UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS, TECNOLOGÍA E INGENIERIA CONTENIDO DIDÁCTICO DEL CURSO: 210101 – MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

211624 – MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS CLAUDIA PATRICIA ZAMBRANO PARRA

MARTHA VINASCO Acreditadora

BOGOTA

Septiembre de 2010

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ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO El presente módulo fue diseñado en el año 2005 por Carmen Eugenia Piña López, M.Sc. Ciencias Biológicas; M.Sc. Docencia Universitaria; Especialista en Nutrición Animal Sostenible; Especialista en Informática y Multimedia. Docente de la UNAD desde 1986. El módulo se modificó en el año 2010 por Claudia Patricia Zambrano Parra, M.Sc. Microbiología. Docente-cátedra de la UNAD desde el 2009, para darle el énfasis requerido en el área de la microbiología de alimentos. Las siguientes son las modificaciones realizadas:

1. Áreas temáticas

Se modificaron los aspectos relacionados con los Conceptos generales y la diversidad microbiana para darle un mayor énfasis al área de la microbiología de alimentos. Igualmente se incorporó una unidad denominada: Importancia de la microbiología de alimentos, en la que se incluye Microorganismos asociados a procesos industriales y enfermedades transmitidas por alimentos, microorganismos indicadores de alimentos y microbiología de ambientes, superficie y manipuladores. Adicionalmente, el capítulo 2.2 sobre Técnicas de seguridad, cultivo, métodos de recuento y control se modificó para darle un mayor énfasis al aspecto experimental en el área de alimentos.

2. Mejoramiento didáctico

Carmen Piña realizó la adecuación de unidades para manejo mediante el sistema de créditos con el tiempo regulado para 3 créditos académicos y la realización de estrategias de aprendizaje por fases de reconocimiento, profundización y transferencia. Claudia Zambrano modificó las estrategias de aprendizaje (fases de reconocimiento, profundización y transferencia) para darle el énfasis necesario al área de microbiología de alimentos. Este documento se puede copiar, distribuir y comunicar públicamente bajo las condiciones siguientes:

• Reconocimiento. Debe reconocer los créditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra).

• No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. • Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada

a partir de esta obra. • Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los términos de la licencia

de esta obra. • Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular

de los derechos de autor • Nada en esta menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

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CONTENIDO

Página

Introducción 7 Justificación 8 Unidad 1. Conceptos Generales 10 Capitulo 1. Generalidades 11 Lección 1. Definición de microbiología 12 Lección 2. Historia y clasificación de los microorganismos 12 Lección 3. Campos de aplicación 17 Lección 4. Entidades de referencia 19 Capítulo 2. Diversidad Microbiana 22 Lección 5. Introducción 23 Lección 6. Microorganismos acelulares: Virus 24 Lección 7. Microorganismos acelulares: Viroides y priones 29 Lección 8. Microorganismos celulares procaríoticos: Bacterias 31

Lección 9. Microorganismos celulares eucaríoticos: Hongos, Protozoos y Helmintos

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Lección 10. Otros microorganismos de interés alimenticio 51 Capítulo 3. Crecimiento bacteriano 52

Lección 11. Metabolismo Bacteriano 53 Lección 12. Crecimiento Bacteriano 56 Lección 13. Fases de crecimiento bacteriano 57 Lección 14. Factores físicos 58 Lección 15. Factores químicos 60

Unidad 2. Importancia de la microbiología de alimen tos 64 Capítulo 4. Microorganismos asociados a procesos in dustriales 65

Lección 16. Fermentación alcohólica 66 Lección 17. Fermentación láctica 72 Lección 18. Producción de ácido acético 75 Lección 19. Producción de ácido citríco 77 Lección 20. Otros procesos industriales 78 Capítulo 5. Microorganismos indicadores de alimento s 81 Lección 21. Mesófilos 81

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Lección 22. Coliformes 82 Lección 23. Salmonella 82 Lección 24. Clostridium sulfito reductores 83 Lección 25. Staphylococo aureus 83

Lección 26. Hongos y levaduras 84 Lección 27. Listeria monocytogenes 84 Lección 28. Escherichia coli O157:H7 85

Lección 29. Bacillus cereus 85 Capítulo 6. Enfermedades transmitidas por alimentos (ETA´s) 86

Lección 30. Enfermedades transmitidas por alimentos de tipo tóxico 87

Lección 31. Enfermedades transmitidas por alimentos de tipo infeccioso

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Lección 32. Enfermedades transmitidas por alimentos causadas por protozoos

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Lección 33. Enfermedades transmitidas por alimentos causadas por helmintos

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Lección 34. Enfermedades transmitidas por alimentos causadas por virus

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Capítulo 7. Microbiología de ambientes y manipulado res 94 Lección 35. Evaluación del ambiente 94

Lección 36. Evaluación de los manipuladores de alimentos 95

Unidad 3. Técnicas de laboratorio utilizadas en el área de alimentos

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Capítulo 8. Generalidades 98 Lección 37. Microscopía 99 Lección 38. Preparación en fresco 100 Lección 39. Tipos de tinciones 100 Lección 40. Medios de cultivo 103

Capítulo 9. Técnicas de cultivo en alimentos 106 Lección 41. Técnicas de diluciones seriadas 107

Lección 42. Sistemas de siembra y recuento de colonias 107 Lección 43. Técnicas de cultivo 109 Lección 44. Técnicas de identificación de microorganismos 112 Lección 45. Técnicas microbiológicas utilizadas en la evaluación del ambiente

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Glosario 118

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Bibliografía 121

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INDICE DE FIGURAS

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Figura 1. Experimento de Francisco Redi 14 Figura 2. Experimentos realizados por Louis Pasteur 15 Figura 3. Los tres dominios del mundo viviente 17 Figura 4. Microfotografía de Adenovirus 24 Figura 5. Virus Bacteriofágo 28 Figura 6. Bacteriofágo infectando una bacteria 28 Figura 7. Esquema de bacteria 31 Figura 8. Bipartición 36 Figura 9. Levaduras 41 Figura 10. Hifas septadas multinucleadas 42 Figura 11. Hongos del pan 44 Figura 12. Paramecio 46 Figura 13. Entamoeba Histolítica 48 Figura 14. Balantidium 48

Figura 15. Giardia Lamblia 48

Figura 16. Plasmodium 49 Figura 17. Fasciola Hepática 50

Figura 18. Taenia Saginata 50 Figura 19. Nemátodo gastrointestinal 50 Figura 20. Clasificación de los seres vivos 54 Figura 21. Curva de crecimiento bacteriano 57 Figura 22. Fermentación alcohólica 67

Figura 23. Producción de cerveza 71

Figura 24. Fermentación láctica 72 Figura 25. Producción de citrato 78

Figura 26. Tipos de ETA´s 86 Figura 27. Tinción de Gram 102 Figura 28. Técnicas de dilución seriada 108

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INDICE DE TABLAS

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Tabla 1. Clasificación de bacterias según su morfología 38 Tabla 2. Procesos fermentativos 55 Tabla 3. Número de células bacterianas por generación 56 Tabla 4. Cálculos del crecimiento bacteriano 57 Tabla 5. Microorganismos productores de enzimas 79 Tabla 6. Principales medios de cultivo para aislamiento bacteriano 110

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INTRODUCCIÓN

El curso de Microbiología de alimentos busca que el estudiante de Ingeniería de Alimentos, conozca el funcionamiento y acción de los microorganismos asociados con la producción de alimentos, ya sean beneficiosos o perjudiciales, y de esta forma pueda establecer una interacción provechosa, en una industria que debe estar en permanente evolución y actualización y donde el consumidor cada vez toma una posición más activa frente a la calidad del producto que está comprando. El análisis microbiológico de los alimentos tiene como finalidad evaluar las prácticas de manufactura del alimento producido, convirtiéndose así en un indicador directo de la línea de producción y elaboración del alimento. Es decir, señala la calidad y seguridad del alimento elaborado, aspectos fundamentales para el posicionamiento y proyección del producto alimenticio. Por otro lado, el ingeniero de alimentos debe tener un sólido conocimiento microbiológico de su área, pues esto le facilita la implantación de sistemas de calidad, como las buenas prácticas de manufactura o el sistema HACCP, entre otros, necesarios dentro de la industria alimenticia para obtener productos de alta calidad. El curso está diseñado para estudiantes de educación a distancia con aprovechamiento de ambientes virtuales de aprendizaje, por consiguiente hace énfasis en la autogestión formativa mediada, sin excluir interacciones directas entre tutor y estudiante y de los estudiantes entre sí.

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JUSTIFICACIÓN

Las actuales reglamentaciones nacionales e internacionales sobre los productos alimenticios, han llevado a mantener un estricto control microbiológico dentro de toda la cadena de transformación del producto, que va desde las materias primas hasta el producto final. Estas exigencias sanitarias y fitosanitarias requiere de ingenieros de alimentos con sólidos conocimientos microbiológicos, que le permitan identificar los potenciales peligros en un producto determinado y además facilite su proyección a un mercado cada vez más globalizado. Es decir, con esta visión microbiológica, dada por el curso de microbiología de alimentos, el ingeniero de alimentos puede establecer las fuentes y modos de contaminación, los efectos sobre el procesamiento del alimento, la supervivencia de los microorganismos y sus toxinas, la multiplicación durante la producción y el almacenamiento, entre otros. Estos conceptos, le permiten al ingeniero de alimentos tomar decisiones fundamentadas, desde el punto de visto microbiológico, con el único fin de mantener su producto en óptimas condiciones. Igualmente, se hace necesario el componente práctico del curso pues es allí donde se da la transferencia del conocimiento y además se le da al ingeniero de alimentos, el soporte metodológico necesario para que pueda sustentar las validaciones necesarias de su proceso productivo. Así mismo, el ingeniero de alimentos tiene que desarrollar programas de inocuidad alimentaria, como buenas prácticas de manufactura o el sistema HACCP, que benefician en primera instancia al consumidor, pero que obviamente le permite a la industria alimenticia tener un valor agregado sobre el producto final, pues los sistemas de calidad son una carta de presentación del producto elaborado, que facilita las relaciones comerciales a todo nivel. Finalmente, el objetivo industrial principal es obtener un producto conforme a las disposiciones legales, de forma que puedan evitarse las alteraciones microbiológicas que afecten la calidad del producto final y la salud del consumidor.

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Uso de Iconos

En todos los casos deben hacer click sobre el icono para abrirlo

Indica que hay un documento en .pdf como lectura complementaria

Indica que hay una dirección electrónica para profundizar.

Indica que hay un video informativo.

Indica que se habla de una utilidad concreta de la microbiología, relacionada con la unidad revisada.

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UNIDAD DIDÁCTICA 1 CONCEPTOS GENERALES

UNIDAD 1. Conceptos Generales

Introducción

La Unidad 1 le permite al estudiante conocer la evolución de la microbiología al ubicarlo históricamente en esta área de estudio. Igualmente le facilita la contextualización de los conceptos microbiológicos en las diferentes áreas de aplicación y su utilidad dentro de las entidades de referencia. Además, la Unidad 1 introduce al estudiante en la multivariedad microbiana y sus interacciones con el medio que los rodea, determinando los principales factores que afectan su metabolismo y crecimiento.

Justificación

La comprensión de los conceptos generales relacionados con el área de la microbiología requiere que el estudiante se ubique históricamente, aplique los mismos en diferentes áreas de trabajo y los valide en entidades de referencia. Igualmente es necesario que el estudiante evidencie la diversidad microbiana y las diferentes interacciones que se dan en el crecimiento bacteriano.

Competencias

1. El estudiante explica el concepto de microbiología, la utilidad del mismo y las entidades de referencia que regulan su área de trabajo.

2. El estudiante interpreta los diferentes acontecimientos históricos relacionados con el área de microbiología.

3. El estudiante analiza y argumenta las posibilidades de acción en los diferentes campos de aplicación de la microbiología.

4. El estudiante identifica los diferentes microorganismos, su metabolismo y los factores que afectan el crecimiento.

Propósito

Lograr que el estudiante profundice en los conceptos básicos de microbiología teniendo en cuenta el contexto histórico, los campos de aplicación y las entidades de referencia útiles para esta área en particular. Igualmente se busca que el estudiante identifique la diversidad microbiana y el funcionamiento metabólico de los mismos.

Objetivos

1. Que el estudiante identifique claramente el concepto de microbiología y su utilidad en el área de trabajo.

2. Que el estudiante establezca la importancia de un contexto histórico y la forma como éste puede determinar el desarrollo de la microbiología.

3. Que el estudiante identifique los campos de aplicación de la microbiología de manera que pueda ubicarse claramente en cada uno de ellos.

4. Que el estudiante determine la importancia de las entidades de referencia en su campo laboral. 5. Que el estudiante conozca la diversidad microbiana y su accionar metabólico frente al medio que lo rodea.

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Horas de trabajo académico

El contenido de esta unidad corresponde a un crédito académico, que equivale a 12 horas de acompañamiento tutorial y 36 horas de trabajo independiente.

Palabras clave Microbiología, Historia, aplicación, entidades de referencia, diversidad microbiana, crecimiento, metabolismo.

Mapa Conceptual Unidad 1: Generalidades

Capítulo 1 Generalidades

La microbiología, como ciencia, se ha desarrollado en la medida que se diseñan nuevos instrumentos ópticos o electrónicos que amplifican organismos no detectados a simple vista. En un primer momento no se le dio importancia al hecho de encontrar organismos en sustratos como el agua, suelo y alimentos, sin embargo, mucho tiempo después se supo que estos microorganismos realizaban cambios químicos tanto útiles como nocivos en su medio e incluso que algunos podían producir enfermedades. Estos conocimientos estimularon la investigación,

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lo que llevo a las aplicaciones que actualmente tiene la microbiología, como por ejemplo el área de alimentos o la biotecnología.

Por otro lado, las áreas de trabajo de la microbiología requieren una serie de entidades cuya finalidad es la de regular y controlar las prácticas realizadas para cada caso.

Las lecciones que se encuentran en este capítulo son:

Lección 1. Definición de Microbiología

Lección 2. Historia y Clasificación de microorganismos

Lección 3. Campos de Aplicación

Lección 4. Entidades de Referencia

Lección 1. Definición de Microbiología

La microbiología estudia los microorganismos u organismos generalmente microscópicos, aunque algunos pueden ser observados a simple vista. El objeto material de la microbiología viene delimitado por el tamaño de los seres que investiga, lo que supone que abarca una enorme heterogeneidad de tipos estructurales, funcionales y taxonómicos: desde partículas no celulares como los virus, viroides y priones, hasta organismos celulares tan diferentes como las bacterias (eubacterias y arqueas), los protozoos, algunas algas, los hongos y levaduras.

La microbiología es una disciplina que aporta tanto conceptos, como técnicas y metodologías útiles para la gestión industrial de muchos procesos, que aprovechan la capacidad de los microorganismos para la producción rápida de una serie de insumos y de transformaciones de materiales, necesarios para el desarrollo humano y económico, tales como aumento y rendimiento de cultivos, biofertilizantes, biocontrol, vectores para transferencias de información genética en el desarrollo de plantas transgénicas, producción de compuestos químicos y aditivos para alimentos, eliminación de materiales contaminantes y residuos tóxicos del medio ambiente entre otras.

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Lección 2. Historia y Clasificación de los microorg anismos

Historia

La historia y evolución del estudio de los microorganismos se remonta a Girolamo Fracastore (1478-1553), médico y humanista, quien se considera la primera persona que, desde el punto de vista científico, relaciona la enfermedad con la presencia de un parásito, y lo detalla en su obra "De contagione et contagiosis morbis" en la que introdujo el concepto "Seminaria morbis" (semilla de enfermedad) y en la que explica el origen del “mal francés” o “morbus gallicus”, actualmente conocida como sífilis1.

El nacimiento de la microbiología, debió esperar la aparición del microscopio a comienzos del siglo XVII por el holandés Antony van Leeuwenhoek. Él se dedico en su tiempo libre, al arte de la fusión del vidrio y el tallado de los lentes, que lo llevo a lograr la amplificación de lo que observaba, hasta 40 y 160 veces. Sus descubrimientos los relató detalladamente a la Sociedad Real de Londres mediante cartas periódicas que les enviaba.

Los primeros tratados editados sobre la naciente ciencia de la microscopía fueron publicados en el siglo XVII, por Pierre Borel, médico, anticuario y filólogo francés, en 1656: por Henry Power, médico inglés, en 1663-1664; y por Henry Hooke, quien en 1665 publicó su renombrada Micrographia 2.

Después de los estudios de Leeuwenhoek y Hooke, el interés por los microorganismos disminuyó y solo surge nuevamente gracias a Louis Pasteur, a quien se le atribuye, con justa razón, la creación de la microbiología como una ciencia. Pasteur inicia el estudio sistemático de los procesos fermentativos, lo que lo lleva a concluir que las fermentaciones eran el producto de la acción microbiana.

Por otro lado, para explicar el origen de la vida, desde la antigüedad, se venía manejando el concepto que sostenía que la Tierra aún conservaba parte de su

1 Llorente-Bousquets y col.1995. Historia de la biología comparada. De Nicolás de Cusa a Francis Bacón. Vol. III. UNAM.México. p.59. 2 Herrera, J.R. 2001. El pensamiento biológico a través del microscopio. Fondo de cultura económico. México. p.17

Lectura complementaria sobre Antony Van Leewenhoek, donde encontrarán una descripción de la vida de este comerciante, quien revolucionó el ámbito científico al usar lentes que permitieron descubrir un “nuevo mundo microscópico”.

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capacidad original para generar vida, lo que se denominó “la Teoría de la Generación espontanea”. Es decir, que a partir de materiales orgánicos en descomposición se producian espontáneamente los seres vivos. En contra de esta teoría, los italianos Francisco Redi (mediados siglo XVII) y Lazzaro Spallanzani (mediados siglo XVIII), realizaron una serie de experimentos: Redi colocó pedazos de carne en frascos abiertos y cerrados y notó que sólo aparecían gusanos en los frascos abiertos (figura 1), obviamente depositados por las moscas y Spallanzani probó distintas infusiones vegetales, tiempos y temperaturas de calentamiento. Sus resultados, según sus propias palabras, pusieron en evidencia que “el número de animalillos desarrollados, es proporcional a la comunicación con el aire externo. El aire conduce a los gérmenes a las infusiones, o ayuda a la expansión de aquellos allí presentes…” 3.

Figura 1. Experimento de Francisco Redi Fuente:http://aportes.educ.ar/biologia/nucleo-teorico/recorrido-historico/como-seoriginalavida/los_primeros_experimentos.php

Pasteur participó de la polémica apoyado de sus experimentos en los que había demostrado que cada fermentación era producida por un tipo específico de microorganismo. Durante cuatro años, Pasteur recorrió el mundo explicando sus experimentos, anulando así, la teoría de la generación espontanea al punto que jamás volvió a ser considerada seriamente.

Para demostrar que el calentamiento no destruía ningún “principio vital u origen de la vida” en el aire, sino a los microorganismos presentes, Pasteur recurrió a experimentos muy ingeniosos, por ejemplo, utilizó recipientes con cuellos largos y curvos, en los que colocó un caldo que había hervido durante algunos minutos. Al retirarlo del fuego, el aire entraba por el cuello, pero los microbios quedaban atrapados en él, lo que impedía que contaminaran el líquido y permitía conservarlo

3 Herrera, J.R. 2001. El pensamiento biológico a través del microscopio. Fondo de cultura económico. México. p.17

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estéril indefinidamente. Sólo cuando se rompía el cuello, aparecían organismos en el caldo (Figura 2).

Figura 2. Experimentos realizados por Louis Pasteur . Fuente: http://es.geocities.com/joakinicu/imagen0016.htm

Clasificación taxonómica En cuanto a la clasificación taxonómica de los microorganismos, en un principio no fue muy clara, puesto que la microbiología como ciencia, solo sería aceptada una vez Pasteur inicia sus trabajos experimentales. El gran naturalista sueco Carl von

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Linné, padre de la taxonomía, muestra en su Systema natura, de 1758 (casi 100 años después de los estudios de Leeuwenhoek), el desconocimiento que se tenía en ese momento sobre los microorganismos, pues los clasifica en un extraño grupo llamado “Chaos infusorium” 4 Desde la época de Linné, la organización de los seres vivos comprendía dos reinos: plantas y animales. Los conceptos más claros para la clasificación inicial de las bacterias fueron introducidos por Ferdinand Julius Cohn (1872) quien señaló la imposibilidad de aplicar los mismos parámetros que hasta ese momento se utilizaban para plantas y animales, por considerar que eran organismos totalmente diferentes5. Ernest Heinrich Haeckel, biólogo alemán, en 1866 propone un tercer reino que denomina Protista, en el cual incluye todos los organismos sencillos, como protozoos, algas, hongos y móneras (bacterias) y en 1969 el norteamericano Robert H. Whittaker, establece un sistema de cinco reinos, basado en la distinción entre células procaríoticas y eucaríoticas:

- Monera, que incluyó organismos procaríoticos como las algas azul verdosas y las bacterias.

- Protistas, que incluyó organismos eucaríoticos como euglenoides, diatomeas, dinoflagelados y protozooarios.

- Plantas - Hongos - Animales

Whittaker no incluyó los virus por no considerarlos organismos vivos6.

Posteriormente, con la aparición del microscopio electrónico y las técnicas moleculares se determinó que los seres vivos se pueden clasificar en tres grandes dominios (una categoría taxonómica más grande que los reinos): Bacterias, Archeas y Eucariotas. El dominio Bacteria, comprende las “bacterias verdaderas”, el dominio Archea (griego achaios, “antiguos”) que comprende un grupo de procariotas con características extremas metabólicas y el dominio Eucariotas (Eucarya) que incluye todos los demás organismos vivos de la tierra: protozoos, hongos, plantas y animales. Un grupo importante de biólogos, basándose en estudios genéticos, han concluido que los tres dominios tienen un único antecesor común, y que las Archeas actuales tienen más cercanía con las células eucaríoticas que con las mismas bacterias (procariotes)7. Figura 3. 4 Herrera, J.R. 2001. El pensamiento biológico a través del microscopio. Fondo de cultura económico. México. p.17. 5 Ganten, D y col. 2004. Vida, Naturaleza y Ciencia. Editorial Santillana. Bogotá, Colombia. p.643 6 Carpenter, P. 1979. Microbiología. Editorial Interamericana. México. p.27 7 Purves, W.K. et col.2004. Life. The science of biology. 7a.Edición.Edit. Sinauer Associates. U.S.A. p. 525.

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Figura 3. Los tres dominios del mundo viviente. Las relaciones e interrelaciones entre los seres vivos todavía siguen siendo muy controversiales y permanentemente se están actualizando. Fuente: Imagen tomada y adaptada de The Science of Biology. (2004). Según el sistema binomial propuesto por Linneo, el nombre científico de un organismo incluye dos palabras, esto es, el género y la especie. El género se refiere al conjunto de características que comparte un grupo de organismos, por ejemplo: Felis, representa a un grupo de animales felinos que se caracterizan por ser carnívoros, de tamaño pequeño y colas cortas. Dentro de este género, encontramos las siguientes especies: Felis chaus (gato selvático o de los pantanos), Felis manul (gato de las estepas de Mongolia, Siberia y Tíbet), Felis margarita (gato del desierto). Por convenciones internacionales, el género se escribe la primera letra en mayúscula y la especie toda en minúscula. Además se subraya el nombre completo y se escribe en cursiva. En el caso de las bacterias, un ejemplo es el género de los Streptococcus, que pueden crecer en condiciones aérobicas, anaerobias o en presencia de CO2 y formar colonias pequeñas y puntiformes. A continuación se mencionan algunas de las especies más importantes, dentro de este género: El Streptococcus pyogenes relacionado con cuadros de faringitis, sinusitis, artritis, entre otros. El Streptococcus agalactiae causante de la meningitis en los recién nacidos y el Streptococcus pneumoniae, que en niños menores de 14 años y recién nacidos puede causar otitis media, neumonía y meningitis.

Lección 3. Campos de Aplicación

La relación de la microbiología con otras disciplinas ha generado el desarrollo de otros campos del conocimiento como:

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La microbiología industrial se encarga de estudiar y manipular los microorganismos a gran escala para que produzcan compuestos o realicen funciones útiles como la producción y transformación de alimentos, fármacos, vacunas, disolventes orgánicos. Por ejemplo la proteína unicelular utilizada en la alimentación animal y producida por microorganismos cultivados sobre desechos industriales, da rendimientos muchísimo más elevados que la producida en las cosechas. La microbiología clínica estudia e identifica los agentes causantes de enfermedades y su proceso infeccioso, así como la respuesta inmunológica del paciente (sistema inmune y protección ante agresiones externas), y la selección del tratamiento antimicrobiano.

La microbiología agrícola estudia los procesos microbianos útiles para el crecimiento de las plantas, además de las enfermedades de las plantas causadas por hongos, bacterias, virus, viroides entre otros.

La microbiología Sanitaria desarrolla procesos de ingeniería a gran escala para el tratamiento de residuos.

La microbiología del agua potable investiga y aplica métodos para eliminar las bacterias patógenas en redes de agua.

Igualmente gracias al estudio de los microorganismos, en la actualidad, se han desarrollado otras ramas de la Biología, como son la Genética Microbiana, la Ingeniería genética y la Biotecnología.

La genética microbiana estudia la función de los genes, su expresión y regulación.

