instituto politÉcnico nacional secretarÍa de...
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
PROGRAMA DE MAESTRÍA EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS
Directores de tesis
México, D.F. 2009
FRECUENCIA DE LOS POLIMORFISMOS PLA1/A2 EN EL GEN DE LA
GLICOPROTEÍNA PLAQUETARIA IIIa EN PACIENTES JÓVENES
CON INFARTO AGUDO DEL MIOCARDIO CON ELEVACIÓN DEL
SEGMENTO ST
TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN CIENCIAS
QUÍMICOBIOLÓGICAS
PRESENTA:
Med. Cir. David Santiago Germán
Dra. Elba Reyes Maldonado Dra. Irma Isordia Salas
EL PRESENTE TRABAJO SE REALIZÓ EN:
1. En la Unidad de Investigación en Trombosis, Hemostasia y Aterogénesis
(UITHA) del Hospital General Regional No. 1 "Dr. Carlos MacGregor
Sánchez Navarro" del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS).
2. En el Hospital de Cardiología del Centro Médico Nacional Siglo XXI
(CMNSXXI) del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS).
3. En el Laboratorio de Citología del Departamento de Morfología de la
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas (ENCB) del Instituto Politécnico
Nacional (IPN).
Dedicatoria:
A la memoria de mi amiga Alba,
de mis tíos Amado Germán y Jorge Mercado,
y de mi querida hermana Maribel.
A mi buen amigo Abel y a Diana
(disfruten cada momento, porque es irrepetible)
Agradecimientos:
A mis directores de tesis la Dra. Irma Isordia Salas, por darme la oportunidad de
formar parte de su grupo de trabajo, y por compartir con sus alumnos de su valioso
tiempo, conocimientos y experiencia. A la Dra. Elba Reyes Maldonado por brindarme
su respaldo y apoyo, sin el cual no hubiera sido posible concretar esta tesis.
A las autoridades y personal del Hospital de Cardiología del Centro Médico Nacional
Siglo XXI (CMNSXXI); de la Unidad de Investigación en Trombosis, Hemostasia y
Aterogénesis (UITHA), del servicio de Urgencias, Laboratorio y Banco de Sangre del
Hospital Regional No. 1 "Dr. Carlos Mac Gregor Sánchez Navarro" del Instituto
Mexicano del Seguro Social (IMSS), por las facilidades y apoyo otorgados para la
realización del estudio.
A las autoridades y profesores de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas (ENCB)
del Instituto Politécnico Nacional (IPN).
A mis padres y amigos Aurora Germán Ramírez y Wenceslao Santiago López, a mi
hermano Wenceslao y Lupita.
i
ii
ABREVIATURAS
ACTP Angioplastía coronaria transluminal percutánea
AHA Asociación Americana del Corazón (del inglés, “American Heart Association”)
AI Angina inestable
AMPc Adenosin monofosfato cíclico
BRIHH Bloqueo de la rama izquierda del has de His
DAG Diacilglicerol
DM Diabetes mellitus
EAC Enfermedad arterial coronaria
EDRF Factor relajante derivado del endotelio (del ingles, “endotelial derived relaxant factor”)
FEVI Fracción de eyección del ventrículo izquierdo
FT Factor tisular
FvW Factor de von Willebrand
GP Glicoproteína plaquetaria
HAS Hipertensión arterial sistémica
IAM Infarto agudo del miocardio
IAMCEST Infarto agudo del miocardio con elevación del segmento ST
IAMNEST Infarto agudo del miocardio sin elevación del segmento ST
ICAM-1 Molécula de adhesión intercelular tipo 1 (del inglés, “intercellular adhesión molecule-1”)
IFN- Interferón gamma
IP3 Inositol trifosfato
LDL Lipoproteína de baja densidad (del ingles, “low density lipoprotein”)
Lp(a) Lipoproteína a
Odd Ratio Razón de momios (del ingles, “odds ratio”)
ON Oxido nítrico
PLC Fosfolipasa C
PCR Reacción en cadena de la polimerasa (del ingles, “polimerase chain reaction”)
PDGF Factor de crecimiento derivado de las plaquetas (del ingles, “platelet derived growth
factor”)
PG I2 Prostaglandina I2
PI3K Fosfoinosítido 3 cinasa
PIP2 Fosfatidilinositol bifosfato
PKC Proteina cinasa C
PLA2 Fosfolipasa A
2
RGDS Arginina-glicina-ácido aspártico-serina
SICA Síndrome coronario agudo
TBXA2
Tromboxano A2
TM Trombomodulina
TNF- Factor de necrosis tumoral alfa (del inglés, “tumor necrosis factor”)
tPA Activador tisular del plasminógeno (del inglés, “tissue plasminogen activator”)
VCAM-1 Molécula de adhesión de células vasculares tipo 1 (del inglés, “vascular cell adhesión
molecule-1”)
iii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Familia de las glicoproteínas plaquetarias "Integrinas".
Tabla 2. Comparación de las variables clínicas y demográficas entre
casos y controles.
Tabla 3. Distribución genotípica y frecuencia alélica del polimorfismo
PLA1/A2 en el gen de la glicoproteína plaquetaria IIIa en pacientes con
IAMCEST y controles.
Tabla 4. Relación clínica y de laboratorio de los alelos (PL1 y PL2) del
polimorfismo PLA1/PLA2 en el gen de la glicoproteína IIIa en pacientes
con IAMCEST.
Tabla 5. Análisis de regresión logística utilizando IAMCEST como
variable dependiente.
Tabla 6. Distribución del genotipo 4G/5G y frecuencia alélica del
polimorfismmo en el gen del PAI-1 entre ambos grupos.
Tabla 7. Impacto clínico del alelo 4G en pacientes de edad ≤ 45 años
con IAMCEST.
Tabla 8. Razón de momios (OR) ajustada eN infarto del miocardio para
el alelo 4G.
iv
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Lesión tipo I. Disfunción endotelial.
Figura 2. Lesión tipo II. Lesión endotelial mediada por monocitos.
Figura 3. Lesión tipo III. Ruptura de la placa por crecimiento.
Figura 4. Progresión de la formación de la placa ateroesclerosa.
Figura 5. Modelo celular de la coagulación.
Figura 6. Trombogénesis.
Figura 7. Glicoproteínas transmembrana plaquetarias.
Figura 8. Estructura de la GP IIb/IIIa.
Figura 9. Vías de señalización plaquetaria.
Figura 10. Patrón de puentes disulfuro y principales dominios de la GP
IIIa.
Figura 11. Fibrinógeno.
Figura 12. Tipos de placa ateroesclerosa.
Figura 13. Análisis de los fragmentos de restricción de los alelos PL
A1/A2 de la GP IIIa.
v
ABSTRACT
Background. Epidemiological and clinical studies indicate that coronary artery
disease (CAD) is the first cause of death worldwide. The major thrombosis
complication of CAD is ST elevation Acute Myocardial Infarction (STEAMI)
representing a very important care health issue in our country. In addition,
approximately 10% of the new events occurred in individuals younger than 45
years old. It has been demonstrated that modifiable risk factors such as
diabetes mellitus, hypertension, hyperlipidemia, obesity and smoking, account
for approximately 50% of the risk for development of STEAMI.
Methods. In a case-control study 127 unrelated patients with STEMI ≤ 45 years
of age, who where admitted to a cardiovascular intense care unit and 127
apparently healthy controls matched by age and gender were recruited from
January 2006 and June 2009. The polymorphism PLA1/A2 was determined in
all participants by a polymerase chain-reaction-restriction fragment length
polymorphism assay (PCR-RFLP).
Results. There was a significant difference in genotype distribution between
both groups OR=3.12 (CI95%1.25-7.99). Also, we identified a significant
difference in the allele frequency between both groups OR=2.92 (CI95%1.21-
7.28). The multivariate logistic regression an analysis identified as an
independent risk factors: A2 allele OR=3.68 (CI95%1.0-12.5), smoking
OR=4.98 (CI95%3.0-8.1), hypertension OR=1.86 (CI95%1.0-3.3), dyslipidemia
OR=3.2 (CI95%1.8-5.6).
Conclusions. The PIA2 allele of the platelet glycoprotein IIIa, hypertension,
smoking, dyslipidemia, familial history of coronary artery disease, represents an
independent risk factor for premature STEAMI in mexican mestizo individuals
younger than 45 years old.
vi
RESUMEN
Antecedentes. Estudios clínicos y epidemiológicos demuestran que la
enfermedad arterial coronaria (EAC) es la primera causa de muerte en el
mundo. La complicación trombótica más importante de la EAC es el Infarto
agudo del miocardio con elevación del segmento ST (IAMCEST) el cual
representa un importante problema de salud pública en nuestro país. Además,
aproximadamente el 10% de los nuevos eventos, se presentan en sujetos
menores de 45 años. Se ha demostrado que los factores de riesgo modificables
como diabetes mellitus, hipertensión, hiperlipidemia, obesidad y tabaquismo
representan aproximadamente el 50% de los factores que contribuyen para el
desarrollo de IAMCEST.
Métodos. En un estudio de casos y controles se incluyeron 127 pacientes no
relacionados con diagnóstico de IAMCEST con una edad menor de 45 años,
los cuales fueron admitidos en la unidad de cuidados intensivos del Hospital de
Cardiología del CMN siglo XXI y 127 sujetos del grupo control pareados por
edad y género, los cuales fueron reunidos de Enero del 2006 hasta Junio del
2009. Se determinó el polimorfismo PLA1/A2 en todos los participantes
mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa-restricción de los
fragmentos polimórficos (PCR-RFLP).
Resultados. Se identificó una diferencia estadísticamente significativa en la
distribución genotípica entre ambos grupos OR=3.12 (IC95%1.25-7.99).
También, nosotros identificamos una diferencia significativa en la frecuencia
alélica entre los grupos de estudio OR=2.92 (IC95%1.21-7.28). El análisis
multivariado de regresión logística identificó como factores de riesgo
independiente: alelo A2 OR=3.68 (IC95%1.0-12.5), tabaquismo OR=4.98
(IC95%3.0-8.1), hipertensión OR=1.86 (IC95%1.0-3.3), dislipidemia OR=3.2
(IC95%1.8-5.6).
Conclusiones. El alelo PLA2 del gen que codifica para la glicoproteína
plaquetaria IIIa, hipertensión, tabaquismo, dislipidemia e historia familiar de
EAC representan un riesgo independiente para el desarrollo prematuro de
IAMCEST en sujetos mestizos mexicanos jóvenes menores de 45 años.
1
I. INTRODUCCIÓN
Se define al infarto del miocardio como la muerte celular miocárdica por
isquemia prolongada como resultado de un desequilibrio entre el aporte y la
demanda de oxígeno, identificado en el contexto clínico como sensación de
incomodidad en tórax, epigastrio, brazo, muñeca o mandíbula, al ejercicio o en
reposo, que dura más de 20 minutos, y que puede estar asociado o presentarse
en forma aislada (en ausencia de síntoma torácico) por disnea, diaforesis,
náuseas y vómito, astenia, mareo, o sincope. En asociación con cambios
electrocardiográficos de isquemia como elevación del segmento ST
presumiblemente reciente en dos o más derivaciones contiguas ≥ 0.2mV en V1,
V2 o V3 y ≥ 0.1mV en las demás derivaciones; y sin elevación del segmento ST
pero con anormalidades de la onda T, o depresión del ST. Así como, por la
presencia de imagen electrocardiográfica de bloqueo de rama izquierda de novo
o por un patrón evolutivo de ondas Q. Manifestado en el contexto bioquímico
por la elevación sérica de marcadores de necrosis miocárdica como mioglobina,
troponina T/I y creatinin fosfoquinasa fracción MB 1.
El segundo Registro Nacional de Síndromes Coronarios Agudos (RENASICA II)
es el registro más grande de síndromes coronarios agudos de Latinoamérica.
Entre diciembre del 2002 y noviembre del 2003 se estudiaron 8,098 pacientes
con dolor torácico de 66 hospitales de segundo y tercer nivel de atención médica
en México, de entre 21 y 100 años de edad. De estos 3,543 (44%) presentaron
angina inestable (AI) o infarto del miocardio sin elevación del segmento ST
(IAMNEST) y 4,555 (56%) infarto del miocardio con elevación del segmento ST
(IAMCEST), con una proporción de 1.3:1 de IAMCEST para AI/IAMNEST. Estos
resultados establecen al IAMCEST como la principal causa de admisión
hospitalaria por síndromes coronarios agudos (SICA) y ponen de relieve el
impacto que tiene sobre los recursos del Sistema de Salud Nacional2.
El estudio Framingham, es uno de los estudios epidemiológicos más grandes
realizados, y estableció por primera vez el concepto de "factores de riesgo
cardiovascular mayores" a la edad, el sexo masculino, la presencia de
diabetes, hipertensión, dislipidemia y tabaquismo 3. Sin embargo, su capacidad
2
de predecir el riesgo de enfermedad arterial coronaria en un sujeto en particular
es limitado, además de que no explica por completo las variaciones encontradas
en diferentes grupos étnicos como se observó en el estudio "Seven Countries" 4-
5. En 1999 el estatuto de la Conferencia sobre Prevención de la Asociación
Americana del Corazón (AHA) clasificó a los factores de riesgo cardiovascular
en tres categorías: 1) "factores de riesgo convencionales o tradicionales" al
tabaquismo, hipertensión arterial sistémica (HAS), dislipidemia y Diabetes
mellitus (DM), que por sí mismos intervienen directamente en la aterogénesis; 2)
"factores de predisposición" a la obesidad, historia familiar de enfermedad
arterial coronaria temprana, sedentarismo, el sexo masculino, factores
socioeconómicos y emocionales, y a la resistencia a la insulina, que no
intervienen directamente en la aterogénesis pero si pueden incrementar el riesgo
cardiovascular; y 3) "factores de riesgo condicionales" a la
hiperhomocisteinemia, hiperfibrinogenemia, el tamaño de la partícula de
lipoproteína de baja densidad (LDL), niveles elevados de proteína C reactiva y
lipoproteína a (Lp(a)) cuya contribución causal y cuantitativa al desarrollo de
enfermedad arterial coronaria aún no se encuentran bien documentada 6.
Recientemente se ha agregado una cuarta categoría llamada "factores de
riesgo emergentes" que incluyen a la fosfolipasa A2 asociada a lipoproteína,
fosfatasa plasmática asociada al embarazo, dimetilarginina asimétrica,
mieloperoxidasa, nitrotirosina, marcadores de estrés oxidativo, y polimorfismos
genéticos 7.
Los síndromes coronarios agudos se originan por una diferencia entre el aporte
de oxígeno y la demanda miocárdica, es decir, cualquier trastorno que provoque
una disminución en los niveles de oxígeno en la sangre, de su liberación, o una
disminución en la presión de perfusión miocárdica, que no satisfaga los
requerimientos del músculo cardiaco de acuerdo a las circunstancias que en ese
momento se presentan, precipitará la aparición de angina o infarto agudo del
miocardio. De lo anterior podemos concluir que la etiología de los síndromes
coronarios agudos no comprende únicamente causas cardiacas, sino también
extra cardiacas. Es así que al infarto agudo al miocardio (IAM) se le ha
clasificado en 5 tipos: tipo 1 o infarto al miocardio espontáneo secundario a
isquemia por un evento coronario primario como erosión de una placa y/o
3
ruptura, fisura o disección (aterotrombosis); tipo 2 o infarto al miocardio
secundario a isquemia por incremento de la demanda de oxígeno o disminución
de su aporte, por ejemplo por espasmo arterial coronario, embolismo coronario,
anemia, arritmias, hipertensión o hipotensión; tipo 3 o "muerte súbita" precedida
por síntomas previos sugestivos de isquemia miocárdica, acompañado por
nueva elevación del segmento ST o bloqueo de rama izquierda del haz de His
(BRIHH) de novo o, evidencia de un trombo fresco en una arteria coronaria por
angiografía o autopsia, pero cuando la muerte ocurre antes de la toma de
muestras séricas o antes de la elevación de los marcadores de daño miocárdico
en sangre; tipo 4a o infarto al miocardio durante una intervención coronaria
percutánea; tipo 4b o infarto al miocardio asociado a trombosis del Stent
documentado por angiografía o autopsia; y tipo 5 o infarto al miocardio asociado
a un puente arterial coronario. Independientemente de la causa, casi siempre en
mayor o menor grado se encuentra involucrada la ateroesclerosis 8. Por lo que a
continuación revisaremos como se forma una placa de ateroma.
La aterogénesis inicia con una lesión de tipo funcional del endotelio (disfunción
endotelial o lesión tipo I) precipitada entre otros factores por la hipertensión
arterial sistémica, Diabetes mellitus, dislipidemia, tabaquismo, en donde la
permeabilidad del endotelio se altera, permitiendo que las LDL penetren al
espacio subintimal en donde sufren un proceso de oxidación. Las LDL oxidadas
posteriormente son fagocitadas por macrófagos tisulares, estimulando la síntesis
y liberación de citocinas proinflamatorias que promueven la proliferación y
migración de las células musculares lisas (principales productoras de colágeno
de la pared arterial) de la capa media vascular al espacio subintimal. Estas
citocinas proinflamatorias, también inducen la expresión de moléculas de
adhesión de superficie en el endotelio entre las que se encuentran la E-
selectina, la molécula de adhesión de células vasculares 1 (VCAM-1) y la
molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) que sirven como receptores de
monocitos permitiendo su paso al espacio subintimal para transformarse en
macrófagos. La presencia de ésteres de colesterol en el citoplasma de los
macrófagos les da una aspecto característico, por lo que se les ha otorgado el
4
nombre de "células espumosas" y se observan en los cortes histológicos como
"estrías grasas" (Figura 1).
Figura 1. Lesión tipo I. Se ilustra la disfunción endotelial generado por el tabaquismo, DM, HAS que
aumentan la permeabilidad endotelial y permiten el paso de LDL (amarillo) al espacio subintimal, su oxidación y fagocitosis por los macrófagos, y la liberación de citocinas proinflamatorias que promueven la quimiotaxis, expresión de moléculas de adhesión e inflamación
9
Conforme la lesión progresa, los macrófagos comienzan a liberar
metaloproteinasas que degradan la matriz (colagenasas), se inhibe la síntesis de
colágeno por acción de IFN- , aunado a un proceso de apoptosis de las células
endoteliales y musculares lisas inducido por el TNF- , exponen al factor tisular
(FT) a las proteínas plasmáticas del sistema de coagulación e inician la
trombogénesis (lesión tipo II). Las plaquetas acuden inmediatamente a reparar
el daño endotelial adhiriéndose a la fisura producida. Estas plaquetas sintetizan
factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) que induce la proliferación
de células musculares lisas, lo que produce crecimiento de la placa
ateroesclerótica (Figura 2).
5
Figura 2. Lesión tipo II. Lesión endotelial mediada por monocitos. Se ilustra el daño endotelial
generado por la liberación de colagenasas por los macrófagos, y por la apoptosis inducida por el TNF- así como, los mecanismos de reparación mediados por la exposición de FT del espacio subintimal a las globulinas del sistema de coagulación y a las plaquetas
9.
Posteriormente, diversas fuerzas de tensión sobre la superficie de la placa
hacen que ésta se fisure o erosione (lesión tipo III), se active la trombogénesis
y la placa ateroesclerosa crezca (Figura 3).
Figura 3. Lesión tipo III. Ruptura de la placa por crecimiento. Se ilustra la ruptura de una placa de ateroma por fuerzas de cizallamiento , y su crecimiento por la trombosis resultante
9.
Una obstrucción parcial del flujo coronario ya sea por trombosis o estenosis por
crecimiento progresivo de la placa de ateroma puede desencadenar una angina
estable, inestable o un IAM. En resumen, una placa de ateroma inicia con una
lesión tipo I, progresa a una lesión tipo II y se complica a una lesión tipo III
(figura 4).
6
Figura 4. Progresión de la formación de la placa ateroesclerosa. Arriba: corte longitudinal de una arteria
representando una línea de tiempo de la aterogénesis humana de una arteria normal (1) a una placa de ateroma que causa manifestaciones clínicas por trombosis o estenosis (5,6,7). Abajo: cuando una placa vulnerable se rompe, el paciente puede experimentar una sensación de discomfort (o dolor) torácico que resulta de la reducción del flujo sanguíneo a través de una arteria epicárdica afectada. La reducción del flujo puede ser causada por una oclusión completa del trombo o una oclusión parcial. Los pacientes con sensación de discomfort pueden presentar elevación o no del segmento ST en el electrocardiograma. Los pacientes con elevación del segmento ST en su mayoría desarrollan un infarto del miocardio con una onda Q en el electrocardiograma, mientras que solo unos cuantos desarrollan un infarto del miocardio sin onda Q. A su vez, los pacientes que no presentan elevación del segmento ST sufren de una angina inestable o infarto del miocardio sin elevación del ST, una distinción que solo puede hacerse con la presencia o ausencia de marcadores séricos cardiacos como CPK-MB o troponinas cardiacas. Muchos pacientes con infarto del miocardio sin elevación del ST desarrollan un infarto no Q en el electrocardiograma, y unos cuantos desarrollan un infarto con onda Q. El espectro de presentaciones clínicas que va desde la angina inestable, a través de IAMNEST hasta IAMCEST se conocen como síndrome coronarios agudos
10-13.
