项目十七大肠菌群计数

项目十七大肠菌群计数

学习任务任务 1. 学习大肠菌群的检验方法。任务 2. 学习配制乳糖胆盐培养基。任务 3. 学习配制伊红美蓝琼脂培养基。任务 4. 学习对大肠菌群的判断及计数。

任务要求：掌握大肠菌群的检验方法。掌握乳糖胆盐培养基的配制。掌握伊红美蓝琼脂培养基的配制。掌握大肠菌群的判断及计数。


项目相关知识：项目相关知识：1. 大肠菌群：一群能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中是否有污染肠道致病菌存在。食品中大肠菌群数系以100mL （ g ）检样内大肠菌群最可能数（ MPN ）表示。2. 国标中大肠菌群计数方法有： MPN 计数法和平板计数法


3. 革兰氏染色（ 1 ）所需试剂结晶紫染色液、革兰氏碘液、沙黄复染液（ 2 ）染色法

革兰氏染色


1 ）用接菌环取一滴灭菌生理盐水于载玻片上，然后再用灭菌环挑取少量菌种于载玻片上与生理盐水充分混合。2 ）将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染 1min水洗。3 ）滴加革兰氏碘液，作用 1min ，水洗。


4 ）滴加 95% 乙醇脱色，约 30s ；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色 10s 。 5 ）水洗，滴加复染液，复染 1min 。水洗待干，镜检。 6 ）结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。


项目知识点：1. 设备和材料冰箱、恒温培养箱、恒温水浴锅、均质器或灭菌乳钵、架盘药物天平、菌落计数器、放大镜、灭菌吸管 1mL 、 10 mL 、灭菌锥形瓶 500mL 、灭菌玻璃珠：直径约 5mm灭菌培养皿：直径 90mm灭菌试管： 16mm×160mm灭菌刀、剪子、镊子等。


2. 培养基及试剂

1. 乳糖胆盐发酵管2. 伊红美兰琼脂平板3. 乳糖发酵管4. 磷酸盐缓冲液5. 0.85% 灭菌生理盐水6. 革兰氏染液


检样

稀释

乳糖胆盐发酵管36 ±1℃ ℃， 48h±2h

不产气产气

大肠菌群阴性伊红美兰琼脂平板 36 ±1 48h±2h℃ ℃

报告

革兰氏染色乳糖发酵管36 ±1 48h±2h℃ ℃

革兰氏阳性革兰氏阴性无芽孢杆菌产气不产气

大肠菌群阴性

报告

大肠菌群阳性大肠菌群阴性

报告报告

项目十七大肠菌群计数3. 检验方法3.1 大肠菌群 MPN 计数法3.1.1 检验程序

3.1.2 操作步骤1 ）样品的稀释① 固体和半固体样品：称取 25 g 样品 , 放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲

液或生理盐水的无菌均质杯内 ,8000 r/min ～ 10000 r/min 均质 1 min ～ 2 min, 或放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min ～ 2 min ，制成 1:10 的样品匀液。

②液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。

③样品匀液的 pH 值应在 6.5 ～ 7.5 之间，必要时分别用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 调节。


④用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL ，沿管壁缓缓注入 9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。

⑤ 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1 次，换用 1 支1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15 min 。


2 ）初发酵试验每个样品，选择 3 个适宜的连续稀释度的样品匀液

（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种 3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（ LST ）肉汤，每管接种 1mL （如接种量超过 1 mL ，则用双料 LST肉汤）， 36 ±1 ℃ ℃ 培养24 h±2 h ，观察倒管内是否有气泡产生， 24 h±2 h 产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至 48 h±2 h ，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。


3 ）复发酵试验用接种环从产气的 LST肉汤管中分别取培养物 1 环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（ BGLB ）管中， 36 ±1℃ ℃培养 48 h±2 h ，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。


4 ）大肠菌群最可能数（ MPN ）的报告按 3 ）确证的大肠菌群 LST 阳性管数，检索MPN 表，报告每 g （ mL ）样品中大肠菌群的 MPN 值。


3.2 大肠菌群平板计数法3.2.1 检验程序

检样25g(ml)样品＋ 225ml稀释液，均质

10倍系列稀释

选择适宜 3个连续稀释度的样品匀液，接种 VRBA平板

报告结果

BGLB肉汤

计数典型和可疑菌落

36±1 18℃ － 24h

336±1 18℃ － 24h


3.2.2 操作步骤1 ）样品的稀释按 MPN 检验方法样品稀释①进行。2 ）平板计数①选取 2 个～ 3 个适宜的连续稀释度 , 每个稀释度接种 2 个无菌平皿，每皿 1 mL 。同时取 1 mL 生理盐水加入无菌平皿作空白对照。

② 及时将 15 mL ～ 20 mL冷至 46 ℃ 的结晶紫中性红胆盐琼脂（ VRBA ）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加 3 mL ～ 4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于 36 ±1 ℃ ℃ 培养 18 h ～ 24 h 。


3 ）平板菌落数的选择选取菌落数在 15 CFU ～ 150 CFU 之间的平板，分别

计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为 0.5 mm 或更大。


4 ）证实试验从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑

菌落，分别移种于 BGLB 肉汤管内， 36 ±1 ℃ ℃ 培养24 h ～ 48 h ，观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。


5 ）大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以 8.3 中计数的

平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每 g （ mL ）样品中大肠菌群数。例： 10-4 样品稀释液 1 mL ，在 VRBA 平板上有100 个典型和可疑菌落，挑取其中 10 个接种 BGLB肉汤管，证实有 6 个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g （ mL ） =6.0×105CFU/g （ mL ）。



8.注意事项：1 ）操作要快而准，包括材料、加样、倒培养基。2 ）吸液体时液体不能进入吸头。3 ）样品稀释时一定要混匀。4 ）倒培养基前，瓶口要过火焰。5 ）一定要有空白对照。6 ）培养基温度控制，培养基薄厚。

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