La Ingeniería genética con importante aplicación tanto en la en la parte clínica y en la agricultura. Mediante técnicas de ADN recombinante se han producido proteínas como la insulina, la hormona del crecimiento, el interferón, el factor VIII de coagulación, las beta endorfinas que suprimen el dolor, vacunas contra microorganismos causantes de enfermedades

La biotecnología microbiana se conoce como el manejo, modificación genética y propagación de microorganismos vivos mediante el uso de tecnologías como el cultivo de tejidos y la ingeniería genética, que dan como resultado la obtención de microorganismos nuevos o mejorados.

Otra de las grandes aplicaciones y sobre todo de interés para el curso, corresponde a la microbiología de alimentos, que se encarga de estudiar los microorganismos como transformadores de alimentos y como agentes de deterioro de alimentos. En el primer caso selecciona, mantiene y mejora microorganismos útiles en la generación de productos alimenticios, con nuevas características sensoriales: texturas, olores o sabores. En el segundo caso se encarga de

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desarrollar mecanismos para prevenir y controlar el contacto de ciertos microorganismos con los alimentos. Esta área de la microbiología se fundamenta en el hecho que los microorganismos producen cambios útiles y nocivos en los alimentos. La elaboración de muchos productos sería imposible sin la participación de los microorganismos, por ejemplo: la cerveza, el pan, el queso, entre otros. Los ácidos producidos por algunos microorganismos evitan, en ciertos alimentos, la actividad microbiana molesta o no conveniente, por ejemplo en: encurtidos y leches fermentadas. En cuanto a la descomposición de los alimentos, por acción de los microorganismos, los ejemplos los encontramos permanentemente en la vida diaria. Lección 4. Entidades de Referencia

Se entiende por entidades de referencia aquellas instituciones que debido a sus objetivos, condiciones técnicas, operativas y de investigación se convierten en referentes o puntos de apoyo para una determinada área de trabajo, en este caso el área de alimentos. Dentro de estas entidades encontramos:

INVIMA (Instituto Nacional de Vigilancia de Medicam entos y Alimentos)

Es un establecimiento público del orden nacional, de carácter científico y tecnológico, con personería jurídica, autonomía administrativa y patrimonio independiente, perteneciente al Sistema de Salud, adscrito al Ministerio de la Protección Social y con sujeción a las disposiciones generales que regulan su funcionamiento.

Sus objetivos y jurisdicción son los siguientes:

- Ejecutar las políticas formuladas por el Ministerio de la Protección Social en materia de vigilancia sanitaria y de control de calidad de: medicamentos, productos biológicos, alimentos, bebidas alcohólicas, cosméticos, dispositivos, elementos médico-quirúrgicos, odontológicos, productos naturales, homeopáticos y los generados por biotecnología, reactivos de diagnóstico y otros que puedan tener impacto en la salud individual y colectiva. - Actuar como institución de referencia nacional y promover el desarrollo científico y tecnológico referido a los productos descritos en el artículo anteriormente señalado.

El INVIMA tiene jurisdicción en todo el territorio nacional; el domicilio y sede de sus órganos administrativos principales está en la ciudad de Bogotá D.C. Esta entidad es un referente importante en cuanto a la normatividad colombiana de medicamentos y alimentos.

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ICONTEC (Instituto Colombiano de Normas Técnicas Co lombianas)

Esta institución es una Entidad reconocida por el Gobierno Nacional cuya función principal es la elaboración, adopción y publicación de las normas técnicas nacionales y la adopción como tales, de las normas elaboradas por otros entes. Según el decreto 2269 de 1993, por el cual se reglamenta el sistema nacional de normalización, certificación y metrología, se define la norma técnica como el documento establecido por consenso y aprobado por un organismo reconocido, que suministra, para uso común y repetido, reglas, directrices y características para las actividades o sus resultados, encaminados al logro óptimo de orden en un contexto dado. Las normas técnicas se deben basar en los resultados consolidados de la ciencia, la tecnología y la experiencia y sus objetivos deben estar enfocados hacía el beneficio común para la comunidad. En el área de alimentos, las normas técnicas colombianas indican las condiciones organolépticas y físico-químicas del producto, las técnicas recomendadas para la identificación de microorganismos y las especificaciones relacionadas con el empaque, entre otros.

CODEX ALIMENTARIUS El Codex Alimentarius es una entidad de referencia a nivel mundial sobre el manejo y cuidado de los alimentos. Dicha institución agrupa un conjunto de normas, códigos de prácticas, directrices, y otras recomendaciones, relacionados todos con el manejo adecuado de los alimentos. Algunos de estos textos son muy generales y otros muy específicos. Algunos contienen requisitos detallados sobre un alimento o grupos de alimentos; otros tienen por objeto el funcionamiento y la gestión de procesos de producción o el funcionamiento de sistemas de reglamentación pública de la inocuidad de los alimentos y la protección de los consumidores.

El INVIMA fue creado en 1995 y una de sus principales funciones es la de emitir la normatividad relacionada con los medicamentos y alimentos, a nivel nacional.

El ICONTEC además de ser la entidad encargada de promover las Normas Técnicas Colombianas (NTC), también es un organismo de certificación, reconocido a nivel internacional.

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El nombre del Codex Alimentarius actual deriva del código austríaco. En el Imperio austrohúngaro, entre 1897 y 1922, se elaboró una colección de normas y descripciones de productos para una gran variedad de alimentos bajo el título de Codees Alimentarius Austriacus. Aunque carecía de fuerza jurídica, fue utilizado como referencia por los tribunales con el fin de determinar normas de identificación para ciertos alimentos. El 11º período de sesiones de la Conferencia de la FAO en 1961 y la 16ª Asamblea Mundial de la Salud (OMS) en 1963 aprobaron las resoluciones por las que se establecía la Comisión del Codex Alimentarius. Los dos órganos adoptaron también los Estatutos y el Reglamento de la Comisión. La FAO y la OMS ayudan a los países en desarrollo a aplicar las normas del Codex y a reforzar los sistemas nacionales de control alimentario así como a aprovechar las oportunidades del comercio internacional de alimentos. Una de las contribuciones más importantes de la FAO y la OMS a la labor de la Comisión es el asesoramiento científico, en especial la evaluación de riesgos, prestado por comités y consultas de expertos. Normalmente la Comisión del Codex se reúne cada dos años, alternativamente en la Sede de la FAO y en la Sede de la OMS en Ginebra. En el 2005, la Comisión estaba integrada por 171 países, que representaban el 98 por ciento de la población mundial. El creciente interés mundial por todas las actividades del Codex indica claramente la aceptación en todo el mundo de los conceptos del Codex, que se refieren a la armonización, la protección de los consumidores y la facilitación del comercio internacional.

¿Cuál fue la principal contribución de Leeuwenhoek a la microbiología? ¿Qué son las técnicas asépticas y de qué modo contribuyó Pasteur a su impulso? ¿En qué se diferencian la virología, la bacteriología y la parasitología? ¿Qué utilidad práctica tiene el conocimiento de las entidades de referencia en el área de alimentos?

El Codex Alimenticius es un organismo de orden internacional cuya normatividad sirve de base para las diferentes legislaciones alimenticias en los países miembros.

Infovideo del Codex Alimenticius que explica la organización, desempeño y objetivos de este organismo.

Preguntas de repaso

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Para qué sirve la microbiología? El manejo genético de los microorganismos ha permitido que estos se conviertan en una herramienta muy útil dentro de la biotecnología. Hasta principios de los 80´s se utilizaba insulina, extraída del páncreas de vacas y cerdos, para el manejo de los diabéticos. Actualmente se produce la insulina a partir de bacterias que han sido modificadas genéticamente para este fin. Lo primero que se realizó fue la construcción de genes sintéticos para cada una de las dos cadenas de polipeptídos que forman la molécula de la insulina. Luego esto genes se insertaron en un plasmido-vector junto con el gen que sintetizaba la enzima β-galactosidasa, y que serviría de marcador. Finalmente se obtuvieron los dos polipeptídos de las bacterias, separados por la β-galactosidasa y unidos por métodos químicos para formar la insulina humana8 . Capítulo 2 Diversidad microbiana

El concepto de diversidad microbiana se refiere al hecho de la increíble variedad de microorganismos y su importancia ecológica en el mantenimiento del equilibrio del ambiente, sin que por ello se excluya el hecho que también son agentes causales de enfermedades tanto en plantas como animales y por supuesto el hombre. Por lo tanto, es importante conocer las características morfológicas y funcionales de los distintos grupos de microorganismos (virus, priones, bacterias y hongos) de manera que sea más fácil su identificación y su estudio en aplicaciones industriales y de alimentos.

Además esta amplia variedad microbiana ha llevado a que la microbiología se especialice en áreas como la virología (ciencia que estudia los virus), la parasitología (ciencia que estudia los helmintos), la micología (ciencia que estudia los hongos) y la bacteriología (ciencia que estudia las bacterias).

Las lecciones que se encuentran en este capítulo son:

Lección 5. Introducción

8 Tortora, G.J. y col. 2007. Introducción a la microbiología. Edit. Médica Panamericana. 9ª. Edición. Buenos Aires.p266.

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Lección 6. Microorganismos acelulares: Virus.

Lección 7. Otros microorganismos acelulares: Viroides y Priones.

Lección 8. Microorganismos celulares procaríoticos: Bacterias.

Lección 9. Microorganismos celulares eucaríoticos: Hongos, Protozoos y Helmintos.

Lección 10. Otros microorganismos de interés alimenticio: Cianobacterias y

Microalgas.

Lección 5. Introducción

Los microorganismos son los seres más numerosos que habitan en todas las regiones del planeta: suelo, aire, agua, hielo, rocas, cuerpo del hombre y de los animales, en plantas, alimentos. Sin ellos nuestro planeta no podría sobrevivir. La mayoría son de tamaño microscópico, aunque los hay visibles a simple vista como es el caso de algunos hongos y algas.

A excepción de los virus, los microorganismos pueden existir como células individuales o como colonias de células. Una célula microbiana puede realizar de forma independiente todos los procesos metabólicos necesarios para vivir. De acuerdo con su estructura celular los microorganismos pueden ser procariotas y eucariotas. Dentro de los procariotas se encuentran las bacterias: eubacterias y arqueas, microorganismos unicelulares. Dentro de los eucariotas se agrupan: los hongos filamentosos pluricelulares de mayor tamaño y las levaduras unicelulares pertenecientes al reino Fungi, las algas (rojas, diatomeas y verdes) y los protozoos pertenecientes al reino protista. También encontramos microorganismos acelulares de tamaño submicroscópico como son los virus, viroides, virusoides y priones.

Los microorganismos pueden ser: parásitos cuando son agentes causantes de enfermedades, simbiontes cuando son habitantes de la flora normal de la piel, cavidades y tracto digestivo del hombre y de los animales y saprofitas la gran mayoría, ayudando a la descomposición de la materia orgánica muerta. También son benéficos cuando se utilizan en medicina, en la industria y en el control de la contaminación. El papel de los microorganismos en el mantenimiento de los ecosistemas es de vital importancia, ya que son los responsables del reciclamiento de la materia. En los ciclos biogeoquímicos, todos los ecosistemas terrestres y acuáticos dependen de los microorganismos para sostener sus requerimientos nutricionales.

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Las bacterias pueden vivir como parásitos afectando los organismos donde habitan, como simbiontes formando parte de la flora bacteriana normal de la piel, cavidades y tracto digestivo del hombre y de los animales y saprofitas la gran mayoría, ayudando a la descomposición de la materia orgánica muerta.

Lección 6. Microorganismos acelulares: Los Virus Características de los virus

Los virus se encuentran en todos los lugares: aire, agua, suelo, en todos los materiales y no como estructuras aisladas, sino parasitando las células de bacterias, hongos, plantas, animales y el hombre.

Son organismos submicroscópicos (observables solo a través del microscopio electrónico), de forma variable, pueden ser alargados, en forma de de óvalos puntiagudos o de ladrillos con las esquinas redondas, otros son poliédricos, icosaédricos (polígono de 20 lados), otros tienen apariencia de cuerdas con bucles, otros como los bacteriófagos que atacan a las bacterias, tienen forma más compleja su estructura presenta cabeza y cola (Figura 4).

Figura 4. Microfotografías de Adenovirus Fuente: http://www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BioBookDiversity_1.htm

Organización y composición de los Virus

Los virus contienen solamente un tipo de ácido nucleico que puede ser: ADN (ácido desoxirribonucleico) o ARN (ácido ribonucleico). El ácido nucleíco está rodeado por una cubierta de proteína denominada cápside viral, la cual tiene como función proteger el ácido nucleico vírico de la acción de las nucleasas presentes en los líquidos biológicos, además de propiciar la unión del virus con los receptores de la célula a infectar. La cápside a su vez está constituida por fragmentos de proteínas llamadas cápsomeros y constituye la mayor parte de la

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masa del virus. La cápside y el ácido nucleíco se denominan: nucleocápside. Algunos tipos de virus, poseen una envoltura externa que envuelve la cápside y que está constituida por lípidos y proteínas. La envoltura tiene su origen en la membrana de la célula infectada y es tomada en el momento en que el virus abandona la célula. La presencia de lípidos en la envoltura hace que los virus sean sensibles a disolventes de grasa como el éter. A esta estructura completa se la denomina partícula vírica o virión.

Los virus por ser organismos acelulares, carecen de ribosomas, de sistemas productores de energía (ATP) y de sistemas enzimáticos, elementos necesarios para realizar sus procesos metabólicos de manera independiente, como son su crecimiento y replicación. Por esto, el genoma viral utiliza el metabolismo de la célula hospedadora, constituyéndose los virus en parásitos intracelulares obligados, motivo por el cual se les sitúa en el límite entre lo vivo y lo no vivo. Los virus tienen especificidad por el tipo de célula a infectar, es decir un virus puede infectar una célula vegetal pero no una animal y solamente un tipo de célula dentro del organismo animal o vegetal. Mecanismos de acción Los virus pueden actuar de dos formas distintas: - Como agentes infecciosos productores de enfermedades en el hombre, las plantas y los animales. Se reproducen en el interior de las células que infectan, de donde obtienen todo el material y los mecanismos requeridos para su replicación. Al no poseer metabolismo propio son insensibles a los antibióticos y a otros fármacos que actúan sobre las vías metabólicas, siendo en su mayoría susceptibles al interferón. - Como agentes genéticos que modifican el material hereditario de las células que infectan, al unirse a su material genético y causar variabilidad genética, un ejemplo es la acción de los bacteriófagos (virus que infectan a las bacterias).

Ciclo vital de los virus o mecanismo de replicació n lítico

Infovideo de Enciclopedia Planeta sobre los componentes básicos de los virus.

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El ciclo vital de los virus consta de las siguientes cuatro fases: entrada en la célula, eclipse, multiplicación y liberación del virus. Veremos primero el ciclo vital de un virus, explicado de la forma más general posible, para pasar a continuación a estudiar las diversas modalidades que pueden presentarse en cada una de las fases del ciclo.

1. Entrada

La entrada en la célula consta a su vez de dos etapas: la adsorción o fijación del virus en la superficie celular y la penetración a través de la membrana.

En la fase de fijación, el virus se une a la membrana de la célula hospedadora de forma estable. Hay una alta especificidad en la fijación de un virus a la membrana de su célula hospedadora, porque se ha de producir la unión entre proteínas especificas de la cápside vírica y glicoproteínas de la membrana plasmática de la célula que lo hospeda. Cada virus ha ido adquiriendo sitios de unión específicos, para anclarse en la membrana de un determinado tipo de célula. La penetración o inyección, a través de la membrana, sigue diversas modalidades. Como resultado, bien el virus completo, bien solamente su ácido nucleico, logra invadir el citoplasma celular. Por regla general, se necesita el concurso de muchos virus para que alguno de ellos logre penetrar en la célula.

2. Eclipse

La fase de eclipse corresponde a un tiempo, después de la penetración, en que el virus parece desaparecer, pues no se advierte ningún indicio de su presencia ni de su actividad. Lo que ocurre en esta fase es que se da un desensamblaje de las piezas del virus (si es que ha penetrado completo), y su ácido nucleico queda asimilado en las estructuras celulares aptas para los procesos de replicación y trascripción. Esta fase, es variable de unos tipos de virus a otros. Durante esta fase se produce la síntesis del ARN, necesario para generar las copias de proteínas de la cápside. También se produce la continua formación de ácidos nucleicos virales. Termina con la síntesis de los ARNm necesarios para que se sinteticen las proteínas que actuarán en la multiplicación del virus.

Si el ácido nucleico del virus es ADN, este se inserta en el ADN de la célula hospedera y de esta manera el virus logra que la célula hospedera fabrique las proteínas víricas. El ácido nucleico viral se replica en la célula que parásita utilizando las enzimas, el material y los mecanismos de la célula que lo hospeda. Si el ácido nucleico del virus es ARN, el virus debe primero cambiar su ARN en ADN, empleando la maquinaria de la célula hospedera para poder insertarse y

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enzimas como la transcriptasa reversa. Luego, la célula hospedera fabrica las proteínas víricas y el ácido nucleico viral se replica en la célula que parásita utilizando las enzimas, el material y los mecanismos de la célula que hospeda.

3. Replicación y ensamblaje

La replicación del virus consiste tanto en la replicación de su ácido nucleico como en la síntesis de las proteínas de la cápside. Los ácidos nucleicos y las proteínas recién sintetizadas, se ensamblan rápidamente, produciéndose nuevas partículas víricas. En esta fase se produce la unión de los capsómeros para formar la cápside y el empaquetamiento del ácido nucleico viral dentro de ella.

4. Liberación y Lisis

La liberación del virus consiste en la salida de las nuevas partículas víricas o viriones, que podrán infectar nuevas células iniciando un nuevo ciclo. Los viriones salen de la célula, mediante la lisis o ruptura enzimática de la pared bacteriana que conlleva a la muerte celular. Los nuevos virus se encuentran en situación de infectar una nueva célula.

Modalidades de penetración en la célula

Los virus sin envoltura lipídica se introducen en la célula con cápside y todo, lo cual puede realizarse de dos maneras:

- Por penetración directa, donde después de la fijación, el virus abre una brecha en la membrana y se introduce en el citoplasma.

- Por endocitosis, la membrana forma una invaginación en torno al virus, llegando a formar una vesícula que penetra en la célula. Formada la vesícula, el virus abre una brecha en la membrana de la misma con ayuda de algunas enzimas hidrolíticas que él mismo transporta, penetrando así en el citoplasma.

Los virus con envoltura lipídica burlan la barrera de la membrana celular porque su cubierta lipídica se funde con la membrana, ya que tienen la misma naturaleza. Esta fusión de membranas puede realizarse en dos lugares distintos:

- Fusión en la superficie celular, de manera que el virión penetra directamente en el citoplasma.

- Fusión con un lisosoma, por lo que se forma una vesícula por endocitosis, a la que se une un lisosoma para digerir la partícula introducida; entonces, la

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cubierta lipídica del virus se funde con la membrana del lisosoma y el virión escapa hacia el citoplasma.

Modalidades de fase de eclipse Según la duración de la fase de eclipse, se suelen distinguir dos modalidades de ciclo infeccioso de un virus:

- Ciclo ordinario : el ácido nucleico vírico procede inmediatamente a la transcripción de su mensaje genético en los ARNm necesarios para su multiplicación, y prosigue rápidamente el ciclo vital. Este tipo de ciclo es el más extendido en la naturaleza.

- Ciclo lisogénico : Ocurre en los bacteriófagos. El ADN vírico se cierra por sus extremos generando un ADN circular. Este ADN se inserta en el ADN bacteriano en un lugar específico en el que la secuencia de nucleótidos bacterianos es semejante a alguna región del ADN vírico (Figura 5).

En el ciclo lisogénico, la bacteria prosigue sus funciones vitales sin que el virus realice ninguna acción, y cuando el ADN bacteriano se duplica también lo hace el ADN vírico, de manera que el genoma del virus pasa a las dos bacterias hijas. La multiplicación bacteriana puede seguir durante generaciones sin que el virus se manifieste. Pero ante una alteración de las condiciones ambientales, el ADN vírico se separa del bacteriano y prosigue entonces las restantes fases de ciclo infeccioso, produciendo la muerte de la bacteria y nuevos ejemplares del virus (Figura 6).

Figura 5. Representación esquemática de un virus bacteriófago. Fuente: Carmen Eugenia Piña

Figura 6. Representación esquemática de bacteriófag o infectando una bacteria. Fuente: Carmen Eugenia Piña

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Modalidades de multiplicación del virus

La multiplicación del virus consta de la replicación de su material genético, de la transcripción de su mensaje en una molécula de ARNm y de la traducción del mensaje para producir las proteínas víricas, tanto las que formarán parte de la cápside como las proteínas enzimáticas, necesarias para el ensamblaje de las piezas del virión. Los ribosomas y la mayor parte de las enzimas que los ácidos nucleicos víricos utilizan en estos procesos son los de la célula infectada.

Posteriormente a estos procesos, tiene lugar el ensamblaje de las piezas del virus para construir nuevos viriones.

Modalidades de liberación de los nuevos virus

Después del ensamblaje del virus tiene lugar la liberación de los nuevos individuos, que tendrán la capacidad de infectar nuevas células. Las principales modalidades de liberación de los virus dan nombre a nuevas variantes de su ciclo vital:

Ciclo lítico y lisogénico

Estos dos ciclos configuran las etapas reproductoras de un virus bacteriófago. En referencia al ciclo lítico, éste se inicia con el anclaje del cuerpo vírico a la superficie de la bacteria y la posterior inyección de parte de su material genético en el interior de la bacteria. El paso posterior es el aprovechamiento del medio interno de la bacteria para sintetizar más virus a partir de componentes citoplasmáticos, tales como proteínas. Cuando se han fabricado los suficientes cuerpos víricos, la bacteria se lisa (rompe) y se liberan.

En cuanto al ciclo lisogénico, el proceso se inicia con la inyección del material genético del virus en la bacteria, del mismo modo que en el proceso anteriormente expuesto; los filamentos de ADN inyectados a presión del cuerpo vírico se combinan con el material genético de la bacteria, denominándose éste proceso Recombinación Génica. Dicha combinación da como resultado una secuencia de nucleótidos bacteriana y vírica, con la cual se sintetizan nuevos virus. Éste ciclo puede dar a su vez un nuevo ciclo lítico.

Los nuevos virus no esperan a la muerte de la célula hospedadora para abandonarla, sino que van saliendo de la célula al mismo tiempo que se van produciendo, de manera que la célula puede seguir viva y produciendo nuevas partículas víricas. La liberación puede hacerse de dos maneras:

- Los virus sin envoltura lipoproteica salen directamente, sin arrastrar ningún resto de la membrana plasmática, bien sea abriendo una brecha en la

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membrana, o bien aprovechando los mecanismos de exocitosis o salida de sustancias al exterior de la célula.

- Los virus con envoltura lipoproteica salen por gemación, es decir, se rodean de una porción de membrana plasmática que acaba separándose de la célula y constituye la cubierta lipoproteica del nuevo virus.

Lección 7. Otros microorganismos acelulares: Viroides y Prione s.

Los Viroides son moléculas de ARN circular que carecen de cubierta viral o cápside, son de tamaño menor que los virus. Su ARN está formado por muy pocas bases nitrogenadas (246-399) que guarda la información para su propia síntesis en un hospedador adecuado al que causa, frecuentemente, una alteración patológica. Atacan principalmente células vegetales causando enfermedades. Debido a que los viroides no codifican para ninguna proteína deben necesariamente reclutar proteínas y vías metabólicas de la célula hospedera para completar su ciclo infeccioso. Se les considera como la etapa primitiva de los virus. Algunos producen enfermedades en plantas, como la papa, el pepino, el tomate, la naranja, la vid, el coco, entre otros, causando importantes pérdidas económicas. Los Priones se definen como partículas proteícas infecciosas y son causantes de un grupo de enfermedades neurodegenerativas que tienen características comunes, como presentar un período de incubación bastante largo (usualmente varios meses o años, incluso décadas), luego del cual aparecen síntomas neurológicos progresivos que llevan a la muerte del individuo infectado9.

La proteína causante de este tipo de enfermedades se conoce como Proteína príonica scrapie (PrPsc) y es idéntica, en cuanto a la secuencia de aminoácidos, a una proteína sintetizada por el huésped, PrPc, pero que difiere en su estructura secundaria y terciaria, es decir, en la forma como se organiza en el espacio.

El cambio de configuración de la proteína del prión es crucial, ya que las proteínas con láminas beta son muy resistentes a las enzimas proteolíticas, al calor y no se disuelven en agua. Pero sobre todo, la proteína alterada tiene una característica

9 McEwen,J.G. 1994. Los priones. Innovación y ciencia. Vol.III.No.4. 39-42p.

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única: interacciona con una molécula de proteína normal, le cambia la conformación y la hace capaz de transformar las estructuras de más proteínas normales. Ahí radica al parecer, el poder infectivo de los priones.

Un ejemplo de una enfermedad príonica, es la Encefalopatía espongiforme bovina (EEB), que ataca el ganado bovino y que se conoce con el nombre común de la “enfermedad de las vacas locas”, debido a la descoordinación motora de los animales y puede ser transmitida al hombre a partir de la carne infectada.

Lección 8. Microorganismos celulares procaríoticos: Bacterias.

