซยส นาน 20 นาท

4. นาไปป�นเหว�ยงท�อณหภมหอง ความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 5 นาท จากน�น

ยายสวนใสใสในหลอดใหม

5. เตมครอโรฟอรม ปรมาตร 1 เทาของสารละลาย นาไปป�นเหว�ยงท�อณหภมหอง

ความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 5 นาท ยายสวนใสใสในหลอดใหม

6. เตม absolute ethanol (แชใน -20 องศาเซลเซยส) ปรมาตร 1 มลลลตร ผสมดวยการ

พลกหลอดกลบไปมา แชท� -20 องศาเซลเซยส นาน 10 – 40 นาท

7. นาไปป�นเหว�ยงท�อณหภมหอง ความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 5 - 10 นาท ป

เปตสวนใสท�ง

8. ลางตะกอน โดยเตมเอทานอล เขมขน 70% (แชใน -20 องศาเซลเซยส) 1 มลลลตร

ผสมดวยการพลกหลอดกลบไปมา นาไปป�นเหว�ยงท�อณหภมหอง ความเรว 12,000

รอบตอนาท เปนเวลา 5 - 10 นาท ปเปตสวนใสท�ง

9. ทาซ�าขอ 8. อกคร� ง

24

10. เปดฝาหลอดแลวคว �าหลอดบนกระดาษซบ จนกระท�งตะกอนแหง

11. ละลายตะกอนดวย dH2O ท�มเอนไซม RNasA ความเขมขน 20 ไมโครกรมตอมลลลตร

ปรมาตร 30 ไมโครลตร

12. นาไปตรวจสอบดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโทรฟอรซส

การเตรยมเวกเตอร pRTL2 โดยการตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ

ตารางท� 1 องคประกอบของการตดพลาสมดดวยเอนไซมตดจาเพาะ

สวนผสมของปฏกรยา ปรมาตรท�ใช

(ไมโครลตร/ปฏกรยา) ความเขมขนสดทาย

dH2O 12 -

10X NE Buffer # 4 2 1X

Plasmid (pRTL2) 5 1µg

NcoI 0.5 -

SacI 0.5 -

Total 20 -

วธการ

1. นาองคประกอบของปฏกรยาการตด มาละลายบนน� าแขง (ยกเวนเอนไซม)

2. คานวณปรมาตรของสารละลายตางๆ ท�จะใช (ตารางท� 1) แลวนาสารละลายเหลาน�น

ผสมกนในหลอด

3. เม�อเตรยมปฏกรยาเสรจแลว จากน�นนาเอนไซมตดจาเพาะออกมาจากต แช ปเปต

เอนไซมลงในหลอด ผสมดวยการปเปตข�นลง

4. ป�นเหว�ยงอยางรวดเรวในไมโครฟวจ เพ�อใหปฏกรยาลงมาดานลางหลอดท�งหมด

5. บมท�อณหภม 37 องศาเซลเซยส ขามคน

6. หยดการทางานของเอนไซม ดวยการบมท� 65 องศาเซลเซยส นาน 20 นาท

7. นาไปตรวจสอบการตดของเอนไซมดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโทรฟอรซส

25

8. แยกบรสทธ� เวกเตอรท�ได โดยใชชด PCR clean-up Gel extraction

9. เกบไวในท�เยนจนกวาจะใชงาน

1.3. การเพ�มปรมาณช�นยน pap1 จากพลาสมด 3PAP-Red ดวยเทคนค PCR

1. สกดพลาสมด 3PAP-Red ดวยชด kit (Plasmid DNA Purification Nucleospin ® Extract)

2. ทาการเพ�มปรมาณช�นยน pap1 ดวยเทคนค PCR โดยใชไพรเมอร คอ F1_NcoI PAP1

และ R_SacI PAP1

ตารางท� 2 องคประกอบของปฏกรยา PCR ในการเพ�มปรมาณช�นยน pap1

สวนประกอบของปฏกรยา ปรมาตร

(ไมโครลตร/1 ปฏกรยา) ความเขมขนสดทาย

dH2O 34 -

10X Thermol pol Reaction buffer 5 1X

2.5 mM dNTP mix 4 0.2 มลลลตร

F1_NcoI PAP1 2.5 0.5 µM

R_SacI PAP1 2.5 0.5 µM

Vent DNA polymerase (2 U/1 µl) 1 2 U

DNA Template (3PAP-Red) 1 -

Total 50 -

3. ผสมสวนประกอบตางๆ ของปฏกรยา ดงตารางท� 2 ตามลาดบ

4. ต�งโปรแกรมเคร�อง PCR ดงน�

Initial Denaturaton 95 องศาเซลเซยส 3 min

Denaturaton 95 องศาเซลเซยส 1 min

Annealing 64 องศาเซลเซยส 30 sec

26

Extension 72 องศาเซลเซยส 3 min

Final Extension 72 องศาเซลเซยส 10 min

อณหภมเกบในเคร�อง 20 องศาเซลเซยส

ทาท�งหมด 35 cycles

5. นาหลอด PCR ท�เตรยม ใสเคร�อง PCR จากน�นปดฝาแลวส�งเคร�องใหความรอนท�ฝา

เคร�อง เพ�อปองกนการระเหยของปฏกรยาท�จะทาใหปรมาตรเปล�ยนแปลง

6. ม�อเคร�องทางานเสรจ นาไปเชคผลผลตดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลคโทรฟอรซส

7. แยกบรสทธ� ดเอนเอท�ได โดยใชชด PCR clean-up Gel extraction

8. จากน�นนาช�นยน pap1 มาตดดวยเอนไซม NcoI และ SacI

ตารางท� 3 องคประกอบของการตด PCR product ดวยเอนไซมตดจาเพาะ

สวนผสมของปฏกรยา ปรมาตรท�ใช

(ไมโครลตร/ปฏกรยา) ความเขมขนสดทาย

dH2O 12 -

10X NE Buffer # 4 2 1X

PCR Product (ยน pap1) 5 1µg

NcoI 0.5 -

SacI 0.5 -

Total 20 -

9. นาองคประกอบของปฏกรยาการตด มาละลายบนน� าแขง (ยกเวนเอนไซม)

10. คานวณปรมาตรของสารละลายตางๆ ท�จะใช (ตารางท� 3) แลวนาสารละลายเหลาน�น

ผสมกนในหลอด

11. เม�อเตรยมปฏกรยาเสรจแลว จากน�นนาเอนไซมตดจาเพาะออกมาจากต แช ปเปต

เอนไซมลงในหลอด ผสมดวยการปเปตข�นลง

27

12. ป�นเหว�ยงอยางรวดเรวในเคร�องไมโครฟวจ เพ�อใหปฏกรยาลงมาดานลางหลอดท�งหมด

13. บมท�อณหภม 37 องศาเซลเซยส ขามคน

14. หยดการทางานของเอนไซม ดวยการบมท� 65 องศาเซลเซยส นาน 20 นาท

15. นาไปตรวจสอบการตดของเอนไซมดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโทรฟอรซส

16. แยกบรสทธ� เวกเตอรท�ได โดยใชชด PCR clean-up Gel extraction

17. เกบไวในท�เยนจนกวาจะใชงาน

1.4. การโคลนยน pap1 เขากบเวกเตอร pRTL2

ตอนท� 1 การเช�อมตอช�นยน pap1 กบเวกเตอร pRTL2

1. คานวณหาปรมาณ เวกเตอร และช�นยนท�สนใจ โดยใชสตร

(Weight ratio) V = 1 × ความยาวของ DNA พาหะ (bp) × MW ของ DNA 1 bp (660)

I 3 × ความยาวของช�นยนท�สนใจ (bp) × MW ของ DNA 1 bp (660)

ตารางท� 4 องคประกอบของปฏกรยาการเช�อมตอดเอนเอ (ligation)

สวนผสมของปฏกรยา ปรมาตรท�ใช (ไมโครลตร/ปฏกรยา)

control V:I=1:3 V:I=1:5

dH2O 3.5 1.5 4

10X buffer for T4 DNA ligase 1 1 1.5

Vector (pRTL2) 5 5 5

Insert (pap1) - 2 4

T4 DNA Ligase 0.5 0.5 0.5

Total 10 10 15

2. ผสมสวนประกอบตางๆ ของปฏกรยา ดงตารางท� 4 ตามลาดบ

3. บมท�อณหภม 16 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 – 17 ช�วโมง

28

1.5. การถายฝากพลาสมดสายผสม (pKL1) ท�ไดจากการเช�อมตอช�นยน pap1 กบเวกเตอร

pRTL2 เขาส competent cell E. coli สายพนธ DH5α ดวยวธ Heat shock

1. นา competent cell (DH5α) มาแชในน� าแขง

2. จากน�นนาดเอนเอท�ทาการเช�อมตอแลวมาใสลงใน competent cell (DH5α)

3. บมท�งไวในน� าแขง 10 นาท

4. เม�อครบนามาบมใน water bath อณหภม 42 องศาเซลเซยส นาน 1 นาท

5. บม และเขยา ท�อณหภม 37 องศาเซลเซยส ความเรว 150 รอบตอนาท นาน 30 - 60 นาท

6. นาเช�อท�บมเสรจมา spread บนอาหารแขง LB ท�เตมแอมพซลน 100 มลลกรมตอลตร

7. บมท� 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 – 17 ช�วโมง

8. คดเลอกโคลนท�ไดแลวนามาสกดพลาสมดสายผสมดวยวธ Alkaline lysis method

9. ตดพลาสมดสายผสมดวยเอนไซม NcoI และ SacI

10. นาไปตรวจสอบการตดของเอนไซมดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโทรฟอรซส

11. คดเลอกโคลนท�มพลาสมดสายผสม และเตรยมการสกดพลาสมดดวยชด kit เพ�อสงหา

ลาดบเบสตอไป

การทดลองท� 2 การถายยนเขาสขาว

พนธขาวท�ใชในการทดลอง

ขาวพนธ Kitaake จดอยในสายพนธ japonica (Toki, 1997) มโครโมโซมเปน 2n = 2x =

AA = 24 (สมศกด� และคณะ, 2542) ลาตนเต� ย ความสงประมาณ 60 – 100 เซนตเมตร ใบส�นและ

แคบ เมลดปอมส�น

สายพนธอะโกรแบคทเรยมและพลาสมดท�ใชในการทดลอง

ใชอะโกรแบคทเรยม สายพนธ AGL1 ท�มพลาสมด pPAP1 ซ�งมยน pap1 ภายใตการ

ควบคมของโปรโมเตอร 35S มยน hptll เปนยนเคร�องหมายท�ใชคดเลอกเน�อเย�อท�ไดรบยน

29

ภาพท� 9 แผนท�พลาสมด pCAMBIA 1390

ภาพท� 10 แผนท� T – DNA ของพลาสมด pCAMBIA 1390

ยน pap1 มขนาด 747 bp (บรเวณ จาก start codon - stop codon) อยภายใตการควบคม

ของ 35S double promoter และ nos terminator และชดยนน� ถกโคลนอยท� MCS ของ

pCAMBIA1390 ท�บรเวณ HindIII และ SmaI (ภาพท� 10)

