PENENTUAN KADAR PARASETAMOL DAN KAFEIN MENGGUNAKAN INSTRUMEN HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

Laporan Praktikum

diajukan untuk memenuhi tugas mata kuliah Praktikum Kimia Instrumen dengan dosen pengampu Dra. Soja Siti Fatimah, M.Si.

Tanggal Praktikum : 16 Februari 2015

Disusun oleh:Kelompok 3Dinar Khairunisa1307218

Esti Septiani1301972

Fadhila Azzahra M1303859

KIMIA C 2013

PRODI KIMIA DEPARTEMEN PENDIDIKAN KIMIAFAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS PENDIDIDKAN INDONESIA2015

Tanggal Praktikum : 16 Februari 2015

Judul Praktikum :Penentuan Kadar Parasetamol dan KafeinMenggunakan Teknik HPLC

Tujuan Praktikum :1. Memahami cara kerja instrumen HPLC untuk analisis kuantitatif.2. Dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat, serta dapat mengikuti manual pengoperasian HPLC.3. Dapat menentukan/menghitung kadar zat aditif dalam sampel minuman.

A. DASAR TEORI

Kromatografi adalah metode suatu proses fisik yang digunakan untuk memisahkan komponen-komponen dari suatu campuran senyawa kimia. Dalam kromatografi, campuran tersebut dibuat sebagi zona yang sempit (kecil) pada salah satu ujung media porus seperti adsorben, yang disebut alas atau landasan kromatografi. Zona campuran kemudian digerakan dengan larutan suatu cairan atau gas yang bergerak sebagai pembawa, melaui media porus tersebut, yang berupa partikel-partikel yang diam (tidak bergerak, statisiones). Sehingga akibatnya masing-masing komponen dari campuran tersebut akan terbagi (terdistribusi) secara tidak merata antara alas yang diam dan cairan atau gas yang membawanya. Akibat selanjutnya, masing-masing komponen akan bergerak (bermigrasi) pada kecepatan yang berbeda (differential migration) dan dengan demikian, akan sampai pada ujung lain dari alas tersebut pada waktu yang berlainan, dan dengan demikian terjadilah pemisahan diantara komponen-komponen yang ada. (Bahti, Husein H. 2011: 4).Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen campuran yang berdasarkan distribusi diferensial dari komponen-komponen sampel diantara dua fasa, yaitu fasa gerak dan fasa diam. Salah satu teknik kromatografi yang dimana fasa gerak dan fasa diamnya menggunakan zat cair adalah HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau didalam bahasa Indonesia disebut KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi).Teknik HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kualitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas area standar. Pada prakteknya, metode pembandingan area standar dan sampel kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan suatu konsentrasi standar. Oleh karena itu, dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi. (Wiji, dkk. 2010 : 17).HPLC yang modern telah mucul akibat pertemuan dari kebutuhan, keinginan manusia untuk meminimalis pekerjaan, kemampuan teknologi, dan teori untuk memandu pengembangan pada jalur yang rasional. Jelas sebelum era peralatan yang modern bahwa LC (Liquid Chromatography) memiliki kekuatan pemisahan yang sangat ampuh, bahkan untuk komponen-komponen yang berhubungan sangat erat. LC harus ditingkatkan kecepatannya, diotomasasi, dan harus disesuaikan dengan sampel-sampel yang lebih kecil, waktu elusi yang beberapa jam (Underwood, Day. 2002 : 553).HPLC berbeda dari kromatografi kolom cairan konvensional dalam hal digunakan bahan pengisi kolom berupa partikel yang sangat kecil berukuran sampai 3-5 m (1m = 10-6 m). Sehingga mengharuskan digunakannya tekanan tinggi sampai 20.000 Kpa ( 200 atmosfir) untuk mengalirkan fasa gerak melalui kolom tersebut.Ternyata, penggunaan bahan pengisi kolom yang lebih kecil ini bukan saja telah memperbaiki kecepatan analisis, tapi (dari ini yang lebih penting) ialah telah menghasilkan suatu teknik dengan daya pisah yang tinggi. HPLC mempunyai kelemahan- kelemahan yang diantaranya, peralatannya lebih rumit, tidak murah, dan perlu pengalaman. Untuk beberapa jenis zat, metode ini kurang sensitif. Selain itu sampel disyaratkan harus stabil dalam larutan. Berdasarkan kepolaran fasa geraknya, HPLC dibagi menjadi 2 macam yaitu :a) Fase Normal HPLCHPLC jenis ini secara esensial sama dengan kromatografi kolom. Meskipun disebut normal, ini bukan bentuk biasa dari HPLC. Kolom ini diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut nonpolar seperti heksan sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4,6 mm (dan kemungkinan kurang dari nilai ini) dengan panjang 120 nm-250 nm. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom. Apabila pasangan fasa diam lebih polar daripada fasa geraknya maka sistem ini disebut HPLC fase normal.b) Fase Balik HPLC Pada HPLC jenis ini, ukuran kolomnya sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan hidrokarbon dengna rantai panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Dalam kasus ini, akan terdapat interaksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Interaksi yang terjadi tidak sekuat interaksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fasa diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu molekul-molekul polar akan lebih cepat bergerak melalui kolom. Sedangkan molekul-molekul non polar akan bergerak lambat karena interaksi dengan gugus hidrokarbon.

