manual microbiologia de alimentos
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1
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS
MANUAL DE LA ASIGNATURA
SECRETARÍA DE EDUCACIÓN PÚBLICA
SUBSECRETARÍA DE EDUCACIÓN SUPERIOR E INVESTIGACIÓN
CIENTÍFICA
SUBSISTEMA DE UNIVERSIDADES TECNOLÓGICAS
COORDINACIÓN GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLÓGICAS
ELABORÓ: GRUPO DE DIRECTORES DE LA CARRERA DE INFORMATICA REVISÓ: COMISIÓN ACADÉMICA NACIONAL
APROBÓ: COORDINACIÓN GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLÓGICAS
FECHA DE ENTRADA EN VIGOR:
Revisión no. 0. Fecha de revisión: MARZO, 2004. Página 1 de 49 F-CADI-SA-MA-38-GP-A
2
PRESENTACIÓN DEL CURSO
Una de las principales funciones de los tecnólogos de alimentos es asegurar la
calidad microbiológica de los alimentos. Las infecciones y toxiinfecciones debidas
a la ingesta de alimentos contaminados por alimentos, son una de las principales
causas de muertes prevenibles en el mundo.
Para los Técnicos Superiores Universitarios en Tecnología de Alimentos, resulta
indispensable conocer las técnicas de trabajo aséptico en un laboratorio de
Análisis Microbiológico, los métodos de detección, identificación y cuantificación
de microorganismos en diferentes muestras de alimentos, para poder asegurar
procesos limpios en la industria y talleres, así como la calidad de los alimentos que
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MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS
GUÍA DEL PROFESOR
SECRETARÍA DE EDUCACIÓN PÚBLICA
SUBSECRETARÍA DE EDUCACIÓN SUPERIOR E INVESTIGACIÓN
CIENTÍFICA
SUBSISTEMA DE UNIVERSIDADES TECNOLÓGICAS
COORDINACIÓN GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLÓGICAS
ELABORÓ: GRUPO DE DIRECTORES DE LA CARRERA DE INFORMATICA REVISÓ: COMISIÓN ACADÉMICA NACIONAL
APROBÓ: COORDINACIÓN GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLÓGICAS
FECHA DE ENTRADA EN VIGOR:
Revisión no. 0. Fecha de revisión: MARZO, 2004. Página 1 de 56 F-CADI-SA-MA-38-GP-A
2
I. DIRECTORIO Y RECONOCIMIENTOS
DR. REYES TAMES GUERRA
SECRETARÍO DE EDUCACIÓN PÚBLICA
DR. JULIO RUBIO OCA
SUBSECRETARIO DE EDUCACIÓN SUPERIOR E INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA
DR. ARTURO NAVA JAIMES
COORDINADOR GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLÓGICAS
RECONOCIMIENTOS
M. en C. ROMÁN LUNA ANAYA
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DEL SUR DEL ESTADO DE MÉXICO
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS D. R. 2004
ESTA OBRA, SUS CARACTERÍSTICAS Y DERECHOS SON PROPIEDAD DE LA: COORDINACIÓN
GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLÓGICAS (CGUT) FRANCISCO PETRARCA No. 321, COL.
CHAPULTEPEC MORALES, MÉXICO D. F.
LOS DERECHOS DE PUBLICACIÓN PERTENECEN A LA CGUT. QUEDA PROHIBIDA SU
REPRODUCCIÓN PARCIAL O TOTAL POR CUALQUIER MEDIO, SIN AUTORIZACIÓN PREVIA Y POR
ESCRITO DEL TITULAR DE LOS DERECHOS.
ISBN (EN TRÁMITE)
IMPRESO EN MÉXICO.
3
II ÍNDICE I. DIRECTORIO Y RECONOCIMIENTOS ....................................................................................... 2 II ÍNDICE........................................................................................................................................... 3 III. INTRODUCCIÓN DE LA ASIGNATURA .................................................................................... 4 IV CONTENIDOS TEMÁTICOS....................................................................................................... 5
Unidad 1: Importancia de la microbiología en los alimentos....................................................... 5 Introducción ............................................................................................................................. 5 Objetivos.................................................................................................................................. 5 1 Clasificación de los microorganismos ............................................................................ 5 2 Morfología celular y colonial de microorganismos ......................................................... 7 3 Medios de cultivo .......................................................................................................... 10
Unidad 2: Condiciones que influyen en el crecimiento de los microorganismos y su control (mecánico, físico y químico) ...................................................................................................... 13
Introducción ........................................................................................................................... 13 Objetivos................................................................................................................................ 14 1 Concentración de sustrato, temperatura, pH, Aw, Eh ................................................... 14 2 Efecto de los parámetros anteriores en el crecimiento de los microorganismos ........ 20 3 Agentes sanitizantes, agentes químicos que inhiben o retardan el crecimiento de los microorganismos ..................................................................................................................... 2 4 Métodos de identificación de microorganismos ........................................................... 29
Unidad III: Análisis microbiológicos de los alimentos................................................................ 45 Introducción ........................................................................................................................... 45 Objetivos................................................................................................................................ 45 1 Microorganismos que causan daño y que están relacionados con los alimentos....... 45 2 Análisis microbiológicos aplicados en los alimentos.................................................... 55
REFERENCIAS .............................................................................................................................. 58
4
III. INTRODUCCIÓN DE LA ASIGNATURA
Desde los inicios de la humanidad, ha sido una constante preocupación del
hombre satisfacer sus necesidades de alimentación. Cuando era cazador y
recolector, tomaba de la naturaleza los alimentos que necesitaba cada día.
Posteriormente, con el advenimiento de la gran revolución en los hábitos culturales
que ocasionó la agricultura, hubo la necesidad de preservar en el tiempo los
alimentos cosechados con tanto esfuerzo.
Pero los alimentos pierden sus características deseables por efecto del tiempo,
por efecto de sus enzimas, y, sobre todo, por efecto de los microorganismos que
existen de manera normal o por contaminaciones.
Para un profesional de la industria alimentaria, es indispensable el conocimiento
sobre los microorganismos que pueden provocar infecciones o toxiinfecciones en
los alimentos, ya sean frescos, durante su procesamiento, o procesados; con el
objetivo de prevenir, controlar y combatir el deterioro que causan en los alimentos.
Este Manual comprende desde la identificación de los microorganismos que están
presentes en los alimentos, hasta los análisis microbiológicos que se aplican a los
alimentos, los factores que afectan y determinan el crecimiento de los
microorganismos, y su control.
5
IV CONTENIDOS TEMÁTICOS
Unidad 1: Importancia de la microbiología en los alimentos
Introducción
Todos los alimentos, de manera natural, poseen una microflora compuesta de
bacterias, mohos, virus, protozoarios o levaduras. Estos microorganismos pueden
proliferar en el alimento y causar su deterioro, o pueden afectar al organismo
productor del alimento, reduciendo o impidiendo la producción. Otros
microorganismos han sido utilizados para mejorar las características de los
alimentos y preservarlos, caso de los quesos, yogurt y otras leches fermentadas,
vinos, cervezas, sidras. Por otra parte, los alimentos pueden ser vehículo de
transmisión de microorganismos y sus metabolitos, los cuales pueden ser
patógenos para el hombre.
Para distinguir unos de otros, se utilizan diferentes técnicas entre las cuales se
desarrollarán en el manual la morfología colonial y al microscopio.
Para poder estudiar a los microorganismos es necesario cultivarlos en medios
apropiados, y por eso el último tema de la unidad comprende el conocimiento de
diferentes medios de cultivo.
Objetivos
1 Clasificación de los microorganismos
1.1 Criterios de aprendizaje
6
1.1.1 Explicar y definir la clasificación de microorganismos en
base a: dañinos, patógenos y benéficos
En el interior y exterior de todos los seres vivos, en el agua, tierra y aire se
encuentran los microorganismos. Los alimentos poseen de manera natural una
microflora al momento de su cosecha o recolección, o ser contaminados por
personal y equipo en las operaciones de matanza, procesamiento o
almacenamiento. Los microorganismos que afectan alimentos, los podemos
clasificar de varias formas, la más utilizada es aquella que los ubica en tres
categorías:
Dañinos: ocasionan problemas y mermas en la producción de alimentos, debido a
que infectan plantas y reducen su producción, o infectan animales e impiden su
utilización para la alimentación, como los agentes causantes de la mastitis en
vacunos.
Benéficos: Utilizados en fermentaciones, permiten conservar los alimentos o
modificarlos para hacerlos más nutritivos o mejorar sus características
organolépticas: vinos, cervezas, quesos, yogurth (Streptococcus thermophilus y
Lactobacillus bulgaricus en éste último).
Patógenos: Son los que pueden causar infecciones o toxiinfecciones cuando
están presentes (o sus toxinas) en los alimentos: Aeromonas, Brucella, Bacillus
cereus, Escherichia coli.
1.2 Demostración de habilidades como resultado del aprendizaje
1.2.1 Diferenciar los microorganismos dañinos, patógenos y
benéficos que afectan los diferentes grupos de alimentos
PRÁCTICA 1: Reunir muestras de diferentes tipos de alimentos (cereales, frutas,
carne, lácteos, pescados y mariscos, hortalizas) y que los alumnos propongan
7
diferentes microorganismos que puedan estar presentes y ser dañinos, benéficos
o patógenos.
2 Morfología celular y colonial de microorganismos
2.1 Criterios de aprendizaje
2.1.1 Describir la morfología colonial y estructural de
microorganismos
Estructura al microscopio
La base para que la célula pueda realzar sus funciones es que mantenga su
estructura. Al microscopio óptico (máximo 1500 aumentos) se han identificado
varias estructuras en las células de los microorganismos. Existen muchos otros
tipos de microscopio que han permitido identificar estructuras cada vez más
pequeñas: microscopio de contraste de fases, campo oscuro y fluorescencia;
microscopio electrónico de transmisión, de barrido.
Bacterias
Son organismos procariotas. Presentan una pared celular y una membrana
citoplasmática. Estas estructuras comunican a las células con su medio
ambiente, permiten introducir nutrientes y agua. Además, la aíslan de un medio
ambiente que puede ser hostil. Las bacterias pueden presentar de uno a muchos
flagelos, involucrados con su movimiento, pili, que están relacionados con el
intercambio genético. También existen ribosomas (hasta 10000 en una sola
bacteria), encargados de la síntesis de proteínas, distribuidos en todo el líquido
intracelular, llamado citoplasma. El material genético de las bacterias se presenta
en un solo cromosoma, asociado a la membrana, y en plásmidos, unidades de
ácido desoxirribonucleico. En ocasiones hay inclusiones de materiales de
8
reserva: carbono, azufre, nitrógeno o fósforo. Se reproducen por fisión binaria o
esporas.
Las bacterias presentan diferentes formas y maneras de agrupación, ésta última
depende de la manera de división de las células. La siguiente figura ilustra estos
últimos conceptos.
Mohos
Los mohos son organismos eucariotas que presentan núcleo, vacuolas y
mitocondrias. Poseen paredes celulares rígidas. También son llamados hongos
filamentosos. Cada filamento es llamado hifa, crecen en cúmulos visibles llamados
micelios, que surge cuando las hifas crecen y se entrecruzan. Las células pueden
9
ser polinucleadas, incluso con centenares de núcleos. Además de crecer mediante
el micelio, los mohos generan estructuras de esporas asexuales llamados
conidias. Algunos mohos producen esporas sexuales en formaciones diferentes:
ascosporas, basidiosporas, zigosporas, oosporas.
Levaduras:
Son hongos unicelulares y la mayoría produce ascosporas. Son células ovales o
cilíndricas y se dividen por gemación. Este proceso involucra la formación de una
yema que aumenta de tamaña hasta que se separa de la célula madre.
Normalmente no producen micelio (con excepciones como Candida albicans). Las
levaduras son mucho más grandes que las bacterias y presentan todas las
características de una célula eucariótica.
2.1.2 Identificar colonias de microorganismos de acuerdo a la
morfología colonial en medios de cultivo
Los microorganismos se identifican de diferentes maneras. Una de ellas es el
cultivo en medios en los cuales desarrollarán características esenciales para su
caracterización. Las colonias microbianas que crecen de manera aislada permiten
la identificación del microorganismo presente. Pero es necesario revisar las
técnicas de cultivo aséptico y obtención de un cultivo puro antes de revisar la
morfología de colonias microbianas.
En un análisis rutinario, se inoculan diluciones seriadas del alimento en agua,
procediendo a su siembra en un medio general, como el agar nutritivo. De las
colonias resultantes, se obtendrán cultivos puros, los cuales se someterán a
crecimiento en medios de identificación (selectivos o prueban bioquímicas).
Las características de una colonia microbiana se enlistan a continuación.
Color
10
Tamaño
Apariencia
Consistencia
Borde
Elevación
Halos alrededor
2.2 Demostración de habilidades como resultado del aprendizaje
2.2.1 Preparación de medios de cultivo, así como condiciones de
trabajo en un laboratorio microbiológico
PRÁCTICA 2: Explicar las técnicas de preparación aséptica de medios de cultivo
líquido, sólido y en medio inclinado, así como el uso de la campana de flujo
laminar. Explicar las diferentes técnicas de cultivo: por estría y asa de vidrio en
medio sólido, por punción y estría en medio líquido. Inocular con muestras de
alimentos de diferentes orígenes, a dos medios de cultivo sólidos, uno para
bacterias y otro para mohos y levaduras. Observar las características y diferencias
de las colonias que se desarrollen.
2.2.2 Preparar frotis de diferentes cultivos microbianos
PRÁCTICA 3: De las colonias resultantes en la práctica 2, preparar frotis y teñirlos
mediante cualquier técnica para observarlos al microscopio con objetivo de
inmersión. Anotar características de los microorganismos observados.
3 Medios de cultivo
3.1 Criterios de aprendizaje
3.1.1 Explicar qué es un medio de cultivo, clasificación y
composición
11
Para su estudio y detección, los microorganismos se cultivan en medios de cultivo
artificiales o naturales, que se formulan en base a los factores de crecimiento
apropiados para cada tipo de microorganismo: pH, nutrientes, factores esenciales
para el crecimiento. También poseen características que permiten la identificación
y aislamiento de microorganismos.
Los medios de cultivo se clasifican en:
1.- Por su estado físico: líquido, semisólido y sólido. El agar es un elemento
solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licua
completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40
grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las
bacterias y no es consumido por aquellas que crecen en él. Su concentración en
un medio de cultivo determina si es sólido o semisólido. Los medios líquidos
carecen de agar en su formulación.
2.- Por su origen: naturales y artificiales: naturales como la papa, zanahoria, suero
de sangre o de leche, la leche misma. Hay mas de 10000 medios artificiales
formulados para cultivar microorganismos.
3.- Por su uso:
Generales: permiten el crecimiento de la mayoría de los microorganismos
presentes en una muestra.
De aislamiento o selectivos: contienen nutrientes solo utilizados por un género de
microorganismo, lo cual impide el crecimiento de otros microorganismos presentes
en la muestra. También se añaden colorantes que actúan como indicadores para
detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de
unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo
en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como
12
inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-
positivas).
De identificación: también llamados para pruebas bioquímicas, cuando sus
nutrientes son utilizados por los microorganismos, de acuerdo a su metabolismo,
se pueden identificar en base al conjunto de observaciones: ureasa, movilidad,
indol, nitratos, citrato, manitol.
De enriquecimiento: En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos
materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa,
bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales:
para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de
fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la
sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos
menos resistentes.
De transporte: contienen pocos nutrientes, apenas permiten conservar la viabilidad
(pero no permiten el crecimiento de la población) de los microorganismos que han
sido colectados en una zona lejana a un laboratorio de análisis.
De mantenimiento: utilizados en los ceparios, sirven para mantener viables los
cultivos axénicos durante un periodo de tiempo, siendo necesaria su resiembra
rutinaria.
3.2 Demostración de habilidades como resultado del aprendizaje
3.2.1 Elección de medios de cultivo apropiados en base al
alimento y microorganismo en estudio
PRÁCTICA 4: Obtener un cultivo puro a partir de las colonias desarrolladas en la
PRÁCTICA 3. Para ello, explicar las técnicas de estriado para obtener colonias
aisladas en medios sólidos.
13
Unidad 2: Condiciones que influyen en el crecimiento de los
microorganismos y su control (mecánico, físico y químico)
Introducción
Los microorganismos son afectados por condiciones medioambientales y
fisicoquímicas en su entorno. Si graficamos el crecimiento de los microorganismos
en el tiempo, la gráfica que se obtiene en condiciones óptimas para su desarrollo
es la siguiente:
0 5 10 15
Horas
Lo
g N
Es importante conocer cómo se puede evitar el desarrollo de esta curva en
instalaciones, materia prima, producto en proceso o en almacén, mediante la
manipulación de las condiciones fisicoquímicas del ambiente, métodos de
conservación de alimentos, utilización de agentes sanitizantes y capacitación del
personal.
14
Objetivos
1 Concentración de sustrato, temperatura, pH, Aw, Eh
1.1 Criterios de aprendizaje
1.1.1 Explicar y definir que es la concentración de sustrato, la
temperatura, el pH, la Aw y el Eh
El medio ambiente en el que se desarrolla un organismo esta formado por factores
físicos, químicos, y biológicos.
Las relaciones entre organismos (parasitismo, depredación) tienen también efecto
entre los microorganismos, pero los siguientes factores revierten especial
importancia para el crecimiento de bacterias, mohos y levaduras:
1.- Concentración de sustrato: las necesidades nutricionales varían de un
microorganismo a otro. Mas aún: pueden variar en un mismo microorganismo en
diferentes etapas de sus desarrollo, o si crece en diferente temperatura. La
incapacidad de un microorganismo para utilizar el componente mayoritario de un
material alimenticio limitará su desarrollo.
2.- Temperatura: puede existir desarrollo microbiano desde los -8 ºC hasta las
100ºC. Sólo se requiere que el agua se encuentre en fase líquida, disponible para
las reacciones bioquímicas. Pero ningún microorganismo puede sobrevivir a todo
el intervalo de temperaturas. La siguiente tabla ilustra los intervalos de
temperatura y la clasificación de los microorganismos basada en su temperatura
de crecimiento:
15
Temperatura ºC Grupo
Mínima Óptima Máxima
Termófilos 40 a 45 55 a 75 60 a 90
Mesófilos 5 a 15 30 a 40 40 a 47
Psicrófilos -5 a 5 12 a 15 15 a 20
Psicrótrofos -5 a 5 25 a 30 30 a 35
Para alimentos, los microorganismos mesófilos y psicrótrofos son de la mayor
importancia. Los mesófilos generalmente son de origen humano o animal y entre
ellos se encuentran algunos de los patógenos mas frecuentes: Salmonella,
Staphylococcus aureus y Clostridium perfringens.
La curva de la velocidad de crecimiento en el intervalo de desarrollo de un
microorganismo es asimétrica:
Comportamiento del crecimiento microbiano ante la temperatura
Temperatura
Vel
oci
dad
de
crec
imie
nto
Tmínima T óptima Tmáxima
16
Esto significa que por encima de la temperatura óptima el crecimiento disminuye
mas lentamente, que por debajo de ella, porque las proteínas se desnaturalizan,
en cambio, a bajas temperaturas las reacciones químicas se ralentizan.
