bahan_hplc

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar belakang

Di zaman yang modern seperti sekarang ini, perkembangan Ilmu

Pengetahuan dan Teknologi melaju dengan pesatnya. Tuntutan kebutuhan hiduplah

yang menjadikan manusia giat mengembangkan ilmu pengetahuan dan teknologi.

Berbagai ilmu dikembangkan, mulai dari ilmu sosial hingga ilmu eksak. Seperti salah

satu ilmu eksak yaitu ilmu kimia. Dalam praktiknya secara umum ilmu kimia, yaitu

ilmu yang mempelajari tentang sususnan, sifat, dan reaksi suatu unsur atau zat

dalam berbagai jenis benda material.

Dalam ilmu kimia banyak aspek-aspek penelitian yang dilakukan. Seperti

halnya, yang paling spesifik yaitu pemisahan molekul- molekul dari senyawa zat nya,

atau yang disebut dalam ilmu kimia yaitu Kromatografi. Kromatografi terbagi

menjadi berbagai macam lagi. Pada kesempatan kali ini penulis akan membahas

tentang “Kromatografi Cair Kinerja Tinggi” atau yang biasa di kenal HPLC. Bahasan

ini akan penulis rangkum dalam bentuk makalah.

1.2 Tujuan

Dalam penulisan makalah ini, penulis bertujuan untuk :

a. Memenuhi nilai salah satu tugas mata pelajaran kimia instrument.

b. Bahan referensi pada saat pembelajaran kimia instrument

c. Bahan pembelajaran dalam pembuatan makalah

Sekolah Menengah Kejuruan Negeri 13 Bandung


1.3 Metodologi

Dalam pembuatan makalah ini, penulis menggunakan metode :

a. mencari referensi dari buku sumber kimia

b. mencari referensi dari Internet

1.4 Sistematika

I. Pendahuluan

II. Isi pembahasan

III. Penutup

IV. Daftar pustaka

1.5 Ruang lingkup

Kromatografi terdiri dari berbagai jenis, yaitu :

a. kromatografi kolom

b. kromatografi kertas dan lapis tipis

c. kromatografi gas

d. kromatografi HPLC

Dalam makalah ini penulis akan membahas kromatografi cair kinerja tinggi

dan alat yang digunakan yaitu HPLC. HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat

dalam analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan

serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi

kolom.



BAB II

ISI

2.1 Pengertian HPLC

HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid Chromatography, yaitu

alat yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam ( yaitu

sebuah tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan

memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom. HPLC secara

mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain

dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui

tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.

HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil

untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan

yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang

melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-

komponen dalam campuran.Sampel yang akan dianalisis dijadikan dalam volume

yang kecil dari fase bergerak dan diubah melalui reaksi kimia oleh fase diam ketika

sampel melalui sepanjang kolom. Tujuan penggunaan alat ini adalah mengetahui

kadar asam organik.

Banyak dari pengubahan tergantung dari sifat alami analit, fase diam, dan

fase bergerak. Waktu saat analit keluar dari ujung kolom disebut waktu retensi dan

merupakan suatu karakteristik yang unik dari tiap analit. Penggunaan dari tekanan

menaikkan kecepatan linear memberikan lebih sedikit waktu bagi analit untuk

berdifusi, dan menghasilkan chromatogram. Pelarut yang banyak digunakan yaitu air

dan zat-zat organik seperti methanol.



HPLC ini digunakan untuk asam organik , seperti asam formiat dan asam

asetat. Jika sampel mula-mula berbentuk padatan harus di-distruksi dulu kemudian

di-treatment sehingga berupa larutan homogen yang tidak terdapat endapan lagi

dan bening karena syarat sampel yang dapat dianalisa menggunakan HPLC adalah

harus tidak ada endapan dan harus bening.