7
La trombosis se inicia cuando los tejidos dañados liberan tromboplastina tisular,
también nombrada factor III extrínseco o factor tisular. La tromboplastina tisular
una vez en contacto con las globulinas disueltas en el plasma (factores de
coagulación), activa una cascada enzimática que culmina con la transformación
de fibrinógeno (factor I) a un polímero insoluble, llamado fibrina (factor Ia).
Recientemente, se ha propuesto un modelo in vivo de la coagulación, llamado
modelo celular de la coagulación, que la divide en tres fases que se traslapan:
iniciación, amplificación y propagación, y que toman lugar sobre la superficie
fosfolipídica de diferentes células. La fase de "iniciación" ocurre en células que
expresan factor tisular (células endoteliales, macrófagos, monocitos,
fibroblastos, músculo liso), que es el receptor y cofactor para el FVII, formando el
complejo FT/FVIIa. Este complejo activa pequeñas cantidades de FIX y FX. El
factor Xa se une con su cofactor el factor Va (proveniente de las plaquetas)
formando el "complejo protrombinasa" en la superficie celular. En la fase de
"amplificación" el complejo protrombinasa activa pequeñas cantidades (1%) de
trombina (FIIa) la cual a su vez activa plaquetas y cofactores de la coagulación
como FV, FVIII, y FXI. Por último, en la fase de "propagación" el factor IXa
(activado por el complejo FT/VIIa y el FXIa) se une a su cofactor FVIIIa sobre la
superficie de las plaquetas activadas para formar el complejo FIXa/FVIIIa, que
activa al factor X, para formar nuevamente al complejo protrombinasa pero en
esta ocasión para convertir grandes cantidades de protrombina (99%) a
trombina, que finalmente transforma al fibrinógeno en fibrina y activa al FXIII
para estabilizarla (Figura 5) 14.
8
Figura 5. Modelo Celular de la Coagulación. Representación gráfica del modelo in vivo de la coagulación
propuesto en la Universidad de Carolina del Norte en Chapell Hill, que divide a la coagulación en tres fases, "iniciación" en la cual se forman pequeñas cantidades del complejo protrombinasa (FXa/Va), "amplificación" se activa el 1% de la trombina (FIIa) que a su vez activa a otros factores de la coagulación y a las plaquetas, y "propagación" en donde se activa el 99% restante de FII que culmina con la generación de fibrina
14.
Al mismo tiempo que en el daño endotelial ocurre liberación de tromboplastina
tisular, la colágena expuesta permite que las plaquetas se adhieran sobre el sitio
de la lesión ("adhesión") formando una masa denominada trombo blanco. Esta
adhesión pone en marcha un proceso designado como "reacción de
liberación" (secreción), que consiste en la liberación de las diversas sustancias
contenidas en los gránulos plaquetarios. Las plaquetas contienen dos tipos de
gránulos, los gránulos densos que contienen calcio, ADP, ATP, GTP,
tromboxano y serotonina; y los gránulos alfa que contienen moléculas de
adhesión, fibrinógeno, factor de Von Willebrand (FvW), trombospondina,
fibronectina. 15.
El tromboxano A2 es sintetizado en las plaquetas a partir del ácido araquidónico
por la vía de la ciclo-oxigenasa. El ácido araquidónico se forma a partir de los
fosfolípidos de la membrana celular por acción de la fosfolipasa A2, una vez
sintetizado, por acción de la enzima ciclo-oxigenasa se forma la prostaglandina
G2 y posteriormente por la tromboxano sintetasa finalmente se forma
tromboxano A2 y su metabolito el tromboxano B2, los cuales tienen acción
vasoconstrictora que promueve la agregación plaquetaria. Por el contrario, las
9
prostaciclinas derivadas de la prostaglandina G2 producida por las células
endoteliales y musculares lisas de los vasos sanguíneos tienen un efecto
vasodilatador y antiagregante plaquetario. Pequeñas dosis de ácido acetil-
salicílico inhiben la ciclo-oxigenasa plaquetaria afectando en menor proporción a
la ciclo-oxigenasa endotelial y muscular. La serotonina al igual que el
tromboxano A2 tiene un efecto vasoconstrictor.
Una vez que se libera el contenido de los gránulos plaquetarios estos sufren un
cambio drástico en su aspecto, pasando de una estructura discoide a una forma
espinosa con pseudopodos, a este cambio se le denomina "activación
plaquetaria". De este modo, las plaquetas se unen unas con otras formando un
agregado ("agregación"). La actividad contráctil de las plaquetas les permite
jalar las hebras de fibrina a las que están unidas, lo que se designa como
"retracción del coágulo". Por último, los fibroblastos migran hacia el sitio en
reparación y convierten al trombo en tejido conectivo laxo, a este reemplazo se
le denomina "organización del trombo" (Figura 6).
Figura 6. Trombogénesis. Se ilustran cuatro de las seis fases para la formación de un trombo. En la fase I
o de adhesión la plaqueta se adhiere al lugar de la lesión endotelial mediante receptores para el FvW y colágena. En la fase II se secretan los gránulos densos y alfa plaquetarios, que contienen agonistas y moléculas de adhesión. En la fase III se activa la plaqueta por diversos agonistas provocando un cambio conformacional, Y en la fase IV se produce un agregado plaquetario mediante la GP IIb/IIIa
16.
10
Las plaquetas contienen cuatro tipos de glicoproteínas transmembrana: 1) Las
selectinas, que son una familia de proteínas que reconocen carbohidratos
específicos de la superficie celular, se conocen la E-selectina que se expresa en
las células endoteliales, la P-selectina en las plaquetas, y la L-selectina en los
leucocitos. 2) la GP Ib-V-IX es una glicoproteína rica en leucina, existen
aproximadamente 25,000 copias por plaqueta, cuyas subunidades son
codificadas por genes diferentes localizados en cromosomas diferentes. El
dominio globular N-terminal de la GP Ib alfa es la mayor región de unión al FvW.
3) La inmunoglobulina (Ig) GP IV (GP IIIb) tiene un peso molecular de 60kDa,
está constituida de 319 aminoácidos y el gen que la codifica se encuentra en el
cromosoma 19. Forma un complejo con el receptor FcR- . Esta glicoproteína se
encuentra de forma dimérica y sus ligandos son la colágena I, II, III, y una
proteína del veneno de serpiente convulxin (Figura 7).
Figura 7. Glicoproteínas transmembrana plaquetarias. Representación gráfica de la selectina
plaquetaria, del complejo heterotetramérico GP Ib-V-IX y del receptor plaquetario tipo Ig la GP IV, así como a sus respectivos ligandos (carbohidratos, FvW y colágena, respectivamente). No se muestra a la familia de las integrinas
17.
El cuarto tipo de glicoproteína transmembrana plaquetaria es el receptor para
fibrinógeno plaquetario el cual es un complejo de dos glicoproteínas no idénticas
dependiente de calcio, la GP IIb y IIIa. Hay aproximadamente 80,000 copias de
este receptor en las plaquetas lo que la convierte en el receptor plaquetario más
abundante. Su secuencia de aminoácidos ha ayudado a definir a la familia de
11
moléculas de adhesión a la que pertenecen, las llamadas "integrinas". Las
integrinas son una familia de glicoproteínas relacionadas estructuralmente que
consisten en una subunidad alfa y beta unidas a proteínas de adhesión
(fibrinógeno y FvW). El término integrina fue acuñado para referirse a proteínas
integrales de membrana que sirven como puente entre la matriz extracelular y el
citoesqueleto de la célula. La GP IIb-IIIa pertenece a una subclase de integrinas
caracterizadas por su habilidad para unirse a ligandos que contienen la
secuencia de aminoácidos: arginina-glicina-ácido aspártico-serina (RGDS). La
subunidad alfa fija cationes divalentes (Figura 8) 18.
Figura 8. Estructura de la GP IIb/IIIa. La GP IIb/IIIa está compuesta por una subunidad (GP IIb) y una
subunidad (GP IIIa). La GP IIb contiene 4 sitios de unión a Ca2
. Se han identificado tres regiones de unión a ligando: RGD (secuencia de aminoácidos 109 a 171), KGD (211 a 222), y KQAGDV (297 a 314). El cambio conformacional del complejo del receptor de la GP IIb/IIIa expone ha los neoepitopos encriptados. Epitopos LIBS (Ligand Induced Binding Sites) (). C extremo carboxilo; N extremo amino terminal
18.
Se han identificado más de 24 integrinas diferentes, formadas por la
combinación de 18 subunidades alfa y 8 subunidades beta conocidas. Las
integrinas se unen a secuencias cortas de aminoácidos presentes en múltiples
12
componentes de la matriz extracelular, incluyendo colágeno, fibronectina y
laminina (Tabla 1).
Tabla 1. Familia de las glicoproteínas plaquetarias "Integrinas" 19.
(18) (8) GP Ligando
2 1 Ia-IIa Colágena
5 1 Ic-IIa Fibronectina
6 1 Ic-IIa Laminina
3 3 Vitronectina
IIb 3 IIb-IIIa Fibrinógeno
FvW
Este heterodímero (GP IIb-IIIa) de 228 kDa, dependiente de calcio, cuyas
subunidades alfa y beta son codificadas por genes diferentes, se halla en forma
de monómero en la plaqueta en reposo, con los grupos de la cabeza de las
integrinas próximas a la superficie celular. Las señales desde el citosol activan a
las integrinas de forma que los grupos de las cabezas se extienden permitiendo
su unión con la matríz extracelular. La adhesión plaquetaria induce por lo tanto,
la señalización intracelular necesaria, mediante la estimulación de receptores de
tipo GP IV, para iniciar la fase de reacción de liberación o secreción plaquetaria,
que incluye la liberación de calcio extracelular, que se enlaza a la subunidad IIb
y que es requerido para lograr el cambio conformacional de la GP IIb IIIa y
permitir la agregación plaquetaria.
