osojnikg_2009_imobilizacija

Ljubljana, 2009

Seminarska naloga pri predmetu: Izbrana poglavja iz biotehnoloških procesov

Imobilizacija

Ilja Gasan Osojnik Črnivec

To delo je zaščiteno z licenco Creative Commons Priznanje avtorstva 2.5 Slovenija License http://creativecommons.org/licenses/by/2.5/si/

Osojnik Črnivec I. G. Imobilizacija. Seminarska naloga pri predmetu: »Izbrana poglavja iz biotehnoloških procesov«. UL, FKKT, Doktorski študijski program Kemijske znanosti, 2009

II

KAZALO VSEBINE str.

1 UVOD 1

2 KATALIZA 2

3 HETEROGENI KATALIZATORJI 3

3.1 PRIPRAVA TRDNIH HETEROGENIH KATALIZATORJEV 5

4 HOMOGENI KATALIZATORJI 9

4.1 HETEROGENIZACIJA HOMOGENIH KATALIZATORJEV 11 5 DVOFAZNI KATALITSKI SISTEMI 12

6 BIOLOŠKI SISTEMI 15

6.1 ENCIMI IN DRUGE KATALITSKO AKTIVNE BIOLOŠKE MOLEKULE 15 6.2 IMOBILIZACIJA ENCIMOV 21 6.3 CELICE 26 6.4 IMOBILIZACIJA CELIC 27 6.5 LASTNOSTI IMOBILIZIRANIH BIOKATALIZATORJEV 31 7 REAKTORJI ZA IMOBILIZIRANE SISTEME 32

7.1 KINETIKA 32 7.2 PRENOS SNOVI 35 7.3 LABORATORIJSKI REAKTORJI 36 7.4 VRSTE REAKTORJEV 37

8 ZAKLJUČEK 43

9 VIRI 44

NASLOVNICA

Na naslovni strani je prikazan del kristalne strukture Iβ oblike celuloze. Celuloza ima velik potencial, kot nosilni material za imobilizacijo. Mnoge beljakovine celo razpolagajo s strukturami, ki se vežejo izključno na celulozo (Linder & Teeri, 1997).


1

1 UVOD

Imobilizacija je omejevanje prostega gibanja neke snovi v okolju. V biotehnološkem kontekstu pojmujemo imobilizacijo kot omejevanje gibanja celic in njihovih delov, predvsem z zadrževanjem v ali na določenem nosilcu, z agregacijo in s flokulacijo (Bucke, 1983).

Z imobilizacijskimi tehnikami zmanjšamo potrebne količine in zagotovimo večjo obstojnost imobiliziranih komponent v procesu, enostavno separacijo od reakcijske mešanice in večkratno ali kontinuirano rabo v ustreznih reaktorskih sistemih (Bucke, 1983; Walker in Rapley, 2009).

V anorganski in organski kemiji poznamo podobne načine zadrževanja aktivnih katalitskih komponent v reakcijski mešanici, z namenom izboljšave procesne učinkovitosti. Na teh področjih izraza: »imobilizacija« ne uporabljamo, temveč govorimo o tehnikah priprave heterogenih katalizatorjev, heterogenizaciji homogenih katalizatorjev in dvofaznih sistemih.

Mnoge snovi, ki izražajo katalitsko aktivnost, lahko delujejo samostojno v suspendirani oz. prosti obliki (Ullman's Biotechnology ... , 2007). Takšni postopki pogosto niso upravičeni z ekonomskega vidika, saj so na proizvodnem nivoju potrebne velike količine prostih katalizatorjev, encimov ali celic za ustrezno pretvorbo reaktantov. Ponovna uporaba mobiliziranih katalitskih komponent je prav tako otežena, saj ostajajo v reakcijski mešanici še po separaciji produktov (Laskin, 1985). Stroški ponovnega pridobivanja katalizatorjev iz izrabljene reaktorske vsebine neredko kljubujejo uspehu znanstvenih dosežkov na proizvodnem nivoju (Rothenberg, 2008).

Imobilizacija katalitsko aktivnih snovi nam ponuja več prednosti pred sistemi, ki vsebujejo proste aktivne katalitske komponente (Marinšek-Logar, 1999):

- povečana koncentracija katalizatorja na enoto prostornine, - zmanjšan volumen oz. zmanjšan zadrževalni čas zaradi višje produktivnosti reaktorja, - neodvisen tok substratov / reaktantov in produktov od katalizatorja, - enostavna separacija katalizatorja od produktov reakcije, - večkratna raba katalizatorja v šaržnih procesih, - dolgotrajna raba katalizatorja v kontinuiranih procesih, - boljši nadzor procesa, - stabilizacija katalizatorja / znatno povečanje življenjske dobe imobiliziranih celic.

Imobilizirane komponente po zaključku šaržnega procesa enostavno ločimo od reakcijske mešanice in jih ponovno uporabimo v novi šarži. V kontinuiranem procesu vgradimo katalitsko aktivno snov, npr. v cevni rektor ter med samim procesom v bioreaktor dodajamo reaktante in odvzemamo produkte. Takšen sistem lahko vodimo več mesecev ali celo več let brez prekinitev S ponovno ali neprekinjeno rabo zmanjšamo potrebno količino surovin v procesu in tako zmanjšamo stroške njihove nabave. Nižji so tudi stroški cena zaključnih postopkov, ker separacijo produktov izvedemo v manj korakih. Končni produkti reakcije namreč niso kontaminirani s katalitskimi komponentami, saj so le-te že v osnovi ločene od reakcijske mešanice (Walker in Rapley, 2009).

Po izvedeni imobilizaciji lahko zaznamo poslabšanje ali izboljšanje lastnosti imobilizirane snovi v primerjavi z njeno prosto obliko. Pomembni lastnosti katalitsko aktivne snovi, na kateri lahko vplivamo z imobilizacijo, sta stabilnost in katalitska aktivnost. Obseg in vrsta spremembe je odvisna od lastnosti snovi same, lastnosti nosilnega materiala, reaktantov oz. substratov in produktov obravnavanega procesa. V konkretni situaciji je zato zelo težko napovedati, natančno


2

kakšen bo učinek nekega imobilizacijskega postopka (Ullman's Biotechnology ... , 2007; Bowker, 2008; Walker in Rapley, 2009)

Komercialna aplikacija imobilizacije je upravičena, ko zmanjšanje stroškov zaradi zmanjšane rabe katalitske snovi in poenostavitve zaključnih procesov odtehta stroške same tehnične izvedbe imobilizacije (Laskin, 1985).

2 KATALIZA

V seminarski nalogi posegamo tudi na področja onkraj biotehnologije, saj imobilizacijo obravnavamo iz vidika zadrževanja vira aktivnih katalitskih komponent v reakcijskem okolju. Zato moramo nekaj uvodnih besed nameniti tudi fenomenu katalize.

Katalizator je snov, ki pospešuje potek kemijske reakcije, tako da v mehanizem kemijske reakcije vnese več vmesnih stopenj, pri čemer ima novi reakcijski mehanizem nižjo aktivacijsko energijo (Slika 1). V procesu se katalizator ne porablja, ne vpliva na kemijsko ravnotežje in ostaja po poteku reakcije nespremenjen.

Slika 1: Katalizator spremeni reakcijsko pot ter tako zmanjša aktivacijsko energijo (ΔG).

Termodinamski faktor (ΔH, sprememba entalpije) se ob tem ne spremeni.

Snovi, ki izboljšujejo delovanje katalizatorjev imenujemo promotorji, snovi, ki katalitsko moč zavirajo, pa katalizatorski strupi.

V grobem razpoznavamo (Hagen., 2006):

- homogeno katalizo (reaktanti in katalizatorji so v isti fazi, npr. proizvodnja ocetne kisline iz metanola), - heterogeno katalizo (reaktanti in katalizatorji v ločenih fazah, npr. proizvodnja margarine z Raney-Ni), - biokatalizo (reakcijo katalizirajo biološke molekule, npr. uporaba celulaz v proizvodnji biogoriv), - elektrokatalizo (reakcijo katalizira elektroda, npr. shranjevanje H2 v gorivnih celicah), - fotokatalizo (reakciji zagotavlja energijo vir svetlobe, npr. čiščenje odpadnih voda z UV aktivnim TiO2).

Prebivalci planeta Zemlje imamo od katalitskih sposobnosti snovi velike koristi. Osnovne biokemijske reakcije, ki so nujno potrebne za življenje, potečejo v reakcijskih pogojih naših habitatov večinoma le ob prisotnosti ustreznih katalizatorjev. Potek bioloških procesov največkrat katalizirajo encimi.

Prikaz evolucijske pomembnosti encimov sta nedavno prikazala Lewis in Wolfenden (2008) na primeru encima UroD, ki sodeluje v biosintezi hema, klorofila in citokromov. Pri opazovanju


3

spontanega poteka ene izmed stopenj sinteze hema sta izračunala, da je razpolovni čas reakcije pri 25°C 2,3 milijarde let. V prisotnosti encima ta reakcija poteče v milisekundah.