2.2 Prinsip kerja alat HPLC

Prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang akan diuji diinjeksikan

ke dalam kolom maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan terpisah menjadi

senyawa-senyawa kimia ( analit ) sesuai dengan perbedaan afinitasnya. Hasil

pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector (spektrofotometer UV,

fluorometer atau indeks bias) pada panjang gelombang tertentu, hasil yang muncul

dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh recorder yang biasanya dapat

ditampilkan menggunakan integrator atau menggunakan personal computer (PC)

yang terhubung online dengan alat HPLC tersebut.

2.3 Jenis-jenis HPLC

Berdasarkan prinsip kerjanya :

1. HPLC Isocratic

HPLC isocratic digunakan pada analisis senyawa kimia yang tidak

memerlukan perubahan komposisi fasa gerak, suhu, tekanan (preassure)

dan daya alir (flow) selama sampel diinjeksikan dan terelusi di dalam

kolom.

2. HPLC Gradient

HPLC gradient digunakan pada analisis senyawa kimia yang biasanya

memerlukan perubahan komposisi fasa gerak, suhu, preassure dan flow

selama sampel terelusi di dalam kolom agar senyawa kimia tersebut

dapat dipisahkan dari campurannya secara sempurna.



Berdasarkan berdasarkan sifat kepolaran (polarity) dari fase diam dan fase

geraknya :

1. Kromatografi fasa normal (normal phase) adalah kromatografi yang

dilakukan dimana fase diam lebih polar dibandingkan fase geraknya.

2. kromatografi fase terbalik (reversed phase) balik adalah kromatografi

dengan fase gerak lebih polar dibandingkan fase diamnya.

2.4 Cara menggunakan HPLC

Langkah-langkah menganalisa menggunakan HPLC yaitu mula-mula sampel

diinjeksi dengan syringe. Kemudian sampel masuk ke injection hall. Dari injection

hall ini proses utama cara kerja HPLC dimulai, yaitu dengan memompa sampel ke

kolom oleh LC20AT dalam tekanan tinggi.

Dari kolom, sampel dijadikan fase bergerak dan diolah dengan fase diam

yaitu biasanya H2SO4 0,05 N dan CH3OH berdasarkan afinitas elektron. Setelah

terpisah, dengan berbagai perhitungan matematis, HPLC yang sudah disambungkan

dengan komputer ini memberikan pembacaan berupa peak. Setelah itu kita mencari

luasan di bawah peak untuk mengetahui kadar analit.

Rumus perhitungannya adalah y = ½ b.h yaitu persamaan yang diplotkan

dengan least square. Sesuai dengan pengerjaan least square, maka sebelum

menggunakan HPLC untuk analit, kita harus membuat kurva standar terlebih dahulu

dengan menggunakan larutan standar.

Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama

analisis kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat

waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom. Dasar-dasar

elusi gradien dijelaskan oleh Snyder.



Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :

a. Total waktu analisis dapat direduksi

b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah

c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)

d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak

Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi Gradien dapat

dipilih dengan cara trial and error.

Gradien elusi memisahkan analit bergantung pada afinitas elektron sesuai

fungsi dari afinitas elektron analit sebagai fase bergerak relatif terhadap fase diam.

Hal ini sesuai dengan ekstraksi liquid-liquid, namun berjalan secara kontinu. Sesuai

dengan prinsip tersebut maka komponen yang hidrofob dari analit akan keluar dari

kolom pada kondisi metanol tinggi, sedangkan komponen yang hidrofil dari analit

akan keluar dari kolom pada kondisi metanol rendah.

Setelah itu sampel dikeluarkan dari HPLC dan ruangan pembuangan dari

HPLC ini dicuci dengan asam asetat.

2.5 Keuntungan dan Kerugian HPLC

2.5.1 Keuntungan HPLC

Keuntungan dari penggunaan HPLC yaitu :

Lebih teliti

Sudah digital sehingga penggunaannya cepat dan lebih praktis

mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran

mudah melaksanakannya

kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi

dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis

Resolusi yang baik

dapat digunakan bermacam-macam detektor



Kolom dapat digunakan kembali

mudah melakukan "sample recovery"

Keuntungan utama KCKT

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Dalam

banyak hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek

pemisahan yang sama membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada KG, namun

pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang

labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama.

Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan

memainkan peranan yang lebih besar bagi para analis laboratorium. Derivatisasi

juga menjadi populer pada KCKT karena teknik ini dapat digunakan untuk

menambah sensitivitas detektor UV Visibel yang umumnya digunakan.

KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi

cair klasik, antara lain:

Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang

dapat diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit

(uncomplicated), waktu analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai

Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua fasa

dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit

berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan

fasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan fasa

diam dan fasa gerak pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk

mencapai pemisahan yang diinginkan.

Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam

KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari

bermacam- macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia

dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor



seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga

digunakan dalam KCKT

Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi

klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang

bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang

diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan Ideal untuk

zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa dianalisis

dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk

menganalisis psesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal

sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.

Mudah rekoveri sampel : Umumnya detektor yang digunakan dalam KCKT

tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang

diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah

dikumpulkan setelah melewati detektor. Solvennya dapat dihilangkan

dengan menguapkan kecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan

prosedur khusus.

2.5.2 Kerugian HPLC

Kerugian dari penggunaan HPLC yaitu :

Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dulu

Hanya bisa digunakan untuk asam organik

Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan

gradien elusi

Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang

terbatas



2.6 Hal-hal yang harus diperhatikan dalam HPLC

Diameter internal dari kolom HPLC adalah aspek penting yang menentukan

kapasitas analit yang dapat dimasukkan dan dapat mempengaruhi sensitivitas.

Kolom yang lebih lebar dijumpai di aplikasi industri seperti pemurnian obat-obatan,

sedangkan kolom yang lebih sempit menaikkan sensitivitas dan hanya

membutuhkan sedikit solven.

Ukuran partikel juga berpengaruh. HPLC tradisional kebanyakan fase

diamnya melekat pada partikel silika. Ukuran partikel yang paling umum adalah

5μm. Ukuran yang lebih kecil menyediakan luas area lebih besar dan separasi yang

lebih baik, namun tekanan yang dibutuhkan untuk kecepatan linear optimum

berbanding terbalik dengan kuadrat diameter partikel.

Tekanan pompa yang besar dibutuhkan untuk partikel yang sangat kecil, dan

sekarang ada UHPLC (Ultra HPLC) yang dapat bekerja pada tekanan sangat tinggi

(1000 atm).

Kolom (coloum) yang digunakan pada HPLC untuk pemisahan biasanya

mempunyai porositas yang sangat kecil (3-50 µm) dengan diameter dalam 2-5 mm,

sehingga seluruh fase gerak serta sampel yang dianalisis harus disaring

menggunakan saringan mikro dengan filter yang mempunyai ukuran yang lebih kecil

atau sama dengan porositas dari kolom yang akan digunakan. Biasanya jika

menggunakan kolom dengan ukuran porositas 10 µm, maka fase gerak dan sampel

harus disaring dengan filter ± 0,45 µm. Hal tersebut sangat penting untuk

memperoleh hasil pemisahan yang sempurna serta untuk menghindari terjadinya

penyumbatan (blocking) di dalam kolom sehingga self life kolom lebih panjang.

Panjang pendek kolom juga mempengaruhi kecepatan dari terpisahnya masing-

masing analit.



Kolom dapat dipanaskan agar dihasilkan pemisahan yang lebih efesien, akan

tetapi suhu di atas 60o jarang digunakan, oleh karena mungkin terjadi penguraian

fase diam ataupun penguapan fase gerak pada suhu yang lebih tinggi tersebut. Jika

tidak dinyatakan lain dalam monografi, kolom dipertahankan pada suhu kamar.