3.- pH: definido como el logaritmo negativo de la concentración de iones hidrógeno
de una solución, brinda una escala para medir la acidez, neutralidad o alcalinidad
de una solución, que tienen gran impacto en la estabilidad de macromoléculas
como las enzimas, que poseen un pH de actividad óptimo, de acuerdo a la
siguiente gráfica:
La velocidad de crecimiento de los microorganismos sufre un gran deterioro
cuando están en un pH diferente al óptimo, también se afecta la producción de
toxinas y esporas.
17
Evidentemente, cambios en el pH afectan la actividad de las enzimas, y con ello,
de toda la actividad de los microorganismos, los cuales se desarrollan de manera
óptima en un intervalo de la escala de pH:
Microorganismo pH mínimo pH óptimo pH máximo
Mohos 1.5 a 3.5 4.5 a 6.8 8 a 11
Levaduras 1.5 a 3.5 5 a 6.5 8 a 8.5
Bacterias 4.5 6.5 a 7.5 11
4.- Actividad de agua (aw): las células utilizan el agua de dos maneras: como
solvente de compuestos químicos (nutrientes, metabolitos) lo que facilita su
transporte; y como reactivo en las reacciones hidrolíticas que originan monómeros
que después se utilizan para síntesis de macromoléculas y generación de
energía. La aw representa la disponibilidad del agua en un medio para reacciones
químicas y bioquímicas a través de membranas semipermeables. Su valor oscila
entre 0 y 1.
No se debe confundir el concepto de aw con humedad, porque una harina con 21%
de humedad tiene la misma aw que una fruta con 80% de humedad. Los
microorganismos también están adaptados a un intervalo de aw para su desarrollo;
las bacterias requieren aw>0.910, las levaduras se desarrollan a aw>0.87,
mientras los mohos lo hacen a aw>0.70. Toda disminución de la aw disminuye el
desarrollo microbiano y la mayor parte de los métodos de conservación de
alimentos tienen su efecto más importante en la disminución de la aw.
5.- Potencial de óxido reducción (Eh) y oxígeno: Según las necesidades de
oxígeno para su metabolismo y reproducción, los microorganismos pueden ser:
aerobios (requieren la presencia de oxígeno: Pseudomonas, Micrococcus,
Bacillus), anaerobios (sólo se desarrollan en ausencia de oxígeno o con baja
tensión de oxígeno: Clostridium, Bacteroides, Peptococcus, Propionibacterium) y
18
anaerobios facultativos (enterobacterias, Staphylococcus). El potencial redox (Eh)
de un sistema biológico es un indicador de su grado de oxidación. El Eh de un
alimento guarda relación con la composición química del mismo (presencia de
sustancias reductoras, ácidos) y con la presión parcial del oxígeno durante el
almacenamiento. El Eh de un alimento determina en gran medida el tipo de flora
microbiana que se puede desarrollar (aerobia, anaerobia).
1.1.2 Explicar y discutir la importancia de los factores anteriores
en el crecimiento de los microorganismos
Los alimentos constituyen un buen medio nutritivo para los microorganismos, que
se desarrollan de acuerdo a las condiciones de los factores anteriores, y de su
potencial genético. La importancia de conocer los factores anteriores en cada tipo
de alimento radica en que, mediante su modificación con los métodos de
conservación de alimentos, se puede inhibir el crecimiento de los gérmenes,
prever las consecuencias del desarrollo de los microorganismos, e interpretar las
observaciones realizadas sobre un alimento presuntamente contaminado.
La curva de la velocidad de crecimiento de un microorganismo contra el tiempo, en
condiciones óptimas se ilustra en la siguiente figura:
19
La curva no inicia de cero, sino de una cantidad inicial de microorganismos.
Durante la fase de latencia los microorganismos se adaptan a las características
del alimento, después se empieza a acelerar la velocidad de crecimiento, en la
fase de crecimiento exponencial, hasta llegar a una fase estacionaria que precede
a la lisis celular cuando se han agotado los nutrientes o se han acumulado
metabolitos tóxicos (o ambas situaciones). El conocimiento de como afectan los
parámetros del tema anterior al crecimiento de los microorganismos permite la
modificación de la duración de la fase de adaptación, la pendiente de la fase de
crecimiento exponencial y la duración y nivel de la fase estacionaria.
1.2 Demostración de habilidades como resultado del aprendizaje
1.2.1 Manejar los parámetros analizados para el control de los
microorganismos
0 5 10 15
Horas
Lo
g N
20
PRÁCTICA 5: Del cultivo puro obtenido en la PRÁCTICA 4, tomar un inóculo para
suspenderlo en 10 ml de agua destilada estéril. Inocular con 0.5 ml de la
suspensión a placas de agar nutritivo con pH ajustado a 3.0, a 10.0, a pH normal
(testigo); otras 3 placas de agar nutritivo inoculadas se incubarán a 20, 60 y 35ºC
(testigo); cultivar otras placas de agar nutritivo con aw modificadas (adición de
solutos), Eh modificado (aerobio-anaerobio), siempre inoculando una placa testigo
para comparar el desarrollo a las 24 h.
2 Efecto de los parámetros anteriores en el crecimiento de los
microorganismos
2.1 Criterios de aprendizaje
2.1.1 Explicar cómo afectan al crecimiento de los
microorganismos los factores anteriores
Para la conservación de los alimentos se utilizan varias técnicas o métodos
basados en la modificación de los parámetros que afectan el crecimiento de los
microorganismos. Se llama sistema de barreras a la combinación de dos o más
técnicas que modifican la aw, pH, temperatura, etc., así, métodos como el secado,
afectan la aw y la temperatura; la adición de un almíbar, afecta el pH, la aw, Eh;
pero también deben controlarse estos métodos y su ejecución porque de no
aplicarse correctamente solo se provocan selecciones de microorganismos
resistentes.
2.2 Demostración de habilidades como resultado del aprendizaje
2.2.1 Identificar el sistema de barreras funcionales en diferentes
tipos de alimentos
Los métodos de conservación de alimentos modifican uno o mas de los fatores
discutidos para impedir la eliminación y/o proliferación de los microorganismos
21
presentes en un alimento. Algunos procedimientos de conservación de alimentos
son:
• conservación por frío
• conservación por calor
• desecación, deshidratación y liofilización
• salazonado
• ahumado
• encurtido
• escabechado
• radiaciones ionizantes
• elaboración de productos de humedad intermedia
• otros procedimientos
Conservación en frío (refrigeración o congelación)
Someter alimentos a bajas temperaturas con el fin de eliminar o inhibir la actividad
microbiana o enzimática, teniendo en cuenta temperatura, humedad relativa y
circulación de aire requeridos para cada alimento.
Refrigeración
Someter a los alimentos a bajas temperaturas sin llegar a las de congelación,
manteniendo la uniformidad (no cambios bruscos) durante el periodo de
conservación y serán temperaturas apropiadas de refrigeración de acuerdo al tipo
de alimento.
Congelación
Someter a los alimentos a temperaturas menores a las de su punto de
congelación, manteniendo temperatura uniforme durante el periodo de
conservación y serán temperaturas apropiadas a cada tipo de alimento.
Los alimentos sometidos a congelación deberán estar en perfectas condiciones
higiénico-sanitarias de manera que su contenido microbiano inicial antes del
22
congelamiento (conservación) asegure estabilidad del producto hasta el momento
de su consumo.
Descongelación
Atemperar en forma conveniente el producto congelado hasta que la temperatura
de este sea en todos sus puntos superior a la de congelación del mismo. Los
alimentos no podrán ser sometidos a procesos sucesivos de descongelación y
congelación.
Congelación rápida:
Someter a alimentos (materias primas y/o productos elaborados) a un proceso de
enfriado brusco que permita exceder rápidamente a la temperatura de máxima
cristalización, en un tiempo no mayor a 4 h.
Proceso de congelación rápida
Se considera completo cuando una vez lograda la estabilización térmica, la
totalidad del producto en todos sus puntos presente una temperatura de -18c o
menor.
Almacenado de productos de congelación rápida
En cámaras frigoríficas aptas para mantener la temperatura de los productos en
valores constantes y siempre de -18ºC o menos.
Conservación por el calor (esterilización, esterilización industrial o técnica,
pasterización)
Someter a los alimentos a la acción de temperaturas y tiempos adecuados para
eliminar o reducir las actividades microbianas y enzimáticas.
Esterilización
Es el proceso que destruye en los alimentos a temperatura adecuada, todas las
formas de vida de microorganismos patógenos y no patógenos.
23
Esterilización industrial o técnica
Es el proceso térmico que, aplicado a un alimento asegura:
1 Conservación sin alteración y buena calidad comercial durante un periodo
suficientemente largo, compatible con las necesidades comerciales.
2 Ausencia de microorganismos perniciosos para la salud del consumidor
(gérmenes patógenos, gérmenes toxico génicos) y ausencia de toxinas.
3 Ausencia de todo microorganismo capaz de proliferar en el alimento, lo que
supone la ausencia de toda alteración de origen microbiano.
Pasterización:
Someter a alimentos a temperaturas inferiores a 100ºC y por tiempos suficientes
para destruir las formas vegetativas de los tipos comunes de microorganismos
patógenos y una cierta proporción de las no patógenos que los contaminan, para
que el producto se pueda transportar, mantener, distribuir, consumir o utilizar en
otros procesos en condiciones de aceptabilidad a temperaturas apropiadas y por
tiempos razonables según la naturaleza del producto.
Desecación
Someter a los alimentos a las condiciones ambientales naturales para privarlos de
la mayor parte de agua que contienen.
Deshidratación
Someter a los alimentos a la acción principal del calor artificial para privarlos de la
mayor parte de agua que contienen
Liofilización
Someter a los alimentos a procesos de congelación seguidos de sublimación del
hielo formado para privarlos de la mayor parte de agua que contienen.
24
Salazón (en seco o salmuera)
Someter los alimentos a la acción de la sal comestible con o sin otros
condimentos.
Salazón en seco
Someter a superficies externas de los alimentos a la acción de la sal en
condiciones ambientales apropiadas.
Conservación en sal muera
Someter a los alimentos a la acción de soluciones de sal en concentración y
tiempos variables, según la naturaleza del producto.
Ahumado
Someter a los alimentos a la acción de humos recién formados, procedentes de la
combustión incompleta y controlada de maderas duras de primer uso, mezcladas
o no con plantas aromáticas de uso permitido. Prohibido en maderas resinosas
(menos abeto) o maderas con procesos que pueden originar toxicidad por
desprendimiento. Los productos ahumados no deben contener: mas de 1
microorganismo por kg (1ppb) de 1,2benzopireno, 3,4 benzopireno, fluoreno,
fenantreno u otros hidrocarburos policíclicos aisladamente o en mezcla de acción
toxica o nociva para la salud.
Encurtido
Someter los alimentos previamente tratados con salmuera o que hubieren
experimentado una fermentación láctica a la acción del vinagre con o sin la adición
de cloruro de sodio, edulcorantes nutritivos, condimentos, productos
aromatizantes, aceites esenciales, colorantes naturales admitidos, etc. La fase
liquida de los encurtidos deberá tener un pH (a 20ºC) no mayor a 4,3.
25
Escabechado
Someter a los alimentos crudos o cocidos, enteros o fraccionados a la acción del
vinagre con la adición o no de cloruro de sodio. La fase liquida de los productos en
escabeche deberá presentar un pH (a 20ºC) no mayor a 4,3.
Otros procedimientos
Podrá realizarse siempre que garanticen las condiciones higienizo sanitarias y de
aceptabilidad requeridas para los alimentos a que se someten. El empleo de
aditivos alimentarios se hará solamente en los casos específicamente autorizados.
Conservación por radiación ionizante o energía ionizante
Someter los alimentos a la acción de alguna de las siguientes fuentes de energía
Rayos gamma
Rayos equis
3 Agentes sanitizantes, agentes químicos que inhiben o
retardan el crecimiento de los microorganismos
3.1 Criterios de aprendizaje
3.1.1 Describir los sanitizantes utilizados en la industria de los
alimentos, forma de uso y concentraciones recomendadas
Existen dos conceptos importantes en la limpieza de industrias de alimentos: la
limpieza física y la limpieza microbiológica. La primera se refiere a la eliminación
de la suciedad visible, con cepillo, agua y detergente, se barre, rasca, se despega
toda la suciedad. La segunda se refiere a la eliminación de los microorganismos
en las superficies que han sido previamente limpiadas, también se conoce como
desinfección o sanitización, y para ello se utilizan diferentes sustancias químicas
conocidas como desinfectantes o sanitizantes.
26
La elección del sanitizante depende de los siguientes factores:
� Número y tipo de microorganismos
� Toxicidad y efecto sobre el alimento
� Corrosión
� Peligro para el personal
� Lo afecta suciedad residual
� Condiciones óptimas de uso (pH, temperatura, dureza del agua, tiempo de
contacto)
� Costo
Entre los sanitizantes más utilizados en la industria de alimentos, se encuentran
los siguientes:
� Detergentes de amonio cuaternario: son detergentes catiónicos. Como
todos los detergentes, afecta la tensión superficial del agua mejorando su
penetración para arrastrar partículas de suciedad, pero además, debido a
su grupo amonio, altera la membrana de los microorganismos conduciendo
a su muerte. No es corrosivo, tóxico, volátil o inflamable, además tiene un
amplio espectro microbiológico de acción, que incluye hongos, levaduras,
bacterias G(+) y G(-) y algas. Le afecta la dureza del agua.
� Dióxido de cloro: Evita el desarrollo de bacterias, es incoloro e inodoro, no
transmite sabor alguno a los alimentos, es seguro, disponible todo el año,
económico, de uso generalizado en la Industria Alimentaria, de fácil
aplicación, solo se diluye en agua de acuerdo a la siguiente tabla:
27
Dosificación del Cl02
potabilización de agua 0.01 AL 0.05 %
sanitización de
utensilios, recipientes e
instalaciones
0.10 AL 0.50%
sanitización de granjas 0.10 AL 0.50 %
sanitización de locales y
hospitales
2.50 %
frutas y legumbres 0.50 %
� Vapor de agua: Elimina todo tipo de microorganismos, incluyendo esporas,
pero mancha el acero, lo afecta la dureza del agua, se requieren calderas y
es peligroso por temperatura.
� Jabón: adicionado de agentes antimicrobianos, se usa para limpieza y
desinfección del personal, en base a su poder tensoactivo.
� Soluciones de yodo: es un líquido café rojizo, con acción germicida de
amplio espectro, económico, eficiente, que elimina bacterias, hongos y
levaduras. Usado ampliamente como sanitizante. Es económico, actúa
contra hongos, fácil disolución en agua, fácil de transportar y conservar,
germicida de amplio espectro aun a bajas concentraciones y temperaturas
bajas, no es irritante, elimina la suciedad, no es afectado por la dureza del
agua ni por detergentes, rápida acción germicida, tiene un gran campo de
aplicación. Se diluye en agua de acuerdo a las siguientes aplicaciones:
28
Dosificación del Yodo
desinfección de equipos y utensilios 0.00125 %
desinfección de ubres, frutas, verduras
y legumbres
0.00250 %
desinfección de granjas 0.00750 %
desinfección de superficies muy
contaminadas
0.01000 %
� Detergentes alcalinos: Los detergentes son tensoactivos: al mismo tiempo
poseen grupos hidrófobos e hidrófilos, reducen la tensión superficial del
agua mejorando su penetración y humectación. Remueven grasa, suciedad,
malos olores, sabores desagradables; suspendiéndolos y eliminándolos
mediante el agua de limpieza, lo cual facilita el lavado de equipo,
maquinaria, tubería, ya sea por aspersión o circulación. Para aplicarlos,
primero se enjuaga la superficie a limpiar con agua limpia, se aplica el
producto diluido y se enjuaga con agua limpia, aplicando después un
detergente ácido.
� Detergentes ácidos: desincrustan los residuos minerales y orgánicos, de las
tuberías y equipos, aumentando su vida útil y la eficiencia del proceso.
Limpia y abrillanta el acero inoxidable. No le afecta la dureza del agua en su
aplicación. Su empleo es recomendado después de lavar con un detergente
alcalino.
� Rotación de sanitizantes: se recomienda por la aparición de resistencia en
los microorganismos, hay que tomar en cuenta los factores fisicoquímicos,
biológicos, de instalaciones, para escoger los sanitizantes a rotar. Pero si el
desinfectante cumple su función, no debe haber rotación.
29
3.2 Demostración de habilidades como resultado del aprendizaje
3.2.1 Proponer la aplicación y concentración de un sanitizante en
función del microorganismo presente
PRÁCTICA 6: En todas las visitas industriales que se realicen, que los alumnos
recopilen la información referente a como controlan la sanitización de sus
instalaciones, así como de los laboratorios y talleres escolares, proponiendo
mejoras.
4 Métodos de identificación de microorganismos
4.1 Criterios de aprendizaje
4.1.1 Explicar los métodos de identificación de microorganismos
que causan daño en los alimentos
Los microorganismos pueden hacer daño en los alimentos de dos maneras:
produciendo su alteración o enfermándonos:
1.- Alteración de los alimentos (microorganismos alterantes)
Alimento deteriorado: aquel dañado por agentes microbianos, químicos o físicos
de forma que es inaceptable para el consumo humano.
- Aproximadamente el 20% de las frutas y verduras recolectadas se pierden por
deterioro microbiano producido por alguna de las 250 enfermedades de mercado.
- Los agentes causantes de deterioro pueden ser bacterias, mohos y levaduras;
siendo bacterias y mohos lo más importantes.
- Las carnes son los alimentos más fácilmente deteriorables. Durante el proceso
de deterioro se va seleccionando una población o tipo de microorganismos
30
predominante; la variedad inicial indica poco deterioro y refleja las poblaciones
iniciales.
- Cada tipo de alimento se deteriora por acción de un tipo de microorganismo
concreto; cada asociación es específica.
- De todos los microorganismos presentes en un alimento solo algunos son
capaces de multiplicarse activamente sobre el alimento resultando seleccionados.
Existen una serie de factores que «dirigen esta selección».
Factores intrínsecos (aw, pH, Eh, nutrientes, estructuras, agentes antimicrobianos),
composición del alimento.
Tratamientos tecnológicos: modifican flora inicial.
Factores extrínsecos: condiciones físicas del ambiente.
Factores implícitos: relaciones establecidas entre los microorganismos.
Estos cuatro factores determinan lo que se denomina resistencia a la colonización
de un alimento.
Los microorganismos al crecer y utilizar los alimentos como fuente de nutrientes
producen cambios en la apariencia, sabor, olor y otras cualidades del alimento.
Estos procesos de degradación son:
a.- Putrefacción
Proteínas alimentos + Microorganismos proteolíticos ------> Aminoácidos + Aminas
+ NH3 + SH2
b.- Fermentación
Carbohidratos alimentos + Microorganismos sacarolíticos ------> Ácidos +
Alcoholes + Gases
31
c.- Enranciamiento
Grasas alimentos + Microorganismos lipolíticos ------> Ácidos grasos + Glicerol
2.- Enfermedades de origen microbiano (microorganismos patógenos)
a.- Infección alimentaria: Salmonelosis
b.- Toxiinfección alimentaria: Botulismo (por acción de las toxinas de un
microorganismo aunque éste ya no se encuentre presente en el alimento)
Identificación de microorganismos
Los microorganismos son identificados mediante pruebas morfológicas y
bioquímicas, tinciones, y otros análisis especializados como serotipos o patrones
de inhibición frente a antibióticos. Cuando es necesario, se utilizan técnicas de
Biología Molecular como la secuenciación genética.