Terdapat beragai zat aditif yang digunakan oleh produsen makanan dan minuman diantaranya : natrium benzoat, vitamin c, dan kafein untuk masing-masing tujuan tertentu. Ketiga zat aditif tersebut merupakan senyawa yang memiliki sifat kepolaran yang berbeda, dan memiliki gugus kromofor yang menyebabkan senyawa tersebut dapat menyerap sinar UV. Berdasarkan karakteristik senyawa ini memungkinkan dilakukan analisis dengan teknik HPLC yang menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar. Vitamin C atau asam askorbatVitamin berupa kristal putih dengan rumus molekul C6H8O6, larut dalam air dan alkohol, dialam ditemukan dalam buah-buahan dan sayuran, dapat disintesis dari glukosa. Vitamin C merupakan komponen esensial makanan manusia untuk perawatan kulit. Kekurangan vitamin ini dapat menimbulkan sariawan, luka pada gusi, badan kurus, dan anemia. Setiap hari diperluka 70-100 mg.Vitamin C adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa geak polar seperti metanol atau air.

Natrium Benzoat atau natrium benzena karboksilatKristalin tanpa warna atau atau serbuk amorf putih, C6H6COONa. Larutan dalam iar dan sedikit larut dalam etanol. Senyawa ini dibuat melalui reaksi natrium hidroksida dengan asam benzoat dan digunakan dalam industri zat warnadan sebagai pengawet makanan. Zat ini dulu digunakan sebagai antiseptik.

KafeinSuatu alkohol dengan rumus molekul C5H10N4O2. Berupa padatan kristal berwarn aputih dan berasa pahit, ditemukan dalam daun dan biji dari pohin kopi, dalam daun teh, dalam biji kola.

