Tokyo Metropolitan University

含窒素基を有する界面活性剤化合物を用いたドラッグデリバリーシステム

2014年7月11日（金）16：10～16：40

首都大学東京 大学院都市環境科学研究科分子応用化学域

准教授 朝山章一郎

首都大学東京・新技術説明会

1

超高齢・成熟社会を迎え、国民の健康維持と医療システムの課題が顕在化

①高QOL・均質医療への国民的欲求の増大

②医療費の適正な設計、医師不足・地域格差の解消

③医療機器・医薬品の不均衡な輸出入構造の解消

ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）

2

ＤＤＳの目的と要素技術

「必要な時に、必要な量の薬剤をターゲット部位に選択的に送達する」

薬剤放出技術

薬剤標的化技術

薬剤吸収制御技術

コントロールドリリース技術、徐放化技術、生物・化学・物理的応答薬剤など

能動標的（分子標的・抗体標識など）、受動標的（PEG応用など）、エネルギー併用DDS技術

薬剤の浸透、吸収制御（生物・化学的制御/物理エネルギー）、遺伝子導入・発現促進

3

☆ＤＤＳの市場は毎年二桁ペースで成長している。

☆2011年の世界市場は11兆2000億円。うち6兆4000億円が米国。3兆2000億円が欧州。残りが日本やアジア。

新たな創薬ターゲットが、がんやアルツハイマー型認知症といった「アンメット・メディカル・ニーズ（未だ満たされていない治療ニーズ）」の高い領域へシフト。

ＤＤＳの重要性

抗体医薬や核酸医薬などの新しい技術の応用の必要性

ＤＤＳの活用の期待

4

In vitro実験 In vivo実験 人体

細胞内動態制御 細胞外環境との適合性 臨床

臨床実験中の遺伝子キャリア

遺伝子キャリアの現状

5

Blood

Carrier Complex

+

Extracellular Space

核移行Cell

Nuclear

DNA

×分解

分解酵素

免疫反応×

免疫細胞

生体個体内への投与

・静脈注射・動脈注射・局所注射

…

Delivery!!

臨床応用可能な遺伝子治療を目指して・・・

血清安定性

細胞外マトリックス等の細胞外障壁の

通過

目的細胞表面まで到達

治療用遺伝子

In vivo 遺伝子デリバリー

6

6

Cationic Carrier

++

++

+Anionic DNA

－

－ －

－－

－

+ +

++ +

++

－

－－

－

－

－

Polyion Complex高効率遺伝子発現

複数のキャリアとDNAが多点で相互作用（架橋）した凝集体

粒径や表面特性の制御が困難

In vitro（培養細胞）

低効率遺伝子発現

In vivo（生体個体内）

多点での静電相互作用

細胞表面に直接投与 細胞表面までの到達が困難

多点ではなく一点で静電相互作用するDNAキャリアの創製

× Cell

Extracellular Space

Cell

Expression

従来技術とその問題点

7

本発明は、界面活性剤様化合物に関し、さらに詳し

くは、生体適合性及び血液中での安定性が高く、カ

チオン過剰による毒性が低く、小粒子径で標的部位

に移送され易く、標的部位での発現効率が高い核酸

複合体を形成することができる界面活性剤様化合物

に関するものである。

多点ではなく一点で静電相互作用するDNAキャリア

界面活性剤様化合物（特願2013-56436）

8

S. Asayama, T. Hakamatani, H. Kawakami, Bioconjugate Chem., 21, 646-652 (2010)：特開2009-298731

Alkylated Poly(1‐vinylimidazole) 

H 2

N

N

N

CH

C H 2 CH

Cn m

N+

102

103

104

105

RLU

/mg

prot

ein

106

107

PVIm-Me

PVIm-Et

PVIm-Bu

PVIm-Oc

DNAalone

4 12+/- Ratio of PVIm-R/DNA

Complexes

1 PEI+/-=8

H 2

N

N

N

CH

C H 2 CH

Cn m

N+

(   )n

0

20

40

60

80

100

120

0 100 200 300 400Concentration [g/mL]

Cell Viability [%

]

PEIMeEtBuOc

本研究グループにおける先行技術9

含窒素基を有する界面活性剤化合物

生体適合性(PEG)

分解保護・免疫反応抑制

相互作用点（分子末端のみ）

モノイオンコンプレックス形成(C H 2CH 2O )nCH 3O CH 2CH 2CH 2NH

CO

R

N CH2C

OHN

N(CH2)nCH 3

静電相互作用（モノカチオン/リン酸間）

Mono‐Cation Alkylated‐PEG

R =

疎水性相互作用（アルキル鎖/塩基対間）水素結合(アミド/DNAグルーブ間)

①「モノイオンコンプレックス」の形成

②DNA鎖内の静電反発の抑制による粒径の減少

細胞外マトリックスなどの障壁の効率的な通過

本研究のコンセプト：モノイオンコンプレックス(MIC)

10

アルキルイミダゾリウム末端修飾PEG/pDNA MIC

＋

Single DNA Mono‐ion Complex (MIC)

微小粒径・生体適合性DNA修飾体の構築（分子末端修飾によるDNA間の架橋抑制）

Unimolecular Modification+

R‐Im‐PEG

++

モノイオンコンプレックス形成 生体適合性

m=0: Me‐Im‐PEG  m=1: Et‐Im‐PEG  m=3: Bu‐Im‐PEG  m=7: Oc‐Im‐PEG 

N CH2 CONHCH2CH2CH2 (OCH2CH2)n OCH3

NCH3(CH2)m

アルキルイミダゾリウムとDNAリン酸アニオンとの静電相互作用の調節

11

DCC

DMF+

Imidazol‐1‐yl‐Acetic Acid NHS

Im‐PEGPEG‐NH2

N

NOH

O

N OO

OH

N

NO

ON

O

O

OCH3O n N

HCO

N

NOCH3O n NH2

Active Ester

Bu‐Im‐PEG

Oc‐Im‐PEG

DMF

Bromobutane

Bromooctane

DMF

DMF

OCH3O n N

HCO

N

N(CH2)3CH3

OCH3O n N

HCO

N

N(CH2)7CH3

含窒素基を有する界面活性剤化合物の合成

アルキルイミダゾリウム末端修飾PEGの合成スキーム

12

アガロースゲル電気泳動によるMIC形成能評価

Charge Ratio ( [Alkylimidazolium]R‐Im‐PEG/[Phosphate]DNA ) 

pDNA 0.1    0.5       1        2        8       16       32     64Loading

pDNA 0.1   0.5    1      2      4       8    16     32    64   128Loading

LoadingpDNA 0.1    0.5     1       2       4       8      16     32    64

Me‐Im‐PEG

Et‐Im‐PEG

Oc‐Im‐PEG

pDNA 0.1   0.5      1       2       4       8      16     32    64Loading

Bu‐Im‐PEG

NN

CH3

NN

CH3CH2

NN

CH3(CH2)3

NN

CH3(CH2)7

13

CDスペクトルによるMIC形成能評価

pDNA 0.1   0.5      1       2       4       8      16     32    64Loading

Bu‐Im‐PEGCharge Ratio ( [Alkylimidazolium]R‐Im‐PEG/[Phosphate]DNA ) 

① Particle Size: 13.0±1.1 nm ( Charge Ratio: 64 )

‐4

‐2

0

2

4

6

8

230 250 270 290 310

Naked pDNA BuIm‐PEG/pDNA complex(+/‐=64)

Wavelength /nm

[θ]×

10‐3/deg

・cm

2 ・dm

ol‐1

② CD Spectra 

①負のコットン効果の出現

②ブルーシフト

B型（水和型）↓

A型（脱水型）

H2O

H2OH2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

水溶液中での水和コンフォメーション

Bu‐Im‐PEG

Bu-Im-PEG存在下における脱水和効果

Discussioin

Bu-Im-PEGによるDNA修飾に成功

14

0

20

40

60

1 10 100 1000 100000

20

40

60

1 10 100 1000 100000

20

40

60

1 10 100 1000 10000

個数

分布

(%)

粒径 (nm) 粒径 (nm) 粒径 (nm)

a) +/‐ = 0.5 b) +/‐ = 1.0 c) +/‐ = 2.0

33.3±11.1 nm 47.3±6.7 nm27.2±7.2 nm

Bu-Im-PEG/pGL3修飾体の粒径

pDNA 0.1   0.5      1       2       4       8      16     32    64Loading

Bu‐Im‐PEG

NN

CH3(CH2)3

高い電荷比においてBu-Im-PEG/pDNA修飾体が形成した

→ 電荷比0.5, 1, 2の低い電荷比における修飾体の形成を確認する

Charge Ratio ( [Alkylimidazolium]R‐Im‐PEG/[Phosphate]DNA ) 