Estructuras de las bacterias

La estructura bacteriana se divide en dos grupos: la estructura externa, que no se encuentra en todas las células y participa en funciones especializadas; y la estructura interna que se encuentra en todas las células procariotas y es probablemente esencial para su supervivencia. Dentro de las estructuras externas se encuentran: la pared celular, los flagelos, las esporas, las fimbrias o pelos y la cápsula. Estas estructuras no siempre se encuentran en todas las bacterias, razón por la cual se estima que no son esenciales. Estructuras externas - Pared celular Es una estructura rígida, se encuentra rodeando la membrana citoplasmática de casi todas las bacterias, posee una gran rigidez lo cual le confiere gran resistencia. Se considera esencial para el desarrollo y división bacteriana; cumple con dos

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funciones importantes: mantener la forma de la célula y evitar que la célula colapse debido a las diferencias de presión osmótica por el constante intercambio de fluidos. El grosor de la pared oscila entre de 10 y 80 nanómetros. La pared celular constituye una porción apreciable del peso seco total de la célula; dependiendo de la especie y de las condiciones de cultivo puede representar del 10 al 40 % del peso seco del organismo. La pared celular en las bacterias, se encuentra formada básicamente por peptidoglicano (molécula formada por proteínas y carbohidratos o azúcares). La coloración de Gram, permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias: las Gram positivas y Gram negativas. Las primeras tienen una pared celular más gruesa que las segundas, lo que permite diferenciarlas en el momento de la coloración.

- Membrana plasmática La membrana plasmática, en las bacterias, presenta invaginaciones hacia el citoplasma llamados mesosomas, que contienen enzimas que participan en la duplicación del ADN. También en la membrana plasmática, se localizan enzimas que intervienen en la producción de energía (ATP), función que en la célula eucariótica cumple la mitocondria.

- Flagelos

Los flagelos están presentes en la mayoría de bacterias, generalmente son rígidos, implantados en la membrana celular mediante un corpúsculo basal.

Curso de Microbiología general, licenciatura de Biología, de la Universidad de Granada, donde explica en detalle la composición de la pared celular en organismos procaríoticos.

Curso de Microbiología general, licenciatura de Biología, de la Universidad de Granada, donde explica en detalle la composición de la membrana plasmática y su funcionamiento.

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Permiten a la mayoría de bacterias la movilidad en medios líquidos. La movilidad, o sea, el movimiento de traslación de un punto a otro en forma rápida y de zig zag permite a las bacterias responder, por ejemplo, a estímulos químicos cuando las bacterias son atraídas a determinados compuestos como la glucosa, la galactosa (quimiotactismo positivo) o por el contrario huyen de algunos compuestos como los antibióticos (quimiotactismo negativo).

La movilidad debe distinguirse del movimiento pasivo de las bacterias en una sola dirección como consecuencia de las corrientes en la preparación, o del movimiento Browniano que es la constante vibración de las bacterias en un punto fijo, comportamiento que se presenta por estar suspendidas en medio líquido y por su pequeño tamaño.

- Fimbrias

Son muy numerosas y cortas. No tienen función de motilidad y se encuentran relacionadas con diversas funciones como la de permitir la adherencia a las superficies de tejidos, ser sitios de adsorción para virus bacterianos y además pueden servir como pelos sexuales para el paso de ADN de una célula a otra.

- Cápsula Es una estructura de material viscoso que rodea la pared celular de muchas bacterias que se encuentran en su ambiente natural. No cumple ninguna función metabólica pero sirve a las bacterias para adherirse a sus sustratos o para la formación de colonias mediante la adhesión de bacterias hermanas. Cuando una bacteria encapsulada invade a un huésped, la cápsula evita que los mecanismos de defensa del huésped destruyan la bacteria.

Estructuras internas

- El Citoplasma

Curso de Microbiología general, licenciatura de Biología, de la Universidad de Granada, donde explica en detalle los organélos que le permiten el movimiento a la bacteria.

Curso de Microbiología general, licenciatura de Biología, de la Universidad de Granada, donde explica en detalle las estructuras superficiales de las bacterias, como por ejemplo, la cápsula

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Se encuentra delimitado por la membrana celular y presenta un aspecto viscoso constituido por agua y sustancias como iones, proteínas, enzimas, lípidos, carbohidratos. En él se encuentran: materiales de reserva, ARN, ribosomas, un nucleoide que se ubica en la zona central. En algunas bacterias se encuentran dispersos, por el citoplasma, fragmentos circulares de ADN con información genética, llamados plásmidos. En bacterias fotosintéticas se encuentran los pigmentos fotosintéticos. En el citoplasma se realizan los procesos metabólicos de la célula bacteriana.

- Los ribosomas

Son organelos con apariencia de gránulos y que se hallan dispersos en el citoplasma bacteriano. Algunos se agrupan en cadena y se les denomina polirribosomas; están compuestos por ácido ribonucleico - ARN (60%) y proteína (40%). Su función es la síntesis de proteína.

- La región nuclear

Está localizada hacia el centro en la célula y se compone principalmente de ADN aunque también puede encontrarse ARN y proteínas asociadas a éste. El ADN está dispuesto en un cromosoma largo y circular, algunas veces llamado nucleoide, genóforo o cuerpo cromatínico.

- Los mesosomas

Son repliegues y extensiones de la membrana citoplasmática que intervienen en procesos metabólicos y de reproducción de la célula bacteriana.

- Los cuerpos de inclusión

También llamados gránulos y que corresponden a materiales de reserva como lípidos, hierro, azufre que se almacenan en el citoplasma, en los períodos de suficiente aporte nutricional para ser utilizados en épocas de inanición.

- Los plásmidos Son pequeñas moléculas circulares de ADN extracromosómico que se encuentran en la región nuclear de algunas bacterias. Las moléculas de ADN plásmico, a pesar de encontrarse fuera del cromosoma, toman una conformación de doble hélice al igual que el ADN de los cromosomas.

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Los plásmidos se replican de manera independiente al cromosoma y contienen información genética adicional a la contenida en el nucleoide y que le es útil a la bacteria para su supervivencia, en condiciones desfavorables. Por ejemplo, transmite el código que hace resistentes a las bacterias frente a los antibióticos, la capacidad de apareamiento, la resistencia y tolerancia a los materiales tóxicos.

Los plásmidos son muy utilizados en ingeniería genética, ya que por su tamaño resulta fácil manipularlos; se pueden aislar, introducir en ellos información y llevarlos a otras células bacterianas viables, en las cuales se expresa la “nueva” información que ellos portan.

- Las vesículas

Se encuentran en ciertas bacterias que habitan sistemas acuáticos y que les sirven para flotar, contrarrestando la atracción gravitatoria y así lograr el óptimo de luz.

- Endosporas

Son estructuras generalmente de forma esférica que se forman en ciertas bacterias Gram positivas (casi siempre bacilos), como respuesta a condiciones ambientales adversas (poca humedad, temperaturas extremas, agentes químicos y físicos etc.). Cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables la endospora se transforma de nuevo a la forma vegetativa. Las esporas bacterianas debido a su amplia difusión en la naturaleza y su tolerancia a la sequedad o a otros agentes letales, se encuentran habitualmente en las especias, granos de cereales, frutos secos, harina, almidones y leche en polvo10.

Reproducción de bacterias

La mayoría de bacterias se reproducen asexualmente por fisión binaria o bipartición. Algunas especies de bacterias filamentosas se reproducen por esporas

10 Yousef, A and Carlstrom, C. 2006. Microbiología de los alimentos. Manual de Laboratorio. Edit. Acribia. Zaragoza. España. p.52.

Curso de Microbiología general, licenciatura de Biología, de la Universidad de Granada, donde explica en detalle los diferentes organelos que se encuentran en el citoplasma bacteriano.

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que se forman en los extremos de los filamentos. Durante la bipartición, la célula bacteriana da origen a dos células idénticas a la original o clones. El resultado de la fisión binaria son dos células hijas por cada célula madre, así, una célula se divide en dos, dos en cuatro, cuatro en ocho y así sucesivamente. La síntesis de la pared, el crecimiento bacteriano y la duplicación del ADN regulan la división celular. Este mecanismo de división celular es más rápido y menos organizado que la mitosis y la meiosis.

El proceso de división ocurre en tres fases principales:

1. Elongación o alargamiento de la célula y duplicación del material genético o

ADN, 2. Separación de ADN dentro de las células hijas formadas y

3. La citocinesis o separación celular.

El proceso de bipartición se inicia con el alargamiento de la célula bacteriana y la duplicación del ADN, luego en el centro de la bacteria, la pared celular y la membrana plasmática se invaginan con la consecuente formación de un tabique transversal o mesosoma que divide la célula bacteriana en dos y separa las dos regiones de ADN cromosómico. La separación de las dos células va acompañada de la segregación en cada una de ellas de uno de los dos genomas que provienen de la duplicación del ADN original (Figura 8).

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Figura 8. Representación de la reproducción de una bacteria Fuente: Carmen Eugenia Piña López

Intercambios genéticos en bacterias

Sin embargo en algunas bacterias ocurren intercambios genéticos, es decir, intercambio de genes, como resultado de tres mecanismos: transformación, conjugación, transducción e intercambio de plásmidos:

Transformación

Consiste en el intercambio genético producido cuando una bacteria es capaz de captar fragmentos de ADN, de otra bacteria que se encuentran dispersos en el medio donde vive.

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Conjugación

En este proceso, una bacteria donadora, denominada F+, transmite a través de un puente o pili sexual, un fragmento de ADN, a otra bacteria receptora, denominada F-. La bacteria que se llama F+ posee un plásmido, además del cromosoma bacteriano.

Transducción

En este caso la transferencia de ADN de una bacteria a otra, se realiza a través de un virus bacteriófago, que se comporta como un vector intermediario entre las dos bacterias.

Fuente: Módulo Microbiología. UNAD. Carmen Piña

Clasificación de las Bacterias - Por su forma y agrupación

Los modelos de agrupamiento celular de las bacterias son característicos de especies definidas y se utiliza como uno de los criterios de clasificación. Cuando las células microbianas, como los cocos, se dividen pueden permanecer unidas unas con otras, formando arreglos característicos y que se denominan colonias. Los bacilos se dividen únicamente en un plano, pero en algunas ocasiones pueden encontrarse células unidas por los extremos o por los lados debido a la etapa del desarrollo en que se encuentren o a las condiciones del cultivo. Las bacterias en espiral generalmente no se agrupan, crecen individuales y aisladas. En la siguiente tabla se resumen algunos de los aspectos fundamentales en la clasificación de las bacterias:

Por forma Por ordenamiento Representación

Por composición de la pared celular que

reacciona a la tinción de Gram

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Coco único o micrococo Cuando los cocos se dividen en

un solo plano vertical, se separan y conservan su

individualidad.

Diplococo cuando las células hijas se presentan en parejas

Estreptococo en cadena

Cuando las células hijas forman cadenas

Estafilococo las células permanecen unidas pero

después de una división celular en dos o más planos y los cocos

forman grupos irregulares en ocasiones de gran volumen similares a racimos de uvas.

Sarcina grupo de ocho cocos La división celular se produce formando paquetes de ocho

células

Coco (esférico)

Tetracoco La división celular se produce en dos o tres planos

perpendiculares formando grupos de cuatro células.

Espirilos En forma de espiral

Bacilos En forma de bastón

Gram negativas: no

retienen el cristal violeta, conservan el colorante rojo

por ejemplo safranina y son

susceptibles a las cefalosporinas.

Gram positivas: absorben y

conservan el colorante cristal

violeta, son susceptibles a la

penicilina y estreptomicina.

Tabla 1. Clasificación de bacterias según su morfol ogía. Fuente Carmen Eugenia Piña López.............

- Por su requerimiento de oxígeno

Otro aspecto a tener en cuenta, en la clasificación de bacterias, es la necesidad de oxígeno para sobrevivir. En este caso, las bacterias dependen en buena medida

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de la disponibilidad de las enzimas eliminadoras de peróxidos y superóxidos. En la siguiente tabla se encuentran los diferentes grupos de bacterias, de acuerdo a su requerimiento de oxígeno:

Aerobias estrictas Dependen exclusivamente del oxígeno para su crecimiento.

Anaerobias estrictas

Son bacterias que se desarrollan en ausencia total de oxígeno, utilizan aceptores finales distintos del oxígeno: CO2, H2 y N2, o poseen metabolismo estrictamente fermentativo.

Anaerobias Facultativas

Pueden desarrollarse en presencia o ausencia de oxígeno, aunque predominan en medios anaeróbicos.

Microaerófilas

Bacterias que sólo se pueden desarrollar en presencia de bajas tensiones de O2 (menos del 12%, en lugar del 20% que es la atmosférica) y altas tensiones de CO2.

Fuente: Módulo Microbiología. UNAD. Carmen Piña

- Por su óptimo de temperatura

Según la temperatura óptima de crecimiento, las bacterias se clasifican en:

Termófilas Bacterias que se desarrollan entre 25 y 80°C, óptima entre 50 y60°C.

Mesófilas Bacterias que se desarrollan entre 10 y 45°C, óptima entre 20 y 40°C.

Psicrófilas Bacterias que se desarrollan entre -5 y 30°C, óptima entre10 y 20°C.

Fuente: Módulo Microbiología. UNAD. Carmen Piña

- Según el pH en que se desarrollan

Según el pH de crecimiento, las bacterias se clasifican en:

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Acidófilas Bacterias que se desarrollan a pH entre 1.0 y 5.0.

Neutrófilas Bacterias que se desarrollan a pH entre 5.5 y 8.5.

Basófilas Bacterias que se desarrollan pH entre 9.0 y 10.0.

Fuente: Módulo Microbiología. UNAD. Carmen Piña

- Por su forma de nutrición

Según su metabolismo interno, las bacterias presentan requerimientos nutricionales diversos y se clasifican en:

Autótrofas quimiosintéticas o fotosintéticas

Las bacterias autótrofas fotosintéticas utilizan la luz del sol y el bióxido de carbono para fabricar su alimento. Las autótrofas quimiosintéticas utilizan compuestos inorgánicos, por ejemplo, el azufre para fabricar su alimento. Su fuente de energía es el CO2.

Heterótrofas

Bacterias que mediante la absorción pueden utilizar fuente de carbono orgánico para su alimentación.

Fuente: Módulo Microbiología. UNAD. Carmen Piña

Lección 9. Microorganismos celulares eucaríoticos: Hongos, Protozoos y Helmintos.

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Los Hongos

Introducción Los hongos pertenecen al dominio Eucarya o Eucariota, Reino Fungi. Presentan diferentes formas, desde microorganismos unicelulares de forma redonda u ovalada llamadas las levaduras hasta pluricelulares como los hongos filamentosos o mohos, que pueden formar largas cadenas de células. Su tamaño y complejidad son superiores al de las bacterias. Habitan en ambientes húmedos y oscuros, sobre el suelo, las frutas, el pan, el queso, las plantas, el cuerpo del hombre y de los animales, en el agua dulce y salada. Se desarrollan mejor en ambientes ligeramente ácidos (pH: 5).

La mayoría son aeróbicos aunque hay algunas especies facultativas. Su nutrición es heterótrofa, carecen de clorofila y adquieren su energía de compuestos orgánicos del suelo y del agua. Se considera que los hongos saprófitos juegan un papel importante en la degradación de la materia orgánica muerta, y en el aumento de la fertilidad del suelo.

Levaduras

Figura 9. Levaduras en gemación Fuente: Carmen Eugenia Piña

Las levaduras son hongos unicelulares de forma esférica, alargada u ovalada, presentan diferentes colores: blanco, rosado, beige o rojo. Su tamaño oscila entre 2,5 – 10 micras de ancho y 4,5 - 21 micras de largo. Son microorganismos anaerobios facultativos (Figura 9).

La levadura aeróbica produce dióxido de carbono, agua y más biomasa, mientras que la levadura anaerobia fermenta el azúcar en alcohol y dióxido de carbono y tiene un crecimiento más lento. La mayoría se reproducen asexualmente, por gemación. En este tipo de reproducción a la levadura-madre le brota un botón o yema. Al mismo tiempo que el botón aumenta de tamaño, el núcleo de la célula madre, mediante el proceso de mitosis, se divide en dos, transfiriéndole uno a la célula hija o botón. Poco a poco la yema se va desprendiendo de la levadura-madre, dando origen a una levadura hija, idéntica a la madre. Una levadura puede producir hasta 24 células hijas. Las levaduras también pueden reproducirse por fisión binaria. Algunas no separan la célula hija o gema y forman pseudomicelio, característica que se usa para identificar y clasificar la levadura. Por ejemplo, la Candida albicans.

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Las levaduras pueden habitar en el suelo, sobre las mucosas, en la superficie de vegetales. La mayoría son mesófilas, con una temperatura máxima de crecimiento entre 24 y 48ºC. Se encuentran en un rango amplio de pH el cual está comprendido entre 2,5 y 8. Son incapaces de moverse por lo que únicamente pueden ser arrastrados a través de corrientes de aire, en fluidos o por insectos.

En el sentido más estricto de la palabra, no existen levaduras patógenas por naturaleza; las que se relacionan con las enfermedades, tanto en el hombre como en los animales, son incapaces de producir infección en un individuo sano. Se deben presentar algunas alteraciones en las defensas celulares del huésped, en la fisiología o en la composición de la flora normal para que pueda producirse la colonización e infección por levaduras.

Hongos Pluricelulares o Mohos

Los hongos pluricelulares o mohos están formados por una serie de filamentos o tubos rígidos denominados hifas; dentro de las hifas se encuentra el citoplasma que contiene varios núcleos y organelos como: mitocondrias, ribosomas, vacuolas, aparato de Golgi, retículo endoplasmático y lisosomas. Las hifas pueden especializarse en estructuras denominadas Micelios. Existen dos tipos de micelio: - El micelio vegetativo que crece por toda la superficie del sustrato y tiene como función absorber los nutrientes necesarios para el hongo y fijar el hongo al sustrato. - El micelio aéreo o reproductor que produce las esporas sexuales y asexuales.

Las hifas pueden ser septadas, es decir, presentar tabiques transversales que separan las células o aseptadas (cenocíticas) con células multinucleadas (Figura 10).

Figura 10. Hifas septadas multinucleadas Fuente: Carmen Eugenia Piña Los hongos presentan una pared celular, compuesta de varias capas constituidas de estructuras amorfas como los mananos (polímeros ramificados de la manosa), los glucanos (polímeros de la glucosa) y por quitina, que es un polisacárido estructural que también se encuentra en el exoesqueleto de los artrópodos. La

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pared celular le da la rigidez al hongo y le permite la nutrición absortiva. Los hongos se pueden reproducir por procesos asexuales, sexuales o parasexuales. La forma de reproducción se constituye en un criterio para su clasificación. Los patógenos generalmente se reproducen de forma asexual, aunque algunas especies pueden tener reproducción sexual y asexual, dependiendo de las condiciones ambientales.

Reproducción asexual

Los hongos imperfectos se reproducen asexualmente de tres formas: por fragmentación o fisión y por la formación de esporas.

Fragmentación del micelio

Es una de las formas más sencillas de reproducción y consiste en la fragmentación, crecimiento y ramificación de las hifas para dar origen una nueva colonia. Este mecanismo se usa en los subcultivos de laboratorio.

Formación de esporas

Este tipo de reproducción puede ser de dos tipos: por doble fisión de las hifas, formando células unicelulares de forma cilíndrica llamadas artrosporas, las cuales se liberan cuando las hifas se separan para germinar en el medio adecuado; En el segundo tipo hay una fragmentación de las hifas que desarrollan esporas redondas cubiertas por paredes gruesas llamadas clamidosporas, resistentes a condiciones adversas como el calor y la desecación.

Fuente: Módulo Microbiología. UNAD. Carmen Piña

Tipos de esporas asexuales

Esporangiosporas

Son esporas que se producen dentro de de una envoltura denominada esporangio. En este tipo de reproducción el núcleo de la célula madre se divide en varios núcleos y cada uno toma una parte del citoplasma de la célula madre, que luego se rodea de una membrana celular. Al romperse el esporangio, las esporas salen y al caer en el sustrato adecuado dan origen a nuevas hifas (Figura 8). Ejemplo: Mucor o Rhizopus nigricans.

Animación del curso de Botánica, de la Universidad de Extremadura (España), donde se observa la formación y liberación de esporangiosporas en un hongo llamado Mucor.

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Conidiosporas

Son esporas desnudas que se forman en los extremos de las hifas mediante gemación. En este caso el micelio especializado se denomina conidióforo (Figura 11). Ejemplo: Aspergillus flavus.

Figura 11. Hongo del pan: Rhizopus nigricans modificado (Esporangiospora) Fuente: http://darwin.baruch.cuny.edu/bio1003/fungi.html

Conidios en Penicillium (Conidiospora)

Reproducción Sexual

La reproducción sexual es otra forma de reproducción de los hongos e implica la unión de 2 núcleos: uno donante y otro receptor, para formar un núcleo cigótico diploide, que por meiosis origina 4 núcleos haploides. A los hongos con reproducción sexual se los denomina perfectos. La reproducción sexual comprende 3 fases:

Plasmogamia Unión los dos protoplastos de las hifas y de los sus núcleos en una sola célula.

Cariogamia Fusión de los dos núcleos que se habían reunido en la plasmogamia.

Meiosis Se reduce el número de cromosomas, se forman gametos haploides.

Fuente: Módulo Microbiología. UNAD. Carmen Piña

Después de la fusión de los núcleos, de las dos células, que comparten el ADN y de ocurrida la meiosis, se forman las esporas con características heredadas de cada uno de sus progenitores. Cada espora tiene capacidad para desarrollar una nueva colonia.

Tipos de esporas Sexuales

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Ascosporas

Son unicelulares. Generalmente se desarrollan 4 a 8 dentro una célula denominada asca.

Basidiosporas

Son unicelulares. Se forman en estructuras llamadas basidios, en número de 4.

Zigosporas

Son de mayor tamaño, con pared celular gruesa y se desarrollan al fusionarse dos hifas sexualmente compatibles.

Oosporas

Se forman por la unión de dos células gaméticas, oogonio y anteridio En condiciones óptimas para la germinación, las oosporas dan origen al micelio y esporangios los cuales infectan las plantas.

Reproducción parasexual

La reproducción parasexual es un mecanismo raro de la naturaleza, en el que las hifas se unen, sin fusión nuclear posterior y da lugar a una célula con más de un núcleo funcional y de diferente procedencia genética. En algunas ocasiones pueden conjugarse los núcleos y aparecer un núcleo diploide heterocigótico. El hecho comprobado por primera vez fue en Aspergillus nidulans.

Los Protozoos

Características

Este tipo de microorganismos hace parte del Reino de los Protistos. Son organismos eucaríoticos, heterótrofos, móviles, incoloros, unicelulares, carecen de pared celular, algunos tienen vacuolas digestivas y excretoras, flagelos y cilios.

Se encuentran en su mayoría en medios acuáticos, aunque algunos son endoparásitos y otros ectoparásitos. Los protozoarios parásitos se pueden encontrar en sangre de humanos y animales y en líquidos tisulares de plantas. Algunos necesitan varios hospedadores para completar su ciclo de vida, presentando en cada uno de ellos una morfología, metabolismo y tipo de reproducción diferente.

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Figura 12. Paramecio

Fuente : Carmen Eugenia Piña López

Durante su ciclo de vida pueden existir de dos formas: trofozoíto y quiste. En la fase de trofozoíto, los protozoarios realizan sus funciones normales de nutrición y crecimiento y es la forma en la que produce la enfermedad. En la fase de quiste, el protozoario se encuentra fuera del huésped y puede resistir condiciones extremas como la desecación, bajas temperaturas y en un medio húmedo logra sobrevivir por años (Figura 12).

Nutrición La mayoría de los protozoarios son heterótrofos, sin embargo algunos son autótrofos. La alimentación suele realizarse mediante la captura del alimento, como por ejemplo algas, bacterias y otros protozoarios, que penetran en el citoplasma por mecanismos de difusión de transporte activo. Algunos protozoarios pueden alimentarse a través de aberturas de la membrana celular, llamadas poros bucales, otros como las amebas rodean el alimento mediante pseudópodos (fagocitosis).

Algunos protozoarios absorben el alimento a través de su membrana celular. Por ejemplo, el paramecio succiona el alimento produciendo un torbellino con los cilios. El alimento es digerido por las vacuolas nutritivas, localizadas en el citoplasma y luego los residuos son expulsados por las vacuolas fecales.

Respiración Los protozoarios respiran por difusión, a través de la membrana celular y por las partículas de agua absorbidas con el alimento. Expulsan el gas carbónico por las vesículas o vacuolas pulsátiles. Cuando la vacuola pulsátil está llena de agua, se abre y libera al exterior el CO2.

Reproducción Se reproducen asexualmente por división binaria, por gemación y por esporulación

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(fragmentación de la célula madre en esporas) del trofozoito o forma vegetativa del protozoo. Cuando sucede este último caso, pueden permanecer mucho tiempo enquistados en una cápsula.

Otro tipo de reproducción asexual es la división múltiple, característica de las amebas. En algunos grupos de protozoarios, la reproducción asexual alterna con fases de reproducción sexual, esto debido a cambios desfavorables del medio. También se pueden reproducir sexualmente. Este tipo de reproducción se inicia con la formación de gametos, macrogametos y microgametos, por diferenciación de las células del trofozoito. Su unión da lugar a la formación del cigoto, seguido de divisiones meíoticas. La fusión celular puede ser total, dando lugar a un cigoto (singamia), como sucede en los esporozoos o parcial, por conjugación, como sucede en algunos ciliados.