En ocasiones, cepas diferentes de la misma especie microbiana presentan
diferente patogenicidad, por lo cual se requiere diferenciarlas mediante análisis de
serotipos (como los flagelares), actividad enzimática, identificación de toxinas.
Tinciones
Tinción de Bacterias
Si se desean observar las características morfológicas de las bacterias, resulta
sumamente útil el utilizar las preparaciones fijas y teñidas, debido a que estas
permiten que las células se visualicen de mejor manera y se puedan diferenciar
las distintas especies por su coloración, este método en particular se llama tinción
diferencial o selectiva.
32
Los pasos a seguir para la tinción de las bacterias es hacer el frote, la fijación y la
aplicación de las soluciones colorantes. La amplia gama de colorantes que se
pueden utilizar, ha obligado a separarlos en tres grupos generales, los de
trifenilmetano, los de oxacina y los de tiacina. Esta clasificación es buena para la
distinción de las familias de colorantes, pero en general se utiliza la clasificación
de acuerdo a su carácter ácido – base, es decir, ácidos, bases o neutros, debido a
que de esto depende mucho su comportamiento. La coloración se da de acuerdo
con a la acción de los iones complejos del colorante y los sitios activos de la
superficie o del interior de la célula.
Entre los diversos tipos de coloración de bacterias, están la coloración simple,
diferencial y la tinción negativa.
Coloración Simple
Este tipo de coloración consiste en inundar con un colorante cualquiera la lámina
donde se tienen las bacterias, luego lavarlas con agua, y algunas células
retendrán el colorante, por reacción con el mismo.
Coloración diferencial
Este tipo de coloración es sumamente importante, ya que discrimina entre un tipo
de bacterias y otro de acuerdo con su susceptibilidad ante uno u otro colorante.
Entre estos métodos se encuentra la coloración de Gram, que es sumamente
importante en microbiología. Este método discrimina entre células grampositivas y
células gramnegativas, es generalmente utilizado debido a que muchas de las
células patógenas son del tipo gramnegativo, aparte de esta diferencia las células
grampositivas son más susceptibles a la penicilina y más resistentes a la acción
mecánica y exposición a algunas enzimas que las gramnegativas.
33
Catalasa
Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra en la
mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen
citocromo. La principal excepción es Streptococcus.
Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes
géneros:
Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).
Bacillus (+) de Clostridium (-).
Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de
C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)
Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse
siguiendo dos técnicas:
Método del portaobjetos (recomendado):
Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y
colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio.
Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el
microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.
Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.
Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada)
pueden producirse falsos positivos.
Método del tubo de ensayo:
Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en tubo
inclinado densamente inoculado.
Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
34
Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre,
se debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa al retirar la
colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dará un
falso resultado positivo.
Citrato
Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato
como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de
nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las
enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros:
Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella.
Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son
incapaces de crecer con esos nutrientes.
Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene
citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno
respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Sólo las bacterias
capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán
iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una
fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color del
indicador de pH, de verde a azul.
Fenilalanina desaminasa
Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el
aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico por su actividad enzimática de
fenilalanina desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad
enzimática es característica de todas las especies del género Proteus y del grupo
Providencia por lo que se usa para separar ambos géneros de otras
enterobacterias.
35
Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie del tubo
inclinado con abundante inóculo e incubando durante 12-16 horas. Seguidamente
se añade 0,2ml de una solución de cloruro férrico al 10% de manera que inunde
todo el crecimiento. La presencia de ácido fenilpirúvico (prueba positiva) se
manifiesta por la aparición de un color característico verde oscuro o verde-
azulado.
Indol
Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano.
Dicha liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante el
enzima triptofanasa.
Para la realización de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas en un
caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante triptófano).
Para la posterior detección del indol se usa el reactivo de Kovacs que se puede
preparar con los siguientes ingredientes:
Alcohol amílico o isoamílico (puede sustituirse por alc.butílico)........150ml
p-dimetilamino-benzaldehído..........................................................10g
HCl (concentrado).........................................................................50ml
Se disuelve primero el aldehído en el alcohol y después se agrega lentamente a
esta mezcla el ácido. Para el control de calidad del reactivo se pueden utilizar
cultivos conocidos. Las más convenientes son Escherichia coli (indol+) y todas las
especies de Klebsiella (indol-).
Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al añadir al medio 5 gotas del reactivo
de Kovacs, se producirá un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la
prueba será considerada positiva. Si esto ocurre después de 24 horas, la prueba
se considera completa, pero si es negativo deberá incubarse otras 24 horas y
36
repetirse la prueba. Por ello es conveniente hacer siempre la prueba no en el tubo
incubado sino en una porción de unos 2 ml que se retira de él asépticamente.
Lactosa
Esta prueba se usa para diferenciar entre las enterobacterias en general y el grupo
de las coliformes. Se trata por tanto de una prueba de gran importancia debido a
que los coliformes se utilizan como organismos indicadores de contaminación
fecal en análisis, sobre todo, de aguas. En bacteriología se define el grupo de
organismos coliformes como los "bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios
facultativos, no formadores de esporas y que fermentan la lactosa con formación
de gas a 35ºC en 48 horas". No se trata de un grupo taxonómico e incluye una
gran variedad de bacterias, la mayoría de ellas de origen intestinal.
Una manera sencilla de realizar la prueba de la fermentación de la lactosa en
enterobacterias es sembrar el microorganismo en agar McConkey, ya que este
medio, además de selectivo frente a bacterias no entéricas, es diferencial ya que
contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro).
En agar McConkey las bacterias Gram positivas ven inhibido su crecimiento
debido a la presencia de sales biliares y cristal violeta y sólo crecerán las
enterobacterias, pero entre ellas las que fermenten la lactosa (coliformes) liberarán
productos ácidos que producirán un cambio de pH que se detectará gracias al rojo
neutro. Las colonias lactosa (+) aparecerán de color rojo o violeta contrastando
con la coloración amarillenta de las colonias lactosa (-).
Manitol, movilidad y nitratos
Se incluyen en este apartado 3 pruebas bioquímicas debido a que se pueden
realizar cultivando el microorganismo en un único medio, el Manitol Movilidad, que
se prepara en tubo con agar recto y se siembra en picadura, incubándose a 37ºC
durante 24 horas. También existe la posibilidad de hacer las pruebas en otros
medios y por separado.
37
Prueba del Manitol
Sirve para detectar si los gérmenes son capaces de fermentar el manitol liberando
productos ácidos que serán detectados gracias al indicador rojo de fenol que
cambiará a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol movilidad incluye 7,5
g/l de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las enterobacterias, Proteus
mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae. Entre las bacterias de
importancia clínica, la prueba del manitol sirve para diferenciar Staphylococcus
aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-).
Prueba de la Movilidad
Sirve para determinar si un organismo es móvil o inmóvil. Las bacterias tienen
movilidad por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre los
bacilos aunque existen algunas formas de cocos móviles.
El medio manitol movilidad permite la realización de esta prueba gracias a ser
semisólido ya que presenta solamente 3,5 g/l de agar. En estas condiciones, las
bacterias móviles producirán un enturbiamiento homogéneo del medio debido a la
distribución aleatoria de los microorganismos. Por el contrario, las bacterias
inmóviles permanecerán en la misma línea de la picadura en que se sembraron.
Entre las enterobacterias, la movilidad nos permite diferenciar el género Klebsiella
(-) de las restantes que suelen ser movilidad (+).
Dentro del género Bacillus, nos permite diferenciar B.anthracis (-) de otras
especies generalmente (+).
Prueba de la reducción de nitratos
Sirve para determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en
nitritos. Para ello, el medio manitol movilidad incorpora 1 g/l de potasio nitrato y
para revelar la presencia de nitritos después de su incubación se añaden los
reactivos A y B de Griess-Ilosvay en cantidades iguales (1ml aprox.). Un cambio
38
de color (rojo) dentro de los 30 seg indica prueba completa con resultado positivo.
Si no cambia de color, se agrega directamente al tubo una pizca (unos 20mg) de
polvo de cinc purísimo, totalmente exento de nitratos o nitritos, y se observa el
cambio de color durante otros 30 seg, al cabo de los cuales se realiza la
interpretación final.
Las enterobacterias son generalmente nitratos (+). Esta prueba se utiliza
principalmente para diferenciar entre sí determinadas bacterias de los géneros
Haemophylus y Neisseria.
Oxidasa
Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción
de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la
oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce
agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por
tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones.
Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos
aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún
microaerófilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad
oxidasa. Asimismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa,
ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno (ver prueba de la catalasa) que se
produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es
tóxica.
La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para identificar todas las especies de
Neisseria (+) , diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las
enterobacterias.
El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1% de
diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menos tóxico
y mucho más sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de
39
Gordon y McLeod), pero es más caro. Este reactivo tiñe las colonias oxidasa
positivas de color lavanda que vira gradualmente a púrpura-negruzco intenso.
Realización de la prueba:
Método en placa directa
Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la
placa y no invertirla.
Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reacción se produce
en unos 10-15 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de
los 10-30 minutos.
Método indirecto sobre papel
Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de
Petri.
Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.
Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado.
La reacción de color positiva se produce a los 5-10 segundos.
Rojo de metilo y Voges-Proskauer
Estas dos pruebas forman parte del IMVIC de las colimetrías y permiten la
diferenciación dentro de las enterobacterias del grupo coli y aerógenes. Las
enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarán la glucosa en dos fases:
primero la metabolizarán aerobiamente (respiración oxibióntica) consumiendo
rápidamente el oxígeno del medio, para, en segundo lugar, continuar
metabolizándola por vía anaerobia (fermentación). Ésta puede ser de dos tipos:
Fermentación ácido mixta: La realizan las bacterias del grupo de E.coli y los
productos finales son ácidos orgánicos (ácidos fórmico, acético, láctico y
succínico) que provocan un fuerte descenso del pH inicial del medio. Puede
detectarse por el viraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo por
encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4.
40
Fermentación butilén glicólica: La realizan las bacterias del grupo Klebsiella-
Enterobacter (antiguo aerógenes). Los productos finales son compuestos neutros
como el butanodiol y el etanol, produciéndose acetoína como intermediario que
podrá ser detectada añadiendo al medio KOH (reactivo A de Voges-Proskauer) y
alfa-naftol (reactivo B de Voges-Proskauer) que reaccionarán con este compuesto
produciendo un color rojo característico.
Para la realización de estas dos pruebas se cultiva el microorganismo en caldo
RMVP (medio de Clark y Lubs) y se incuba a 30ºC durante un periodo de 3 días
como mínimo y 5 como máximo. Al revelar las pruebas, se separa el cultivo en dos
porciones de unos 2,5ml que servirán para cada uno de los ensayos.
Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le añade unas gotas (4-5) de solución
indicadora de Rojo de Metilo. Se agita para homogeneizar y se observa la
coloración. Se considera positiva si vira al rojo y negativa si permanece amarillo.
Foto de los resultados de esta prueba
Voges-Proskauer: A la otra porción de cultivo se le añade: 0,6ml del Reactivo A de
Voges-Proskauer (alfa-naftol 5% en etílico absoluto). El medio adquiere un
aspecto lechoso.
0,2ml del Reactivo B de Voges-Proskauer (KOH 40%). Desaparece el aspecto
lechoso y se agita fuertemente.
Si la prueba es positiva, antes de cinco minutos aparece un color rosado-violáceo,
más o menos intenso, que se inicia en la parte superior del tubo. Si la prueba es
negativa no aparece coloración alguna.
Ureasa
Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos
moléculas de amoniaco por acción del enzima ureasa. Esta actividad enzimática
es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para
41
diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo
retardado.
Se cultiva el microorganismo en tubo inclinado en agar urea de Christensen. Este
medio se complementa después del autoclavado con 50ml/l de urea. Ésta será
degradada por aquellos microorganismos capaces de producir el enzima ureasa.
Esta degradación produce amoniaco que hará variar el color del indicador de
amarillo a rojo, poniéndose así de manifiesto la actividad ureasa.
Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo
de incubación ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio poco después
de la inoculación y sus resultados deben ser leídos en las primeras 2-6 horas,
mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen actividad ureasa
dentro de las 24-48 horas de incubación.
Resumen de resultados positivos
PRUEBA
RESULTADO POSITIVO
Catalasa Aparición de burbujas de O2
Citrato Medio de color azul
Fenilalanina desaminasa Aparición de color verde oscuro
Indol Aparición de un anillo rojo
Lactosa Colonias de color violeta
Manitol Aparición de color amarillo
Movilidad Difusión a partir de la línea del
inóculo
Nitratos Cambio de color (rojo oscuro)
Oxidasa Aparición de color azul
42
Rojo de Metilo Aparición de color rojo
Ureasa Aparición de color rojo
Voges-Proskauer Aparición de color rojo
Una vez que se tiene el conjunto de resultados de esta, y mas pruebas
bioquímicas, se procede a buscar en tablas preparadas en libros de Análisis
Microbiológico, el microorganismo que presente los resultados iguales a las
pruebas ensayadas.
4.2 Demostración de habilidades como resultado del aprendizaje
4.2.1 Evaluar los métodos adecuados para la identificación de
microorganismos y su efecto en alimentos
PRÁCTICA 7: TINCIÓN DE GRAM: Reactivos: Cristal violeta (1 g de cristal
violeta en 100 ml de agua destilada). Lugol (1 g de iodo en 2 g de ioduro potásico
en 100 ml de agua destilada). Safranina (1 g de safranina en 100 ml de agua
destilada). Desarrollo: Extensión: En un portaobjetos limpio (con alcohol, papel de
filtro y flameado) se coloca una gota de agua destilada a la cual, con el asa de
siembra, previamente esterilizada a la llama, se lleva una pequeña cantidad de
suspensión de bacterias o, en su caso, de una colonia.
Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el portaobjetos y se fija la
extensión por el calor, calentando suavemente a la llama del mechero hasta que
se seque.
43
Coloración:
a) 1 minuto en cristal violeta de Hucker (colorante inicial)
b) Se lava con agua destilada
c) 1 minuto en lugol (mordiente)
d) Se decolora con alcohol de 95° (decolorante)
e) Se lava con agua destilada
f) 1 minuto en safranina (colorante de contraste)
g) Se lava con agua corriente
h) Se seca suavemente y sin frotar con papel de filtro
Una vez que la preparación está totalmente seca, poner una gota muy pequeña de
aceite se inmersión y observar al microscopio con el objetivo de inmersión.
PRÁCTICA 8: Pruebas bioquímicas. A partir de un cultivo puro obtenido de la flora
presente en un alimento, inocular tantos medios para pruebas bioquímicas de que
44
se disponga, obtener resultados a las 24 h (corroborar negativos hasta las 48 h),
discutirlos y tratar de identificar el género y la especie presente.
45
Unidad III: Análisis microbiológicos de los alimentos
Introducción
Los alimentos, de cualquier origen, nunca son estériles. De manera normal poseen
una flora microbiana cuya composición depende de cómo llegan los
microorganismos al alimento, como se multiplican, que relaciones se establecen
entre ellos y como interaccionan al pasar el tiempo.
La flora de los alimentos que consumimos dependerá de esta flora natural inicial,
de los microorganismos introducidos durante las operaciones de cosecha,
recolección, pesca, matanza; procesamiento, almacenamiento y distribución.
Como ya se mencionó, esta flora puede causar infecciones o toxiinfecciones al ser
consumidos.
Uno de los objetivos más importantes de la Microbiología de alimentos es
contribuir a garantizar al consumidor un abastecimiento de alimentos sanos e
inocuos, aplicando los tratamientos adecuados para preservar y asegurar la
calidad de los alimentos.
Objetivos
1 Microorganismos que causan daño y que están relacionados
con los alimentos
1.1 Criterios de aprendizaje
1.1.1 Identificar los microorganismos que causan daño con
mayor frecuencia en los alimentos
46
Leche
La leche es el líquido segregado por los mamíferos para alimentar a sus crías
(excluyendo el calostro). Económicamente, la leche de vaca es la más importante.
Sus componentes principales son lactosa, grasa y proteínas, además de un 78%
de agua. Posee un pH cercano a la neutralidad, elevada aw y numerosos
nutrientes, por lo tanto, es un excelente medio para el desarrollo de
microorganismos.
Los microorganismos presentes en la piel y ubre de la vaca pueden invadir el
pezón y el interior de la ubre. Micrococos, estreptococos y Corynebacterium bovis
son los organismos comúnmente hallados. Los culpables de las infecciones de las
ubres son Staphylococcus aureus, E. coli, Streptococcus agalactiae,
Streptococcus uberis, Pseudomonas aeruginosa y Corynebacterium pyogenes.
Algunos patógenos de origen humano también pueden intervenir en la mamitis:
Salmonella, Listeria monocytogenes, Mycobacterium bovis y Mycobacterium
tuberculosis.
El material para la manipulación y almacenamiento de la leche, también pueden
ser fuente de microorganismos.
Carne
Se llama carne al músculo y vísceras de los animales, las fuentes más importantes
son las de ganado vacuno, los cerdos, borregos, chivos y aves de corral. La carne
es una fuente importante de proteínas, lípidos y nitrógeno no proteico. Además,
posee una elevada aw y un pH cercano a la neutralidad.
Los primeros organismos en crecer en la carne utilizan los carbohidratos y el
nitrógeno no proteico soluble. Los microorganismos proteolíticos entran en acción
en las últimas etapas de la descomposición de la carne.
47
Durante el procesamiento de los animales, la evisceración reviste primordial
atención debido a que el tracto intestinal está repleto de microorganismos, muchos
de los cuales son patógenos, como Salmonella y Campylobacter en aves de
corral. Después de formar la canal, el lavado con agua caliente (80°C), lavado con
agua clorada o con ácido cítrico reducen la flora microbiana de superficie de la
canal. Además, regularmente se expone la carne a choque térmico con
temperaturas de refrigeración.
Las carnes rojas refrigeradas poseen un elevado Eh en la superficie lo cual
permite el crecimiento de aerobios psicrótrofos como Pseudomonas (P. fragi, P.
lundesis y P. flurescens), Acinetobacter y Psichobacter. Las Pseudomonas son el
organismo predominante en el deterioro de las carnes rojas.
Las carnes envasadas al vacío dan origen a una microflora dominada por
microorganismos gram positivos, ácido lácticos, como Lactobacillus,
Carnobacterium y Leuconostoc.
Pescado
A diferencia de la carne, el pescado no contiene depósitos de grasa visibles.
También es una fuente importante de proteínas. El pescado recién capturado
suele ser estéril pero la piel, agallas e intestinos contienen muchas bacterias,
principalmente gram negativas como Pseudomonas, Shewanella, Psychrobacter,
Vibrio, Flavobacterium y Cytophaga.
La grasa del pescado es poliinsaturada y por lo tanto muy reactiva, esto implica
que muchas veces la alteración del pescado es química (rancidez oxidativa). La
descomposición microbiana es la más frecuente y comienza con la utilización de la
fracción nitrogenada no proteica que origina la trimetilamina. El olor desagradable
del pescado descompuesto se debe a sulfuro de hidrógeno, metil mercaptano y el
dimetil sulfuro así como la trimetilamina.
48
La alteración del pescado refrigerado se debe principalmente a bacilos psicrótrofos
gram negativos como Shewanella putrefaciens y Pseudomonas spp.
Crustáceos y moluscos
Además de su flora endógena, suelen contaminarse con bacterias del lodo que es
arrastrado con ellos en su captura. Como contienen mas carbohidratos que la
carne y el pescado, su alteración es glucolítica en lugar de proteolítica.
