結核菌藥物感受性試驗

長庚紀念醫院 醫檢部

郭安靜

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大綱 • 結核菌藥物感受性原理

• 結核菌藥物感受性操作流程

• 結核菌藥物感受性品管作業

• 結核菌藥物感受性試驗判讀

• 重要事項提醒

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結核菌藥物感受性原理

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建議使用時機 • 第一套分離的MTBC

• 治療失敗或是治療三個月未陰轉

• 臨床治療没有反應，醫師要求作藥敏試驗

• MDR-TB指對isoniazid, rifampicin呈抗藥

• XDR-TB指MDR-TB再加上一種fluoroqguinolone及一種第二線針劑(如capreomycin, kanamycin, amikacin)呈抗藥性

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CLSI-M24 A2 • M. tuberculosis complex

• 瓊脂平板法 Agar proportion method

o Middlebrook 7H10 medium

o Middlebrook 7H11 medium

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臨界濃度Critical concentration • 可以抑制95%特定菌種野生株生長的濃度

• The lowest concentrations of drugs that inhibit 95% of wild strains of M. tuberculosis that have never been exposed to the drugs.

CLSI M24-A2

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Resistance of agar proportion

method • Growth of greater than 1% of an inoculum of bacterial cells in the presence of a critical concentration of antituberculous drug.

• 大於1%的細菌出現在抗結核桿菌群的藥物臨界濃度下。當用來測試的臨床分離菌株暴露在藥物臨界濃度下，菌株生長超過1%，則該藥物即不適合繼續當做抗結核治療藥物。

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CLSI M24-A2 傳染病標準檢驗方法手冊

適用濃度

8 CLSI M24-A2

Not recommended

瓊脂平板法Agar proportion

method

• 經過消化去汙處理且抹片鏡檢陽性檢體

直接法

Direct testing

• 從固態培養基純化之MTBC菌株

間接法

Indirect testing

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藥物感受性試驗快速方法 • 美國 FDA核准液態培養系統

o BACTECTM 460

o BACTECTM MGITTM 960

o VersaTREK®

• 結果與瓊脂平板法結果呈現相關

• 若有抗藥結果可以先發初報，但需使用瓊脂平板法再行確認。

• 液態培養系統結果有疑義或有其他新的藥物需要測試時，都需使用瓊脂平板法。

10 CLSI M24-A2

結核菌藥物感受性操作流程

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四分格培養基

不含藥培養基

（control）

0.2 μg/mL Isoniazid（INH）

1.0 μg/mL Rifampin（RMP）

1.0 μg/mL Isoniazid（INH）

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2.0 μg/mL Streptomycin（SM）

10.0 μg/mL Streptomycin

（SM）

10.0 μg/mL Ethambutol

（EMB）

5.0 μg/mL Ethambutol（EMB）

接種菌液製備—固態培養基

• 足量新鮮pure菌落(不要超過4-5週)

• 盡可能挑取大範圍菌落

• 不要刮到培養基

• 盡可能使用初次培養基，使用液態次培養菌液可能因慢速生長菌落不足導致false-susceptible

1.刮取新鮮菌落

• 16*125 mm無菌試管

• 3~5 mL無菌水或生理食鹽水或PBS

• 6~10顆玻璃或塑膠珠 (直徑3 mm)

• 濃度大於McFarland No. 1

• 整個操作過程須避免噴濺及飛沫產生。

2. 加入試管

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操作時，物品擺設及動線設計勿使手越過無菌區，例如已開蓋朝上的檢體及蓋子。

file:///E:/結核分枝桿菌檢驗作業/結核分枝桿菌檢驗作業(藥敏試驗).wmv

接種菌液製備—固態培養基 •使用接種環將菌落沿管壁乳化(emulsify)

•確認上蓋鎖緊

•使用振盪器以足夠速度、漩渦式離心混合1-2分鐘

•震盪時保持液面不超過試管2/3高度

•避免菌液翻騰以減少氣膠生成

3.混合菌液

• 靜置30分鐘或以上，讓大菌落沉降，避免開蓋時氣膠溢散。

• 試管拿起時宜輕緩，勿使已沉澱的大顆粒漂浮在要吸取的菌液中。

4.靜置沉降

• 取上清液至另一無菌管

• 以加入無菌水方式調整濃度至0.5~1 McFarland 5.調整濃度

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接種與培養 •無菌水或生理食鹽水或PBS

•以調整好濃度的菌液進行系列稀釋成10-2與10-4 1.系列稀釋

• 以無菌微量吸管吸取0.1 mL10-2稀釋液(106CFU/mL)至含藥與不含藥培養基；或以無菌吸管於各培養基不同處接種3滴。(可輕微搖晃，使菌液均勻散開)

• 以相同方式將10-4稀釋液(104CFU/mL)接種到另一套含藥與不含藥培養基

2.接種

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Modified indirect susceptibility method: 10-2稀釋液接種到含藥與不含要培養基，10-4稀釋液只接種到不含藥培養基。