Teknologi kolom partikel kecil ini memerlukan sistem pompa tekanan tinggi yang

mampu mengalirkan fase gerak pada tekanan tinggi, agar tercapai laju aliran

beberapa ml per menit. Oleh karena sering digunakan jumlah zat uji yang kecil

(umumnya lebih kecil dari 20 µg), maka diperlukan detektor yang sensitif. Dengan

teknologi ini, maka kromatografi cair dalam banyak hal dapat menghasilkan

pemisahan yang sangat cepat dan efisien yang tinggi.

Kolom yang terdapat pada alat, HPLC merupakan fase diam dimana senyawa

kimia yang berbeda akan berinteraksi berdasarkan perbedaan afinitasnya. Ada dua

perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut

dan fase diam.

Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau fasa gerak adalah

salah satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang

sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada beberapa sifat

umum yang disukai, yaitu fasa gerak harus :

Murni, tidak terdapat kontaminan

Tidak bereaksi dengan wadah (packing)

Sesuai dengan defektor

Melarutkan sampel

Memiliki viskositas rendah

Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"

Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price)



Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena

prosedur pemurniannya kembali sangat membosankan dan mahal biayanya. Dari

semua persyaratan di atas, persyaratan 1 s/d 4) merupakan yang sangat penting.

Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama untuk KCKT

yang menggunakan pompa bolak balik (reciprocating pump) sangat diperlukan

terutama bila detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang terlarut yang

tidak dikeluarkan akan menyebabkan gangguan yang besar di dalam detektor

sehingga data yang diperoleh tidak dapat digunakan (the data may be useless).

Menghilangkan gas (degassing) juga sangat baik bila menggunakan kolom yang

sensitif terhadap udara (contoh : kolom berikatan dengan NH2).

2.6.1 Fase normal HPLC

Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin

kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm yang diisi dengan partikel

silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan.

Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih

lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh

karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

2.6.2 Fase balik HPLCDalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non

polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya

secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar

digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.

Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan

molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan

sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase

diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul

polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama

dengan pelarut.



Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk

atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals.

Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan

pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada

dalam molekul-molekul air atau metanol. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini

akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom.

Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.

Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC untuk melihat

seluruh proses

2.7 Diagram alir HPLC

Injeksi sampel

Injeksi sample seluruhnya bekerja secara otomatis sehingga kita tidak

mungkin mengetahui apa yang terjadi selama prose situ berlangsung, karena proses

ini meliputi tekanan.



Waktu retensi

Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju

detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu

dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang

maksimum, dari senyawa itu.

Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda.

Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung

pada:

tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari

pelarut)

kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga

pada ukuran partikel)

komposisi yang tepat dari pelarut

temperatur pada kolom

Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika kita

menggunakan waktu retensi sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-

senyawa.

Detektor

Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom.

Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan

ultra-violet.

Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang

gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom

dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, kita akan mendapatkan pembacaan

langsung berapa besar sinar yang diserap.



Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang

melewati berkas pada waktu itu. Kita akan heran mengapa pelarut yang digunakan

tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya, tetapi berbeda, senyawa-

senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari

specktrum UV.

Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan

air pada gelombang dibawah 190 nm. Jika kita menggunakan campuran metanol-air

sebagai pelarut, kita sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih besar

dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut.

Interpretasi output dari detektor

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-

masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan

menerap sinar UV. Sepanjang kita mengontrol kondisi kolom, kita dapat

menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang

diperoleh.Tentunya, kita sudah mengukur senyawa-senyawa murni tersebut dari

berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

Kita juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur

kuantitas dari senyawa yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa kita tertarik

dengan senyawa tertentu, misalnya X.



Jika kita menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang

telah diketahui jumlahnya pada instrumen, kita tidak hanya dapat merekam waktu

retensi dari senyawa tersebut, tetapi kita juga dapat menghubungkan jumlah dari

senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui

detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area

dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).

Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun

waktu retensi akan sama.

Misalnya,Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat

digunakan untuk mengetahui berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun

dalam jumlah kecil.

Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika kita mempunyai dua substansi

yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), dapatkah kita mengatakan jumlah



relatifnya? kita tidak dapat mengatakannya jika kita menggunakan serapan UV

sebagai metode pendeteksinya.