Los receptores asociados a proteínas G como el receptor de la trombina PAR-1
se caracterizan por tener siete hélices alfa transmembrana. La unión del ligando
al dominio extracelular de estos receptores, induce un cambio conformacional
que permite al dominio citosólico del receptor unirse a una proteína G unida a la
membrana interna de la membrana plasmática. Las proteínas G (familia más
numerosa de receptores de la superficie celular) son proteínas heterotriméricas
constituidas por tres subunidades, designadas alfa, beta y gama, que unen
nucleótidos de guanina. En el estado inactivo alfa se une al GDP formando un
13
complejo con beta y gama. La unión con su ligando produce un cambio
conformacional tal en el receptor, que el dominio citosólico de este interacciona
con la proteína G estimulando la liberación de GDP e intercambio con GTP. La
subunidad alfa unida al GTP ahora activada, se disocia de beta y gama, que
permanecen unidas formando un complejo beta-gama. La subunidad alfa unida
al GTP y el complejo beta-gama activados se disocian del receptor e
interaccionan con sus dianas respectivas, que pueden ser una enzima o un
canal iónico, a modo de interruptores fisiológicos regulando la actividad de
diversas dianas intracelulares en respuesta a señales extracelulares. La
actividad de la subunidad alfa finaliza mediante la hidrólisis del GTP unido a ella,
y la subunidad alfa inactiva unida al GDP se reasocia con el complejo beta-
gama. Así también, la estimulación del receptor FcR por la colágena, inicia una
cascada de transmisión de señales que estimulan a las tirosin cinasas activando
a la fosfolipasa C (PLC ) que cataliza la degradación de fosfatidilinositol bifosfato
(PIP2), a inositol trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG), el IP3 eleva las
concentraciones citoplásmicas de calcio y el DAG activa a la proteína cinasa C
(PKC) que también puede ser activada por fosfoinosítido 3 cinasa (PI3K). La
PKC fosforila a las cadenas ligeras de la miosina conduciendo a la separación
de los complejos actina-miosina presentes bajo la membrana plasmática,
permitiendo así que los gránulos entren en contacto con la membrana
plasmática. La elevación de calcio intracitoplásmico a su vez activa a la enzima
fosfolipasa A2 (PLA2) (Figura 9).
14
Figura 9. Vías de señalización plaquetaria. Se muestran dos tipos de receptores (receptores asociados a
proteína G y GP IV), así como las vías de señalización implicadas para la síntesis de tromboxano A2, la
liberación de los gránulos plaquetarios, y la liberación de calcio intracelular necesario para la activación de la GP IIb/IIIa
20.
La GP IIb de 136 kDa está formada por dos subunidades unidas por un enlace
disulfuro. A su vez, la GP IIIa de 92 kDa está formada por una subunidad de
cadena simple compuesta por 28 enlaces disulfuro. Sus principales dominios
estructurales son: el dominio localizado en el extremo N-terminal rico en cisteína
(primeros 100 aminoácidos) que contiene siete residuos de cisteína unidos por
un enlace disulfuro a un residuo de cisteina corriente arriba de Gly-349, el
dominio de unión a fibrinógeno (del aa 100 al 348), el núcleo resistente a
proteinasas rico en cisterna (423-622) que se encuentra unido al dominio N-
terminal por un enlace disulfuro, y el dominio C-terminal que comprende al
menos los subdominios, uno transmembrana (693-721) y otro intracitoplásmico
(722-762) (Figura 10) 20.
15
Figura 10. Patrón de puentes disulfuro y principales dominios de la GPIIIa. A la
izquierda: la lista de puentes disulfuro. Símbolos:◊– puntos de glucosilación, puntos de restricción para arginina y lisina
20.
El fibrinógeno consiste de un par de tres cadenas peptídicas (A , B , y ) y es
codificado a partir de 3 genes fibrinógeno- (FGA), fibrinógeno- (FGB) y
fibrinógeno- (FGG) , localizados en el cromosoma 4q28 en una región de
aproximadamente 50kb 21. Tiene una vida media de 72 a 120 horas y se
encuentra en concentraciones plasmáticas normales de 2,000 a 4,000 mcg/mL
22. Además, es rico en secuencias RGDS (Figura 11) 15.
Figura 11. Fibrinógeno. Se muestran las tres pares de polipéptidos ( , , ) del fibrinógeno, así como, la
región de la cadena denominada dominio D, rica en secuencias RGDS 21
.
16
Bajo condiciones normales las plaquetas no se adhieren a las células
endoteliales. La naturaleza no trombogénica de las células endoteliales está
dada por factores pasivos (una carga negativa en su superficie) y numerosos
procesos activos. La prostaciclina PG I2 es un vasodilatador que inhibe la
activación plaquetaria incrementando los niveles de AMPc. Las células
endoteliales también liberan factor relajante derivado del endotelio (EDRF)
también conocido como óxido nítrico (ON). Además, el activador del
plasminógeno tisular (tPA) promueve la lisis del coágulo. La trombomodulina
(TM) inactiva a las proteínas de la coagulación al inhibir a la trombina. Las
ADPasas catalizan la destrucción de ADP, disminuyendo la activación
plaquetaria 15.
En esencia tres factores contribuyen a la trombosis (triada de Virchow): el flujo
sanguíneo, la composición de la sangre (o potencial coagulante) y el endotelio
vascular; las variaciones en estos elementos ocasiona que la coagulación
responda de manera diferente en las arterias que en las venas. A su vez, el
grado de trombosis será determinado por la intensidad del evento iniciador
(lesión vascular), las fuerzas que promueven la propagación de la actividad
coagulante, y de la capacidad de los mecanismos anticoagulantes y fibrinolíticos.
Así pues, a diferencia de la trombosis arterial, en la trombosis venosa ésta
comienza por un foco inflamatorio en el área proximal a la válvula venosa,
secundario a hipoxemia como resultado de éstasis venosa, por lo cual
clínicamente tiene un inicio lento y gradual si el origen no es traumático, por tal
motivo el trombo venoso contiene menos plaquetas y más células inflamatorias y
eritrocitos, y por lo tanto, la influencia de los factores de la coagulación y
moléculas anticoagulantes para el riesgo de trombosis venosa se vuelve
substancial, más que la adhesión y agregación plaquetaria, lo que se pone de
manifiesto en el tratamiento de ambos tipos de trombosis 23.
Por otro lado, la composición de la placa ateroesclerosa como determinante del
riesgo de ruptura más que la estenosis luminar, se ha convertido en el mayor
determinante en esta enfermedad 24. Las placas inestables o vulnerables son
generalmente excéntricas y producen una estenosis 50%, tienen un gran
17
contenido lipídico extracelular separado del lumen arterial por una delgada capa
fibrosa de colágena, un número reducido de células musculares lisas vasculares
y abundante infiltración de macrófagos y linfocitos T que expresan una actividad
inflamatoria intensa, especialmente en la región de la placa denominada "codo".
Una placa estable es más concéntrica, con núcleos lipídicos intracelulares, sin
signos de actividad inflamatoria y cubiertas por gruesas capas de colágeno. No
es de sorprender que las primeras sean menos estables y por consiguiente,
tengan una alta propensión a romperse por su baja expresión de colágena y,
actividad inflamatoria intensa, a diferencia de las placas con capas fibrosas ricas
en colágena y baja actividad inflamatoria. La ruptura de la placa usualmente
ocurre en el punto más débil, el "codo" en donde la capa frecuentemente es más
delgada y más densamente infiltrada con células inflamatorias (Figura 12) 24-25.
Figura 12. Tipos de placa ateroesclerosa. A la izquierda se observa la
representación gráfica de una placa inestable o vulnerable, blanda y joven por su escasa cantidad de colágena y con una elevada cantidad de células inflamatorias. A la derecha una placa estable, dura y antigua por su alto contenido en colágena, mayor migración de células musculares lisas y escasa respuesta inflamatoria
24-25.
A la fecha, la prevención de la enfermedad arterial trombótica ha consistido en la
modificación de los factores de riesgo cardiovascular tradicionales, sin embargo,
aproximadamente la mitad de todos los eventos trombóticos ocurren en
pacientes sin dichos factores de riesgo 26, y los estudios epidemiológicos han
demostrado que estos factores son insuficientes para explicar completamente
las variaciones en la incidencia y el riesgo.
18
En un extremo, se encuentra un paciente joven sin factores de riesgo, con una
puntuación Framingham de riesgo bajo, una dieta y ejercicio regular apropiados
y que desarrolla un infarto al miocardio, con una angiografía posterior que revela
múltiples lesiones coronarias que requieren cirugía de revascularización. En el
otro extremo del espectro se encuentra un paciente de edad avanzada con
múltiples factores de riesgo, una puntuación de Framingham de alto riesgo,
obeso, sedentario y diabético. Este paciente, paradójicamente, se encuentra
asintomático a los 92 años de edad. Estos ejemplos límite representan los
extremos de un universo complejo, en donde múltiples factores clásicos, noveles
y genéticos interactúan de manera muy variada 25.
La hemostasia normal se mantiene por un cuidadoso equilibrio entre los
procesos protrombóticos y antitrombóticos, los cuales son mediados por
componentes celulares (plaquetas), proteínas solubles del plasma (factores de la
coagulación y sistema fibrinolítico), y factores derivados del endotelio. Las
alteraciones genéticas que comprometen la producción, actividad,
biodisponibilidad o metabolismo de factores específicos pueden alterar este
balance fisiológico a favor de la trombosis y predisponer a eventos
tromboembólicos y aterotrombóticos prematuros 27.
Uno de los polimorfismos más estudiados se encuentra en la subunidad GP IIIa,
un polimorfismo común T/C en la posición 1565 en el exón 2 del gen de la GP
IIIa localizado en el brazo largo del cromosoma 17 que conlleva a la sustitución
de leucina por prolina en el aminoácido 33 (Leu33/Pro), resultando en un cambio
conformacional del extremo disulfuro N-terminal importante para su unión con el
fibrinógeno 28. Este polimorfismo se encuentra en ~15% en individuos blancos y
5 al 8% en negros, pero está virtualmente ausente en asiáticos. La isoforma más
común de GP IIIa se conoce como PL A1 (HPA-1a) y codifica para leucina, para
la cadena de aminoácidos en la posición 33, y el polimorfismo menos común es
el alelo 33Pro conocido como PLA2 (HPA-1b) 29 (figura 13).
19
Figura 13. Análisis de los fragmentos de restricción de los alelos Pl A1/2 de la GP IIIa. Carril 6, marcador de peso molecular
de 100pb. Carril 4, producto de PCR sin restricción. Carril 3, muestra al genotipo A1/A1. Carril 2, muestra al genotipo heterocigoto A1/A2. Y Carril 1, muestra al homocigoto para el alelo A2
30.