Cereales
Trigo, arroz y maíz son la principal fuente de alimentación en el mundo. Al poseer
una reducida aw, los mohos son los responsables del deterioro de los granos
almacenados. Los géneros Penicillium, Aspergillus y Fusarium son los más
importantes.
Legumbres, nueces y semillas oleaginosas
Las legumbres constituyen la principal fuente de proteínas vegetales, y las nueces
y semillas oleaginosas proporcionan aceites vegetales. Las semillas almacenadas
pueden ser atacadas por mohos, especialmente lipolíticos: Aspergillus niger, A.
tamarii, Penicillium spp. y Paelomyces spp.
Frutas y sus derivados
Aunque poseen aw elevadas, el bajo pH que los caracteriza permite el desarrollo
de levaduras y mohos. Los cítricos son deteriorados por Penicillium italicum y P.
digitatum. En manzanas, P. expansum provoca la podredumbre blanda. Peras y
manzanas son atacadas por los ascomicetos Venturia inaequalis y Monilia
fructigena.
49
Hortalizas y derivados
Su pH más elevado permite el crecimiento de bacterias, y también hongos. La
alteración de las hortalizas es provocada por bacterias pectinolíticas de los
géneros gram negativos Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas y Clostridium.
Alimentos enlatados
En los alimentos enlatados los microorganismos pueden causar alteraciones. En
general, los microorganismos se asocian con grupos particulares de alimentos.
Éstos pueden sobrevivir al tratamiento térmico requerido para el enlatado o bien
contaminar el alimento después de dicho tratamiento debido a suturas o fugas del
envase.
Cuando la contaminación es anterior al tratamiento, es posible predecir el
microorganismo responsable si se conocen bien la naturaleza del alimento y las
condiciones a las que se ha sometido dicho alimento. Sin embargo, los
microorganismos que se introducen por fugas pueden ser muy variados al igual
que la composición de los medios de enfriamiento. En la siguiente tabla se ilustran
algunos microorganismos que deterioran alimentos enlatados.
Grupos según grado de
acidez
Rango de pH
Grupos de alimento
Microorganismos
Grupo 1: poco ácidos
> 5
Productos cárnicos Productos marinos Leche Hortalizas
Grupo 2: semiácidos
4,5 < pH < 5,0
Mezclas de carne y vegetales Sopas Salsas
Aerobios esporulados Anaerobios esporulados Levaduras, mohos y bacterias no esporuladas
Grupo 3: ácidos
3,7 < pH < 4,5
Tomates Peras Higos Piña Otras frutas
Bacterias esporuladas Bacterias no esporuladas Levaduras Mohos
Grupo 4: muy ácidos
PH < 3,7 Encurtidos Pomelo Zumos cítricos
50
Microorganismos en alimentos de acidez baja y media
Aerobios esporulados
Los más difundidos son los del género Bacillus, que tiene su origen en el suelo y
agua, por lo que casi siempre están presentes en las materias primas empleadas
en conservas. Su temperatura óptima de crecimiento oscila entre los 28 y 40 ºC
para la mayoría, aunque existen algunos termófilos, que pueden desarrollarse a 55
ºC e incluso 70 ºC. Entre estos podemos encontrar, tanto aerobios obligados,
como anaerobios facultativos, estos últimos capaces de crecer en condiciones de
vacío. Los tipos de alteraciones que pueden tener lugar son: la fermentación
simple, la producción de gas y la de ácido y gas.
La fermentación simple es la más común y se debe al ataque de los carbohidratos
con producción de ácido y sin producción de gas. B. stearothermophilus y B.
coagulans son los principales termófilos causantes de la fermentación simple. El
primero, en productos de baja acidez (guisantes, hortalizas;no crece con un pH
menor de 5), sometidos a un tratamiento térmico relativamente intenso, aunque no
se produce la alteración cuando el enfriamiento es rápido y si se realiza el
almacenamiento en frío. B. coagulans es acidúrico (pH de hasta 4,2) y presenta
esporas menos resistentes al calor, por lo que las alteraciones tienen lugar en las
carnes enlatadas, ya que el tratamiento térmico para estas es más bajo que en las
hortalizas. También aparece asociado a productos ácidos (jugo de tomate), ya que
por su bajo pH el tratamiento térmico es ligero.
La producción de gas por aerobios esporulados se debe a la denitrificación del
nitrato en carnes curadas enlatadas, maiz, guisantes, etc. B. cereus y B.
mesentericus aparecen en salmón y cangrejos, mientras que B. macerans y B.
polymixa forman ácido y gas.
Anaerobios esporulados
Los anaerobios esporulados proceden principalmente del suelo, por lo que se
encuentran ampliamente distribuidos en la leche, hortalizas y otros productos
51
alimenticios. También es posible encontrarlos en la carne, ya que algunas
especies también se desarrollan en los intestinos del hombre y animales.
El género más importante es el Clostridium, pudiendo encontrar organismos
termófilos y mesófilos. Entre los primeros, los sacarolíticos son los más
importantes, produciendo gran cantidad de gas a partir de los carbohidratos,
principalmente dióxido de carbono e hidrógeno, lo que da lugar al abombamiento
de las latas. Estas alteraciones van acompañadas de un olor butírico. No producen
ácido sulfhídrico. La temperatura óptima de desarrollo se sitúa alrededor de los 55
ºC, apareciendo sobre todo en países cálidos, donde las temperaturas de
almacenaje pueden sobrepasar los 35 ºC. También los termófilos pueden ser
causantes de una alteración sulfurosa, en este caso con producción de ácido
sulfhídrico.
Los organismos mesófilos son los segundos en importancia después de los
causantes de la fermentación simple. Entre estos destaca Clostridium botulinum.
Se trata de una bacteria Gram positiva, anaerobia y esporógena, cuyo crecimiento
queda inhibido a pH menor de 4,5. Sin embargo, los organismos aeróbios de un
alimento pueden crecer y usar el oxígeno en un recipiente, creando condiciones
anaerobias adecuadas para su desarrollo y en un producto ácido puede crecer C.
botulinum, si está presente, cuando el ácido haya sido utilizado por otros
organismos, aumentando el pH. Es el más resistente de los microorganismos que
intoxican los alimentos, por lo que la industria de enlatado admite de forma general
que todos los productos no ácidos tratados deben cumplir los requerimientos
básicos necesarios para destruir a C. botulinum (esterilización durante 2,8 minutos
a 121,1ºC). En los alimentos correctamente procesados no se produce el
desarrollo de esta bacteria, aunque existen alimentos con porciones sólidas en los
que puede haber heterogeneidad de pH durante cierto tiempo, por lo que debe
mantenerse un pH inferior a 4,5 como margen de seguridad. Este microorganismo
merece especial mención debido a su significancia para la salud humana. Se
presenta tanto en forma vegetativa como de esporas, siendo estas últimas la
52
forma importante desde el punto de vista del enlatado de alimentos. La forma
vegetativa se destruye fácilmente a temperaturas menores de 100ºC, mientras que
las esporas, que proceden del polvo y del suelo, pueden sobrevivir 300 minutos de
ebullición a 100ºC. Éstas varían su resistencia al calor, siendo difícil obtener una
suspensión de esporas de resistencia uniforme al calor para su estudio. Tiene
poderes proteolíticos y sacarolíticos. La toxina botulina es soluble en agua y
extremadamente letal para el hombre (tipos A y B). Las esporas deben germinar
para producir una célula vegetativa que produce la toxina, por lo que es poco
probable encontrar presente el organismo con su toxina, de forma que el alimento
puede ser ingerido por ausencia de indicios de contaminación (sabor u olor
extraños). Dicha toxina es destruida por exposición durante diez minutos a calor
húmedo a 100ºC. La determinación del tipo de toxina se lleva a cabo mediante
reacciones antigénicas.
La temperatura óptima de crecimiento de los organismos mesófilos oscila entre los
20 y 50 ºC (algunos menos y otros más, aunque generalmente es de 37 ºC).
Según su capacidad para atacar a los hidratos de carbono pueden ser de dos
tipos: proteolíticos o putrefactivos y sacarolíticos. Los primeros son causantes de
alteraciones gaseosas con degradación del alimento y producción de compuestos
de olor desagradable. Éstos son más importantes en los alimentos de acidez baja
y media, excepto en el jamón york enlatado, en el cual se producen alteraciones
de tipo sacarolítico causadas por C. perfringens. Destacan C. hystolyticum, C.
sporogenes y C. bifermentans. Entre los de tipo sacarolítico los más frecuentes
son C. butyricum, C. pasteurianum, C. perfringens y otros.
Levaduras, mohos y bacterias no esporuladas
Los únicos importantes en los alimentos de acidez baja y media son aquéllos con
resistencia térmica relativamente baja, los que producen alteraciones por fugas en
la lata y aquéllos que producen alteraciones en la leche condensada y las carnes
curadas enlatadas (jamón, tocino, etc.).
53
Entre las levaduras destacan las fermentadoras de la sacarosa que se desarrollan
en la leche condensada, ya que este alimento no es sometido a ningún tratamiento
térmico, sino que la base de su conservación radica en su elevado contenido en
azúcar. Torula globosa, de células redondeadas, ocasiona la distensión de las
tapas de las latas. Torula lactiscondensis, de células ovales, produce una
fermentación mucho más vigorosa, por lo que las latas pueden reventar en pocos
días. Aspergillus repens es un moho que da lugar a la formación de botones en la
superficie de la leche condensada. Dentro de las bacterias no esporuladas
destacan:
- Pseudomonas fluorescens, que poduce rancidez.
- Streptococcus liquefaciens, que provoca la licuefación de la gelatina del jamón
enlatado.
- S. faecicum y S. faecalis, son estreptococos fecales que producen olores y
sabores anormales en jamones enlatados. El primero es de mayor interés debido
a su mayor termorresistencia.
- Las Enterobacteriaceae (coliformes, Aerobacter, Proteus sp., etc.) son
responsables del abombamiento del jamón enlatado.
Microorganismos en productos ácidos
En la mayoría de los casos se controlan fácilmente con un tratamiento térmico
relativamente corto a una temperatura inferior a los 100 ºC.
Bacterias esporuladas
Podemos encontrar bacterias anaerobias sacarolíticas y otras responsables de la
fermentación simple. Dentro de las primeras destacan Clostridium pasteurianum,
que produce la alteración gaseosa de frutas y tomates enlatados y que no se
54
desarrolla a pH inferior a 3,7, y C. butyricum, que afecta también a las frutas
enlatadas.
Bacillus coagulans es responsable de la fermentación simple en el jugo de tomate
enlatado, ocasionando además sabores anormales. Es termófilo y se desarrolla
aun pH de 4,2. B. macerans, produce alteraciones gaseosas en frutas enlatadas y
junto a B. polymixa, en hortalizas y frutas enlatadas.
Bacterias no esporuladas
Son bacterias Gram positivas productoras de ácido láctico (cocos y bacilos) y
algunas son productoras de gas. Pueden desarrollarse con escasa tensión de
oxígeno y son responsables de fermentaciones de vegetales. Se destruyen con
tratamiento térmico a menos de 100ºC.
Lactobacillus brevis causa una vigorosa fermentación en salsa capsup y productos
similares y es formador de gas. Leuconostoc pleofructi produce la alteración de los
jugos de fruta, dando lugar a la formación de una película de limo en las
soluciones de azúcar (alteración de productos de tomate). Leuconostoc
mesenteroides da lugar a la alteración gaseosa de la piña enlatada.
Levaduras
Presentan escasa resistencia al calor, por lo que no son frecuentes en enlatados
sometidos a tratamiento térmico y sí cuando el tratamiento es subtérmico o
cuando se producen fugas. Son responsables de la fermentación de salsas ácidas,
gelatinas y productos similares cuya conservación depende de los ácidos, el
azúcar y la sal.
Mohos
Byssochlamys fulva es la especie de mohos de mayor importancia en los
alimentos enlatados ácidos. Afecta a frutas enlatadas y embotelladas. Es
responsable de la desintegración de la fruta por descomposición del material
55
pectínico. Las latas a veces se abomban debido al desprendimiento de dióxido de
carbono. Su temperatura óptima de crecimiento es de 30-37 ºC y resulta altamente
resistente al calor.
Byssochlamys nivea es semejante al anterior y es mucho más frecuente en la
alteración de fresas enlatadas. Penicillium afecta a las grosellas enlatadas y es
altamente termorresistente. Aspergillus también es termorresistente y se presenta
en las fresas enlatadas. Rhizopus nigricans es responsable de la degradación de
las frutas enlatadas y especialmente del albaricoque. Rhizopus stolonifer ocasiona
el ablandamiento de los albaricoques enlatados.
1.2 Demostración de habilidades como resultado del aprendizaje
1.2.1 Aislar microorganismos que se encuentran en alimentos
sospechosos
PRACTICA 9: Analizar un alimento presuntamente contaminado con
microorganismos de acuerdo a la NOM- NOM-113-SSA1-1994 Bienes y servicios.
Método para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.
2 Análisis microbiológicos aplicados en los alimentos
2.1 Criterios de aprendizaje
2.1.1 Explicar los métodos de análisis microbiológicos que se
aplican a los alimentos en base a la composición de estos
últimos
Como ya se discutió anteriormente, la composición química y propiedades
fisicoquímicas de los alimentos determinan el tipo de flora microbiana que se
puede desarrollar.
56
Algunos métodos de análisis autorizados se encuentran descritos en las siguientes
Normas Oficiales Mexicanas y Normas Mexicanas:
Prueba Norma y/o Método de Referencia
Toma, manejo y transporte de muestras de alimentos
NOM-109-SSA1-1994 Procedimiento para la toma, manejo y transporte de
muestras de alimentos para su análisis microbiológico.
Cuenta de bacterias aerobias en placa.
NOM-092-SSA1-1994 Bienes y servicios. Método para la cuenta de bacterias
aerobias en placa.
Cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.
NOM-113-SSA1-1994 Bienes y servicios. Método para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.
Cuenta de mohos y levaduras en alimentos.
NOM-111-SSA1-1994 Bienes y servicios. Método para la cuenta de mohos y
levaduras en alimentos. Determinación de bacterias coliformes. Técnica del Número Mas Probable.
NOM-112-SSA1-1994 Bienes y servicios. Determinación de bacterias coliformes.
Técnica del Número Mas Probable.
Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos.
NOM-115-SSA1-1994 Bienes y servicios. Método para la determinación de
Staphylococcus aureus en alimentos.
Método para la determinación de Salmonella en alimentos.
NOM-114-SSA1-1994. Bienes y servicios. Método para la determinación de
Salmonella en alimentos.
Determinación de coliformes fecales Escherichia coli por la técnica de diluciones en tubo múltiple.
NOM-145-SSA1-1995
Productos cárnicos troceados y curados. Productos cárnicos curados y madurados. Disposiciones y
especificaciones sanitarias. Apéndice normativo B. De la estimación de la densidad microbiana por la técnica del número mas probable. B.2 Determinación de fecales y
Escherichia coli por la técnica de coliformes diluciones en tubo múltiple.
Bacillus mesentéricos.
NMX-F-403-S-1981 Alimentos para humanos-microbiológicos-cuenta de
bacillus mesentericus o bacillus subtilis (Esporas formadoras de hebra).
57
2.2 Demostración de habilidades como resultado del aprendizaje
2.2.1 Realizar análisis microbiológicos para diferentes muestras
de alimentos. Coliformes totales, coliformes fecales, E. coli,
Salmonella, Shigella, hongos, levaduras.
PRÁCTICA 10: Aplicar las Normas Oficiales Mexicanas o Normas Mexicanas para
determinar la presencia de Coliformes totales, coliformes fecales, Escherichia coli,
Salmonella spp., Shigella spp., hongos y levaduras, a partir de
muestras de alimentos presuntamente contaminados.
58
REFERENCIAS
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Brock. Primera Edición en español. Prentice Hall, Inc. 1998.
Bourgeois, C. M., Mescle, J. F., Zucca, J. Microbiología Alimentaria. Tomos 1 y 2.
Editorial ACRIBIA, S.A. 1988.
Adams, M. R. y Moss, M. O. Microbiología de los Alimentos. Editorial ACRIBIA,
S.A. 1995.
Herson, A. C. y Hulland, E. D. Conservas Alimenticias. Editorial ACRIBIA, S.A.
1980.
Mossel, D. A. A., y Moreno García, B. Micr Microbiología de los Alimentos.
Editorial ACRIBIA, S.A. 1985.
http://www.bioinformacion.net/deterioro%20y%20conservacion%20de%20alimento
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http://www.geocities.com/grupoindustrialaisa (Grupo Industrial AISA)
http://www.promase.com.mx/santec.htm (Sanitizantes y material de limpieza para
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http://www.engormix.com/nuevo/prueba/areadeporcicultura1.asp?valor=276
59
http://www.danival.org/notasmicro/medioscult/medios_100_intro.html
http://canales.nortecastilla.es/canalagro/datos/conservas/microorganismos.htm
1
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS
GUÍA DEL ALUMNO
SECRETARÍA DE EDUCACIÓN PÚBLICA
SUBSECRETARÍA DE EDUCACIÓN SUPERIOR E INVESTIGACIÓN
CIENTÍFICA
SUBSISTEMA DE UNIVERSIDADES TECNOLÓGICAS
COORDINACIÓN GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLÓGICAS
ELABORÓ: GRUPO DE DIRECTORES DE LA CARRERA DE INFORMATICA REVISÓ: COMISIÓN ACADÉMICA NACIONAL
APROBÓ: COORDINACIÓN GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLÓGICAS
FECHA DE ENTRADA EN VIGOR:
Revisión no. 0. Fecha de revisión: MARZO, 2004. Página 1 de 59 F-CADI-SA-MA-38-GP-A
2
I. DIRECTORIO Y RECONOCIMIENTOS
DR. REYES TAMES GUERRA
SECRETARÍO DE EDUCACIÓN PÚBLICA
DR. JULIO RUBIO OCA
SUBSECRETARIO DE EDUCACIÓN SUPERIOR E INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA
DR. ARTURO NAVA JAIMES
COORDINADOR GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLÓGICAS
RECONOCIMIENTOS
M. en C. ROMÁN LUNA ANAYA
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DEL SUR DEL ESTADO DE MÉXICO
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS D. R. 2004
ESTA OBRA, SUS CARACTERÍSTICAS Y DERECHOS SON PROPIEDAD DE LA: COORDINACIÓN
GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLÓGICAS (CGUT) FRANCISCO PETRARCA No. 321, COL.
CHAPULTEPEC MORALES, MÉXICO D. F.
LOS DERECHOS DE PUBLICACIÓN PERTENECEN A LA CGUT. QUEDA PROHIBIDA SU
REPRODUCCIÓN PARCIAL O TOTAL POR CUALQUIER MEDIO, SIN AUTORIZACIÓN PREVIA Y POR
ESCRITO DEL TITULAR DE LOS DERECHOS.
ISBN (EN TRÁMITE)
IMPRESO EN MÉXICO.
