Kauno technologijos universiteto gimnazija

ARBATOS IR PIENO GRYBŲ UŽPILŲ PRITAIKYMAS ANTIBAKTERINIO ODOS

KREMO GAMYBAI

Darbą atliko: Karolina Zakarauskaitė

Darbo vadovė: dr. Vilma Petrikaitė

Lietuvos sveikatos mokslų universitetas,

VU Biotechnologijos institutas

Darbo konsultantas: prof. Alvydas Pavilonis

Lietuvos sveikatos mokslų universitetas

2012 m.

1

TURINYS

SANTRUMPOS 3

ĮVADAS 4

1. TYRIMŲ APŽVALGA 5

2. EKSPERIMENTINĖ DALIS 6

2.1. Arbatinio ir pieno grybų užpilo antimikrobinio aktyvumo tyrimai

2.2. Antibakterinio kremo priešmikrobinio aktyvumo tyrimai

6-7

7-8

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS 9-12

IŠVADOS 13

LITERATŪROS SĄRAŠAS 14

PRIEDAS 15-16

2

SANTRUMPOS

S. aureus Staphylococcus aureus

E. coli Escherichia coli

B. subtilis Bacillus subtillis

K. pneumoniae Klebsiella pneumoniae

C. albicans Candida albicans

P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

P. mirabilis Proteus mirabilis

B. cereus

A. hydrophila

Bacillus cereus

Aeromonas hydrophila

3

1 pav. Arbatos grybo Kombucha užpilas

ĮVADAS

Darbo aktualumas

Kombucha arbata – tai juoda saldinta, arbatos grybe fermentuota arbata [3]. Arbatos

grybo tėvynė – Rytų Azija. Grybą sudaro arbatos

paviršiuje plūduriuojančios bakterijų

(Schizosaccharomyces pombe, Acetobacter xylinum ir

kt.) kolonijos (žr. 1 paveikslą). Pagrindinės

Kombucha arbatos sudedamosios dalys yra acto

rūgšties bakterijos ir gliukorono rūgštis [1,2]. Dėl

organinių rūgščių arbata įgyja saldžiarūgštį skonį.

Dažniausiai šis grybas platinamas tik iš rankų į

rankas, o kai kuriose šalyse, pvz. JAV, Norvegijoje

parduodamas interneto parduotuvėse ir vaistinėse.

Kombucha arbata naudojama liaudies medicinoje nuo įvairių negalavimų. Teigiama,

kad ji stiprina imuninę sistemą, naikina kai kurias kenksmingas bakterijas skrandyje ir

žarnyne, valo organizmą nuo toksinų. Netgi manoma, kad arbatos grybas užkerta kelią širdies

ir kraujagyslių, kasos, inkstų ir vėžiniams susirgimams. Kai kurie žmonės jį vadina

„stebuklinguoju grybu“ ar jaunystės eliksyru, stabdančiu senėjimą.

Vis dėlto, kyla klausimas, kiek šiose kalbose yra tiesos. Kurias bakterijas iš tiesų šis

grybas veikia, ir ar iš viso veikia? O galbūt šis grybas, ypač paplitęs tarp vyresnio amžiaus

žmonių, iš tiesų turi potencialią naudą ir gali būti naudojamas daug plačiau nei tik kaip

geriama arbata? Siekdami išsiaiškinti kilusius klausimus, nutarėme ištirti grybo užpilo

antimikrobines savybes ir pabandyti jį pritaikyti kaip konservantą arba kaip antimikrobinę

medžiagą kremo gamybai.

Darbo tikslas – sukurti antibakterinį kremą, panaudojant kaip antimikrobines

medžiagas arbatos grybą Kombucha ir pieno grybą.

Uždaviniai:

1. Ištirti pieno grybo antimikrobines savybes.

2. Ištirti arbatos grybo antimikrobines savybes ir jų priklausomybę nuo

fermentacijos laiko.

3. Pagaminti kremus su arbatos grybo skirtingomis koncentracijomis.

4. Įvertinti pagaminto kremo antimikrobines savybes.

4

1. TYRIMŲ APŽVALGA

Įrodyta, jog Kombucha arbata teigiamai veikia medžiagų apykaitą, gydo artritą,

skrandžio veiklos sutrikimus ir įvairias vėžio rūšis. Tyrimai rodo, jog Kombucha apsaugo

kepenis nuo kenksmingo paracetamolio poveikio [10]. 2000 metais atliktas tyrimas, kuriame

tirtas grybo poveikis Shigella sonnei, Escherichia coli, Aeromonas hydrophila, Yersinia

enterolitica, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae ir kt. bakterijoms. Įrodyta, jog

grybas antibakteriškai veikia B. cereus, E. coli, A. hydrophila, S. typhimurium [8].