La forma homocigoto A2/A2 se sabe que está asociada con púrpura post-
transfusional y trombocitopenia neonatal autoinmune, condiciones en las cuales
se forman autoanticuerpos en contra del alelo A1 28. En 1996, Weiss y cols.
publicaron por primera vez una asociación entre PLA2 con el riesgo de trombosis
coronaria aguda, el cual se presentó fuertemente en un pequeño subgrupo de
pacientes menores de 60 años, con un riesgo relativo de 6.2. Los posibles
mecanismos postulados de la relación entre el polimorfismo PLA2 y la trombosis
arterial, incluyen un aumento en la sensibilidad a la agregación plaquetaria por
varios agonistas y sensibilidad alterada a la aspirina31. Varios estudios
subsecuentes analizaron el papel del alelo PLA2 en la enfermedad arterial
coronaria y EVC, algunos de los cuales confirmaron su asociación 32-33 pero la
mayoría no. Muchos de estos estudios negativos, como el estudio prospectivo
US Physician's Health Study 34 y el estudio ECTIM 35, incluyeron un gran número
de pacientes y controles, así mismo, intentaron confirmar los hallazgos de Weiss
y cols. en un subgrupo de acuerdo a la edad, sin éxito. En contraste, en un
estudio de casos y controles en 200 sobrevivientes jóvenes a infarto al
miocardio, encontraron un modesto pero significativo 1.8 veces de mayor riesgo
en portadores del alelo PLA2, riesgo que se incrementó a 13.7 veces en
A2/A
2
A1/A
2
A1/A
1
UN
CU
T
LA
DD
ER
20
portadores que fumaban 36. Los autores concluyeron que al menos 50% de los
infartos al miocardio prematuros eran atribuibles a la interacción entre estos dos
factores de riesgo.
21
JUSTIFICACIÓN
La enfermedad arterial coronaria representa una de las primeras causas de
morbi-mortalidad en México y el mundo, por lo que constituye un problema de
salud pública. Se consideran como factores de riesgo para el desarrollo de
infarto al miocardio, la presencia de factores ambientales o algunas
enfermedades como: la hipertensión arterial sistémica, Diabetes mellitus,
tabaquismo, sedentarismo, dislipidemia, obesidad, hiperfibrinogenemia. Sin
embargo, se han establecido otro tipo de alteraciones genéticas denominadas
polimorfismos, las cuales al ser heredadas contribuyen al desarrollo de infarto al
miocardio. Dichos polimorfismos están presentes en algunas proteínas que
constituyen el sistema hemostático (coagulación y fibrinolisis). Uno de estos
polimorfismos es el PL A1/A2 que codifica para la GP IIIa, el cual produce un
incremento en la agregación plaquetaria. Debido a los reportes previos acerca
de la evaluación del gen PL A2 como factor de riesgo individual o asociado a
factores convencionales cardiovasculares, se requiere de más estudios para
confirmar o descartar dichos alelos como elementos contribuyentes. Por último,
en nuestro país no se cuenta con informes acerca de la frecuencia del
polimorfismo en el gen de la GP IIIa en pacientes con IAM, por lo que solo
contamos con resultados generados en otros países, la mayoría de ellos con un
genotipo muy diferente a nuestra población, motivo por el cual consideramos
importante determinar la participación de dichos marcadores genéticos como
posibles contribuyentes para el desarrollo de infarto al miocardio, así como su
posible asociación con otros factores de riesgo y de esta manera, establecer un
mejor entendimiento sobre la interacción entre los factores genéticos y
ambientales.
22
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN
¿Cuál es la frecuencia del polimorfismo PL A1/A2 en el gen de la GP IIIa, y su
asociación a factores de riesgo cardiovascular convencionales (hipertensión,
diabetes, tabaquismo, obesidad, dislipidemia) en pacientes con IAMCEST?
HIPÓTESIS
Ho: Los pacientes con IAMCEST no presentan asociación con los polimorfismos
en el gen de la GP IIIa.
Hi: Los pacientes con IAMCEST presentan asociación con los polimorfismos
en el gen de la GP IIIa.
OBJETIVOS
GENERAL:
Determinar la asociación entre la frecuencia del polimorfismo PL A1/A2 en el gen
de la GP IIIa en pacientes con IAMCEST.
ESPECÍFICOS:
1. Determinar la frecuencia del polimorfismo PL A1/A2 en pacientes con
IAMCEST.
2. Asociar la frecuencia de los polimorfismos en el gen de la GP IIIa con los
factores de riesgo cardiovascular convencionales y la presencia de
IAMCEST.
23
II. MATERIAL Y MÉTODOS
DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN
Estudio de casos y controles.
UNIVERSO DE TRABAJO
Pacientes que ingresaron al servicio de urgencias del Hospital de Cardiología de
CMNSXXI con diagnóstico clínico, electrocardiográfico y por laboratorio de
infarto agudo al miocardio, de enero del 2006 a junio del 2009.
GRUPOS DE ESTUDIO
A) Casos: pacientes con IAMCEST.
B) Controles: sujetos sin infarto al miocardio.
CRITERIOS DE INCLUSIÓN PARA EL GRUPO CONTROL
Pacientes de ambos géneros.
Mayores de 18 y menores de 45 años de edad.
Que acepten participar en el estudio mediante consentimiento informado.
Sin diagnóstico o antecedente de enfermedad aterotrombótica al momento
de su inclusión.
Sin tratamiento alguno
CRITERIOS DE INCLUSIÓN PARA PACIENTES CON IAM
Pacientes de ambos géneros.
Mayores de 18 y menores de 45 años.
Pacientes con diagnóstico de IAM con los siguientes criterios:
o Dolor torácico ≥ 20 minutos.
24
o Elevación del segmento ST en dos o más derivaciones contiguas de 2
mm en V1-3 y 1 mm en el resto.
o Elevación de CPK-MB o troponinas ≥ percentil 99.
CRITERIOS DE EXCLUSIÓN Y NO INCLUSIÓN PARA EL GRUPO CONTROL
Que no acepten participar en el estudio.
Que no cumplan con los criterios de inclusión.
Diagnóstico de algún proceso patológico después de haber sido incluido en
el estudio (clínicamente o por laboratorio).
Que usen terapia anticoagulante.
CRITERIOS DE EXCLUSIÓN Y NO INCLUSIÓN PARA PACIENTES CON IAM
Pacientes que no acepten participar en el estudio.
Con antecedentes de cardiomiopatía en cualquiera de sus variantes.
Cualquier valvulopatía cardiaca o cardiopatía congénita compleja.
Que usen terapia anticoagulante.
TAMAÑO DE LA MUESTRA
El tamaño de la muestra se estimó en base a las frecuencias reportadas en otras
poblaciones, con una n de 127.
VARIABLES
Dependiente:
o Infarto agudo al miocardio.- estado de desequilibrio entre el aporte y la
demanda de oxígeno en los tejidos que condiciona isquemia tisular
con presencia de lesiones necróticas. Tipo de variable cualitativa.
Escala de medición nominal, dicotómica. Unidades de medición sí/no.
25
Independiente:
o Presencia del polimorfismo PL A1/A2 del gen de la GP IIIa.-
polimorfismo se define como la variación de múltiples alelos en un
determinado locus en una frecuencia > 1% en una población
determinada. Tipo de variable cualitativa. Escala de medición nominal,
dicotómica. Unidades de medición sí/no.
Confusoras:
o Hipertensión arterial sistémica.- cuantificación de cifras de tensión
arterial sistólica de ≥ 140 mmHg y de diastólica de ≥ 90 mmHg en
mediciones repetidas, o bien cifras de tensión arterial normal pero bajo
tratamiento antihipertensivo previamente establecido. Tipo de variable
cualitativa. Escala de medición nominal, dicotómmica. Unidades de
medición sí/no.
o Diabetes Mellitus.- sujetos con una determinación de glucemia ≥ 126
mg/dl en ayuno de al menos 6 horas o bien ≥ 200 mg/dl a cualquier
hora del día con presencia de síntomas o bien cifras normales de
glucemia pero bajo tratamiento médico previo con hipoglucemiantes.
Tipo de variable cualitativa. Escala de medición nominal, dicotómica.
Unidades de medición sí/no.
o Tabaquismo.- consumo de tabaco en cualquier época de la vida de
por lo menos un cigarro por día durante un año, o bien la exposición
pasiva al humo de tabaco diariamente al menos un año. Tipo de
variable cualitativa. Escala de medición nominal, dicotómica. Unidades
de medición sí/no.
o Dislipidemia.- estado de desequilibrio entre el aporte y la demanda de
oxígeno en tejido miocárdico que condiciona isquemia tisular con
presencia de lesiones aterotrombóticas obstructivas. Se consideró
dislipidemia si el sujeto tenía nivel de colesterol mayor de 200 mg/dl o
26
que estuviera bajo tratamiento médico establecido. Tipo de variable
cualitativa. Escala de medición nominal, dicotómica. Unidades de
medición sí/no.
o Obesidad.- peso corporal secundario al acumulo de tejido adiposo que
confiere un índice de masa corporal > 30m2 de superficie corporal.
Tipo de variable cualitativa. Escala de medición nominal, dicotómica.
Unidades de medición sí/no.
o Antecedente familiar para enfermedad cardiovascular.- cuando un
familiar en primer grado (hombre menor de 55 años y mujer menor de
65 años de edad) tuvo una causa de muerte por enfermedad arterial
coronaria.
OBTENCIÓN DE LA MUESTRA SANGUÍNEA
Se extrajo de la vena antecubital 5 mL de sangre total (teniendo cuidado de que
el torniquete no fuera aplicado con mucha tensión), la cual se recolectó en un
tubo conteniendo EDTA, el cual se centrifugó a 2500 rpm por 10 minutos.
Posteriormente la capa superior (plasma) se retiró cuidadosamente tratando de
no perturbar la siguiente capa en donde se encuentra localizado el contenido de
células mononucleares (buffy coat), éste se transfirió con una pipeta de plástico
estéril a un tubo de plástico Eppendorf estéril de 1.5 mL libre de enzimas
(RNasas y DNasas). Finalmente el concentrado eritrocitario, el cual se encuentra
en la capa inferior se desechó en un contenedor destinado para material
(residuos peligrosos).
EXTRACCIÓN DE ADN
Se utilizó el equipo comercialmente disponible de la marca Qiagen (QIAamp
DNAMini Kit) de acuerdo a las instrucciones establecidas por la compañía. Una
vez extraído el ADN se procedió a su conservación en un ultracongelador a -
27
70°C, hasta que se utilizó para la amplificación de los segmentos
correspondientes.
DETERMINACIÓN DE PUREZA DE ADN
Se realizó la medida de la absorbancia a dos longitudes de onda: UV 260nm y
280 nm debido a que las bases púricas y pirimídicas absorben a 260 nm y los
grupos aromáticos en las proteinas a 280 nm. Haciendo el cociente entre la
absorbancia a 260 nm y la absorbancia a 280 nm se obtuvo un valor que refleja
el estado de pureza del ADN. Si este valor se encuentra entre 1.8-2.0, el ADN
obtenido se encuentra libre de contaminantes celulares. Valores por debajo de
1.8 indican contaminación.