Dalam gambar,

area di bawah puncak Y lebih

kecil dibanding dengan area dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena

Y lebih sedikit dari X, tetapi bisa jadi sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada

panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin karena jumlah

besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah,ini akan hanya memberikan puncak

yang kecil.

2.8 Rangkaian HPLC pada spektrometer massa

Pada saat detektor menunjukkan puncak, beberapa senyawa sementara

melewati detektor dan pada waktu yang sama dapat dialihkan pada spektrometer

massa. Pengalihan ini akan memberikan pola fragmentasi yang dapat dibandingkan

pada data komputer dari senyawa yang polanya telah diketahui. Ini berarti bahwa

identifikasi senyawa dalam jumlah besar dapat ditemukan tanpa harus mengetahui

waktu retensinya.



Bagian-bagian instrument HPLC

Keterangan :

1. Botol pelarut (reservoir)

Botol untuk fase gerak (mobile phase) dapat berisi campuran eluen atau

eluen murni disesuaikan dengan kepentingan analisa.

2. Pompa (pump)

Pompa berfungsi untuk memompa baik eluen dan sampel yang

disuntikan melalui injektor. Sebagian besar pompa HPLC memiliki keluaran

tekanan (output pressure) 1000-6000 psi dan mampu menghasilkan aliran

sampai 20 mL/menit.

Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant

pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan

konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa

syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut



teratur (pulsating),oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau

peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor

yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya

ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang

tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.

3. Injektor (injector)

Injektor adalah tempat untuk menyuntikan sampel ke dalam kolom.

Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan

disturbansi yang minimum dari material kolom.

Ada dua model umum :

a. Stopped Flow

b. Solvent Flowing

Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

1) Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir,

sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan

karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi

2) Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang

digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada

kinerja sampai 60 -70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan

semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair.Partikel kecil dari septum yang

terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.

3) Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi

volume lebih besar dari 10 µ dan dilakukan dengan cara automatis

(dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil

dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi

kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel

akan masuK ke dalam kolom.



4. Kolom (coloum)

Kolom merupakan bagian yang sangat penting dari disebut cartridge,

ada pula yang terbuat dari stainless steel. Kolom terdiri dari fase diam (oktil,

oktadesil, fenil, nitril, amin, dll) yang terikat secara kimia dengan partikel-

partikel silika berpori yang terdapat dibagian dalam kolom.

Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan

kolom dan kondisi percobaan yang sesuai.

Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :

1) Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung

pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang

yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros

mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.

2) Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar

dan panjang kolom 25 -100 cm. Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel

dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga

digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi

penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung

pada model KCKT yang digunakan (Liquid Solid Chromatography, LSC;

Liquid Liquid Chromatography, LLC; Ion Exchange Chromatography, IEC,

Exclution Chromatography, EC)

5. Detektor (detector)

Detektor yang paling banyak digunakan adalah detector ultra violet

(UV)/Visible, fluorometer (terutama untuk zat yang memiliki panjang

gelombang eksitasi dan emisi) dan detektor indeks bias.

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di

dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis

kuantitatif). Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan

(noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons



untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan

fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.

Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel

panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa

dengan range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara

luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif

jika dibandingkan dengan detektor UV.

Detektor-detektor lainnya antara lain:

1) Detektor Fluorometer

2) Detektor Spektrofotometer Massa

3) Detektor lonisasi nyala

4) Detektor Refraksi lndeks

5) Detektor Elektrokimia

6) Detektor Reaksi Kimia

6. Komputer (PC) dan Printer

Komputer berisi software pengolahan data yang menampilkan grafik

dari pembacaan absorbansi sampel terhadap perubahan waktu. Grafik hasil

pembacaan disebut kromatogram.