3
II ÍNDICE I. DIRECTORIO Y RECONOCIMIENTOS ............................................................................................. 2 II ÍNDICE................................................................................................................................................. 3 III. INTRODUCCIÓN DE LA ASIGNATURA .......................................................................................... 4 IV DIAGNÓSTICO DE CONOCIMIENTOS............................................................................................ 5 V CONTENIDOS TEMÁTICOS.............................................................................................................. 6
Unidad 1: Importancia de la microbiología en los alimentos............................................................. 6 Introducción ................................................................................................................................... 6 Objetivos........................................................................................................................................ 6 1 Clasificación de los microorganismos .................................................................................. 6 2 Morfología celular y colonial de microorganismos ............................................................... 8 3 Medios de cultivo ................................................................................................................ 14
Unidad 2: Condiciones que influyen en el crecimiento de los microorganismos y su control (mecánico, físico y químico) ............................................................................................................ 18
Introducción ................................................................................................................................. 18 Objetivos...................................................................................................................................... 19 1 Concentración de sustrato, temperatura, pH, Aw, Eh ......................................................... 19 2 Efecto de los parámetros anteriores en el crecimiento de los microorganismos .............. 24 3 Agentes sanitizantes, agentes químicos que inhiben o retardan el crecimiento de los microorganismos ......................................................................................................................... 30 4 Métodos de identificación de microorganismos ................................................................. 34
Unidad III: Análisis microbiológicos de los alimentos...................................................................... 51 Introducción ................................................................................................................................. 51 Objetivos...................................................................................................................................... 51 1 Microorganismos que causan daño y que están relacionados con los alimentos............. 51 2 Análisis microbiológicos aplicados en los alimentos.......................................................... 62
VI REFERENCIAS................................................................................................................................ 65
4
III. INTRODUCCIÓN DE LA ASIGNATURA
Desde los inicios de la humanidad, ha sido una constante preocupación del
hombre satisfacer sus necesidades de alimentación. Cuando era cazador y
recolector, tomaba de la naturaleza los alimentos que necesitaba cada día.
Posteriormente, con el advenimiento de la gran revolución en los hábitos culturales
que ocasionó la agricultura, hubo la necesidad de preservar en el tiempo los
alimentos cosechados con tanto esfuerzo.
Pero los alimentos pierden sus características deseables por efecto del tiempo,
por efecto de sus enzimas, y, sobre todo, por efecto de los microorganismos que
existen de manera normal o por contaminaciones.
Para un profesional de la industria alimentaria, es indispensable el conocimiento
sobre los microorganismos que pueden provocar infecciones o toxiinfecciones en
los alimentos, ya sean frescos, durante su procesamiento, o procesados; con el
objetivo de prevenir, controlar y combatir el deterioro que causan en los alimentos.
Este Manual comprende desde la identificación de los microorganismos que están
presentes en los alimentos, hasta los análisis microbiológicos que se aplican a los
alimentos, los factores que afectan y determinan el crecimiento de los
microorganismos, y su control.
5
IV DIAGNÓSTICO DE CONOCIMIENTOS
Responder las siguientes preguntas para determinar el conocimiento del grupo
sobre los temas de la asignatura. Las respuestas pueden ser tan amplias como se
desee.
1.- ¿Cuál es la diferencia entre un microorganismo que causa la mastitis
(inflamación de las ubres) en vacas y Escherichia coli, una bacteria que nos puede
provocar diarreas?
2.- ¿Y la diferencia de los microorganismos de la pregunta 1, con las levaduras
que producen cerveza y vinos?
3.- ¿Qué aspecto poseen las colonias de microorganismos que se desarrollan en
medios de cultivo?
4.- ¿Para qué sirve un medio de cultivo selectivo?
5.- ¿Son lo mismo la Actividad de agua que el contenido de humedad de un
alimento?
6.- ¿Cómo es que los alimentos ácidos (bebidas carbonatadas, cervezas, yogurt)
se conservan contra los microorganismos?
7.- ¿Cómo (proceso) y con qué (agentes químicos) limpiarías las instalaciones
(maquinaria, pisos, instrumentos, mesas de trabajo) de una industria alimentaria?
8.- ¿Que se realiza para realzar las células cuando se observan al microscopio?
6
V CONTENIDOS TEMÁTICOS
Unidad 1: Importancia de la microbiología en los alimentos
Introducción
Todos los alimentos, de manera natural, poseen una microflora compuesta de
bacterias, mohos, virus, protozoarios o levaduras. Estos microorganismos pueden
proliferar en el alimento y causar su deterioro, o pueden afectar al organismo
productor del alimento, reduciendo o impidiendo la producción. Otros
microorganismos han sido utilizados para mejorar las características de los
alimentos y preservarlos, caso de los quesos, yogurt y otras leches fermentadas,
vinos, cervezas, sidras. Por otra parte, los alimentos pueden ser vehículo de
transmisión de microorganismos y sus metabolitos, los cuales pueden ser
patógenos para el hombre.
Para distinguir unos de otros, se utilizan diferentes técnicas entre las cuales se
desarrollarán en el manual la morfología colonial y al microscopio.
Para poder estudiar a los microorganismos es necesario cultivarlos en medios
apropiados, y por eso el último tema de la unidad comprende el conocimiento de
diferentes medios de cultivo.
Objetivos
4 Clasificación de los microorganismos
1.1 Criterios de aprendizaje
7
1.1.1 Explicar y definir la clasificación de microorganismos en
base a: dañinos, patógenos y benéficos
En el interior y exterior de todos los seres vivos, en el agua, tierra y aire se
encuentran los microorganismos. Los alimentos poseen de manera natural una
microflora al momento de su cosecha o recolección, o ser contaminados por
personal y equipo en las operaciones de matanza, procesamiento o
almacenamiento. Los microorganismos que afectan alimentos, los podemos
clasificar de varias formas, la más utilizada es aquella que los ubica en tres
categorías:
Dañinos:
Ocasionan problemas y mermas en la producción de alimentos, debido a que
infectan plantas y reducen su producción, o infectan animales e impiden su
utilización para la alimentación, como los agentes causantes de la mastitis en
vacunos. Es decir, disminuyen la producción de alimentos e impiden su
comercialización al afectar sus características de calidad (color, sabor, aroma,
consistencia)
Benéficos:
Utilizados en fermentaciones, permiten conservar los alimentos o modificarlos para
hacerlos más nutritivos o mejorar sus características organolépticas: vinos,
cervezas (Saccharomyces cereviseae), quesos, yogurth (Streptococcus
thermophilus y Lactobacillus bulgaricus en éste último), sidras, vinagre.
Patógenos:
Son los que pueden causar infecciones o toxiinfecciones cuando están presentes
(o sus toxinas) en los alimentos: Aeromonas, Brucella, Bacillus cereus,
Escherichia coli.
8
1.2 Demostración de habilidades como resultado del aprendizaje
1.2.1 Diferenciar los microorganismos dañinos, patógenos y
benéficos que afectan los diferentes grupos de alimentos
PRÁCTICA 1: Reunir muestras de diferentes tipos de alimentos (cereales, frutas,
carne, lácteos, pescados y mariscos, hortalizas) y proponer diferentes
microorganismos que puedan estar presentes y ser dañinos, benéficos o
patógenos. Es recomendable examinar las características de calidad dañadas
mediante la comparación con alimentos frescos y en buen estado.
5 Morfología celular y colonial de microorganismos
2.1 Criterios de aprendizaje
2.1.1 Describir la morfología colonial y estructural de
microorganismos
Estructura al microscopio
La base para que la célula pueda realzar sus funciones es que mantenga su
estructura. Al microscopio óptico (máximo 1500 aumentos) se han identificado
varias estructuras en las células de los microorganismos. Existen muchos otros
tipos de microscopio que han permitido identificar estructuras cada vez más
pequeñas: microscopio de contraste de fases, campo oscuro y fluorescencia;
microscopio electrónico de transmisión, de barrido.
Bacterias
Son organismos procariotas. Presentan una pared celular y una membrana
citoplasmática. Estas estructuras comunican a las células con su medio
ambiente, permiten introducir nutrientes y agua. Además, la aíslan de un medio
9
ambiente que puede ser hostil. Las bacterias pueden presentar de uno a muchos
flagelos, involucrados con su movimiento, pili, que están relacionados con el
intercambio genético. También existen ribosomas (hasta 10000 en una sola
bacteria), encargados de la síntesis de proteínas, distribuidos en todo el líquido
intracelular, llamado citoplasma. El material genético de las bacterias se presenta
en un solo cromosoma, asociado a la membrana, y en plásmidos, unidades de
ácido desoxirribonucleico. En ocasiones hay inclusiones de materiales de
reserva: carbono, azufre, nitrógeno o fósforo. Se reproducen por fisión binaria o
esporas.
Las bacterias presentan diferentes formas y maneras de agrupación, ésta última
depende de la manera de división de las células. La siguiente figura ilustra estos
últimos conceptos.
10
Mohos
Los mohos son organismos eucariotas que presentan núcleo, vacuolas y
mitocondrias. Poseen paredes celulares rígidas. También son llamados hongos
filamentosos. Cada filamento es llamado hifa, crecen en cúmulos visibles llamados
micelios, que surge cuando las hifas crecen y se entrecruzan. Las células pueden
ser polinucleadas, incluso con centenares de núcleos. Además de crecer mediante
el micelio, los mohos generan estructuras de esporas asexuales llamados
conidias. Algunos mohos producen esporas sexuales en formaciones diferentes:
ascosporas, basidiosporas, zigosporas, oosporas.
11
Levaduras:
Son hongos unicelulares y la mayoría produce ascosporas. Son células ovales o
cilíndricas y se dividen por gemación. Este proceso involucra la formación de una
yema que aumenta de tamaña hasta que se separa de la célula madre.
Normalmente no producen micelio (con excepciones como Candida albicans). Las
levaduras son mucho más grandes que las bacterias y presentan todas las
características de una célula eucariótica.
2.1.2 Identificar colonias de microorganismos de acuerdo a la
morfología colonial en medios de cultivo
Los microorganismos se identifican de diferentes maneras. Una de ellas es el
cultivo en medios en los cuales desarrollarán características esenciales para su
caracterización. Las colonias microbianas que crecen de manera aislada permiten
la identificación del microorganismo presente. Pero es necesario revisar las
técnicas de cultivo aséptico y obtención de un cultivo puro antes de revisar la
morfología de colonias microbianas.
En un análisis rutinario, se inoculan diluciones seriadas del alimento en agua,
procediendo a su siembra en un medio general, como el agar nutritivo. De las
colonias resultantes, se obtendrán cultivos puros, los cuales se someterán a
crecimiento en medios de identificación (selectivos o prueban bioquímicas).
Las características de una colonia microbiana se enlistan a continuación.
Color: puede ser desde los tonos claros (blanco, amarillo, beige) hasta los oscuros
(café, azul rojo) dependiendo del tipo de microorganismo. Un mismo
microorganismos puede producir colonias con diferente color si se cultiva en
12
diferentes medios de cultivo (lo mismo se aplica a las demás características de las
colonias)
Tamaño: desde las colonias puntiformes hasta las que pueden medirse en
milímetros.
Consistencia: seca, gelatinosa, escamosa, blanda.
Borde: puede ser determinado (colonias redondas) o bien con bordes irregulares
(aserrados, en forma de raiz).
Forma: redonda, fusiforme, irregular, ovalada.
Elevación: planas, cóncavas o convexas.
Halos alrededor: pueden indicar utilización de un sustrato, producción de ácidos o
de metabolitos que afectan el desarrollo de otros microorganismos (antibióticos).
2.2 Demostración de habilidades como resultado del aprendizaje
2.2.3 Preparación de medios de cultivo, así como condiciones de
trabajo en un laboratorio microbiológico
PRÁCTICA 2: Explicar las técnicas de preparación aséptica de medios de cultivo
líquido, sólido y en medio inclinado, así como el uso de la campana de flujo
laminar. Explicar las diferentes técnicas de cultivo: por estría y asa de vidrio en
medio sólido, por punción y estría en medio líquido. Inocular con muestras de
alimentos de diferentes orígenes, a dos medios de cultivo sólidos, uno para
13
bacterias y otro para mohos y levaduras. Observar las características y diferencias
de las colonias que se desarrollen.
Siembra en tubos de agar inclinado:
El cuello del tubo debe ser flameado antes y después de ser sembrado. Con el
asa previamente esterilizada a la llama, se toma una pequeña cantidad de la
muestra y se lleva al fondo del tubo, luego se estría suavemente la superficie del
medio en forma ondulante.
Siembra por picadura:
El inóculo es introducido con el asa recta o pipeta Pasteur hasta el fondo del
medio con un solo movimiento y teniendo cuidado en hacer el mismo trayecto de
entrada que de salida. Debe flamearse la boca del tubo antes y después de la
siembra.
Siembra en superficie y picadura:
El inóculo es introducido con el asa recta o pipeta Pasteur hasta el fondo del
medio con un solo movimiento y teniendo cuidado en hacer el mismo trayecto de
entrada que de salida, se retira hacia la superficie inclinada del agar haciendo
suavemente una estría ondulada. Debe flamearse la boca del tubo antes y
después de la siembra.
Siembra en profundidad:
Al inocular un medio líquido como es el tioglocolato, el tubo se inclina y el material
se extrae del asa por frotamiento contra la pared del tubo, cuando éste se
endereza el material se encuentra bajo la superficie del medio. Al inocular el
14
medio líquido con tórula o con inóculo líquido se deposita este en el fondo del
tubo. Debe flamearse la boca del tubo antes y después de efectuada la siembra.
2.2.4 Preparar frotis de diferentes cultivos microbianos
PRÁCTICA 3: De las colonias resultantes en la práctica 2, preparar frotis y teñirlos
mediante cualquier técnica para observarlos al microscopio con objetivo de
inmersión. Anotar características de los microorganismos observados.
6 Medios de cultivo
3.1 Criterios de aprendizaje
3.1.1 Explicar qué es un medio de cultivo, clasificación y
composición
Para su estudio y detección, los microorganismos se cultivan en medios de cultivo
artificiales o naturales, que se formulan en base a los factores de crecimiento
apropiados para cada tipo de microorganismo: pH, nutrientes, factores esenciales
para el crecimiento. También poseen características que permiten la identificación
y aislamiento de microorganismos.
Los medios de cultivo se clasifican en:
1.- Por su estado físico: líquido, semisólido y sólido. El agar es un elemento
solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licua
completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40
grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las
bacterias y no es consumido por aquellas que crecen en él. Su concentración en
un medio de cultivo determina si es sólido o semisólido. Los medios líquidos
carecen de agar en su formulación.
15
2.- Por su origen: naturales y artificiales: naturales como la papa, zanahoria, suero
de sangre o de leche, la leche misma. Hay mas de 10000 medios artificiales
formulados para cultivar microorganismos.
3.- Por su uso:
Generales: permiten el crecimiento de la mayoría de los microorganismos
presentes en una muestra.
De aislamiento o selectivos: contienen nutrientes solo utilizados por un género de
microorganismo, lo cual impide el crecimiento de otros microorganismos presentes
en la muestra. También se añaden colorantes que actúan como indicadores para
detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de
unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo
en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como
inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-
positivas).
De identificación: también llamados para pruebas bioquímicas, cuando sus
nutrientes son utilizados por los microorganismos, de acuerdo a su metabolismo,
se pueden identificar en base al conjunto de observaciones: ureasa, movilidad,
indol, nitratos, citrato, manitol.
De enriquecimiento: En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos
materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa,
bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales:
para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de
fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la
sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos
menos resistentes.
16
De transporte: contienen pocos nutrientes, apenas permiten conservar la viabilidad
(pero no permiten el crecimiento de la población) de los microorganismos que han
sido colectados en una zona lejana a un laboratorio de análisis.
De mantenimiento: utilizados en los ceparios, sirven para mantener viables los
cultivos axénicos durante un periodo de tiempo, siendo necesaria su resiembra
rutinaria.
3.2 Demostración de habilidades como resultado del aprendizaje
3.2.1 Elección de medios de cultivo apropiados en base al
alimento y microorganismo en estudio
PRÁCTICA 4: Obtener un cultivo puro a partir de las colonias desarrolladas en la
PRÁCTICA 3. Para ello, aplicar las técnicas de estriado para obtener colonias
aisladas en medios sólidos: tomar un inóculo con el asa de platino a partir de una
colonia aislada del cultivo inicial y distribuirla en la superficie del medio en una
placa de Petri de la siguiente manera.
Primera estría Segunda estría
Tercera estría
17
Advierta que debe esterilizar el asa de platino entre cada estría, y sólo se toma un
pequeño extremo como inóculo de la siguiente estría. Así se pueden obtener
colonias bien separadas en la estría más delgada, y por sucesivas resiembras los
cultivos son purificados. Los cultivos puros o axénicos son muy importantes ya que
se utilizan para el resto de los análisis microbiológicos como tinciones y pruebas
bioquímicas.
18
Unidad 2: Condiciones que influyen en el crecimiento de los
microorganismos y su control (mecánico, físico y químico)
Introducción
Los microorganismos son afectados por condiciones medioambientales y
fisicoquímicas en su entorno. Si graficamos el crecimiento de los microorganismos
en el tiempo, la gráfica que se obtiene en condiciones óptimas para su desarrollo
es la siguiente:
0 5 10 15
Horas
Lo
g N
Es importante conocer cómo se puede evitar el desarrollo de esta curva en
instalaciones, materia prima, producto en proceso o en almacén, mediante la
manipulación de las condiciones fisicoquímicas del ambiente, métodos de
conservación de alimentos, utilización de agentes sanitizantes y capacitación del
personal.
19
Objetivos
5 Concentración de sustrato, temperatura, pH, Aw, Eh
1.1 Criterios de aprendizaje
1.1.1 Explicar y definir que es la concentración de sustrato, la
temperatura, el pH, la Aw y el Eh
El medio ambiente en el que se desarrolla un organismo esta formado por factores
físicos, químicos, y biológicos.
Las relaciones como parasitismo, depredación, tienen también efecto entre los
microorganismos, pero los siguientes factores revierten especial importancia para
el crecimiento de bacterias, mohos y levaduras:
1.- Concentración de sustrato: las necesidades nutricionales varían de un
microorganismo a otro. Mas aún: pueden variar en un mismo microorganismo en
diferentes etapas de sus desarrollo, o si crece en diferente temperatura. La
incapacidad de un microorganismo para utilizar el componente mayoritario de un
material alimenticio limitará su desarrollo.
2.- Temperatura: puede existir desarrollo microbiano desde los -8 ºC hasta las
100ºC. Sólo se requiere que el agua se encuentre en fase líquida, disponible para
las reacciones bioquímicas. Pero ningún microorganismo puede sobrevivir a todo
el intervalo de temperaturas. La siguiente tabla ilustra los intervalos de
temperatura y la clasificación de los microorganismos basada en su temperatura
de crecimiento:
20
Temperatura ºC Grupo
Mínima Óptima Máxima
Termófilos 40 a 45 55 a 75 60 a 90
Mesófilos 5 a 15 30 a 40 40 a 47
Psicrófilos -5 a 5 12 a 15 15 a 20
Psicrótrofos -5 a 5 25 a 30 30 a 35
Para alimentos, los microorganismos mesófilos y psicrótrofos son de la mayor
importancia. Los mesófilos generalmente son de origen humano o animal y entre
ellos se encuentran algunos de los patógenos mas frecuentes: Salmonella,
Staphylococcus aureus y Clostridium perfringens.
La curva de la velocidad de crecimiento en el intervalo de desarrollo de un
microorganismo es asimétrica:
Comportamiento del crecimiento microbiano ante la temperatura
Temperatura
Vel
oci
dad
de
crec
imie
nto
Tmínima T óptima Tmáxima
21
Esto significa que por encima de la temperatura óptima el crecimiento disminuye
mas lentamente, que por debajo de ella, porque las proteínas se desnaturalizan,
en cambio, a bajas temperaturas las reacciones químicas se ralentizan.