Skirtingų Kombucha užpilų koncentracija skiriasi, priklausomai nuo to, kokia grybo

kultūra naudojama [8].

Pagrindinės organinės rūgšties Kombucha arbatoje – acto rūgšties – didžiausia

koncentracija pasiekiama penkioliktą fermentacijos dieną. Dar viena iš pagrindinių rūgščių

yra L-gliukorono rūgštis. Didžiausia jos koncentracija būna dvyliktą fermentacijos dieną.

Manoma, kad būtent dėl šios rūgšties Kombucha veikia detoksifikuojančiai [7]. Pieno ir

citrinų rūgščių fermentuotame arbatos tirpale yra labai maži kiekiai. Šių rūgščių daugiausia

būna trečią fermentacijos dieną.

Jokių azoto turinčių junginių nėra pridedama į arbatą prieš ją fermentuojant, tačiau

baltymų kiekis fermentacijos metu auga. Tai rodo, jog arbatinio grybo bakterijos ir raugas

išskiria papildomus baltymus [8]. Dėl šios priežasties arbatinis grybas greitai dauginasi, todėl

jį patogu naudoti pramonėje.

Pieno grybas yra bakterijų kolonija, kurio tėvynė – Azija. Jame fermentuojamas

pienas, kuris savo skoniu ir konsistencija po 24 valandų fermentacijos primena kefyrą. Šiam

grybui priskiriamas antibakterinės ir priešgrybelinės savybės. Įrodytas pieno grybo

priešuždegiminis poveikis granuliomos atveju [10].

5

2. EKSPERIMENTINĖ DALIS

1. Arbatos grybo užpilo gamyba

Arbatos grybą gavome iš Lietuvos gyventojų, kurie jį augino namuose, juodojoje

arbatoje. Tyrimams arbatos grybo užpilą gaminome pagal kitų mokslininkų straipsniuose

aprašytas ir jau išbandytas metodikas [2,4,5], jas pritaikius mūsų laboratorijos sąlygoms.

Į verdantį išgrynintą vandenį dedama 100 g/l cukraus, 3 paketėliai/l juodosios arbatos

ir virinama 3-5 min. Atvėsinama iki kambario temperatūros ir supilama į stiklinį indą. Į

paruoštą arbatą dedama 150 g arbatos grybo ir paliekama fermentuotis kambario

temperatūroje, pridengus marle. Taip paruoštas grybo užpilas laikomas iki tyrimų pabaigos,

po to iš jo atsisluoksniavusio naujo “grybo” sluoksnio gaminamas naujas užpilas.

2. Pieno grybo užpilo gamyba

Pieno grybą gavome iš Lietuvos gyventojų, auginančių jį namuose. Jis auginamas

piene, kuris keičiamas kiekvieną dieną, perkošiant pieną per sietelį, nuplaunant pieno grybą ir

vėl jį užpilant nauju pienu.

3. Arbatos ir pieno grybų užpildų antimikrobinių sąvybių tyrimas

Arbatos ir pieno grybo užpilų antimikrobinį aktyvumą in vitro tyrėme skirtingų

bakterijų ir grybelio kultūroms:

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Escherichia coli ATCC 25922

Klebsiella pneumoniae ATCC 33499

Proteus mirabilis ATCC 12459

Bacillus cereus ATCC 6633

Candida albicans ATCC 60193

Streptococcus epidermidis

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Šios bakterijų ir grybelių kultūros buvo auginamos 5 ml talpos mėgintuvėliuose ant

nuožulnaus triptozės sojos agaro. Kas 7 dienas jos buvo persėjamos į šviežią triptozės sojos

agarą, laikomos šaldytuve (2–8 ºC temperatūroje).

Antimikrobinis aktyvumas nustatytas standžioje terpėje (Mueller-Hinton broth II,

BBL, Cockeysville, JAV) cilindrų metodu.