粒子径測定によるMIC形成能評価

15

②皮内注射

③ Luciferase Assay

手順

pGL3 5μg + Bu‐Im‐PEGmixture

①複合体調製

Incubationfor 24 hours

Incubationfor 2days

106

105

104

103PBS Naked

DNA0.5 1 2

BuIm‐PEG: Charge Ratio(+/‐)

RLU / mg protein

電荷比(+/-) 1 において naked DNA を有意(*p=0.06)に上回る遺伝子発現

+/-1 において最適な粒径とPEG密度

*

MICによるin vivo遺伝子導入

16

Mono‐ion Complex

アルキルイミダゾリウム末端修飾PEGによるDNA一分子修飾に基づく約30nmの微小な粒子径が組織への拡散性を向上

DNAモノイオンコンプレックスはin vivo遺伝子デリバリーシステムの構築に向けて有効な手段

皮内投与の応用展開

○ 感染性疾患や腫瘍に対するDNAワクチン製剤の開発

○ 皮膚の再生医療（創傷治癒）への展開

電荷比(+/-) 1 において naked DNA を有意(p=0.06)に上回る遺伝子発現

含窒素基を有する界面活性剤化合物を用いたDDS

17

新技術の特徴

(1)30nm程度の微小粒径のプラスミドDNA複合体の調製

(2)一つの正電荷と一つの負電荷による静電相互作用による複合体（モノイオンコンプレックス）の調製

(3)生体適合性高分子による非共有結合的な生体高分子の修飾

⇒In vitroで高効率な遺伝子キャリアがinvivoでは発現が低下されるのは、従来技術のポリイオンコンプレックス形成に問題があると考え、遺伝子とキャリア間の架橋を抑制

18

遺伝子治療

RNA干渉mRNAデリバリー

皮下・皮内・静脈・動脈・筋肉内への注射、経粘膜投与、脳内投与、腫瘍内投与など

UnimolecularModification

非共有結合的なDNAのラベル化による分析化学への応用

In vivo遺伝子デリバリーシステムへの展開

核移行性遺伝子デリバリーシステムの構築

蛍光分子

核移行性分子

ImagingFunctionate DNA

効率的な核移行

DNAモノイオンコンプレックスの確立により核酸修飾への幅広い展開が可能

含窒素基を有する界面活性剤化合物を用いた核酸修飾

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想定される用途

(1)核酸治療薬のドラッグデリバリー用途

本発明の界面活性剤様化合物を用いて形成された上記複合体はカチオン過剰による毒性がなく、且つ、ポリエチレングリコール基など生体適合性を有する親水性基を具備することで生体適合性及び血液中での安定性が高く、ドラッグデリバリー用として好ましい。

上記複合体の投与は、皮下、皮内、静脈、動脈または筋肉内への注射、経粘膜（口腔、鼻、肺、眼、直腸、子宮など）投与、脳内投与、腫瘍内投与などにより行うことができる。

(2)タンパク質医薬のドラッグデリバリー用途

(3)固相基板への生体適合性の付与20

実用化に向けた課題

(1)界面活性剤様化合物の分子構造の最適化

(2)プラスミドDNAとの新規概念の電解質複合体であるモノイオンコンプレックスの安定性の向上を含めた構造活性相関

(1)モノイオンコンプレックスの体内動態解析および、遺伝子発現部位の特定

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企業に期待すること

本発明の界面活性剤様化合物は、生体適合性高分子であるポリエチレングリコール（PEG）の誘導体です。従いまして、各種界面活性剤、または、各種PEG誘導体を御販売している貴社において、商品の一つのシリーズとして、御取扱い頂けることを希望します。

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関連する学術文献・知的財産権

＜学術文献＞S. Asayama, A. Nohara, Y. Negishi, and H. Kawakami,Alkylimidazolium End-Modified Poly(ethylene glycol) to Form theMono-Ion Complex with Plasmid DNA for In Vivo Gene Delivery,Biomacromolecules, 15, 997-1001 (2014).

＜知的財産権＞発明の名称：界面活性剤様化合物出願番号：特願2013-056436出願人：公立大学法人 首都大学東京発明者：朝山章一郎、野原 敦、川上浩良、根岸洋一

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お問い合わせ先

首都大学東京 ＵＲＡ室 研究支援係主任ＵＲＡ 阿部 紀里子

T E L : 042-677-2759F A X : 042-677-5640E-mail: abe-kiriko@jmj.tmu.ac.jp

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