วธการทดลอง

30

ไดแบงเปน 3 ข�นตอนไดแก

2.1. การถายยนสรางแอนโทไซยานนเขาสแคลลสขาว

2.2. การตรวจวเคราะหตนขาวท�ไดรบการถายยน

2 1 การถายยนสรางแอนโทไซยานนเขาสแคลลสขาว

ตอนท� 1 การชกนาใหเกดแคลลส

1. แกะเปลอกเมลดแกของขาวพนธ Kitaake

2. ฟอกฆาเช�อดวย 10% โซเดยมไฮโปคลอไรด 2 คร� งๆ ละ 15 นาท

3. นาเมลดแกของขาวท�ผานการฟอกฆาเช�อแลว มาลางดวยน� ากล�นท�ผานการฆาเช�อ

4. ซบเมลดขาวบนกระดาษทชชท�ฆาเช�อแลว

5. เพาะเล�ยงเมลดใหเกดเปนแคลลสโดยการปกเมลดขาวท�ได ลงไปบนอาหารสตร N6D

ดดแปลง โดยใหสวนท�เปนเอมบรโอ (จมกขาว) โผลพนข�นมาเหนออาหาร

6. นาไปเพาะเล�ยงท�อณหภม 28±2 องศาเซลเซยส ในท�มด เปนระยะเวลา 3 – 4 สปดาห

7. ยายแคลลสลงบนอาหารใหมสตรเดม เพาะเล�ยงในท� 28±2 องศาเซลเซยส ในท�มดเปน

เวลา 3 วน กอนนามาถายยน

ตอนท� 2 การเตรยมอะโกรแบคทเรยมสาหรบใชถายยน

1. ทาการขดอะโกรแบคทเรยม สายพนธ AGL1 ท�มพลาสมด pPAP1 จากกลเซอรอลเช�อลง

บนอาหารสตร LB ท�มกานามยซนความเขมขน 50 มลลกรมตอลตร และไรแฟมมซน

ความเขมขน 50 มลลกรมตอลตร

2. นาไปเล�ยงท�อณหภม 28 องศาเซลเซยส ในท�มดเปนเวลา 3 – 4 วน เพ�อใหเกดโคโลนเด�ยว

3. เลอกเอาโคโลนเด�ยวมาเล�ยงในอาหารเหลวสตร LB ปรมาตร 20 มลลลตร ท�ม กานามยซน

ความเขมขน 50 มลลกรมตอลตร และอะซโตไซรงโกนความเขมขน 100 มลลกรมตอลตร

4. นาเช�อท�ไดไปเล�ยงท�อณหภม 28 องศาเซลเซยส บนเคร�องเขยาท� 150 รอบตอนาท (ขามคน)

กอนนามาทาการถายยน

5. วดคาความเขมขนของสารแขวนลอยเช�อดวยเคร�องสเปกโตรโฟโตมเตอร โดยวดคาการ

ดดกลนแสง(OD) ท�ความยาวคล�น 600 นาโนเมตร

31

6. ป�นเหว�ยงเพ�อตกตะกอนอะโกรแบคทเรยม โดยเทสารแขวนลอยอะโกรแบคทเรยม ลงใน

หลอดพลาสตก และป�นเหว�ยงท�ความเรวรอบ 6000 รอบตอนาท อณหภม 4 องศาเซลเซยส

เปนเวลา 10 นาท

7. เทสวนใสท�ง และละลายตะกอนดวยอาหารเหลวสตร 2N6 ปรมาตร 20 มลลลตร

8. เจอจางความเขมขนของสารแขวนลอยอะโกรแบคทเรยมสาหรบการถายยนใหได คา OD600

เทากบ 0.15 โดยปเปตสารแขวนลอยจากขอ 7 ตามปรมาตรท�คานวณไดจากคาความเขมขนเช�อ

ท�ตองการใสในหลอดพลาสตก

9. เตมอาหารเหลวสตร 2N6 ใหปรมาตรสดทายเปน 35 มลลลตร และเตมอะซโตไซรงโกน

ความเขมขน 100 ไมโครโมลาร

ตอนท� 3 การปลกถายเช�อและการเพาะเล�ยงรวม

1. วางตะแกรงท�ฆาเช�อแลวบนกนเพลทเปลา ใสแคลลสท�ไดจากการยายวางบนอาหาร

ใหม เปนเวลา 3 วน ไปบนตะแกรง

2. เทสารละลายเช�อท�เตรยมไดลงไป ทาการปลกถายเช�อเปนระยะเวลา 90 วนาท

3. นาตะแกรงท�มแคลลสไปซบบนกระดาษทชชท�ฆาเช�อแลวใหพอหมาด

4. นาแคลลสท�ไดไปวางบนอาหารสตร Co-culture กระจายแคลลสใหท�วเพลท

5. เพาะเล�ยงรวมระหวางอะโกรแบคทเรยมกบแคลลสในท�มดเปนเวลา 3 วน

ตอนท� 4 การคดเลอกช�นสวนท�ไดรบการถายยน

1. ทาการลางแคลลสดวยน� ากล�น 3 – 4 คร� งกอน โดยเกบแคลลสท�ไดจากการเพาะเล�ยง

รวมใสในหลอดฝาเกลยวขนาด 50 มลลลตร จากน�นเตมน� ากล�นลงไปประมาณ 35 –

40 มลลลตร กลบกลอกไปมา 3 – 4 คร� ง แลวเทน� าท�ง

2. เม�อลางดวยน� ากล�นเสรจแลว กจะทาการลางอกคร� งดวยอาหารลางเน�อเย�อท�เตรยมไว

กลบกลอกไป 4 – 5 คร� ง

3. ซบบนกระดาษทชชใหพอหมาด จากน�นกยายแคลลสท�ไดไปวางบนอาหารคดเลอก

(สตรN6D) ท�มไฮโกรมยซนความเขมขน 50 มลลกรมตอลตร และซโฟแทกซมความ

เขมขน 250 มลลกรมตอลตร

32

4. นาแคลลสท�ไดไปเล�ยงในท�มแสง 16 ช�วโมงตอวน เปนเวลา 2 สปดาห

5. ทาการยายแคลลสท�สามารถตานทานสารปฏชวนะไฮโกรมยซนไดหลงจากการเล�ยง 2

สปดาห ลงบนอาหารคดเลอกใหมสตรเดมทมไฮโกรมยซนความเขมขน 30 มลลกรม

ตอลตรและซโฟแทกซมความเขนขน 250 มลลกรมตอลตร เพาะเล� ยงเปนเวลา 2

สปดาห

6. ยายแคลลสท�ตานทานสารปฏชวนะลงบนอาหารคดเลอกสตรชกนาใหเกดตนท�มไฮ

โกรมยซนความเขมขน 30 มลลกรมตอลตรและซโฟแทกซมความเขมขน 250

มลลกรมตอลตร เพาะเล�ยงเปนเวลา 2 สปดาห ยายลงบนอาหารใหมสตรเดม เพาะเล�ยง

จนกวาจะไดตน

2.2 การตรวจวเคราะหตนท�ไดรบการถายยน

ตอนท� 1 การสกดจโนมกดเอนเอจากใบขาว

1. บดใบขาวใหละเอยด

2. เตมสารสะลาย mCTAB ซ� งม 1% (v/v) 2-mercaptoethanol ปรมาตร 500

ไมโครลตร หรอตามสดสวนปรมาณใบ ถาเตม mCTAB ปรมาตร 100 ไมโครลตร

จะตองเตม mercaptoethanol ปรมาตร 1 ไมโครลตร หรอปรบปรมาตรตามความ

เหมาะสมของปรมาณใบท�บดได แลวผสมใหเขากนโดยใชเคร�อง Vortex

3. นาไปบมท�อณหภม 65 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท โดยผสมใหเขากนทก 10

และ 20 นาท

4. ป�นเหว�ยงท�อณหภมหอง ท�ความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 5 นาท

5. ยายเอาสวนใสใสในหลอดใหม โดยหามเอาตะกอนออกมา จากน�น

5.1 เตม RNase A ความเขมขน 10 ไมโครกรมตอมลลลตร ปรมาตร 1

ไมโครลตรตอสารละลาย 300 ไมโครลตร

5.2 บมท�อณหภม 37 องศาเซลเซยส อยางนอยเปนเวลา 30 นาท

6. เตม Chloroform ปรมาตร 500 ไมโครลตร หรอ 1 เทาของปรมาตรสารละลาย

mCTAB แลวทาการ Vortex เลกนอย

33

7. ป�นเหว�ยงท�อณหภมหอง ท�ความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 5 นาท

8. ยายช�นน� าดานบนใสในหลอดใหม (ทาซ�าในขอท� 6-7 จนกระท�งช�นของโปรตนเหลอ

นอยท�สด) ซ�งการทาซ�าท� 2 ถายายช�นน� ามาปรมาตรเทาไหร ใหเตม Chloroform ใน

ปรมาตรท�เทากน

9. เตม 3 M Na-acetate, pH 5.2 ปรมาตร 1/10 เทา แลวเตม absolute ethanol เยน

ปรมาตร 2 เทาของสารละลาย (จะสงเกตเหนตะกอนสขาวขน) แลวผสมใหเขากน

10. ป�นเหว�ยงท�อณหภม 4 องศาเซลเซยส ท�ความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 5

นาท

11. เท absolute ethanol ท�ง แลวเตม Ethanol ความเขมขน 70 เปอรเซนตท�เยน เพ�อลาง

ตะกอน (ลางตะกอน จานวน 2 คร� ง)

12. ป�นเหว�ยงท�อณหภม 4 องศาเซลเซยส ท�ความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 2

นาท

13. ตากตะกอนดเอนเอใหแหง แลวละลายกลบดวย 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ปรมาตร

30 ไมโครลตร (ถายงมความหนดของสารละลายมาก ใหเตมเพ�ม)