Reservoir PelarutJumlah reservoir pelarut : (1) bisa salah satu atau lebih; berisi pelarut organik seperti heksana, atau air, atau campuran air dan pelarut organik seperti metanol,tergantung kepada apakah kita bekerja menggunakan fasa normal atau fasa terbalik atau metode kromatografilainnya.Bila sistem KCKT dilengkapi dengan alat pencampuran (2) (atau mempunyai lebih dari satu pompa) yang memungkinkan membuat campuran-campuran pelarut dengan komposisi yang diatur dengan bantuan suatu programener, maka diperlukan lebih dari satu reservoir, sistem ini diperlukan untuk melakukan elusi bergradien dimana komposisi pelarut diubah-ubah selama pengelusian.Pelarut fasa gerak dipompa dari reservoir oleh sistem pompa, demikian sehingga campuran pelarut dengan komposisi tertentu dapat mengalir tanpa denyutan (pulseless). Kecepatan aliran dapat diatur antara 0,1 10 mL/menit.Gas yang terlarut dalam pelarut fasa gerak yang digunakan harus dibuang terlebih dahulu (de-gassing), selain itu, pelarut harus di saring dahulu agar bebas dari partikel-partikel kecil yang tidak larut.Pada saluran-saluran pelarut biasanya dipasang saringan (berukuran 2-10 m) untuk mencegah partikel-partikel kecil yang tidak larut tadi, masuk kedalam kolom. Saringan ini harus diganti atau dibersihkan bila terjadi penyumbatan.Diantara jenis-jenis pompa yang paling umum digunakan untuk sistem HPLC adalah jenis pompa isap dan tekan (reciprocating).Pompa isap dan tekan yang sederhana mempunyai kecepatan isap yang tetap. Artinya, waktu yang diperlukan untuk langkah mengisis sama dengan waktu untuk langkah memompa. Pompa seperti ini memerlukan perendam denyutan yang baik. Oleh karena itu, pompa jenis ini umumnya menggunakan dua pengisap yang masing-masing bekerja kebalikan satu dari yang lainnya. Setiap pengisap memppunyai dua katup pengendali.Pelarut diisap ke dalam ruang pengisap melalui katup pemasukkan dan kemudian ditekan ke luar melalui katup pengeluaran. Untuk melakukan elusi bergradien diperlukan dua sistem pompa yang masing-masing mempunyai satu atau dua penghisap. Ada dua macam rancangan utama pompa gradien yaitu pecampuran tekana tinggi yang mempunyai hantaran dua pompa dan pencampuran tekana rendah dengan hantaran satu pompa.Rancangan pompa gradien yang pertama, yakni sistem pencampuran tekanan tinggi, mempunyai dua pompa dan satu pengendali, masing-masing pompa menghantarkan satu sistem pelarut. Fungsi pengendali adalah mengatur kecepatan aliran masing-masing pelarut sesuai dengan komposisi yang diinginkan dan juga berfungsi untuk menjamin terjadinya pengadukan yang baik oleh suatu pengaduk dinamik. Setiap pompa mempunyai dua penghisap dan setiap penghisap mempunyai dua katup. Jenis yang kedua, pompa pembagi bertekanan rendah hanya mempunyai satu penghisap. Untuk melakukan elusi gradien hanya diperlukan satu pompa. Pompa ini mempunyai katup pembagi, tidak mempunyai pengendali gradien.Dengan katup-katup pembagi dimungkinkan untuk membuat suatu campuran terner (tiga jenis pelarut) dengan perbandingan yang diinginkan. Jadi untuk melakukan gradien gradien tidak diperlukan lebih dari satu pompa. Katup-katup pembagi ini dikendalikan oleh suatu microprocessor dan terbuka selama langkah pemasukan pelarut. (Bahti, Husein. H . 2011 : 34-40)

Prinsip kerja instumentasi HPLCHPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari sebuah campuran komponen (analit). Prinsip keja HPLC adalah pemisahan setiaap komponen dalam sampel berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yang biasa digunakan (pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik adalah RMe2SiCl, dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C8. Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi), misalnya : air:asetonitril (80:20), hal ini bergantung pada kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan waktu retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang punsak-puncaknya terpisah.Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan komponen-komponen terjadi karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Keunggulan menggunakan HPLC dibandingkan kromatografi gas yaitu terletak pada kemampuannya untuk menganalisis cuplikan yang tidak menguap dan labil pada suhu tinggi. HPLC tidak terbatas pada senyawa organik tapi mampu menganalisis senyawa anorganik, mampu menganalisis cuplikan yang mempunyai molekul tinggi (beratnya), mampu menganalisis cuplik yang mempunyai titik didih yang sangat tinggi seperti polimer.

