江苏农牧科技职业学院

毕业设计（论文）

题目：油菜花粉多肽饮料的研制及抗氧化性

评价

姓名： 陈孝梅

学号： 201212937

二级院系部： 食品科技学院

班级: 食药监 121

专业： 食品药品监督管理

指导教师： 张焕新 职称： 副教授

殷 玲 讲 师

二〇一五 年 六 月

I

【摘要】

以油菜蜂花粉为原料，利用复合蛋白酶水解处理技术，通过单因素和正交试

验，研究酶解各因素对酶解效果的影响，确定了酶解的最佳工艺、蜂花粉多肽饮

料的最佳配方及其抗氧化活性。酶解的最佳工艺条件为：10.0 g/100mL油菜蜂花

粉浆液，复合蛋白酶（碱性蛋白酶∶中性蛋白酶=2∶1）添加量 3.5%（m/m），

pH8.5，酶解温度 55℃、时间 200min；在此条件下，多肽的平均得率 74.37%。

油菜蜂花粉多肽饮料制作的最佳配方为：以油菜蜂花粉蛋白酶解液 100%为基准，

分别添加 0.10%柠檬酸，4.00%蔗糖，0.25%黄原胶。利用此配方制作的产品口感

清爽，酸甜适中，味感协调，柔和；浅黄色，质地均匀，无颗粒或者絮状沉淀物；

有油菜蜂花粉特有的香气，无异味；多肽含量≥1.53%，各项理化指标和微生物

指标均符合相应国家标准；具有良好的抗氧化活性，油菜蜂花粉多肽饮料对清除

羟自由基和超氧阴离子分别为 85.28%、46.52%，对羟自由基的清除效果优于清

除超氧阴离子。

【关键词】

油菜花粉；酶解；多肽饮料；抗氧化性

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II

AbstractIn this study, a combination of alcalase and neutrase was used to hydrolyze

rape pollen to obtain polypeptide and develop rape pollen polypeptide beverage. With

the peptide yield as the index, single-factor and orthogonal experiments were

employed to optimize the hydrolysis conditions. Results indicate that the optimal

processing conditions for hydrolyzing rape pollen with were as follows: 10.0

g/100mL rape pollen, 3.5% alcalase and neutrase (2:1), pH values 8.5, temperature

55℃ . Under the conditions, the polypeptide yield reached 74.37%. The optimum

formula of rape pollen polypeptide beverage was as follows: based on rape pollen

solution (10.0%) with enzymatic degradation 100%, 0.10% citric acid, 0.10% sugar,

0.25% xanthan gum. The beverage produced using the optimum formula had nice

taste and special flavor of rape pollen, Its polypeptide content was more than 1.53%,

all the physicochemical and health indices met national standards. Moreover, the

product showed significant antioxidant activity differences from the control group, the

scavenging rate of hydroxyl radical and superoxide anion radical were 85.28% and

46.52%, respectively. The scavenging effect of hydroxyl radical was higher than these

of superoxide anion radical.

Key words

rape pollen enzymatic hydrolysis polypeptide beverage antioxidant activity

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III

目 录

前言................................................................................................................................1

1 材料与仪器................................................................................................................2

1.1 试验材料与主要试剂......................................................................................2

1.2 试验仪器设备..................................................................................................2

1.3 分析方法..........................................................................................................2

1.3.1 多肽得率测定（TCA-NSI法）...........................................................2

1.3.2 清除羟自由基活性的测定: 采用邻氮二菲比色法[10,11]。.................2

1.3.3 清除超氧阴离子的测定: 采用邻苯三酚自氧化法[12]。.................... 2

1.3.4 感官评价................................................................................................2

1.4 试验方法..........................................................................................................3

1.4.1 工艺流程................................................................................................3

1.4.2 操作要点................................................................................................3

1.4.3 蜂花粉蛋白肽酶解工艺的研究............................................................4

1.4.4 油菜蜂花粉多肽饮料的配方设计........................................................4

2 结果与分析..............................................................................................................5

2.1 油菜蜂花粉蛋白水解单因素分析..................................................................5