2.9 Komponen Analisis HPLC

HPLC memiliki empat komponen dasar: sistem pengiriman pelarut untuk

memberikan kekuatan pendorong untuk fase gerak, sebuah sarana yang sampel

dapat diperkenalkan ke dalam pelarut, kolom, dan beberapa jenis detektor. Sebuah

perekam digunakan untuk menampilkan hasil dan integrator yang melakukan

perhitungan.

Kolom yang digunakan untuk pemisahan tertentu didasarkan pada jenis

molekul yang akan dianalisis. Berbagai jenis mode kromatografi dapat digunakan

untuk pemisahan molekul. Sebagai contoh, kolom pertukaran ion terpisah



dibebankan molekul seperti asam amino, protein, atau nukleotida. Ukuran polimer

organik pengecualian kolom terpisah seperti polyvinyls dan silikon atau biopolimer

seperti protein, asam nukleat, atau gula. Adsorpsi molekul kolom terpisah

berdasarkan interaksi mereka dengan fase diam. Mode ini berguna untuk

pemisahan vitamin, pewarna, lipid, fenol, dan antioksidan.

Pemisahan kolom digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan cara

bahwa pelarut menjadi dibagi menjadi lapisan stasioner dan mobile, dan berguna

dalam menganalisis steroid, aromatik, vitamin, dan antibiotik.

Molekul-molekul eluting dari salah satu dari berbagai jenis kolom ini

kemudian dianalisis oleh berbagai jenis detektor, mengukur absorbansi, fluoresensi,

atau elektrokimia atau properti radiokimia. Jenis lain dari detektor termasuk indeks

massa spektroskopi dan bias.

2.10 Aplikasi HPLC

Sebuah kemajuan terbaru dari HPLC telah pengembangan metode HPLC

dipisahkan oleh medan (DHPLC). prosedur ini dapat memisahkan molekul DNA

untai-ganda yang berbeda dengan sebagai sedikit sebagai salah satu pasangan

basa. Kecepatan analisis (sekitar 5 menit per sampel) dan ukuran fragmen DNA yang

dapat dianalisis (hingga 2,0 kilobyte) telah membuatnya menjadi metode yang

disukai untuk berbagai aplikasi dalam bidang biologi molekular.

Aplikasi dari DHPLC termasuk deteksi polimorfisme nukleotida tunggal

(SNP). Ini adalah satu variasi pasangan basa dalam DNA yang dapat memberikan

informasi yang berharga pada variasi genetik dalam populasi. Mereka juga dapat

membantu untuk mengidentifikasi gen yang menyebabkan penyakit manusia

tertentu.

Untuk menentukan apakah kedua gen kepentingan berbeda, mereka terlebih

diperkuat oleh reaksi berantai polimerase dan kemudian disuntikkan bersama-sama

ke dalam kolom terbalik-fase yang disebut. Dalam jenis kolom, fasa stasioner kurang



polar dari fase gerak, yang merupakan kebalikan dari pengaturan yang ditemukan di

kolom standar. Setelah gen yang disuntikkan, yang mengikat DNA pada fase

stasioner. Peningkatan suhu menyebabkan gen masing-masing untuk memisahkan

menjadi dua alur (fenomena yang disebut dipisahkan oleh medan). Setelah

didenaturasi, alur dapat memasuki fase gerak dan bergerak melalui kolom.

Pendinginan kolom menyebabkan untai gen untuk bergabung, dan DNA

pasang kembali ke kolom. Suhu dimanipulasi untuk membuat untaian terus terpisah

dan bergabung kembali, dengan saldo ditentukan oleh kekuatan daya tarik yang ada

antara untai. Jika dua gen yang persis sama, mereka akan menghabiskan lebih

banyak waktu dalam fase stasioner, dan elute dari kolom lebih lambat. Jika gen

berbeda bahkan oleh nukleotida tunggal, bagaimanapun, mereka akan

menghabiskan lebih banyak waktu dalam fase gerak, dan biarkan kolom lebih cepat.

analisis kromosom Y adalah salah satu alat molekul yang paling kuat untuk melacak

evolusi manusia.