Katalitski procesi so prešli iz narave v človeška bivališča že na pragu civilizacije. Človek se je v zgodnji kameni dobi naučil priprave vina in piva, t.j. procesov alkoholne fermentacije v katerem ima katalitska pretvorba organskih snovi ključno vlogo (McGovern 2004; McGovern 2009).

Znanost namenja katalizi aktivno pozornost šele od začetka 19. stoletja. Leta 1936 je švedski Baron Jöns Jacob Berzelius objavil sistematičen pregled opazovanj sodobnikov in dotlej nedefiniranem pojavu podelil ime: »kataliza« (καταλύειν, cata - za, z, dol; lysein – razcepiti, popustiti, zrahljati). Kasnejši Nobelov nagrajenec Jacobus Henricus van 't Hoff je z utemeljitvijo fizikalne kemije, predvsem s svojimi opazovanji na področju kemijskega ravnotežja, omogočil razvoj tehnik priprave katalizatorjev (Santen in sod., 2000).

V istem obdobju so začele potekati raziskave na področju bioloških katalizatorjev. Luis Pasteur je leta 1850 opisal fermentacijo sladkorja s kvasovkami in predpostavil, da fermenti za svoje delovanje potrebujejo: »življenjsko silo«. To tezo vitalizma je leta 1897 zavrnil Eduard Buchner, ker je dokazal, da izolirana celična vsebina kvasovk še vedno katalizira pretvorbo kvasovk do alkohola. Prepoznavanje encimov kot samostojno aktivnih molekul je postavilo znanstvene temelje za aplikacijo izoliranih encimov v industriji. Moderno razumevanje delovanja encimov je osnoval J.B.S Haldane, z ugotovitvijo da je katalitska moč encimov pogojena s šibkimi interakcijami med encimom in substratom (Buchholz in sod., 2005; Palmer in Bonner, 2007).

3 HETEROGENI KATALIZATORJI

Pravimo, da so heterogeni tisti katalizatorji, ki so od reaktantov ločeni s fazno mejo. Večinoma so heterogeni katalizatorji v trdni snovi in delujejo na reaktante v plinasti ali tekoči fazi. Kot primera navedimo uporabo platine za čiščenje izpušnih plinov avtomobila in proizvodnjo margarine iz rastlinskega olja s pomočjo niklja.

Dandanes so heterogeni katalizatorji prisotni v večini industrijskih katalitskih procesov (Preglednica 1). Kot enega izmed prvih procesov industrijske katalize štejemo postopek sinteze amoniaka, ki se je uveljavil v zgodnjih letih 20. stoletja. Nemški kemik Fritz Haber je v eksperimentalnih pogojih proizvedel amoniak iz plinov dušika in vodika pri visokem pritisku s pomočjo osmijevega katalizatorja. Nato sta Carl Bosch in Alan Mittasch v podjetju BASF preizkusila še preko 2500 snovi, preden sta pridobila ustrezno kovinsko spojino, ki je bila kot katalizator dovolj poceni za komercialno sintezo amoniaka.

Katalizator je v osnovi kompatibilen z reaktanti in produkti reakcije, če se med katalizo ne spreminja v svoji notranjosti, temveč le preko svoje površine vpliva na reaktante.

Mehanizmi delovanja heterogenih katalizatorjev so pretežno odvisni od načina adsorpcije reaktantov na fazni meji (Slika 2). Kadar molekule reaktantov na površini katalizatorja zadržujejo Van der Waalsove sile, govorimo o fizični adsorpciji. Kadar je interakcija kemične narave, govorimo o kemijski adsorpciji. Na nizkovalenčne površine se reaktanti pri nizkih temperaturah navadno adsorbirajo fizično, medtem ko pri višjih temperaturah poteka kemijska adsorpcija.

Dobro površinsko aktivnost in adsorbcijske sposobnosti za vodik in ogljikovodike izražajo prehodne kovine, zato so te snovi in njihove zlitine dobri katalizatorji pri hidrogenaciji, dehidrogenaciji, hidrogenolizi in podobnih reakcijah. Nekaterih kovinskih oksidov ni moč uporabiti za tovrstno katalizo, saj se med reakcijo lahko reducirajo do kovin.


4

Preglednica 1: Pomembnejši industrijski procesi rabe heterogenih katalizatorjev (Rothenberg, 2008).

Proces Katalizator Reaktanti Produkti Področje uporabe

Haber‐Bosch sinteza NH3 magnetit (Fe) H2, N2 NH3 gnojila,

razstreliva

sinteza metanola Cu, ZnO, Al2O3 CO, CO2, H2 CH3OH goriva,

kemikalije

Fischer‐Tropsch Co, Fe premog,

zemeljski plin C5‐C11 ogljikovodiki

avtomobilska goriva

kreking glina C12+ alkani C7‐C9 alkani goriva,

detergenti

alkilacija zeoliti, glina,

silikati C5‐C3 alkani C7‐C9 isoalkani

visokooktanska goriva

dehidrogenacija / reforming

Pt, Al2O3 alkani alkeni polimeri, kemikalije

odstranjevanje žvepla Co ali Mo sulfidi dizelsko gorivo dizel z nižjo

vsebnostjo žvepla avtomobilska

goriva

hidrokreking Pt na zeolitih ali aluminosilikatih

mešanica aromatov

nasičeni ogljikovodiki

avtomobilska / letalska goriva

izomerizacija zeoliti H‐ZSM‐5 ksileni, tolueni p‐ksilen polimeri, kemikalije

polimerizacija Ti, Ziegler‐Natta eten polietilen polimeri, kemikalije

oksidacija vanadijev oksid ksileni ftalna kislina polimeri

Za katalizo oksidacije uporabljamo plemenite kovine, ker se pri potrebnih reakcijskih temperaturah ne oksidirajo tako zlahka kot navadne kovine. Polprevodni oksidi prav tako učinkovito spodbujajo redoks reakcije. Neprevodni oksidi (npr. aluminijevi, silicijevi ali magnezijevi oksidi) so slabi oksidacijski katalizatorji. Zaradi njihovih higroskopskih lastnosti jih uporabljamo pri katalizi dehidracije in polimerizacije.

Slika 2: Primer adsorpcije na površinski katalizator (povzeto po: B owker, 2008)

kovina

difuzija v plinski fazi

molekularna adsorpcija

disociativna adsorpcija

površinska difuzija površinska

reakcija

adsorbiran produkt

desorpcija produkta


5

Kovinski sulfidi katalizirajo reakcije, v katerih so vključene žveplove spojine. Za tako rabo oksidi niso primerni, saj sulfidirajo v kratkem po vstopu v reakcijsko okolje. Za katalizo krekinga, polimerizacije in izomerizacije so v uporabi številne soli in kisline v trdni obliki (Chakrabarty in Viswanathan, 2009).

Aktivnost katalizatorja izrazimo kot količino produkta, ki nastane oz. kot količino reaktantov, ki se pretvorijo v določenem času na enoto mase katalizatorja. V heterogeni katalizi je hitrost pretvorbe reaktantov v produkte tesno povezana s površino katalizatorja, ki je na voljo za adsorpcijo reaktantov. Majhno specifično površino kovin in kovinskih oksidov izboljšamo z jedkanjem žlebičev in vdolbin, z obarjanjem drobnih delcev ali z nanašanjem aktivnih katalitskih komponent na nosilne strukture z veliko specifično površino (Bond, 1987; Chakrabarty in Viswanathan, 2009).

3.1 PRIPRAVA TRDNIH HETEROGENIH KATALIZATORJEV

Pri zasnovi heterogenih katalizatorjev moramo upoštevati elemente fizikalne, anorganske, organske, organokovinske kemije, površinske fizike in znanosti o materialih.

Zaželene lastnosti heterogenih katalizatorjev so (Chakrabarty in Viswanathan, 2009):

- visoka aktivnost in stabilnost, - enakomerna in visoka selektivnost, - velika površina in enakomerna poroznost, - odpornost na visoke temperature, nihanja temperature in mehanske obremenitve.

Končne lastnosti katalizatorja so odvisne od posameznih korakov postopka priprave in prečiščenosti vhodnega materiala.

Slika 3: Načini priprave heterogenih katalizatorjev (delitev po: Rothenberg, 2008)

Heterogeni katalizatorji

Katalizatorji z enotno prostorninsko sestavo

Impregnirani katalizatorji

obarjanje (oksidi ‐ Al2O3, SiO2)

hidrotermalna sinteza (zeoliti)

legiranje (Raney nikelj, mešani oksidi)

sol‐gel sinteza (mešani oksidi, nosilci)

plamenska hidroliza (mešani oksidi, nosilci)

mokra impregnacija (čiščenje izpušnih plinov)

metoda začetne vlažnosti (Pt/Sn/Al2O3)

vakuumska impregnacija por (Bi/Pt/ SiO2)

ionska izmenjava (kisli zeoliti)

sidranje in cepljenje (kompleksi prehodnih kovin)


6

Izbiramo lahko med številnimi tehnikami priprave heterogenih katalizatorjev (Slika 3), kot so: metoda impregnacije, metoda obarjanja, metoda nanosa, metoda sežiganja, sol-gel metoda, metoda trdne šablone, metoda nanosa kovin s kemičnim naparjevanjem (MOCVD) ipd. Pri izbiri upoštevamo, (i) ali bo aktivna katalitska komponenta pritrjena na dodaten nosilni material, (ii) kakšna bo oblika katalizatorja (kroglasta, valjasta, obročasta, monoliti, premazi, ...), (iii) kakšen delež praznega prostora moramo zagotoviti v poroznem materialu in (iv) kako bomo dosegli primerno trdnost materiala ter, (v) ali bo hitrost katalize omejena s transportnim uporom.

