I. Nomor Percobaan : V

II. Nama Percobaan : Penentuan Kadar Protein Secara Biuret

III. Tujuan Percobaan : Untuk menentukan kadar suatu protein dengan

menggunakan spektrometer

IV. Landasan Teori

Protein merupakan polimer asam amino. Ada puluh asam amino yang berbeda

merupakan penyusun protein alami. Protein dibedakan satu sama lain berdasarkan tipe,

jumlah dan susunan asam aminonya. Perbedaan ini menyebabkan perbedaan struktur

molekuler, kandungan nutrisi dan sifat fisikokimia. Protein merupakan konstituen penting

dalam makanan, dimana protein merupakn sumber energi sekaligus mengandung asam-

asam amino esensial seperti lysine, tryptophan, methionine, leucine, isoleucine dan valine

(esensial berarti penting bagi tubuh, namun tidak bisa disintesis dalam tubuh). Protein juga

merupakan komponen utama dalam berbagai makanan alami, yang menentukan tekstur

keseluruhan, misalnya keempukan produk daging atau ikan, dan sebagainya. Protein

terisolasi sering digunakan dalam makanan sebagai unsur kandungan (ingredient) karena

sifat atau fungsi uniknya, antara lain kemampuannya menghasilkan penampilanm tekstur

atau stabilitas yang diinginkan. Misalnya, protein digunakan sebagai agen pembentuk gel

(gelling agent), pengemulsi (emulsifier), pembentuk busa (foaming agent) dan pengental

(thickener). Beberapa protein makanan merupakan enzim yang mampi meningkatkan laju

reaksi biokimia tertentu, baik yang menguntungkan maupun yang merugikan merusak. Di

dalam analisis makanan, mengetahui kadar total, jenis, struktur molekul dan sifat

fungsional dari protein sangat penting.

Spektrofotometri adalah cara analisa kuantitatif berdasarkan transmitansi atau

absorban larutan terhadap cahaya pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan

instrumen spektrofotometer. Apabila suatu cahaya yang mengandung seluruh spektrum

dari panjang gelombang melewati suatu medium, misal kaca berwarna atau larutan yang

meneruskan cahaya dengan panjang gelombang tertentu dan menyerap cahaya yang

lainnya maka medium seakan-akan berwarna. Warna ini sesuai dengan panjang gelombang

yang diteruskan dan disebut sebagai warna komplementer.

Sejumlah metode telah ditemukan untuk pengukuran kadar protein berdasarkan

spektroskopi UV-visible. Metode ini berdasarkan kemampuan protein menyerap (atau

membaurkan) cahaya di daerah UV-visible. Atau secara kimiawi atau fisik memodifikasi

protein untuk membuatnya menyerap (atau membaurkan) cahaya di daerah UV-visible.

Prinsip dasar di balik masing-masing uji ini serupa. Pertama-tama, semua serapan kurva

kalibrasi (atau turbiditas) vs kadar protein disiapkan menggunakan satu seri larutan protein

yang sudah diketahui kadarnya. Serapan (atau turbiditas) larutan yang dianalisis kemudan

diukur pada panjang gelombang yang sama, dan kadar protein ditentukan dari kurva

kalibrasi. Perbedaan utama pengujian ini adalah gugus fungsi yang berperan untuk absorbsi

atau pembiasan radiasi elektromagnetik, misalnya ikatan peptida, rantai samping aromatis,

gugus inti dan agregat protein.

Sejumlah metode UV-visibe untuk penetapan kadar protein sebagai berikut :

a. Pengukuran langsung pada 280nm.

Tryptophan dan tyrosine mengabsorbsi kuat cahaya uv pada 280 nm. Kandungan

tryptophan dan tyrosine berbagai protein umumnya konstan sehingga serapan larutan

protein pada 280 nm dapat digunakan untuk menentukan kadarnya. Keuntungan metode ini

karena sederhana untuk dilakukan, non-destruktif, dan tidak dibutuhkan reagen khusus.

Kerugian utama : asam nukleat juga mengabsorbi kuat pada 280 nm dan sehingga

mengganggu pengukuran protein jika ada dalam kadar yang bermakna. Namun demikian,

metode ini telah berkembang untuk mengatasi masalah ini, antara lain dengan pengukuran

serapan pada dua panjang gelombang yang berbeda.

b. Metode Biuret

Warna violet akan terbentuk bila ion cupri (Cu2+) berinteraksi dengan ikatan

peptida dalam suasana basa. Reagen biuret, yang mengandung semua bahan kimia yang

diperlukan untuk analisis sudah tersedia di pasaran. Reagen ini dicampurkan dengan

larutan protein, didiamkan 15-30 menit, kemudian diukur serapannya pada 540 nm.