2.1.1 酶添加量对油菜蜂花粉蛋白水解效果的影响....................................5

2.1.2 pH值对油菜蜂花粉蛋白水解效果的影响...........................................5

2.1.3 温度对油菜蜂花粉蛋白水解效果的影响............................................6

2.1.4 时间对油菜蜂花粉蛋白水解效果的影响............................................6

2.2 油菜蜂花粉蛋白水解最佳工艺条件的确定..................................................7

2.3 油菜蜂花粉多肽饮料配方的确定..................................................................8

2.4.2 油菜蜂花粉多肽饮料理化指标..........................................................10

2.4.3 油菜蜂花粉多肽饮料微生物指标......................................................10

2.4.4 油菜蜂花粉多肽饮料抗氧化活性......................................................10

3 结论..........................................................................................................................11

参考文献......................................................................................................................12

致谢..................................................................................................................................................14

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1

前言

蜂花粉是工蜂采集花粉时加上特殊的腺体分泌物、唾液和花蜜等加工而成的

花粉球，呈淡黄色或栗色，味微甜、微苦、略腥。蜂花粉含有丰富的蛋白质、不

饱和脂肪酸、黄酮类化合物等物质，不仅具有抗疲劳、抗氧化、增强体力和记忆

力、改善组织缺氧等功能[1]，而且对癌症、心脏病、高血压、高血脂、高血糖等

多种疾病有很好的预防和改善作用，具有较高的营养价值和药效价值。其具有独

特的天然保健功能、医疗与美容价值，被越来越多的人所认知。传统直接吞咽的

食用方法很难充分发挥蜂花粉的营养价值和保健功能，主要原因在于：（1）结构

特殊：花粉具有由纤维素、果胶质、半纤维素及蛋白质构成的坚韧细胞壁，既影

响了蜂花粉营养成分的吸收利用，也阻止了提取时营养物质的释放。（2）成分复

杂，不溶性蛋白含量高，且某些蛋白质引起部分人群的过敏性反应[2]；（3）蜂花

粉天然味重，口感略差，消费者接受性差。生物活性多肽具有激素调节、免疫调

节、降血压、降血脂、抗疲劳、抗氧化等生理调节功能，是当前国际医药界、食

品界重要的研究课题和极具发展前景的功能因子[3]。谷胱甘肽[4]、大豆蛋白酶解

物[5]、花生多肽[6]等功能性多肽都已有相关研究证实它们都具有很强的抗氧化能

力。

国内外对油菜蜂花粉的研究主要集中在破壁技术，对于蜂花粉多肽活性的研

究开展相对较晚[7, 8]，相关产品开发甚少。本研究以油菜蜂花粉为原料，采用复

合蛋白酶（碱性蛋白酶∶中性蛋白酶=2∶1）水解处理技术，通过单因素和正交

试验，研究反应各因素对多肽得率的影响，确定酶解的最佳工艺条件；以油菜蜂

花粉蛋白酶水解液为原料，制备功能性油菜蜂花粉多肽饮料并对其抗氧化活性进

行了评价。旨在使水不溶性和难溶性蛋白降解为可溶性多肽，提高蜂花粉营养保

健价值；同时促进细胞内营养物质的释放，降低蛋白的过敏性；改善产品的感官

特性，提高产品的可接受性，为油菜蜂花粉深加工提供可靠的理论依据和技术参

考。

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2

1 材料与仪器

1.1 试验材料与主要试剂

碱性蛋白酶（120000 U/g） Sigma-Aldrich上海贸易有限公司；中性蛋白酶

（100000 U/g）无锡杰能科生物工程有限公司；柠檬酸、蔗糖、黄原胶（食品级）

市售；其余试剂均为分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司。

1.2 试验仪器设备

AL204分析天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司；JM/GM-胶体磨 温州昊

星机械设备制造有限公司；DELTA-320精密pH计 梅特勒-托利多中国有限公司；

80-2 离心机 上海浦东物理光学仪器厂；SP-2100UV 紫外分光光度计 上海光谱

仪器有限公司； THZ-82A水浴恒温振荡器 江苏荣华仪器制造有限公司； GJB-

型高压均质机 常州市均质机械有限公司；YXQ-LS-100G立式压力蒸汽灭菌器

上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 分析方法

1.3.1 多肽得率测定（TCA-NSI法）

取2.5mL 油菜蜂花粉酶解处理液，加入2.5mL 10％（w/v）的三氯乙酸（TCA）

溶液，混合均匀后静置30min，然后在10000×g下离心15 min，将上清液全部转移

到50mL 容量瓶中，并用5％的TCA定容至刻度，摇匀。然后取6.0mL 上述溶液

转移置另一试管中，加入双缩脲试剂4.0mL，混合均匀，静置30min，取上清液

于540nm处测定OD值。按公式（1）计算多肽得率[9]。

多肽得率（%）=（待测液中肽含量×总体积）/酶解处理液中蛋白总量×100 （1）

1.3.2 清除羟自由基活性的测定: 采用邻氮二菲比色法[10,11]。

清除率按公式（2）进行计算：

清除率/%＝（A样品－A损伤）/（A未损伤－A损伤）×100 （2）

1.3.3 清除超氧阴离子的测定: 采用邻苯三酚自氧化法[12]。

按式（3）计算样品对O2－·的清除率：

清除率（%）＝（V对照－V样品）/ V 对照×100 （3）

式中：V对照为未加入样品的邻苯三酚自氧化速率，ΔA/min；

V样品为加入样品的邻苯三酚自氧化速率，ΔA/min。

1.3.4 感官评价

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优选10位经过培训的人员组成评分小组，采用盲标法对油菜蜂花粉多肽饮料

的外观、香气、色泽和口感等品质进行评价打分[13]。以综合得分为指标，优化油

菜蜂花粉多肽饮料配方，评分标准见表1.1。

表1.1 油菜蜂花粉多肽饮料感官质量评分标准

项 目 分数 感官评分标准

口 感 20 具有油菜蜂花粉固有的滋味；口感清爽；酸甜适中

色 泽 20 浅黄色，接近油菜蜂花粉的天然色泽

外 观 40 质地均匀；无颗粒或者絮状沉淀物

香 气 20 有油菜蜂花粉特有的香气，无异味

1.4 试验方法

1.4.1 工艺流程

油菜蜂花粉→破壁处理→酶解→灭酶→调配→均质→脱气→灌装→灭菌→

检验→成品

1.4.2 操作要点

1.4.2.1 破壁处理[14]