Polimorfisme dalam kromosom Y manusia, terdeteksi oleh DHPLC, dapat

digunakan sebagai penanda untuk melacak evolusi manusia. Hal ini pada akhirnya

akan membantu untuk menjelaskan pola-pola asal-usul manusia, migrasi, dan

campuran. Kemampuan untuk secara cepat dan efisien SNP genotipe dengan

menggunakan DHPLC juga berguna dalam kedokteran, melalui identifikasi mutasi

yang mengakibatkan kerentanan terhadap penyakit tertentu atau yang

mempengaruhi tanggapan fisik terhadap obat tertentu.



BAB III

KESIMPULAN

1. HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid Cromatography, yaitu alat

yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam ( yaitu

sebuah tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu)

dengan memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom.

HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari

kromatografi kolom.

2. Prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang akan diuji

diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan

terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia ( analit ) sesuai dengan perbedaan

afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector

(spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias) pada panjang gelombang

tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh

recorder yang biasanya dapat ditampilkan menggungakan integrator atau

menggunakan personal computer (PC) yang terhubung online dengan alat HPLC

tersebut.

3. Keuntungan dari penggunaan HPLC yaitu :

Lebih teliti

Sudah digital sehingga penggunaannya cepat dan lebih praktis

mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran

mudah melaksanakannya

kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi

dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis

Resolusi yang baik



dapat digunakan bermacam-macam detektor

Kolom dapat digunakan kembali

mudah melakukan "sample recovery"

4. Kerugian dari penggunaan HPLC yaitu :

Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dulu

Hanya bisa digunakan untuk asam organic

Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan

gradien elusi.

Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang

terbatas

DAFTAR PUSTAKA



Basset,J.dkk.1994.Buku Ajar Vogel Analisis Kunatitatif Anorganik.

Jakarta: E.G.C.Penerbit Buku Kedokteran

Depkes RI Farmakope Indonesia,halaman 1061-1064

Cook Book.Atomatik Absorption Spectrometer Al 1200 ,buku satu.

http://www.chemistry.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromatografi1/kromatografi_cair_kinerja_tinggi_hplc/

Bidlingmeyer, Praktis HPLC Brian A. Metodologi dan Aplikasi: New. York John Wiley & Sons, 1992.

Underhill, A. Peter, Peidong Shen, Alice A. Lin, et al. "Kromosom Y Sequence Variasi dan Sejarah Manusia Genetika populasi. Sifat" 26 (2000): 358-361.

Gemboa Ana,2003, The Theory and Instrumentation of the AAS , www.physicspost.com/articles.php

http://www.cee.vt.edu/ewr/environmental/teach/smprimer/aa/aa.html .

http://infolab.uns.ac.id/?p=875

http://translate.google.co.id/translate?hl=id&langpair=en|id&u=http://www.pharm.uky.edu/ASRG/HPLC/HPLCMYTRY.html

http://www.lcresources.com/resources/getstart/generic%20HPLC.gif

http://translate.google.co.id/translate?hl=id&langpair=en|id&u=http://www.encyclopedia.com/doc/1G2-3406500142.html


http://translate.google.co.id/translate?hl=id&langpair=en%7Cid&u=http://www.encyclopedia.com/doc/1G2-3406500142.html

http://translate.google.co.id/translate?hl=id&langpair=en%7Cid&u=http://www.encyclopedia.com/doc/1G2-3406500142.html

http://www.lcresources.com/resources/getstart/generic%20HPLC.gif

http://translate.google.co.id/translate?hl=id&langpair=en%7Cid&u=http://www.pharm.uky.edu/ASRG/HPLC/HPLCMYTRY.html

http://translate.google.co.id/translate?hl=id&langpair=en%7Cid&u=http://www.pharm.uky.edu/ASRG/HPLC/HPLCMYTRY.html

http://infolab.uns.ac.id/?p=875

http://www.cee.vt.edu/ewr/environmental/teach/smprimer/aa/aa.html

http://www.physicspost.com/articles.php



bahan_hplc

Documents