14. ทาการวเคราะหผลการสกดดเอนเอดวยวธอะกาโรสเจลอเลกโตรฟอรซส

ตอนท� 2 การตรวจวเคราะหดวยเทคนคพซอาร

ทาการวเคราะหตนขาวท�ไดรบการถายยน PAP1 ดวยเทคนคพซอาร โดยใชไพรเมอร

F_PAP1 และR_PAP1 ซ�งเปนไพรเมอรท�จาเพาะตอยน pap1

1. เตรยมองคประกอบท�ใชในปฏกรยาพซอาร ดงตารางท� 1

ตารางท� 5 องคประกอบของปฏกรยาพซอาร สาหรบใชตรวจสอบตนขาวท�ไดรบการถายยน

สวนประกอบของปฏกรยา ความเขมขนสดทาย ปรมาตร (µl) ปฏกรยา

2X Go Taq 1X 10

10µM F_PAP1 0.5µM 1

34

10µM R_PAP1 0.5µM 1

Template DNA - 1

dH2O - 7

Total - 20

2. ต�งโปรแกรมเคร�องพซอาร ดงน�

Initial Deneturation 95 องศาเซลเซยส 5 นาท

Deneturation 94 องศาเซลเซยส 1 นาท

Annealing 63 องศาเซลเซยส 1 นาท 35 รอบ

Extension 72 องศาเซลเซยส 1 นาท

Final Extention 72 องศาเซลเซยส 10 นาท

Set 20 องศาเซลเซยส 12 ช�วโมง

การทดลองท� 3 การถายยนเขาสยาสบ

ตนยาสบท�ใชในการทดลอง

ยาสบสายพนธเบอรเลย (Burley) จาก อ.ดร.กนกวรรณ รมยานนท สานกงานพฒนา

วทยาศาสตรและเทคโนโลย (สวทช.) และ อ.ดร.ศรเมฆ ชาวโพงพาง หองปฎบตการชวโมเลกล

ภาควชาโรคพช คณะเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร (บางเขน) กรงเทพมหานคร

วธการทดลอง

การทดลองการศกษาการถายยนสรางแอนโทไซยานนเขาสยาสบแบงออกเปน 3 ข�นตอน

ไดแก

3.1. การเตรยมช�นสวนใบยาสบเพ�อใชในการถายยน

3.2. การสงถายยนเขาสใบยาสบ

3.3. การวเคราะหตนยาสบท�ไดรบยนดวยเทคนคพซอาร

3.1 การเตรยมช�นสวนตนยาสบเพ�อใชในการถายยน

1. เพาะเล�ยงตนยาสบบนอาหารสตร MS ท�ไมเตมสารควบคมการเจรญเตบโตและสาร

ปฏชวนะ

35

2. เพาะเล�ยงภายใตสภาวะท�มแสง 16 ช�วโมงตอวน ท�อณหภม 27-29 องศาเซลเซยส จน

เจรญเปนตน

3. ทาการยายเน�อเย�อ (subculture) ตนยาสบโดยตดช�นสวนตายอดมาเพาะเล�ยงบนอาหาร

MS ใหม ทกๆ 1 เดอน

3. 2 การถายยนเขาสใบยาสบ

1. นาเน�อเย�อใบของตนยาสบจากการเพาะเล�ยงเน�อเย�อในสภาพท�ปลอดเช�อ ตดใบยาสบ

โดยใชบรเวณตรงกลางใบ แลวทาการห�นเปนช�นเลกๆ ใหมขนาดประมาณ 0.5 x 1

เซนตเมตร จานวน 20 ช�น

2. หลงจากน�นนามาปลกถายเช�อรวมกบสารละลายอะโกรแบคทเรยมสายพนธ AGLl ท�

มพลาสมด pPAP1 ท�เตรยมไวในการทดลองท� 2 เตมเช�อลงไปในหลอด เตมอะซโตไซ

รงกอน 200 ไมโครโมลาร ลงไปในหลอด 8 µl นาหลอดไปเขยา 110 รอบตอนาท

นาน 15 นาท

3. จากน�นเทเน�อเย�อลงบนตะแกรงแลวซบใหแหง

4. นาช�นสวนใบยาสบไปวางบนอาหารสตร MS ดดแปลงสาหรบ Co-culture เพาะเล�ยง

เปนเวลา 3 วน

5. หลงจากน�นลางเน�อเย�อ โดยลางดวยน� ากล�นปรมาตร 40 ml ประมาณ 3 – 4 คร� งหรอ

ลางจนกวาจะใส (ควรเขยาเบาๆ เพ�อไมใหช�นสวนเน�อเย�อช�า)

6. จากน�นลางดวยอาหารสตร MS ดดแปลง 40 ml โดยเตม ซโฟแทคซม 300 มลลกรม

ตอลตร ลงไป 48 ไมโครลตร แลวเขยาเบาๆใหเขากนแลวเทสวนใสท�ง

7. ซบดวยกระดาษทชชวางเน�อเย�อใบยาสบบนอาหารคดเลอกคร� งท� 1 (สตร MS

ดดแปลง ท�เตมซโฟแทคซม 300 มลลกรมตอลตร และไฮโกรมยซน 50 มลลกรมตอ

ลตร นาไปเพาะเล�ยงภายใตสภาวะท�มแสง 16 ช�วโมงตอวน ท�อณหภม 27-29 องศา

เซลเซยส

8. เม�อครบสองสปดาหยายช�นสวนใบยาสบลงบนอาหารคดเลอกคร� งท� 2 (สตร MS

ดดแปลงท�เตมซโฟแทคซม 300 มลลกรมตอลตร และไฮโกรมยซน 30 มลลกรมตอ

ลตร และยายลงบนอาหารใหมทกๆ 2 สปดาห เพาะเล�ยงจนกวาจะเกดตน

36

3.3 วเคราะหตนยาสบโดยเทคนคพซอาร

ตอนท� 1 การสกดจโนมกดเอนเอจากใบยาสบท�ผานการถายยน ดวยวธ mCTAB

วธการ

1. บดใบยาสบใหละเอยดและแชบนน� าแขง

2. เตมสารสะลาย mCTAB ซ�งม 1% (v/v) 2-mercaptoethanol ปรมาตร 500

ไมโครลตร ปรบตามสดสวนปรมาณใบ ถาเตม mCTAB ปรมาตร 100

ไมโครลตร จะตองเตม mercaptoethanol ปรมาตร 1 ไมโครลตร แลวผสมให

เขากนโดยใชเคร�อง Vortex

3. นาไปบมท�อณหภม 65 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท โดยผสมใหเขากนทก

10 และ 20 นาท

4. ป�นเหว�ยงท�อณหภมหอง ท�ความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 5 นาท

5. ยายเอาสวนใสใสในหลอดใหม โดยหามเอาตะกอนออกมา จากน�น

a. เตม RNase A ความเขมขน 10 ไมโครกรมตอมลลลตร ปรมาตร 1

ไมโครลตรตอสารละลาย 300 ไมโครลตร

b. บมท�อณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลาอยางนอย 30 นาท

6. เตม chloroform ปรมาตร 500 ไมโครลตร หรอ 1 เทาของปรมาตรสารละลาย

mCTAB แลวทาการ Vortex เลกนอย

7. ป�นเหว�ยงท�อณหภมหอง ท�ความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 5 นาท

8. ยายช�นน� าดานบนใสในหลอดใหม (ทาซ�าในขอท� 6-7 จนกระท�งช�นของโปรตน

เหลอนอยท�สด) ซ�งการทาซ�าท� 2 ถายายช�นน� ามาปรมาตรเทาไหร ใหเตม

Chloroform ในปรมาตรท�เทากน

9. เตม 3 M Na-acetate, pH 5.2 ปรมาตร 1/10 เทา แลวเตม absolute ethanol เยน

ปรมาตร 2 เทาของสารละลาย (จะสงเกตเหนตะกอนสขาวขน) แลวผสมใหเขา

กน

10. ป�นเหว�ยงท�อณหภม 4 องศาเซลเซยส ท�ความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา

5 นาท

37

11. เท absolute ethanol ท�ง แลวเตม ethanol ความเขมขน 70 เปอรเซนตท�เยน เพ�อ

ลางตะกอน (ลางตะกอน จานวน 2 คร� ง)

12. ป�นเหว�ยงท�อณหภม 4 องศาเซลเซยส ท�ความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา

2 นาท

13. ตาก pellet ใหแหง แลวละลายกลบดวย 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ปรมาตร 30

ไมโครลตร (ถายงมความหนดของสารละลายมาก ใหเตมเพ�ม)

ตอนท� 2 การวเคราะหตนยาสบท�ไดรบการถายยน pap1 ดวยเทคนคพซอาร โดยใชไพรเมอรท�

จาเพาะตอยน pap1

ตารางท� 6 องคประกอบของพซอาร ในการวเคราะหตนยาสบท�ไดรบการถายยน pap1 โดยใชไพร

เมอรท�จาเพาะตอยน pap1

สวนประกอบของปฏกรยา ความเขมขนสดทาย ปรมาตร

2X GoTaq 1X 10 µl

10 µM F_PAP1 0.5 µM 1 µl

10 µM R_PAP1 0.5 µM 1 µl

DNA Template - 1 µl

dH2O - 7 µl

Total - 20 µl

ไพรเมอรท�ใชในการวเคราะหพซอาร ของตนยาสบท�ไดรบการถายยน pap1 ดวย

พลาสมด pPAP1 คอ F_PAP1 [5’CTA AAC CGG TGC AGG AAA AG3’]

R_PAP1 [5’GTC CAA GGC TAG GAG GAT TA3’]

ต�งโปรแกรมเคร�องพซอารดงน�

Initial Denaturation 94๐C 3 min

Denaturation 95๐C 1 min

Annealing 55๐C 1 min 35 รอบ

Extention 72๐C 1 min

38

Final Extention 72๐C 10 min

Set 20๐C 12 hr

39

ผลการวจยและวจารณผล

การสรางชดยน pap1 สาหรบถายยนในพช

การทดลองน� ตองการนายน pap1 (production of anthocyanin pigment) ซ�งเปนยนท�

สงเสรมการสงเคราะหสาร anthocyanin มาสรางชดยนใหอยภายใตการควบคมของ 35S dual

promoter, TEV Leader sequence (ไดจาก Tobacco Etch Virus) และ 35S terminator แลวนาใสเขา

ไปในพลาสมดท�ตองการ เพ�อท�จะใชถายยนเขาไปในพช ซ�งหากยน pap1 อยภายใตการควบคม

ดงกลาว 35S dual promoter จะสงผลใหพชท�ไดรบยนมการแสดงออกของยน pap1 อยางสงและ

ตลอดเวลาในทกเน�อเย�อพช และสวนของ TEV Leader จะชวยสงเสรมใหยนท�ตอจากสวนน� มการ

แสดงออกอยางสง โดยยน pap1 จะแสดงออกเปนสแดงหรอมวงเขม ทาใหงายตอการคดเลอก

เน�อเย�อท�ไดรบยน ข�นตอนการสรางชดยน pap1 มดงน�

1. การเตรยม competent cell

นาเช�อ E. coli สายพนธ DH5α มาเตรยม competent cell ดวยวธ CaCl2 จากน�นทาการ

ทดสอบ competent cell โดยนาพลาสมด pRTL2 มาถายฝากเขาส competent cell แลวเพาะเล�ยงบน