En la conjugación, el macronúcleo de un protozoario se degenera y el micronúcleo, por divisiones meioticas, da origen a cuatro micronúcleos con reducción de su material genético. Uno de estos micronúcleos es transferido de un protozoo al otro para formar el cigoto y los otros tres micronúcleos se degeneran. Luego el cigoto formado, realizando división múltiple (reproducción asexual) da lugar a numerosas células denominadas esporozoitos. En este tipo de reproducción se produce un intercambio de información genética entre dos protozoos.

Clasificación Según la forma como se desplazan los protozoos se clasifican en11:

• sacordinos • ciliados • flagelados • esporozoos.

Sacordinos

11 Piña, C. 2010. Módulo Microbiología General. UNAD.

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Figura 13. Entamoeba histolítica . Fuente: http://hpd.botanic.hr/ bio/ odgovori/odgovor315.htm

Se desplazan por medio de pseudópodos, que son prolongaciones de la célula y que les sirven además para capturar el alimento, englobarlo (proceso de fagocitosis) y formar una vacuola digestiva, donde el alimento es digerido por acción de enzimas. La mayoría son parásitos del hombre y habitan en el tracto gastro-intestinal y cavidad oral. Un ejemplo es la Entamoeba histolítica (Figura 13).

Ciliados

Figura 14. Balantidium Fuente: http://www.ufrgs.br/para- site/siteantigo/Imagensatlas/Protozoa/Balantidium.htm

Su forma es ovalada, se desplazan y capturan el alimento por medio de cilios, filamentos cortos, vibrátiles y numerosos que rodean su cuerpo. Poseen una hendidura bucal o boca en el citoplasma para la ingestión de alimentos al final se presenta el citostoma y la citofaringe que se continúan, en el interior del citoplasma, con las vesículas alimenticias. El citoplasma realiza movimiento de ciclosis. Poseen vacuolas contráctiles que ayudan a expulsar el agua y residuos de la digestión a través del poro anal o citopigio. Se caracterizan por ser los únicos organismos con dos núcleos un micronúcleo para la reproducción y un macronúcleo para la alimentación. Se reproducen de dos formas: asexual por bipartición y sexual por conjugación. Un ejemplo es el Balantidium coli (Figura 14).

Flagelados

Figura 15. Giardia Lamblia

Fuente: http://www.inselhunde.de/ giardien.htm

Se desplazan por medio de flagelos, filamentos largos y poco numerosos. Muchos son de vida libre y necesitan vectores (insectos) para su transmisión. También pueden transmitirse por aguas o alimentos contaminados. Un ejemplo es la Giardia Lamblia (Figura 15).

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Esporozoos

Carecen de órganos de locomoción. Todos son parásitos obligados de células del hombre y de los animales. Presentan una estructura apical que permite la penetración intracelular. Se reproducen en dos fases: una asexual y otra sexual, dependiendo de la fase pueden estar como: trofozoito, gameto o cigoto (Figura 16).

Figura 16. Plasmodium Fuente: http://www.cdc.gov/malaria/ spotlights/ index_100504.htm

Helmintos

Aunque no son microorganismos en el sentido estricto, tienen importancia en el área de alimentos debido a los procesos infecciosos que causan. Comprenden dos tipos: gusanos aplanados (cestodos y trematodos) y gusanos redondos (nematodos). Corresponden a un grupo de parásitos animales multicelulares y que durante algunos estadios del ciclo vital, se presentan en tamaños microscópicos. Los helmintos parásitos deben estar altamente especializados para vivir dentro de sus huéspedes12 :

- Pueden carecer de aparato digestivo, pues absorben nutrientes a partir del alimento, líquidos corporales y tejidos del huésped.

- Su sistema nervioso es reducido, pues no necesitan buscar alimento y el ambiente dentro del huésped se mantiene relativamente constante.

- Carecen de medios de locomoción o son muy limitados pues son transferidos de un huésped a otro.

12 Tortora, G.J. y col. 2007. Introducción a la microbiología. Edit. Médica Panamericana. 9ª. Edición. Buenos Aires.p370.

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- Su aparato reproductor suele ser complejo, por las grandes cantidades de huevos con las que infectan un huésped.

El ciclo vital de los helmintos es muy complejo pues pueden requerir múltiples huéspedes para completar cada estado larvario, además de un huésped definitivo para el parásito adulto.

Trematodos

Llamados dístomas y caracterizados por ser de cuerpos planos, en forma de hoja, con una ventosa oral y ventral, que son las que mantienen fijo al microorganismo, en el sitio que colonizan al huésped. Los trematodos obtienen el alimento por la absorción a través de su cubierta externa inerte, denominada cutícula (Figura 17).

Figura 17. Fasciola Hepática Fuente:http://www.ferato.com/wiki/index.php/Fascioliasis

Cestodos

Figura18. Taenia Saginata Fuente: http://www.manualmerck.net/?id=210&cn=1761

Son parásitos intestinales, también conocidos como tenías. La cabeza o escólex tiene unas ventosas que sirven para que el parásito se adhiera a la mucosa intestinal. Carecen de aparato digestivo por lo que toman los nutrientes a través de su cutícula. El cuerpo está formado por segmentos llamados proglótides, donde se pueden encontrar ambos órganos reproductores (masculino y femenino) y sacos llenos de huevos, que colonizaran posteriormente el huésped (Figura 18).

Nematodos

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Figura 19. Nematodo Gastrointestinal Fuente: http://www.portalechero.com/ ver_items_descrip.asp?wVarItem=2153

Presentan un sistema digestivo completo. Casi todas las especies son dioicas. Los machos son más pequeños que las hembras. Algunas especies de nematodos viven libremente en el suelo y agua y otros son parásitos de plantas y animales. También algunos pasan su ciclo vital completo, de huevo a adulto maduro, en un único huésped. Las infecciones por nematodos, en seres humanos, pueden dividirse en dos categorías: aquellas en las que el elemento infeccioso es el huevo y aquellas en las que es la larva (Figura 19).

Lección 10. Otros microorganismos de interés alimen ticio: Cianobacterias y microalgas.

Cianobacterias

Son organismos procaríoticos, que pueden ser unicelulares o pluricelulares (filamentosos) y que hacen parte del grupo de las bacterias fotosintéticas oxigénicas, es decir, que pese a su naturaleza elemental, se caracterizan por realizar el proceso de la fotosíntesis en una estructura celular típicamente bacteriana. Algunas asimilan nitrógeno atmosférico. Viven sin demasiadas exigencias nutricionales, con luz pueden mantenerse en medios artificiales minerales. El CO2 atmosférico constituye una excelente fuente de carbono para las cianobacterias, por lo que contribuyen en la productividad de materia orgánica de la Tierra. Se emplea biomasa cianobacteriana para alimentación humana, de peces, crustáceos, aves de corral y ganadería. Un ejemplo, de amplio uso en el área de alimentos, es la Spirulina, cianobacteria filamentosa pluricelular fotoautotrófica, de ambiente acuático con elevada alcalinidad y salinidad. Tiene un alto contenido proteico, β-caroteno y ácidos grasos esenciales como el ácido linoleíco y gamma linolénico.

Microalgas

Organismos eucaríoticos, autótroficos, pertenecientes al reino Protista. Presentan pared celular, clorofila, algunas poseen otros pigmentos como carotenos, ficoxantina o ficobilinas que pueden enmascarar la clorofila. La mayoría son unicelulares, como las algas doradas o diatomeas. También pueden ser multicelulares, como las algas verdes y las rojas. Su tamaño varía desde algas microscópicas de 1 micrómetro hasta las que se observan a simple vista, como las

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algas verdes que crecen en las aguas aposadas o las que se encuentran en los acuarios o en el mar. Su reproducción puede asexual por fisión binaria longitudinal y sexual por producción de esporas cuando las condiciones del medio son extremas. Existen en el mercado alimenticio dos tipos de microalgas: Chlorella y Dunaliella Salina, la primera por su alto contenido proteíco y la segunda por la presencia de β-caroteno.

¿De acuerdo a sus características celulares qué diferencia hay entre las bacterias, hongos y virus? ¿Por qué es importante conocer la diversidad nutricional de las bacterias? ¿Por qué es importante la cápside para un virus? ¿En qué se diferencian los priones de los virus?

Para qué sirve la microbiología?

Antiguamente los panes se hacían crecer con levaduras silvestres del aire, que habían quedado atrapadas en la masa. Y para poder preparar el pan al día siguiente, los panaderos conservaban un cultivo de levadura iniciador. Actualmente, el pan se prepara con harina de trigo, agua, azúcar, sal, mantequilla y un microorganismo vivo, llamado Saccharomyces cerevisiae, un tipo de levadura. Cuando se mezcla la harina de trigo y el agua, una enzima presente en la harina rompe el almidón, en dos azúcares, maltosa y glucosa. Una vez mezclados todos los demás ingredientes, la levadura metaboliza los azúcares formados (maltosa y glucosa) y produce etanol (alcohol) y CO2 (dióxido de carbono) como productos de desecho. El CO2 eleva la masa del pan y el etanol se evapora durante la cocción. Este proceso se conoce como fermentación.

Capítulo 3. Características del Crecimiento bacteri ano

La dispersión tan amplia de los microorganismos en el suelo, aire, agua, sustratos biológicos naturales y medios artificiales de cultivo, con velocidades de reproducción y de crecimiento verdaderamente notables, han obligado a investigar y a aplicar técnicas de manejo y bioseguridad microbiana.

Por lo tanto, el conocimiento de las opciones de control del crecimiento bacteriano significa identificar los parámetros extrínsecos e intrínsecos que afecten el metabolismo y el crecimiento microbiano y poderlos aplicar en estrategias y técnicas que permitan un manejo inocuo e idóneo de las áreas de trabajo.

Preguntas de repaso

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Las lecciones que se encuentran en este capítulo son:

Lección 11 : Metabolismo bacteriano

Lección 12: Crecimiento bacteriano

Lección 13: Fases de crecimiento bacteriano

Lección 14: Parámetros extrínsecos

Lección 15: Parámetros intrínsecos

Lección 11 : Metabolismo bacteriano

El metabolismo bacteriano se define como la suma de procesos internos, físicos y químicos, gracias a los cuales sobreviven y conservan las bacterias. Para realizar dichos procesos, la bacteria requiere de una serie de nutrientes que después de pasar por su membrana celular se emplean como material sintético, es decir para producir otras sustancias, o para que la bacteria obtenga la energía necesaria para su crecimiento, reparación, reproducción o desplazamiento. Las reacciones específicas metabólicas de las bacterias les permiten, por ejemplo, vivir de la celulosa, del petróleo o reciclar elementos utilizados previamente por otros microorganismos. Prácticamente cualquier sustancia terrestre puede servir de alimento a un microorganismo, sin embargo ningún microorganismo es capaz de utilizar todos los alimentos presentes en un sustrato o medio de cultivo. Algunos de estos nutrientes, como por ejemplo los carbohidratos (azúcares), son empleados por un pequeño grupo de microorganismos, pero otro no usan en absoluto dichas sustancias. Las diferencias en la capacidad de empleo de las sustancias alimenticias, constituye una de de las principales bases para la identificación de microorganismos, siendo esto muy útil en el laboratorio (pruebas bioquímicas). Todas las especies, y en algunos casos los géneros, se clasifican según los compuestos que utilizan y los productos que se forman a partir de ellos.

En la figura 20 se observa la organización de los seres vivos, de acuerdo al tipo de nutrición, que existe en la naturaleza y se hace énfasis en las procariotas.

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Figura 20. Clasificación de los seres vivos según s u tipo de nutrición. Fuente: Claudia Zambrano

Fermentación

La fermentación puede definirse como cualquier proceso metabólico que:

- libere energía a partir de un azúcar u otra molécula orgánica. - no necesite la presencia de oxígeno ni de una cadena de electrones - utilice una molécula orgánica como aceptor final de electrones y - sólo produce pequeñas cantidades de ATP, debido a que gran parte de la energía original almacenada en la glucosa se mantiene en los enlaces químicos de los productos finales orgánicos (ácido láctico, etanol)13.

En general en la fermentación, los microorganismos producen metabolitos primarios, como el etanol, o secundarios, como la penicilina. En el caso del metabolito primario, este se produce al mismo tiempo que las nuevas bacterias y

13 Tortora, G.J. y col. 2007. Introducción a la microbiología. Edit. Médica Panamericana. 9ª. Edición. Buenos Aires.p144.

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su curva de producción está directamente relacionada con la curva de crecimiento del microorganismo. Para el caso del metabolito secundario, solo se empieza a producir al final de la fase logarítmica y tiene su máxima producción en la fase estacionaria de la curva de crecimiento. La fermentación industrial se refiere al cultivo, en gran escala, de microorganismos para producir una sustancia valiosa comercialmente. A continuación se enumeran algunos procesos fermentativos utilizados en el área de alimentos:

Sustrato Producto Final de la fermentación

Proceso Industrial o comercial

Microorganismo que interviene

Extracto de malta Etanol Cerveza Saccharomyces cerevisiae (levadura)

Frutas (uva especialmente) Etanol Vino

Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus

Desechos agrícolas Etanol Combustible Saccharomyces cerevisiae

Etanol Ácido acético Vinagre Acetobacter (bacterias)

Leche Ácido láctico Queso, Yogur Lactobacillus, Streptococcus (bacterias)

Cereal en granos, azúcar Ácido láctico Pan Lactobacillus delbruckii Repollo Ácido láctico Chucrut Lactobacillus plantarum Carne Ácido láctico Salchicha ahumada Pediococcus (bacteria)

Ácido láctico Ácido propiónico y CO2 Queso Gruyer Propionibacterium freudenreichii (bacteria)

Melaza Acetona y butanol Materia prima de productos farmacéuticos y uso industrial

Clostridium acetobutylicum (bacteria)

Melaza Glicerol Materia prima de productos farmacéuticos y uso industrial

Saccharomyces cerevisiae

Melaza Ácido cítrico Aromatizador Aspergillus (Hongo filamentoso)

Ácido acético Metano Combustible Methanosarcina (bacteria)

Tabla 2. Procesos fermentativos donde intervienen m icroorganismos

Fuente: Claudia Zambrano

En términos generales, existen varios tipos de fermentación, entre las más importantes y relacionadas con el área de los alimentos encontramos:

- La fermentación alcohólica que transforma los jugos azucarados de los frutos en bebidas alcohólicas, por ejemplo, el vino.

- La fermentación acética que transforma el vino en vinagre.

- La fermentación láctica que es la responsable de la coagulación de la leche.

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Lección 12: Crecimiento bacteriano

El crecimiento microbiano hace referencia al aumento del número de microorganismos a lo largo del tiempo y no al aumento de tamaño de un microorganismo. El aumento del número de microorganismos permite la formación de colonias o de poblaciones. Es por eso que en microbiología el crecimiento se estudia por poblaciones y no en microorganismos individuales. Las bacterias se reproducen generalmente por fisión binaria. El resultado de la fisión binaria son dos células hijas por cada célula madre, así, una célula se divide en dos, dos en cuatro y cuatro en ocho y así sucesivamente.

El intervalo de tiempo que transcurre para la formación de dos células a partir de la célula madre se llama tiempo de generación o tiempo generacional y al igual que la tasa de crecimiento o cambio en el número de células por unidad de tiempo, varía en dependencia de las condiciones genéticas de las bacterias y de los factores nutricionales. Si partimos de una célula al cabo de una generación habrá duplicado su número y así sucesivamente en cada generación. Como se puede observar el crecimiento se produce en progresión geométrica y no aritmética (Tabla 3).

Tabla 3. Número de células bacterianas por generación. Fuente: Módulo Microbiología. UNAD. Carmen Eugenia Piña En algunas bacterias como en el caso la E. coli, en condiciones óptimas la duplicación celular se realiza cada 20 minutos, es así como en 10 horas se habrán producido 30 generaciones, es decir mil millones de células bacterianas. A partir de una célula de E. coli, se obtiene al cabo de 10 horas o sea 600 minutos, 600/20=30 generaciones. El número de células entonces sería 230

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Aspectos para el cálculo del crecimiento microbiano

Tabla 4. Cálculos del crecimiento bacteriano Fuente: Módulo Microbiología. UNAD. Carmen Eugenia Piña

Lección 13: Fases de crecimiento bacteriano

El incremento en el número de las células en una población se denomina crecimiento exponencial o logarítmico. Si se inoculan unas bacterias en un medio de cultivo fresco y se cuantifica la población en intervalos de tiempo se puede obtener una curva que represente el crecimiento bacteriano, como la que se observa a continuación.

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Figura 21. Curva de crecimiento bacteria no donde se relaciona número de células contra tiempo de genera ción. Fuente: Módulo Microbiología. UNAD. Carmen Eugenia Piña. La curva de crecimiento de la población tiene cuatro fases (Figura 21):

1) fase lag o fase de latencia es el periodo de adaptación de los microorganismos a un nuevo ambiente. En este periodo el número de células no se incrementa, sino que se mantiene constante por un largo período que puede durar desde 1 hora hasta varios días. En esta fase las células presentan gran actividad metabólica, que se manifiesta por el aumento del volumen celular.

2) fase log. o logarítmica o de crecimiento exponencial, durante este periodo las células se empiezan a dividir en forma constante y la actividad metabólica (producción de metabolitos, respiración celular, síntesis de proteínas, entre otros) es máxima, por lo que es la etapa preferida a nivel industrial. El número de células vivas en reproducción es mucho mayor que las células que mueren. El tiempo generacional es máximo y constante. Las células muestran su morfología: color, agrupación, forma, entre otras. En el momento final de esta fase y como resultado de la alta tasa de reproducción, comienzan a escasear los nutrientes y el ambiente se torna tóxico por el exceso de productos de desecho. Es el momento en el cual las células son más sensibles a los antimicrobianos o a las radiaciones que pueden intervenir negativamente en su crecimiento. Esta fase se representa por una línea recta ascendente.

3) fase estacionaria, en este periodo se generan dos factores limitantes del

crecimiento: aporte nutricional y productos tóxicos de desecho. Si la población no se reproduce ni muere, el número de células permanece constante y dependerá del balance que logren las células con el medio ambiente. Es un periodo de equilibrio.

4) fase de muerte o de declive logarítmico, en esta fase las células no se reproducen, solo mueren y son destruidas por lisis en forma exponencial a causa del incremento en las cantidades de ácido y otros desechos dañinos en el ambiente.

Lección 14: Factores Físicos

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Dentro del grupo de factores físicos que influyen en el crecimiento bacteriano, se encuentran: Temperatura, pH y Presión Osmótica. Temperatura Es uno de los factores ambientales que más influye en el crecimiento de los microorganismos. Al aumentar la temperatura aumenta la velocidad de las reacciones enzimáticas y por consiguiente el metabolismo bacteriano, hasta una cierta temperatura a la cual las proteínas, DNA y otras macromoléculas son sensibles y se desnaturalizan. En caso contrario, es decir a temperaturas bajas, se disminuye la actividad metabólica del microorganismo. Se puede hablar por consiguiente de una taxonomía microbiana referida a rangos óptimos de adaptación a la temperatura. Esta clasificación contempla los tres casos siguientes:

Psicrófilos Bacterias adaptadas a bajas temperaturas, en términos generales se maneja un rango de 0°C a 20°C como límites normales para su crecimiento.

Mesófilos

Bacterias que viven en temperaturas moderadas, en un rango de 20°C a 40°C. Los microorganismos mesófilos, son los más comunes. Por ejemplo, la temperatura óptima para la mayoría de las bacterias patógenas se aproxima a los 37°C.

Termófilos Bacterias que soportan altas temperaturas, contemplan como rangos usuales de tolerancia de 40°C. a 80°C. y por consiguiente sus endosporas son normalmente resistentes al calor.

Fuente: Módulo Microbiología. UNAD. Carmen Eugenia Piña En el área de alimentos existe una tendencia a clasificar los organismos psicrófilos como sicrótrofos, refiriéndose a aquellos que crecen a bajas temperaturas y afectan los alimentos. La refrigeración es el método más común de conservación de alimentos, pues disminuye la velocidad de reproducción de los microorganismos. En este caso, las bacterias pueden sobrevivir a bajas temperaturas y permanecer en estado de latencia pero su número comienza a

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disminuir. Mientras esto ocurre pueden degradar lentamente los alimentos y descomponerlos14. En el caso de los termófilos, otro grupo de interés en el área de alimentos, pueden formar endosporas que presentan una alta resistencia al calor y pueden sobrevivir al tratamiento térmico, por ejemplo, el caso de los enlatados. Las elevadas temperaturas de almacenamiento del enlatado pueden causar la germinación y el crecimiento de las endosporas sobrevivientes y de este modo afectar el alimento.

pH

En la mayoría de bacterias el pH (acidez o alcalinidad de una solución o medio de crecimiento) de rango neutro (6,5 a 7,5) es el más adecuado para el crecimiento bacteriano y muy pocas bacterias soportan pH inferiores a 4.0. Por esta razón el manejo de la acidez es un recurso para el control microbiológico. Por ejemplo, el caso de algunos quesos que se preservan del deterioro, por los ácidos producidos por la fermentación bacteriana.

Una tabla de rangos de tolerancia a la acidez es la siguiente:

Bacterias pH

Acidófilas 1,0 a 6,0

Neutrófilas 6,5 a 7,5

Alcalófilas 8,0 a 11,0 Fuente: Módulo Microbiología. UNAD. Carmen Eugenia Piña El intervalo óptimo de pH para mohos y levaduras está entre 5,0 y 6,0.

Presión osmótica

Los microorganismos están formados por un 80-90% de agua y por consiguiente son fácilmente afectados por soluciones hipertónicas o sea con una concentración de solutos mayor a la de la célula microbiana, razón por la cual esta pierde agua por el efecto conocido como plasmólisis. Por consiguiente, la adición de sales o de azúcar, produce una contracción celular que evita el crecimiento bacteriano, un sistema muy usado en el área de alimentos, como el pescado salado, la miel y la leche. 14 Tortora, G.J. y col. 2007. Introducción a la microbiología. Edit. Médica Panamericana. 9ª. Edición. Buenos Aires.p160.

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Sin embargo existen las bacterias llamadas halófilas extremas que requieren alta concentración salina para supervivir (alrededor del 30% de sal). Otro grupo es el de las halófilas facultativas, que no necesitan altas concentraciones salinas pero pueden soportar concentraciones entre el 2 y 15% de sal. Se comprende entonces la técnica usada para solidificar los medios de cultivo microbiano con agar, con una concentración del orden del 1,5%.

Lección 15: Factores químicos Dentro de los parámetros químicos encontramos los nutrientes (macro y micronutrientes), el oxígeno y agentes químicos antimicrobianos. Macronutrientes Las fuentes de carbono son necesarias para el crecimiento bacteriano ya que este elemento es una estructura básica en todos los compuestos orgánicos que constituyen la célula viva. Por consiguiente, los microorganismos obtienen su carbono a partir de compuestos orgánicos (microorganismos quimioheterótrofos), o del bióxido de Carbono (quimioautótrofos y fotoautótrofos). Para el caso del Nitrógeno, los microorganismos lo utilizan principalmente para formar el grupo amino de los aminoácidos constituyentes de las proteínas. En algunos casos de simbiosis, el nitrógeno fijado por bacterias se comparte con ciertas plantas (generalmente leguminosas), lo cual permite aumentar la fertilidad del suelo. El Azufre se utiliza generalmente para sintetizar aminoácidos y vitaminas como la timina y la biotina. El Fósforo se utiliza en síntesis de ácidos nucleicos y de los fosfolípidos de las membranas celulares. De manera similar los microorganismos necesitan otros elementos como potasio, magnesio y calcio necesarios como cofactores de las enzimas. Micronutrientes Por otra parte, los microorganismos requieren algunos elementos minerales en cantidades muy pequeñas, como es el caso del: hierro, cobre, molibdeno y zinc, los cuales son esenciales como cofactores en la actividad enzimática.

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Oxígeno Los requerimientos de este elemento en los microorganismos varían considerablemente, lo que permite clasificarlas de acuerdo a sus necesidades o no del oxígeno:

Aerobios Microorganismos que utilizan el oxígeno molecular, con el cual producen más energía a partir de los nutrientes.

Anaerobios facultativos Microorganismos que utilizan el oxígeno disponible, pero si no lo hay pueden crecer mediante procesos de fermentación o respiración anaeróbica.

Anaerobios obligados Microorganismos para los cuales el oxígeno es tóxico y por consiguiente no lo utilizan.

Anaerobio aerotolerante Microorganismos que no pueden utilizar oxígeno para su crecimiento pero lo toleran bastante bien.

Microaerófila Microorganismos que crecen solo en concentraciones de oxígeno menores que las del aire.

Fuente: Módulo Microbiología. UNAD. Carmen Piña

Agentes antimicrobianos que afectan el crecimiento

A partir del descubrimiento de la penicilina se han observado reacciones de inhibición del crecimiento microbiano, en medios sólidos, por causa de sustancias producidas por otros microorganismos, sustancias que por tal motivo se llaman antibióticos. Algo más de la mitad de los antibióticos de amplio uso son producidos por la bacteria Streptomyces. Otros antibióticos son producidos por bacterias del género Bacillus y algunos son generados por mohos de los géneros Penicillium y Cephalosporium. Es necesario diferenciar entre dos conceptos: Los agentes bactericidas eliminan las bacterias y los agentes bacteriostáticos solo impiden su crecimiento, contribuyendo a que las propias defensas del huésped destruyan a los microorganismos patógenos.

Espectro de actividad antimicrobiana

Los antibióticos presentan cierta selectividad sobre los tipos de células microbianas que pueden afectar, por ejemplo, la penicilina es efectiva contra

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bacterias Gram Positivas, pero ataca a pocas bacterias Gram Negativas. Los antibióticos que atacan a un alto número de Gram Positivas y Gram Negativas se denominan de amplio espectro y se recurre a ellos cuando no es segura la identidad del patógeno. Desafortunadamente estos antibióticos destruyen gran parte de la flora normal del huésped y aquellos microorganismos patógenos que no son destruidos por el antibiótico pueden atacar más fuertemente al organismo huésped por el desequilibrio de la flora.

Mecanismo de acción de los antibióticos o agentes a ntimicrobianos

Los principales mecanismos antibióticos son los siguientes: • Inhibición de la síntesis de la pared celular. Algunos antibióticos interfieren con las síntesis del peptidoglucano necesario para la construcción de la pared celular de bacterias Gram positivas y Gram Negativas. De esta manera, la pared celular de la bacteria patógena se debilita y no puede crecer normalmente. • Inhibición de la síntesis de proteínas. Algunos antibióticos como el Cloranfenicol, la Eritromicina y las Tetraciclinas inhiben la síntesis de proteínas, en ciertos tipos de ribosomas, de las bacterias patógenas y de esta manera se anula su actividad fisiológica. • Alteración de la membrana citoplasmática. Antibióticos como la Polimixina B dañan la permeabilidad de la membrana citoplasmática y otros fármacos antifúngicos como la Nistatina, Anfotericina B y Ketoconasol desorganizan la membrana citoplasmática causando la destrucción celular al liberar el contenido citoplasmático. • Inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos. Este tipo de acción evita el desarrollo normal del microorganismo, pero tiene un efecto tóxico en el ADN y ARN de los mamíferos, como es el caso del antivírico Idoxuridina. Son más selectivamente tóxicos para las bacterias, afectando menos al huésped la Rifampicina y el Ácido Nalidixico. • Inhibición de la actividad enzimática. Algunos antibióticos se comportan como antimetabolitos, que por su parecido al sustrato normal de una enzima necesaria en la producción de ácido fólico, interfieren con esta síntesis y detienen el crecimiento del microorganismo. Es el caso de la sulfanilamida. Otros agentes de acción similar son las sulfotas y el Timetropin.

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¿Qué función cumplen las enzimas en los organismos vivos? ¿Cuáles son las diferencias entre respiración aeróbica y anaeróbica? ¿Qué importancia tienen las pruebas bioquímicas en microbiología? ¿Cuál es la diferencia entre organismos quimiótrotofos y fotótrofos?

Para qué sirve la microbiología? El estudio detallado de los factores que afectan el crecimiento bacteriano tiene una gran utilidad en la fermentación industrial. Los tanques utilizados en dicha fermentación se conocen como biorreactores y se diseñan teniendo en cuenta aireación, control de pH y control de temperatura, factores que afectan directamente el crecimiento de los microorganismos y por ende el producto que ellos elaboran. El alto valor de los productos elaborados por los microorganismos y las células eucarióticas modificadas, ha estimulado el desarrollo de nuevos tipos de biorreactores que incluso son manejados por computador, de manera que todos los factores sean controlados y/o modificados óptimamente15.

15 Yousef, A and Carlstrom,C. 2006. Microbiología de los alimentos. Manual de Laboratorio. Edit. Acribia. Zaragoza. España. p.145.

Preguntas de repaso

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UNIDAD DIDÁCTICA 2 IMPORTANCIA DE LA MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

UNIDAD 2. Importancia de la microbiología industria l

Introducción

En la Unidad 2 el estudiante evidencia como de acuerdo a sus características metabólicas los microorganismos intervienen en procesos industriales o actúan de forma perjudicial produciendo, en el hombre, enfermedades transmitidas por los alimentos. También le permite determinar la influencia del ambiente y los manipuladores en la calidad del producto alimenticio.

Justificación

El conocimiento sobre las diferentes formas de acción que tienen los microorganismos sobre los alimentos y las áreas de trabajo permitirá al estudiante elaborar un producto alimenticio idóneo e inocuo para el consumidor.

Competencias

1. El estudiante explica las diferentes formas de acción de los microorganismos sobre los alimentos.

2. El estudiante interpreta los hallazgos microbiológicos obtenidos en ambientes y manipuladores de manera que pueda ejercer un control sobre los mismos.

3. El estudiante analiza y argumenta las posibilidades de acción microbiológica en los diferentes procesos industriales donde intervienen microorganismos.

4. El estudiante identifica las diferentes enfermedades transmitidas por los alimentos cuyo agente causal es un microorganismo.

Propósito

Contribuir a que el estudiante reconozca la influencia que tienen los microorganismos sobre los alimentos y la manera de controlarlos o manejarlos con el fin de optimizar sus procesos, elaborando así un producto alimenticio de óptima calidad.

Objetivos

1. Que el estudiante identifique los microorganismos asociados con problemas en la calidad del alimento.

2. Que el estudiante determine la importancia de los microorganismos asociados a procesos industriales.

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3. Que el estudiante establezca la relación entre el microorganismo causal y la enfermedad transmitida por el alimento.

Horas de trabajo académico

El contenido de esta unidad corresponde a un crédito académico, que equivale a 12 horas de acompañamiento tutorial y 36 horas de trabajo independiente.

Palabras clave Procesos industriales, fermentación, microorganismos indicadores, enfermedades transmitidas por alimentos.

Mapa Conceptual Unidad 2: Importancia de la microbi ología de alimentos

Capitulo 4. Microorganismos asociados a procesos industriales La importancia de los microorganismos en procesos como la fermentación ha sido evidente desde tiempos de Pasteur, quien dijo que “la fermentación es la vida sin aire” y a partir de esta idea se puede definir la fermentación como un proceso donde la energía que requieren los microorganismos para vivir puede ser obtenida

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mediante reacciones donde no interviene el oxígeno. El microorganismo no causa la fermentación; es el mecanismo que utiliza para vivir16 . Como se observa en la figura 20 una forma de clasificar los organismos es de acuerdo a la fuente de energía que utilizan: los fotótrofos, son aquellos que utilizan la luz como fuente de energía y los quimiotótrofos, que utilizan la energía liberada a partir de diferentes compuestos químicos. Para este último caso, si el oxígeno actúa como aceptor de electrones se habla de la respiración (metabolismo aérobico), pero si el proceso ocurre en ausencia de oxígeno, se llama fermentación (metabolismo anaeróbico).

Las lecciones que se encuentran en este capítulo son:

Lección 16. Fermentación alcohólica Lección 17. Fermentación láctica Lección 18. Producción de ácido acético Lección 19. Producción de ácido cítrico Lección 20. Otros procesos industriales Lección 16. Fermentación alcohólica La ecuación general de la fermentación alcohólica es la siguiente:

En esta ecuación se indica que un azúcar es el sustrato (C6H12O6) y que la reacción es anaeróbica. En unos casos se utiliza el CO2, para la elaboración del pan y en otros se aprovecha el etanol. La degradación de la glucosa en condiciones de anaerobiosis libera una pequeña cantidad de energía que el organismo utiliza para impulsar sus propias reacciones de síntesis de materia orgánica. El proceso degradativo que implican liberación de energía se llaman catabolismo y el proceso de síntesis o producción de biomoléculas se denomina anabolismo. El catabolismo de la glucosa se realiza mediante una vía universal denominada “vía glicolítica” o en honor de sus

16 Herrera, J.R. 2001. El pensamiento biológico a través del microscopio. Fondo de cultura económico. México. p.66.

C6H12O6 (Glucosa) + Levadura 2 C2H5OH (Etanol) + 2CO2

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descubridores “vía de Embden-Meyerhoff-Parnas”17. En el siguiente esquema se representa esta vía: Figura 22. Fermentación alcohólica . Se relacionan los principales productos y transformaciones que ocurren en la fermentación pues se producen varias sustancias intermedias durante el proceso. El número que se observa al lado de cada molécula se refiere al número de moléculas producidas. Fuente: Imagen tomada y adaptada de The Science of Biology. (2004). En la figura 22 se observa que el primer paso para cualquier tipo de fermentación es la glicolisis, donde la glucosa pasa a ácido pirúvico y luego este es convertido a acetaldehído con liberación de CO2. El NADH + H+ de la glicolisis actúa como un agente reductor, para permitir la conversión del acetaldehído a etanol, es decir actúa como una coenzima (pequeñas moléculas que se requieren en forma indispensable para ayudar al funcionamiento de algunas enzimas). Igualmente se produce una pequeña

17 Herrera, J.R. 2001. El pensamiento biológico a través del microscopio. Fondo de cultura económico. México. p.69.

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cantidad de ATP (2 moléculas de Adenosin Trifosfato) que es utilizada por el organismo para sus reacciones internas18 . La fermentación alcohólica varía de acuerdo al producto que se quiere obtener: cerveza, vino, licores destilados o alcohol industrial. La cerveza se elabora de granos, los vinos a partir de jugos de frutas y los licores destilados y el alcohol industrial pueden elaborarse de uno u otro tipo de material. Saccharomyces cereviciae Saccharomyces cereviciae es la levadura utilizada en la fermentación alcohólica que permite la elaboración de la cerveza y produce dos tipos de fermentación llamadas superior e inferior, denominadas así por el lugar donde se deposita la levadura. Esta propiedad física se conoce como floculación, y le permite a la levadura agruparse de manera que se puedan sedimentar (fermentación inferior) o permanecer en la superficie del líquido (fermentación superior). Las cervezas inglesas (11% de alcohol) emplean la fermentación superior y las alemanas, menos fuertes, más carbonatadas, más claras, menos aromáticas y con menor contenido alcohólico (3,5% de alcohol) la fermentación inferior. Cada tipo de fermentación influye en el aroma, sabor, olor, cantidad de gas carbónico, de alcohol, entre otros. Se necesitan aproximadamente casi 4g de levadura/litro de cerveza independientemente del tipo de fermentación utilizada19. Existen una serie de factores que influyen en la reproducción de la levadura durante la fermentación y que deben ser controlados para lograr un adecuado proceso: - Concentración de Oxígeno, es un elemento necesario para la reproducción acelerada de la levadura lo que favorece el proceso de fermentación. - Intervalos de temperatura, por ser un microorganismo que crece entre 25 -30º:C, el aumento de la temperatura durante la fermentación favorece la reproducción de la levadura. - Componentes del mosto, por ser el mosto la materia prima que transforma la levadura debe tener unos requerimiento nutricionales altos, que favorezcan la reproducción de la levadura y por consiguiente el proceso de fermentación. 18 Purves, W.K. et col.2004. Life. The science of biology. 7a.Edición.Edit. Sinauer Associates. U.S.A. p. 256. 19 Córdova Frunz, J.L. 2002. La química y la cocina. 3ª. Ed. Fondo de cultura económico. México. p 35.

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Elaboración de la cerveza Prácticamente cualquier material con almidón puede hacerse fermentar con levadura. La cebada es el cereal más utilizado en la elaboración de la cerveza. La semilla de la cebada tiene una gran masa de tejido que constituye las reservas alimenticias para la germinación de la planta. Estas reservas son principalmente, polisacáridos, es decir, moléculas hechas de unidades de azúcares como glucosa y maltosa (monosacáridos). Germinación La malta es el germinado de la cebada. Durante la germinación de la cebada se producen, dentro del grano, las enzimas amilasas que rompen los polisacáridos en sus componentes mínimos (monosacáridos) y sobre estos monosacáridos es donde la levadura puede actuar. Esto se debe a que la levadura solo puede metabolizar los azúcares simples. Para detener la germinación se hace un calentamiento suave que no daña las enzimas. Un calentamiento excesivo produce un grano más oscuro, empleado para elaborar la cerveza oscura. Maceración La maceración de la malta en agua caliente se realiza para facilitar el rompimiento de los polisacáridos. Las enzimas (producidas en la germinación) comienzan a romper los polisacáridos y a producir péptidos, aminoácidos, azúcares, etc., los cuales se disuelven en el agua dando lugar al “mosto”, el liquido que se fermentará más tarde. Luego se mezcla la malta con agua a 40 ºC y se deja en reposo por 30 min. En este punto las enzimas que descomponen las proteínas tienen sus condiciones ideales para la producción de péptidos y aminoácidos, que se convierten en alimento para las levaduras. En otro recipiente se prepara una infusión del cereal macerado con agua y se lleva a una temperatura cercana a la ebullición. Cuando alcanza una textura gelatinosa se añade a la malta obteniéndose una mezcla que se calienta por etapas hasta alcanzar los 77 ºC. En este punto la mezcla y la temperatura favorecen la acción de las amilasas. Después de mantener la mezcla a 77 ºC por media hora se eleva la temperatura hasta 80 ºC con la finalidad de destruir las enzimas y poder controlar la fermentación. A continuación se cuela la mezcla o mosto a fin de obtener un líquido transparente que se pone a hervir por 30 a 60 min. para destruir cualquier enzima remanente, esterilizarlo y concentrarlo un poco. Luego se añade a intervalos regulares, la flor seca del lúpulo y se lleva a ebullición lo que permite extraer sustancias que

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contribuyen al sabor y aroma de la cerveza. Después de la ebullición se eliminan los restos del lúpulo y se enfría a 10 ºC. Fermentación Durante la fermentación las levaduras no solo se multiplican casi tres veces sino que tienen tiempo de transformar los azúcares del mosto a alcohol y CO2 que se recoge para añadirlo después. Son más de 12 reacciones enzimáticas que producen la fermentación de azúcares a alcohol, todas exotérmicas (reacciones que liberan calor) por lo que el tanque debe refrigerarse. La fermentación requiere unos 9 días, se realiza en el citoplasma de la levadura, produce un contenido alcohólico en el mosto de un 4,6% (v/v), baja el pH a 4,0 y produce CO2.

Al final de la fermentación la levadura se recoge para volverla a emplear. En las cervecerías los cultivos se renuevan cada 10 meses, aproximadamente, pues se contaminan con otros microorganismos20.

Maduración Una vez terminada la fermentación se filtra la mayor parte de la levadura y sustancias en suspensión, se almacena cerca de los 0 ºC por períodos que van de semanas a meses a fin de mejorar el sabor y aroma. Todavía no son claras las reacciones que ocurren en esta etapa de la elaboración de la cerveza. Durante el almacenamiento se adiciona CO2, que además de mejorar la frescura del producto ayuda a eliminar el oxígeno disuelto que disminuye la vida media de la cerveza. Una vez la cerveza se embotella o enlata se pasteuriza a 60 ºC por 15 minutos para evitar la acción de microorganismos patógenos. Las propiedades alimenticias de la cerveza lo son también para los microorganismos que pueden sobrevivir a la pasteurización y sustancias que inhiben su crecimiento. Sin embargo, la acidez y el alcohol de la cerveza son inhibidores de los microorganismos patógenos (Figura 23).

20 Córdova Frunz, J.L. 2002. La química y la cocina. 3ª. Ed. Fondo de cultura económico. México. p 40.

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Figura 23. Producción de la cerveza Fuente:http://www.clubplaneta.com.mx/bar/proceso_de_elaboracion_de_la_cerveza.htm

Infovideo que presenta la elaboración de la cerveza y la acción de las levaduras

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Lección 17. Fermentación láctica La reacción general de este tipo de fermentación es la siguiente: En este caso la lactosa la encontramos principalmente en la leche de animales y el hombre y a partir de este sustrato las bacterias ácido lácticas (BAL) transforman este disacárido (glucosa + galactosa) en ácido láctico, lo que permite la elaboración de yogur, kéfir y quesos. La vía glicolítica o glicolisis de la fermentación láctica, al igual que la fermentación alcohólica, produce ácido pirúvico, ATP y NADH + H+. Este último actúa como un agente reductor que permite la conversión del piruvato a ácido láctico (Figura 22).

Infovideo de History Channel que consta de 5 capítulos en los cuales detalla la elaboración de la cerveza. Incluye su historia, clases de cerveza y acción de la levadura.

C6H12O6 (Glucosa) + BAL 2 H3C-CH(OH)-COOH (Ácido láctico)

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Figura 24. Fermentación láctica . Se relacionan los principales productos y transformaciones que ocurren en la fermentación pues se producen varias sustancias intermedias durante el proceso. El número que se observa al lado de cada molécula se refiere al número de moléculas producidas. Fuente: Imagen tomada y adaptada de The Science of Biology. (2004). Bacterias ácido lácticas Comprenden un grupo heterogéneo de bacterias Gram (+), que incluyen cocos y bacilos. Son bacterias no formadoras de esporas, microaerófilas o anaerobias pero aerotolerantes y pueden metabolizar los carbohidratos mediante diferentes rutas fermentativas. Son bacterias exigentes para su crecimiento por lo que requieren sustratos como la leche para un adecuado metabolismo. La mayoría crece a temperaturas mesófilas, aunque se pueden encontrar psicrófilas y termófilas. De acuerdo a la forma de metabolizar la glucosa se pueden clasificar en21:

21 Yousef, A and Carlstrom,C. 2006. Microbiología de los alimentos. Manual de Laboratorio. Edit. Acribia. Zaragoza. España. p.55.

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- Bacterias Homolácticas o también llamadas Homofermentativas, aquellas que utilizan la vía glicolítica, por lo tanto solo producen ácido láctico. - Bacterias Heteroláctica o también llamadas Heterofermentativas, son bacterias que producen un metabolito intermedio llamado triosa fosfato y que por acción de la enzima fosfocetolasa se convierte en ácido láctico. Esta ruta también se conoce como la ruta de la fosfocetolasa y además de ácido láctico y ATP producen etanol y CO2. Una diferencia importante y destacable en estos dos grupos de BAL, es que en el caso de las bacterias Homolácticas producen 2 moléculas de ATP mientras que las Heterolácticas una sola molécula de ATP. Dentro del grupo de bacterias ácido lácticas se encuentran por lo menos 10 géneros: Corynebacterium, Enterococos, Lactococos, Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus y Vagococcus22. Elaboración del Queso La fermentación láctica ocupa el segundo lugar después de la fermentación alcohólica, entre las industrias que se basan en procesos microbiológicos. Las etapas generales en la elaboración del queso son las siguientes: Pre-tratamiento de la leche La leche, materia prima en la elaboración del queso, debe tener las siguientes condiciones:

22 Ibis. p. 57

C6H12O6 (Glucosa) + BAL 2 H3C-CH(OH)-COOH (Ácido láctico) + 2 ATP

C6H12O6 (Glucosa)+ BAL H3C-CH(OH)-COOH(Ácido láctico) + C2H5OH (Etanol) + CO2 + ATP

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- Bajo recuento bacteriano, pues si es muy alto este recuento puede haber una excesiva producción de gas y olores desagradables en el producto final. Por esto es necesario refrigerar rápidamente la leche una vez ordeñada. - No debe tener enzimas que perjudiquen la elaboración del producto, por ejemplo, la lactoperoxidasa inhibe el crecimiento de algunas bacterias lácticas importantes en la fabricación del queso y las lipasas y proteasas pueden modificar el aroma y sabor del queso. - Es necesaria la homogenización de la leche, proceso que reduce el tamaño de los glóbulos grasos, para la elaboración del queso crema, quesos blandos y quesos para untar. Coagulación El proceso de coagulación de la leche se realiza por: - Acidificación, es decir, el pH de la leche disminuye por acción de bacterias “iniciadoras” lácticas que fermentan la lactosa a ácido láctico. Esta disminución del pH reduce la solubilidad de las caseínas (principales proteínas de la leche) y acelera la coagulación enzimática del queso. Además el pH ácido facilita la extracción del suero y controla el desarrollo de flora bacteriana indeseable. - Acción de enzimas que hidrolizan específicamente una fracción de la caseína. Dicha fracción tiene como función estabilizar las micelas (agregados circulares multimoleculares) de caseína de la leche, en presencia de calcio, en una suspensión coloidal. Por consiguiente, si está bloqueada esta fracción se desestabiliza la micela haciendo que coagule la leche. Separación del cuajo y el suero Este proceso se conoce como sinéresis del suero y que consiste en separar la cuajada sólida del suero líquido y que puede acelerarse por cortes a la cuajada, aumento de la temperatura, reducción del pH por bacterias lácticas o simplemente separación física. En este punto se puede moldear la cuajada de acuerdo al producto final. Maduración del queso Se refiere al paso que permite la elaboración de los diferentes tipos de quesos:

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- Usando microorganismos, por ejemplo: Propionibacterium (queso Suizo), Penicillium roqueforti (queso Azul) o Penicillium camemberti (queso camembert). - Usando enzimas por ejemplo, esterasas pregástricas (queso Romano y Provolone).

Lección 18. Producción de Ácido Acético La ecuación general de la producción de ácido acético (vinagre) es la siguiente: Según la ecuación se observa que se requiere una fuente de alcohol etílico (que puede provenir de la fermentación de levaduras) y la reacción es de tipo aérobica. El vinagre es una solución que contiene por lo menos 4% de ácido acético y pequeñas cantidades de alcohol, glicerina, esteres, azúcares y sales.

Acetobacteriaceae La familia Acetobacteriaceae está conformada por dos grandes géneros: Acetobacter spp. y Gluconobacter spp. formadoras ambas de ácido acético y que se diferencian por que el Acetobacter spp puede oxidar el ácido acético a CO2 y H2O, mientras que las Gluconobacter spp no. La especie Acetobacter, entre las que se encuentran A. aceti, A. orleanensis, A. schutzenbachii, entre otras, se localizan ampliamente en el suelo y el aire y por lo general aparecen en uvas, manzanas y otras frutas, por lo que fácilmente se produce la fermentación acética después de la fermentación alcohólica espontanea, salvo que se evite este proceso. Son bacterias elipsoides y esféricas, sueltas o unidas en cadenas de dos o más. Inmóviles o móviles por medio de

Infovideo que presenta la elaboración del queso

C2H5OH (Etanol) + O2 + Bacteria CH3COOH (Ácido Acético) + H2O

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flagelos perítricos. Se manifiestan como gram negativos en su juventud y volubles con respecto al Gram en su madurez. Son aerobios, catalasa positivos, formadores de indol y de H2S. Gluconobacter spp son células elipsoides o redondeadas. Gram negativas o Gram variables, móviles por flagelos polares o inmóviles, aerobios. Productores de indol y de H2S23. Elaboración del Vinagre Existen dos métodos utilizados en la elaboración del Vinagre, que dependen de la forma de aireación: - Métodos Lentos, como el procedimiento casero y el método francés o de Orleans, en los cuales no hay movimiento del líquido alcohólico durante la acetificación (formación del ácido acético). - Métodos Rápidos como el método del generador y el sistema de fermentación sumergida, en los cuales hay movimiento del líquido alcohólico. El método más utilizado es el del generador que consiste en un tanque de aproximadamente 5 m de diámetro por seis m de alto y en cuyo fondo perforado se colocan virutas de madera. En una tapa falsa perforada se hace que pase el aire hacia arriba por las virutas. Las virutas son empapadas lo mejor posible en vinagre de la mejor calidad para inocularlas con una cepa de la familia Acetobacteriacea, es decir, las virutas son el soporte físico para los microorganismos. Una solución alcohólica distribuida en la tapa superior escurre lentamente por las virutas. La oxidación bacteriana de alcohol a ácido acético, en las virutas, desencadena la producción de calor y el generador funciona como una chimenea, haciendo que el aire pase por el fondo. En algunos casos se hace necesario usar serpetines que mantengan la temperatura entre 25 a 30 oC. La producción final del vinagre requiere de la recirculación por el generador varias veces.

23 Beryey´s Manual of Determinative Bacteriology. 9a. Ed. 1994. p.279

Lectura de profundización sobre la producción del vinagre

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Lección 19. Producción de ácido cítrico (o citrato) El ácido cítrico se utiliza como acidulante en bebidas, como auxiliar en la fabricación de mermeladas, como aditivo general en las industrias de repostería, como antioxidante y ajustador de pH de muchos alimentos. La materia prima utilizada para la producción de citrato son las melazas o jarabes de glucosa, enriquecidas con nitrógeno y sales. Para la elaboración del ácido cítrico se trabaja con cepas de Aspergillus niger y Candida guillermondii, que pueden crecer a un pH por debajo de 2.0, muy útil para la producción del citrato y que sintetizan la enzima piruvato carboxilasa que es la que permite la conversión del ácido pirúvico a oxalacetato y este a citrato, por unión con un Acetil-CoA (metabolismo aerobio) Figura 23. La fermentación se realiza de 25 a 30 ºC y necesita de 7 a 10 días, al cabo de los cuales el ácido cítrico es precipitado en forma de citrato de calcio y se recupera al tratarlo con ácido sulfúrico.

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Figura 25. Proceso metabólico que conduce a la acum ulación de citrato. La producción de citrato implica los siguientes pasos: 1. Descomposición de las hexosas a piruvato y acetil CoA, 2. Formación del oxalacetato a partir de piruvato y CO2, 3. Acumulación de citrato dentro del ciclo de Kreebs o ciclo del ácido tricarboxílico. La oxidación del piruvato y el ciclo del ácido cítrico se realizan en la matriz mitocondrial. Fuente: Claudia Zambrano Lección 20. Otros procesos industriales Existen una amplia gama de productos industriales elaborados mediante procesos donde intervienen los microorganismos, aquí se relacionan los que tienen importancia para el área de los alimentos: Producción de ácido giberélico El ácido giberélico es utilizado para acelerar la producción de malta y se obtiene del hongo Fusarium monoliforme. Para su producción se requieren dos condiciones importantes, un bajo contenido de nitrógeno y una mezcla de fuentes de carbono24.