•沿管壁混合均勻，須更換drop。 •連續稀釋時稀釋倍數須精確及須確實混合均勻 •操作過程須避免噴濺及飛沫產生 •dropper丟入有裝消毒劑的桶子內，注意丟棄動線沒有因dropper內的殘留液體，產生噴濺至操作台上的檢體及培養基的疑慮。

接種與培養 •培養基需正面向上擺放至水份已經被培養基吸收

•將培養基放入二氧化碳可以進入的PE塑膠袋封口 3.密封

•將培養基正面向下放入培養箱培養

•36℃+/-1℃、5-10% CO2 •培養基須避免暴露於陽光下以防止甲醛氣體生成

4.培養

• 為了避免視覺干擾，可以將放置培養基的塑膠袋從培養箱取出，正放方式在室溫下放置數小時或overnight

• 利用解剖顯微鏡每週觀察

5.觀察

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結核菌藥物感受性品管作業

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品管菌株種類 • Pan-susceptible菌株

o M. tuberculosis H37Rv (ATCC 27294)

o M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177)

• 抗藥菌株

o 可考慮選擇單抗低濃度INH菌株(ATCC BAA-812)

o 安全考量下，不建議使用具二種藥物之抗藥性菌株

• 若無法取得標準菌株，可從能力試驗菌株或臨床經過確認的菌株挑選

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品管菌株使用 • 執行頻率

o 新批號培養基(培養基或藥物)

o 若病人檢體每週操作，M. tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) 至少需每週執行一次。

o 抗藥菌株執行頻率可以減少

• 避免繼代培養以減少突變機會

o 菌株以多管小量分裝於-60℃以下且不會自動除霜冰箱(-20℃可保存期限短)

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結核菌藥物感受性試驗判讀

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生長情形記錄 生長情形 記錄方式

>500 colonies

(confluent growth) 生長融合

4+

200-500 colonies

(almost confluent growth)

幾乎融合

3+

100-200 colonies 2+(建議實際計數菌落數)

50-100 colonies 1+(建議實際計數菌落數)

判讀時間 • 每週觀察，若有汙染可提早處理。觀察時間以三週為限。

• 如果不含藥培養基已有50個菌落，可於三週內發出抗藥報告；敏感結果則需觀察滿三週確認後才可發出。

• 21天菌株生長不佳，不建議再放至28天觀察

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判讀條件 • 品管菌株

o 通常10-2不含藥培養基需有200-400個菌落生長，10-4不含藥培養基需有20-40個菌落生長。

Clinical Microbiology Procedure Handbook, 2010

• 臨床菌株

o 不含藥培養基至少需有50個菌落生長 (實際作業建議至少有100個菌落生長)

o 不含藥培養基需有分開可數的菌落

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判讀方法 • 以計算百分比決定抗藥與否

10-2/10-4X

10-2 含藥/10-4control*100

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判讀方法 • 以不含藥培養基生長數達100個菌落以上且可數之稀釋濃度比較為原則

• 如果同稀釋倍數無法計數時，可計算不同濃度的菌落數後乘以稀釋倍數進行比較

• 需要重新操作

o 不含藥培養基菌落數生長不足

o 當10-2與10-4 菌落數不成比例而影響結果判讀時

o 當計算之抗藥菌落數比率在1%附近易有疑義時

o 含藥培養基比不含藥培養基生長量少，但不含藥培養基生長融合無法計算菌落數時

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結果判讀--範例一

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以不含藥培養基生長數達50個菌落以上且可數之稀釋濃度比較為原則

結果判讀--範例二

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如果同稀釋倍數無法計數時，可計算不同濃度的菌落數後乘以稀釋倍數進行比較。

結果判讀--範例三

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如果同稀釋倍數無法計數時，可計算不同濃度的菌落數後乘以稀釋倍數進行比較。

重要事項提醒

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菌落型態確認 • MTBC菌落型態認知

• 單一型態確認

o 建議使用解剖顯微鏡

o 結果無法判讀時，不可由含藥的培養皿直接調菌再作藥敏

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操作細節 • 振盪器振盪時間不足

o 振盪器振盪須配合使用計時器

• 濁度調整不正確(過度接種)

o 調濁度時，使用濁度計輔助。

• 連續稀釋時稀釋倍數不精確及未確實混合均勻

o 稀釋倍數須正確及確實的連續稀釋

o 使用塑膠滴管置換儘可能大量的混合均勻， 同時要避免氣泡及飛沫、噴濺的產生。

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操作細節 • 接種時超過3滴

o 接種量須確實

o 等量接種

• 未確實計算菌落數目

o 確實計算菌落數目，由 10‐2及10‐4的結果正確綜判藥敏結果。

• 生安問題: 操作過程噴濺及飛沫產生

o 加強優良微生物技術

o 加強生安訓練及落實操作過程防止噴濺及飛沫產生

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敬請指教!!

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