称取油菜蜂花粉，用高速组织捣碎机粉碎2min，-20℃冻藏24h，按1∶10料

液比加入80℃的热水进行解冻，经过胶体磨磨浆后过120目筛。

1.4.2.2 酶解

称取一定量的油菜蜂花粉浆液，用碱性蛋白酶与中性蛋白酶按2∶1的比例配

成复合酶进行水解处理，对影响酶促反应的各因子进行分析，确定酶解的工艺参

数。

1.4.2.3 灭酶

到达所需时间反应后，将酶解液置于沸水中灭酶10min。

1.4.2.4调配、均质

将糖、酸和稳定剂先配成溶液，然后按先后顺序加入果汁中；调配好的浆液

在 60℃、25MPa 条件下进行二次均质处理。

1.4.2.5 脱气、灌装

真空脱气机的压力为 60～70 kPa，脱气温度为 70 ℃；脱气后的料液及时装

瓶封口。

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1.4.2.6灭菌、冷却

在 85 ℃灭菌 30 min，然后进行三级冷却，即 70 ℃-50℃-30℃。

1.4.3 蜂花粉蛋白肽酶解工艺的研究

1.4.3.1 单因素试验

油菜蜂花粉浓度固定为10.0 g/100mL，基于碱性蛋白酶与中性蛋白酶在其他

蛋白水解中的应用条件[15-18]，单因素试验的基本条件设定为：加酶量的质量分数

为3.0%（E/S，以底物质量计），pH 8.0，反应温度55℃，水解时间180min。反

应结束后，90℃水浴15 min灭酶，测多肽得率。改变影响酶水解的其中一个因素，

其他因素保持不变，分别考察复合酶添加量、pH值、反应温度和时间对多肽得

率的影响，每组处理重复3次。

1.4.3.2 正交试验

依据单因素试验确定因素水平范围，以多肽得率为考察指标，采用四因素三

水平正交试验设计 L9（34），优化油菜蜂花粉蛋白最佳水解条件组合，各因素与

水平见表 1.2。

表 1.2正交试验因素水平表

水

平

因 素

A：酶添加量（E/S，%） B：pH值 C：酶解温度（℃） D：酶解时间（min）

1 2.5 8.0 52 160

2 3.0 8.5 55 180

3 3.5 9.0 58 200

1.4.4 油菜蜂花粉多肽饮料的配方设计

在预试验基础上，选取对饮料感官品质影响比较大的蔗糖、柠檬酸、黄原胶

三个因素，各取三水平，按正交设计试验L9（33）方案，以感官评分为参考指优

化产品配方，各因素与水平见表1.3。

表 1.3正交试验因素水平表

水 平因 素

A：柠檬酸量（%） B：蔗糖用量（%） C：黄原胶（%）

1 0.10 2.00 0.052 0.15 4.00 0.153 0.20 6.00 0.25

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2 结果与分析

2.1 油菜蜂花粉蛋白水解单因素分析

2.1.1 酶添加量对油菜蜂花粉蛋白水解效果的影响

用 1M NaOH调整 10.0%油菜蜂花粉浆液 pH值至 8.0，分别加入碱性与中性

复合蛋白酶 1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0% (E/S，以底物质量计)，50℃水解时

间 180min。反应结束后，90℃水浴 15 min灭酶，测多肽得率。油菜蜂花粉蛋白

多肽得率随复合蛋白酶添加量的变化如图 2.1所示。由图 2.1可知，复合蛋白酶

添加量在 1.0%～3.0%范围内，油菜蜂花粉蛋白多肽得率随添加量升高迅速上升，

当添加量达到 3.0% 时，多肽得率达到 71. 6%，比 1.0%时增加 29.2%。酶添加量

在 4.0%～5.0%范围内，多肽得率基本不变。水解过程中，随着添加量的增大，

大分子油菜蜂花粉蛋白在较短时间内被降解成为小分子多肽，多肽得率迅速增

加，体系反应的初速度迅速增大。当添加量较大时，酶的浓度不再是水解反应的

限速因素，因此，进一步添加酶的用量对提高肽的得率已没有明显效果[19]。因此，

确定最佳酶添加量在 2.0%～4.0%之间。

图 2.1 复合蛋白酶添加量对多肽得率的影响

2.1.2 pH值对油菜蜂花粉蛋白水解效果的影响

复合蛋白酶在 pH6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 条件下水解油菜蜂花粉蛋白时多

肽得率的变化如图 2.2所示。酶促反应中，酶活力受 pH值影响较大。由图 2.2

可知，pH在 6.0～7.0范围内，油菜蜂花粉蛋白多肽得率较低（37.8%）。随着 pH

（>7.0）值的升高，多肽得率迅速增大；当体系 pH值达到 8. 0时，多肽得率达

到最大值 68.9%。当体系 pH>9.0时，多肽得率呈现明显下降趋势，主要原因为

在过碱性环境中，酶的构象发生改变，降低了酶的活性[20]，表明复合蛋白酶适合

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于弱碱性的环境。因此，选择 pH 8.0～9. 0作为油菜蜂花粉蛋白水解的最佳 pH