Tipičen heterogeni katalizator je sestavljen iz aktivne katalitske komponente, promotroja, in nosilnega materiala (npr. Al2O3, SiO2, ...). Nosilni material je lahko bodisi inerten bodisi deluje kot sekundarni katalizator, ki dopolnjuje delovanje osnovne katalitske komponente (Chakrabarty in Viswanathan, 2009).

V prvi fazi priprave heterogenih katalizatorjev pripravimo bodisi nosilni material za površinski katalizator bodisi ogrodni katalizator z enotno prostorninsko sestavo, oboje z uporabo postopkov legiranja, obarjanja, želiranja, polimerizacije in hidrotermalne sinteze (Pechini, 1967; Rothenberg, 2008).

Katalizatorji z enotno prostorninsko sestavo sestojijo v celoti iz katalitsko aktivnega materiala. Katalitsko aktivne snovi, ki imajo visoko komercialno vrednost, ali pa so same nestabilne v reakcijskih pogojih, s postopki impregnacije, ionske izmenjave in sidranja pritrdimo na nosilni material. Nosilni material mora omogočati čim bolj enakomerno porazdelitev in veliko gostoto pritrjene aktivne komponente, dobro prehodnost reagentov do aktivnih mest katalizatorja ter dobro odpornost na sintranje.

Legiranje z nadaljnjo obdelavo

Z legiranjem pripravljamo katalizatorje na osnovi zlitin in nekaterih mešanih kovinskih oksidov. Pri visokih temperaturah se kovine raztalijo in raztopijo druga v drugi. Iz trdne raztopine lahko v nadaljnjem odstranimo eno izmed prvin, da pridobimo porozno snov z višjo specifično površino in dobro razporejenostjo vrzeli.

Takšen postopek se uporablja pri pripravi Raney-Ni katalizatorja. V proizvodnji katalizatorja najprej pripravijo Ni-Al zlitino in zmes naknadno obdelajo z NaOH. Večina aluminija zrn se izloči iz zmesi, s čimer pridobimo urejeno porozno strukturo. Aluminij, ki ostane v katalizatorju (ponavadi okrog 25 %) pomaga pri stabilizaciji končne strukture (Raney, 1940).

Ogrodni katalizatorji na osnovi Raney-kovin (večinoma Ni in CU) so dandanes najbolj razširjeni v katalizi hidrogenacije, alkilacije in razgradnje amoniaka. Z razmeroma nezahtevno pripravo pridobimo stabilen material, ki ima visoko stopnjo čistosti, veliko specifično površino in ne potrebuje naknadne redukcije oz. kakšne druge vrste aktivacije.

Slika 4: Döbereinerjev vžigalnik

a ‐ posoda, b ‐ steklenica, c ‐ žica, d ‐ valj iz cinka, e ‐ vzmetno pero, f ‐ šoba, g ‐ glina prepojena s Pt

Nemški kemik Johan Wolfgang Döbereiner je leta 1823 izdelal prvo različico komercialno uporabnega vžigalnika (Slika 4).

V kovinsko posodo je namestil steklenico, napolnjeno z žveplovo (VI) kislino. V kislino je obesil kos cinka in steklenico plinotesno zaprl. Zaradi reakcije med kislino in kovino je nastajal vodik. Ko se je tlak povečal v zadostni meri, se je reakcija ustavila.

Nastali vodik je Döbereiner odvedel skozi ventil na glineni nosilec prepojen s platino, kjer je platina katalizirala gorenje vodika.

S platino prepojena porozna glina, ki je služila prižiganju plamena na Döbereinerjevem vžigalniku, je prvi znani primer priprave heterogenega katalizatorja na nosilnem materialu (Hoffmann, 1998).


7

Zaradi velike mase lahko te katalizatorje ločimo od reakcijske mešanice kar z usedanjem. Ker so piroforni, jih hranimo v vodi (Rothenberg, 2008).

Precipitacija in koprecipitacija

Z obarjanjem pripravljamo številne katalizatorje in nosilce, kot so silicijevi in aluminijevi oksidi ter Cu/ZnO/Al2O3 (katalizator sinteze metanola). Metoda obarjanja omogoča pridobivanje materialov visoke čistosti, pri soobarjanju pa dobimo dobro definirane mešane kristalite v stehiometričnem razmerju. Zaradi potrebnega topila in precipitacijskega sredstva je strošek separacije oborjenega katalizatorja in ravnanja z odpadno brozgo večji kot pri uporabi drugih tehnik.

Večinoma govorimo o obarjanju iz vodne raztopine soli. Z dodajanjem precipitacijskega reagenta iz raztopine oborimo gel ustrezne soli (sol-gel metoda). Obarjanje se prične s prenasičenim stanjem in poteka preko nukleacije oborine do dokončnega oblikovanja velikosti delcev. Gel po obarjanju stabiliziramo, filtriramo, očistimo, sušimo in kalciniramo. Glede na lastnosti končnega materiala, ki ga pripravljamo, je mogoče uporabiti številne kombinacije prekurzorjev in precipitatorjev (Rothenberg, 2008; Mouret in sod., 2009).

Impregnacija poroznih nosilcev

Impregnacija je ena izmed najbolj uporabljanih metod za pripravo heterogenih katalizatorjev na nosilcih. Pri mokri impregnaciji potopimo porozni nosilec v raztopino z aktivno katalitsko komponento. Vezava na nosilec poteče spontano, ali pa obarjanje komponente na površino nosilca induciramo (npr. s spremembo pH). Katalizator nato filtriramo iz raztopine, posušimo in kalciniramo.

Z mokro impregnacijo ustvarimo precej več odpadne raztopine kot z metodo začetne vlažnosti, kjer je prostornina dodane raztopine prilagojena skupni prostornini por nosilca. Nosilcem, ki so v obliki suhega prahu, dodajamo raztopino z aktivno katalitsko komponento dokler zmes ne postane lepljiva – tako vemo, da so vse pore v materialu napolnjene z raztopino (Bowker, 1998; Chakrabarty in Viswanathan, 2009).

Še bolj učinkovita je metoda vakuumske impregnacije por. V vakuumski komori izpraznimo zrak iz por dobro osušenega nosilnega materiala ter dodamo ekvivalentno količino raztopine s katalitskim prekurzorjem. Z večkratno ponovitvijo postopka dosežemo visoko obremenjenost nosilnega materiala z aktivno katalitsko komponento (Rothenberg, 2008).

Hidrotermalna sinteza

V tipičnem postopku hidrotermalne sinteze segrevamo razne oborine, gele ali flokule v avtoklavu pri 100 do 300 °C. Med sintezo potekajo teksturne in/ali strukturne spremembe snovi, kot je rast kristalov, rast delcev, spremembe v strukturi kristalov, kristalizacija amorfnih snovi ipd.

Aktualno področje aplikacij hidrotermalne sinteze je izdelava zeolitnih struktur. To so kristalni aluminosilikati z aktivnimi mesti Lewisovih in Brønstedovih kislin (Chakrabarty in Viswanathan, 2009). Včasih jim pravimo tudi molekularna sita, saj jih prepredajo kanalčki in pore nanometričnih dimenzij (Corma, 1995). Tovrstni materiali v praksi postopoma nadomeščajo amorfne aluminosilikate.

( ) ( )[ ] OHzSiOAlOM yxn

nx 222/+ [1]

Enačba 1 povzema splošno sestavo zeolitov (M – kation, n+ – naboj, x/y/z – množine). Razmerje med vsebnostjo AlO2 in SiO2 (y/x) je lahko zelo široko. Poznani so celo nekateri primeri zeolitnih struktur, ki ne vsebujejo aluminija (Chakrabarty in Viswanathan, 2009).


8

Slika 5: Sinteza materiala ZSM‐5 (Zeolite Socony Mobil no. 5), ki se uporablja v proizvodnji sintetičnih goriv

(postopek povzet po Rothenberg, 2008).

Običajen postopek priprave vključuje segrevanje prenasičenih raztopin natrijevih silikatov in natrijevih aluminatov do temperature 100 – 150 °C (Slika 5). Kristalizacija zeolitov poteka počasi in je močno odvisna od pogojev priprave. V zgodnjih sedemdesetih letih so znanstveniki odkrili, da majhne količine alkilamonijevih soli delujejo kot šablona za rast zeolitnih kristalov z urejeno strukturo por. Odkritje je dobilo pravo težo šele dobri dve desetletji kasneje, ko je izboljšanje analiznih metod omogočilo opazovanje visoko topološko urejenost por (Chiola in sod., 1971).