3.- pH: definido como el logaritmo negativo de la concentración de iones hidrógeno
de una solución, brinda una escala para medir la acidez, neutralidad o alcalinidad
de una solución, que tienen gran impacto en la estabilidad de macromoléculas
como las enzimas, que poseen un pH de actividad óptimo, de acuerdo a la
siguiente gráfica:
La velocidad de crecimiento de los microorganismos sufre un gran deterioro
cuando están en un pH diferente al óptimo, también se afecta la producción de
toxinas y esporas.
Evidentemente, cambios en el pH afectan la actividad de las enzimas, y con ello,
de toda la actividad de los microorganismos, los cuales se desarrollan de manera
óptima en un intervalo de la escala de pH:
Comportamiento de la actividad enzimática ante el pH
pH
Act
ivid
ad e
nzi
mát
ica
3 4 5 6 7 8 9 10
22
Microorganismo pH mínimo pH óptimo pH
máximo
Mohos 1.5 a 3.5 4.5 a 6.8 8 a 11
Levaduras 1.5 a 3.5 5 a 6.5 8 a 8.5
Bacterias 4.5 6.5 a 7.5 11
4.- Actividad de agua (aw): las células utilizan el agua de dos maneras: como
solvente de compuestos químicos (nutrientes, metabolitos) lo que facilita su
transporte; y como reactivo en las reacciones hidrolíticas que originan monómeros
que después se utilizan para síntesis de macromoléculas y generación de
energía. La aw representa la disponibilidad del agua en un medio para reacciones
químicas y bioquímicas a través de membranas semipermeables. Su valor oscila
entre 0 y 1.
No se debe confundir el concepto de aw con humedad, porque una harina con 21%
de humedad tiene la misma aw que una fruta con 80% de humedad. Los
microorganismos también están adaptados a un intervalo de aw para su desarrollo;
las bacterias requieren aw>0.910, las levaduras se desarrollan a aw>0.87,
mientras los mohos lo hacen a aw>0.70. Toda disminución de la aw disminuye el
desarrollo microbiano y la mayor parte de los métodos de conservación de
alimentos tienen su efecto más importante en la disminución de la aw.
5.- Potencial de óxido reducción (Eh) y oxígeno: Según las necesidades de
oxígeno para su metabolismo y reproducción, los microorganismos pueden ser:
aerobios (requieren la presencia de oxígeno: Pseudomonas, Micrococcus,
Bacillus), anaerobios (sólo se desarrollan en ausencia de oxígeno o con baja
tensión de oxígeno: Clostridium, Bacteroides, Peptococcus, Propionibacterium) y
anaerobios facultativos (enterobacterias, Staphylococcus). El potencial redox (Eh)
de un sistema biológico es un indicador de su grado de oxidación. El Eh de un
alimento guarda relación con la composición química del mismo (presencia de
23
sustancias reductoras, ácidos) y con la presión parcial del oxígeno durante el
almacenamiento. El Eh de un alimento determina en gran medida el tipo de flora
microbiana que se puede desarrollar (aerobia, anaerobia).
1.1.2 Explicar y discutir la importancia de los factores anteriores
en el crecimiento de los microorganismos
Los alimentos constituyen un buen medio nutritivo para los microorganismos, que
se desarrollan de acuerdo a las condiciones de los factores anteriores, y de su
potencial genético. La importancia de conocer los factores anteriores en cada tipo
de alimento radica en que, mediante su modificación con los métodos de
conservación de alimentos, se puede inhibir el crecimiento de los gérmenes,
prever las consecuencias del desarrollo de los microorganismos, e interpretar las
observaciones realizadas sobre un alimento presuntamente contaminado.
La curva de la velocidad de crecimiento de un microorganismo contra el tiempo, en
condiciones óptimas se ilustra en la siguiente figura:
Tiempo (horas)
Crecimiento
Fase L
ag
o d
e
adapta
ció
n
Fase d
e e
cele
ració
n
Fase d
e c
recim
ien
to
exp
on
en
cia
l Fase d
e d
esa
cele
ració
n
Fase e
sta
cio
na
ria
Fas
e de
mue
rte
24
La curva no inicia de cero, sino de una cantidad inicial de microorganismos.
Durante la fase lag los microorganismos se adaptan a las características del
alimento, después se empieza a acelerar la velocidad de crecimiento, en la fase
de crecimiento exponencial, hasta llegar a una fase estacionaria que precede a la
lisis celular cuando se han agotado los nutrientes o se han acumulado metabolitos
tóxicos (o ambas situaciones). El conocimiento de como afectan los parámetros
del tema anterior al crecimiento de los microorganismos permite la modificación de
la duración de la fase de adaptación, la pendiente de la fase de crecimiento
exponencial y la duración y nivel de la fase estacionaria.
1.2 Demostración de habilidades como resultado del aprendizaje
1.2.1 Manejar los parámetros analizados para el control de los
microorganismos
PRÁCTICA 5: Del cultivo puro obtenido en la PRÁCTICA 4, tomar un inóculo para
suspenderlo en 10 ml de agua destilada estéril. Inocular con 0.5 ml de la
suspensión a placas de agar nutritivo con pH ajustado a 3.0, a 10.0, a pH normal
(testigo); otras 3 placas de agar nutritivo inoculadas se incubarán a 20, 60 y 35ºC
(testigo); cultivar otras placas de agar nutritivo con aw modificadas (adición de
solutos), Eh modificado (aerobio-anaerobio), siempre inoculando una placa testigo
para comparar el desarrollo a las 24 h.
6 Efecto de los parámetros anteriores en el crecimiento de los
microorganismos
2.1 Criterios de aprendizaje
2.1.1 Explicar cómo afectan al crecimiento de los
microorganismos los factores anteriores
25
Para la conservación de los alimentos se utilizan varias técnicas o métodos
basados en la modificación de los parámetros que afectan el crecimiento de los
microorganismos. Se llama sistema de barreras a la combinación de dos o más
técnicas que modifican la aw, pH, temperatura, etc., así, métodos como el secado,
afectan la aw y la temperatura; la adición de un almíbar, afecta el pH, la aw, Eh;
pero también deben controlarse estos métodos y su ejecución porque de no
aplicarse correctamente solo se provocan selecciones de microorganismos
resistentes.
2.2 Demostración de habilidades como resultado del aprendizaje
2.2.1 Identificar el sistema de barreras funcionales en diferentes
tipos de alimentos
Procedimientos de conservación de alimentos:
• conservación por frío
• conservación por calor
• desecación, deshidratación y liofilización
• salazonado
• ahumado
• encurtido
• escabechado
• radiaciones ionizantes
• elaboración de productos de humedad intermedia
• otros procedimientos
Conservación en frío (refrigeración o congelación):
26
Someter alimentos a bajas temperaturas con el fin de eliminar o inhibir la actividad
microbiana o enzimática, teniendo en cuenta temperatura, humedad relativa y
circulación de aire requeridos para cada alimento.
Refrigeración
Someter a los alimentos a bajas temperaturas sin llegar a las de congelación,
manteniendo la uniformidad (no cambios bruscos) durante el periodo de
conservación y serán temperaturas apropiadas de refrigeración de acuerdo al tipo
de alimento.
Congelación
Someter a los alimentos a temperaturas menores a las de su punto de
congelación, manteniendo temperatura uniforme durante el periodo de
conservación y serán temperaturas apropiadas a cada tipo de alimento.
Los alimentos sometidos a congelación deberán estar en perfectas condiciones
higiénico-sanitarias de manera que su contenido microbiano inicial antes del
congelamiento (conservación) asegure estabilidad del producto hasta el momento
de su consumo.
Descongelación
Atemperar en forma conveniente el producto congelado hasta que la temperatura
de este sea en todos sus puntos superior a la de congelación del mismo. Los
alimentos no podrán ser sometidos a procesos sucesivos de descongelación y
congelación.
Congelación rápida:
Someter a alimentos (materias primas y/o productos elaborados) a un proceso de
enfriado brusco que permita exceder rápidamente a la temperatura de máxima
cristalización, en un tiempo no mayor a 4 hs.
27
Proceso de congelación rápida
Se considera completo cuando una vez lograda la estabilización térmica, la
totalidad del producto en todos sus puntos presente una temperatura de -18c o
menor.
Almacenado de productos de congelación rápida
En cámaras frigoríficas aptas para mantener la temperatura de los productos en
valores constantes y siempre de -18c o menos.
Conservación por el calor (esterilización, esterilización industrial o técnica,
pasterización)
Someter a los alimentos a la acción de temperaturas y tiempos adecuados para
eliminar o reducir las actividades microbianas y enzimáticas.
Esterilización
Es el proceso que destruye en los alimentos a temperatura adecuada, todas las
formas de vida de microorganismos patógenos y no patógenos.
Esterilización industrial o técnica
Es el proceso térmico que, aplicado a un alimento asegura:
1 Conservación sin alteración y buena calidad comercial durante un periodo
suficientemente largo, compatible con las necesidades comerciales.
2 Ausencia de microorganismos perniciosos para la salud del consumidor
(gérmenes patógenos, gérmenes toxico génicos) y ausencia de toxinas.
3 Ausencia de todo microorganismo capaz de proliferar en el alimento, lo que
supone la ausencia de toda alteración de origen microbiano.
Pasterización:
Someter a alimentos a temperaturas inferiores a 100c y por tiempos suficientes
para destruir las formas vegetativas de los tipos comunes de microorganismos
patógenos y una cierta proporción de las no patógenos que los contaminan, para
28
que el producto se pueda transportar, mantener, distribuir, consumir o utilizar en
otros procesos en condiciones de aceptabilidad a temperaturas apropiadas y por
tiempos razonables según la naturaleza del producto.
Desecación
Someter a los alimentos a las condiciones ambientales naturales para privarlos de
la mayor parte de agua que contienen.
Deshidratación
Someter a los alimentos a la acción principal del calor artificial para privarlos de la
mayor parte de agua que contienen
Liofilización
Someter a los alimentos a procesos de congelación seguidos de sublimación del
hielo formado para privarlos de la mayor parte de agua que contienen.
Salazón (en seco o salmuera)
Someter los alimentos a la acción de la sal comestible con o sin otros
condimentos.
Salazón en seco
Someter a superficies externas de los alimentos a la acción de la sal en
condiciones ambientales apropiadas.
Conservación en sal muera
Someter a los alimentos a la acción de soluciones de sal en concentración y
tiempos variables, según la naturaleza del producto.
29
Ahumado
Someter a los alimentos a la acción de humos recién formados, procedentes de la
combustión incompleta y controlada de maderas duras de primer uso, mezcladas
o no con plantas aromáticas de uso permitido.
Prohibido en maderas resinosas (menos abeto) o maderas con procesos que
pueden originar toxicidad por desprendimiento.
Los productos ahumados no deben contener: mas de 1 microorganismo por kg
(1ppb) de 1,2benzopireno, 3,4 benzopireno, fluoreno, fenantreno u otros
hidrocarburos policíclicos aisladamente o en mezcla de acción toxica o nociva
para la salud.
Encurtido
Someter los alimentos previamente tratados con salmuera o que hubieren
experimentado una fermentación láctica a la acción del vinagre con o sin la adición
de cloruro de sodio, edulcorantes nutritivos, condimentos, productos
aromatizantes, aceites esenciales, colorantes naturales admitidos, etc.
La fase liquida de los encurtidos deberá tener un pH (a 20ºC) no mayor a 4,3.
Escabechado
Someter a los alimentos crudos o cocidos, enteros o fraccionados a la acción del
vinagre con la adición o no de cloruro de sodio.
La fase liquida de los productos en escabeche deberá presentar un pH (20ºC) no
mayor a 4,3.
Otros procedimientos
Podrá realizarse siempre que garanticen las condiciones higienizo sanitarias y de
aceptabilidad requeridas para los alimentos a que se someten.
El empleo de aditivos alimentarios se hará solamente en los casos
específicamente autorizados.
30
Conservación por radiación ionizante o energía ionizante
Someter los alimentos a la acción de alguna de las siguientes fuentes de energía
Rayos gamma
Rayos equis
7 Agentes sanitizantes, agentes químicos que inhiben o
retardan el crecimiento de los microorganismos
3.1 Criterios de aprendizaje
3.1.1 Describir los sanitizantes utilizados en la industria de los
alimentos, forma de uso y concentraciones recomendadas
Existen dos conceptos importantes en la limpieza de industrias de alimentos: la
limpieza física y la limpieza microbiológica. La primera se refiere a la eliminación
de la suciedad visible, con cepillo, agua y detergente, se barre, rasca, se despega
toda la suciedad. La segunda se refiere a la eliminación de los microorganismos
en las superficies que han sido previamente limpiadas, también se conoce como
desinfección o sanitización, y para ello se utilizan diferentes sustancias químicas
conocidas como desinfectantes o sanitizantes.
La elección del sanitizante depende de los siguientes factores:
� Número y tipo de microorganismos
� Toxicidad y efecto sobre el alimento
� Corrosión
� Peligro para el personal
� Lo afecta suciedad residual
� Condiciones óptimas de uso (pH, Temp., dureza del agua, tiempo de
contacto)
31
� Costo
Entre los sanitizantes más utilizados en la industria de alimentos, se encuentran
los siguientes:
� Detergentes de amonio cuaternario: son detergentes catiónicos. Como
todos los detergentes, afecta la tensión superficial del agua mejorando su
penetración para arrastrar partículas de suciedad, pero además, debido a
su grupo amonio, altera la membrana de los microorganismos conduciendo
a su muerte. No es corrosivo, tóxico, volátil o inflamable, además tiene un
amplio espectro microbiológico de acción, que incluye hongos, levaduras,
bacterias G(+) y G(-) y algas. Le afecta la dureza del agua.
� Dióxido de cloro: Evita el desarrollo de bacterias, es incoloro e inodoro, no
transmite sabor alguno a los alimentos, es seguro, disponible todo el año,
económico, de uso generalizado en la Industria Alimentaria, de fácil
aplicación, solo se diluye en agua de acuerdo a la siguiente tabla:
Dosificación del Cl02
potabilización de agua 0.01 AL 0.05 %
sanitización de utensilios,
recipientes e instalaciones
0.10 AL 0.50%
sanitización de granjas 0.10 AL 0.50 %
sanitización de locales y
hospitales
2.50 %
enjuague de frutas y
legumbres
0.50 %
32
� Vapor de agua: Elimina todo tipo de microorganismos, incluyendo esporas,
pero mancha el acero, lo afecta la dureza del agua, se requieren calderas y
es peligroso por temperatura.
� Jabón: adicionado de agentes antimicrobianos, se usa para limpieza y
desinfección del personal, en base a su poder tensoactivo.
� Soluciones de yodo: es un líquido café rojizo, con acción germicida de
amplio espectro, económico, eficiente, que elimina bacterias, hongos y
levaduras. Usado ampliamente como sanitizante. Es económico, actúa
contra hongos, fácil disolución en agua, fácil de transportar y conservar,
germicida de amplio espectro aun a bajas concentraciones y temperaturas
bajas, no es irritante, elimina la suciedad, no es afectado por la dureza del
agua ni por detergentes, rápida acción germicida, tiene un gran campo de
aplicación. Se diluye en agua de acuerdo a las siguientes aplicaciones:
Dosificación del Yodo
desinfección de equipos y utensilios 0.00125 %
desinfección de ubres, frutas, verduras
y legumbres
0.00250 %
desinfección de granjas 0.00750 %
desinfección de superficies muy
contaminadas
0.01000 %
� Detergentes alcalinos: Los detergentes son tensoactivos: al mismo tiempo
poseen grupos hidrófobos e hidrófilos, reducen la tensión superficial del
agua mejorando su penetración y humectación. Remueven grasa, suciedad,
33
malos olores, sabores desagradables; suspendiéndolos y eliminándolos
mediante el agua de limpieza, lo cual facilita el lavado de equipo,
maquinaria, tubería, ya sea por aspersión o circulación. Para aplicarlos,
primero se enjuaga la superficie a limpiar con agua limpia, se aplica el
producto diluido y se enjuaga con agua limpia, aplicando después un
detergente ácido.
� Detergentes ácidos: desincrustan los residuos minerales y orgánicos, de las
tuberías y equipos, aumentando su vida útil y la eficiencia del proceso.
Limpia y abrillanta el acero inoxidable. No le afecta la dureza del agua en su
aplicación. Su empleo es recomendado después de lavar con un detergente
alcalino.
� Rotación de sanitizantes: se recomienda por la aparición de resistencia en
los microorganismos, hay que tomar en cuenta los factores fisicoquímicos,
biológicos, de instalaciones, para escoger los sanitizantes a rotar. Pero si el
desinfectante cumple su función, no debe haber rotación.
3.2 Demostración de habilidades como resultado del aprendizaje
3.2.1 Proponer la aplicación y concentración de un sanitizante en
función del microorganismo presente
PRÁCTICA 6: En todas las visitas industriales que se realicen, que los alumnos
recopilen la información referente a como controlan la sanitización de sus
instalaciones, así como de los laboratorios y talleres escolares, proponiendo
mejoras.
34
8 Métodos de identificación de microorganismos
4.1 Criterios de aprendizaje
4.1.1 Explicar los métodos de identificación de microorganismos
que causan daño en los alimentos
Los microorganismos pueden hacer daño en los alimentos de dos maneras:
produciendo su alteración o enfermándonos:
1.- Alteración de los alimentos (microorganismos alterantes)
Alimento deteriorado: aquel dañado por agentes microbianos, químicos o físicos
de forma que es inaceptable para el consumo humano.
- Aproximadamente el 20% de las frutas y verduras recolectadas se pierden por
deterioro microbiano producido por alguna de las 250 enfermedades de mercado.
- Los agentes causantes de deterioro pueden ser bacterias, mohos y levaduras;
siendo bacterias y mohos lo más importantes.
- Las carnes son los alimentos más fácilmente deteriorables. Durante el proceso
de deterioro se va seleccionando una población o tipo de microorganismos
predominante la variedad inicial indica poco deterioro y refleja las poblaciones
iniciales.
- Cada tipo de alimento se deteriora por acción de un tipo de microorganismo
concreto; cada asociación es específica.
- De todos los microorganismos presentes en un alimento solo algunos son
capaces de multiplicarse activamente sobre el alimento resultando seleccionados.
Existen una serie de factores que «dirigen esta selección».
35
Factores intrínsecos (aw, pH, Eh, nutrientes, estructuras, agentes antimicrobianos),
composición del alimento.
Tratamientos tecnológicos: modifican flora inicial.
Factores extrínsecos: condiciones físicas del ambiente.
Factores implícitos: relaciones entre los microorganismos establecidas como
consecuencia de los factores a, b y c.
Estos cuatro factores determinan lo que se denomina resistencia a la colonización
de un alimento.
Los microorganismos al crecer y utilizar los alimentos como fuente de nutrientes
producen cambios en la apariencia, sabor, olor y otras cualidades del alimento.