อาหารแขง LB ท�เตมแอมพซลน 100 มลลกรมตอลตร โดยทา 3 ทรตเมนต (ตารางท� 15) พบวา T1

และ T2 ซ�งเปนชดควบคมไมเกดโคโลน แสดงวา competent cell ไมมการปนเป� อนของเช�อท�มพ

ลาสมดตานยาแอมพซลน สวน T3 เกดโคโลน 1,520 โคโลน แสดงวา competent cell สามารถรบพ

ลาสมด pRTL2 เขาไปได เม�อนามาคานวณประสทธภาพของ competent cell โดยใชสตร

ประสทธภาพของ competent cell (จานวนโคโลนตอ 1 ไมโครกรม ดเอนเอ)

= จานวนโคโลน × ปรมาตรสดทาย (จากการ transformation) × dilution factor

ปรมาตรท�ใชในการ spread × ไมโครกรมดเอนเอท�ใช

ไดเทากบ 1.52 × 104 โคโลนตอไมโครกรมดเอนเอ ซ�งมประสทธภาพใกลเคยงกบคา

ประสทธภาพของ competent cell ท�เตรยมดวยวธ CaCl2 ตามทฤษฎ คอ 105 – 106 ไมโครกรม ดเอน

เอ จงสามารถนา competent cell ท�เตรยมมาใชในการทดลองตอไปได

40

ตารางท� 7 การทดสอบ competent cell บนอาหารแขง LB ท�เตมแอมพซลน 100 มลลกรมตอลตร

ทรตเมนต Competent cell

(ไมโครลตร)

dH2O

(ไมโครลตร)

pRTL2

(ไมโครลตร) จานวนโคโลน

T1 200 - - -

T2 200 5 - -

T3 200 - 5 1,520

2. การเตรยมพลาสมดเวกเตอร pRTL2

สกดพลาสมด pRTL2 (ภาพท� 11) ซ�งมขนาด 3,900 bp ดวยวธ Alkaline lysis method (ภาพ

ท� 11) เพ�อใชเปนเวกเตอรสาหรบการโคลนยน pap1 จากน�นนามาตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ NcoI

และ SacI เพ�อแยกเอา coding sequence ออก และใชเปนบรเวณสาหรบการโคลนยน pap1 จากน�น

ทาการแยกบรสทธ� เวกเตอร pRTL2 ท�ตดดวยเอนไซม NcoI และ SacI แลวจากเจล โดยใชชด PCR

clean-up Gel extraction (ภาพท� 12 ก และ ข) นาไปคานวณความเขมขนของพลาสมดดวยเทคนคอะ

กาโรสเจลอเลกโทรฟอรซส พบวา ไดพลาสมด pRTL2 ท�ตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ NcoI และ SacI

ขนาดประมาณ 4 kb (ภาพท� 13) และมความเขมขนเทากบ 16.66 นาโนกรมตอไมโครลตร

ภาพท� 11 การวเคราะหพลาสมด pRTL2 ท�สกดดวยวธ Alkaline lysis method

41

ก. ข.

ภาพท� 12 การวเคราะหพลาสมด pRTL2 ท�ตดดวยเอนไซม NcoI และ SacI เปรยบเทยบกบ พลาส

มด pRTL2 ท�ยงไมไดตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ (uncut pRTL2) ก) กอนตดเจล และ ข) หลงตดเจล

ท�มแถบดเอนเอ

42

ภาพท� 13 การวเคราะหพลาสมด pRTL2 ท�ตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ NcoI และ SacI แลวทาการ

แยกบรสทธ� โดยใชชด PCR clean-up Gel extraction

3. การเพ�มปรมาณช�นยน pap1 จากพลาสมด 3PAP-Red ดวยเทคนค PCR

นาพลาสมด 3PAP-Red ขนาด 11 kb (ภาพท� 8) ท�สกดพลาสมดดวยชด kit (Plasmid DNA

Purification) มาเพ�มปรมาณช�นยน pap1 ดวยเทคนค PCR โดยใช primer F1_NcoI PAP1 และ

R_SacI PAP1 ซ�งจะไดผลผลต PCR คอ ช�นยน pap1 ท�มบรเวณจดจาของเอนไซม NcoI และ SacI

ท�ปลาย 5' และ 3' ของยน ตามลาดบ (ภาพท� 14)

จากน�นนาช�นยน pap1 ท�ไดจากการทา PCR มาแยกบรสทธ� จากเจล โดยใชชด PCR clean-

up Gel extraction นาดเอนเอท�ไดมาตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ NcoI และ SacI แลวทาการแยก

บรสทธ� ดเอนเอจากเจลอกคร� ง (ภาพท� 15 ก และ ข) จากน�นคานวณความเขมขนดวยเทคนคอะกา

โรสเจลอเลกโทรฟอรซส พบวา ไดดเอนเอขนาดประมาณ 750 bp (ภาพท� 16) มความเขมขน 21.5

นาโนกรมตอไมโครลตร

ภาพท� 14 การวเคราะหช�นยน pap1 ท�ไดจากเทคนค PCR

43

ก. ข.

ภาพท� 15 การวเคราะหยน pap1 ท�ตดดวยเอนไซม NcoI และ SacI เปรยบเทยบกบยน pap1 ท�ยง

ไมไดตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ (uncut pap1) ก) กอนตดเจล และ ข) หลงตดเจลท�มแถบดเอนเอ

ภาพท� 16 การวเคราะหช�นยน pap1 ท�ตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ NcoI และ SacI แลวทาการการแยก

บรสทธ� โดยใชชด PCR clean-up Gel extraction

44

4. การเช�อมตอช�นยน pap1 กบเวกเตอร pRTL2

ทาการคานวณหาปรมาณเวกเตอร pRTL2 ท�ตดดวยเอนไซม NcoI และ SacI และช�นยนท�

สนใจ คอยน pap1 ท�ตดดวยเอนไซม NcoI และ SacI โดยกาหนดอตราสวนน� าหนก (Weight ratio)

ของ vector (V) ตอ insert (I) คอเวกเตอร (pRTL2) ตอช�นยนท�สนใจ (pap1) เทากบ 1:3 และ 1:5

จากน�นทาการเช�อมตอเวกเตอรตอช�นยนท�สนใจ โดยใชเอนไซม T4 DNA ligase ทาปฏกรยา

ligation ท�อณหภม 16 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 – 17 ช�วโมง จากน�นทาการหยดปฏกรยาโดยบมท�

อณหภม 65 องศาเซลเซยส นาน 20 นาท แลวนาปฏกรยาท�ไดไปฝากถายเขาส competent cell ของ

E. coli เพ�อคดเลอกโคลนท�มพลาสมดสายผสมท�เกดจากการเช�อมตอช�นยน pap1 กบ เวกเตอร

pRTL2 โดยใหช�อพลาสมดสายผสมท�ไดวา pKL1

ภาพท� 17 แผนท�พลาสมด pKL1

5. การถายฝากพลาสมดสายผสม (pKL1) ท�ไดจากการเช�อมตอช�นยน pap1 กบเวกเตอร

pRTL2 เขาส competent cell E. coli สายพนธ DH5α ดวยวธ Heat shock

นาพลาสมดสายผสม pKL1 (ภาพท� 17) ท�ไดจากการเช�อมตอช�นยน pap1 กบเวกเตอร

pRTL2 ทาการถายฝากเขาส competent cell ของ E. coli สายพนธ DH5α ดวยวธ Heat shock

จากน�น spread บนอาหารแขง LB ท�เตมแอมพซลน 100 มลลกรมตอลตร โดยทา 3 ทรตเมนต โดย

ให T1 เปนชดควบคม T2 และ T3 คอ V:I = 1:3 และ 1:5 ตามลาดบ (ตารางท� 8) พบวา มโคโลน

45

เกดข�นท�ง 3 ทรตเมนต จาก T1 แสดงวาพลาสมดเวกเตอร pRTL2 อาจตดไมสมบรณ และจาก T2

และ T3 แสดงวา competent cell อาจไดรบพลาสมดสายผสม pKL1 เขาไปในเซลล

ตารางท� 8 การถายฝากพลาสมดสายผสม (pKL1) เขาส competent cell และคดเลอกโคลนบน

อาหารแขง LB ท�เตม แอมพซลน 100 มลลกรมตอลตร

Treatment ปฏกรยา

ligation จานวนโคโลน

T1 V 137

T2 V:I=1:3 มากกวา 300

T3 V:I=1:5 มากกวา 300

หมายเหต V = pRTL2 ท�ตดดวยเอนไซม NcoI และ SacI และทาใหบรสทธ� แลว

I = ยน pap1 ท�ตดดวยเอนไซม NcoI และ SacI และทาใหบรสทธ� แลว

T1 = V ท�ไมเตมเอนไซม T4 DNA ligase

6. การตรวจสอบโคลนท�มพลาสมดสายผสม

นาโคลนท�ไดจากการถายฝากพลาสมดสายผสมไปตรวจสอบวามยน pap1 หรอไม ซ�งคาด

วาเม�อทาการสกดพลาสมดแลว นาไปตดดวยเอนไซม NcoI และ SacI จะเหนแถบดเอนเอขนาด

3,900 bp (pRTL2) และ 750 bp (ยน pap1) โดยนาโคโลนเด�ยวท�ไดจาก V:I = 1:3 จานวน 1 โคโลน

และ V:I = 1:5 จานวน 9 โคโลน ไปสกดพลาสมดแลวตรวจสอบดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโทร

ฟอรซส พบวา มแถบดเอนเอข�นทกตวอยาง ยกเวน 1:5 โคโลนท� 6 โดย 1:3 โคโลนท� 1 และ 1:5

โคโลนท� 1, 3, 4, 5, 7, 8 และ 9 ใหแถบดเอนเอขนาดประมาณ 5,000 bp ซ�งนาจะอยในโครงรป

Relaxed และนาจะเปนพลาสมดสายผสม pKL1 ซ�งมขนาดประมาณ 4,650 bp (pKL1 = pRTL2

3,900 bp + pap1 750 bp ) และ 1:5 โคโลนท� 2 มแถบดเอนเอขนาดตางจากโคลนอ�นแตมลกษณะ

คลายกนจงนาไปทาการตรวจสอบตอไป (ภาพท� 18)

46

จากน�นนาพลาสมดท�สกดไดทกโคลนไปตดดวยเอนไซม NcoI และ SacI และทาการ

ตรวจสอบดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโทรฟอรซส พบวา ทกโคลนยกเวน 1:5 โคลนท� 2 มแถบด

เอนเอขนาดประมาณ 3,900 bp และ 750 bp เกดข�น แสดงวาทกโคลนนาจะมพลาสมดสายผสม

pKL1 ซ�งมช�นยน pap1 แทรกอย (ภาพท� 19)

ภาพท� 18 การวเคราะหพลาสมดท�สกดไดจาก 1:5 โคโลนท� 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 และ 1:3 โคโลนท� 1

โดยเปรยบเทยบขนาดกบดเอนเอมาตรฐาน 1kb Ladder Plus ดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโทรฟอ

รซส

47

ภาพท� 19 การวเคราะหโคลนท�มพลาสมดสายผสม pKL1 โดยตดพลาสมดท�สกดไดจาก 1:5

โคโลนท� 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 และ 1:3 โคโลนท� 1 ดวยเอนไซม NcoI และ SacI โดยเปรยบเทยบ

ขนาดกบดเอนเอมาตรฐาน 1kb Ladder Plus ดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโทรฟอรซส

จากน�นนาโคลน 1:3 โคลนท� 1 โดยใหช�อวา A และ 1:5 โคลนท� 1 โดยใหช�อวา B มา

sterak บนอาหารแขง LB ท�เตมแอมพซลน 100 มลลกรมตอลตร เพ�อใหไดโคโลนเด�ยว (เน�องจาก

โคลน A และ B เกด Satellites ข�นรอบๆ โคโลนเด�ยว) แลวเลอกโคโลนเด�ยวจากโคลน A จานวน 2

โคโลน (A1 และ A2) และ B จานวน 2 โคโลน (B1 และ B2) มาสกดพลาสมด และตรวจสอบโดย

ตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ NcoI และ SacI แลวทาการตรวจสอบดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโทร

ฟอรซส พบวา ไดแถบดเอนเอขนาดประมาณ 3,900 bp และ 750 bp เกดข�น (ภาพท� 20) แสดงวา

โคลน A1, A2, B1 และ B2 มยน pap1 แทรกอยจากน�นไดทาการเกบ glycerol stock ของ โคลน A1

และ B1

48

ภาพท� 20 การวเคราะหพลาสมด pKL1 ท�ไดจากโคลน A1, A2, B1 และ B2 โดยตดดวยเอนไซม

NcoI และ SacI เปรยบเทยบขนาดกบดเอนเอมาตรฐาน 1kb Ladder Plus ดวยเทคนคอะกาโรส

เจลอเลกโทรฟอรซส

เตรยมพลาสมด pKL1 สงไปวเคราะหหาลาดบเบส โดยนา pKL1 จากโคลน A1 และจาก

โคลน B1 มาสกด พลาสมดดวยชด kit (Plasmid DNA Purification) ทาการตรวจสอบ และคานวณ

ความเขมขนดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโทรฟอรซส พบวา มแถบดเอนเอขนาดประมาณ 5,000

bp (ภาพท� 21) โคลน A1 Elute1 และ B1 Elute1 มความเขมขน 30.67 และ 61.33 นาโนกรมตอ

ไมโครลตร ตามลาดบ นาพลาสมด pKL1 สงไปวเคราะหลาดบเบสเพ�อนามาเปรยบเทยบกบลาดบ

เบสของยน pap1 ท�รายงานใน GenBank (Accession number NM_104541.3)

49

ภาพท� 21 การวเคราะหพลาสมด pKL1 โคลน A1 Elute 1, A1 Elute 2, B1 Elute 1 และ B1 Elute 2

ท�ไดจากการสกดดวยชดkit โดยเปรยบเทยบขนาดกบดเอนเอมาตรฐาน 1kb Ladder Plus ดวย

เทคนคอะกาโรสเจลอเลกโทรฟอรซส

พลาสมด pKL1 ไดถกสงไปวเคราะหหาลาดบเบส และพบวา มลาดบเบสบางสวนใน

บรเวณ coding region ของยน pap1 แตกตางจากลาดบเบสของยน pap1 ท�รายงานใน GenBank จง

ไดทาการเลอกโคลนใหมและสราง construct ใหม ท�มยน pap1 อยภายใตการควบคมของ 35S dual

promoter และ nos terminator และมช�อ construct หรอพลาสมดวา pPAP1 (ศรเมฆ Unpublished,

2554) และถายฝากเขาสอะโกรแบคทเรยม สายพนธ AGL1 เพ�อใชถายยน pap1 เขาสขาวและยาสบ

50

การถายยนสรางแอนโทไซยานนเขาสแคลลสขาว

การทดลองถายยน pap1 เขาสแคลลสขาวพนธ Kitaake โดยใชอะโกรแบคทเรยมสายพนธ

AGL1 ท�มพลาสมด pPAP1 ซ�งมยน pap1 อยภายใตการควบคมของโปรโมเตอร 35S มยน hptll

เปนยนเคร�องหมายท�ใชคดเลอกเน�อเย�อท�ไดรบยน เพ�อทดสอบประสทธภาพการถายยนสรางสาร

แอนโทไซยานนเขาสแคลลสขาว

โดยทาการเพาะเล� ยงเมลดแกขาวพนธ Kitaake บนอาหารสตร N6D เปนระยะเวลาอยางนอย 4

สปดาห เพ�อชกนาใหเกดแคลลส เน�อเย�อสวนท�เปนเอมบรโอหรอสวนจมกขาวจะเกดการเจรญและ

แตกตวเปนแคลลส (ภาพท� 22ก.) ซ�งแคลลสท�ดจะตองเปนสเหลองออน กลม แนน และมลกษณะ

ของการแบงตวท�ด (ภาพท� 22ข.)

จากน� นทาการปลกถายเช�อและเพาะเล� ยงรวมระหวางแคลลสกบอะโกรแบคทเรยม

เพาะเล�ยงบนอาหารสตร N6D ดดแปลง (อาหารสตร N6D ท�เตมอะซโตไซรงโกน ) ในท�มดเปน

เวลา 3 วน แคลลสท�ไดจะมเปนสเหลอง กลม แนน (ภาพท� 23)

จากน�นทาการลางแคลลสดวยน� ากล�นและอาหารลางเน�อเย�อท�เตมซโฟแทกซม วางลงบนอาหาร

คดเลอกคร� งท� 1 เพาะเล�ยง 2 สปดาห จากน�นยายลงบนอาหารคดเลอกคร� งท� 2 เพาะเล�ยงตอเปนเวลา

2 สปดาห พบวาแคลลสท�ตานทานสารปฏชวนะไฮโกรมยซน สามารถเจรญไดจะมลกษณะเปนส

เหลอง สวนแคลลสท�ไมตานทานตอสารปฏชวนะกจะตายลง (ภาพท� 19) กลมแคลลสท�สามารถ

เจรญไดและรอดตายบนอาหารคดเลอกอยในชวง 52 - 98 เปอรเซนต (ตารางท� 24)

หลงจากเพาะเล�ยงบนอาหารคดเลอกท�ง 2 คร� งแลวกจะทาการยายแคลลสท�ตานทานสาร

ปฏชวนะลงบนอาหารสตรชกนาใหเกดตน ทาการยายเน�อเย�อแคลลสทก 2 สปดาห ลงบนอาหาร

สตรเดม กลมแคลลสท�เจรญไดจะเกดการแบงตวและเกดเปนจดเขยวหรอขาวและเจรญเปนยอด

(ภาพท� 25) กลมแคลลสท�เกดยอดท�งหมดอยในชวง 7 – 11 เปอรเซนต (ตารางท� 9) กลมแคลลสท�

เกดยอดสเขยวบนอาหารสตรชกนาใหเกดตนอยในชวง 5 - 11 เปอรเซนต (ตารางท� 9 และภาพท� 25

ข.) กลมแคลลสท�เกดยอดสขาวบนอาหารสตรชกนาใหเกดตนอยในชวง 2 – 3 เปอรเซนต (ตารางท�

9 และภาพท� 25ค.) เม�อทาการยายและเพาะเล�ยงตอไปบนอาหารสตรชกนาใหเกดตน กลมแคลลสท�

ตานทานสารปฏชวนะกจะเจรญเปนตน (ภาพท� 26) ไดท� งหมดจานวน 23 ตน คดเปน 7 - 10

เปอรเซนต (ตารางท� 9) ของการถายยนท�งหมด

จากน�นนาตนท�ไดไปเพาะเล�ยงบนอาหารสตร MS เพ�อชกนาใหเกดรากบนอาหารสตร MS ท�ไมเตม

สารควบคมการเจรญ (ภาพท� 27) เม�อสงเกตดวาตนขาวแขงแรง มการเพ�มจานวนของรากมากข�นก

จะทาการยายปลกลงในกระถางตอไป (ภาพท� 28)

51

ภาพท� 22 ลกษณะการเกดแคลลสของเมลดขาวพนธ Kitaake ท�เพาะเล�ยงบนอาหารสตร N6D

ระยะเวลา 4 สปดาห

ภาพท� 23 ลกษณะของแคลลสภายหลงการปลกถายเช�อและเพาะเล�ยงรวมเปนระยะเวลา 3 วน

ตารางท� 9 ประสทธภาพการถายยน pap1 เขาสแคลลสขาวพนธ Kitaake แสดงกลมแคลลสท�รอด

บนอาหารคดเลอก และการเกดตน

คร� งท�

ถายยน

จานวนกลม

แคลลส

ท�งหมด

จานวนกลม

แคลลสท�

รอดบน

อาหาร

คดเลอก

จานวนกลม

แคลลสท�เกด

ยอดท�งหมด

จานวนกลม

แคลลสท�เกด

ยอดสเขยว

จานวนกลม

แคลลสท�เกด

ยอดสขาว

จานวนตน

ท�งหมด

1 76 58/76 (76) 4/58 (7) 3/58 (5) 1/58 (2) 6/58 (10)

2 97 56/97 (58) 4/56 (7) 3/56 (5) 1/56 (2) 4/56 (7)

3 82 43/82 (52) 3/43 (7) 3/43 (7) 0 3/43 (7)

4 60 59/60 (98) 5/59 (8) 3/59 (5) 2/59 (3) 5/59 (8)

52

5 57 47/57 (82) 5/47 (11) 5/ 47(11) 0 6/47 (13)