DETERMINACIÓN DEL GENOTIPO DEL RECEPTOR DE LA GP IIIa
Una vez que se extrajo el ADN, se llevó a acabo su amplificación mediante el
uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bajo las siguientes
condiciones para la búsqueda del polimorfismo del gen que codifica para el
receptor de la GP IIIa. Para la reacción de PCR se utilizó un oligonucleótido
específico sentido 5'-TTCTGATTGCTGGACTTCTCTT-3' y un oligonucleótido
específico contrasentido 5'-TCTCTCCCCATGGCAAAGAGT-3'. La reacción de
PCR se llevó a cabo conteniendo lo siguiente: en un volumen final de 50 l
conteniendo 2 ng/ l de ADN, 0.8U de la enzima Taq DNA polimerasa, una
concentración final de 1x de buffer, 1.0 mmol/L de MgCl2, 100 mol/L de mezcla
de alelos específicos de dNTP, 400 nmol/L de oligonucleótido específico sentido
y contrasentido. La reacción de PCR se llevó a cabo mediante las siguientes
condiciones térmicas: una desnaturalización inicial de 94°C por 5 minutos,
posteriormente 35 ciclos de los siguientes segmentos, desnaturalización a 94°C
por 60 segundos, alineación a 57°C por 45 segundos, y extensión a 72°C por 60
segundos seguidos por una extensión final a 72°C por 15 minutos.
DETERMINACIÓN DE FRAGMENTOS POLIMORFICOS
Se procedió a visualizar una banda de 255 pb correspondiente al fragmento
amplificado el cual, mediante la técnica de RFLP, fue sometido a la acción de la
28
enzima de restricción Msp l. Los genotipos polimórficos fueron identificados
mediante electroforesis de los productos resultado de la acción enzimática con el
uso de la tinción del gel mediante bromuro de etidio 1 g/ml y se conservaron
mediante el uso de fotografías de los mismos y cada paciente fue clasificado en
uno de los tres genotipos PL A1/A1, PL A1/A2, PL A2/A2.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Las variables continuas fueron expresadas como medias y desviación estándar.
Las variables categóricas fueron expresadas en porcentajes. Las diferencias con
significancia estadística entre las variables continuas fueron determinadas
mediante el uso de la prueba de t de Student. Las diferencias entre las variables
categóricas fueron determinadas mediante la prueba de X2. El riesgo
independiente entre los factores de riesgo cardiovascular y la presencia del
polimorfismo fue estimado con razón de momios (OR con IC 95%) mediante el
análisis de regresión logística. Se consideró una diferencia estadística cuando el
valor de p fue 0.05. El análisis estadístico se realizó mediante el uso del
paquete SPSS v13.
FACTIBILIDAD Y ASPECTOS ÉTICOS
En el Instituto Mexicano del Seguro Social se cuenta con la infraestructura para
llevar a cabo la colección de muestras de pacientes con diagnóstico de IM, así
como para la realización de pruebas de biología molecular.
Con relación a los aspectos éticos, a todos los pacientes se les dió hoja de
consentimiento informado (ver apéndice 1) de acuerdo a la Declaración de
Helsinki de la Asociación Médica Mundial, sobre los Principios Éticos para la
Investigación Médica que involucra sujetos humanos, adoptada por la 18ª
Asamblea Médica Mundial, Helsinki Finlandia 1964, modificada en Tokio, Japón
1975 (ver apéndice 3).
29
III. RESULTADOS
Se estudiaron 127 pacientes con diagnóstico de IAMCEST que ingresaron en
forma consecutiva al servicio de la Unidad de Cuidados Intensivos Coronarios
(UCIC) del Hospital de Cardiología del CMN Siglo XXI y 127 sujetos sin
IAMCEST, que constituyeron el grupo control. No se encontraron diferencias
estadísticas respecto a la edad y sexo debido a que los grupos fueron pareados
en dichas variables. La edad promedio en el grupo control fue de 40.0 4.6
años y en el grupo de IAMCEST fue de 40.0 4.1 años con un valor de p=0.53.
El género predominante fue el masculino con un porcentaje de 82.6% en el
grupo control y 83.3% en el grupo de estudio con un valor de p<0.88. El índice
de masa corporal registrado en el grupo control fue de 27.10 ± 3.9, mientras que
en el grupo de IAMCEST fue de 28.14 ± 3.4, por lo que no se observaron
diferencias estadísticas (p<0.50). En relación a los factores de riesgo, el
porcentaje de tabaquismo en el grupo control fue del 13.3% y en el grupo de IM
fue de 65.87% (p<0.001). El porcentaje de sujetos hipertensos en el grupo
control fue de 9.4% mientras que en el grupo de IAMCEST fue del 43.65%
obteniendo también una diferencia significativa de p<0.001. La presencia de
Diabetes Mellitus se registro en un porcentaje del 8.7% en el grupo control y del
46.03% en el grupo de IM con un valor de p<0.001. La dislipidemia el grupo
control se obtuvo un porcentaje del 8.6% mientras que en el grupo de IAMCEST
fue del 47.62% con una diferencia de p<0.001. El porcentaje de antecedentes
heredofamiliares para enfermedad arterial coronaria fue del 8.6% en el grupo
control y de 42.06% en el grupo de IAMCEST con una diferencia de p<0.001. La
localización más frecuente del infarto correspondió a la cara inferior del
ventrículo izquierdo. Ninguno de los pacientes registro historia previa de angor
pectoris, todos estos resultados se resumen en la tabla 2.
30
Tabla 2. Comparación de las variables clínicas y demográficas entre casos y controles (datos publicados por: Isordia I, Leaños A, Sainz I, Reyes E, Borrayo G. Asociación
entre el polimorfismo 4G/5G en el gen del inhibidor del activador del plasminógeno-1 (PAI-1) y el infarto agudo del miocardio on elevación del ST en pacientes jóvenes. Rev Esp Cardiol 2009; 62:
365-72).
Variable Casos
(n=127)
Controles
(n=127)
Valor p
Edad (años, media DE±) 40 ± 4.6 40 ± 4.1 NS
Sexo (masculino %) 83.3 82.6 NS
IMC (kg/m2)) 28.1 ± 3.4 27.1 ± 3.9 NS
Tabaquismo (%) 65.8 13.3 <0.001*
HAS (%) 43.6 9.4 <0.001*
DM (%) 36 7.8 <0.001*
Dislipidemia (%) 47.6 8.6 <0.001*
Historia familiar de EAC (%) 42.5 11.8 <0.001*
Creatinina (mg/dl) 0.91 ± 0.37 0.83 ± 0.27 0.13§
EAC: enfermedad arterial coronaria, n= número de pacientes, NS= no
significativo, §= prueba de la t de Student, *= prueba de la X2.
Respecto a la distribución genotípica de los alelos PLA1 y PLA2 cuyos resultados
se muestran en la tabla 3, se encontró una diferencia estadísticamente
significativa para la distribución genotípica entre ambos grupos: OR=3.12 (IC
1.25-7.99), p=0.006 con la siguiente distribución: en el grupo de pacientes
A1/A1= 105 (82.7%), A1/A2= 22 (17.3%) y A2/A2= 0 (0%), mientras que en el
grupo control fue: A1/A1= 119 (93.7%), A1/A2= 8 (6.3%) y A2/A2= 0 (0%). En
relación con la frecuencia alélica también encontramos una diferencia
estadísticamente significativa: OR=2.92 (IC=1.21-7.28), p=0.008, y una
distribución alélica de la siguiente manera: en el grupo de pacientes con
IAMCEST A1= 232 (91.75%) y A2= 22 (8.25%), mientras que en el grupo de
controles A1= 246 (96.85%) y A2= 8 (3.15%).
31
Tabla 3. Distribución Genotípica y frecuencia alélica del polimorfismo PIA1/A2
en el gen de la glicoproteína plaquetaria IIIa en pacientes con IAMCEST y
controles.
IAMCEST
n=127 (%)
Controles
n=127 (%)
Valor de p
Genotipo 0.006*
A1/A1 105 (82.7%) 119 (93.7%)
A1/A2 22 (17.3%) 8 (6.3%)
A2/A2 0 (0%) 0 (0%)
Frecuencia alélica 0.008*
A1 232 (91.75%) 246 (96.85%)
A2 22 (8.25%) 8 (3.15%)
n= número de pacientes, *= prueba de la X2
Respecto a la relación clínica y de laboratorio de los diferentes alelos del
polimorfismo de la GP IIIa (tabla 4), no se encontró diferencia significativa entre
las medias del porcentaje de fracción de eyección del ventrículo izquierdo
(p=0.54), la concentración de creatinincinasa (CPK) fue de 1040 ± 248 U/L en
los sujetos con el genotipo PLA1/PLA1, mientras que en los portadores del
genotipo PLA1/PLA2 fue de 1916 ± 316 U/L (p=0.07). La concentración de
troponina I (TnI) fue una media de 13.4 ± 6.8 ng/dL en los sujetos portadores del
genotipo PLA1/PLA1, mientras que los sujetos portadores del genotipo
PLA1/PLA2 fue de 19.0 ± 7.6 ng/dL (p=0.03). En cuanto al estado inflamatorio, la
concentración de fibrinógeno fue mayor en los sujetos portadores del genotipo
PLA1/PLA1 (499 ± 152.2) que en los individuos con el genotipo PLA1/PLA2 (406
± 146.7) (p=0.02). La cifra de leucocitos en los sujetos del grupo PLA1/PLA1 fue
de 11,117 ± 2,669 y en los del grupo PLA1/PLA2 fue de 10,428 ± 2,584 (p=0.4).
En cuanto a la reperfusión, se efectuó un total de 62 procedimientos de
angioplastía coronaria transluminal percutánea (ACTP); de los cuales 36 se
llevaron a cabo en sujetos portadores de PLA1/PLA1, se consideraron exitosas
34 (88.2%), mientras que se efectuaron 26 en sujetos con el polimorfismo
PLA1/PLA2, 21 (78.5%) en forma exitosa (p=0.05).
32
Tabla 4. Relación clínica y de laboratorio de los alelos (PL1 y PL2) del
polimorfismo PLA1/PLA2 en el gen de la glicoproteína IIIa en pacientes con
IAMCEST.