Estos procesos de degradación son:
a.- Putrefacción
Proteínas alimentos + Microorganismos proteolíticos ------> Aminoácidos + Aminas
+ NH3 + SH2
b.- Fermentación
Carbohidratos alimentos + Microorganismos sacarolíticos ------> Ácidos +
Alcoholes + Gases
c.- Enranciamiento
Grasas alimentos + Microorganismos lipolíticos ------> Acidos grasos+ Glicerol
2.- Enfermedades de origen microbiano (microorganismos patógenos)
a.- Infección alimentaria: Salmonelosis
b.- Toxiinfección alimentaria: Botulismo (por acción de las toxinas de un
microorganismo aunque éste ya no se encuentre presente en el alimento)
36
Los microorganismos son identificados mediante pruebas morfológicas y
bioquímicas, tinciones, y otros análisis especializados como serotipos o patrones
de inhibición frente a antibióticos. Cuando es necesario, se utilizan técnicas de
Biología Molecular como la secuenciación genética.
En ocasiones, cepas diferentes de la misma especie microbiana presentan
diferente patogenicidad, por lo cual se requiere diferenciarlas mediante análisis de
serotipos (como los flagelares), actividad enzimática, identificación de toxinas
Tinciones
Tinción de Bacterias
Si se desean observar las características morfológicas de las bacterias, resulta
sumamente útil el utilizar las preparaciones fijas y teñidas, debido a que estas
permiten que las células se visualicen de mejor manera y se puedan diferenciar
las distintas especies por su coloración, este método en particular se llama tinción
diferencial o selectiva.
Los pasos a seguir para la tinción de las bacterias es hacer el frote, la fijación y la
aplicación de las soluciones colorantes. La amplia gama de colorantes que se
pueden utilizar, ha obligado a separarlos en tres grupos generales, los de
trifenilmetano, los de oxacina y los de tiacina. Esta clasificación es buena para la
distinción de las familias de colorantes, pero en general se utiliza la clasificación
de acuerdo a su carácter ácido – base, es decir, ácidos, bases o neutros, debido a
que de esto depende mucho su comportamiento.La coloración se da de acuerdo
con a la acción de los iones complejos del colorante y los sitios activos de la
superficie o del interior de la célula.
Entre los diversos tipos de coloración de bacterias, están la coloración simple,
diferencial y la tinción negativa.
37
Coloración Simple
Este tipo de coloración consiste en inundar con un colorante cualquiera el
portaobjetos donde se tienen las bacterias, luego lavarlas con agua, y algunas
células retendrán el colorante, por reacción con el mismo.
Coloración diferencial
Este tipo de coloración es sumamente importante, ya que permite diferenciar entre
un tipo de bacterias y otro de acuerdo con su susceptibilidad ante uno u otro
colorante.
Entre estos métodos se encuentra la coloración de Gram, que es muyy importante
en Microbiología. Este método discrimina entre células grampositivas y células
gramnegativas, es generalmente utilizado debido a que muchas de las células
patógenas son del tipo gramnegativo, aparte de esta diferencia las células
grampositivas son más susceptibles a la penicilina y más resistentes a la acción
mecánica y exposición a algunas enzimas que las gramnegativas.
Productos que
se utilizan Reacción y coloración de las bacterias
GRAM + GRAM -
1) Cristal violeta Células color violeta Células color violeta
2) Lugol
solución iodada
Se forma el complejo CV-I. Las células
continúan teñidas de color violeta.
Se forma el complejo CV-I. Las células
continúan teñidas de color violeta.
3) Alcohol Se deshidratan las paredes celulares.
Se contraen los poros. Disminuye la
permeabilidad. El complejo CV-I no sale
de las células que continúan teñidas de
color violeta.
Eliminación por extracción de grasas
de las paredes celulares. Aumenta la
porosidad. El complejo CV-I se separa
de la célula.
4) Safranina Células no decoloradas; quedan teñidas
de color violeta.
Células decoloradas; se tiñen de color
rosado
38
Pruebas bioquímicas (o de metabolismo)
Catalasa
Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la
mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen
citocromo. La principal excepción es Streptococcus.
Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes
géneros:
Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).
Bacillus (+) de Clostridium (-).
Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de
C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)
Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse
siguiendo dos técnicas:
Método del portaobjetos (recomendado):
Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y
colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio.
Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el
microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.
Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.
Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada)
pueden producirse falsos positivos.
Método del tubo de ensayo:
Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en slant
densamente inoculado.
Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
39
Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre,
se debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa al retirar la
colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dará un
falso resultado positivo.
Citrato
Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato
como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de
nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las
enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros:
Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella.
Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son
incapaces de crecer con esos nutrientes.
Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene
citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno
respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Sólo las bacterias
capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán
iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una
fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color del
indicador de pH, de verde a azul.
Fenilalanina desaminasa
Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el
aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico por su actividad enzimática de
fenilalanina desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad
enzimática es característica de todas las especies del género Proteus y del grupo
Providencia por lo que se usa para separar ambos géneros de otras
enterobacterias
40
Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie del slant
con abundante inóculo e incubando durante 12-16 horas. Seguidamente se añade
0,2ml de una solución de cloruro férrico al 10% de manera que inunde todo el
crecimiento. La presencia de ácido fenilpirúvico (prueba positiva) se manifiesta por
la aparición de un color característico verde oscuro o verde-azulado.
Indol
Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano.
Dicha liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante el
enzima triptofanasa.
Para la realización de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas en un
caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante triptófano).
Para la posterior detección del indol se usa el reactivo de Kovacs que se puede
preparar con los siguientes ingredientes:
Alcohol amílico o isoamílico (puede sustituirse por alc.butílico)........150ml
p-dimetilamino-benzaldehído..........................................................10g
HCl (concentrado).........................................................................50ml
Se disuelve primero el aldehído en el alcohol y después se agrega lentamente a
esta mezcla el ácido. Para el control de calidad del reactivo se pueden utilizar
cultivos conocidos. Las más convenientes son Escherichia coli (indol+) y todas las
especies de Klebsiella (indol-).
Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al añadir al medio 5 gotas del reactivo
de Kovacs, se producirá un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la
prueba será considerada positiva. Si esto ocurre después de 24 horas, la prueba
se considera completa, pero si es negativo deberá incubarse otras 24 horas y
repetirse la prueba. Por ello es conveniente hacer siempre la prueba no en el tubo
incubado sino en una porción de unos 2 ml que se retira de él asépticamente.
41
Lactosa
Esta prueba se usa para diferenciar entre las enterobacterias en general y el grupo
de las coliformes. Se trata por tanto de una prueba de gran importancia debido a
que los coliformes se utilizan como organismos indicadores de contaminación
fecal en análisis, sobre todo, de aguas. En bacteriología se define el grupo de
organismos coliformes como los "bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios
facultativos, no formadores de esporas y que fermentan la lactosa con formación
de gas a 35ºC en 48 horas". No se trata de un grupo taxonómico e incluye una
gran variedad de bacterias, la mayoría de ellas de origen intestinal.
Una manera sencilla de realizar la prueba de la fermentación de la lactosa en
enterobacterias es sembrar el microorganismo en agar McConkey, ya que este
medio, además de selectivo frente a bacterias no entéricas, es diferencial ya que
contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro).
En agar McConkey las bacterias Gram positivas ven inhibido su crecimiento
debido a la presencia de sales biliares y cristal violeta y sólo crecerán las
enterobacterias, pero entre ellas las que fermenten la lactosa (coliformes) liberarán
productos ácidos que producirán un cambio de pH que se detectará gracias al rojo
neutro. Las colonias lactosa (+) aparecerán de color rojo o violeta contrastando
con la coloración amarillenta de las colonias lactosa (-).
Manitol, movilidad y nitratos
Se incluyen en este apartado 3 pruebas bioquímicas debido a que se pueden
realizar cultivando el microorganismo en un único medio, el Manitol Movilidad, que
se prepara en tubo con agar recto y se siembra en picadura, incubándose a 37ºC
durante 24 horas. También existe la posibilidad de hacer las pruebas en otros
medios y por separado.
42
Prueba del Manitol
Sirve para detectar si los gérmenes son capaces de fermentar el manitol liberando
productos ácidos que serán detectados gracias al indicador rojo de fenol que
cambiará a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol movilidad incluye 7,5
g/l de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las enterobacterias, Proteus
mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae. Entre las bacterias de
importancia clínica, la prueba del manitol sirve para diferenciar Staphylococcus
aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-).
Prueba de la Movilidad
Sirve para determinar si un organismo es móvil o inmóvil. Las bacterias tienen
movilidad por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre los
bacilos aunque existen algunas formas de cocos móviles.
El medio manitol movilidad permite la realización de esta prueba gracias a ser
semisólido ya que presenta solamente 3,5 g/l de agar. En estas condiciones, las
bacterias móviles producirán un enturbiamiento homogéneo del medio debido a la
distribución aleatoria de los microorganismos. Por el contrario, las bacterias
inmóviles permanecerán en la misma línea de la picadura en que se sembraron.
Entre las enterobacterias, la movilidad nos permite diferenciar el género Klebsiella
(-) de las restantes que suelen ser movilidad (+).
Dentro del género Bacillus, nos permite diferenciar B.anthracis (-) de otras
especies generalmente (+).
43
Prueba de la reducción de nitratos
Sirve para determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en
nitritos. Para ello, el medio manitol movilidad incorpora 1 g/l de potasio nitrato y
para revelar la presencia de nitritos después de su incubación se añaden los
reactivos A y B de Griess-Ilosvay en cantidades iguales (1ml aprox.). Un cambio
de color (rojo) dentro de los 30 seg indica prueba completa con resultado positivo.
Si no cambia de color, se agrega directamente al tubo una pizca (unos 20mg) de
polvo de cinc purísimo, totalmente exento de nitratos o nitritos, y se observa el
cambio de color durante otros 30 seg, al cabo de los cuales se realiza la
interpretación final.
Las enterobacterias son generalmente nitratos (+). Esta prueba se utiliza
principalmente para diferenciar entre sí determinadas bacterias de los géneros
Haemophylus y Neisseria.
Oxidasa
Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción
de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la
oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce
agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por
tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones.
Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos
aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún
microaerófilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad
oxidasa. Asímismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa,
ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno (ver prueba de la catalasa) que se
produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es
tóxica.
44
La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para
Identificar todas las especies de Neisseria (+)
Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las
enterobacterias.
El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1% de
diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menos tóxico
y mucho más sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de
Gordon y McLeod), pero es más caro. Este reactivo tiñe las colonias oxidasa
positivas de color lavanda que vira gradualmente a púrpura-negruzco intenso.
Realización de la prueba:
Método en placa directa
Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la
placa y no invertirla.
Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reacción se produce
en unos 10-15 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de
los 10-30 minutos.
Método indirecto sobre papel
Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de
Petri.
Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.
Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado.
La reacción de color positiva se produce a los 5-10 segundos.
Rojo de metilo y Voges-Proskauer
Estas dos pruebas forman parte del IMVIC de las colimetrías y permiten la
diferenciación dentro de las enterobacterias del grupo coli y aerógenes. Las
enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarán la glucosa en dos fases:
45
primero la metabolizarán aerobiamente (respiración oxibióntica) consumiendo
rápidamente el oxígeno del medio, para, en segundo lugar, continuar
metabolizándola por vía anaerobia (fermentación). Ésta puede ser de dos tipos:
Fermentación ácido mixta: La realizan las bacterias del grupo de E.coli y los
productos finales son ácidos orgánicos (ácidos fórmico, acético, láctico y
succínico) que provocan un fuerte descenso del pH inicial del medio. Puede
detectarse por el viraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo por
encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4.
Fermentación butilén glicólica: La realizan las bacterias del grupo Klebsiella-
Enterobacter (antiguo aerógenes). Los productos finales son compuestos neutros
como el butanodiol y el etanol, produciéndose acetoína como intermediario que
podrá ser detectada añadiendo al medio KOH (reactivo A de Voges-Proskauer) y
alfa-naftol (reactivo B de Voges-Proskauer) que reaccionarán con este compuesto
produciendo un color rojo característico.
Para la realización de estas dos pruebas se cultiva el microorganismo en caldo
RMVP (medio de Clark y Lubs) y se incuba a 30ºC durante un periodo de 3 días
como mínimo y 5 como máximo. Al revelar las pruebas, se separa el cultivo en dos
porciones de unos 2,5ml que servirán para cada uno de los ensayos.
Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le añade unas gotas (4-5) de solución
indicadora de Rojo de Metilo. Se agita para homogeneizar y se observa la
coloración. Se considera positiva si vira al rojo y negativa si permanece amarillo.
Foto de los resultados de esta prueba
Voges-Proskauer: A la otra porción de cultivo se le añade: 0,6ml del Reactivo A de
Voges-Proskauer (alfa-naftol 5% en etílico absoluto). El medio adquiere un
aspecto lechoso.
0,2ml del Reactivo B de Voges-Proskauer (KOH 40%). Desaparece el aspecto
lechoso y se agita fuertemente.
46
Si la prueba es positiva, antes de cinco minutos aparece un color rosado-violáceo,
más o menos intenso, que se inicia en la parte superior del tubo. Si la prueba es
negativa no aparece coloración alguna.
Ureasa
Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos
moléculas de amoniaco por acción del enzima ureasa. Esta actividad enzimática
es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para
diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo
retardado.
Se cultiva el microorganismo en slant en agar urea de Christensen. Este medio se
complementa después del autoclavado con 50ml/l de urea. Ésta será degradada
por aquellos microorganismos capaces de producir el enzima ureasa. Esta
degradación produce amoniaco que hará variar el color del indicador de amarillo a
rojo, poniéndose así de manifiesto la actividad ureasa.
Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo
de incubación ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio poco después
de la inoculación y sus resultados deben ser leídos en las primeras 2-6 horas,
mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen actividad ureasa
dentro de las 24-48 horas de incubación.
47
Resumen de resultados positivos
PRUEBA
RESULTADO POSITIVO
Catalasa Aparición de burbujas de O2
Citrato Medio de color azul
Fenilalanina desaminasa Aparición de color verde oscuro
Indol Aparición de un anillo rojo
Lactosa Colonias de color violeta
Manitol Aparición de color amarillo
Movilidad Difusión a partir de la línea del
inóculo
Nitratos Cambio de color (rojo oscuro)
Oxidasa Aparición de color azul
Rojo de Metilo Aparición de color rojo
Ureasa Aparición de color rojo
Voges-Proskauer Aparición de color rojo
Una vez que se tiene el conjunto de resultados de esta, y mas pruebas
bioquímicas, se procede a buscar en tablas preparadas en libros de Análisis
Microbiológico, el microorganismo que presente los resultados iguales a las
pruebas ensayadas.
4.2 Demostración de habilidades como resultado del aprendizaje
4.2.1 Evaluar los métodos adecuados para la identificación de
microorganismos y su efecto en alimentos
48
PRÁCTICA 7: TINCIÓN DE GRAM: Reactivos: Cristal violeta (1 g de cristal
violeta en 100 ml de agua destilada). Lugol (1 g de iodo en 2 g de ioduro potásico
en 100 ml de agua destilada). Safranina (1 g de safranina en 100 ml de agua
destilada). Desarrollo: Extensión: En un portaobjetos limpio (con alcohol, papel de
filtro y flameado) se coloca una gota de agua destilada a la cual, con el asa de
siembra, previamente esterilizada a la llama, se lleva una pequeña cantidad de
suspensión de bacterias o, en su caso, de una colonia.
Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el portaobjetos y se fija la
extensión por el calor, calentando suavemente a la llama del mechero hasta que
se seque.
49
Coloración:
a) 1 minuto en cristal violeta de Hucker (colorante inicial)
b) Se lava con agua destilada
c) 1 minuto en lugol (mordiente)
d) Se decolora con alcohol de 95° (decolorante)
e) Se lava con agua destilada
f) 1 minuto en safranina (colorante de contraste)
g) Se lava con agua corriente
h) Se seca suavemente y sin frotar con papel de filtro
Una vez que la preparación está totalmente seca, poner una gota muy pequeña de
aceite se inmersión y observar al microscopio con el objetivo de inmersión.
PRÁCTICA 8: Pruebas bioquímicas. A partir de un cultivo puro obtenido de la flora
presente en un alimento, inocular tantos medios para pruebas bioquímicas de que
se disponga, obtener resultados a las 24 h (corroborar negativos hasta las 48 h),
discutirlos y tratar de identificar el género y la especie presente, de acuerdo a las
siguientes instrucciones:
Medios y Materiales:
Tubos con tapón de rosca
Matraces Erlenmeyer
Asa bacteriológica
Estufa de incubación a 35ºC
Campana de flujo laminar
Campana de humos
Balanza analítica
50
Espátula
Peróxido de hidrógeno al 30% (H2O2) y portaobjetos
Agar nutritivo (preparar en cajas Petri)
Agar citrato de Simmons (preparar en tubos inclinado)
Reactivo de Kovacs:
Alcohol amílico o isoamílico (puede sustituirse por alc.butílico)........150ml
p-dimetilamino-benzaldehído...............................................................10g
HCl (concentrado)...............................................................................50ml
Se disuelve el aldehído en el alcohol y se agrega lentamente a esta
mezcla el ácido.
Caldo rojo fenol y lactosa (en tubos)
Agar Manitol-Movilidad (preparar en tubos)
Caldo urea de Christensen (añadir 2 g de agar por 100 ml y preparar en tubo
inclinado)
Medio SIM (en tubos)
Desarrollo:
1.- De acuerdo a los apuntes proporcionados de pruebas bioquímicas, realizar las
pruebas para catalasa, citrato, lactosa (con el medio Caldo rojo fenol y lactosa en
lugar del agar de McConkey), manitol y movilidad, oxidasa, ureasa, indol (con el
medio SIM en lugar del caldo de triptona).
2.- Anotar observaciones y entregar informe escrito con esquemas de las
observaciones y resultados.
51
Unidad III: Análisis microbiológicos de los alimentos
Introducción
Objetivos
3 Microorganismos que causan daño y que están relacionados
con los alimentos
1.1 Criterios de aprendizaje
1.1.1 Identificar los microorganismos que causan daño con
mayor frecuencia en los alimentos
Leche
La leche es el líquido segregado por los mamíferos para alimentar a sus crías
(excluyendo el calostro). Económicamente, la leche de vaca es la más importante.
Sus componentes principales son lactosa, grasa y proteínas, además de un 78%
de agua. Posee un pH cercano a la neutralidad, elevada aw y numerosos
nutrientes, por lo tanto, es un excelente medio para el desarrollo de
microorganismos.
Los microorganismos presentes en la piel y ubre de la vaca pueden invadir el
pezón y el interior de la ubre. Micrococos, estreptococos y Corynebacterium bovis
son los organismos comúnmente hallados. Los culpables de las infecciones de las
ubres son Staphylococcus aureus, E. coli, Streptococcus agalactiae,
Streptococcus uberis, Pseudomonas aeruginosa y Corynebacterium pyogenes.
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Algunos patógenos de origen humano también pueden intervenir en la mamitis:
Salmonella, Listeria monocytogenes, Mycobacterium bovis y Mycobacterium
tuberculosis.
El material para la manipulación y almacenamiento de la leche, también pueden
ser fuente de microorganismos.
Carne
Se llama carne al músculo y vísceras de los animales, las fuentes más importantes
son las de ganado vacuno, los cerdos, borregos, chivos y aves de corral. La carne
es una fuente importante de proteínas, lípidos y nitrógeno no proteico. Además,
posee una elevada aw y un pH cercano a la neutralidad.
Los primeros organismos en crecer en la carne utilizan los carbohidratos y el
nitrógeno no proteico soluble. Los microorganismos proteolíticos entran en acción
en las últimas etapas de la descomposición de la carne.