หมายเหต ใน 1 กลมแคลลส สามารถแยกเปนตนไดมากกวา 1 ตน

ภาพท� 24 ลกษณะแคลลสท�รอดตายบนอาหารคดเลอกสตร N6D ดดแปลง คร� งท� 2 หลงการ

เพาะเล�ยงเปนเวลา 2 สปดาห

ภาพท� 25 ลกษณะกลมแคลลสท�เกดเปนตายอดบนอาหารสตรชกนาใหเกดตนคร� งท� 2 หลง

เพาะเล�ยงเปนเวลา 2 สปดาห (ก) ลกษณะของแคลลสท�ตานทานสารปฏชวนะและเกดการแบงตว

(ข) ลกษณะของแคลลสท�เกดตายอดสเขยว (ค) ลกษณะของแคลลสท�เกดตายอดสขาว

53

ภาพท� 26 ลกษณะของแคลลสท�เจรญเปนตนบนอาหารสตรชกนาใหเกดตนคร� งท� 3 หลงการ

เพาะเล�ยงเปนเวลา 2 สปดาห

ภาพท� 27 ลกษณะของตนขาวพนธ Kitaake ท�ผานการถายยนและเพาะเล�ยงบนอาหารสตร MS

ระยะเวลา 3 สปดาห (ก) ตนขาวปกต (ข) ตนขาวสขาว

54

ภาพท� 28 ลกษณะของตนขาวพนธ Kitaake ท�ผานการถายยน เพาะเล� ยงในโรงเรอนกระจก

(ก) เพาะลงดนอาย 2 สปดาห (ข) เพาะลงดนอาย 5 สปดาห

การตรวจวเคราะหตนขาวท�ไดรบการถายยน pap1 ดวยเทคนคพซอาร

นาใบขาวจากตนท�ผานการถายยน pap1 มาสกดจโนมกดเอนเอดวยวธ mCTAB โดยทาการ

สกดท�งหมด 2 คร� ง พบวา เหนแถบดเอนเอขนาดใหญและมคณภาพด (ภาพท� 29 และ 30

ตามลาดบ) สามารถนาไปใชทาพซอารตอไปได

ผลการตรวจสอบการแทรกตวของยน pap1 ในจโนมขาวดวยเทคนคพซอาร โดยใชไพร

เมอร F_PAP1 และ R_PAP1 ซ�งจาเพาะตอยน pap1 โดยตรวจสอบขาวท�งหมด 18 ตน ในการทา

คร� งท� 1 จากดเอนเอตวอยาง 9 ตน พบวา มอย 3 ตน ซ�งไดจากการถายยนคร� งท� 1 ท�มแถบดเอน

ขนาด 400 คเบส เกดข�นและมขนาดเทากบ พลาสมด pPAP1 (Positive control) คดเปน 16.66

เปอรเซนต (ภาพท� 30 และตารางท� 10) จงกลาวไดวา ท�ง 3 ตนมการแทรกตวของยน pap1 ใน

จโนมของขาว สวนในคร� งท� 2 จากดเอนเอตวอยาง 9 ตน พบวา มอย 1 ตน ซ�งไดจากการถายยนคร� ง

ท� 5 ท�มแถบดเอนขนาด 400 คเบส เกดข�นและมขนาดเทากบพลาสมด PAP1 (Positive control) คด

เปน 5.55 เปอรเซนต (ภาพท� 30 และตารางท� 10) จงอาจกลาวไดวา ตนขาวท�ไดน�นมการแทรกตว

ของยน pap1 ในจโนมของขาว

55

ภาพท� 29 ผลการสกดจโนมกดเอนเอจากใบขาวพนธ Kitaake ท�ไดรบการถายยน pap1 คร� งท� 1

จานวน 9 ตน M คอ Lambda DNA/EcoRl+Hindlll Marker, C คอ ตนขาวพนธ Kitaake ท�ไมผาน

การถายยน (Control) และ 1 – 9 คอตนขาวท�ผานการถายยนและตานทานตอสารปฏชวนะไฮโกรมย

ซน ไดแก ตนท� 3.1(1.1), 3.1(1.2), 3.1(1.3), 3.1(2.1), 3.1(3.1), 5.1(1.1), 5.1(1.1w), 3.1(1.4) และ

3.1(1.4w) ตามลาดบ

ภาพท� 30 การตรวจสอบการแทรกตวของยน pap1 ในจโนมขาวดวยเทคนคพซอารคร� งท� 1 โดยใช

ไพรเมอรท�จาเพาะตอยน pap1 โดย M คอ ดเอนเอมาตรฐาน 100 bp DNA Ladder, N คอ ตน

56

ขาวพนธ Kitaake ท�ไมผานการถายยน (Negative control), P คอ พลาสมด pPAP1 (Positive

control), 1 – 9 คอ ตนขาวท�ผานการถายยนและตานทานตอสารปฏชวนะไฮโกรมยซน ไดแก

ตนท� 3.1(1.1), 3.1(1.2), 3.1(1.3), 3.1(2.1), 3.1(3.1), 5.1(1.1), 5.1(1.1w), 3.1(1.4) และ 3.1(1.4w)

ตามลาดบ และ W คอ น� ากล�น

ตารางท� 10 สรปผลการทาพซอารของตนขาวท�ผานการถายยน เพ�อตรวจสอบการแทรกตวของยน

pap1 ในจโมนขาว

คร� งท� ลกษณะ จานวนตนท�ทา

พซอารท�งหมด

จานวนตนท�

ไดผลพซอาร

บวก

ตนท�ไดผลพซ

อารบวก

เปอรเซนตตน

ท�ไดพซอาร

บวก

1 ยอดเขยว 6 3

3.1 (1.3)

3.1(2.1)

3.1(3.1)

16.66

ยอดขาว 1 0 0 0

2 ยอดเขยว 2 0 0 0

ยอดขาว 1 0 0 0

3 ยอดเขยว 0 0 0 0

ยอดขาว 0 0 0 0

4 ยอดเขยว 1 0 0 0

ยอดขาว 2 0 0 0

5 ยอดเขยว 5 1 11.1 (1.1) 5.55

ยอดขาว 0 0 0 0

57

การถายยนสรางแอนโทไซยานนเขาสใบยาสบ

จากการทดลองถายยน pap1 ซ�งเปนยนสรางแอนโทไซยานน เขาสยาสบพนธเบอรเลย

ดวยอะโกรแบคทเรยมสายพนธ AGL1 ท�มพลาสมด pPAP1 ซ�งมยน pap1 อยภายใตการควบคม

ของ 35S โปรโมเตอร เพ�อตรวจสอบประสทธภาพการถายยน ซ�งมสารปฏชวนะไฮโกรมยซนเปน

สารคดเลอก หลงจากเพาะเล�ยงบนอาหารคดเลอก เปนเวลา 4 สปดาห พบวาช�นสวนใบยาสบมการ

รอดบนอาหารคดเลอกสงท�สดคดเปน 50 เปอรเซนต (ตารางท� 11) หลงจากเพาะเล�ยงเน�อเย�อบน

อาหารคดเลอกเปนเวลา 4 – 6 สปดาห พบวาช�นสวนใบเกดตายอดท�งหมดสงสดคดเปน 50

เปอรเซนต (ตารางท� 11) และเกดตายอดสแดงสงสดคดเปน 44.44 เปอรเซนต (ตารางท� 11) และ

หลงเพาะเล�ยงเปนเวลา 8 สปดาห ตายอดสามารถเจรญเปนตนท�งหมด แบงออกเปน 3 แบบ คอ ตน

ท�เปนสเขยวท�งตน ตนท�มสเขยวปนแดง และ ตนท�มสแดง (ภาพท� 34 และ 36) ซ�งในบางกรณบาง

ตนอาจจะมสแดงในสปดาหท� 8 หลงจากน�นสปดาหท� 10 จะกลายเปนตนสเขยว

ตารางท� 11 ประสทธภาพการถายยนเขาสช�นสวนใบยาสบดวยอะโกรแบคทเรยมสายพนธ AGL1

ท�มพลาสมด pPAP1

คร�งท�

ถายยน

จานวน

ช�นสวน

เร�มตน

ท�งหมด

จานวน

ช�นสวนท�

รอดบน

อาหาร

คดเลอก

จานวน

ช�นสวนท�

เกดตายอด

ท�งหมด

จานวน

ช�นสวนท�

เกดตายอดส

แดง

จานวนตน

ท�งหมด

1 40 9/40 (22.5) 9/40 (22.5) 4/9 (44.44) 42/40 (105)

2 40 19/40 (47.5) 19/40 (47.5) 3/19 (15.8) 5/40 (12.5)

3 40 16/40 (40) 16/40 (40) 1/16 (6.25) 3/40 (7.5)

4 40 17/40 (42.5) 17/40 (42.5) 3/17 (17.64) 2/40 (5)

5 40 20/40 (50) 20/40 (50) 2/20 (10) 1/40 (2.5)

* หมายเหต ตวเลขในวงเลบคอ เปอรเซนตตางๆ

58

ภาพท� 31 ลกษณะของช�นสวนใบยาสบท�ผานการถายยน แลวนาไปวางบนอาหารคดเลอกสตร MS

ดดแปลง ท�ประกอบดวย BA 1 มลลกรมตอลตร NAA 0.1 มลลกรมตอลตร ซโฟแทคซม 200

มลลกรมตอลตร และไฮโกรมยซน 50 มลลกรมตอลตร เปนเวลา 2 สปดาห จะสงเกตเหนวา

ช�นสวนของใบยาสบมลกษณะสเขยว

ภาพท� 32 ลกษณะช�นสวนใบยาสบบนอาหารคดเลอกสตร MS ดดแปลง ท�ประกอบดวย BA 1

มลลกรมตอลตร NAA 0.1 มลลกรมตอลตร ซโฟแทกซม 200 มลลกรมตอลตร และไฮโกรมยซน

30 มลลกรมตอลตร เปนเวลา 4 สปดาห

(ก) ลกษณะช�นสวนของใบยาสบท�สามารถตานตอสารปฏชวนะไฮโกรมยซนได ซ�งจะม

ลกษณะเปนสเขยว

(ข) ลกษณะช�นสวนของใบยาสบท�รอดและตายบนอาหารคดเลอก

59

ภาพท� 33 ลกษณะช�นสวนใบยาสบบนอาหารคดเลอกสตร MS ดดแปลง ท�ประกอบดวย BA 1

มลลกรมตอลตร NAA 0.1 มลลกรมตอลตร ซโฟแทกซม 200 มลลกรมตอลตร และไฮโกรมยซน

30 มลลกรมตอลตร เปนเวลา 4 สปดาห

(ก) ลกษณะการเกดตายอดจากช�นสวนของใบยาสบ ซ�งจะมลกษณะเปนตมเลกๆ สเขยว

ตามขอบของช�นสวนใบยาสบ

(ข) ลกษณะการเกดตายอดสแดงจากช�นสวนของใบยาสบ ซ�งจะมลกษณะเปนตมเลกๆ ส

แดงตามขอบของช�นสวนใบยาสบ

ภาพท� 34 ลกษณะของตนยาสบท�ผานการถายยนดวยอะโกรแบคทเรยมท�มพลาสมด pPAP1

เพาะเล�ยงเน�อเย�อในขวดท�มอาหารคดเลอกสตร MS ดดแปลง ท�ประกอบดวย BA 1 มลลกรมตอ

ลตร NAA 0.1 มลลกรมตอลตร ซโฟแทคซม 200 มลลกรมตอลตร และไฮโกรมยซน 30

มลลกรมตอลตร เปนเวลา 8 สปดาห

(ก) ตนยาสบท�ไมผานการถายยน (ตนควบคม)