PL1/PL1 PL1/PL2 Valor de p
Evaluación de la talla del infarto
FEVI (%) 53.2 ± 6.7 49.4 ± 7.4 0.54§
Creatinincinasa (U/L) 1040 ± 248 1916 ± 316 0.07§
Troponina (ng/dl) 13.4 ± 6.8 19.0 ± 7.6 0.03§
Estado inflamatorio
Leucocitos (µ/l) 11,117 ± 2,669 10,428 ± 2,584 0.40§
Fibrinógeno (mg/dl) 499 ± 152.2 406 ± 146.7 0.02§
Tipo de reperfusión
ACTP realizadas 36 26 0.05
ACTP exitosas, n (%) 34 (88.2%) 21 (78.5%)
FEVI: fracción de eyección del ventrículo izquierdo, APTC: angiografía coronaria
transluminal percutánea, § = prueba de la t de Student, * = prueba de la X2
En el análisis multivariado de regresión logística, cinco variables mantuvieron su
independencia como factores de riesgo de IAMCEST: ser portador del alelo A2
(PLA1/PLA2), el tabaquismo, la hipertensión, la dislipidemia y la historia familiar
de enfermedad arterial coronaria (tabla 5).
Tabla 5. Análisis de regresión logística utilizando IAMCEST como variable
dependiente.
Factor de riesgo Odd Ratio IC 95% Valor de p
Hipertensión 1.86 1.0-3.3 0.03
PL1/PL2 3.68 1.0-12.5 0.03
Tabaquismo 4.98 3.0-8.1 <0.001
Dislipidemia 3.20 1.8-5.6 <0.001
Historia familiar de EAC 4.66 2.0-4.6 0.02
EAC: enfermedad arterial coronaria.
33
IV. DISCUSIÓN
En el presente estudio se analizaron 127 pacientes con diagnóstico de IAM con
elevación del segmento ST de edad ≤ 45 años y 127 sujetos aparentemente
sanos para evaluar la presencia del polimorfismo plaquetario A1/A2 como
posible factor de riesgo cardiovascular en nuestra población. Se identificó por
primera vez en población mexicana al alelo genotipo A1/A2 como factor de
riesgo independiente para el desarrollo de IAMCEST en sujetos jóvenes
[OR=2.92 (IC=1.21-7.28), p=0.008]. Nuestros resultados están acordes con lo
publicado por Bojesen y cols., en el que se demostró una asociación significativa
entre el aleo PLA2 y el IAM en sujetos jóvenes 37 . Sin embargo, difiere de lo
publicado por Herrmann y cols, en donde no pudieron demostrar una asociación
entre la presencia del polimorfismo y el IAM 35. La frecuencia alélica fue similar a
la reportada en otras partes del mundo, pero a diferencia de otras poblaciones
de origen caucásico 29, en nuestro grupo de estudio no se identificaron sujetos
homocigotos para el alelo A2 (PL A2/A2), lo que puede deberse al mestizaje de
nuestra población. Las discrepancias entre diferentes estudios posiblemente es
el resultado de las diferencias en las características demográficas de las
poblaciones estudiadas alrededor del mundo; a la prevalencia de los factores de
riesgo tradicionales que influyen en menor o mayor grado en la génesis de la
enfermedad arterial coronaria; a la selección de pacientes por los distintos
autores de un amplio espectro de enfermedades como la angina estable,
inestable, infarto del miocardio sin elevación del segmento ST, con elevación del
segmento ST, y muerte súbita; a la disparidad en la edad de los grupos
estudiados; y finalmente a la influencia de otros polimorfismos presentes en el
sistema de la coagulación, fibrinolítico y endotelio en una misma población.
Anderson y cols. en 1999, no encontraron una asociación entre el alelo A2 y la
presencia de enfermedad arterial coronaria (estenosis coronaria >60%) en 549
individuos, pero sí encontraron una modesta asociación entre este alelo y la
presencia de infarto del miocardio en un subgrupo (n=225) de pacientes
[OR=1.5, p=0.006], con una fuerte asociación en sujetos de edad ≥60 años que
en jóvenes 30. Por otro lado, Gruchala y cols 38. encontraron una mayor
prevalencia del genotipo homocigoto PLA1/A1 en sujetos con enfermedad arterial
34
coronaria bivascular y trivascular que en sujetos con enfermedad en un solo
vaso coronario, y en mayor proporción en sujetos de más de 65 años en
comparación con jóvenes. Debido a la naturaleza retrospectiva de estos estudios
no fue posible asociar al alelo A2 con el desarrollo de infarto al miocardio fatal.
Por lo tanto, estos hallazgos no excluyen la posibilidad de que los portadores del
alelo A2 hallan tenido una muerte temprana por eventos cardiovasculares, lo que
explicaría el exceso del genotipo A1/A1 en pacientes de edad avanzada. Lo
anterior permite plantear la necesidad de realizar estudios prospectivos y en
pacientes jóvenes, como es el caso del presente trabajo. Además, es posible
inferir, que en el paciente joven en ausencia o escases de factores de riesgo
convencionales, existen otros polimorfismos involucrados que inducen a la
formación de una placa de ateroma inestable, y que en su historia natural de la
enfermedad, al romperse, fracturarse o erosionarse, debido a una mayor
afinidad de la adhesión y agregación plaquetaria por el alelo A2, se genera la
máxima expresión patológica de trombosis en la enfermedad arterial coronaria,
el IAMCEST.
López y cols. en el 2004 encontraron una fuerte interacción entre el alelo PLA2 y
el tabaquismo en sujetos con enfermedad arterial coronaria con un aumento en
el riesgo de 2.2 veces (IC= 1.1-4.5, p <0.028) a los tres años de
revascularización por angina refractaria o infarto del miocardio, y de muerte.
Mientras que en ausencia de tabaquismo, la presencia del polimorfismo por si
sola no incrementó el riesgo. Estos resultados dan soporte a la idea de que el
polimorfismo PLA2 en asociación con factores de riesgo ambientales como
tabaquismo, pueden contribuir en alterar el curso de la ateroesclerosis hacia la
ruptura de la placa y la formación del trombo 39. Al igual que en otros estudios
relacionados, en este estudio los factores de riesgo tradicionales tuvieron un
impacto aditivo con el polimorfismos de la GP IIIa PLA1/A2, por lo que el estudio
de estos factores genéticos y el control de los factores de riesgo modificables
podrían en un futuro, ser una de las herramientas en la prevención de IAMCEST,
especialmente en jóvenes.
Por lo tanto, el infarto agudo del miocardio es una enfermedad que resulta de la
interacción entre factores genéticos y ambientales 40. Tradicionalmente se han
35
considerado como factores de riesgo cardiovascular al tabaquismo, diabetes,
hipertensión arterial, sedentarismo, dislipidemia, obesidad e incremento en la
concentración de fibrinógeno. Sin embargo, en la última década se han
identificado variantes genéticas denominadas polimorfismos las cuales se han
asociado al desarrollo de IAM 41-43. Entre los polimorfismos más importantes que
han sido estudiados y que se consideran en la actualidad como riesgo para IAM
tenemos, el localizado en el gen que codifica para el inhibidor del activador del
plasminógeno tipo 1 (PAI-1). Recientemente en el 2009 se demostró en esta
misma muestra de pacientes (casos y controles) una de las frecuencias más
bajas reportadas del alelo 4G, pero similar a la descrita en población
afroamericana y japonesa, lo que podría explicarse por el tipo de mestizaje del
mexicano (mezcla étnica indígena, negra y española, principalmente). Así
mismo, se encontró al alelo 4G como un factor de riesgo independiente
[OR=2,29 IC(95%)= 1.12-4.68, p=0.022] para el desarrollo de IAMCEST en
jóvenes de edad ≤ 45 años, también se obtuvieron concentraciones de PAI-1
más elevadas para sujetos homocigotos para 4G que los heterocigotos 4G/5G y
homocigotos 5G (ver tablas 6-8, apéndice 4-6) 44. La adhesión y agregación
plaquetaria tienen una participación importante en la fisiopatología de la
formación del trombo en el IAM, razón por la cual se ha estudiado la posible
asociación entre el polimorfismo PLA1/A2 y el desarrollo temprano de IAM en
sujetos jóvenes en diversas poblaciones en todo el mundo 45,46. Por lo anterior,
es posible explicar como algunos sujetos jóvenes en ausencia de factores de
riesgo convencionales desarrollan IAM debido a una mayor susceptibilidad para
la formación de placas de ateroma inestables, a un estado de hipofibrinolisis, y a
un aumento en la agregación y adhesión plaquetaria.
Una limitante de este estudio es que no se realizó agregometría plaquetaria en
cada uno de los pacientes, sin embargo, se ha demostrado previamente y en
múltiples ocasiones, que la variante del alelo PLA2 se asocia con un incremento
en la adhesión y agregación plaquetaria 45. Esto es debido a que el cambio
conformacional en el receptor produce un incremento en la capacidad de unión
con la molécula de fibrinógeno y al factor de von Willebrand, los cuales son
indispensables para su unión interplaquetaria y al endotelio. Por lo tanto,
36
podemos hipotetizar que este tipo de pacientes portadores del alelo A2, cursan
con un incremento de la participación plaquetaria en la formación del trombo.
37
V. CONCLUSIONES
Se demostró por primera vez en nuestro país, que el alelo A2 del gen de
la GP IIIa representa un factor de riesgo para el IAMCEST en sujetos
jóvenes menores de 45 años.
Los antecedentes de tabaquismo, diabetes, hipertensión y
heredofamiliares de enfermedad aterotrombótica coronaria también
representan factores de riesgo para IAMCEST.
En la población estudiada no se identificó el genotipo homocigoto para el
alelo A2 (A2/A2), lo cual nos indica diferencias en la distribución
genotípica entre los diversos grupos étnicos en el mundo, estando
ausente en la población mestiza mexicana, por lo que probablemente se
requiera de más estudios incluyendo un mayor número de sujetos.
38
VI. PERSPECTIVAS PARA TRABAJOS FUTUROS
Es una línea de investigación adicional, ver la presencia del polimorfismo
estudiado en los pacientes con IAMCEST que han sido sometidos a
angioplastia primaria y colocación de Stent, con o sin liberación de fármacos,
especialmente en la actualidad en que se han identificado algunos pacientes no
respondedores al manejo con inhibidores de la GP IIb IIIa. Quedan aún
preguntas por responder respecto al impacto de estos y otros polimorfismos del
sistema hemostático, en la respuesta al tratamiento trombolítico y antiagregante
plaquetario en pacientes con IAMCEST, y su asociación con re-estenosis post-
angioplastía y post-colocación de Stent. Es necesario realizar más estudios en
relación a la frecuencia de polimorfismos considerados como factores de riesgo
cardiovascular en población mexicana, como interaccionan con los factores de
riesgo convencionales y determinar su participación en la génesis de la
aterotrombosis, para así establecer medidas preventivas en la corrección de los
factores de riesgo modificables, complementar las guías para la estratificación
del riesgo de enfermedad arterial coronaria y riesgo para IAM, para determinar el
mejor tratamiento para el IAM, así como para establecer factores pronósticos de
la enfermedad arterial coronaria y el IAM.