Keuntungan utama dari teknik ini adalah tidak adanya gangguan dari senyawa yang

menyerap pada panjang gelombang yang lebih rendah. Teknik ini kurang sensitif terhadap

jenis protein karena absorpsi yang terjadi melibatkan ikatan peptida yang ada di semua

protein, bukan pada gugus samping spesifik.

c. Metode Lowry

Metode Lowry mengkombinasikan pereaksi biuret dengan pereaksi lain (Folin-

Ciocalteauphenol) yang bereaksi dengan residu tyrosine dan tryptophan dalam protein.

Reaksi ini menghasilkan warna kebiruan yang bisa dibaca di antara 500 - 750 nm,

tergantung sensitivitas yang dibutuhkan. Akan muncul puncak kecil di sekitar 500 nm yang

dapat digunakan untuk menentukan protein dengan konsentrasi tinggi dan sebuah puncak

besar di sekitar 750 nm yang dapat digunakan untuk menentukan kadar protein dengan

konsentrasi rendah. Metode ini lebih sensitif untuk protein dengan konsentrasi rendah

dibanding metode biuret.

d. Metode pengikatan pewarna

Pewarna dengan muatan negatif (anionik) ditambahkan dalam jumlah berlebih pada

larutan protein yang pH nya telah disesuaikan sehingga protein menjadi bermuatan positif

(misalnya dibuat di bawah titik isoelektrik). Protein membentuk kompleks tak larut dengan

pewarna karena interaksi elektrostatik antar molekul, tapi masih tersisa pewarna tak terikat

yang larut. Pewarna anionik berikatan dengan gugus kationik dari residu asam amino basa

(histidine, arganine dan lysine) dan pada gugus asam amino bebas di ujung. Jumlah

pewarna tak terikat yang tersisa setelah kompleks protein-pewarna dipisahkan (misalnya

dengan sentrifugasi) ditentukan dengan pengukuran serapan. Jumlah protein yang ada di

larutan awal berhubungan dengan jumlah pewarna yang terikat :

[Pewarnaterikat] = [Pewarnaawal] - [Pewarnabebas]

e. Metode Turbimetri

Molekul protein yang umumnya laruta dapat dibuat mengendap dengan

penambahan senyawa kimia tertentu, seperti asam trikloroasetat. Pengendapan protein

menyebabkan larutan menjadi keruh, sehingga konsentrasi protein dapat ditentukan dengan

mengukur derajat kekeruhan (turbiditas).

Keuntungan dan kerugian menggunakan UV-visible

Keuntungan :

Teknik UV-visible merupakan teknik yang cepat dan sederhana, serta sensitif terhadap

protein dengan konsentrasi rendah.

Kerugian :

Sebagian besar teknik UV-visible memerlukan larutan yang encer dan jernih, serta

tidak mengandung senyawa kontaminan yang dapat mengabsorpsi atau memantulkan

cahaya pada panjang gelombang di mana protein akan dianalisis. Karena diperlukan

larutan jernih, maka makanan harus mengalami sejumlah tahap preparasi sampel sebelum

dianalisis, seperti homogenisasi, ekstraksi pelarut, sentrifugasi, filtrasi, dsb. yang dapat

menyita waktu dan tenaga. Selain itu, kadang-kadang sulit untuk secara kuantitatif

mengekstraksi protein dari jenis makanan tertentu, terutama bila makanan tersebut telah

mengalami proses dimana protein menjadi agregat atau terikat secara kovalen dengan

senyawa lain. Kelemahan lain adalah, serapan tergantung pada jenis protein (karena

protein yang berbeda mempunyai sekuens/urutan asam amino yang berbeda pula)

HUKUM LAMBERT-BEER

Lambert merumuskan hubungan antara absorbansi dan panjang gelombang yang

ditempuh sinar dalam larutan.

Log P 0P

= k1’ b ........................(1)

Dimana Log P 0P

= absorbansi

P = tenaga radiasi yang keluar medium

Po = tenaga radiasi yang masuk medium

b = tebal lapisan medium

Menurut Beer, absorbansi dipengaruhi oleh konsentrasi sehingga

Log P 0P

= k2’ c ........................(2)

Bila k1’ = f (c) dan k2’ = f (b) maka substitusi dari persamaan (1) dan (2) adalah :

Log P 0P

= f (c) b Log P 0P

= f (b) c

f (c) b = f (b) c

f (c)c

= f (b)

b = k

Maka Log P 0P

= f (c) b = f (b) c = k ∙ c ∙ b

Jika konsentrasi larutan dalam mol/liter maka k harus ditulis sebagai ε dimana ε =

absortivitas molar

Log P 0P

= ε b c

Jika konsentrasi larutan dalam gram/liter maka k harus ditulis sebagai a dimana a =

absortivitas

Log P 0P

= a b c

A = a b c

Jika absorbsi = Log P 0P

= transmitansi (T)

A = Log P 0P

= Log 1T

= - log T

% T = P 0P

x 100%

Metode least square

Metode Least Square dipilih untuk pendekatan spektrofotometer menurut Hukum

Beer yang merupakan dasar absorbsi.

A = a b c

Dimana :

a = absortivitas c = konsentrasi zat pengabsorbsi

b = tebal cuvet

Bila A dialirkan untuk c terhadap cuplikan yang tebalnya b cm akan menghasilkan

daerah dimana hukum Beer berlaku suatu garis lurus dengan lereng ab.

A

C

Tetapi secara instrumentasi didapat grafik yang kurang memenuhi hubungan linier

antara absorbsi dan konsentrasi pada penentuan absorbansi larutan sehingga untuk

memenuhi hukum Beer kurva A vs C dipakai metode Least Square.

y = mx + c

dimana :

y = absorbansi

m = bilangan tetap (konstanta)

x = kadar larutan seri

Sedangkan m=n ∑ xy−∑ x ∑ y

n ∑ x2−(∑ x )2

c = ∑ x2∑ y−∑ x ∑ xy

n ∑ x2−(∑ x )2

V. Alat dan Bahan

Alat :

- Rak tabung reaksi

- Beker gelas

- Pipet tetes

- Spektrometer

- Tabung reaksi

- Gelas ukur

- Batang pengaduk

Bahan :

- reagen-reagen

reagen biuret : Larutkan 1,5 gr CuSO4.5H2O dan 6,0 gr natrium kalium tartrat (NaK

C4O6.4H2O) kedalam kira-kira 500 ml air di labu takar 1 liter. Kemudian tambahkan

300 ml 10 % NaOH sambil d ikocok-kocok. Dan akhirnya tambahkan air sampai garis.

Larutan biru ini dapat disimpan lama sekali. Apabila pembuatannnya kurang baik

dapat terjadi endapan hitam atau merah. Reagen yang demikian tidak boleh dipakai.

Larutan protein : buatlah larutan serum albumin murni atau kasein dalam air yang

berkadar 10 mg per ml. untuk mudah larutannya tambahkan beberapa tetes 3 %

NaOH.

VI. Prosedur Percobaan

Pipet kedalam tabung reaksi 1 ml larutan protein yang mengandung 1 sampai 10

mg per ml. tambahkan 4 ml reagen biuret. Kocok dan diamkan selama 30 menit pada suhu

kamar. Baca serapannya pada 540 nm. Untuk blanko dipakai campuran 1 ml air dan 4 ml

reagen biuret yang juga didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Hukum lambert-beer

berlaku untuk larutan-larutan protein antara 1 dan 10 mg per ml.

VII. Hasil Pengamatan

Konsentrasi Kasein

(mg/ml)

Adsorbansi (A)

albumin

Adsorbansi (A)

blanko

1 0,199 0,148

2 0,249 0,137

3 0,299 0,154

4 0,341 0,153

5 0,465 0,141

6 0,561 0,142

7 0,592 0,146

8 0,598 0,141

9 0,623 0,142

10 0,676 0,141

Absorbansi Sampel : 0.536

VIII. Reaksi Kimia

IX. Analisa Data

X Y XY X2

1 0,199 0,199 12 0,249 0,498 43 0,299 0,897 94 0,341 1,364 165 0,465 2,325 256 0,561 3,366 367 0,592 4,144 498 0,598 4,784 649 0,623 5,607 8110 0,676 6,76 100