60

(ข) ตนยาสบท�ไดรบการถายยน แสดงตนท�มสเขยว

(ค) ตนยาสบท�ไดรบการถายยน แสดงตนท�มสเขยวปนแดง

(ง) ตนยาสบท�ไดรบการถายยน แสดงตนท�มสแดง

ภาพท� 35 ลกษณะของตนยาสบท�ผานการถายยนดวยอะโกรแบคทเรยมท�มพลาสมด pPAP1 แตตน

ไมสมบรณ เพาะเล�ยงเน�อเย�อในขวดท�มอาหารคดเลอกสตร MS ดดแปลง ท�ประกอบดวย ซโฟแท

คซม 200 มลลกรมตอลตร และไฮโกรมยซน 30 มลลกรมตอลตร

(ก) ตนยาสบท�ไมผานการถายยน (ตนควบคม) เพาะเล�ยงเปนเวลา 1 เดอน

(ข) ตนยาสบสเขยวท�ไดรบการถายยน แสดงตนท�ปกต เพาะเล�ยงเปนเวลา 8 สปดาห

(ค) ตนยาสบสแดงท�ไดรบการถายยน แสดงตนท�ผดปกต เพาะเล�ยงเปนเวลา 8 สปดาห

(ง) ตนยาสบสแดงท�ไดรบการถายยนและพฒนาเปนตนสเขยว เพาะเล�ยงเปนเวลา 10 – 12

สปดาห แสดงตนท�ปกต

61

35

1 1 0 0

7

2 1 1 002 1 1 1

0

5

10

15

20

25

30

35

40

1 2 3 4 5

คร �งท �ถายยน

จานวนตน สเขยว

สเขยวปนแดง

สแดง

ตนยาสบท�มสแดงเขมตนจะเลกและมการเจรญเตบโตผดปกต โดยใบยาสบจะมลกษณะ

เปนใสๆ ฉ�าน� า ใบเลกลบและบางตนใบจะหงกงอมลกษณะแหง และตนเจรญเตบโตไดชากวาปกต

(ภาพท� 35 ค) ซ�งเปรยบเทยบกบตนสเขยวท�ไดรบยน เพาะเล�ยงเปนเวลาเทากน (ภาพท� 35 ข) โดย

จะเหนไดวาตนสเขยวใบจะใหญกวาและมการเจรญเตบโตท�ดกวาตนสแดง ซ�งถาเพาะเล�ยงตอไป

เร�อยๆ ตนสแดงท�ไดจะพฒนาเปนตนสเขยวและตนจะมลกษณะตามปกต (ภาพท� 35 ง)

การเจรญเตบโตท�ผดปกตของตนสแดงเขมอาจเกดจากมการสงเคราะหแอนโทไซยานน

มากเกนไป อาจทาใหมการดง phenylalanine และสาร intermediate ในวถการสงเคราะหแอนโทไซ

ยานนไปใชจานวนมาก จงมผลกระทบตอวถการสงเคราะหอ�น ซ�งสงผลใหการเจรญและการ

พฒนาของตนยาสบสแดงผดปกต

ภาพท� 36 การเกดตนยาสบท�ไดรบการถายยน pap1 แสดงการเกดตนสเขยว ตนสเขยวปนแดง

และตนสแดง จากการถายยน 5 คร� ง

การวเคราะหตนยาสบท�ไดรบการถายยนโดยเทคนคพซอาร

นาตนยาสบท�ไดท�งหมดมาสกดจโนมกดเอนเอโดยใชวธ CTAB แลวกนาไปวเคราะหการ

แทรกตวของยน pap1 ในจโนมยาสบดวยเทคนคพซอาร โดยใชไพรเมอรท�จาเพาะตอยน pap1 คอ

F_PAP1 และ R_PAP1

จากการตรวจสอบตนยาสบท�ไดรบการถายยน pap1 โดยนาตนยาสบท�ไดมาทาการสกดจ

โนมกดเอนเอจากใบดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโทรฟอรซส พบวาดเอนเอท�สกดไดมโมเลกล

62

ขนาดใหญ (ภาพท� 37) แสดงวามคณภาพด แตจะมการแตกหกของดเอนเอบางสวนสงเกตจาก

แถบดเอนเอท�มลกษณะเปนป� น (smear) และสามารถนาไปวเคราะหผลดวยเทคนคพซอารตอไปได

ภาพท� 37 ชอง M คอ ดเอนเอมาตรฐาน / EcoRI + HindIII ชอง C คอ ตนยาสบท�ไมไดรบ

การถายยน ชองท� 1 - 5 คอ ตนยาสบท�ไดรบการถายยน ตน 7.1.11, 7.1.14, 7.2.9, 7.1.3 และ

7.4.5 ตามลาดบ

เม�อนาจโนมกดเอนเอของตนยาสบ ท�ไดรบการถายยน pap1 มาตรวจสอบการแทรกตว

ของยน pap1 ในจโนมยาสบ ดวยเทคนคพซอารโดยใชไพรเมอรท�จาเพาะตอยน pap1 พบวาจาก

ตนยาสบท�นามาทาพซอารท�งหมด 26 ตน มตนยาสบจานวน 12 ตน เกดแถบดเอนเอขนาด 400 bp

แสดงวาเปนตนท�มยน pap1 แทรกอยในจโนมคดเปน 46.15 เปอรเซนต

21226 bp

M C 1 2 3 4 5

63

ภาพท� 38 ชอง M คอ ดเอนเอมาตรฐาน 100 bp DNA Ladder ชอง P คอ พลาสมด pPAP1

(Positive control) ชอง N คอตนยาสบท�ไมไดรบการถายยน (Negative control) ชองท� 1-5 คอ

ตนยาสบท�ไดรบการถายยน pap1 ตนท� 7.1.11, 7.1.14, 7.2.9, 7.1.3 และ 7.4.5ตามลาดบ และชอง H

คอ น� ากล�น

จากการสกดจโนมกดเอนเอจากตนยาสบท�ผานการถายยนดวยอะโกรแบคทเรยม ท�มพ

ลาสมด pPAP1 ท�มยน pap1 แลวกนาไปวเคราะหการแทรกตวของยน pap1 ในจโนมยาสบดวย

เทคนคพซอาร โดยใชไพรเมอรท�จาเพาะตอยน คอ F_PAP1 และ R_PAP1 สรปผล PCR ท�ได

(ตารางท� 12) พบวาตนสเขยวท�นามาทาพซอารท�งหมดจานวน 13 ตน ใหผลพซอารบวกจานวน 7

ตน แสดงวาตนท�ใหผลพซอารบวกมยน pap1 เขาไปแทรกอยในจโนมของยาสบท�ไดรบยน แตตน

ยาสบสเขยวท�ใหผลพซอารลบไมมยน pap1 เขาไปแทรกอยในจโนมยาสบ สาหรบตนสเขยวท�

ไดผลพซอารบวก เพราะวาไดรบยน pap1 แตการแสดงออกของยน pap1 นอยมาก หรอไม

แสดงออก สวนตนสเขยวปนแดงท�นามาทาพซอารท�งหมดจานวน 9 ตน ใหผลพซอารบวกจานวน

2 ตน และตนสแดงท�นามาทาพซอารท�งหมดจานวน 4 ตนใหผลพซอารบวกจานวน 3 ตน พบวาตน

ท�ใหผลพซอารบวกมยน pap1 เขาไปแทรกอยในจโนมของยาสบท�ไดรบยน แตตนยาสบสเขยวปน

แดงและตนท�สแดงท�ใหผลพซอารลบอาจมยนเขาไปแทรกอยในจโนมของยาสบเหมอนกน แตท�

ใหผลพซอารลบเพราะวาในการวเคราะหผลดวยเทคนคพซอารยงมปจจยหลายอยาง เชน ดเอนเอไม

สะอาด หรอ ในการสกดจโนมกดเอ โดยดเอนเอท�ไดยงไมเหมาะกบการนาไปทาพซอาร ซ�งดเอนเอ

ท�ไดมปรมาณมากเกนไป หรอมปรมาณนอยเกนไป ซ�งกรณท�ดเอนเอมมากเกนไปควรจะนาไปเจอ

จางกอนท�จะนามาทาพซอารตอไป

64

สาหรบตนท�ไดจากการถายยนท�งหมด 53 ตน แลวนาไปวเคราะหผลดวยเทคนคพซอาร

จานวน 26 ตน ท�เหลออก 27 ตน ตายระหวางการเพาะเล�ยงเน�อเย�อ เน�องจากตนยาสบมการปนเป� อน

เช�อรา เช�อแบคทเรย และอะโกรแบคทเรยม

ตารางท� 12 สรปผลการทาพซอารของตนยาสบท�ไดรบการถายยน เพ�อตรวจสอบการแทรกตวของ

ยน pap1 ในจโนมยาสบ

คร�งท�

ถายยน

ลกษณะ

สของตน

ยาสบ

จานวนตน

ท�งหมดท�นามา

ทา PCR

จานวนตน

ท�มผล PCR

บวก

ตนท�ม

ผล PCR บวก

เปอรเซนต

ตนท�มผล

PCR บวก

1 เขยว 11 7 7.1.11, 7.3.1, 7.3.7,

7.1.14, 7.2.9, 7.4.2 ,

7.4.5

63.63

เขยวปนแดง 6 1 7.1.5 16.7

แดง 0 0 - 0

2 เขยว 1 0 - 0

เขยวปนแดง 2 0 - 0

แดง 2 1 10.9.2 50

3 เขยว 1 0 - 0

เขยวปนแดง 0 0 0 0

แดง 0 0 0 0

4 เขยว 0 0 0 0

เขยวปนแดง 1 1 15.18.2 100

แดง 1 1 15.18.1 100

5 เขยว 0 0 0 0

เขยวปนแดง 0 0 0 0

แดง 1 1 19.24.1 100

65

สรปผลการทดลอง

1. การสรางชดยน pap1 สาหรบถายยนในพช

จากการสรางชดยน pap1 สามารถสรางพลาสมดสายผสมท�มยน pap1 ซ�งทางานภายใตการ

ควบคมของ 35S dual promoter และ nos terminator ไดสาเรจ (35SPdual :: pap1 :: nosT) และนา