39
VII. REFERENCIAS
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44
APÉNDICE 1
HOSPITAL DE CARDIOLOGIA CMN SXXI
SERVICIO DE URGENCIAS
HOJA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO
Por medio de la presente yo________________________________________ doy mi autorización a la Dra. Irma Isordia Salas y colaboradores para participar en el estudio de investigación titulado ―FRECUENCIA DE LOS POLIMORFISMOS PL A1/A2 EN EL GEN DE LA GLICOPROTEÍNA PLAQUETARIA IIIa EN PACIENTES CON INFARTO MIOCÁRDICO‖. mismo que consiste en la toma de muestra sanguínea (5ml) para la determinación de la presencia de dichos polimorfismos mediante técnicas de biología molecular, y forma parte del estudio integral de mi padecimiento; mi participación es voluntaria. En caso de negarme, dicha decisión no repercutirá en lo absoluto en mi tratamiento. Se me ha explicado ampliamente el procedimiento y debido a que no implica ningún riesgo y conozco de manera precisa la gravedad de mi enfermedad, firmo de conformidad. Firma del paciente _______________________________________________________ Domicilio________________________________________________________ _______________________________________________________________ Fecha__________________________________________________________ Testigos________________________________________________________
45
APÉNDICE 2
HOSPITAL DE CARDIOLOGIA CMN SIGLO XXI HOJA DE RECOLECCION DE DATOS
PROTOCOLO: ―FRECUENCIA DE LOS POLIMORFISMOS PL A1A2 EN EL GEN DE LA GLUCOPROTEÍNA PLAQUETARIA IIIa EN PACIENTES CON INFARTO MIOCÁRDICO‖. Nombre:______________________________________________________ No deFiliación:________________________________________________ Edad:____________________Sexo:_________________ Tel:___________ Peso:__________________Talla:__________________Sedentarismo:____ DM ______________ HAS:________________Tabaquismo:___________________ CK______________________ CK-MB____________________DHL_____________ Troponina_______________HDL________________VLDL_____________ Microalbuminuria___________________________ LDL _____________________ Glucosa: ______________________ Colesterol: _____________________ Triglicéridos:____________________Fibrinógeno:____________________ Hemoglobina: __________________Hematócrito:_____________________ Leucocitos _____________________Plaquetas______________________ Presión diastólica________________ Presión sistólica_________________ Medicamentos antihipertensivos: _________________________________ Medicamentos hipoglucemiantes: _________________________________ Otro tipo de medicamentos ______________________________________ Colocación de stent: ____________________________________________ Realización de angioplastía: _____________________________________ Genotipificación: PIA1/A1_____________PIA1/A2________________PIA2/PIA2_________________ DM: Diabetes Mellitus HAS: Hipertensión Arterial Sistémica DHL: Deshidrogenasa Láctica HDL: Lipoproteínas de alta densidad VLDL: Lipoproteínas de muy baja densidad
LDL: Lipoproteínas de baja densidad CK: Creatininfosfoquinasa
46
APÉNDICE 3
Declaración de Helsinki de la Asociación Médica Mundial, sobre los Principios
Éticos para la Investigación Médica que involucra sujetos humanos, adoptada
por la 18ª Asamblea Médica Mundial, Helsinki Finlandia 1964, modificada en
Tokio, Japón 1975. Quien establece los siguientes lineamientos:
1. El objetivo principal de la investigación médica en humanos consiste en
mejorar los procedimientos de diagnóstico, terapéuticos y profilácticos, así como
también, la compresión de la etiología y patogénesis de la enfermedad. Aún los
métodos profilácticos, de diagnostico y terapéuticos más probados deben
ponerse a prueba de modo contínuo a través de la investigación para su
efectividad, eficacia, accesibilidad y calidad.
2. Constituye el deber del médico en una investigación médica el proteger la
vida, la salud, la privacidad y la dignidad del ser humano.
3. En cualquier investigación sobre seres humanos, cada paciente potencial
debe estar debidamente informado respecto a los objetivos, métodos, fuente de
los fondos, cualquier conflicto de interés, afiliaciones institucionales del
investigador, beneficios anticipados y peligros potenciales del estudio, así como
también, de la incomodidad que el mismo pueda implicar. Se le debe de informar
que tiene plena libertad de rehusarse a participar en el estudio y que dicha
libertad también alcanza la facultad de retirarse su consentimiento para
participar en el estudio en cualquier momento sin ningún tipo de represalia.
Luego de asegurarse que el paciente ha entendido la información, el médico
deberá obtener el consentimiento informado otorgado voluntariamente por el
paciente, de preferencia por escrito. Si el consentimiento no se puede obtener
por escrito, el consentimiento no escrito debe documentarse de modo formal y
se debe dar testimonio del mismo.
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APÉNDICE 4
Tabla 6. Distribución del genotipo 4G/5G y frecuencia alélica del polimorfismo en
el gen del PAI-1 entre ambos grupos.
Casos (n=127) Controles (n=127) Valor de p*
Genotipo, n (%)
4G/4G + 4G/5G 73 (57,48) 55 (43,3) 0,032
5G/5G 54 (42,52) 72 (56,7)
4G/4G 9 (7,1) 17 (13,4) 0,024
4G/5G 64 (50,4) 38 (30)
5G/5G 54 (42,5) 72 (56,6)
Frecuencia alélica, n (%) 0,461
4G 82 (32,3) 72 (28,4)
5G 172 (67,7) 182 (72,6)
PAI-1: inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1
* = prueba de la X2
Se encontró que el genotipo más frecuente fue el heterocigoto 4G/5G (50.4%), seguido del homocigoto para 5G (42.5%), el menor fue el homocigoto 4G (7.1%). La frecuencia alélica en el grupo de IAMCEST fue para el alelo 4G (32.3%) y (67.7%) para el alelo 5G. En el grupo control el genotipo 4G/4G fue del 13.4%, el 4G/5G el 30%, y el 5G/5G el 56%. La frecuencia del alelo 5G fue del 71.6% en el grupo control. Se encontró una diferencia significativa en la distribución genotípica (p<0.002), pero no en la frecuencia alelica entre los pacientes con IAMCEST y el grupo control (p=0.46). En el análisis univariado se determinó riesgo de IAMCEST en los sujetos portadores del alelo 4G (4G/4G y 4G/5G) comparado con los homocigotos para el alelo 5G (5G/5G), con OR=1.77 (IC=95%, 1.04-3).
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APÉNDICE 5
Tabla 7. Impacto clínico del alelo 4G en pacientes de edad ≤ 45 años con
IAMCEST
Alelo 4G Alelo 5G Valor de p
Estimación del tamaño del infarto
FEVI (%) 44.7 ± 8.5 44.3 ± 9.6 0.58§
Creatinincinasa (U/L) 1,756 ± 1,661 956 ± 767 0.01§
Troponina (ng/dl) 15.6 ± 13.08 8.5 ± 8.4 0.05§
Estado inflamatorio
Leucocitos (µ/l) 10,754 ± 2,232 10,436 ± 3,113 0.64§
Fibrinógeno (mg/dl) 585 ± 187 471 ± 133 0.02§
Tipo de repercusión
ACTP realizadas 14 24
ACTP con éxito, n (%) 8 (57.1%) 21 (87.5%) 0.05*
ACTP: Angioplastía Coronaria Transluminal Percutánea. §= prueba de la t de Student *= prueba de la X2
No se encontró diferencia significativa entre las medias del porcentaje de fracción de eyección del ventrículo izquierdo (p=0.58). La concentración de creatincinasa estuvo en una media de 956 ± 767 U/L en los sujetos portadores del alelo 5G, mientras que en los portadores del alelo 4G fue 1,756±1,661 U/L (p=0.01). La concentración de troponina I fue una media de 8.5 ± 8.4 ng/dL en los sujetos portadores del alelo 5G, mientras que los sujetos portadores del alelo 4G fue 15.6 ± 13.08 ng/dL (p=0.05). En cuanto al estado inflamatorio, la concentración de fibrinógeno fue mayor en los sujetos portadores del alelo 4G (585 ± 187 mg/dL) que en los individuos con el alelo 5G (471 ± 133 mg/dL) (p=0.02). La cifra de leucocitos en los sujetos del grupo 4G fue de 10,754 ± 2,232 y en los grupo 5G de 10,436 ± 3,113 (p=0.64). En cuanto a la reperfusión, se efectuó un total de 38 procedimientos de angioplastía coronaria transluminal percutánea, de los cuales 24 se llevaron a cabo en sujetos portadores del alelo 5G, se consideraron exitosos a 21 (87.5%), mientras que se efectuaron 14 en sujetos portadores del alelo 4G, 8 (57.1%) en forma exitosa (p=0.05).
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APÉNDICE 6
Tabla 8. Razón de momios (OR) ajustada de infarto del miocardio para el alelo
4G.
Variable OR (IC del 95%) Valor de p
Diabetes mellitus 1.26 (0.40-3.97) 0.69
Dislipidemia 0.87 (0.27-2.77) 0.82
Alelo 4G 2.29 (1.12-4.68) 0.022
Hipertensión 5.42 (1.67-17.56) 0.005
Tabaquismo 23.23 (8.92-60.47) < 0.001
Antecedentes familiares 4.66 (2.06-10.52) < 0.02
IC: intervalo de confianza.
En el análisis multivariado de regresión logística, cuatro variables mantuvieron su independencia como factores de riesgo de IAMCEST: ser portador del alelo 4G (4G/4G + 4G/5G), el tabaquismo y el antecedente de enfermedad cardiovascular e hipertensión arterial.
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APÉNDICE 7
CRONOGRAMA
Las etapas del proyecto han sido definidas en función de los objetivos y metas
específicos como sigue:
Etapa 1. (Agosto del 2008 a enero del 2009).
A) Presentación del protocolo.
Etapa 2. (Febrero a julio del 2009).
A) Estandarizacion de las técnicas de biología molecular.
B) Genotipificación de las muestras de ambos grupos (casos y controles)
mediante técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y búsqueda
de los polimorfismos mediante el uso de enzimas de restricción específicas
(RFLP).
Etapa 3. (Agosto del 2009 a enero del 2010)
A) Recopilación, análisis y discusión de todos los datos obtenidos
B) Elaboración de Tesis
Etapa 4. (Febrero a julio del 2010).
A) Elaboración de artículo para envío a revista indexada.