Durante el procesamiento de los animales, la evisceración reviste primordial
atención debido a que el tracto intestinal está repleto de microorganismos, muchos
de los cuales son patógenos, como Salmonella y Campylobacter en aves de
corral. Después de formar la canal, el lavado con agua caliente (80°C), lavado con
agua clorada o con ácido cítrico reducen la flora microbiana de superficie de la
canal. Además, regularmente se expone la carne a choque térmico con
temperaturas de refrigeración.
Las carnes rojas refrigeradas poseen un elevado Eh en la superficie lo cual
permite el crecimiento de aerobios psicrótrofos como Pseudomonas (P. fragi, P.
lundesis y P. flurescens), Acinetobacter y Psichobacter. Las Pseudomonas son el
organismo predominante en el deterioro de las carnes rojas.
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Las carnes envasadas al vacío dan origen a una microflora dominada por
microorganismos gram positivos, ácido lácticos, como Lactobacillus,
Carnobacterium y Leuconostoc.
Pescado
A diferencia de la carne, el pescado no contiene depósitos de grasa visibles.
También es una fuente importante de proteínas. El pescado recién capturado
suele ser estéril pero la piel, agallas e intestinos contienen muchas bacterias,
principalmente gram negativas como Pseudomonas, Shewanella, Psychrobacter,
Vibrio, Flavobacterium y Cytophaga.
La grasa del pescado es poliinsaturada y por lo tanto muy reactiva, esto implica
que muchas veces la alteración del pescado es química (rancidez oxidativa). La
descomposición microbiana es la más frecuente y comienza con la utilización de la
fracción nitrogenada no proteica que origina la trimetilamina. El olor desagradable
del pescado descompuesto se debe a sulfuro de hidrógeno, metil mercaptano y el
dimetil sulfuro así como la trimetilamina.
La alteración del pescado refrigerado se debe principalmente a bacilos psicrótrofos
gram negativos como Shewanella putrefaciens y Pseudomonas spp.
Crustáceos y moluscos
Además de su flora endógena, suelen contaminarse con bacterias del lodo que es
arrastrado con ellos en su captura. Como contienen mas carbohidratos que la
carne y el pescado, su alteración es glucolítica en lugar de proteolítica.
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Cereales
Trigo, arroz y maíz son la principal fuente de alimentación en el mundo. Al poseer
una reducida aw, los mohos son los responsables del deterioro de los granos
almacenados. Los géneros Penicillium, Aspergillus y Fusarium son los más
importantes.
Legumbres, nueces y semillas oleaginosas
Las legumbres constituyen la principal fuente de proteínas vegetales, y las nueces
y semillas oleaginosas proporcionan aceites vegetales. Las semillas almacenadas
pueden ser atacadas por mohos, especialmente lipolíticos: Aspergillus niger, A.
tamarii, Penicillium spp. y Paelomyces spp.
Frutas y sus derivados
Aunque poseen aw elevadas, el bajo pH que los caracteriza permite el desarrollo
de levaduras y mohos. Los cítricos son deteriorados por Penicillium italicum y P.
digitatum. En manzanas, P. expansum provoca la podredumbre blanda. Peras y
manzanas son atacadas por los ascomicetos Venturia inaequalis y Monilia
fructigena.
Hortalizas y derivados
Su pH más elevado permite el crecimiento de bacterias, y también hongos. La
alteración de las hortalizas es provocada por bacterias pectinolíticas de los
géneros gram negativos Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas y Clostridium.
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Alimentos enlatados
En los alimentos enlatados los microorganismos pueden causar alteraciones. En
general, los microorganismos se asocian con grupos particulares de alimentos.
Éstos pueden sobrevivir al tratamiento térmico requerido para el enlatado o bien
contaminar el alimento después de dicho tratamiento debido a suturas o fugas del
envase.
Cuando la contaminación es anterior al tratamiento, es posible predecir el
microorganismo responsable si se conocen bien la naturaleza del alimento y las
condiciones a las que se ha sometido dicho alimento. Sin embargo, los
microorganismos que se introducen por fugas pueden ser muy variados al igual
que la composición de los medios de enfriamiento. En la siguiente tabla se ilustran
algunos microorganismos que deterioran alimentos enlatados.
Grupos según grado de
acidez
Rango de pH
Grupos de alimento
Microorganismos
Grupo 1: poco ácidos
> 5
Productos cárnicos Productos marinos Leche Hortalizas
Grupo 2: semiácidos
4,5 < pH < 5,0
Mezclas de carne y vegetales Sopas Salsas
Aerobios esporulados Anaerobios esporulados Levaduras, mohos y bacterias no esporuladas
Grupo 3: ácidos
3,7 < pH < 4,5
Tomates Peras Higos Piña Otras frutas
Bacterias esporuladas Bacterias no esporuladas Levaduras Mohos
Grupo 4: muy ácidos
PH < 3,7 Encurtidos Pomelo Zumos cítricos
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MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS DE ACIDEZ BAJA Y MEDIA
AEROBIOS ESPORULADOS
Los más difundidos son los del género Bacillus, que tiene su origen en el suelo y
agua, por lo que casi siempre están presentes en las materias primas empleadas
en conservas. Su temperatura óptima de crecimiento oscila entre los 28 y 40 ºC
para la mayoría, aunque existen algunos termófilos, que pueden desarrollarse a 55
ºC e incluso 70 ºC. Entre estos podemos encontrar, tanto aerobios obligados,
como anaerobios facultativos, estos últimos capaces de crecer en condiciones de
vacío. Los tipos de alteraciones que pueden tener lugar son: la fermentación
simple, la producción de gas y la de ácido y gas.
La fermentación simple es la más común y se debe al ataque de los carbohidratos
con producción de ácido y sin producción de gas. B. stearothermophilus y B.
coagulans son los principales termófilos causantes de la fermentación simple. El
primero, en productos de baja acidez (guisantes, hortalizas;no crece con un pH
menor de 5), sometidos a un tratamiento térmico relativamente intenso, aunque no
se produce la alteración cuando el enfriamiento es rápido y si se realiza el
almacenamiento en frío. B. coagulans es acidúrico (pH de hasta 4,2) y presenta
esporas menos resistentes al calor, por lo que las alteraciones tienen lugar en las
carnes enlatadas, ya que el tratamiento térmico para estas es más bajo que en las
hortalizas. También aparece asociado a productos ácidos (jugo de tomate), ya que
por su bajo pH el tratamiento térmico es ligero.
La producción de gas por aerobios esporulados se debe a la denitrificación del
nitrato en carnes curadas enlatadas, maiz, guisantes, etc. B. cereus y B.
mesentericus aparecen en salmón y cangrejos.
B. macerans y B. polymixa forman ácido y gas.
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ANAEROBIOS ESPORULADOS
Los anaerobios esporulados proceden principalmente del suelo, por lo que se
encuentran ampliamente distribuidos en la leche, hortalizas y otros productos
alimenticios. También es posible encontrarlos en la carne, ya que algunas
especies también se desarrollan en los intestinos del hombre y animales.
El género más importante es el Clostridium, pudiendo encontrar organismos
termófilos y mesófilos. Entre los primeros, los sacarolíticos son los más
importantes, produciendo gran cantidad de gas a partir de los carbohidratos,
principalmente dióxido de carbono e hidrógeno, lo que da lugar al abombamiento
de las latas. Estas alteraciones van acompañadas de un olor butírico. No producen
ácido sulfhídrico. La temperatura óptima de desarrollo se sitúa alrededor de los 55
ºC, apareciendo sobre todo en países cálidos, donde las temperaturas de
almacenaje pueden sobrepasar los 35 ºC. También los termófilos pueden ser
causantes de una alteración sulfurosa, en este caso con producción de ácido
sulfhídrico.
Los organismos mesófilos son los segundos en importancia después de los
causantes de la fermentación simple. Entre estos destaca Clostridium botulinum.
Se trata de una bacteria Gram positiva, anaerobia y esporógena, cuyo crecimiento
queda inhibido a pH menor de 4,5. Sin embargo, los organismos aeróbios de un
alimento pueden crecer y usar el oxígeno en un recipiente, creando condiciones
anaerobias adecuadas para su desarrollo y en un producto ácido puede crecer C.
botulinum, si está presente, cuando el ácido haya sido utilizado por otros
organismos, aumentando el pH. Es el más resistente de los microorganismos que
intoxican los alimentos, por lo que la industria de enlatado admite de forma general
que todos los productos no ácidos tratados deben cumplir los requerimientos
básicos necesarios para destruir a C. botulinum (esterilización durante 2,8 minutos
a 121,1 ºC). En los alimentos correctamente procesados no se produce el
desarrollo de esta bacteria, aunque existen alimentos con porciones sólidas en los
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que puede haber heterogeneidad de pH durante cierto tiempo, por lo que debe
mantenerse un pH inferior a 4,5 como margen de seguridad. Este microorganismo
merece especial mención debido a su significancia para la salud humana. Se
presenta tanto en forma vegetativa como de esporas, siendo estas últimas la
forma importante desde el punto de vista del enlatado de alimentos. La forma
vegetativa se destruye fácilmente a temperaturas menores de 100 ºC, mientras
que las esporas, que proceden del polvo y del suelo, pueden sobrevivir 300
minutos de ebullición a 100 ºC. Éstas varían su resistencia al calor, siendo difícil
obtener una suspensión de esporas de resistencia uniforme al calor para su
estudio. Tiene poderes proteolíticos y sacarolíticos. La toxina botulina es soluble
en agua y extremadamente letal para el hombre (tipos A y B). Las esporas deben
germinar para producir una célula vegetativa que produce la toxina, por lo que es
poco probable encontrar presente el organismo con su toxina, de forma que el
alimento puede ser ingerido por ausencia de indicios de contaminación (sabor u
olor extraños). Dicha toxina es destruida por exposición durante diez minutos a
calor húmedo a 100 ºC. La determinación del tipo de toxina se lleva a cabo
mediante reacciones antigénicas.
La temperatura óptima de crecimiento de los organismos mesófilos oscila entre los
20 y 50 ºC (algunos menos y otros más, aunque generalmente es de 37 ºC).
Según su capacidad para atacar a los hidratos de carbono pueden ser de dos
tipos: proteolíticos o putrefactivos y sacarolíticos. Los primeros son causantes de
alteraciones gaseosas con degradación del alimento y producción de compuestos
de olor desagradable. Éstos son más importantes en los alimentos de acidez baja
y media, excepto en el jamón york enlatado, en el cual se producen alteraciones
de tipo sacarolítico causadas por C. perfringens. Destacan C. hystolyticum, C.
sporogenes y C. bifermentans. Entre los de tipo sacarolítico los más frecuentes
son C. butyricum, C. pasteurianum, C. perfringens y otros.
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LEVADURAS, MOHOS Y BACTERIAS NO ESPORULADAS
Los únicos importantes en los alimentos de acidez baja y media son aquéllos con
resistencia térmica relativamente baja, los que producen alteraciones por fugas en
la lata y aquéllos que producen alteraciones en la leche condensada y las carnes
curadas enlatadas (jamón, tocino, etc.).
Entre las levaduras destacan las fermentadoras de la sacarosa que se desarrollan
en la leche condensada, ya que este alimento no es sometido a ningún tratamiento
térmico, sino que la base de su conservación radica en su elevado contenido en
azúcar. Torula globosa, de células redondeadas, ocasiona la distensión de las
tapas de las latas. Torula lactiscondensis, de células ovales, produce una
fermentación muco más vigorosa, por lo que las latas pueden reventar en pocos
días.
Aspergillus repens es un moho que da lugar a la formación de botones en la
superficie de la leche condensada.
Dentro de las bacterias no esporuladas destacan:
- Pseudomonas fluorescens, que produce rancidez.
- Streptococcus liquefaciens, que provoca la licuefación de la gelatina del jamón
enlatado.
- S. faecicum y S. faecalis, son estreptococos fecales que producen olores y
sabores anormales en jamones enlatados. El primero es de mayor interés debido
a su mayor termorresistencia.
- Las Enterobacteriaceae (coliformes, Aerobacter, Proteus sp., etc.) son
responsables del abombamiento del jamón enlatado.
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MICROORGANISMOS EN PRODUCTOS ÁCIDOS
En la mayoría de los casos se controlan fácilmente con un tratamiento térmico
relativamente corto a una temperatura inferior a los 100 ºC.
BACTERIAS ESPORULADAS
Podemos encontrar bacterias anaerobias sacarolíticas y otras responsables de la
fermentación simple. Dentro de las primeras destacan Clostridium pasteurianum,
que produce la alteración gaseosa de frutas y tomates enlatados y que no se
desarrolla a pH inferior a 3,7, y C. butyricum, que afecta también a las frutas
enlatadas.
Bacillus coagulans es responsable de la fermentación simple en el jugo de tomate
enlatado, ocasionando además sabores anormales. Es termófilo y se desarrolla
aun pH de 4,2.
B. macerans, produce alteraciones gaseosas en frutas enlatadas y unto a B.
polymixa, en hortalizas y frutas enlatadas.
BACTERIAS NO ESPORULADAS
Son bacterias Gram positivas productoras de ácido láctico (cocos y bacilos) y
algunas son productoras de gas. Pueden desarrollarse con escasa tensión de
oxígeno y son responsables de fermentaciones de vegetales. Se destruyen con
tratamiento térmico a menos de 100 ºC.
Lactobacillus brevis causa una vigorosa fermentación en salsa capsup y productos
similares y es formador de gas.
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Leuconostoc pleofructi produce la alteración de los jugos de fruta, dando lugar a la
formación de una película de limo en las soluciones de azúcar (alteración de
productos de tomate).
Leuconostoc mesenteroides da lugar a la alteración gaseosa de la piña enlatada.
LEVADURAS
Presenta escasa resistencia al calor, por lo que no son frecuentes en enlatados
sometidos a tratamiento térmico y sí cuando el tratamiento es subtérmico o
cuando se producen fugas.
Son responsables de la fermentación de salsas ácidas, gelatinas y productos
similares cuya conservación depende de los ácidos, el azúcar y la sal.
MOHOS
Byssochlamys fulva es la especie de mohos de mayor importancia en los
alimentos enlatados ácidos. Afecta a frutas enlatadas y embotelladas. Es
responsable de la desintegración de la fruta por descomposición del material
pectínico. Las latas a veces se abomban debido al desprendimiento de dióxido de
carbono. Su temperatura óptima de crecimiento es de 30-37 ºC y resulta altamente
resistente al calor.
Byssochlamys nivea es semejante al anterior y es mucho más frecuente enla
alteración de fresas enlatadas.
Penicillium afecta a las grosellas enlatadas y es altamente termorresistente.
Aspergillus también es termorresistente y se presenta en las fresas enlatadas.
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Rhizopus nigricans es responsable de la degradación de las frutas enlatadas y
especialmente del albaricoque.
Rhizopus stolonifer ocasiona el ablandamiento de los albaricoques enlatados.
1.2 Demostración de habilidades como resultado del aprendizaje
1.2.1 Aislar microorganismos que se encuentran en alimentos
sospechosos
PRACTICA 9: Analizar un alimento presuntamente contaminado con
microorganismos de acuerdo a la NOM- NOM-113-SSA1-1994 Bienes y servicios.
Método para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.
4 Análisis microbiológicos aplicados en los alimentos
2.1 Criterios de aprendizaje
2.1.1 Explicar los métodos de análisis microbiológicos que se
aplican a los alimentos en base a la composición de estos
últimos
Como ya se discutió anteriormente, la composición química y propiedades
fisicoquímicas de los alimentos determinan el tipo de flora microbiana que se
puede desarrollar.
Algunos métodos de análisis autorizados se encuentran descritos en las siguientes
Normas Oficiales Mexicanas y Normas Mexicanas:
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Prueba Norma y/o Método de Referencia
Toma, manejo y transporte de muestras de alimentos
NOM-109-SSA1-1994 Procedimiento para la toma, manejo y transporte de
muestras de alimentos para su análisis microbiológico.
Cuenta de bacterias aerobias en placa.
NOM-092-SSA1-1994 Bienes y servicios. Método para la cuenta de
bacterias aerobias en placa.
Cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.
NOM-113-SSA1-1994 Bienes y servicios. Método para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.
Cuenta de mohos y levaduras en alimentos.
NOM-111-SSA1-1994 Bienes y servicios. Método para la cuenta de mohos y
levaduras en alimentos. Determinación de bacterias coliformes. Técnica del Número Mas Probable.
NOM-112-SSA1-1994 Bienes y servicios. Determinación de bacterias coliformes. Técnica del Número Mas Probable.
Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos.
NOM-115-SSA1-1994 Bienes y servicios. Método para la determinación de
Staphylococcus aureus en alimentos.
Método para la determinación de Salmonella en alimentos.
NOM-114-SSA1-1994. Bienes y servicios. Método para la determinación de
Salmonella en alimentos.
Determinación de coliformes fecales Escherichia coli por la técnica de diluciones en tubo múltiple.
NOM-145-SSA1-1995 Productos cárnicos troceados y curados. Productos
cárnicos curados y madurados. Disposiciones y especificaciones sanitarias. Apéndice normativo B. De la estimación de la densidad microbiana por la
técnica del número mas probable. B.2 Determinación de coliformes fecales y Escherichia coli por la técnica
de diluciones en tubo múltiple.
Bacillus mesentéricos.
NMX-F-403-S-1981 Alimentos para humanos-microbiológicos-cuenta de
Bacillus mesentericus o Bacillus subtilis (Esporas formadoras de hebra).
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2.2 Demostración de habilidades como resultado del aprendizaje
2.2.1 Realizar análisis microbiológicos para diferentes muestras
de alimentos. Coliformes totales, coliformes fecales, E. coli,
Salmonella, Shigella, hongos, levaduras.
PRÁCTICA 10: Aplicar las Normas Oficiales Mexicanas o Normas Mexicanas para
determinar la presencia de Coliformes totales, coliformes fecales, Escherichia coli,
Salmonella spp., Shigella spp., hongos y levaduras, a partir de muestras de
alimentos presuntamente contaminados.
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VI REFERENCIAS
Madigan, M. T., Martinko, J. M., Parker, J. Biología de los Microorganismos de
Brock. Primera Edición en español. Prentice Hall, Inc. 1998.
Bourgeois, C. M., Mescle, J. F., Zucca, J. Microbiología Alimentaria. Tomos 1 y 2.
Editorial ACRIBIA, S.A. 1988.
Adams, M. R. y Moss, M. O. Microbiología de los Alimentos. Editorial ACRIBIA,
S.A. 1995.
Herson, A. C. y Hulland, E. D. Conservas Alimenticias. Editorial ACRIBIA, S.A.
1980.
Mossel, D. A. A., y Moreno García, B. Micr Microbiología de los Alimentos.
Editorial ACRIBIA, S.A. 1985.
http://www.bioinformacion.net/deterioro%20y%20conservacion%20de%20alimento
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http://www.geocities.com/grupoindustrialaisa (Grupo Industrial AISA)
http://www.promase.com.mx/santec.htm (Sanitizantes y material de limpieza para
la industria farmacéutica cosmética y de alimentos)
http://edicion-micro.usal.es/web/educativo/micro2/tema31.html#anchor305138
http://www.engormix.com/nuevo/prueba/areadeporcicultura1.asp?valor=276
http://www.danival.org/notasmicro/medioscult/medios_100_intro.html
http://canales.nortecastilla.es/canalagro/datos/conservas/microorganismos.htm