Zaključni procesi

Po poteku sinteze katalizatorja v raztopini moramo katalitski material še ločiti od topila. Kristalne strukture zelo enostavno odstranimo iz raztopine, medtem ko je sušenje gelov ter flokulatov bolj zahtevno.

Geli lahko vsebujejo tudi do 90 % vode, zato lahko med sušenjem njihova porozna struktura propade. Z nadzorovanim odstranjevanjem vode iz povrhnjega sloja gela dosežemo zmanjšanje gostote in prostornine gela. Tako pridobimo t.i. kseroge, v katerem ostaja 25-30 % topila ali pa s sušenjem pri superkitiričnih pogojih naredimo t.i. aerogel, v katerem tekočo komponento popolnoma nadomesti zrak.

Naslednji termični postopek, ki se uporablja v zaključni fazi priprave katalizatorjev, je kalciniranje. Z ogrevanjem materiala do 300 – 800 °C v prisotnosti zraka ali drugih plinov kovinskih oksidov na nosilec in vplivamo na površinsko hidrofobnost katalizatorske površine.

Končna faza priprave mnogih katalizatorjev z enotno prostorninsko sestavo je peletiranje. Postopek izdelave peletov lahko poteka na dva načina. S peletirnim postrojenjem pri visokem pritisku stisnemo material v kalupe, ali pa katalizatorski prah dodamo ekstrudorju plastičnih mas. S temi postopki dobimo katalitski material makroskopske velikosti in ustreznih oblik v rinfuzi, s katerim je enostavno ravnati v proizvodnih pogojih (Bowker, 2008).

Z zaključnimi postopki vplivamo tudi na lastnosti aktivnih mest katalizatorja. V primeru, da se katalitske lastnosti izhodnega materiala poslabšajo, je katalizator pred uporabo potrebno ponovno aktivirati.

natrijev silikat / aluminat

avtoklav

100 ‐ 150°C gel

ZSM‐5

šablonaH2SO4

sušenje kalciniranje

filtriranje spiranje


9

4 HOMOGENI KATALIZATORJI

Homogeni katalizatorji delujejo v isti fazi kot reaktanti (Slika 6). Homogeni katalizatorji delujejo torej kot plini (npr. dušikov oksid katalizira oksidacijo žveplovega dioksida) ali kot tekočine (npr. kisline ali baze katalizirajo izomerizacijo glukoze) (Bond, 1987).

Razširjena definicija homogenih sistemov velja tudi za nekatere sisteme med kapljevinami in plini. V industrijskem procesu hidroformilacije v tekoči alken raztopimo organokovinski kompleks in prepihujemo z vodikom in ogljikovim monoksidom. V reakciji poteče adicija vodika in skupine C≡O na alkensko verigo. Ker se plina H2 in CO se v dejanskih pogojih raztopita v reakcijski mešanici, govorimo o homogeni katalizi (Rothenberg, 2008).

Slika 6: Osnovni koraki homogene katalize (povzeto po: Rothenberg, 2008)

Čeprav je najbolj razširjena uporaba heterogenih katalizatorjev, saj ti po nekaterih virih katalizirajo preko 90 % procesov industrijske katalize, uporaba homogenih katalizatorjev ni zanemarljiva(Preglednica 2). Homogeni katalizatorji se pogosto ponašajo z večjo selektivnostjo kot heterogeni, vendar pa je njihova ponovna uporaba precej bolj zahtevna (Rothenberg, 2008).

Vrste homogenih katalizatorjev so (Rothenberg, 2008):

- topni kovinski kompleksi, - klasične kisline/baze, - organski katalizatorji.

Topni kompleksi prehodnih kovin katalizirajo hidrogenacijo, oksidacijo, hidroformilacijo, karbonilacijo, tvorbo C-C vezi, telomerizacijo, odpiranje ogljikovih obročev in kopolimerizacijo. V aplikacijah poznamo predvsem hidroformilacijo alkenov do alkoholov ali aldehidov, karbonilacijo metanola v ocetno kislino, sintezo učinkovine L-dopa z asimetrično hidrogenacijo, oksidacijo p-ksilena do tereftalne kisline, oligomerizacija etilena, itd (Preglednica 2).

Številne reakcije katalizirajo H+ ali OH- ioni. V grobem poznamo dva načina katalitskih učinkov kislin in baz. Pri splošnem učinku reakcijo katalizirajo vse donorske / akceporske specije

M

CH3

H CO

M CH3

H CO

disociacija liganda koordiniranje

liganda

oksidativna adicija

reduktivna eliminacija

nukleofilni napad

migratorna insercija

β‐eliminacija

M CH3

H CO

CH3 CH3Br

Br

M CH3

H CO

M CH3 H

CO

M CH3

H O

HO


10

protonov, medtem ko pri specifičnem učinku na hitrost reakcije vpliva le koncentracija protoniranih / deprotoniranih molekul (Kwan, 2005). Preglednica 2: Raba homogenih katalizatorjev v praksi (po Mukhopadhyay, 2003)

Homogeni katalizatorji

Karbonilacija Hidroformilacija Oksidacija Oligomerizacija / polimerizacija

Hidrocianacija

metanol propilen p‐ksilen etilen butadien

ocetna kislina butanal tereftalna kislina α‐alkeni adiponitril

propin C6 ‐ C11 alkeni aldehidi polyetilen

MMA C7 ‐ C12 aldehidi karboksilne

kisline poliketon

ariletanol / alkeni C12 ‐ C19 alkeni butadien

2‐aril propionska kislina

C13 ‐ C20 aldehidi

polibutadien

benzil klorid alil alkohol

fenilocetna kislina 4‐hidroksi‐butanal

dušikove spojine diacetoksibuten

izocianati vitamin A

Oksidativna karbonilacija

fenol

difenil karbonat

amini

izocianati

Amidna karbonilacija

aldehini / alkeni

aminokisline

Organski katalizatorji so nizko molekularne organske molekule, ki pogosto izražajo lastnosti Lewisovih kislin. V primerjavi z organokovinskimi kompleksi so večinoma bolj stabilni, ceneni in dostopnejši. Ker ne vsebujejo kovin so manj toksični in jih po separaciji produktov ni potrebno dodatno ločevati od odpadne mešanice (Rothenberg, 2008).


11

4.1 HETEROGENIZACIJA HOMOGENIH KATALIZATORJEV

Homogeni katalizatorji imajo številne privlačne lastnosti, vendar je njihova raba v praksi omejena z nestabilnostjo katalizatorjev pri industrijskih pogojih in visokimi stroški ločevanja katalizatorjev in produktov. V komercialni rabi so homogeni katalizatorji, ki bodisi katalizirajo reakcije lahko hlapnih substratov in/ali produktov bodisi ne vsebujejo termolabilnih organskih ligandov (Mukhopadhyay, 2003).

Združevanje prednosti homogenih (visoka selektivnost in možnost modifikacije lastnosti katalizatorja z različnimi reakcijskimi pogoji ter neoviran prenos snovi med reakcijo) in heterogenih katalizatorjev (dobra obstojnost pri visokih temperaturah, enostavna separacija) je svojevrsten raziskovalni izziv.

Heterogenizacija je postopek imobilizacije kompleksov prehodnih kovin na površino ali v notranjost (t.i. ship-in-a-bottle princip) inertnega organskega ali anorganskega nosilca. Postopki heterogenizacije homogenih katalizatorjev se v principu zgledujejo po metodah priprave heterogenih katalizatorjev in metodah imobilizacije celic in encimov (Preglednica 3).

Dendrimeri

Nosilni materiali, ki jih uporabimo za imobilizacijo, se v reakcijskih pogojih lahko raztopijo v mešanici. S pripravo takšnih snovi dosežemo bolj enakomerno razporeditev aktivne katalitske komponente v raztopini. Pri oblikovanju takšnega katalizatorja posnemamo strukturo njegove homogene različice, le da lahko v primeru uporabe nosilca katalizator povrnemo iz reakcijske mešanice s filtracijo (Mukhopadhyay, 2003).

Slika 7: Različni načini vezave aktivne katalitske komponente na dendrimer (van Heerbek in sod, 2002)

a in d – periferna vezava, b in c – žariščna vezava

Topni polimerni materiali lažje prehajajo skozi filtracijske membrane, zato so bolj primerni nosilci dendrimeri (Slika 7). Dendrimeri so visoko razvejane globularne molekule reda velikosti nekaj nm. Omogočajo dolgotrajno vezavo kovin, saj eno vezavno mesto dendrimera pogosto razpolaga z dvema donorskima atomoma, kar omogoči vzpostavitev dvojne vezi površine dendrimera s kovinskim ionom. Nadalje skrbi za obstojnost vezave kelatni učinek. Tudi če se kovinski atom sprosti z enega vezavnega mesta, se lahko v kratkem času veže na številna druga nezasedena mesta v bližini (van Heerbek in sod, 2002).

katalizator


12

Netopni nosilci

Trdne ogrodne strukture, ki so primerne za površinsko vezavo ali enkapsulacijo kovinskih kompleksov so kovinski oksidi (silicijevi in aluminijevi oksidi, mikroporozni zeoliti, mezoporozni M41S materiali in mezoporozni glineni delci), ogljik, ogljikove nanocevke, fulereni in polimeri(De Vos in sod., 2002).