Cara kerja instumentasi HPLC Prinsip kerja alat HPLC adalah pertama fasa gerak dialirkan melalui kolom kedetektor dengan bantuan pompa. Kemudian cuplikan dimasukan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran karena perbedan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu. Sebaliknya solut-solut yang interaksinya kuat dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen yang campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.

Gambar skema instrumentasi HPLCKomponen-komponen instrumentasi HPLC1. Fasa Gerak

Fasa gerak dari HPLC merupakan zat cair yang disebut eluen atau pelarut. Dalam HPLC fasa gerak selain berfungsi untuk membawa komponen-komponen campuran menuju ke detektor, selain itu juga dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penetu keberhasilan proses pemisahan. Persyaratan zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak sebagai berikut:a) Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisisb) Zat cair harus murni, untuk menghindari masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatogramc) Zat cair harus jernih, untuk meghindari penyumbatan pada kolomd) Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracune) Zat cair tidak kental dan harus sesuai dengan detektor

Fasa gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil. Selain itu adanya gas dalam fasa gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama do pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fasa gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien diguakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan buffer dengan metanol atua campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fasa gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding fase terbalik.

2. Kolom

Kolom HPLC biasanya terbuat dari stailess steel, akan tetapi ada juga yang terbuat dari gelas berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa diam, tepat terjadinya pemisahan campuran menjadi komponen-komponen. Bergantung keperluannya kolom utama dapat digunakan untuk analisis atau preparatif setiap komponen yang keluar kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan dengan fraction colector selain kolom utama dikenal pula kolom pengaman.Kolom utama berisi fasa dian dan jenisnya bervariasi bergantung pada keperluan, misalnya dikenal kolom C8, C-18, cyanopropyl, dan penukar ion. Kolom utama untuk HPLC biasanya berukuran panjang berkisar antara 5-30 cm dan diameter dalam berkisar 4,510 mm.Kolom pengaman (guard coloumn) disebut juga pra-kolom karena letaknya sebelum sistem pemasukan cuplikan. Kolom ini berukuran pendek 5 cm dengan diameter 4,6 mm biasanya dipaking dengan partikel silika berukuran besar dari ukuran partikel kolom utama. Kolom pengaman mempunyai dua fungsi yaitu: menyaring kotoran yang terbawa oleh fasa gerak dan untuk menjenuhkan fasa gerak dalam rangka menghindarkan terjadinya erosi fasa diam oleh aliran pelarut. Kolom merupakan jantung kromatograf, keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pilhan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :a) Kolom analitikGaris tengah dalam 2-6 mm, panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm, untuk kemasan mikropartikel berpori biasanya 10-30 cm.

b) Kolom preparatifUmumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar, dan panjang 25-100 cm.

3. Pompa

Pada HPLC, pompa ini berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Digunakan pompa bertekanan tinggi dalam metode ini sebagai akibat penggunaan fasa gerak yang berupa zat cair yang akan sukar mengalir dalam kolom yang dipadatkan dengan serbuk halus. Oleh karena itu, agar zat cair dapat melewati kolom secara tepat maka dibutuhkan bantuan pompa yang bertekana tinggi. Pompa yang digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan sebagai berikut :a) Menghasilkan tekanan sampai 5000 psib) Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menitc) Bahan tahan korosid) Keluaran bebas pulse

Dikenal 3 jenis pompa yang masing-masing memiliki keuntungan yaitu :a) Pompa ReciprocatingPompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston maju mundur yang dijalankan oleh motor. Gerakan piston memberikan aliran eluen yang konstan, memiliki volume internal kecil (35-400 mL) menghasilkan tekanan tinggi (sampai 10.000 psi). Piston berupa batang gelas dan berkontak lengsung dengan pelarut.

b) Pompa DisplacementPompa ini menyerupai syringe (alat suntik) tersiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Menghasilkan aliran yang cenderung tidak tergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut. Memiliki keterbatasan kapasitas pelarut ( 250 mL) dan tidak mudah untuk pergantian pelarut.

c) Pompa PneumaticDalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi.Pompa jenis ini murah, tetapi memiliki keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (