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MICROBIOLOGIA 2014-FACULTAD DE MEDICINA

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLAREAL

RECONOCIMIENTO DE LOS TRES AMBIENTES DE MICROBIOLOGIA Y

PARASITOLOGIA. USO DEL MICROSCOPIO. BIOSEGURIDAD

1.- Con qu finalidad se utiliza la solucin salina o suero fisiolgico?

La adicin del suero es para promover el crecimiento de microorganismos menos

resistentes. Los sueros ms empleados son: suero de ternera, suero de bovino y

algunas veces el suero humano.

2.- Qu es agar?

Es un coloide hidroflico obtenido de varias especies de algas rojas. Es utilizado para el

cultivo solido de bacterias y otros microorganismos emulsificadores y como medio de

soporte para inmunodifusin e inmunoelectroforesis.

3.- Diga en qu momento se requiere el uso de los indicadores y amortiguadores?

Un amortiguador se usa cuando se necesita infundir algn cambio en la [H+]. El indicador

se usa para dar a conocer la aparicin y desaparicin de un compuesto qumico por un

cambio de color o logro de un determinado pH.

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PRESENCIA DE MICROORGANISMOS EN EL MEDIO AMBIENTE. TCNICAS PARA EL

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS. NECESIDAD DE PRACTICAR LAS TECNICAS

ASPTICAMENTE. CULTIVO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS

I. EXPERIMENTO N 1:

Presencia de microorganismos en el medio ambienteFundamentacin:

Confirmar la presencia de microorganismos en el medio ambiente,mediante un

procedimiento llamado siembra que consiste en acondicionar el microorganismoa un medio de cultivo frtil, para que en condiciones ptimas de temperatura

y tiempo de incubacin, pueda desarrollarse y multiplicarse.

Materiales

1 placa petri con agar nutritivo, agar sangre. Suero salino. Asa de Kolle

Procedimiento

Tomar la placa con agar nutritivo y dividirlo en 4 cuadrantes con un plumn indeleble. Dibujar estrias en medio de cultivo. 1 cuadrante: agua de cao. 2 cuadrante: Saliva. 3 Cuadrante: Agua de piso. 4 cuadrante: Agua de Piel. Tomar la placa de agar sangre y tosa en el. Incubar a 37C por 24h.

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Resultados y conclusiones:

En el sector con agua de cao no se observa crecimiento de microorganismo. El sector con saliva presenta crecimiento

pero no por la saliva porque no contiene

microorganismos; esto demuestra que nuestra boca

contiene gran cantidad de microorganismos como elEstreptococo mutans.

El sector con agua de piso y de piel tambinmostro crecimiento debido a la presencia de

microorganismos en el medio ambiente.

En el agar sangre se observo lapresencia de microorganismos pero ninguno realizo hemolisis, por lo cual no era

un Estreptococo B hemoltico.

II. EXPERIMENTO N2:

Tcnicas para el aislamiento de microorganismos. Necesidad de practicar las tcnicasspticamente.

Fundamento

En todos los ambientes habitan mltiples microorganismos de diversos tipos yactividad fisiolgica. Para efectuar el estudio de un organismo en particular es

necesario separarlo de la poblacin mixta en la que se encuentra. Para tal fin se

emplean tcnicas de aislamiento que conduzcan a la obtencin de un cultivo puro.Los mtodos usados son: diluciones seriadas y siembra por vertido en placa, siembra

por agotamiento.

Material

1 Placa Petri Estril con Agar Nutritivo 1 Placa Petri No Estril con Agar Nutritivo. 2 Tubos de prueba con caldo Nutritivo 1 Pipeta estril de 1 ml. 1 Tubo con caldo de cultivo mixto de bacterias

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Procedimiento:

Aislamiento por mtodo de sembrado de estras. Estra Simple Estra por Agotamiento Siguiendo estrictamente las reglas de asepsia aprendidas en experimento 1, con el

asa de Kolle, tome una muestra del tubo con caldo de cultivo mixto y dibuje, estras

sobre la superficie del medio de cultivo en la placa Petri estril con agar nutritivo.

Marque la placa con lpiz de vidrio y lleve a la estufa a 37C por 24 h. Tome la placa Petri no estril y mrquela en su parte posterior colocando No

estril, llvela a la estufa a 37C por 24h.

Tome los dos tubos de caldo nutritivo y con la pipeta estril transfiera 1 ml de caldode un tubo a otro y viceversa por 5 veces, usando la misma pipeta, tapone los tubos y

llvelos a la estufa a 37C por 24 a 48 h.

Resultados

En las placas con estras simples, se observa que hay crecimiento pero de un solo tipode colonia.

En las placas de agotamiento por estras, se trata de un mtodo rpido y simple deagotamiento y continuo de inoculo sobre un medio solido contenido en una placa

petri. El objetivo es obtener, a partir de un elevado nmero de bacterias, un nmero

reducido de ellas distribuidas individualmente sobre la superficie de la placa. Cada

una de estas bacterias originara una colonia. Se obtiene diferentes colonias.

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METABOLISMO BACTERIANO. ENZIMAS DE LOS

MICROORGANISMOS. FERMENTACIBACTERIANAI. EXPERIMENTO N 1: HIDRLISIS DEL ALMIDN

1. OBJETIVO:Hacer conocer al alumno que existen microorganismos que producen exoenzimas y que

atacan substratos importantes como carbohidratos y protenas.

El almidn es un polmero de glucosa, se encuentra como material de reserva. Es hidrolizado

por las enzimas: Alfa Amilasa y Beta Amilasa. Tambin puede ser hidrolizado por los cidos

minerales.

La primera desdobla las macromolculas de la amilosa y la amilopectina, de las cuales se

compone el almidn, en unidades de 6-7moleculas de Glucosa. Con ms tiempo de

exposicin, esa enzima logra desdoblar a estos oligosacridos llevndolos a maltosa, punto

en el que la enzima maltasa se encarga de desdoblar esta molcula hasta Glucosa.

La -amilasa puede desdoblar las molculas de amilosa y amilopectina pero solo a partir de

los extremos no reductores de estas molculas. Cada vez son escindidas dos unidades de

glucosa en forma de maltosa, punto en el que la maltasa entra en juego. Las molculas de

amilasa son desdobladas de esta forma pero las de amilopectina son solo desdobladas en un50% ya que la enzima no puede desdoblar las ramificaciones propias de esta macromolcula,

se hace necesaria entonces la intervencin de la a-amilasa para desdoblarla por completo.

-amilasa + AlmidnDextrina + -maltosa

-amilasa + Almidn-maltosa

Las amilasas son enzimas extracelulares.

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2. MATERIALES: Solucin de yodo (lugol) Cepas de Bacillus subtilis y Escherichia coli 1 Placa de Agar Almidn3. PROCEDIMIENTO: Dividir en dos sectores la placa de Agar almidn. Inocular en estras cada sector con las cepas de B. subtilis y E. coli. Incubarlo a 37C por 24 h4. RESULTADOS:

Empleando la solucin de Lugol para evidenciar la hidrlisis, se obtiene:

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5. CONCLUSION: Ambas son capaces de utilizar al almidn como nutriente; sin embargo, la E. coli

requiere de ms nutrientes que el B. subtilis.

6. IMPORTANCIA:Conocer el grado de hidrlisis de las bacterias Gram + y Gramcomo evidencia de su

actividad enzimtica y sus requerimientos energticos.

II. EXPERIMENTO N2: HIDROLISIS DE LA GELATINALa gelatina es una protena dotada de la propiedad de tomar gel cuando se disuelve en agua

caliente. Por tratarse de una protena puede ser atacada por alguna bacteria que la prive de

su propiedad gelatinizante.

La hidrolisis de la gelatina es una reaccin enzimtica y a la enzima encargada de ello se le

llama gelatinasa.

1. OBJETIVO:Conocer y estudiar a la enzima encargada de hidrolizar la gelatina

2. MATERIALES: Cepa de S. Aureus Cepa de B. Subtilis Cepa de E. Coli Asa de kolle en aguja Tres tubos de gelatina nutriente estril3. PROCEDIMIENTOS:

Escherichia coli : La muestra presenta

color azulado, a partir de lo cual se

concluye que la E. coli hidroliza

totalmente al almidn.

Bacillus subtilis : al presentar la

muestra color pardo marrn, se concluye

que el B subtilis hidroliza parcialmente al

almidn (poco hidroltico)

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Inocule cada uno de los organismos en un tubo de gelatina nutriente por punturahasta el fondo del tubo, una sola vez

Llevar a temperatura ambiente por 2 a 7 das.4. RESULTADO: Gelatina + S. Aureus: prueba positiva, se observ hidrolisis parcial de la gelatina Gelatina + B. Subtilis: prueba positiva, se observ hidrolisis total de la gelatina Gelatina + E. Coli: prueba negativa, no se observ hidrolisis.

5. CONCLUSIN: Podemos afirmar que dentro de los diferentes microorganismos los bacilos tiene la

propiedad de hidrolizar la gelatina y con ello afirmar que poseen la enzima

gelatinasa.

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III. EXPERIMENTO N3: PRODUCCIN DE HEMOLISINAS1. OBEJTIVOS:

Conocer que microorganismos tienen la capacidad de secretar exoenzimas que causar lisis

en los glbulos rojos.

2. MATERIALES: Cepa de S. Aureus y B. subtilis Agar sangre

3. PROCEDIMIENTO: -Dividir en dos placas Petri

Inocular en estras las cepas en cada uno de los lados. Incubar a 37C por 24-28 h.

4. RESULTADOS:

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En ambos sectores se observ la presencia de hemolisinas. En el cultivo de S. Aureus se vio halos en todo el borde; este debido a que este

microorganismo es un gran positivo y productor de hemolisina beta la cual produce

una hemolisis completa , la destruccin y decoloracin total de la hemoglobina , y

por eso la presencia de una zona hemoltica clara alrededor de la colonia.

En el cultivo de B. Subtilis se observ cambio en la coloracin a un tono verdoso estodebido a que este microorganismo elabora un pigmento llamado biliverdina

5. CONCLUSION:-Este experimento nos demuestra que en los diferentes microorganismos producen

distintos tipos de hemolisis; el grado de hemolisis se relaciona con su grado de

patogeneidad, especialmente los betas hemolticos.

IV. EXPERIMENTO N 5 : FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOSLa fermentacin es un proceso catablico de oxidacin incompleta, que no requiere oxgeno,

y el producto final es un compuesto orgnico. Segn los productos finales, existen diversos

tipos de fermentaciones.

Hay fermentacin natural, cuando las condiciones ambientales permiten la interaccin de

los microorganismos y los sustratos orgnicos susceptibles, y artificial, cuando el ser humano

propicia condiciones y el contacto referido.

La prueba contendr lo siguiente:

Agar TSI (3 azucares y hierro) favorece el crecimiento de la mayora de bacterias. Azucares qumicamente definidos: Lactosa, sacarosa y glucosa.

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Un indicador de pH.NC : no cambio de pH.

A : cido.

AG : cido y gas.

B : bsico.Cuando no hay carbohidratos utilizables en el medio la energa necesaria la obtiene la

bacteria de protena y su producto final es gas de amoniaco.

1. MATERIALES: Cultivo de Escherichia coli, Staphilococcus aureus, Y Bacillus S. 3 tubos con TSI en plano inclinado.

2. PROCEDIMIENTO: Sembrar por estra y puntura:

o E. coli - TSIo S. aureus - TSIo B. subtilis - TSI

Incubar por 24 h. a 37 C

3. RESULTADOS:

E. coli: Se observa que el fondo

y la superficie han cambiado.

Ants. De la seimbra Desp. De la siembra

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Staphilococcus aureus: se observa que tanto la

superficie como el fondo han cambiado, esto debido

al medio acido.

ANTES DESPUES

Pseudomona: Seobserva que la superficie

mantuvo su color esto debido al medio alcalino, con esto

se demuestra que no hubo fermentacin de

carbohidratos en la superficie.

Mientras que al fondo del tubo se muestra claramente la

fermentacin de carbohidratos, por la accin del medio

acido.

Ants. De la seimbraDesp. De la siembra

Mediante estos experimentos se llega a conocer la accin fermentadora de los

microorganismos en un determinado medio.

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En los cultivo de S. aureus y E. coli. Se demostr que si hubo fermentacin por el pH que

mantienen.

V. EXPERIMENTO N 7: REDUCCIN DE CIDO SULFHDRICO1. OBJETIVO:

Determinar la capacidad bacteriana para producir HS (cido sulfhdrico)

Mecanismo: Cuando se realiza la fermentacin de las protenas obtiene como producto

cido sulfhdrico, ya que las protenas contienen aminocidos sulfurados, algunas bacterias

tienen enzimas que desprenden el cido de azufre de estos aminocidos, el cual es reducido

con hidrogeno del sustrato para formar cido sulfhdrico, por lo tanto el azufre funciona

como aceptor de H +.

H2S + FeO3 FeS + H2SO4

2. MATERIALES: Cultivo de E. Coli y Proteus Vulgaris Tubos de TSI con superficie inclinada (2)3. PROCEDIMIENTO: Inocular a cada tubo de TSI, las cepas de E. Coli y Proteus respectivamente, por estra

y puntura.

Incubara 37OC por 24Hrs y observar la formacin de FeS color negro.4. RESULtADOS:


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E. coli: Se observa que no se produce cido sulfhdrico (no reduce) ni tampoco se produce

gas.


Proteus Vulgaris: se observan los cambios por la aparicin de un precipitado negro (FeS) a lo

largo de la picadura, tornndose alcalino en la superficie y acido en el fondo. Se produce la

reduccin, hay formacin de cido sulfhdrico, utilizndose al azufre del medio como aceptor

final de H+.

5. APLICACIN:Es til para la identificacin de bacterias de los gneros Salmonella,Campylobacter y Brucella y permite diferenciar entr especies de Proteus.

VI. EXPERIMENTO N 8 : DEMOSTRACION DE LA PRODUCCION DEL INDOL1. FUNDAMENTO

El Indol es un compuesto que se genera mediante la desanimacin reductiva del triptfano y

esta reaccin es llevada a cabo por algunas bacterias que poseen las enzimas denominadas

en su conjunto triptofanasas.

Para detectar la produccin de indol se utiliza el medio Caldo triptfano y la lectura de la

prueba se realiza con el reactivo de Kovacs; el indol producido reacciona generando una

coloracin rosa intensa.

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2. MATERIALES: Cultivo de E.Coli y Bucillus Subtilis Caldo Triptfano 2 tubos con 3cc cada uno Solucin de Kovacs Pipeta de 1cc

3. PROCEDIMIENTO:Se incuba a 37C durante 24 horas y tras la incubacin, aadimos unas gotas de reactivo de

Kovacs.

Si se ha producido Indol aparecer un anillo rosa fucsia en la superficie del caldo de cultivo.

Indol negativo Indol positivo

4. RESULTADOS E.Coli (+) Bacteria que si produce indol al agregar gotas de solucin Kovacs

Es una propiedad de algunas bacterias que degradan el aminocido triptfano

formando Indol.

B.Subtilis () Bacteria que no produce indol a pesar de agregar gotas de solucinKovacs.
https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-microbiologia/indice/identificacion-bacteriana/produccion-de-indol/2.png?attredirects=0

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EXPERIMENTO N 9: DETECCION DE LA CATALASA

La catalasa es una enzima que est relacionada con la capacidad de una bacteria para utilizar

el oxgeno Le falta de esta enzima en los organismos anaerobios es la causa de que el O2 les

sea perjudicial. Cuando hay oxigeno estos organismos lo emplean como aceptor final de

Hidrogeno para formar Agua Oxigenada, pero esta no puede desdoblarse en H2O y O2

porque falta la Catalasa; por lo tanto el agua oxigenada se acumula y mata a la bacteria.

1. MATERIALES:- Cultivo d E.coli y S. aureus- Tubos de Triptosa Caldo (2)- Agua Oxigenda 3,0 %2. OBJETIVO:

Identificar cules son los microorganismos anaerbicos que producen catalasa,

exponindolos a un medio donde que contenga agua oxigenada.

3. PROCEDIMIENTO:- Incubar en cada tubo una de las cepas- Incubar a 37 C por 24 horas- Cubrir la superficie del caldo con agua oxigenada y observar la presencia de burbujas

en el tubo donde hay catalasa.

4. RESULTADOS:1.- Tubo con E.coli: Negativo

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2.- Tubo con S.Aureus: Positivo (Presencia de burbujas)

5. CONCLUSIONES:- La presencia de burbujas en el tubo que contiene S.Aureus se debe a que este

microorganismo produce la enzima catalasa, y por lo tanto el agua oxigenada

contenida en el medio trmino siendo disociada en oxigeno (burbujas) y agua.

- El tubo que contena E.Coli no sufri ningn cambio a simple vista ya que estemicroorganismo no produce catalasa, por lo tanto se asume que estando en este

medio la E.Coli no pudo sobrevivir.

Existen bacterias que pueden vivir estando en un medio que contiene H202

EXPERIMENTO N 10: REDUCCION DE AZUL DE METILENO

Se trata de demostrar la oxidacin en los procesos fermentativos, realizada por los

grmenes anaerbicos, llamada oxidacin anaerbica, donde el sustrato cede un H +, para

lo cual se necesitan aceptores de H +, el azul de metileno acta como aceptor.

Azul de Metileno + 2H Azul de etileno - 2 H

(azul) (Incoloro)

Reduccin del azul de Metileno.

MATERIALES:

Cultivo de E. coli 7.5cc. Tubo de Prueba (3) Pipetas estriles

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4cc cultivo 2.5 cultivo 1cc. cultivo

cc de caldo 2.5 caldo 4cc de caldo

Azul de Metileno de Loeffer Caldo nutritivo 7.5cc

PROCEDIMIENTOS:

Rotular los tubos con 1,2,3.Tubo 1 Tubo 2 Tubo3

1

Mezclar y agregar 1 gota de azul de Metileno a cada tubo. Incubar a 37C. Observar cada 10 minutos hasta los 20 minutos y

anotar los cambios de color.

RESULTADOS:

El azul de metileno es un aceptor de H, posee la propiedad de cambiar de color al pasar de

oxidado (azul) a reducido (incoloro). La E. coli reduce el azul de metileno por eso es

observa que se muestra incoloro. Por eso el tubo 1 se ve ms incoloro.

DETERMINACION DE LOS REQUERIMIENTOS MNIMOS PARA EL CRECIMIENTO

BACTERIANO. MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS Y DIFERENCIALES

EXPERIMENTO N 1

Objetivo: Conocer los diferentes nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano.

Materiales:

Ingredientes necesarios para la preparacin de diferentes medios de cultivo.a) Unicamente Agar (lavado y purificado antes de disolverlo)

b) Agar + Minerales (NH4 H2 PO4; Mg SO4; KCl)c) Agar + Minerales + Glucosa

d) Agar + Minerales + Glucosa + Fuente de Nitrgeno Orgnico (Peptona)

4 placas Petri estriles.conteniendo los medios de cultivo de a,b,c,y d. Cultivo Escherichia coli. (Sector1), Stafilococcus aureus (Sector2) y

candida Albicans (Sector 3).

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Procedimiento:

Con un lpiz de cera, trace sobre el fondo de vidrio de cada placapetri para dividirlo en cuatro sectores y enumera cada sector.

Inocule los sectores correspondientes de cada placa con uno de los tres

organismos.

Deje el cuarto sector de cada placa sin inocular. Vierta las placas, incbelas a38C por 48 horas y observe el crecimiento en cada uno de los

sectores inoculados.

Resultado:

No hay crecimiento en las 3 primeras placas petri debido a que losrequerimientos de las bacterias son importantes para su crecimiento y estas 3

placas no cumplen con ello.

En la cuarta placa petri si hay presencia de crecimiento porque si cumple conlos requerimiento nutricionales bacterianos permitiendo su desarrollo.

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II. EXPERIMIENTO N 2:

Medios selectivos y diferenciales

Objetivo: Conocer los diferentes medios de cultivo, que permitan el aislamiento eidentificacin de bacterias.

Materiales:

Agar nutriente Porcin de Agar-Cloruro de sodio Porcin de rojo fenol-Agar Cultivo de Staphylococcus epidermidis y Alcaligenes (Pseudomona).

Procedimiento:

Con el lpiz de cera dividida cada placa en tres sectores: el primeroetiqutelo

Alcaligenes faecalis el segundo S. Epidermidis y el tercero djelo sin rotular. Use el asa de Kolle para sembrar en estras cada sector de la placa con el

cultivo correspondiente. Invierta las placas Petri e incbelas por 24 horas a

37C.

Resultados:

En el AGAR NUTRIENTE la seudomona crece y libera tiocianina. En el AGAR CLORURO DE SODIO la gran concentracin de sal limita el

crecimiento bacteriano.

En AGAR FENOL-AGAR toma un color rojizo.

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III. TINCIN DIFERENCIAL

Se denomina Coloracin Diferencial cuando se emplean dos o ms reactivos. La ms

empleada en la bacteriologa es la coloracin Gram y la coloracin para bacilos

cido alcohol resistentes.

Coloracin Gram

La tincin Gram se compone de cuatro reactivos diferentes: El Cristal Violeta que es

el colorante bsico inicial que tie todas las bacterias, el segundo reactivo es el

lugol que acta como mordiente (sustancia que aumenta la unin del colorante y el

substrato). El tercer reactivo es el alcohol-acetona que acta como decolorante. Muchomicroorganismos retienen el cristal violeta permaneciendo teidos y tomando el nombre

de bacterias Gram positivas; otro grupo de mircroorganismos pierde el color

fcilmente por accin del decolorante, al aadirse la safranina que es de color rojo,

toman este segundo colorante, denominndose microorganismos Gram negativos.

Materiales:

Solucin Cristal Violeta de Genciana Solucin de Lugol Alcohol Acetona Fucciana bsica o Safranina Lmina portaobjeto, Asa de Kolle, Solucin salina. Cepas de Estafilococos aureus y Eschericha coli.

Procedimiento:

Frotis y fijado de la muestra Cubrir la muestra con solucin de cristal violeta durante 1 minuto Lavar ligeramente con agua de cao Cubrir la muestra con solucin de lugol durante 1 minuto Lavar con agua de cao Decolorar con alcohol-acetona hasta que el alcohol-acetona no arrastre

color.

Lavar con agua de cao. Colorear con safranina por 30 segundos Lavar, secar y observar

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Examinar el preparado al microscopio con objetivo 100x de inmersin(aceite). Las bacterias Gram positivas se tien de azul oscuro; las

bacterias Gram negativas aparecen rojo rosadas.

Resultados:

Se realizo la prueba de acuerdo al procedimiento indicado. Luego se hizo unatoma de muestra del agar sangre y del agar simple y se los tio con Gram:Estafilococo aureus y E. coli.

Microscpicamente

E. coli

S. aureus

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I. EXPERIMENTO N1:

Evaluacin de antibiticos por el mtodo disco difusin.

Materiales:

Cultivo de S. aureus, E. coli. Disco de antibiograma para gram + y gram -. Placas petri con agar nutritivo TSA. Mechero, asa de kolle, hisopo estril.

Procedimiento:

Sembrar con hisopo estril en la superficie de las placas cada sp. Aspticamente colocar con pinzas los discos de antibiograma en cada placa. Incubar por 24 hrs. a 37C y dibujar los resultados.

Resultados:

Se pudo observar mediante el tamao del halo: E. coli resistente a ciprofloxacina, gentamicina. Parcialmente

resistente a amikacina.

S. aureus resistente a oxacilina, ampicilina. Sensible a nitrofurantoina.

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I. EXPERIMENTO N 1:

Efecto de la Concentracin de iones H+El pH de una solucin es el valor negativo del logaritmo en base 10 de su concentracin de

iones hidrgeno en mol x lt.

pH = - log H +

Segn Bronsted y Lowry (1923), un cido se caracteriza por su tendencia a perder H+,

mientras que una base se caracteriza por su tendencia a asociarse con H+. Por lo tanto, los

cidos aportan con una concentracin determinada de H+.

Aplicando la frmula encontraremos que a mayor concentracin de H +, menor pH (mayor

acidez).

El pH puede ejercer una accin bactericida segn la concentracin de hidrgenos y la

especie de la bacteria sometida a dicho pH.

Materiales:

Cepas de E.coli o Estafilococo en suspensin Reactivos: HCL 1.0N y NAOH 1.ON Medio de Cultivo: Caldo Peptonado.

Procedimiento:

Es tres tubos con caldo de cultivo estriles, realizar la siembra de E. coli enasadas.

A cada tubo agregarle gota HCL 1.0N, NAOH 1.0 N hasta que en lostubos se obtengan los siguientes pH: 2 y 9 respectivamente. El tercer tuboservir de control.

Volver a taponar los tubos e incubar a 37C por 24 hrs. Despus de estetiempo, leer por turbidez.

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Resultados:

Tubo1: sin crecimiento de E. coli en medio cido. Caldo peptonadotrasparente.

Tubo2: crecimiento de E. coli en medio alcalino. Caldo peptonado turbio. Tubo3: por fallas de procedimiento tambin se observo crecimiento

de E. coli. Debi haber sido trasparente el caldo peptonado.

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II. EXPERIMENTO 2:

Efecto del calor

Materiales:

Cepas de E.coli o Estafilococo Equipo: Bao Mara y estufa Medios de cultivo: caldo peptonado

Procedimiento:

Empleando tres tubos de caldo peptonado, realizar la siembra de E.coli.

Someter a dos de los tubos a la accin del calor por bao Mara, graduando en 40C y 100C por 10

minutos respectivamente. El tercer tubo no se somete a la accin del calor para que sirva de control.

Retirar los tubos del bao Mara e incubar los tres tubos a 37C por 24 horas. Realizar lalectura por turbidez.

Resultados:

Tubo 1 (Experimental) 40C Tubo 2 (Experimental) 100C Tubo 3 (Control)

Turbidez Si ++ No. Trasparencia Si +

La E. coli presenta temperatura optima de crecimiento 40C pero puede presentarcrecimiento a temperatura ambiente porque su lmite de temperatura va de 8-47C

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III. EXPERIMENTO N 3: ACCION OLIGODINMICA DE LOS METALES PESADOS

Las sales solubles de mercurio, arsnico, plata, cobre y otros metales

pesados, alteran la actividad enzimtica formando mercptidos con grupos

sulfhidrilo de residuos de cistena.

La reaccin inicial es reversible, y si se agregan grupos SH extraos en formade glutation

o tioglicolato de na, muchas de las clulas se recuperan. La capacidad

de unin de los mercuriales se extiende en un amplio rango de

ligandos a dems de los grupos que contienen SH, por ejemplo

carboxilados, fosfatos y aminas.

Materiales:

- Cepas de E. coli Estafilococo

- Reactivo: Mercurio Cromo. No3Ag al 1%- Medios de cultivo: caldo peptonado

- Equipo: Estufa

Procedimiento:

- Realizar la siembra de una cepa de E. coli en dos tubos de caldo y en dos

placas con

Agar nutritivo hacer la siembra en toda la superficie del agar.

- A uno de los tubos, agregarle 5 a 10 gotas de mercurio cromo o nitrato de

plata. El otro constituye el control.

- Incubar a 37C por 24 horas. La lectura se hace por turbidez en la siembraen caldo

y por halo de inhibicin en agar.

Resultados:

Tubo Problema Tubo Control

AgNO3 1% Si No

Crecimiento (Turbidez) No Si

Precipitacin Si No

- Tubo problema: no hay crecimiento bacteriano = accin oligodinamica

de los

metales.

- Tubo control: si hay crecimiento bacteriano.

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Materiales (Observacin del crecimiento):

Placa petri (3) con agar nutritivo o TSA dividido en 2 sectores cada unoIsopos de algodn estril (3)

Solucin antisptica, alcohol yodado

Un tubo con caldo nutritivo estril

Procedimiento:

En el sector 1 toque con sus dedos varias zonas, lavase las manos con agua y jabn

squese y toque con sus el sector 2, lavase las manos por segunda vez y toque el sector 3

lavase las manos por tercera vez y toque el sector 4.

En otra zona de su piel aplique el desinfectante por 2 minutos sobre esta zona

humedezca con caldo nutritivo y siembra esta con el hisopo estril en la zona 5.

Aplique el desinfectante por dos minutos ms y repita lo anterior para sembrar en el sector

6.

Incube a 37C por 24 hrs. observe y comente los resultados.

Resultados:

1 placa petri: en el 1 sector hay crecimiento bacteriano debido a que no hubo una buena

asepsia, en el sector 2 gracias al lavado de manos hubo disminucin del crecimientobacteriano.

2 placa petri: sector 3 y 4 gracias al lavado de manos varias veces hubo un menor

crecimiento bacteriano.

3 placa petri: no hubo crecimiento bacteriano porque se hizo una asepsia con

desinfectante y alcohol yodado.

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CUESTIONARIO

Qu es SIEMBRA POR ESTRA?Se siembra el material en la superficie de el agar inclinado en un tubo de ensayo, all se

extiende por toda la superficie con el asa bacteriolgica, previamente esterilizada y cargadacon el material a sembrar, haciendo estras no muy amplias, pero tampoco muy estrechas.

Se inicia por la parte ms profunda de la superficie inclinada y se termina la estra en la

parte ms cerca de la boca del tubo.

Medio de cultivo: agar base inclinado.

Instrumento: asa o aguja bacteriolgica.

Qu es SIEMBRA POR AGOTAMIENTO?Con ste procedimiento se puede conseguir una buena separacin de las colonias y

aislarlas fcilmente. Para ello se funde el medio de cultivo, se vuelca en caja de Petri y

se deja solidificar. Con el asa previamente esterilizada se toma material de un

cultivo heterogneo y se descarga sobre la superficie del medio formando estras.

Esto puede realizarse de varias formas:

a- Al comienzo se coloca el inoculo, luego se contina con las estras. Cuando se quiereobtener colonias muy separadas se puede utilizar dos o tres placas de Petri, para lo cual

se repite la operacin sin tomar con el asa nuevo material.

b- Se puede dividir la placa de Petri en cuatro cuadrantes; una vez depositado el material enel primero, siguiendo el sentido de las agujas del reloj, se hace una estra luego en

el segundo, tercero y cuarto cuadrante sin cargar nuevamente el asa; en el ltimo

cuadrante aparecern las colonias aisladas

c- El inculo se extiende sobre una pequea zona de la placa, prxima al borde, se esteriliza

el asa y se traza otra estra a partir del depsito y as sucesivamente.Medio de cultivo: solido en placa de Petri.

Instrumento: Asa Kolle.

Finalidad: Obtener colonias aisladas

Qu es AGAR NUTRITIVO?Es un medio para fines generales utilizado en el examen de agua y productos lcteos;

tambin para el cultivo de la mayora de microorganismos menos fastidiosos; de la

misma manera para el transporte de cepas; para el cultivo preliminar de muestras

sometidas a exmenes bacteriolgicos y para aislar organismos en cultivos puros.

Composicin

Extracto de carne 3g

Peptona 5g

Agar 15g

pH final 6.8

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Qu es AGAR SANGRE?Se prepara a partir de un medio base al cual se le aade sangre, lo que permite aislar y

cultivar organismos fastidiosos y exigentes. El pH ligeramente cido, del medio base

favoreces reacciones hemolticas precisas.

Composicin

Infusin de corazn vacuno

500g.Triptosa 10g

pH 6.8

Cloruro sdico 5g

Agar 15g

Qu es AGAR ALMIDN?Es un medio para cultivos de organismos que se analizan para determinacin de hidrlisis

del almidn o para estudios comparativos.

Composicin

Extracto de carne

3g

Almidn soluble 10g

Bacto Agar 12g

pH final 7.5 +/- a.2 a 25C

Qu es AGAR GELATINA?Se utiliza para determinar la licuefaccin de la gelatina por organismos proteolticos,

facilitando el recuento directo en la placa, para la determinacin de poblaciones bacterianas

y para el aislamiento de cultivos puros. Sin embargo su uso es limitado en procedimientos

de siembra y aislamiento, ya que, la incubacin tiene que realizarse a 20C (temperatura

ms baja que la optima para mucho microorganismos), adems muchos organismos tienen

la capacidad de licuar y atacar a la gelatina.ComposicinExtracto de carne 3g

Peptona 5g

Gelatina 120g

pH final 6.8 +/- 0.2 a 25C.

Qu es AGAR TSI?Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la

fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico.

FundamentoEn el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes

adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos

de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la

produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones

Fe3+

, los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de

color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene

el balance osmtico. Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se

detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio

cido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego

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con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.

Frmula (en gramos por litro) InstruccionesExtracto de carne 3.0

Suspender 62,5 g del polvo por litro de

agua destilada. Mezclar bien y calentar

con agitacin frecuente, hervir 1 o 2minutos hasta disolucin total. Llenar

hasta la tercera parte de los tubos de

ensayo. Esterilizar a 121C por 15

minutos. Enfriar en pico de flauta

profundo.

Pluripeptona 20.0

Cloruro de sodio 5.0Lactosa 10.0

Sacarosa 10.0

Glucosa 1.0

Sulfato de hierro y amonio 0.2

Tiosulfato de sodio 0.2

Rojo de fenol 0.025

Agar 13.0

pH final: 7.3 0.2

Qu es CALDO TRIPTONA?Es un medio de cultivo microbiolgico que presenta abundante triptfano, se utiliza para la

reaccin del indol (liberacin de triptfano). Dicha liberacin se debe a la degradacin del

aminocido triptfano mediante la enzima triptofanasa.

Qu significa CALDO MIXTO?Es decir tiene como finalidad ser un medio selectivo y un medio diferencial.

Qu significa CALDO TIOGLICOLATO?Se utiliza para pruebas de esterilidad para ciertos productos biolgicos que estn turbios.

Contienen tioglicolato para neutralizar el efecto bacteriosttico de preservantes

mercuriales. No contiene agar, lo que le hace adecuado para probar materiales viscososy aparatos que tengan tubos con pequeas aberturas.

Composicin

Extracto de levadura

5g

Casitona 10g

L-cistina 12g Tioglicolato

sdico 0.5g Cloruro

sdico 2.5g Dextrosa

5.5g

Qu es un MEDIO SELECTIVO?El medio de cultivo selectivo favorece el crecimiento de organismos pero tambin inhibe elcrecimiento de otros. Este medio contiene compuestos qumicos que favorece e inhibe

el crecimiento de ciertos microorganismos, este medio tambin tiene ciertos

tintes que provoca que ciertas bacterias fermentadoras de lactosa crezcan y se tie de

dicho color caracterstico del tinte.

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Qu es un MEDIO DIFERENCIAL?El medio de cultivo diferencial es el que facilita la deteccin de diferentes clases de

bacterias a base de cambios visibles en el medio de cultivo o diferencias en la apariencia de

las colonias, este medio tambin utiliza ciertos tipos de tintes que tien ciertos tipos de

bacterias.

DIFERENCIAS ENTRE MEDIO SELECTIVO Y DIFERENCIAL.La diferencia de este medio con el medio selectivo es que el selectivo solo provoca que

algunas bacterias en especfico se tian mientras que el diferencial tie todas las bacterias

para as poder diferencias una de otras.