Tyrimai vyko keliais etapais:

6

1. Etaloninių mikroorganizmų kultūrų paruošimas. Etaloninės bakterijų ir grybelio

C. albicans kultūros buvo auginamos 20–24 val. 35–37 ºC temperatūroje ant Miulerio-

Hintono agaro. Mikrobų suspensija gaminama iš išaugintų mikrobų kultūrų fiziologiniame

natrio chlorido (0,9 proc.) tirpale, standartizuojama McFarland standartiniu indikatoriumi,

kuris matuoja mėgintuvėlyje esančios suspensijos drumstumą. Mikrobų suspensija laikoma

standartizuota, kai indikatoriaus reikšmė lygi 0,5 (tai reiškia, kad 1 ml mikrobų suspensijos

yra 1,5 × 108 mikrobų ląstelių).

2. Tiriamųjų grybų užpilų paruošimas mikrobiologiniam tyrimui. Tyrimams

naudojami arbatos grybo užpilai buvo sterilizuojami, juos filtruojant per 0,2 µm porų

skersmens filtrus. Pieno grybo užpilas prieš filtravimą centrifūguojamas 20 min. esant

5000 aps./min. greičiu. Antimikrobinio aktyvumo tyrimų metu buvo atliekama užpilo

sterilumo kontrolė.

3. Terpių su mikroorganizmų kultūromis paruošimas. Standi Miulerio-Hintono terpė

išlydoma ir atvėsinama iki 50 °C temperatūros. Aseptinėmis sąlygomis atmatuojama 15 ml

terpės, sumaišoma su 1 ml paruoštos atitinkamos mikroorganizmų suspensijos ir perkeliama į

sterilią Petri lėkštelę. Sustingus terpei, ant jos paviršiaus aseptinėmis sąlygomis išdėliojami

maždaug vienodu atstumu vienas nuo kito 5 arba 6 sterilūs cilindrai, kurių vidinis diametras

yra 7 mm, o išorinis diametras – 8 mm.. Paliekama maždaug 15-20 min., kad cilindrai įsmigtų

į terpę apie 1-2 mm.

4. Grybų užpilų išpilstymas į cilindrus. Paruoštas tyrimams grybo užpilas sterilia

pipete perkeliamas į Petri lėkštelėse išdėliotus cilindrus po 0,1 ml. Petri lėkštelės dedamos į

termokamerą 1 arba 2 paroms.

Po 1 arba 2 dienų vertinamas mikrobų augimas ir lyginamas su kontrole.

Kontroliniame mėginyje į cilindrus užpilas nebuvo pilamas. Esant antimikrobiniam arbatos

veikimui, aplink cilindrus susidaro sterili (skaidri) zona, kurios skersmuo matuojamas

liniuote.

4. Kremo gamyba

Kremo gamybai naudojome hidrofilinį kremo pagrindą, gautą iš Lietuvos svekatos

mokslų universiteto Vaistų technologijos katedros prof. Jurgos Bernatonienės. Kremo

pagrindo stabilumas ištirtas kitų mokslininkų ir nustatyta, kad jis išlieka stabilus, į jį dedant

iki 20 proc. vandens arba vandeninio tirpalo.

Buvo gaminami penkių koncentracijų kremai: į pagrindą dedama 1 proc., 5 proc.,

10 proc., 15 proc. ir 20 proc. Kombucha užpilo, fermentuoto 8 dienas, arba pieno grybo

7

užpilo, fermentuoto parą. Gamybai naudojami grybų užpilai buvo sterilizuojami, juos

filtruojant per 0,2 µm porų skersmens filtrus. Porceliano grūstuvėje atsvertas kiekis kremo

pagrindo (5 g) piestele sukamaisiais judesiais maišomas su reikiamu kiekiu užpilo apie

10 min. Pagaminti kremai perkelti į tamsaus stiklo užsukamus buteliukus.

Kadangi į pagrindą įdėto užpilo pH yra rūgštinis, įvertinome pagamintų kremų

stabilumą centrifūgavimo metodu (3500 aps./min., centrifūgavimo trukmė – 5 min.).

Nustatyta, kad visi pagaminti kremai yra stabilūs.

5. Kremo antimikrobinių sąvybių tyrimas

Pagamintų kremų antimikrobinis aktyvumas nustatytas standžioje terpėje (Mueller-

Hinton broth II, BBL, Cockeysville, JAV) šulinėlių metodu. Metodika tokia pati, kaip ir

vertinant užpilų antimikrobinį aktyvumą, tik standžioje terpėje buvo aseptinėmis sąlygomis

išpjaustyti šulinėliai (7 mm diametro) ir į juos dedamas tiriamasis kremas.