X= 55 Y= 4,603 XY = 29,944 X2 = 385

N . XY - X . Y Slope (A) =

N . X2 – (X)2

10(29,944) – 55 (4,603) =

10 (385) – (55)2

= 0,056091

Y . X2 - X . XY Intersep =

N . X2 – (X)2

4,603(385) – 55 (29,944) =

10 . 385 – (55)2

= 0,1518

Y = AX+ B

Y = 0,06 X + 0,15 Y = 0.06 X + 0.15 = 0,06 (1) + 0,15 = 0.06 (6) + 0.15 = 0,21 = 0.51Y = 0,06 X + 0,15 Y = 0.06 X + 0.15 = 0,06 (2) + 0,15 = 0.06 (7) + 0.15 = 0,27 = 0.57Y = 0,06 X + 0,15 Y = 0.06 X + 0.15 = 0,06 (3) + 0,15 = 0.06 (8) + 0.15 = 0,33 = 0.63Y = 0,06 X + 0,15 Y = 0.06 X + 0.15 = 0,06 (4) + 0,15 = 0.06 (9) + 0.15 = 0,39 =0.69Y = 0,06 X + 0,15 Y = 0.06 X + 0.15 = 0,06 (5) + 0,15 = 0.06 (10) + 0.15 = 0,45 = 0.75

X 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Y 0.15 0.21 0.27 0.33 0.39 0.45 0.51 0.57 0.63 0.69 0.75

Grafik Hubungan antara Konsentrasi Albumin dan Adsorbansi Albumin

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.150.21

0.270.33

0.390.45

0.510.57

0.630.69

0.75

Grafik Hubungan antara Konsentrasi Albumin dan Adsorbansi Albumin dalam

regresi linear

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

0.10.20.30.40.50.60.70.8

0.150.21

0.270.330000000

000001

0.390000000000001

0.450.51

0.570.630000000

000001

0.690000000000001

0.750000000000001

kadar albumin

abso

rban

si

Dengan menggunakan kurva standar konsentrasi vs absorban maka konsentrasi

sample X

yang memiliki Absorbansi= 0.536 dapat ditentukan dengan rumus berikut :

A6

C6=

Ax

C x

0.5616

=0.536

X

0.561 . x = 0.536 .6

x = 3.2160.561

x = 5.73

X. Pembahasan

Spektrofotometri adalah cara analisa kuantitatif berdasarkan transmitansi atau

absorban larutan terhadap cahaya pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan

instrumen spektrofotometer. Terdapat beberapa metode spektrofotometri untuk penetapan

kadar protein yaitu Pengukuran langsung pada 280nm, Metode Biuret, Metode Lowry,

Metode pengikatan pewarna dan Metode Turbimetri. Namun pada percobaan kali ini

penentuan kadar protein dengan menggunakan metode biuret. Dimana protein yang akan di

uji adalah larutan albumin.

Pada percobaan kali ini, larutan protein di buat dari 1 sampai 9 mg per ml yang di

encerkan dari larutan albumin 10%. Setelah larutan protein dibuat lalu dimasukkan dalam

tabung reaksi dan semua tabung tadi ditambahkan dengan 4 ml reagen biuret dan dikocok

lalu diamkan selama 30 menit. Pada saat sampel dikocok, jangan sampai menimbulkan

buih karena akan mempengaruhi pengukuran absorbansi. Dan setelah ditetesi pereaksi

biuret, sampel didiamkan selama 30 menit. 30 menit ini merupakan operating time yaitu

waktu yang dibutuhkan agar seluruh reaktan/protein bereaksi seluruhnya dengan reagen.

Setelah 30 menit, maka sampel diukur absorbansinya dengan alat spektrofotometer dengan

panjang gelombang 540 nm. Panjang gelombang 540 nm merupakan panjang gelombang

serapan maksimum untuk warna ungu. Selain itu digunakan juga larutan blanko, larutan

blanko merupakan larutan tidak berisi analit. Larutan blanko biasanya digunakan untuk

tujuan kalibrasi sebagai larutan pembanding dalam analisis fotometri. Larutan blanko

diberi perlakuan yang sama seperti larutan albumin.

Setelah itu akan terlihat warna biru ungu pada semua tabung reaksi tadi.

Pembentukan warna biru ungu, ini menunjukkan adanya pembentukan senyawa kompleks

dengan Cu+2. Pengukuran nilai absorbansi larutan menggunakan suatu alat ukur yaitu

spectrometer UV pada panjang gelombang 540 nm, dengan alat ukur ini kita dapat secara

sfesifik mengukur absorbansi atau % T dari senyawa yang mengandung unsure logam,

oleh sebab itulah larutan standar ditambahkan dengan reagen biuret yaitu reagen yang

mengandung ion logam dalam hal ini adalah Cu2+.