Qu es el ANTIBIOGRAMA?Se entiende por antibiograma el estudio de la sensibilidad "in vitro" de las bacterias a los

antibiticos. Por extensin, se suele incluir el estudio de la sensibilidad a las sulfamidas y

otros quimioterpicos.

Utilidad: La razn por la cual es conveniente el estudio del antibiograma de una

bacteria determinada radica en el hecho de la diferente sensibilidad a los antibiticos de

las distintas especies bacterianas y, ms an, en el hecho de que en numerosas especies

existen grandes diferencias de sensibilidad a un determinado antibitico entre unas y

otras cepas.

El antibiograma es un mtodo de diagnstico rpido y preciso

Con ayuda del antibiograma se puede escoger el antibitico ms adecuado para el

tratamiento de una enfermedad.

Mtodo de la difusin en medio slido

Se siembra, con el germen a estudiar, una placa de un medio de cultivo adecuado. Sobre la

superficie del medio se colocan discos de papel impregnados con el antibitico o

quimioterpico a ensayar. Si el germen estudiado es sensible, en torno al disco se observar

un halo, en el cual no hay proliferacin de bacterias. Si el germen es resistente alantibitico, crecer uniformemente y no habr ningn halo de inhibicin en torno al disco

de papel.

Para un determinado antibitico, una cepa bacteriana es, segn la NCCLS:

Sensible, si existe una buena probabilidad de xito teraputico en el caso de untratamiento a la dosis habitual.

Resistente, si la probabilidad de xito teraputico es nula o muy reducida. No es deesperar ningn efecto teraputico sea cual fuere el tipo de tratamiento.

Intermedia, cuando el xito teraputico es imprevisible. Se puede conseguir efectoteraputico en ciertas condiciones (fuertes concentraciones locales o aumento de

la posologa).

TIPOS DE HEMLISISFundamentoMuchos microorganismos son capaces de crecer en agar sangre y cuando lo hacen

responden de diferente manera segn realicen o no la lisis de los glbulos rojos

(hemlisis) producida por la accin de una enzima llamada hemolisina

Podemos diferenciar tres tipos de hemlisis:

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Hemlisis alfa: es una hemlisis parcial y la zona de crecimiento aparece rodeada de un

halo de color verdoso.

Hemlisis beta: en este caso la hemlisis es total y el halo que rodea a las colonias es

totalmente transparente.

Hemlisis gamma (no hemlisis): el microorganismo en cuestin no es capaz de realizarla hemlisis y por tanto no existe halo alrededor de la colonia.

EXPLIQUE EL USO DE TINTES EN TINCIN GRAM Alcohol -

acido en la coloracin de ZiehlNeelsen.

El alcohol-acido se usa para decolorar la muestra en una tincin de Ziehl Neelsen, la

cual es una tcnica de tincin diferencial que se basa en que las paredes celulares

de ciertos paracitos y bacterias contienen cidos grasos de cadena larga que les

confiere la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-acido, despus de la

tincin con colorantes bsicos.

S o l u c i n de Lugol y alcohol acetona en la coloracin Gram.

Solucin de Lugol: El Lugol se aplica como mordiente, el lugol est formado por

yodo (I2) en equilibrio con yoduro de potasio (KI), el cual est presente para

solubilizar el yodo. El yodo entra en las clulas y forma un complejo insoluble en

solucin acuosa con el cristal violeta.

Poe eso se le llama mordiente porque como es estable esta interaccin (con el cristal

violeta) quedan e n a m b o s t i p o s d e bacteria.

De no ponerlo, este complemento no se formara y el cristal violeta saldra del medio

ante el lavado con agua. Tindose todo Gram (-).

Alcohol acetona: Sirve para decolorar, ya que en la misma es soluble el complejo

yodo/cristal violeta. Los organismos GRAM + no se decoloran mientras los GRAM - si

lo hacen.

Entonces permite que el complemento cristal violeta lugol salga de la clula al

debilitar la pared de los GRAM (-).

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Por qu se emple la tincin negativa o de contraste?

Porque tie el fondo de la preparacin y no el microorganismo,

aumentando de este modo su contraste, mostrando la imagen exacta de

los microorganismos, nos permite apreciar el tamao real de estos.Se usa tambin para la tincin de capsulas, la presencia de estos indicapatogenecidad.

EXPLIQUE EL USO DE TINTES EN LA TINCIN DIFERENCIAL Alcohol-

cido en la coloracin de Ziehl-Neelsen.

El uso de este alcohol sirve para intentar decolorar la muestra de bacterias

fijadas con calor en la muestra, si este alcohol q es m uy fuerte no llega a

decolorar a las bacterias pero si a los espacios, y seguido a esto laaplicacin del color contraste azul de metileno, se podra deducir la

estructura de l a pared bacteriana compuesta

por cido miclico lo cual le confiere una propiedad hidrofbica y cerosa por

eso su resistencia a este acido alcohol.

Solucin de Lugol y Alcohol-Acetona en la coloracin Gram.

El lugol acta como un fijador entre el primer colorante bsico aplicado y la

muestra de bacterias, mientras que el alcohol acetona funciona como el

decolorante, casi similaral acido alcohol, pero con menor potencia.

lelele

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