Ligande kovinskih kompleksov lahko glede na design namenimo vezavi na zunanjo površino ali v notranjost nosilca (Preglednica 3). Na ta način ohranimo selektivnost in katalitsko moč po imobilizaciji homogenega katalizatorja, saj so med reakcijo reaktantom dostopna vsa katalitsko aktivna mesta.

Kovalentne vezi med kovinskim kompleksom in nosilcem so dovolj močne, da vzdržijo izredne razmere katalitskih reakcij. Vezi med ligandi in kovinskimi atomi so šibkejše in se med reakcijo pogosteje razcepijo oz. reformirajo. Zaradi posledičnega sproščanja kovin v raztopino se zmanjšuje aktivnost katalizatorja (Mukhopadhyay, 2003). Preglednica 3: Principi heterogenizacije homogenih katalizatorjev (Cubillos Lobo, 2005)

Načini imobilizacije kovalentna vez adsorpcija in ionska vez

enkapsulacija »Ship‐in‐a‐bottle«

Možnost aplikacije široka omejena omejena

Slabosti priprava kompeticija s topili in

substrati velikost substrata in omejenost z difuzijo

Pri enkapsuliranih katalizatorjih je aktivna katalitska komponenta ujeta v porah zeolitov ali v mezopornem materialu, reaktanti in produkti pa so dovolj majhni, da prehajajo skozi nosilno strukturo (Corma in Garcia, 2004). Ujeti kovinski atomi v manjši meri uhajajo iz obdajajoče strukture, kot se to dogaja pri ionih pritrjenih na zunanjo površino nosilcev (Corma, 1997; De Vos in sod., 2002).

5 DVOFAZNI KATALITSKI SISTEMI

V dvofaznih sistemih tekoče-tekoče so katalizatorji in regenti v eni tekočini, regenti pa v drugi. Ker je med raztopinama fazna meja, nekateri avtorji katalizatorje, ki nastopajo v takih sistemih štejejo med heterogene katalizatorje (Rothenberg, 2008). Drugi viri zaradi raztopljenosti katalizatorjev v topilu tovrstne katalizatorje uvrščajo med homogene oz. na področje heterogenizacije homogenih katalizatorjev (Mukhopadhyay, 2003; Cubillos Lobo, 2005). Ker je meja med homogeno in heterogeno katalizo v dvofaznih sistemih zabrisana (Baricelli in sod., 2001) in so lahko vhodni katalizatorji tako homogeni (Zheng in sod., 1998; ), kot heterogeni (Zhu in sod., 2003; ), navajamo to področje v ločenem poglavju.

Vodni dvofazni sistemi

Z modifikacijo katalizatorjev (uporabo ligandov, derivatizacijo, ipd.) pripravimo njihove vodotopne različice (Zhu in sod., 2003). Drugi raztopini dodamo organske reagente, ki se v vodi

L L

M L L

M

L L M3+ Z‐ Z‐ Z‐

L L M3+


13

slabo topijo. Stik med reagentom in katalizatorjem vzpostavimo z burnim mešanjem, po poteku reakcije pa mešanico umirimo in odlijemo produkte. Katalizator ostane v vodni fazi in je na voljo za naslednjo šaržo (Slika 8).

Slika 8: Princip delovanja vodno‐organskih dvofaznih sistemov

Zaradi zelo nizke topnosti v vodi, dolgo verižni alkeni v praksi niso primerni reaktanti za tovrstno pretvorbo. Počasna sinteza aldehidnih detergentov v vodno-organskih sistemih neredko ovira komercialno opravičljivost proizvodnje.

Fluorni dvofazni sistemi

Zaradi omejene topnosti v vodnih sistemih, sta Horváth in Rábai (1994) razvila postopek fluornih dvofaznih sistemov. Uporabila sta ga za hidroformilacijo alkenov z rodijevim kompleksom fluoriranih fosfinov. Fluorni dvofazni sistemi temeljijo na omejeni sposobnosti mešanja delno in povsem fluoriranih spojin z nefluoriranimi spojinami (Slika 9).

Slika 9: Prehod fluorno‐organskega sistema v enofazni sistem (povzeto po Klement in sod., 1997)

Reagent in katalizatorji so raztopljeni v fluorni fazi, za drugo fazo pa lahko uporabimo katerokoli topilo, ki ima slabo topnost oz. se ne raztaplja v prvi. Reakcije potekajo bodisi v fluorni fazi, bodisi na fazni meji med raztopinama.

Fluorna faza je bogata s fluoriranimi ogljikovodiki (večinoma perrfluorirani alkani, etri in terciarni amini). Od količine fluoriranih funkcionalnih skupin na katalizatorju in reaktantih (najbolj učinkovite so višje perfluoroalkilne verige), je odvisna učinkovitost in selektivnost raztapljanja v fazah sistema.

Fazni prehod

V nekaterih primerih lahko s spreminjanjem reakcijskih pogojev (navadno s termoregulacijo) vplivamo na prehod katalizatorja med raztopinama dvofaznega sistema.

Načelo derivatizacije trifenilfosfina s polietersko verigo je uporabno za sintezo številnih katalizatorjev v vodno-organskih dvofaznih sistemih. Zheng in sodelavci (1998) poročajo o

katalizator

reaktanti

produkti organska faza

vodna faza

produkti reaktanti

katalizator katalizator

organska faza

vodna faza

organska faza

reaktanti

produkti 60°C 25°C

flourna faza

O2

organska faza

produkti

katalizator

O2

flourna faza

katalizator


14

pripravi rodijevega derivata fosfina. Pri sobni temperaturi je kompleks dobro topen v vodi in netopen v organskem topilu, ki raztaplja reaktante. Z ogrevanjem reakcijske mešanice se kompleks vedno slabše raztaplja v vodi in vedno bolj v organskem topilu. Po poteku reakcije reakcijsko mešanico ohladimo in katalizatorji se ponovno raztopijo v vodni fazi. Nekontaminirane produkte ločimo z dekantiranjem in sistem je pripravljen za ponovno uporabo.

Slika 10: Shematski prikaz Starksovega (a) in Makoszovega mehanizma faznega prehoda

(po Rothenberg, 2008), X – reagent, Y – intermediat

Superkritični fluid

Superkritični fluidi so komprimirani plini ogreti na temperaturo višjo od kritične temperature plina. Docela se mešajo z ostalimi plini in raztapljajo številne nizko- do srednje-polarne organske molekule.Ob prisotnosti katalizatorja, topnega v superkritičnem fluidu, poteče prava homogena kataliza.

Čeprav lahko superkritični plin po poteku reakcije enostavno ločimo od reakcijske mešanice z zniževanjem tlaka, ostanejo v preostali zmesi produkti kontaminirani s katalizatorji. Zahtevnem separacijskem postopku se je mogoče izogniti na različne načine, npr. z inducirano precipitacijo (Koch in Leitner, 1998).

Ionske tekočine

Ionske tekočine so soli v tekočem stanju. Njihovi parni tlaki so zelo nizki, kot je to sicer značilno za trdnine. Z zasnovo ionske tekočine lahko vplivamo na topnost snovi v njej. Tiste soli, ki so tekoče v reakcijskih pogojih, lahko uporabimo za selektivno raztapljanje ionskih katalizatorjev (npr. kovinskih kompleksov) in organskih spojin (Gordon, 2001).

Dandanes so ionske tekočine prisotne v skorajda vseh procesih industrijske katalitske pretvorbe (Welton, 2004; Olivier-Bourbigou in sod., 2010). Mogoče jih je uporabljati tudi v kontinuiranih sistemih, saj jih v obliki filmov lahko pritrdimo na nosilni material (Mehnert, 2005).

Produkte reakcije, ki je katalizirana v ionski tekočini, po poteku odstranimo s pomočjo organskih topil. Številne organske snovi lahko iz ionskih tekočin estrahiramo tudi z raztapljanjem v superkritičnih fluidih (npr. v scCO2). Postopki uvajanja superkritičnega fluida v reakcijsko mešanico, raztapljanja produktov, odvajanja fluida s produkti in končnega ločevanja produktov s dekompresijo prav tako omogočajo kontinuirano rabo ionskih tekočin (Sellin in sod., 2001).

a

vodna faza

Q+X‐ + RY

organska faza

RX + Q+Y‐

X‐ + Q+Y‐ Q+X‐ + Y‐

organska faza

b

fazna meja

R‐

RH

OH

Q+X‐ R'X

Q+R‐

H2O X‐ vodna faza


15

6 BIOLOŠKI SISTEMI

Biotehnogija temelji predvsem na izkoriščanju katalitske sposobnosti celic ali delov celic (Nekrep, 1996). Biološke molekule, ki izražajo katalitske sposobnosti, so encimi in multiencimski kompleksi, ribocimi, deoksiribocimi, ribosomi, izrezovalna telesca in abcimi (Walker in Rapley, 2009).