8

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

Prieš tiriant užpilų ir kremo antimikrobinį aktyvumą, buvo įvertintas galimas saldintos

juodosios arbatos (be grybo) poveikis mikroorganizmams (1 pav.).

Juodosios arbatos antibakterinės savybės

6

8

10

12

14

16

S. aur

eus

E. col

iK. p

neum

onia

e

B. sub

tilis

C. albi

cans

S. epi

derm

idis

P. aer

ugin

osa

P. mira

bilis

Ske

rsm

uo (

mm

)

1 pav. Juodosios arbatos poveikis tirtiems mikroorganizmams

Nustatyta, kad juodoji arbata turi antimikrobinį aktyvumą tik prieš S. epidermidis

(13,17 ± 1,47 mm), o kitų bakterjų ir grybelio C. albicans praktiškai neveikia (sterili zona

buvo tik cilindro skersmens, apie 8 mm).

Atlikus įvairaus fermentacijos laikotarpio grybo užpilo antimikrobinio aktyvumo

tyrimus, paaiškėjo, kad ilgėjant fermentacijos laikui, poveikis prieš mikrobus gerėja. Vieną

dieną fermentuotos arbatos aktyvumas prieš daugumą bakterijų ir grybelį buvo labai mažas

(sterilios zonos skersmuo buvo apie 8mm), aktyviausiai veikė B. subtilis ir S. epidermidis

(sterilios zonos buvo 13 ± 1,26 mm). Tuo tarpu po dešimties dienų fermentacijos arbata

mikroorganizmus veikia 1,5 karto (C. albicans), 2 kartus (B. subtilis, P. aeruginosa) ar net 3

kartus stipriau (kiti mikroorganizmai). Tokie rezultatai leidžia manyti, kad norint pritaikyti

grybo arbatą kaip antimikrobinę priemonę, tikslinga ją fermentuoti 7-10 dienų (2 pav.).

9

Kombucha antimikrobinės savybės

5

10

15

20

25

30

35

0 2 4 6 8 10

Fermentacijos laikas (dienos)

Ske

rsm

uo (

mm

)S. aureus

E. coli

K. pneumoniae

B. subtilis

C. albicans

S. epidermidis

P. aeruginosa

P. mirabilis

2 pav. Grybo užpilo antimikrobinio aktyvumo priklausomybė nuo fermentacijos laiko

Arbatinis grybas Kombucha stipriausiai veikia šias bakterijas: S. epidermidis,

S. aureus, B. subtilis, E. coli, K. pneumoniae. Jam atspariausi: grybelis C. albicans bei

bakterijos P. mirabilis ir P. aeruginosa. Gauti rezultatai kelių mikrobų atžvilgiu atitinka

literatūroje pateiktus antimikrobinių tyrimų rezultatus [8].

Gali būti, kad acto rūgštis – tai Kombucha antibakterinių savybių priežastis [4,5],

tačiau nustatyta, jog ir esant beveik neutraliam pH (apie 6), grybo užpilas pasižymi

antibakterinėmis savybėmis.

Atlikus kremo su įvairiomis Kombucha užpilo, fermentuoto 8 dienas,

koncentracijomis, antimikrobinio aktyvumo tyrimus prieš bakterijas ir grybelį, nustatėme, kad

kremas stipriausiai veikia S. aureus, S. epidermidis ir P. aeruginosa bakterijas. Antibakterinis

kremo poveikis prieš P. aeruginosa pasireiškė esant 10 proc. ir didesnėms koncentracijoms.

S.  aureus kremas veikia nestipriai ir aktyvumas prieš šią bakteriją beveik nepriklauso nuo

koncentracijos. Aktyvumas prieš E. coli pasireiškia esant bent 10 proc. ir didesnėms kremo

koncentracijoms (3 pav.).

10

0

2

4

6

8

10

12

1 5 10 15 20

Užpilo koncentracija kreme (proc.)

Ske

rsm

uo

(mm

)

S. aureus

S. epidermidis

P. aeruginosa

E. coli

3 pav. Kombucha kremo antimikrobinio poveikio priklausomybė nuo užpilo

koncentracijos.