24 Ward, O.P. 1989. Biotecnología de la fermentación. Principios, procesos y productos. Edit. Acribia S.A. Zaragoza. España. 159p.

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Producción de ácido glutámico El ácido glutámico se utiliza como potenciador del sabor en los alimentos y se obtiene de procesos de fermentación con Corynebacterium glutamicum. Para la producción del glutamato, se utiliza como materia prima las melazas o almidón hidrolizado con una adecuada fuente de nitrógeno y la ruta utilizada es la “vía de Embden-Meyerhoff-Parnas”. Producción de Lisina La lisina es un aminoácido esencial en la nutrición de animales y el hombre por lo que su producción es muy importante a nivel industrial. Este aminoácido se produce por fermentación directa de un mutante de Corynebacterium glutamicum. Producción de enzimas La producción industrial de enzimas, utilizando los procesos metabólicos de los microorganismos, se ha ido ampliando cada vez más debido a los diferentes usos y aplicaciones en la industria de los alimento. Entre otros se encuentran:

Microorganismo Enzima que produce Utilidad de la en zima Observaciones

Mucor, E. coli Renina (Quimosina) Participa en la producción de queso

E. coli ha sido modificada genéticamente para este fin.

Aspergillus oryzae Proteasas Ablanda carnes y modifica la masa de pan y galletas.

Aspergillus niger Pectinasa Jugos de frutas

La pectinasa eleva el rendimiento del zumo, reduce la viscosidad y mejora la extracción del color de las frutas (Ward,1989)

Aspergillus niger Lipasa Participa en la producción de queso

Saccharomyces fragilis Lactasa Fabricación de dulces Enzima intracelular Saccharomyces

cerevisiae Invertasa Fabricación de dulces

Trichoderma viride Celulasa Jugos de frutas, café

Bacillus subtilis β-amilasa Elaboración de la cerveza

Tabla 5. Microorganismos productores de enzimas uti lizadas en el área de alimentos Fuente: Claudia Zambrano La mayoría de enzimas son extracelulares lo que favorece su obtención y los costos de producción. Las proteasas son las de mayor producción industrial.

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¿Cuál es la diferencia fundamental entre fermentación y respiración? ¿Qué es la glucolisis? ¿Cuáles son los productos del ciclo de Kreebs? ¿Cuál es la diferencia entre la fermentación homoláctica y la fermentación heteroláctica?

Para qué sirve la microbiología? La Xanthomona campestris es un bacilo Gramnegativo que afecta las plantas produciendo una enfermedad llamada: putrefacción negra. En este caso la bacteria utiliza la glucosa, elaborada por la planta, para formar una masa gomosa llamada Xantano. Esta sustancia obstruye el transporte de nutrientes de la planta. El xantano no produce efectos adversos en el humano, por lo que puede utilizarse como espesante en productos lácteos y aderezos para ensaladas y en cosméticos como las cremas para el cutis y los champús. Para lograr esto, se debió identificar una cepa de Xanthomona campestris que utilizara la lactosa, como fuente de carbono, en vez de la glucosa, de manera que pudiera transformar el principal azúcar presente en el suero de la leche, producto de desecho en la elaboración del queso, y que gracias a este bacteria puede convertirse en xantano, obteniendose un valor agregado en la elaboración del queso25. Capítulo 5. Microorganismos indicadores de alimento s Muchos alimentos son elaborados en condiciones desfavorables que facilitan la contaminación con varios microorganismos. Sin embargo la supervivencia y multiplicación de estos microorganismos depende de la composición del alimento y las condiciones de almacenamiento, entre otros. Para controlar estas dificultades se han establecido un grupo de microorganismos que al ser identificados en los alimentos indican o señalan la calidad, idoneidad e inocuidad del producto alimenticio por lo que su adecuado reconocimiento es fundamental para la evaluación del proceso productivo y validar, así, el producto final que llegará al consumidor.

25 USDA.2007.Estados Unidos. 27-35p.

Preguntas de repaso

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Las lecciones que se encuentran en este capítulo son:

Lección 21. Mesófilos Lección 22. Coliformes Lección 23. Salmonella Lección 24. Clostridium sulfito reductor Lección 25. Staphylococo aureus Lección 26. Hongos y levaduras Lección 27. Listeria monocytogenes Lección 28. Escherichia coli O157:H7 Lección 29. Bacillus cereus Lección 21. Mesófilos El recuento de microorganismos mesófilos es considerado el recuento indicador más general y amplio de alimentos, pues incluye todos los géneros aerobios y facultativos que crecen en medios simples a una temperatura entre 20-45º.C. El número de microorganismos mesófilos es un indicador del grado de contaminación de los alimentos en cualquier etapa del proceso de producción26. Los alimentos pueden tener una apariencia normal pero si su recuento de mesófilos es alto, señalaría que la alteración del producto está cercana, por lo que también se considera un indicador de la vida útil o media del alimento. El recuento de mesófilos tiene algunas limitaciones27:

26 Sánchez, M y col. 1988. Análisis microbiológico de alimentos. INS. Bogotá. Colombia. p 18.

27 Yousef, A and Carlstrom,C. 2006. Microbiología de los alimentos. Manual de Laboratorio. Edit. Acribia. Zaragoza. España. p.78.

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- Los alimentos fermentados, como por ejemplo el queso Cheddar, contienen naturalmente un número elevado de carga microbiana, por lo que el número de mesófilos no es útil para evaluar la calidad microbiológica de estos alimentos. - El medio utilizado para la recuperación de estos microorganismos no permite el crecimiento de aquellos que son exigentes en sus requerimientos nutricionales por lo que no permiten evaluar este tipo de microorganismos. - Por las condiciones de incubación de los mesófilos no se puede determinar ni anaerobios estrictos ni hongos y levaduras. Lección 22. Coliformes Son bacterias aerobias o facultativas anaerobias, gram negativas, no formadoras de esporas, con formas bacilares y fermentadoras de lactosa con la producción de ácido y gas en 48 h. a 35º.C. Los coliformes comprenden al menos tres géneros: Escherichia, Klebsiella y Enterobacter. Como los coliformes se encuentran normalmente en tracto intestinal, su presencia en los alimentos puede indicar contaminación fecal, además de una mala calidad higiénica en el proceso, falta de higiene en los manipuladores o recontaminación después del proceso. Sin embargo, la presencia de números elevados de coliformes en un alimento también puede deberse al crecimiento de un pequeño inóculo de origen no fecal. Por lo tanto, el recuento de coliformes debe interpretarse cuidadosamente. Lección 23. Salmonella El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae y comprende un grupo de bacterias que se caracterizan por ser gram negativas flageladas y de forma bacilar. Las salmonelas son anaerobias facultativas, por lo que presentan las dos vías metabólicas: oxidativa y fermentativa. Además, fermentan la glucosa formando ácido y gas, pero no fermentan la lactosa; crecen en citrato como única fuente de carbono, descarboxilan la lisina y suelen producir sulfuro de hidrogeno (H2S). La mayor parte de los serotipos de Salmonella solo crecen en el intervalo de temperaturas mesófilos. La pasteurización inactiva eficazmente estas bacterias. La vía de entrada de las salmonellas y de otros agentes de infecciones grastrointestinales es la oral. Los alimentos pueden contaminarse con excretas humanas o de animales en cualquier punto del proceso productivo. Sin embargo, los principales vehículos de transmisión son la carne (ternera, cerdo, aves), los huevos y los productos industrializados que contienen estas materias primas28.

28 Sánchez, M y col. 1988. Análisis microbiológico de alimentos. INS. Bogotá. Colombia. p 31

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El agua es uno de los vehículos de transmisión de la Salmonella y en general, los serotipos de mayor incidencia son la Salmonella typhimurium y Salmonella enteritidis. Lección 24. Clostridium Sulfito Reductor Es el grupo más importante de bacterias anaerobias formadoras de esporas y se encuentran normalmente en el suelo, por eso se consideran contaminantes naturales de la mayoría de alimentos, especialmente los de origen vegetal. Igualmente, algunos Clostridium spp. se encuentran en el tracto gastrointestinal de los animales por lo que se les considera contaminantes naturales de los alimentos de origen natural. En el caso de estos últimos alimentos el microorganismo se nutre de ellos y con la cocción de la carne el nivel de oxígeno disminuye lo que lleva a la formación de las endosporas. La presencia de recuentos altos de bacterias esporuladas en un alimento puede indicar una severa contaminación ambiental, deficiente manipulación o fallas en el proceso térmico destinado a la eliminación de esporas. La esterilización comercial de alimentos enlatados se ha diseñado para destruir los esporulados patógenos. Los principales Clostridium asociados a enfermedades transmitidas por alimentos (ETA´s) son: C. botulinum (proteolítico y no proteolítico), C. butyricum, C. perfringens, C. sporogenes y C. tyrobutyricum29. El C. botulinum en condiciones de anaerobiosis (por ejemplo, enlatados) sintetiza una exotoxina considerada la más potente de las toxinas naturales. Esta toxina tiene una fuerte afinidad por el sistema nervioso (neurotoxina), donde bloquea la acetilcolina, una sustancia química que permite la transmisión del impulso nervioso (neurotransmisor). Esta toxina puede ser destruida por la mayor parte de los métodos de cocción que llegan a los 100 ºC. Lección 25. Staphyloccocus aureus Es un coco Gram positivo que se organiza en forma de racimos y que presenta una alta capacidad de supervivencia en condiciones de sequedad durante un largo período de tiempo. Incluso pueden crecer en alimentos o medios de cultivo con bajas concentraciones de agua. La presencia de Staphyloccocus aureus en un alimento se interpreta como indicativo, principalmente, de contaminación a partir de piel, boca y fosas nasales

29 Yousef, A and Carlstrom,C. 2006. Microbiología de los alimentos. Manual de Laboratorio. Edit. Acribia. Zaragoza. España. p.95.

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de los manipuladores de alimentos, material, equipos sucios y materias primas de origen animal contaminados30. Son varios los métodos utilizados que pueden disminuir la población de Staphyloccocus aureus pero que no destruyen la toxina que este microorganismo produce. De hecho, está puede permanecer activa incluso después del proceso de pasteurización. Lección 26. Hongos y Levaduras La presencia de una gran cantidad de levaduras y mohos no es deseable en los alimentos, excepto en los quesos madurados por mohos. Un elevado número de estos microorganismos en los alimentos indica una mala higiene y manipulación deficiente, abuso de temperatura, tratamiento inadecuado o contaminación post-proceso. Cuando los hongos se desarrollan en alimentos ácidos, pueden consumir los ingredientes ácidos y en consecuencia aumentar el pH del producto, es decir tornarlo básico, lo que puede favorecer el crecimiento de bacterias contaminantes que no habían crecido antes por la acidez del alimento. Lección 27. Listeria Monocytogenes Es un bacilo gram positivo, no formador de esporas, móvil por la presencia de flagelos cuando se cultiva a 20-25 oC. La movilidad es mucho menor o se pierde por completo al cultivar la bacteria a 37 ºC. Es una bacteria aeróbica y microaerofílica y puede crecer en un intervalo de temperatura desde 1ºC hasta 45 ºC, siendo óptima entre 35-37 ºC, lo que permite su crecimiento en condiciones de refrigeración. También puede crecer en condiciones ácidas. Es una bacteria inocua en el medio ambiente, por lo que se ha aislado de materias primas como: leche, ensaladas, carnes y pescados. Igualmente, puede encontrarse en el ambiente donde se procesan los alimentos, por lo que se debe evaluar periódicamente la presencia de esta bacteria en muestras tomadas de la línea de producción31. Lección 28. Escherichia coli O157:H7 Bacteria Gram negativa flagelada, de forma bacilar y anaerobio facultativo (es decir posee las dos rutas metabólicas: respiratoria y fermentativa). Fermenta glucosa y otros carbohidratos produciendo ácido y gas.

30 Sánchez, M y col. 1988. Análisis microbiológico de alimentos. INS. Bogotá. Colombia. p 25 31 Yousef, A and Carlstrom,C. 2006. Microbiología de los alimentos. Manual de Laboratorio. Edit. Acribia. Zaragoza. España. p.112.

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Las diferentes cepas de E. coli se clasifican de acuerdo a dos tipos de antígenos presentes en su superficie: El antígeno O de la capa de lipopolisacaridos y el antígeno flagelar denominado H. En la actualidad se reconoce la existencia de 167 antígenos O y 53 antígenos H. Los serotipos de E. coli se identifican con estos dos antígenos añadiendo dos números al nombre de la especie. El primero indica el antígeno O y el segundo el H, por ejemplo: E. coli 055:H6, E. coli O111:H8. E. coli O157:H7 y E. coli O167:H432 . E. coli es un microorganismo normal del tracto intestinal y la mayoría de cepas son inocuas para el ser humano. Las cepas patógenas se clasifican de acuerdo a sus factores de virulencia, los síndromes clínicos que provocan y sus mecanismos de patogenicidad. El ganado vacuno es el principal reservorio de E. coli O157:H7, por lo que esta bacteria está muy asociada con carne picada de vacuno poco cocida. Aunque también se ha aislado de: leche cruda y pasteurizada, cuajadas de queso y lechuga. El agua también se considera un vehículo para su transmisión. Lección 29. Bacillus cereus Es un microorganismo aerobio, Gram positivo, esporulado y se encuentra normalmente en el suelo, vegetales, alimentos crudos y procesados. Cuando se encuentra un recuento alto de este microorganismo (mayor de 106 UFC/g) en un alimento puede ocasionar intoxicación alimentaria. Se ha asociado a brotes de enfermedad de alimentos con almidón, carnes cocidas, hortalizas, sopas, ensaladas y pudines33. ¿Qué utilidad tiene el recuento de mesófilos en alimentos? ¿Qué indica la presencia de coliformes en el alimento? ¿Qué beneficio tiene la esporulación para el microorganismo?

Para qué sirve la microbiología?

32 Ibis. p.117 33 Ibis. p.124

Preguntas de repaso

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La importancia de identificar microorganismos patógenos en los alimentos, radica en poder organizar las medidas preventivas necesarias que eviten afecciones al consumidor y que además, fundamenten la implantación de sistemas de calidad que garanticen la inocuidad e idoneidad del alimento. Dentro de estos sistemas se destacan las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) y la identificación de Puntos Críticos de Control (HACCP), que en parte se basan en los hallazgos microbiológicos obtenidos durante el proceso de producción o en el producto final. Capítulo 6. Enfermedades transmitidas por alimentos (ETA´s) Las ETA´s se refieren a los procesos patológicos causados por el consumo de un alimento contaminado por bacterias, protozoos, helmintos o virus. Si la ETA’s tiene un origen bacteriano puede clasificarse, en infecciones e intoxicaciones, de acuerdo a la forma como actúa el agente causal (Figura 26):

Figura 26. Tipos de ETA´s. Fuente: Tomada y modificada de Youself, 2006 En el caso de las ETA´s, la infección se origina por la ingestión de microorganismos vivos en el alimento y la intoxicación por el consumo de toxinas producidas por los microorganismos. En este último caso no es necesaria la presencia del microorganismo sino la de la toxina.

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A su vez, las enfermedades de tipo infeccioso se pueden clasificar en: - Infecciones no invasivas (toxiinfecciones) que se refieren a aquellas infecciones que se producen en el intestino y los microorganismos causantes de la enfermedad elaboran toxinas que aumentan su patogenicidad. - Infecciones invasivas, en las cuales el agente causal puede atravesar la barrera intestinal y colonizar otros tejidos.

Las lecciones que se encuentran en este capítulo son:

Lección 30. Enfermedades transmitidas por alimentos de tipo tóxico Lección 31. Enfermedades transmitidas por alimentos de tipo infeccioso Lección 32. Enfermedades transmitidas por alimentos causadas por Protozoos Lección 33. Enfermedades transmitidas por alimentos causadas por Helmintos Lección 34. Enfermedades transmitidas por alimentos causadas por Virus Lección 30. Enfermedades transmitidas por alimentos de tipo tóxico Gastroenteritis estáfilocócica Es producida por el Staphylococcus aureus y se considera una de las más frecuentes. Debe haber al menos 106 UFC/g o mL para que el microorganismo produzca la cantidad suficiente de toxina y se desarrolle la enfermedad. Los síntomas aparecen a las 4-6 horas de haber consumido el alimento y los más frecuentes son: dolores abdominales, vómitos, nauseas, diarreas y no cursa con fiebre. Normalmente se da en los extremos de la vida: niños y adultos mayores. Los alimentos más relacionados con este tipo de ETA son los productos de pastelería rellenos de crema, productos lácteos, ensaladas y algunos productos cárnicos34. Botulismo El botulismo es un tipo de intoxicación por alimentos producida por el C. botulinum, debido a la neurotoxina que sintetiza este microorganismo y que lleva a

34 Yousef, A and Carlstrom,C. 2006. Microbiología de los alimentos. Manual de Laboratorio. Edit. Acribia. Zaragoza. España. p.119.

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una parálisis progresiva que dura de 1 a 10 días y que puede producir la muerte por insuficiencia cardiaca y respiratoria. Sus síntomas aparecen a los 1 o 2 días de ingesta del microorganismo y se incluye también debilidad y dificultad para deglutir. El botulismo no es una enfermedad frecuente, solo se registran algunos casos anuales, aunque en ocasiones se presentan brotes en restaurantes. Parece ser que el C. botulinum es incapaz de competir de manera eficaz con la microflora normal del intestino, por lo que la producción de toxina por las bacterias ingeridas casi nunca causa botulismo en adultos. A diferencia de los niños cuya flora intestinal no está bien desarrollada y el C. botulinum puede producir el botulismo infantil35. Intoxicación por Aflatoxina Este tipo de intoxicación se produce por la ingesta de la aflatoxina, una micotoxina elaborada por el Aspergillus flavus, un hongo filamentoso y que se ha encontrado principalmente en el maní. En el humano, esta aflatoxina, se ha relacionado con la cirrosis y el cáncer hepático y en el ganado produce daños graves cuando consume alimentos contaminados con la aflatoxina. Lección 31. Enfermedades transmitidas por alimentos de tipo infeccioso Gastroenteritis por C. perfringens (Toxinfección) Si se ingiere C. perfringens en un alimento, la bacteria esporula en el intestino y simultáneamente produce una toxina, para luego continuar con una infección no invasiva. Con la formación de la toxina aparecen los síntomas típicos: dolor abdominal y diarrea. La mayoría de los casos son leves y no se diagnostican. Los síntomas suelen aparecer de 8 a 12 horas después de la ingestión y el tratamiento es la rehidratación oral. Este tipo de gastroenteritis es muy similar a la producida por el B. cereus. Colitis Hemorrágica o Diarrea del viajero (Toxinfec ción)

35 Tortora, G.J. y col. 2007. Introducción a la microbiología. Edit. Médica Panamericana. 9ª. Edición. Buenos Aires. p 650.

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La mayor parte de las cepas patógenas de E.coli se clasifican en: enteropatógenas, enterotoxigénicas, enteroinvasivas, enteroagregativas y entero hemorrágicas. La E. coli O157:H7 y otros miembros del grupo enterohemorrágico, como son: O26:H11, O111:H8 y O157:NM, se consideran los causantes de la colitis hemorrágica. El período de incubación suele ser entre 3 a 4 días, tiempo en el cual la bacteria coloniza el intestino grueso y produce la toxina. Ataca principalmente los extremos de la vida: niños y adultos mayores. Los síntomas con los que cursa la enfermedad son: intensos dolores abdominales y diarrea que termina siendo sanguinolenta de acuerdo al progreso de la enfermedad. Ocasionalmente hay vómitos y no se presenta con fiebre. En los niños puede desembocar en un síndrome urémico hemolítico (HUS) que lleva a un daño renal severo y finalmente la muerte. Cólera (Toxiinfección) Enfermedad producida por el Vibrio cholerae, un bacilo Gram negativo de forma curva que posee un único flagelo polar. El vehículo de transmisión es el agua no tratada y por consiguiente los alimentos preparados con este tipo de agua. La bacteria llega al intestino y allí se reproduce liberando una exotoxina que induce a las células intestinales a secretar gran cantidad de líquidos y electrólitos. Además, altera las contracciones normales musculares, lo que causa una diarrea grave que puede estar acompañada de vómitos. Esta diarrea se caracteriza por tener heces acuosas con masas de moco intestinal y células epiteliales y que se conoce como “heces en agua de arroz”. La perdida de líquidos y electrólitos puede provocar shock, colapso y muerte. Listeriosis (Infección invasiva) Es un tipo de ETA, donde la dosis infectiva es de más de 102 UFC/g o mL. El período de incubación oscila entre una y varias semanas. Se presenta principalmente en niños menores de 4 años, embarazadas, adultos mayores y pacientes inmunocomprometidos. Los principales síntomas son bacteremia y meningoencefalitis. La tasa de mortalidad es del 20 ó 30%. En el caso de las mujeres embarazadas puede llevar al aborto, nacimiento de niños muertos o partos prematuros36. Este microorganismo puede resistir los efectos del congelamiento, secado y calentamiento suave y puede multiplicarse a bajas temperaturas (especie sicrótofa). Salmonelosis (Infección invasiva)

36 Yousef, A and Carlstrom,C. 2006. Microbiología de los alimentos. Manual de Laboratorio. Edit. Acribia. Zaragoza. España. p.150.

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Los principales agentes causales de la fiebre tifoidea (entérica) son la Salmonella typhi y Salmonella paratyphi y sus síntomas incluyen diarrea, dolor abdominal, dolor de cabeza y fiebre alta y prolongada. Su período de incubación varía de 1 a 7 semanas. Este tipo de salmonelosis corresponde a menos del 5% del total de casos de salmonelosis. La forma más frecuente de salmonelosis humana es la gastroentérica o enterocolítica cuya causa puede ser cualquiera de los 150 serotipos de Salmonella. Es una enfermedad que cursa con: diarrea, dolor abdominal, escalofríos, fiebre moderada, vómitos, deshidratación y dolores de cabeza. Su período de incubación se encuentra entre 12 y 36h y su duración de 1 a 4 días37. Shigelosis (Infección invasiva) También conocida como disentería bacilar y producida por cualquiera de los 4 tipos de Shigella, bacilos Gram negativo anaerobios facultativos: S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexneri y S. boydii. Es una bacteria que soporta los ácidos gástricos y llega al intestino grueso donde ataca las células intestinales, diseminándose por ellas. La disentería es consecuencia del daño de la pared intestinal y puede producir hasta 20 deposiciones diarias, cólicos abdominales y fiebre. La S. dysenteriae produce la toxina de Shiga que es muy virulenta y en algunos casos también se le atribuye a E. coli 38. Lección 32. Enfermedades transmitidas por alimentos causadas por Protozoos Son enfermedades de tipo infeccioso cuyo agente causal es un protozoo. Entre las principales encontramos: Giardiasis Su agente causal es la Giardia lamblia y como se menciono anteriormente es un protozoo flagelado. Produce diarrea prolongada, que puede durar semanas y que cursa con malestar general, nauseas, flatulencia, debilidad, pérdida de peso y cólicos abdominales. Su patogenicidad se debe a que ocupa gran parte de la pared intestinal e impide la absorción de los alimentos. Se transmite por agua contaminada y se disemina a través de las heces de portadores sanos o no. Enfermedad Amibiana

37 Ibis. p.162 38 Tortora, G.J. y col. 2007. Introducción a la microbiología. Edit. Médica Panamericana. 9ª. Edición. Buenos Aires. p 324.