Pri izboru sistema konkretne biološke pretvorbe upoštevamo tri osnovne faktorje. Prvič, kakšne so razpoložljive oblika izbrane biokatalitske snovi, so to čisti izolirani encimi, delno prečiščeni encimski preparati, surov encimski ekstrakt, ekstrakt celičnih organel oz. celic, odmrle celice z ohranjeno strukturo ali žive celice v aktivnem oz. inhibiranem stanju. Drugič, kateri bioreaktor je primeren za biokatalizo glede na izbrano obliko katalitskega materiala, lastnosti substrata in zahtevanih lastnostih končnega produkta. In tretjič, ali želimo na katere značilnosti sistema želimo vplivati z imobilizacijo, kar bo odvisno tudi od predhodnih korakov izbire (Walker in Rapley, 2009).

6.1 ENCIMI IN DRUGE KATALITSKO AKTIVNE BIOLOŠKE MOLEKULE

Encimi so skupina proteinov, ki nastajajo v celicah za katalizo reakcij metabolnih poti (Walker in Rapley, 2009). Katalitske sposobnosti encimov so izjemne, njihova pretvorbena števila se gibljejo med 102-104 ter dosegajo vrednosti do 108 molekul/sekundo (Rothenberg, 2008). Aktivna mesta encimov in obdajajočih struktur izražajo visoko regionalno selektivnost številnih funkcionalnih skupin na eni molekuli, kar se odraža v enostavnejšem vodenju procesa.

Zaradi visoke specifičnosti prepoznavanja substrata v mnogih encimskih reakcijah nastajajo istovrstni enantiomeri produktov ob manjši količini / odsotnosti stranskih produktov, kar je izredno koristna lastnost v proizvodnji.

Slika 11: Komplementarnost encima in substrata

a ‐ključ in ključavnica, b ‐ inducirano prilagajanje encima substratu

Encim nudi substratom specifično reakcijsko okolje, reakcija poteče na aktivnem mestu ki se ne nahaja nujno na isti regiji encima kot vezavno mesto za substrat. Emil Fischer je leta 1894 primerjal komplementarnost substrat in vezavnega mesta s ključem in ključavnico. Po tej definiciji naj bi bila struktura vezavnega mesta popolni negativ strukture dela substrata, ki se veže na encim. Danes komplementarnost opisujemo s principom induciranega prilagajanja encima substratu, modifikacijo Fischerjevega modela, ki jo je leta 1985 predlagal Daniel Koshland. Model induciranega prilagajanje encima substratu poleg specifičnosti encima opisuje še stabilnost encima v prehodni konformaciji (Slika 11).

a

b

encim substrat produkti


16

ve

zavn

o mes

to za ce

lulozo celulaz

e C

Hidro

laze

2. cifr

a: Vez pod

vrže

na hidro

lizi:

1 es

ter,

2 glik

ozidna

, 3 pep

tid (‐CO

NH‐),

4 nep

eptid

ne C‐N vez

i. 3. cifra: O

pisu

je nad

aljnji zn

ačaj hidro

lizira

ne vez

i. Npr

. pri hidrolizi e

strov:

3.1.1 h

idro

laze karbo

ksiln

ih estro

v (–CO

O–),

3.1.2 hidro

laze tiolnih es

trov (–

COS–

),

3.1.3 h

idro

laze fo

sfornih mon

oestro

v (–O–P

O32

‐ ),

3.1.4 hidrolaze fo

sfornih dies

trov (–

O–P

O2‐–O

–).

3.2.1 glikoz

idaz

e (hidro

liza O– in S–g

likoz

idnih ko

mpo

nent)

3.Liga

ze

2. cifr

a: Nastala vez

: 1 C‐O,

2 C‐S,

3 C‐N,

4 C‐C.

3. cifra: O

pisu

je nad

aljnji zn

ačaj sintetiz

irane vez

i.

2. Trans

feraze

2. cifr

a: Glede na skup

ino v pren

osu:

1 1‐C sku

pina

, 2 aldeh

idi a

li ke

toni (>

C=O),

3 acil (–C

OR)

, 4 glik

ozil,

5 fo

sfat.

3. cifra: Več

inom

a op

isuje na

daljn

ji zn

ačaj sku

pine v

pren

osu.

Npr

.: 2.1.1 m

etiltrans

feraze (p

reno

s ‐CH3),

2.1.2 hidrok

simetiltrans

feraze (p

reno

s –C

H2O

H),

2.1.3 ka

rbok

si (–

COOH) a

li ka

rbam

oil (‐CONH2) tr

ansferaz

e.

5. Iz

omeraz

e 2. cifr

a: Vrsta izom

erac

ije:

1 race

mizac

ija ali ep

imerizac

ija,

2 cis‐trans izom

erizac

ija,

3 re

dox reak

cije zno

traj m

olek

ule,

4 preno

s skup

in zno

traj m

olek

ule.

3. cifra: Sno

v, ki je po

dvržen

a izom

erizac

iji.

Npr

. za race

mne m

ešan

ice in epimere:

1 am

inok

islin

e,

2 hidro

ksiln

e kisline,

3 ogljik

ovi h

idrati.

1. cifra: Glede na reak

cijo, k

i jo en

cim katalizira

:

1. ok

sido

redu

ktaz

e redo

ks re

akcije,

2. tr

ansferaz

e pren

os sku

pin med m

olek

ulam

i,

3. hidro

laze

pren

os sku

pin na H2O (h

idro

liza),

4. liaz

e

od

stranjev

anje sku

pin,

5. izom

eraz

e

pren

os sku

pin zn

otraj m

olek

ule,

6. liga

ze

združe

vanje molek

ul s kov

alen

tno C‐C, C‐N

, C‐O

, C‐S

vezjo ob por

abi A

TP.

EC 3.2.1.4 ‐ c

elulaz

e

1. Oksidor

eduk

taze

2. cifr

a: Glede na do

nor v

odika / e

lektro

nov:

1 alko

holi (>CH

OH),

2 aldeh

idi a

li ke

toni (>

C=O),

3 –CH‐CH–,

4 prim

arni amini (>C

HNH2 ali >

CHNH3),

5 sek

unda

rni a

min (>

CHNH–),

6 NADH ali NADPH (s

amo z drug

im re

dox ak

cept

orjem).

3. cifra: Glede na ak

cept

or vod

ika / e

lektro

nov:

1 NAD+ ali N

ADP+

, 2 Fe3

+,

3 O

2,

99 drug akc

epto

r.

4. Liaze

2. cifr

a: Raz

cepljena vez

: 1 C‐C,

2 C‐O

, 3 C‐N

, 4 C‐S.

3. cifra: O

dcep

ljena sku

pina

: 1 ka

rbok

silna,

2 aldeh

idna (‐CH

=O),

3 ketok

islin

ska (‐CO

.CO2‐).

Slika 12: K

lasifik

acija enc

imov (J

CBN, 2

009) na prim

eru ce

lulaz


17

Encimi v osnovi katalizirajo kompleksnejše biokemijske pretvorbe, kot konvencionalni katalizatorji in manj zahtevne procese, kot potekajo pri fermentaciji. Raba izoliranih encimov je smotrna, ko za pretvorbo substrata do končnega produkta ne potrebujemo veliko različnih vrst encimov (≤ 3) in regeneracija kosubstratov (ATP, NADH) ni potrebna. V takem primeru lahko z izoliranimi encimi uporabimo manjše in cenejše reaktorje oz. pri enaki prostornini zagotovimo večjo proizvodnjo kapaciteto. Ker v sistem vnesemo samo potrebne encime, ni nevarnosti nadaljnje razgradnje oz. preoblikovanja produkta. Z imobilizacijo izoliranih encimov omogočimo kontinuiran proizvodni sistem v pretočnih reaktorjih, ki so lahko stabilni več mesecev (Buchholz in sod., 2005).

Mednarodna klasifikacija encimov deli encime v 6 razredov glede na vrsto reakcije, ki jo katalizirajo. Razredi so razdeljeni v podrazrede, ki nadalje opisujejo značilnosti reakcij, encimov ali substratov (Slika 12). Trenutno je klasificirano okrog 4200 različnih encimov (JCBN, 2010). Številni od teh encimov katalizirajo reakcije preko 150 aktivnih industrijskih procesov (Preglednica 4; Rothenberg, 2009). Največ encimov se uporabi v industrijskih procesih (56 % tržišča vključno s čistilnimi postopki), dobra tretjina (33 %) v živilski industriji, preostala proizvodnja pa je namenjena uporabi v prehrani domačih živali (Buchholz in sod., 2005).