值。

图 2.2 pH 值对多肽得率的影响

2.1.3 温度对油菜蜂花粉蛋白水解效果的影响

复合蛋白酶在 40～60℃范围内水解油菜蜂花粉蛋白时多肽得率的变化如图

2.3所示。蛋白酶分子稳定性与酶解温度的高低密切相关。反应温度过高，酶分

子的空间结构发生改变，次级键解离，致使酶的活性降低甚至丧失催化活性。但

反应温度过低，体系内分子运动速度缓慢，降低了酶与蛋白分子的碰撞几率[21]。

由图 3可知，温度由 40℃ 升至 55℃ 过程中油菜蜂花粉蛋白多肽得率逐渐上升，

55℃时，多肽得率达到最大值（70.5%）；进一步升高反应温度（>55℃）后，多

肽得率迅速下降。选择 52～58℃作为油菜蜂花粉蛋白水解的最佳温度范围。

图 2.3 温度对多肽得率的影响

2.1.4 时间对油菜蜂花粉蛋白水解效果的影响

复合蛋白酶在 120～240min范围内水解油菜蜂花粉蛋白时多肽得率的变化如

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图 2.4所示。在水解时间 120～180min内，油菜蜂花粉蛋白多肽得率逐渐上升，

水解 180min时，多肽得率达到最大值（70.9%）。随着水解时间的延长，多肽得

率则呈现下降趋势。碱性蛋白酶和中性蛋白酶均可用于多肽的生产，中性蛋白酶

是一种蛋白质水解内切酶，它能快速地将蛋白质从分子内部切割成小分子多肽，

碱性蛋白酶兼具内切和外切特性。由于不同蛋白酶的水解位点不同，二者复配后

可以提高多肽的得率。水解过程中随着内切位点逐渐减少外切的活力逐渐显现，

体系中的一些多肽分子被水解为氨基酸[22]。因此，在酶解 180 min后，体系多肽

得率略有降低。由此可见，复合蛋白酶确定最佳水解时间应在 160～200 min。

图 2.4 反应时间对多肽得率的影响

2.2 油菜蜂花粉蛋白水解最佳工艺条件的确定

根据正交设计 L9（34）确定试验方案，在不同因素水平组合条件下，用复合

蛋白酶对油菜蜂花粉进行水解处理，测定多肽的得率，结果与分析见表 2.1及表

2.2。

表 2.1正交试验设计组合及试验结果

试验号因 素

多肽得率(%)A B C D

1 A1 B1 C1 D1 54.56

2 A1 B2 C2 D2 72.42

3 A1 B3 C3 D3 59.47

4 A2 B1 C2 D3 71.24

5 A2 B2 C3 D1 69.7

6 A2 B3 C1 D2 54.7

7 A3 B1 C3 D2 68.45

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试验号因 素

多肽得率(%)A B C D

8 A3 B2 C1 D3 66.28

9 A3 B3 C2 D1 67.32

K1 186.45 194.25 175.54 191.58

K2 195.64 208.40 210.98 195.57

K3 202.05 181.49 197.62 196.99

k1 62.15 64.75 58.51 63.86

k2 65.21 69.47 70.33 65.19

k3 67.35 60.50 65.87 65.66

r 5.20 8.97 11.81 1.80

表 2.2正交试验方差分析

因 素 均差平方和 自由度 F值 P值 显著性

A 41.00 2 7.82 0.113 不显著（P>0.05）

B 120.80 2 23.03 0.042 显 著（P

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果与分析见表 2.3及表 2.4。

表 2.3正交试验设计组合及试验结果

试验号因 素

综合评分A B C

1 A1 B1 C1 74.5

2 A1 B2 C2 80.2

3 A1 B3 C3 88.8

4 A2 B1 C2 75.6

5 A2 B2 C3 92.3

6 A2 B3 C1 65.4

7 A3 B1 C3 82.7

8 A3 B2 C1 68.5

9 A3 B3 C2 65.3

K1 243.50 232.80 208.40

K2 233.30 241.00 221.10

K3 216.50 219.50 263.80

k1 81.17 77.60 69.47

k2 77.77 80.33 73.70

k3 72.17 73.17 87.93

r 9.00 7.17 18.47

表 2.4正交试验方差分析

因 素 均差平方和 自由度 F值 P值 显著性

A 123.92 2 30.78 0.031 显 著（P

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肽饮料的最佳配方为：油菜蜂花粉蛋白酶解液 100%计，柠檬酸添加量 0.10%，