Ištyrus pieno grybo užpilo antibakterinį aktyvumą, nustatėme, kad jis stipriausiai

veikia bakteriją S. epidermidis, šiek tiek silpniau K. pneumoniae, S. aureus, E. coli ir

silpniausiai P. mirabilis:

0

5

10

15

20

S. aur

eus

K. pne

umon

iae

S. epi

derm

idis

P. mira

bilis

E. col

i

Ske

rsm

uo

(m

m)

4 pav. Pieno grybo antibakterinės savybės

11

Atsižvelgę į šiuos rezultatus sukūrėme antibakterinėmis savybėmis pasižymintį kremą:

0

1

2

3

4

10 20

Užpilo koncentracija kreme (proc.)

Ske

rsm

uo

(mm

)

E. coli

S. aureus

P. aeruginosa

5 pav. Pieno grybo kremo poveikio priklausomybė nuo užpilo

koncentracijos.

Atlikus kremo su įvairiomis pieno grybo užpilo, fermentuoto 1 parą,

koncentracijomis, antimikrobinio aktyvumo tyrimus prieš bakterijas ir grybelį, nustatėme, kad

kremas veikia S. aureus, E.coli ir P. aeruginosa bakterijas.

12

IŠVADOS

1. Arbatos ir pieno grybo užpilai pasižymi antimikrobinėmis savybėmis. Stipriausiai

arbatos grybo užpilas veikia S. aureus, S. epidermidis, B. subtilis, K. pneumoniae ir E.

coli bakterijas; labai mažai veikia P. mirabilis, P. aeruginosa, C. albicans. Pieno grybo

užpilas stipriausiai veikia bakteriją S. epidermidis.

2. Ilgėjant arbatos fermentacijos laikui iki 10 dienų, stiprėja antimikrobinės užpilo

savybės.

3. Kremas, sudėtyje turintis 10 proc. ir daugiau Kombucha arbatos arba pieno grybo

užpilo, veikia S. aureus, E. coli, ir P.aeruginosa bakterijas. Kremas su Kombucha

arbata veikia ir S. epidermidis. Abu kremai galėtų būti pritaikyti kaip antibakterinės

priemonės.

13

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Changes in content of organic acids and tea polyphenols during kombucha tea fermentation R. Jayabalan, S. Marimuthu, K. Swaminathan.

2. Blanc, P. J. (1996). Characterization of tea fungus metabolites. Biotechnology Letters, 18(2), 139–142

3. Chen, C., & Liu, B. Y. (2000). Changes in major components of tea fungus metabolites during prolonged fermentation. Journal of Applied Microbiology, 89, 834–839.

4. Greenwalt, C. J., Ledford, R. A., Steinkraus, K. H.: Determination and characterization of the antimicrobial activity of the fermented tea Kombucha. Lebensm. Wiss. Technol. 31 (1998),291–296.

5. Steinkraus, K. H., Shapiro, K. B., Hotchkiss, J. K., Mortlock, R. P.: Investigations into the antibiotic activity of tea fungus/Kombucha beverage. Acta Biotechnol. 16 (1996), 199–205.

6. Vijayaraghavan, R., Singh, M., Rao, P. V. L., Bhattacharya, R., Kumar, P., Sugendran, K., Kumar, O., Pant, S. C., & Singh, R. (2000). Subacute (90 days) oral toxicity studies of Kombucha Tea. Biomedical and Environmental Sciences, 13, 293–299.

7. Loncar, E. S., Petrovic, S. E., Malbasa, R. V., & Verac, R. M. (2000). Biosynthesis of glucuronic acid by means of tea fungus. Nahrung, 44, 138–139.

8. Sreeramulu, G., Zhu, Y., & Knol, W. (2000). Kombucha fermentation and its antimicrobial activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry,48, 2589–2594.)

9. Pauline, T., Dipti, P., Anju, B., Kavimani, S., Sharma, S. K., Kain, A. K.,Sarada, S. K. S.,Sairam, M., Ilavazhagan, G., Kumar, D., &Selvamurthy, W. (2001). Studies on toxicity; anti-stress and hepatoprotective properties of kombucha tea. Biomedical and Environmental Sciences, 14(3), 207–213.

10. Study of anti-inflammatory activity of Tibetanmushroom, a symbiotic culture of bacteria and fungi encapsulated into a polysaccharide matrix (2003) R.O Diniz, L.K Garla, J.M Schneedorf, J.C.T Carvalho. 49-52

14

PRIEDAS

1 pav. Cilindrų metodas antimikrobiniuose tyrimuose

2 pav. Sterilios zonos

15

3 pav. Šulinėlių metodas kremo

antimikrobiniuose tyrimuose

4 pav. Paruošti kremai

5 pav. Kremo antimikrobiniai tyrimai

16