ชดยนถายฝากเขาส E. coli สายพนธ DH5 และถายฝากเขาส Agrobacterium tumefaciens สาย

พนธ AGL1 เพ�อใชสาหรบถายยนเขาสพช

2. การถายยนสรางแอนโทไซยานนเขาสแคลลสขาว

การถายยน pap1 เขาสแคลลสขาวพนธ Kitaake โดยใชวธอะโกรแบคทเรยม พบวา กลม

แคลลสท�สามารถเจรญไดและรอดตายบนอาหารคดเลอกไดเปน 98 เปอรเซนต ซ�งเม�อทาการ

เพาะเล�ยงตอบนอาหารสตรชกนาใหเกดตน พบวา กลมแคลลสไดพฒนาเปนยอดท�งหมด 21 กลม

แคลลส ไดเปน 11 เปอรเซนต โดยแบงเปนกลมแคลลสท�เกดยอดสเขยวท�งหมด 17 กลมแคลลส

และเปนกลมแคลลสท�เกดยอดสขาวท�งหมด 4 กลมแคลลส และเม�อเพาะเล�ยงตอไปไดเจรญเปนตน

ท�งหมดจานวน 24 ตน คดเปน 13 เปอรเซนต ของการถายยนท�งหมด

3. การตรวจวเคราะหตนขาวท�ไดรบการถายยน pap1 ดวยเทคนคพซอาร

การตรวจสอบการแทรกตวของยน pap1 ในจโนมขาวดวยเทคนคพซอาร โดยใชไพรเมอร

F_PAP1 และ R_PAP1 ซ�งจาเพาะตอยน pap1 จากตนขาวท�ผานการถายยนท�งหมด 18 ตน แบงตน

ขาวปกตสเขยวจานวน 14 ตน และตนขาวผดปกตสขาวจานวน 4 ตน พบวา มตนขาวท�งหมด 4 ตน

ท�ใหผลพซอารบวก คอ เหนแถบดเอนเอขนาด 400 คเบส ซ�งตนขาวท�ง 4 ตน ท�ใหผลพซอารบวก

น�นเกดจากตนขาวสเขยวซ�งไดจากการถายยนคร� งท� 1 จานวน 3 ตน คดเปน 16.66 เปอรเซนต และ

เกดจากตนสเขยวซ�งไดจากการถายยนคร� งท� 5 จานวน 1 ตน คดเปน 5.55 เปอรเซนต จงอาจกลาวได

วา ตนขาวท�ไดน�นมการแทรกตวของยน pap1 ในจโนมของขาว

จากการทดลองตรวจวเคราะหตนขาวท�ไดรบการถายยน pap1 ดวยเทคนคพซอาร พบวาม

การแทรกตวของยน pap1 ในจโนมขาว ซ� งตามสมมตฐานตนขาวท�ไดจะตองเกดสแดงจากการ

สรางรงควตถแอนโทไซยานน เน�องจากวายน pap1 จะเขาไปเปดการทางานของยนหลายยน แตผล

การทดลองท�ไดพบวาไดตนขาวท�มฟโนไทปปกตสเขยว และผดปกตไดตนสขาว ในตนขาวสเขยว

ท�มผลพซอารบวก แตไมมการแสดงออกของการสรางแอนโทไซยานน อาจเปนผลมาจากยน pap1

เขาไปในแทรกจโนมโดยท�ต าแหนงของยนในจโนมขาวท�ยน pap1 เขาไปแทรก อาจจะไม

เหมาะสมท�จะทาใหเกดการแสดงออกของยน pap1 หรออกประการหน� งยนท�สงถายเขาไปไม

สามารถกระตน pathway ในการสงเคราะหแอนโทไซยานน ซ�งอาจเน�องมาจากยน pap1 เปนยนท�

66

ไดจาก Arabidopsis ซ�งเปนพชใบเล�ยงค เม�อนามาทดสอบในขาวซ�งเปนพชใบเล�ยงเด�ยวยน pap1

จงอาจไมสามารถทางานได ดงน�นตองทาการศกษาเพ�มเตมตอไป

ในตนขาวสขาวเกดลกษณะท�ผดไปจากปกต คอตนขาวท�ไดไมมการสรางคลอโรฟลล

ฟโนไทปท�ไดจงเกดเปนสขาวท�งตน สามารถเจรญไดในอาหารสงเคราะหแตไมสามมารถเจรญได

เม�อปลกลงดน ซ�งเม�อนาใบจากตนสขาวท�ไดมาตรวจวเคราะหดวยเทคนคพซอาร จานวน 4 ตน

จากตนขาวท�ตรวจวเคราะหท� งหมด 18 ตน พบวา ไมมตนขาวสขาวใหผลพซอารบวก ซ� งได

ต�งสมมตฐานวาตนสขาวท�เกดข�นน�น อาจเกดจากความผดปกตของยนอนเน�องจากการแทรกตว

ของยน pap1 ทาใหไปหยดกระบวนการในการสรางคลอโรฟลลในตนขาว แตสาเหตท�ตรวจไมพบ

ยน pap1 อาจเกดจากข�นตอนการทาพซอารดเอนเอท�ไดหรอปรมาณดเอนเอมากเกนไปไมสะอาด

พอทาใหไมพบแถบดเอนเอหลงการทาพซอารและตรวจสอบดวยวธอะกาโรสเจลอเลกโทรฟอรซส

4. การถายยนสรางแอนโทไซยานนเขาสยาสบ

การถายยน pap1 ซ� งเปนยนสรางแอนโทไซยานนเขาสยาสบพนธเบอรเลยดวยอะโกร

แบคทเรยมสายพนธ AGL1 ท�มพลาสมด pPAP1 เพ�อตรวจสอบประสทธภาพการถายยน ซ�งมสาร

ปฏชวนะไฮโกรมยซนเปนสารคดเลอก หลงจากเพาะเล�ยงบนอาหารคดเลอก พบวา ช�นสวนใบ

ยาสบท�วางบนอาหารคดเลอกเปนเวลา 4 สปดาห มช�นสวนท�สามารถตานทานตอสารปฏชวนะไฮ

โกรมยซนไดสงสดคดเปน 50 เปอรเซนต

เม�อเพาะเล�ยงเปนเวลา 4 – 6 สปดาห พบวาบรเวณขอบของช�นสวนใบยาสบ เร�มมตายอด

สเขยวเกดข�น และในบางช�นสวนมตายอดสแดงเกดข�น คดเปนเปอรเซนตการเกดตายอดท�งหมด

สงสดคดเปน 50 เปอรเซนตและการเกดตายอดสแดงสงสดคดเปน 44.44 เปอรเซนต

หลงจากเพาะเล�ยงเปนเวลา 8 สปดาห พบวาไดตนยาสบท�งหมด 53 ตน แยกเปนตนสเขยว

จานวน 37 ตน ตนท�มสเขยวปนแดงจานวน 11 ตน และตนท�มสแดงจานวน 5 ตน

5. การตรวจวเคราะหตนยาสบท�ไดรบการถายยนดวยเทคนคพซอาร

สาหรบตนยาสบท�ไดจากการถายยนท�งหมดจานวน 53 ตน เม�อนาไปวเคราะหดวยเทคนค

พซอาร พบวาจากตนยาสบท�นามาทาพซอารท�งหมด 26 ตน มตนยาสบจานวน 12 ตน ท�ใหผล

พซอารบวก แยกออกเปนตนสเขยวจานวน 7 ตน ตนสเขยวปนแดงจานวน 2 ตน และตนสแดง

จานวน 3 ตน ซ�งเปนตนท�มยน pap1 แทรกอยในจโนมคดเปน 46.15 เปอรเซนต

จากการทดลองน�พบวา สามารถนายน pap1 ซ�งควบคมการสรางแอนโทไซยานนไปใชเปน

ยนเคร�องหมายคดเลอกยาสบท�ไดรบยนแทนการใชยนตานสารปฏชวนะได

67

เอกสารอางอง

สนลไรซ. ม. ป. ป. ขาวสนล. [ระบบออนไลน]. แหลงท�มา

http://www.sininrice.com/insight_sinin.html (25 มกราคม 2554)

สานกงานพฒนาการวจยการเกษตร (องคการมหาชน). ม. ป. ป. ประวตความเปนมาของขาว.

[ระบบออนไลน]. แหลงท�มา http://kasetinfo.arda.or.th/rice/rice-histories.html (7

มกราคม 2554).

ศนยวจยขาวชมแพ. ม. ป. ป. “ขาวเหนยวดา” หลากประโยชน หลายแนวคด เสรมเศรษฐกจไทย ส

สากล. [ระบบออนไลน]. แหลงท�มา

http://www.brrd.in.th/main/document/Pattaya52%20report/25.pdf (3 กมภาพนธ 2554).

สทธพร ศรพาณช. 2549. ประวตยาสบ. [ระบบออนไลน]. แหลงท�มา :

http://kanchanapisek.or.th/kp6/BOOK15/chapter3/t15-3-l1.htm.

(23 ธนวาคม 2553)

ธรรมนญ ฤทธเมธ. 2550. ประวตยาสบ. [ระบบออนไลน]. แหลงท�มา :

http://www.ubon.ricethailand.org/document/warapong/gep.htm.

(23 ธนวาคม 2553)

อทศ เกตทต. 2542. สาราณกรมไทยสาหรบเยาวชนฯ เลมท� 25 ประวตยาสบ.

[ระบบออนไลน]. แหลงท�มา :

http://kanchanapisek.or.th/kp6/New/sub/book/book.php?book=15&chap=3&page=chap3.

htm.

(23 ธนวาคม 2553)

Borevitz J. O., Xia Y. Blount J., Dixon R. A. and Lamb C. 2000. Activation Tagging Identifies a

Conserved MYB Regulator of Phenylpropanoid Biosynthesis. The Plant Cell. 12: 2383–

2393.

Endo S., Sugita K., Sakai M., Tanaka H. and Ebinuma H. 2002. Single-step transformation for

generating marker-free transgenic rice using the ipt-type MAT vector system. The Plant

Journal. 30(1): 115 – 122.

Geekiyanage S., Takase T., Ogura Y. and Kiyosue T. 2007. Anthocyanin production by over-

expression of grape transcription factor gene VlmybA2 in transgenic tobacco and

Arabidopsis. Plant Biotech Rep. 1:11–18

68

Kim B. G., Kim J. H., Min S. Y., Shin K., Kim J. H., Kim H. Y., Ryu S. N. and Ahn J. 2007.

Anthocyanin Content in Rice Is Related to Expression Levels of Anthocyanin

Biosynthetic Genes. Journal of Plant Biology. 50(2) : 156-160

Toki S. 1997. Rapid and Efficient Agrobacterium-Mediated Transformation in Rice. Plant

Molecular Biology Reporter.15 (1): 16 – 21.

Xie D., Sharma B. S., Wright E., Wang Z. and Dixon A. R. 2006. Metabolic engineering of

proanthocyanidins through co-expression of anthocyanidin reductae and the PAP1 MYB

transcription factor. Plant Journal. Vol. 45, 895 - 907

Zhang W., Ning G., Lv H., Liao. And Bao M. 2009. Single MYB – type transcription factor

AtCAPRICE: A new efficirnt tool to engineer the production of anthocyanin in tobacco.

Biochemical and Biophysical Research. 742 – 747

Zhou L., Zeng H., Shi M. and Xie D. 2008. Development of tobacco callus cultures over

expressing Arabidopsis PAP1/MYB75 transcription factor and characterization of

anthocyanin biosynthesis. Planta. 229: 37–51.

Zuluaga D. L., Gonzali S., Loreti G. S., Pucciariello C., Innocentic E. D., Guidic L., Alpi A. and

Perata P. 2008. Arabidopsis thaliana MYB75/PAP1 transcription factor induces

anthocyanin production in transgenic tomato plants. Functional Plant Biology. 35: 606 –

618.