蔗糖添加量 4.00%，黄原胶添加量 0.25%。

2.4 油菜蜂花粉多肽饮料品质分析

利用优化后的最佳工艺和配方制作功能性油菜蜂花粉多肽饮料，对产品进行

感官、理化、微生物指标和抗氧化性能评价。

2.4.1 油菜蜂花粉多肽饮料感官特性

口感清爽，酸甜适中，味感协调，柔和；浅黄色，质地均匀，无颗粒或者絮

状沉淀物；有油菜蜂花粉特有的香气，无异味。

2.4.2 油菜蜂花粉多肽饮料理化指标

多肽含量≥1.53%，可溶性固形物≥ 12.0%。

2.4.3 油菜蜂花粉多肽饮料微生物指标

细菌总数≤ 100CFU/mL；大肠菌群≤6 MPN/mL；致病菌没有检出。

2.4.4 油菜蜂花粉多肽饮料抗氧化活性

以未经复合蛋白酶处理的油菜蜂花粉为原料（其他配方、工艺处理相同），

制作油菜蜂花粉饮料作为对照组，分别测定对照组和试验组对羟自由基和超氧阴

离子清除活性，对功能性油菜蜂花粉多肽饮料抗氧化特性进行评价，试验结果见

表 2.5。

表 2.5产品抗氧化特性测定结果

组 别 羟自由基清除率（%） 超氧阴离子清除率（%）

普通油菜蜂花粉饮料（对照组） 29.34±1.98a 16.35±1.78a

油菜蜂花粉多肽饮料（试验组） 85.28±2.17b 46.52±1.64b

*同列上角标小写字母不同表示差异显著（P

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能力优于清除超氧阴离子。

3 结论

（1）油菜蜂花粉是一种富含蛋白质的重要功能性食品资源。通过单因素和

正交试验确定了复合蛋白酶水解油菜蜂花粉的最佳工艺：10.0 g/100mL油菜蜂花

粉浆液，复合蛋白酶（碱性蛋白酶∶中性蛋白酶=2∶1）添加量3.5%（m/m），pH8.5、

酶解温度55℃、时间200min。在此工艺条件下，多肽的平均得率74.37%。

（2）结合实际生产，确定了油菜蜂花粉多肽饮料的配方：以油菜蜂花粉蛋

白酶解液100%为基准，分别添加0.10%柠檬酸，4.00%蔗糖，0.25%黄原胶。利用

此配方制作的产品口感清爽，酸甜适中，味感协调，柔和；浅黄色，质地均匀，

无颗粒或者絮状沉淀物；有油菜蜂花粉特有的香气，无异味；各项理化指标和微

生物指标均符合相应国家标准。

（3）油菜蜂花粉多肽饮料具有良好的抗氧化活性，对清除羟自由基和超氧

阴离子分别为85.28%、 46.52%，对羟自由基的清除效果优于清楚超氧阴离子，

而对于其它生物活性则有待于进一步的研究。

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参考文献

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江苏农牧科技职业学院毕业设计（论文）

14

致谢

三年的大学生活将在今年的六月画上句号，这是我在人生成长路途中的必经

之路。这三年中，历经艰辛，从而收获了很多。和老师、同学和睦相处，学到专

业知识的同时交到了这么一群良师益友。

非常感谢张焕新和殷玲老师对我论文的指导，他们渊博的专业知识，良好的

工作作风，严于律己、宽以待人的崇高风范，将一直是我生活、工作中学习的榜

样。每次交流后都有种茅塞顿开的体悟。同时，也要感谢帮助过我的其他老师如

陈玉勇老师，他们一视同仁对待每一位学生，这种无私奉献的精神给我提供了获

得其他知识的机会。

回首既往，自己最宝贵最快乐的时光是大学校园生活，很荣幸能分享到才华

横溢的老师们带来的知识与乐趣。同时感谢一值陪伴我成长的同学们，与他们交

流让我受益颇多，他们的欢歌笑语仍在我耳旁荡漾。感谢一直陪伴我做实验的小

伙伴们，两三个月的相处早已把你们当作我的亲人，在实验遇到困难的时候，是

你们为我排忧解难；在我没有信心的时候，是你们一直鼓励着我前进。这些将是

我人生中最宝贵的财富。

最后衷心祝愿各位老师身体健康，工作顺利；祝愿各位同学前程似锦！