Dalam pereaksi biuret terkandung 3 macam reagen yaitu reagen yang pertama

adalah CuSO4 dalam aquadest dimana reagen ini berfungsi sebagai penyedia ion Cu2+ yang

nantinya akan membentuk kompleks dengan protein. Reagen yang kedua adalah K-Na-

Tartrat yang berfungsi untuk mencegah terjadinya reduksi pada Cu2+ sehingga tidak

mengendap. Reagen yang ketiga adalah NaOH dimana fungsinya adalah membuat suasana

basa. Suasana basa akan membantu pembentukan Cu(OH)2 yang nantinya akan menjadi

Cu2+ dan 2OH-. Dari hasil pengukuran pada spektrofotometer, didapatlah harga absorbansi

pada masing-masing konsentrasi yaitu 0.249, 0.299, 0.341, 0.465, 0.561, 0.592, 0.598,

0.623, 0.676. Data tersebut menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi harga

absorbansi yang didapat semakin besar. Hal ini sesuai dengan hukum Lambert-Beer yang

menyatakan bahwa hubungan antara konsentrasi dengan absorbansi yang berbanding lurus,

yaitu semakin besar konsentrasi maka semakin besar pula absorbansinya.

XI. Kesimpulan

1. Pada percobaan penentuan kadar protein secara biuret, terjadi pembentukan warna

biru ungu, ini menunjukkan adanya pembentukan senyawa kompleks dengan Cu2+.

2. Penentuan kadar protein secara biuret didasarkan pada pengukuran serapan cahaya

oleh ikatan kompleks yang bewarna ungu.

3. Semakin tinggi konsentrasi larutan protein maka semakin banyak ikatan peptida

dalam larutan yang menyebabkan pembentukan kompleks semakin banyak, ini

dapat dilihat dari warna biru ungu yang semakin pekat.

4. Pengukuran nilai absorbansi larutan menggunakan suatu alat ukur yaitu

spektrometer UV pada panjang gelombang 540 nm.

5. Panjang gelombang 540 nm merupakan panjang gelombang serapan maksimum

untuk warna ungu

6. Semakin besar konsentrasi maka semakin besar pula daya serapnya.

XII. Daftar Pustaka

Anonim. (2012,Juni 09). Penentapan Totap Protein Serum Dengan Metode Biuret. Dipetik Mei 08, 2013, dari Blogspot: http://smart-fresh.blogspot.com/2012/06/penetapan-total-protein-serum-dengan.html

Poedjiadi, Anna.1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI-Press.

Lehninger.1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: Erlangga.

Lesmana, I. (2011,Maret 01). Fungsi Larutan Blanko. Dipetik Mei 08, 2013, dari Blogspot: http://indralesman.blogspot.com/2011_03_01_archive.html

Lampiran :

a. Gambar Alat

Pipet tetes Beaker Gelas Gelas Ukur

Erlenmeyer Spektometer

b. Jawaban Pertanyaan

1. Buatlah standar kurva dan tetapkan kadar protein larutan protein yang diberikan

1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

0.10.20.30.40.50.60.70.8

Konsentrasi Albumin

Adso

rban

Karena diketahui harga adsorbansi sampel sebesar 0,536 maka konsentrasi

sampelnya terletak antara 5-6 mg/ml

A6

C6=

Ax

C x

0.5616

=0.536

X

0.561 . x = 0.536 .6

x = 3.2160.561

x = 5.73

2. Berikan penjelasan tentang hukum Lambert-beer

Jawab : Hukum lambert-beer menyatakan hubungan antara konsentrasi dengan

adsorbansi yang semakin besar konsentrasi maka semakin besar pula absorbansinya.

Hal ini ditunjukkan dengan bentuk kurva yang linear antara konsentrasi dan

adsorbannya.

3. Senyawa apakah yang dapat menganggu cara biuret seperti di atas ?

Jawab : Senyawa yang memberikan endapan warna hitam atau merah pada reagen

biuret yaitu garam amonia. Jika hal tersebut terbentuk maka reagen biuret tidak

terbentuk.

4. Mengapa reaksi tersebut juga disebut dengan reaksi biuret ?

Jawab : Karena menggunakan reagen biuret

5. Senyawa kompleks apa yang terjadi ?

Jawab : Senyawa kompleks bewarna ungu

6. Apakah peptida juga memberikan reaksi biuret, jika memberikan, berikan penjelasan

dan bagaimana cara menentukan kadar protein yang bercampur di dalam peptide ?

Jawab : Ya, karena pada uji tersebut berfungsi untuk menunjukkan adanya ikatan

peptida pada molekul protein dengan memberikan efek warna ungu. Cara

menentukannya yaitu dengan menambahkan reagen biuret pada larutan protein

dengan pengukuran adsorbansi.