Raba izoliranih encimov je ekonomsko upravičena, (i) ko je na trgu mogoče nabaviti dovolj encimskega pripravka ustrezne kvalitete, (ii) metabolizem morebitnih organizmov, ki so prisotni v reakcijski mešanici, ne moti delovanja dodanih encimov in (iii) znašajo stroški uporabe encimov 5-10 % skupne vrednosti produkta (Buchholz in sod., 2005).

Ribocimi, deoksiribocimi, ribosomi

Ribocimi in deoksiribocimi so RNK in DNK molekule z endonukleazno aktivnostjo. Na podlagi njihovih katalitskih lastnosti se sklepa, da so evolucijski predhodniki encimov. Ker so sposobni katalize svoje lastne sinteze, je njihovo odkritje omogočilo oblikovanje novih spoznanj o nastanku življenja na Zemlji (Orgel, 1994).

Ribocimi sodelujejo pri prepisovanju DNK, kjer katalizirajo izrezovanje odvečnih regij mRNK in tRNK. S katalizo hidrolize omogočijo izomerizacijsko prerazporeditev fosfodiesterskih vezi RNK molekule in odstranitev nepotrebnih regij (The Nobel Prize in Chemistry, 1989).

Te biološke molekule so ponavadi manjše in preprostejše strukture kot encimi, zato v literaturi naletimo na veliko število raziskav, ki se ukvarjajo s sintezo in designom umetnih ribocimov in deoksiribocimov za katalizo širokega nabora kemijskih reakcij (Jäschke, 2001; Breaker, 2002; Lilley, 2005).

Že dolgo vemo, da sinteza proteinov v celici poteka na ribosomih. Podroben pogled na del tega ribonukleotidnega kompleksa, kjer nastaja peptidna vez med aminokislinami pa nam razkrije, da se na aktivnem mestu nahaja ribocim (Rodnina in sod., 2007).

Izrezovalna telesca

Izrezovalno telo sodeluje v postopku spajanja mRNK po procesu prepisovanja. Tako kot ribosom, je izrezovalno telo kompleksna ribonukleotidno-proteinska struktura. V prvi fazi bodo nadaljnje raziskave mehanizma delovanja izrezovalnega telesca omogočile razvoj terapevtskih metod za zdravljenje bolezenskih stanj povezanih z motnjo spajanja RNK.

Abcimi

Protitelesa so glikoproteinske molekule, ki izražajo visoko afiniteto za vezavo tujkov v organizmu. V naravi večinoma nimajo katalitskih sposobnosti in vežejo antigene z izredno obstojno selektivno vezavo. Z oslabitvijo vezavnih mest so raziskovalci razvili abcime, t.j. nove vrste umetno sintetiziranih protiteles, ki izražajo katalitsko aktivnost (Walker in Rapley, 2009).


18

Abcimi in encimi izražajo številne podobne lastnosti, kot so inducirano prileganje substratom in alosterična modulacija aktivnosti. Številne raziskave katalitskih protiteles so usmerjene v klinično aplikacijo. Novejše študije vključujejo psihoaktivno deaktivacijo kokaina, razgradnjo nikotina, aktivacijo predzdravil za tarčno kemoterapijo, zaščito pred UV-svetlobo, inhibicijo infektivnosti humanega virusa imunske pomanjkljivosti in zmanjševanje β-amiloidnih agregatov ki nastajajo pri Alzheimerjevi bolezen (Hanson in sod., 2005).

Multiencimi

V aplikacijah katalize biokemijskih procesov uporabljamo encime pri enostopenjskih procesih, celice in celične organele pa pri večstopenjskih pretvorbah. Možna alternativa katalize več zaporednih biokemijskih reakcij je uporaba multiencimskih proteinov (Walker in Rapley, 2009).

Slika 13: Shematski prikaz celulosoma

Multiencimi so proteini, z več kot eno katalitsko funkcijo, ki jo prispevajo različna območja oz. podenote polipeptidne verige. Če se katalitske domene teh organiziranih encimskih sistemov nahajajo na več kot eni vrsti polipeptida, govorimo o multiencimskih kompleksih, eni vrsta polipeptida z več katalitskimi domenami pa pravimo multiencimski polipeptid. Multiencimski kompleksi se povezujejo nekovalentno, multiencimski polipeptidi pa kovalentno (JCBN, 2010).

Apoptosomi igrajo ključno vlogo v procesu programirane celične smrti. Apoptoza ima pomembno vlogo pri homeostazi (ravnotežje med zaradi ravnovesja med številom odmrtih in prolifeliranih celic), embrionalnem razvoju (pravilen potek diferenciacije tkiv) in v imunskem sistemu (npr. propadanje limfocitov B in T). V normalnem stanju je proces dormanten, ob pozitivni indukciji pa se sproži proces tvorbe apoptosoma iz proteaznih encimov kaspaz. Apopotosom nato v natančno določenem zaporedju reakcij uniči celično proteinsko strukturo, encime in ostale proteine, ki omogočajo delovanje celice. Podrobno razumevanje mehanizma programirane celične smrti je pomembno iz več vidikov. Apoptoza zavira razrast novotvorb, zato rakava obolenja nastanejo le s predhodno inhibicijo tega procesa. Nasprotno, pri degenerativnih boleznih živčevja prihaja do prezgodnje aktivacije apoptoze (Yu in sod., 2005).

encimski modul sidrni protein

kohezin vezni peptid

modul za vezavo na celulozo celična stena


19

Proteasomi so veliki multiencimski kompleksi (ponavadi okrog 2000 kDa), ki v citoplazmi in celičnem jedru razgrajujejo okvarjene ali nepotrebne proteine. Kompleks je sestavljen iz štirih obročev, ki tvorijo obliko sodčka. Razgradnja proteinov poteka v notranjosti kompleksa, kjer so nameščene katalitske domene (Peters in sod., 1994). Encimske podenote multiencima izražajo tako endopeptidazno kot eksopeptidazno aktivnost encimskih podenot. Pri rakavih obolenjih so proteasomi pogosto tarčno mesto zdravil, saj je razrast tumorjev odvisna tudi od deaktivacije proteinov, ki nadzorujejo procese celične delitve (Takimoto in Calvo, 2008; Walker in Rapley, 2009).

Nekatere bakterije in glive izkoriščajo visok energetski potencial celuloznih substratov. Za razgradnjo so potrebni ekstracelularni encimi, ki so se tekom evolucije pri številnih bakterijah organizirali v celulosom. Struktura celulosoma sestoji iz osnovnega proteinskega ogrodja (t.i. skafoldin) na katerega se pripenja širok spekter različnih encimski modulov (celulaze, ligninaze, manaze, ksilanaze, pektinaze, hitinaze, β-glukozidaze, endoglukanaze, eksoglukanaze, ...). Modularna zasnova omogoča učinkovito prilagajanje funkcionalnosti celulosoma glede na specifično strukturo celuloznega substrata, ki je mikroorganizmu na voljo (Slika 13). Fleksibilnost in prilagodljivost tega multiencimskega kompleksa sta privlačni značilnosti z vidika izkoriščanja energetskega potenciala odpadne celulozne biomase (Bayer in sod., 2004).

Design novih multiencimskih kompleksov odpira nova poglavje na področju reakcijskega inženirstva in marsikje drugje. Müller in Niemeyer(2008) sta preučila eno izmed potencialnih metod za povezovanje združljivih encimskih komponent. Na kovalentne konjugate DNA sta imobilizirala različne encimske komponente, kar je omogočilo uspešno samo-organizacijo umetnega multiencimskega kompleksa.


20

Preglednica 4: Pomembnejši industrijski procesi rabe encimov (Buchholz in sod., 2005).

Produkt Encim Imobilizacija

> 10 000 000 ton / leto

koruzni sirup z visokim deležem fruktoze (HFCS) amilaze

glukoamilaze

glukoza‐izomeraze

etanol amilaze

glukoamilaze

> 10 000 ton / leto

akrilamid nitrilaze celice

6‐aminopenicilanska kislina penicilin‐amidaze

kakavovo maslo lipaze

izomaltuloza saharoza‐mutaze v celicah

mlečni izdelki brez laktoze β‐galaktozidaze &

> 1000 ton / leto

7‐aminocefalosporanska kislina amino‐oksidaze

glutaril‐amidaze

7‐aminodesacetoksi‐cefalosporanska kislina glutaril‐amidaze

asparaginska kislina aspartaze

aspartam termolizini metaloproteaze

metoksipropil amin lipaze

pantotenska kislina aldolaktonaze

fenilglicin hidantoinaze

karbamoilaze

aminokisline aminoacilaze

1000 ‐ 10 ton / leto (izbor novejših postopkov)

amoksicilin penicilin‐amidaze

cefaleksin penicilin‐amidaze

3,4‐dihidroksi‐fenilalanin β‐tirozinaze

človeški inzulin karboksipeptidaze A

lizil endopeptidaze

tripsin

sterično čiste oblike alkoholov in aminov lipaze

mandljeva kislina nitrilaze


21

6.2 IMOBILIZACIJA ENCIMOV

V začetku 20 stoletja sta Newlson in Griffin (1916) postavila temelje sodobnih tehnik imobilizacije encimov, z raziskavami adsorpcije invertaze, tripsina in renina na različne organske nosilce. Čez dobrega pol stoletja so znanstveniku temu področju biotehnologije pričeli namenjati več pozornosti (Laskin, 1985; Buchholz in sod., 2005).