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También es conocida como Disentería Amebiana o Amibiasis y su agente causal es la Entamoeba histolytica. Este protozoo se puede encontrar, en forma de quiste, contaminando el agua o los alimentos. Una vez llega el quiste al intestino (soporta los ácidos estomacales) se fija a su pared y libera trofozoítos que penetran las células epiteliales lo que produce una diarrea que puede ser súbita o progresiva, casi siempre acompañada de cólico, flatulencia y deposiciones mucosanguinolentas. Estas crisis pueden mejorar incluso sin tratamiento médico. La amibiasis intestinal, ocasionalmente, puede complicarse y producir amibiasis de tipo extraintestinal39: - Perforación del colón con la consecuente peritonitis del paciente. - Amibiasis hepática, cuya frecuencia y gravedad están relacionados directamente con las malas condiciones sanitarias en que se encuentren las personas. - Amibiasis cerebral, muy rara y cuya vía de invasión, posiblemente, es a través del sistema circulatorio por vía carotidea. - Amibiasis genital y cutánea, por malos hábitos higiénicos Lección 33. Enfermedades transmitidas por alimentos causadas por Helmintos Las enfermedades transmitidas por este tipo de organismos están relacionadas con las malas condiciones higiénicas de los manipuladores y las zonas de trabajo, además de una inadecuada preparación de los alimentos. Son también conocidas como Helmintiasis intestinales. Teniasis Los agentes causantes de esta patología, dependen del alimento ingerido: - Taenia saginata (Tenia de la vaca) - Taenia solium (Tenia del cerdo) - Diphyllobothrium latum (Tenia del pez) El ciclo infeccioso inicia cuando el ganado ingiere pastos o alimento que contiene los huevos de la Taenia y pasan al estado de larva, llamada cisticerco que se aloja en el músculo del animal. Al consumir carne de vaca o cerdo mal cocida el hombre adquiere la infección. En el intestino humano los cisticercos pasan al estado adulto y se adquieren a la pared intestinal mediante ventosas ubicadas en la cabeza de

39 Argüello M. 1985. De la Entamoeba histolytica a la enfermedad amibiana. Laboratorios Synthesis. División Gastrointestinal. Bogotá. Colombia.p.85

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la Taenia. Esta afección es benigna y asintomática, pero el humano está permanentemente eliminando los huevos de la Taenia. En el caso de la Teniasis por T. solium puede producir complicaciones conocidas como: cisticercosis oftálmica, cuando las larvas atraviesan intestino y se alojan en el ojo o neurocisticercosis, que se produce cuando las larvas se desarrollan en el sistema nervioso central. En el caso de la Diphyllobothrium latum su transmisión está relacionada principalmente con el consumo de trucha y salmón mal cocidos y también con el sashimi y sushi, alimentos que se consumen crudos. Fasciolosis humana Es una enfermedad zoonótica producida por la Fasciola hepática, transmitida por el consumo del hígado, mal cocido, de animales, que se encuentra contaminado con el trematodo. Una vez en el intestino humano el parasito, produce síntomas leves como fiebre y al cabo de 3 meses de migración llega a los conductos biliares donde alcanza la madurez y elimina huevos permanentemente. En la mayoría de los casos la enfermedad cursa asintomática y ocasionalmente se puede complicar produciendo obstrucción biliar, colecistitis aguda o crónica, ruptura hepática y cirrosis. Ascariasis Es una enfermedad causada por el nematodo Ascaris lumbricoides. Se transmite a partir de la ingestión de huevos del nematodo que pueden permanecer en los alimentos o en el agua, obviamente sin el debido manejo o tratamiento. En el tubo digestivo superior los huevos liberan pequeñas larvas en forma de gusanos que pasan a la sangre y luego a pulmones. De allí migran hacia la garganta donde son deglutidas y en el intestino, nuevamente, las larvas crecen y liberan huevos 40. Lección 34. Enfermedades transmitidas por alimentos causadas por Virus Hepatitis A El agente causal de esta enfermedad es el virus de la Hepatitis A (HAV), clasificado como un picornavirus, que presenta una cadena simple de RNA y que carece de cubierta. El virus puede sobrevivir varios días en las superficies donde se preparan los alimentos, como las tablas de picar y es resistente al cloro en las concentraciones que se utilizan para potabilizar el agua, lo que facilita la

40 Tortora, G.J. y col. 2007. Introducción a la microbiología. Edit. Médica Panamericana. 9ª. Edición. Buenos Aires. p 376.

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contaminación de los alimentos o las bebidas. Los moluscos y las ostras que se cosechan de aguas contaminadas, son otra fuente de infección (Tortora, 2007). Una vez ingresa el virus al organismo por vía oral se multiplica en las células intestinales y se disemina, vía hematógena, hasta el hígado, los riñones y el bazo. Su sintomatología comienza con anorexia, malestar general, nauseas, diarrea, molestias abdominales, fiebre y escalofríos. Por lo menos el 50% de las infecciones por HAV son subclínicas. La cantidad de virus excretado en heces es alto, antes de aparecer los síntomas, por lo que un manipulador de alimentos puede transmitir el virus sin saberlo. Un solo manipulador puede contaminar simultáneamente a docenas o cientos de personas, causando un fuerte impacto en la salud pública. La contaminación de un alimento con HAV puede ocurrir en cualquier punto durante el cultivo, cosecha, procesamiento, distribución o preparación del mismo. La principal fuente de diseminación del virus son los manipuladores de alimentos de puntos de venta (por ejemplo restaurantes) o quienes preparan alimentos para eventos sociales (por ejemplo bodas, aniversarios, etc). Gastroenteritis viral La causa más frecuente de esta enfermedad es el rotavirus, aunque también se encuentran los virus tipo Norwalk. Su forma de transmisión es por vía fecal-oral a través de los alimentos y del agua. Luego de un período de incubación de 18 a 48h se presentan vómitos y diarrea durante dos o tres días. La gravedad de los síntomas depende de la magnitud de la dosis infectante. El único tratamiento es la rehidratación oral. ¿Qué diferencia hay entre una diarrea viral o una causada por protozoos? ¿Qué efectos produce la perdida de líquidos y electrólitos durante la infección por V. cholerae? ¿La adhesión es un factor que influye en la patogenicidad de un microorganismo?

Para qué sirve la microbiología? En la naturaleza el agua raramente esta pura, incluso el agua-lluvia se contamina al caer a la Tierra y el área de alimentos no está exenta de la contaminación microbiológica del agua. Este tipo de contaminación es un punto fundamental de analizar, debido a que la mayoría de industrias alimenticias requieren como materia prima de producción, el agua. La microbiología acuática es el estudio de los microorganismos y sus actividades en aguas naturales como los lagos,

Preguntas de repaso

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estanques, arroyos, ríos, estuarios y océanos. Las aguas residuales domésticas e industriales llegan a los lagos y arroyos afectando profundamente los ecosistemas y por consiguiente los recursos hídricos que serán utilizados para consumo humano o para la industria alimenticia. En este caso, el estudio microbiológico de los ambientes acuáticos permite mitigar los efectos perjudiciales de los microorganismos o conocer las interacciones benéficas de los mismos y lograr recuperar dichos ambientes. Capitulo 7. Microbiología de ambientes y manipulado res El medio ambiente que rodea la elaboración del alimento es muy importante, pues a partir de este entorno el producto puede contaminarse o tener una alta carga microbiana que afecta la calidad del alimento. Por esto es necesario evaluar microbiológicamente el ambiente, las superficies y los manipuladores de alimentos, de manera que se pueda detectar la contaminación secundaria en el proceso del alimento. Aquellos sitios con una frecuente contaminación deberán ser evaluados más seguido, una vez tomadas las medidas correctivas, con el fin de mantener las buenas condiciones en la elaboración del producto. Los resultados obtenidos en la evaluación microbiológica del área de producción permitirán determinar la frecuencia con que debe hacerse la limpieza e higienización, así como comprobar la eficacia de los manipuladores en el momento de elaborar el alimento.

Las lecciones que se encuentran en este capítulo son:

Lección 35. Evaluación del ambiente Lección 36. Evaluación de los manipuladores de alimentos Lección 35. Evaluación del ambiente La evaluación del ambiente tiene 3 finalidades importantes: - Recuento total de microorganismos. - Identificación de microorganismos indicadores. - Detección de microorganismos patógenos. Evaluación de superficies

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Las superficies que pueden ser evaluadas en el área de alimentos son los equipos, envases, sala de maduración, entre otros. Las superficies que no entran en contacto directo con el alimento también pueden ocasionar contaminación, por ejemplo: paredes, suelos y vestuario de los operarios. Las superficies a muestrear pueden ser rugosas, lisas, planas, curvas y rincones, continuas o con hendiduras y rendijas, etc., por esto la elección del método utilizado para tomar la muestra depende de las características de la superficie. Evaluación del aire El grado de contaminación microbiológica del aire en una industria alimenticia influye en la calidad y seguridad de los alimentos pues el aire es un vehículo muy eficaz para el transporte de los microorganismos y esto se puede deber a: - Las actividades propias de la elaboración del alimento, por ejemplo el uso de harinas como materia prima. - La humedad relativa del sitio de trabajo. - Movimientos fuertes del aire. Los microorganismos contaminantes más encontrados en el análisis del aire son los mohos (esporas) y las bacterias esporuladas, por ser la forma resistente de las bacterias. Lección 36. Evaluación de los manipuladores de alim entos La evaluación de los manipuladores de alimentos es un punto muy importante dentro de la producción de alimentos pues son considerados uno de los principales focos de contaminación de los alimentos. La flora microbiana de los manipuladores puede llegar a multiplicarse hasta alcanzar una dosis infectante que contamine al alimento o las superficies donde se elabore el mismo. Para reducir lo más posible este riesgo es necesario que el personal que labora en el área de alimentos sea capacitado en conceptos como la higiene personal, la manipulación higiénica de los alimentos y el uso adecuado del equipo de protección individual: guantes, gorro, tapabocas, delantal, botas, etc. Igualmente, es importante que el manipulador comunique a su jefe directo la presencia de síntomas que indiquen el curso de alguna patología que pueda afectar la elaboración del alimento, como por ejemplo: - Ictericia - Diarrea - Vómitos - Fiebre

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- Dolor de garganta - Lesiones de piel visiblemente infectadas - Supuración de ojos, oídos o nariz.

¿La evaluación de ambientes se relacionará con el alimento elaborado? ¿Cómo capacitar al manipulador de alimentos en manejo higiénico del alimento? ¿Qué medidas de control microbiológico se pueden utilizar en el área de alimentos?

Para qué sirve la microbiología ? El método más eficaz para el control de las enfermedades son las vacunas. Aunque el interés en el desarrollo de vacunas disminuyó con la introducción de los antibióticos, poco a poco ha ido intensificándose. Las vacunas solamente se empezaron a producir masivamente, cuando se desarrollaron los cultivos celulares, por ejemplo el virus de la viruela se cultivaba en vientres rasurados de terneros, lo que obviamente dificultaba su producción. Un modelo conveniente que permite el desarrollo de muchos virus, es el embrión de pollo. Es importante destacar que la primera vacuna contra el virus de la hepatitis B utilizó antígenos virales extraídos de personas que padecían la enfermedad de forma crónica, pues no se disponía de otra fuente para recuperarlos. Actualmente, esta vacuna se obtiene por técnicas recombinantes de DNA por lo que no se necesita de un huésped celular o animal para la reproducción del microorganismo con fines de vacuna.

UNIDAD DIDÁCTICA 3

Infovideo que presenta las condiciones de higiene en el manejo de los alimentos.

Preguntas de repaso

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TÉCNICAS DE LABORATORIO UTILIZADAS EN EL LABORATORI O DE ALIMENTOS

UNIDAD 3. Técnicas de laboratorio utilizadas en el laboratorio de alimentos

Introducción

En la Unidad 3 se introduce al estudiante en las técnicas básicas de identificación microbiana en las que se incluye la microscopía, las tinciones y el cultivo de microorganismos en diferentes medios. Además, se hace referencia a pruebas más especializadas como son las pruebas serológicas y/o moleculares.

Justificación

La adecuada identificación de un microorganismo, ya sea patógeno o no, le permitirá al estudiante organizar estrategias adecuadas de control y manejo de la línea de producción logrando así la máxima calidad del producto alimenticio que este elaborando.

Competencias

1. El estudiante explica los diferentes tipos de tinción utilizados para la identificación de microorganismos.

2. El estudiante analiza y argumenta las estrategias a seguir frente al hallazgo de microorganismos patógenos en la línea de producción.

3. El estudiante identifica las técnicas de cultivo más idóneas para la identificación de microorganismos en las diferentes etapas de producción del alimento.

Propósito

Lograr que el estudiante comprenda la utilidad de las diferentes técnicas de identificación de microorganismos asociados a los alimentos y de acuerdo a los resultados obtenidos optimizar el proceso relacionado con la elaboración del alimento.

Objetivos

1. Que el estudiante determine las principales técnicas de identificación microscópica y de tinción asociadas con los alimentos.

2. Que el estudiante identifique claramente las técnicas de cultivo utilizadas en el área de alimentos.

3. Que el estudiante establezca los métodos de identificación apropiados para el reconocimiento de microorganismos asociados a ETA´s.

Horas de trabajo académico

El contenido de esta unidad corresponde a un crédito académico, que equivale a 12 horas de acompañamiento tutorial y 36 horas de trabajo independiente.

Palabras clave Técnicas de laboratorio, microscopía, tinciones, medios de cultivo, diluciones seriadas, evaluación de ambiente.

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Mapa Conceptual Unidad 3: Técnicas de laboratorio u sadas en el laboratorio de alimentos

Capitulo 8. Generalidades La amplia variedad microbiana encontrada en los alimentos debe ser aislada preliminarmente utilizando medios de cultivo apropiados para el ciclo de crecimiento y reproducción de cada microorganismo. Esto facilita enormemente la identificación del microorganismo asociado a una enfermedad de transmisión por alimentos. Igualmente, esta identificación se corrobora con técnicas microscópicas y tinciones especiales que permiten diferenciar las estructuras bacterianas, mejorando así la observación en las muestras del laboratorio.

Las lecciones que se encuentran en este capítulo son:

Lección 37. Microscopía Lección 38. Preparación en fresco Lección 39. Tipos de tinción

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Lección 40. Medios de cultivo Lección 37. Microscopía La utilización del microscopio es fundamental en la identificación de los microorganismos pues es el instrumento que permite visualizar aquello que no se puede ver a simple vista. La observación en el microscopio se logra mediante dos factores principalmente: aumento y resolución. Aumento La capacidad que tiene el microscopio para amplificar un objeto es fundamental para que el ojo pueda apreciar con precisión e independencia las características de lo que observa y así identificar claramente el microorganismo presente en la preparación. Normalmente se expresa por el signo “x” y luego el número de ampliación del objetivo: 4x, 10x, 40x y 100x. Resolución Se refiere a la capacidad que tiene el microscopio para dar imágenes distintas de puntos situados muy cerca uno del otro en el objeto que se está observando.

El manejo del microscopio es un conocimiento previo que debe recordarse del estudio anterior en el curso de biología. El estudiante debe ubicar este tema en el curso mencionado de biología, página Web de la UNAD, en las siguientes direcciones41:

Video: el Microscopio parte 1

Vídeo: El microscopio parte 2

Manual de Prácticas de Biología: Microscopia Páginas 15 a 43

Lección 38. Preparaciones en fresco

41 Piña, C. Manual de laboratorio. Curso Biología. UNAD.

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Para este caso los microorganismos se pueden observar in vivo o en fresco y corresponde a la forma más simple de observación. Existen principalmente dos tipos de técnicas utilizadas para este tipo de preparaciones:

En fresco Este método microscópico permite observar el microorganismo vivo y conocer sus características, morfología, color, tamaño real, movimiento, evita las deformaciones de su morfología producidas por las técnicas de coloración y fijación. Este tipo de preparación se emplea para detectar trofozoítos móviles de parásitos intestinales como Entamoeba hystolitica, huevos y quistes de otros parásitos (como el caso de las tenias y ascaris), larvas y gusanos adultos, hifas de hongos, Candida, etc. Gota Pendiente En este tipo de observación microscópica se construye una “pequeña cámara cerrada” que permite la observación continua de la movilidad bacteriana o el crecimiento de células individuales de un microcultivo. Lección 39. Tipos de tinciones La mayoría de los microorganismos son incoloros lo que dificulta la identificación de los mismos. Por esto se requiere someterlos a tinciones que permitan el contraste de sus estructuras y se facilite la observación. Lo primero que se debe hacer es tomar una muestra previa y realizar un frotis o extendido, es decir colocar una película del microorganismo sobre la lámina portaobjetos y dejarla secar al aire. Antes de teñir el microorganismo, a partir del frotis, es necesario realizar un procedimiento denominado Fijación y que permite preservar la morfología y composición química de la célula. Consiste en la muerte del organismo o célula que se quiera observar, de manera que las estructuras que poseía en estado vivo se conservan con un mínimo de artificios. La fijación puede ser mediante sustancias químicas (acetona, formaldehido, tetróxido de osmio, entre otros) o por acción del calor (flameado). En general, los colorantes utilizados son sales compuestas por un ión positivo y un ión negativo, uno de los cuales está coloreado y se conoce como cromóforo. El color de los denominados colorantes básicos está en el ión positivo; en los colorantes ácidos, está en el ión negativo. En un pH 7 las bacterias presentan una carga levemente negativa, por lo tanto, el ión positivo coloreado en un colorante

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básico es atraído hacía la célula bacteriana con carga negativa. Los colorantes básicos se utilizan más que los ácidos, debido a que estos últimos no son atraídos por la mayor parte de las bacterias pues la superficie bacteriana con carga negativa repele los iones negativos del colorante, de modo que este tiñe el fondo y no la estructura bacteriana42. Entre los colorante básicos más usados están: azul de metileno, fuscina básica, cristal violeta y safranina. Los colorantes ácidos se utilizan para teñir tejidos animales infectados de microorganismos: fuscina ácida, eosina y rojo Congo. En microbiología de alimentos el recuento directo de microorganismos utilizando métodos microscópicos es limitado, debido a la dificultad en la identificación y en el recuento bacteriano. Sin embargo, el análisis microscópico de una muestra alimenticia puede dar un panorama previo de los microorganismos presentes en el alimento. Existen dos tipos de técnicas de tinción utilizadas en el área de alimentos: Tinción simple Esta tinción permite destacar el microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras celulares básicas y normalmente se utiliza como una solución acuosa o alcohólica de un colorante básico único. Algunas veces es necesario aplicar una sustancia química que intensifica la coloración y que se conoce como mordiente. Esta sustancia tiene funciones como: aumentar la afinidad de un muestra biológica por un colorante, cubrir una estructura (por ejemplo, un flagelo) para darle mayor espesor y/o facilitar la observación después del teñido. En el laboratorio las tinciones simples más utilizadas son: Azul de metileno, carbolfucsina, el violeta de genciana (cristal violeta) y la safranina. Permiten identificar las cepas del yogurt y el vinagre (cocos, bacilos y estreptococos). En el caso de los hongos y levaduras la tinción más utilizada es el azul de lactofenol. Tinción diferencial Se utiliza para poder distinguir entre los diferentes tipos de bacterias o sus estructuras intracelulares. El primer colorante es el primario, que actúa como una tinción simple. Luego se hace la diferenciación, que consiste en aplicar una solución que quita el colorante primario a algunas células, bacterias o estructuras.

42 Tortora, G.J. y col. 2007. Introducción a la microbiología. Edit. Médica Panamericana. 9ª. Edición. Buenos Aires. p 69.

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El siguiente colorante es el colorante secundario o de contraste, que como su nombre lo indica permite contrastar estructuras o células para poder diferenciarlas. La tinción diferencial más utilizada en el área de microbiología es la tinción de Gram y se utiliza para diferenciar las bacterias en dos grandes clases: grampositivas y gramnegativas, además de permitir identificar la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos.) (Figura 27). Esta tinción se denominó así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844.

Figura 27. Tinción de Gram. Se observa la coloración característica violeta de las bacterias Gram positivas (lado izquierdo de la imagen) y la rosada de las bacterias Gram negativas (lado derecho de la imagen). Fuente: Infobiol.com

Como ya se menciono, sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram-positivas y Gram-negativas (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrica, sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias). Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula Gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la célula Gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula gram-negativa es peptidoglicano.

Lección 40. Medios de cultivo Para la adecuada identificación de un microorganismo, además de la observación microscópica y la tinción, se hace necesario que haya un crecimiento de la

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bacteria en condiciones controladas de temperatura, oxígeno y fuente de carbono, entre otros. Esto es lo que se conoce como cultivo de un microorganismo. Dicho crecimiento, para que sea totalmente controlado, se realiza en condiciones de laboratorio, y en sustratos llamados medios de cultivo, que contienen los nutrientes necesarios para el adecuado crecimiento microbiológico. Clases de medios de cultivo

El tipo de medio de cultivo a utilizar depende del microorganismo de interés y de la necesidad de realizar ese cultivo. Los medios se pueden utilizar para el crecimiento de una especie o para diferenciar entre cepas o especies.

En la literatura se encuentran diferentes formas para clasificar los medios de cultivo utilizados en el laboratorio. A continuación se enumeran algunas:

Según su consistencia o estado físico pueden ser:

1. Líquidos o caldos, que se emplean fundamentalmente para cultivar los microorganismos y obtener grandes cantidades de los mismos; para la producción de metabolitos específicos y estimular y promover la selección de algún o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen.

2. Semisólidos, que se utilizan para identificaciones bioquímicas y averiguar si el microorganismo estudiado es móvil. Los medios semisólidos tienen una consistencia blanda.

3. Sólidos o Agares, que se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. A diferencia de los líquidos se les agrega Agar. El agar es un polisacárido acídico producido por ciertas algas rojas, es un elemento solidificante que se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. El agar se usa a una concentración del 1,5%. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él. La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación.

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Según su utilidad práctica pueden ser:

1. No selectivos o generales: permiten el cultivo y crecimiento de una amplia gama de microorganismos. Por ejemplo, Caldo nutritivo, Agar nutritivo, Agar Soya Tripticasa (TSA), Agar marino 2216 o Zobell. A menudo están enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, Factor X, Factor V, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc.).

2. Selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) permiten el aislamiento y crecimiento del microorganismo o grupo de microorganismos de interés, para lo cual se manipulan factores ya sean de tipo nutricional o de tipo ambiental. Algunos medios son selectivos porque contienen un producto químico, como la azida sódíca, el telurito potásico o el cristal violeta, que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros. En el caso de utilizar factores nutricionales, se añaden al medio de cultivo sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de microorganismos, permitiendo a la vez el crecimiento de otros.

Los antibióticos, el cloruro sódico en altas concentraciones, colorantes y algunas sustancias químicas, son ejemplos de agentes selectivos que se añaden a los medios para inhibir el crecimiento de otros microorganismos diferentes al de interés. El agar SPS (denominado de esta forma porque contiene sulfadiacina y sulfato de polimixina) se utiliza para identificar Clostridium botulinum, agente causal de una grave intoxicación alimentaria. El medio SPS permite el crecimiento de esta bacteria, pero inhibe el de otras especies de Clostridium. Un ejemplo de la acción de los colorantes que inhiben selectivamente determinados microorganismos, es el verde brillante (Agar verde brillante), utilizado para establecer la presencia de Salmonella en heces fecales, ya que inhibe las bacterias Gram positivas y la mayoría de las bacterias intestinales. Para el caso de los factores ambientales se puede manipular la temperatura, el grado de humedad, el pH, la concentración de oxígeno o la intensidad de la luz. Son ejemplo de este tipo de medios: Agar Tiosulfato, Citrato, Sales de bilis, Sacarosa (TCBS) para cultivo de Vibrio y Agar Cetrimida para cultivo de Pseudomonas.

Otros medios de cultivo utilizados son:

Enriquecidos: suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K).

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Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos específicos de microorganismos, ayudando a su identificación (Lowenstein). En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. En el caso de los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos, por ejemplo el caso de la lactosa.

Diferenciales: permiten distinguir unos microorganismos de otros por las características que presentan las colonias. Para estos medios de cultivo se tienen en cuanta principalmente las características fisiológicas específicas de los microorganismos, por ejemplo, nutrición, respiración, entre otras. Algunos medios diferenciales llevan incluido un indicador de pH, que pone de manifiesto la degradación de un nutriente específico (generalmente un azúcar) por el cambio de color que se origina cuando éste es metabolizado. Los colorantes que se añaden a estos medios actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido. Un ejemplo es el medio Rojo Fenol, que es de color rojo en pH básico y amarillo en pH ácido.

Utilizando el cultivo de microorganismos en medio diferencial se pueden distinguir las bacterias que fermentan la lactosa (con producción de ácido) de las no fermentadoras.

Otros componentes como los colorantes actúan inhibiendo el crecimiento de cierto grupo de microorganismos, por ejemplo la Violeta de Genciana impide el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-positivas.

Algunos medios pueden ser a la vez selectivos y diferenciales. El agar Mac Conkey es un ejemplo de medio selectivo y diferencial. La presencia de sales biliares y cristal violeta inhiben el crecimiento de bacterias no entéricas (acción selectiva); la fermentación de lactosa con liberación de productos ácidos hace virar un indicador de pH incorporado en el medio (acción diferencial).

El agar sangre es un agar que contiene hematíes y permite reconocer los microorganismos que producen hemólisis. Por ejemplo para aislar la bacteria que causa la escarlatina, se utiliza el medio de agar sangre. Las colonias de esta bacteria producen hemólisis, es decir, muerte y lisis de los hematíes generando una zona transparente a su alrededor.

El Agar eosina-azul de metileno (EAM) permite identificar el crecimiento de coliformes y E. coli. Este medio contiene peptona, lactosa y los colorantes eosina y azul de metileno. En dicho medio se inhibe el crecimiento de otras bacterias, pero no el de las coliformes (éstas desarrollan colonias típicas). E. coli muestra colonias grandes, oscuras, negro-azuladas, centro casi negro, con brillo metálico verdoso causado por la luz reflejada. La presencia de coliformes como Enterobacter se

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manifiesta en colonias grandes, de color rosado pálido, mucosas, con centro oscuro y sin brillo metálico.

Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificación de casi cualquier bacteria.

¿Qué significa resolución? ¿Por qué es útil la identificación de Gram para recetar un tratamiento antibiótico? ¿Cómo se relaciona el metabolismo microbiano con los medios de cultivo utilizados?

Para qué sirve la microbiología? Los microorganismos por sí solos no son capaces de causar daño, pero gracias a los procesos evolutivos han logrado organizarse y convivir con especies diferentes, de manera que se relacionan simbióticamente unos a otros, logrando así un mayor poder de acción. Esto lo han hecho gracias a la posibilidad que tienen de formar lo que se conoce como biofilms o biopeliculas: agrupación de bacterias formando una biomasa en torno a una superficie cualquiera. Mediante a la observación directa con el microscopio láser cofocal de barrido (CSML), el cual permite ver el biofilm bacteriano in vivo, en tiempo real y completamente hidratado, se ha demostrado claramente que la mayoría de biofilms están formados por microcolonias de células bacterianas (15-20% volumen), envueltas en una densa matriz polimérica extracelular (75-80%) con marcados canales de agua (Londoño, 2006). Un ejemplo de la acción de estos biofilms es el V. cholerae, que gracias a esta forma de organización, puede sobrevivir en el océano y resistir la acción del ácido estomacal. Una vez el Vibrio atraviesa el estómago, las células individualmente se separan del biofilm y colonizan el intestino donde empieza a producir su patología característica43. 43 Zambrano, M.A. y Suárez, L. 2006. Biofilms bacterianos. Universitas Odontológica. PUJ. 19-25p.

Lectura de profundización sobre el cultivo de microorganismo y que incluye medios de cultivo, métodos de aislamiento y crecimiento bacteriano. Fuente: Universidad de Navarra. Instituto de agrobiotecnología.

Preguntas de repaso

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Capitulo 9. Técnicas de cultivo en alimentos En general las bacterias requieren una serie de condiciones estándar para su crecimiento y desarrollo, sin embargo existe un grupo de microorganismos que necesita ambientes y nutrientes especiales para poder crecer, aislarse y ser identificados en los alimentos. Esto hace necesario que deba haber claridad en las diferentes técnicas de recuperación y caracterización de los microorganismos causantes de una enfermedad o de la descomposición de un alimento, de manera que el control y erradicación del microorganismo sea mucho más efectivo y finalmente se obtenga un producto apto para el consumo humano.

Las lecciones que se encuentran en este capítulo son:

Lección 41. Técnica de diluciones seriadas Lección 42. Sistemas de siembra y recuento de colonias Lección 43. Técnicas de cultivo Lección 44. Técnicas de identificación de microorganismos Lección 45. Técnicas microbiológicas utilizadas en la evaluación de ambientes Lección 41. Técnica de diluciones seriadas Cuando la muestra del alimento debe ser analizada microbiológicamente es necesario realizar una serie de diluciones seriadas, que facilitan el recuento final de microorganismos presentes en dicho alimento. La muestra original se diluye para que el número de colonias desarrolladas en la placa, se encuentren entre 30 y 300 colonias y así permitir un óptimo crecimiento y facilitar la lectura. Cuando la muestra se diluye, el cálculo del resultado se realiza contando las colonias en aquellas placas que tengan entre 30 y 300 colonias, se promedia y se multiplica por el factor de dilución (Figura 28). El diluyente utilizado no debe afectar la viabilidad ni reproducción de los microorganismos. Los diluyentes más utilizados son: Agua de peptona tamponada (0,1%), solución salina isotónica y caldo de Tristona-sal. Lección 42. Sistemas de siembra y recuento de colon ias

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La cantidad de microorganismos presentes en un alimento depende del tipo de proceso al que se someta, su transporte y manipulación. Antes de que un alimento se analice microbiológicamente se le deben hacer diluciones seriadas para que el recuento de colonias sea ajustado a la realidad y a partir de estas diluciones sembrar.

Figura 28. Técnica de diluciones seriadas. Se observa el procedimiento práctico para la realización de esta técnica, ampliamente utilizada en el área de los alimentos y la farmacéutica. Fuente:http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/ documen/uni_02/58/texthtml/cap804.htm

La siembra se refiere a la operación de transferir e incorporar la dilución respectiva a una caja de petri con su correspondiente medio de cultivo. Existen varias formas de siembra:

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La siembra en superficie se realiza cuando, una vez solidificado el agar, se incorpora la dilución y se extiende sobre la superficie mediante la técnica de estría. Se utiliza para el recuento de hongos y levaduras. La siembra en profundidad se realiza cuando la dilución se dispensa primero en la caja de Petri vacía y luego se adiciona el agar tibio para mezclarlo con la dilución. Esta técnica se utiliza para el recuento de mesófilos. Una vez se llevan a incubar los medios de cultivo a los tiempos y temperatura que requieran los microorganismos para su crecimiento se debe evaluar el recuento de colonias. Para esto es necesario enumerar las unidades formadoras de colonias (UFC). El valor de UFC es un valor que expresa el número relativo de microorganismos de un taxón determinado en un volumen de un metro cúbico de muestra. Este procedimiento de denomina recuento en placa y que en últimas determina el número de células que pueden formar colonias en las cajas de petri observadas. El recuento de colonias puede hacerse visualmente o con ayuda de un contador de colonias. Conociendo el factor de dilución, el volumen del inóculo y el número de colonias de la placa (o el promedio de las placas duplicadas), el número de microorganismos del alimento se calcula mediante la siguiente expresión:

Recuento (UFC/ml o g) Media del número de colonias de placas duplicadas = Factor de dilución x Volumen inoculado en la placa Examen macroscópico de colonias El examen morfológico de las colonias bacterianas es un paso preliminar importante para la identificación de las colonias aisladas a partir de los alimentos. Las colonias bacterianas se caracterizan por ser redondeadas, colonias puntiformes o circulares, bordes lisos y en algunos casos ondulados y lobulados. Igualmente se observan diferentes coloraciones. Las colonias de levaduras son similares a las bacterianas mientras que las colonias de hongos filamentosos son más grandes y con aspecto algodonoso. El excesivo desarrollo de los mohos puede dar lugar a dificultades para el recuento. Para la identificación de un microorganismo, además de sus características morfológicas, se debe someter a pruebas adicionales bioquímicas, fisiológicas, serológicas o genéticas. Además, el examen microscópico (tinción simple o diferencial) es fundamental para la identificación morfológica de la cepa.

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Lección 43. Técnicas de cultivo Las técnicas de cultivo se realizan para enriquecer, enumerar (se refiere al recuento de colonias) o aislar microorganismos. Enriquecimiento Es una técnica que se utiliza cuando la cantidad de microorganismos presentes en el alimento no es la suficiente para ser detectada por el recuento directo en placa o para revitalizar microorganismos presentes en el alimento. El enriquecimiento se realiza en dos pasos fundamentales: - Preenriquecimiento o enriquecimiento primario, en el cual se utiliza un medio no selectivo buscando la recuperación del microorganismo de interés. Normalmente no se utilizan medios extremadamente ricos ni una incubación óptima que favorezcan el crecimiento acelerado de los microorganismos, pues el objetivo primordial de esta fase es un aumento moderado en el número de microorganismos para luego pasar a la siguiente fase. - Enriquecimiento secundario o selectivo, en esta etapa se hace un subcultivo, partiendo de la fase anterior, a un caldo selectivo donde, únicamente, crecerá el microorganismo de interés y se inhibirá el resto de microorganismos. Se utiliza para la identificación de microorganismos como: Clostridium perfringes, Listeria monocytogenes, Salmonelas y Escherichia coli O157:H7. Técnica del Número Más Probable (NMP) Esta técnica también se conoce como técnica de tubos múltiples (Yousef, 2003) y se utiliza para determinar el recuento presuntivo de coliformes. Para analizar el alimento mediante la técnica del NMP la muestra se diluye por la técnica de diluciones seriadas, como se describió anteriormente y luego se transfiere una alícuota o muestra a un medio selectivo diferencial, que normalmente es caldo Bilis Verde Brillante (BRILLA) donde, después de la incubación, se evidencia el crecimiento de los microorganismos por la turbidez del medio y la reacción típica de coliformes, que en este caso es la producción de gas a partir de la lactosa y que se evidencia en los tubos invertidos de Durham. El número de tubos positivos de las diluciones observadas se convierte en tablas estandarizadas para hallar el

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NMP. El NMP se basa en fórmulas de probabilidad y es una estimación de la densidad media de coliformes en la muestra44. Aislamiento El aislamiento de un microorganismo en un alimento se logra siempre que la muestra, enriquecida o no, se siembra en una placa que contenga un medio selectivo o selectivo diferencial adecuado. Para esta siembra se utiliza, principalmente, se utiliza la técnica de estría. El cultivo en estos medios es el sistema más confiable para aislar el microorganismo que se esté investigando. A continuación se presentan los principales medios utilizados en el aislamiento de patógenos en alimentos:

Microorganismo Medio de cultivo utilizado Observaci ones

Agar Baird-Parker

Medio selectivo-diferencial: El S. aureus forma colonias circulares, negras, rodeadas por un halo opaco y una zona clara.

Agar manitol sal

Medio selectivo-diferencial: El S. aureus produce cambio de color, apareciendo una tonalidad amarilla brillante

Staphylococcus aureus

Agar ADN azul de toluidina Medio diferencial: Detecta la desoxirribonucleasa del S. aureus

Listeria monocytogenes Agar Oxford Modificado (MOX)

Medio selectivo-diferencial: Presenta sustancias antimicrobianas como el cloruro de litio, sulfato de colistina y moxalactamo y que L. monocytogenes resiste.

Salmonella

Agar Sulfito Bismuto

Medio selectivo/diferencial: El bismuto selecciona la Salmonella frente a coliformes y Gram positivos

44 Yousef, A and Carlstrom,C. 2006. Microbiología de los alimentos. Manual de Laboratorio. Edit. Acribia. Zaragoza. España. p.176.

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Agar Entérico Hektoen

Medio selectivo/diferencial: presenta componentes que inhiben el desarrollo de Gram positivas

Caldo modificado para E. coli con novobiocina (mEC+N)

Se utiliza para diferenciar y enumerar coliformes. La novoviocina impide el crecimiento de los Gram positivos y de algunos Gram negativos, mientras que la mayor parte de las enterobacterias son resistentes al antibiótico.

Escherichia coli O157:H7

Caldo Sorbitol Rojo de Fenol

Confirma E. coli O157:H7 pues este serotipo no fermenta el sorbitol.

Tabla 6. Principales medios de cultivo utilizados e n el aislamiento de microorganismos asociados a ETA´s. Fuente: Claudia Zambrano Lección 44. Técnicas de identificación de microorga nismos Una vez aislado el microorganismo, se han desarrollado una serie de técnicas que permiten su identificación. Estas técnicas se pueden clasificar en tres grandes grupos: Pruebas bioquímicas, Pruebas inmunológicas y Pruebas genéticas o moleculares. Pruebas Bioquímicas En este caso se busca determinar las actividades metabólicas específicas de cada microorganismo mediante la identificación de metabolitos que reaccionan con los reactivos del medio de cultivo, produciendo virajes en el pH que se manifiestan con cambios en el color del medio. Las pruebas bioquímicas pueden ser tan sencillas como transferir una colonia a una lámina portaobjetos donde haya una gota de peróxido de hidrógeno (H2O2) y observar si hay producción de gas. Esta prueba se conoce como Catalasa y permite diferenciar entre Estafilococos y Estreptococos. Otro ejemplo es la prueba de fermentación de lactosa, que puede determinarse a partir de la siembra de agar MacConkey: si las colonias formadas son de color violeta, indican que son géneros lactofermentadores (E. coli, Klebsiella, Enterobacter) y si son colonias incoloras se está frente a no lactofermentadores (Salmonella, Shiguella, Proteus).

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Pruebas inmunológicas o serológicas La importancia de este tipo de pruebas radica en la rapidez, relativa sencillez en el procedimiento y la especificidad demostrada por la mayoría de las técnicas que están siendo utilizadas con este objetivo. Además permiten estudios rápidos epidemiológicos de ETA´s que surjan en la población. Este tipo de pruebas se fundamentan en el hecho de que los microorganismos son antigénicos, es decir que cuando ingresan en el cuerpo del humano o de un animal estimulan la formación de anticuerpos. Los anticuerpos son proteínas que circulan en la sangre y se unen específicamente con el microorganismo que origino su producción. Las pruebas serológicas son muy útiles en la identificación temprana de la hepatitis A. Los marcadores serológicos de la infección aguda por VHA son Anticuerpos IgM (IgM anti-VHA) que se logran identificar 5-10 días antes del inicio de los síntomas y van disminuyendo durante los siguientes 6 meses hasta ser indetectables. Además, las pruebas serológicas no sólo permiten diferenciar entre especies bacterianas sino también entre cepas de una misma especie. Las cepas con diferentes antígenos se denominan serotipos, serovariedades (serovares) o biovariedades (biovares)45. Una prueba serológica muy utilizada en el área de alimentos es ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas). Esta técnica puede ser: - Indirecta, que utiliza la detección de anticuerpos producidos por los patógenos asociados a la enfermedad (utilizada en el campo de la microbiología médica). - Directa, que detecta los antígenos del patógeno y es la más utilizada en el área de alimentos. En la ELISA directa se trabaja con la bacteria desconocida (el agente causal de la ETA´s) que se introduce en los pocillos de una microplaca que contiene adheridos anticuerpos conocidos. La reacción entre los anticuerpos conocidos y la bacteria permite identificar la bacteria. Se utiliza para la detección de Salmonella, pues permite descartar rápidamente los alimentos negativos, para esta bacteria, con una mayor rapidez. También se utiliza en la identificación de Listeria monocytogenes y Clostridium perfringes enterotoxigénico y la detección de toxinas bacterianas y micotoxinas.

45 Tortora, G.J. y col. 2007. Introducción a la microbiología. Edit. Médica Panamericana. 9ª. Edición. Buenos Aires. p 766.

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Pruebas genéticas o moleculares Estas pruebas se fundamentan en el hecho que la información genética de una célula bacteriana se encuentra en el cromosoma y, a veces, en el plásmido. Las secuencias que conforman el cromosoma son únicas para cada bacteria, lo que es utilizado para su identificación. Las principales técnicas utilizadas en alimentos son: - Hibridación de ácido nucleíco, en este caso la molécula de DNA del agente causal se somete al calor para romper los enlaces de hidrogeno entre los bases y separar las hebras que conforman el DNA. Luego se enfrían con lentitud las cadenas separadas para permitir que se unan a sondas de DNA (secuencia conocida y única de DNA) marcadas con enzimas que facilitan su identificación debido a reacciones colorimétricas. Este paso es el que se conoce como hibridación. Si una sonda de DNA se hibrida con DNA de un microorganismo desconocido es posible identificarlo por la semejanza de sus secuencias. Esta técnica se utiliza en la identificación de Salmonella. - Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), permite la identificación del microorganismo causal al aumentar la cantidad de DNA microbiano, utilizando enzimas termorresistentes (ADN-polimerasa), nucleótidos y un cebador (oligonucleótidos diseñados para unirse de forma complementaria a una única secuencia del DNA investigado). Si el DNA buscado no existiera en el alimento, el cebador no podría unirse y no se produciría la amplificación. Una vez amplificado el DNA, mediante una serie de pasos que incluyen calentamientos y enfriamientos sucesivos, la muestra se pasa por electroforesis en gel de agarosa para compararla con un patrón específico de DNA, que permite la identificación del microorganismo asociado a la ETA´s. En el área de alimentos esta técnica se utiliza para la identificación de Listeria monocytogenes. Igualmente, el diagnóstico de la gastroenteritis viral se realiza evaluando muestras de heces o vómito con PCR.

Lectura de profundización sobre el uso de las técnicas moleculares en el área de la biotecnología. Fuente: Amgen. Compañía mundial de biofarmacia (biotecnología aplicada a productos farmacéuticos).

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Lección 45. Técnicas microbiológicas utilizadas en la evaluación del ambiente Evaluación de superficies Para la evaluación de superficies se recomienda tener en cuenta las características de la superficie: Método de la torunda En este método se utiliza una torunda estéril, que en el extremo tiene una bola de algodón (aproximadamente 0,5 cm de diámetro y 2 cm de largo) unida a una varilla de madera (12-15 cm) y puede ser construida por el analista. Esta torunda se sumerge en agua estéril para poder tomar la muestra de la superficie46. Es recomendable en aquellas superficies de difícil acceso o que no sean totalmente planas (superficies irregulares). También es conocido como el método del frotis. Método de la esponja Se utiliza para evaluar superficies amplias o para la recuperación de microorganismos que tienen una baja incidencia en las zonas analizadas. En este caso se trabaja con una esponja natural o sintética estéril (5x5 cm) y libre de antimicrobianos. Para tomar la muestra se humedece la esponja en agua estéril y se restriega sobre la superficie que se quiere muestrear. Si la finalidad del muestreo es: - La detección de patógenos, la esponja se transfiere a un caldo de enriquecimiento y la mezcla se lleva a incubar, para continuar con el proceso de identificación. - Cuantificar la flora del ambiente, la esponja se mezcla con 50 a 100 mL de diluyente y se realizan las diluciones correspondientes47.

46 Yousef, A and Carlstrom, C. 2006. Microbiología de los alimentos. Manual de Laboratorio. Edit. Acribia. Zaragoza. España. p.182. 47 Ibis. p.194

Infovideo que muestra los pasos a seguir para la realización de la prueba serológica de ELISA. Fuente: Abnova Corp. Empresa productora de anticuerpos y proteínas.

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Método de replicación de microorganismos por contac to directo con agar (RODAC) También es conocido como Placa de contacto. Se aplica en superficies planas de fácil acceso y que hayan sido previamente limpiadas o higienizadas. En este caso se utilizan medios de cultivo apropiados que recuperen el microorganismo de interés y que contengan una mayor cantidad de agar a la normal, de manera que exceda la superficie de la caja de petri. Esto con el fin de tomar adecuadamente la muestra, pues para eso se presiona la placa contra la superficie a analizar y se mueve sin dejar de presionar. Después se coloca la tapa y se lleva a incubar, para observar el crecimiento bacteriano. Evaluación del aire Los métodos más utilizados para la evaluación del aire son: Sedimentación Consiste en exponer el medio de cultivo al ambiente, por un determinado tiempo, por ejemplo, 15 min. Los microorganismos del aire se depositan, por la fuerza de la gravedad, en el medio de cultivo, que se lleva a incubar y de acuerdo al recuento bacteriano se establecerá que nivel de contaminación existe en el aire. Filtración En este caso se hacen pasar corrientes de aire a través de microfiltros, con un diámetro de poro definido. Los microorganismos que hayan quedado en el filtro serán removidos mediante un diluyente adecuado, para luego inocularlos en los medios de cultivo necesarios para su crecimiento. Evaluación de manipuladores de alimentos La evaluación del manipulador de alimentos se inicia con la valoración de manos y uñas utilizando un escobillón impregnado de agua estéril para facilitar la recuperación de los microorganismos presentes. El escobillón se pasa por dedos y uñas para obtener una adecuada muestra del operario. Luego se pone en medio líquido de Tioglicolato para favorecer el crecimiento bacteriano y a partir de este caldo se siembra en los medios de cultivo correspondientes para la identificación del microorganismo, por ejemplo, agar sangre y agar nutritivo.

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Otra técnica utilizada es la impresión de dedos o guantes y que consiste en presionar los dedos o los guantes sobre el medio de cultivo y esta muestra se lleva a cultivar para recuperar los microorganismos presentes. También se pueden obtener muestras de secreción faríngea y secreción nasal las cuales se siembran en los medios de cultivo correspondiente para identificar la flora microbiana presente y evaluar la presencia o no de microorganismos patógenos. Otro punto anatómico importante a evaluar en el manipulador de alimentos es la cavidad oral. Grandes masas de bacterias se desarrollan en el interior de la boca, en las superficies epiteliales de la lengua, mejillas y en los dientes, por lo que su valoración indica las condiciones en que esta laborando el manipulador. Existe un grupo de microorganismos, asociados con problemas de contaminación en vinos como son los Streptococcus mitis, Streptococcus salivarius y Lactobacillus. Estas bacterias se asocian con la producción de aminas biógenas, que se definen como compuestos orgánicos de nitrógeno y que están relacionadas con una serie de alteraciones físicas en el consumidor, como por ejemplo y donde se destaca, la migraña. De ahí el interés en identificar este tipo de microorganismos en manipuladores vinícolas48. ¿Cuáles son las ventajas de los métodos utilizados en el área de alimentos? ¿El método del NMP se utiliza en que caso? ¿Qué ventajas tienen las pruebas serológicas y moleculares contra las Técnicas microbiológicas de rutina?

Para qué sirve la microbiología? Hacia 1815 se empezaron a incluir las primeras prácticas de control microbiológico en los procedimientos quirúrgicos y el cloro fue uno de los primeros antisépticos en usarse, incluso antes de que se supiera el papel real de los microorganismos en las enfermedades. Se utilizaba como cloruro de calcio para el lavado de manos y evitar la contaminación microbiana de heridas quirúrgicas. Fue muy importante para impedir la sepsis puerperal, que era transmitida por las manos de los médicos y de las parteras, y considerada como la causa de hasta el 25% de las muertes post-parto en mujeres49. Actualmente el hipoclorito de sodio, de calcio o de litio son las soluciones más utilizadas en las industrias alimenticias, en restaurantes, hoteles y hospitales y su actividad antimicrobiana es evaluada mediante técnicas microbiológicas que validan la acción de dichos desinfectantes. En general, el control microbiológico de los establecimientos alimenticios o de las

48 Angarita, E. 1990. Aminas vasopresoras en vinos, cervezas y jugos de frutas. Alimentaria. Vol. 1. No. 7. Pg 12-15. 49 Troya, J. 2007. Evaluación de la efectividad de desinfectantes Divosan Forte y MH en la desinfección de equipos y parea de trabajo en una empresa procesadora de helados. Tesis. PUJ. p.17.

Preguntas de repaso

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áreas intrahospitalarias, se realiza con el fin de comprobar el grado de limpieza de los mismos y por consiguiente el efecto de los desinfectantes en uso.

Gloosario

Ácido nucleíco: Biomolécula que almacena la información genética de un organismo y que está conformada por un azúcar (pentosa), un grupo fosfato y bases nitrogenadas (adenina, guanina, timina y citosina) ARNmensajero: Tipo de ácido nucleíco que participa en la producción de proteínas llevando la información codificada desde el DNA (núcleo) hasta los ribosomas (citoplasma). Biocontrol: Se refiere al uso de cualquier organismo vivo que facilite el manejo o control de las diferentes plagas en el área agrícola. Biofertilizantes: Se refiere a un grupo de microorganismos que gracias a sus procesos metabólicos pueden mejorar los problemas de deficiencia de nutrientes en el suelo y mejorar la productividad agrícola. Biomasa: Masa total de los seres vivos que están en un área determinada. Diploide: Se refiere a las células que tienen el número completo de cromosomas del organismo. Cuerpo basal: Corresponde a un orgánelo intracelular que permite la formación y el anclaje de cilios y flagelos. Ectoparasitos: Son aquellos parásitos que se mantienen externamente al huésped que colonizan. Endoparásitos: Son aquellos parásitos que habitan dentro del cuerpo de su huésped. Enzima: Sustancia de tipo proteínica que acelera una reacción bioquímica. Enzimas Hidrolíticas: También llamadas hidrolasas y son enzimas que rompen los enlaces de tipo éster, éter, peptído, glucosilo, entre otros, utilizando moléculas de agua. Enzimas proteolíticas: También llamadas proteasas y son aquellas que actúan sobre el enlace peptídico de las proteínas.

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Especie: Es un concepto que sigue siendo muy discutido, pero puede definirse como el grupo de organismos con un hábitat particular, características físicas similares y fértiles entre sí. Exoesqueleto: Se refiere al tipo de esqueleto externo que tienen algunos seres vivos como los artrópodos. Forma Vegetativa: Corresponde a la forma infectante y activa de un microorganismo. Gametos: Célula reproductora, masculina o femenina, con la mitad de los cromosomas del organismo y que al unirse con otro gameto forma el cigoto. Genoma: Se refiere al conjunto del material genético presente en un organismo. Glicoproteínas: También llamadas Glucoproteínas y corresponde a biomoléculas formadas por proteínas y carbohidratos. Haploide: Se refiere a las células que tienen la mitad del número total de cromosomas del organismo. Heterocigoto: Se refiere al organismo que presenta los dos alelos diferentes para una determinada característica. Interferon: Corresponde a un tipo de proteína antiviral producida por células animales, como los macrófagos y los linfocitos, después que estas han sido infectadas con un virus. Lipoproteínas: Biomólecula formada por la unión de un lípido y una proteína. Meiosis: División celular que ocurre en las células sexuales y en la cual se reduce a la mitad el número de cromosomas del organismo. Microscopio Electrónico: Tipo de microscopio que utiliza electrones emitidos por un filamento catódico a alta velocidad y que contiene tres o más electromagnetos en forma de anillo, uno que funciona como lente, otro como objetivo y otro como amplificador. Se pueden obtener amplificaciones de 100.000x. Mitosis: División celular que ocurre en el núcleo y en la cual se mantiene el número completo de cromosomas del organismo, lo que da lugar a dos células idénticas a la original. Polímero: Se refiere a cualquier compuesto químico formado por la unión de repetidas unidades básicas llamados monómeros. En los seres vivos existen tres ejemplos importantes de polímeros: ácidos nucleícos, polisacáridos y proteínas.

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Polisacárido: Resultan de la unión de muchos monómeros de hexosas (azúcares de 6 carbonos) con la correspondiente perdida de agua. Su fórmula es (C6H10O5) Plantas Transgénicas: Hace referencia a las plantas que han sido modificadas genéticamente para mejorar alguna de sus características biológicas. Procesos Fermentativos: Son aquellos procesos en los cuales intervienen enzimas microbianas que transforman sustancias orgánicas produciendo compuestos de utilidad industrial. Protoplastos: Se refiere a células vegetales sin paredes celulares. Respuesta Inmunológica: Se refiere a la reacción que tiene el sistema inmunológico o de defensa frente a un organismo o sustancia extraña. Ribosoma: Organelo celular encargado de la producción de proteínas. Sustrato: Se refiere a la base o material donde puede crecer un ser vivo. Taxonomía: Ciencia relacionada con la organización o clasificación de los seres vivos. Transcriptasa reversa: También llamada transcriptasa inversa. Es una enzima que poseen algunos virus y que utiliza el RNA viral como molde para producir DNA bicatenario complementario y así poderlo incorporar más fácilmente a la célula huésped. Virión: Es el término que se le asigna a una partícula de virus individual y que mantiene toda su capacidad infecciosa. Zigosopora: Tipo de espora sexual que se produce en los hongos y que permite su clasificación taxonómica.

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Bibliografía

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