Slika 14: Načini imobilizacije encimov (Ullman's Biotechnology ..., 2007)

Imobilizacija encimov se je sprva uveljavila v živilsko-predelovalni industriji, kjer še dandanes prednjači pred ostalimi sektorji uporabe (Preglednica 4). Specifičnost encimov in njihove sposobnosti selektivne pretvorbe substratov, ponuja izboljšavo organoleptičnih lastnosti (okus, vonj, teksture, ...) in ohranitev hranilne vrednosti živila. Pretvorba poteka v nadzorovanem procesu, v odsotnosti nezaželenih stranskih reakcij (Laskin, 1985).

Načini imobilizacije encimov vključujejo (Slika 14):

- pripravo nevodotopnih različic encimov, - zadrževanje encimov v procesu z ultrafiltracijskimi membranami, - omejevanje gibanja in vezava encimov s pomočjo nosilnih materialov.

Učinkovitost imobilizacije encima s pomočjo nosilnega materiala je odvisna od interakcije encima z nosilcem. Primerni nosilni materiali (Preglednica 5) so netopni v vodi, mehansko odporni in stabilni v reakcijskih pogojih, imajo hidrofilni značaj, visoko specifično površino, dobro prepustnost in veliko število veznih mest za encim. Nosilci ne smejo biti toksični oz. se razgrajevati do strupenih snovi in morajo omogočati enostavno regeneracijo iz reakcijske

Imobilizacija encimov

Heterogena kataliza (netopni encimi)

Homogena kataliza (topni encimi)

ujetje

vezava

ultrafiltracijske membrane

kapilarne membrane

Dvofazni sistemi (topni‐netopni encimi)

mikro enkapsulacija

ujetje v reverzne micele

ujetje v gel

vezava na nosilec

ko‐polimerizacija

prečno povezovanje

ionska vez kovalentna

vez fizikalna adsorpcija

adsorpcija in prečna vezava

tvorba kelatov biospecifična

vezava


22

mešanice. Aplikacija takšnega sistema je omogočena s komercialni dostopnostjo nosilnega materiala (Ullmann's Biotechnology ..., 2007). Preglednica 5: Osnovni pregled nosilnih materialov za imobilizacijo encimov in celic

Anorganski Organski Biološki Nanodelci Minerali Polimeri Polisaharidi atapulgit polietilen celuloza zlati nanodelci bentonit polistiren škrob kvantne pike diatomejska zemlja poli(met)akrilati dekstran nanolipidi plovec Nylon agar & agaroza nanotelesca Sintetični materiali poliamid karagenan nanoporozna silika neporozno steklo polivinil hitin in hitozan nanoprizme porozno steklo ... Beljakovine nanocevke porozni kovinski oksidi kolagen kovine želatina albumin svila Ogljični materiali aktivno oglje

Pri izbiri nosilnega materiala je za imobilizacijo pomembna tudi makro in mikroskopska struktura snovi. Novi nosilni materiali, ki so osnovani na nanodelcih (npr. sferični polimeri, ki dosegajo velikosti od 50 nm - 10 μm), omogočajo kovalentno vezavo proteinov, encimov in protiteles in odpravljajo procesne težave povezane z difuzijo substratov in produktov do/od biološkega katalizatorja (Jain, 2006).

6.2.1 Vezava encimov

Encimi so velike proteinske molekule, ki razpolagajo z velikim številom reaktivnih mest, ionskih skupin in hidrofilnih domen. Vse te strukture s pridom izkoriščamo pri imobilizaciji.

Fizikalna adsorpcija

V primeru fizikalne adsorpcije se encim poveže s površino nosilca s fizikalnimi interakcijami, npr. z van der Waalsovimi vezmi, vodikovo vezjo ali hidrofilno-hidrofobnim delovanjem. Ker ne poteče nobena kemijska reakcija, je konformacija adsorbiranih proteinov nespremenjena in katalitska aktivnost encimov ohranjena. Nosilni materiali za fizikalno adsorpcijo encimov so aluminijevi oksidi, aktivno oglje, glina, diatomejska zemlja, steklo in hidroksiapatit (Buchholz in sod., 2005).

Zaradi šibke elektrostatične privlačnosti se fizikalno adsorbirani encimi v pretočnih sistemih izlužujejo z nosilca. Reakcijski pogoji (pH vrednost, ionska upornost, ...) še dodatno vplivajo na tovrstno izluževanje. Izgubo katalitske aktivnosti lahko omejimo s prečnim povezovanjem adsorbiranih encimskih molekul (Lee in sod., 2009).

Ionska vez

Ionska vez omogoča enostavno povezovanje encimov z nosilnim materialom. Vzpostavljene vezi ionskih parov med encimom in nosilcem so močnejše kot pri fizikalni adsorpciji, moč vezi pa je prav tako odvisna od reakcijskih pogojev. Kot nosilno ogrodje je mogoče uporabiti kar komercialne anionske in kationske izmenjevalce.


23

Kovalentna vez

Najpogostejši način imobilizacije je kovalentna vezava encima na nevodotopni nosilni material. Pri uspešni imobilizaciji se tvori kovalentna vez med funkcionalnimi skupinami nosilca in med reaktivnimi aminokislinskimi ostanki encima (Preglednica 6), ki niso del encimskega aktivnega mesta ali veznega mesta za substrat.

Kovalentno imobilizirani encimi se pri običajnih reakcijskih pogojih ne izlužujejo z nosilca in ostajajo stabilni tudi ob spremembi koncentracije substratov in/ali ionske jakosti. Napačen izbor oz. napačna predpriprava nosilnega materiala se lahko odraža v spremenjeni strukturi aktivnega mesta oz. v zmanjšanju encimske aktivnosti in selektivnosti.

Preglednica 6: Reaktivne skupine aminokislinskih ostankov

Skupina Opis

‐ NH3 terminalna amino skupina L‐lizina in N‐terminalna skupina

‐ SH tiolna skupina L‐cisteina

‐ COOH karboksilna skupina L‐aspartata in L‐glutamata, C‐terminalna karboksilna skupina

fenolna skupina L‐tirozina

gvanidinska skupina L‐arginina

imidazolni del funkcionalne skupine L‐histidina

– S – S– disulfidna skupina L‐cisteina

imidazolni del funkcionalne skupine L‐triptofana

CH3 – S – tioeterska skupina L‐metionina

– CH2OH hidroksilna skupina L‐serina in L‐treonina

Vezava nosilnih materialov in encimov ne poteče spontano. Pred izpostavitvijo nosilca encimu moramo na površini nosilnega materiala kemijsko aktivirati funkcionalne skupine amino, amido, hidroksilnega ali karboksilnega značaja (reaktivne skupine, ki pri tem nastanejo so opisane v Ullmann's Biotechnology ..., 2007). Takšna priprava nosilnega materiala ponuja širok nabor imobilizacije encimov na nosilni material:

Diazonijeva vezava je osnovana na pretvorbi amino skupine nosilca z nitritom v kislem mediju do arildiazonija, s katerim se poveže npr. imidazolna ali fenolna skupina encima.

Peptidna oz. amidna vez nastane med nukleofilno (amino, hidroksil, tiol) skupino encima in aktivirano skupino nosilca. Karboksilne skupine nosilca lahko aktiviramo na dva načina, z direktno pretvorbo do reaktivnega derivata ali z uporabo kondenzirajočih reagentov, ki tvorijo amidno vez z amino skupinami encima.

Alkilirane ali arilirane amino, fenolne ali tiolne skupine encima reagirajo s halidnimi, epoksi ali vinilsulfonilnimi skupinami nosilnega materiala.

V literaturi naletimo še na številne druge načine aktivacije funkcionalnih skupin nosilnega materiala. Opis konkretnih mehanizmov kovalentne vezave sta uredila Palmer in Bonner (2007).

Tvorba kelatov

Zanimiva tehnika imobilizacije je tvorba kelatnega kompleksa med encimom in nosilno molekulo. Centralni atom predstavlja navadno katera od prehodnih kovin (npr. Ti, Zr, ...), ki tvori več vezi tako z organskim (npr. celuloza) ali anorganskim (npr. steklo) nosilcem, kot z encimom. Vzpostavljene strukture so neobstojne ob prisotnosti drugih kelatizirajočih snovi (Kirstein, 1996; Ho in sod., 2004).

NH N

N H

H NH –N – C NH2

– – OH


24

Biospecifična vez

Mnoge biološke molekule razpolagajo tudi z vezavnimi mesti, ki so encimom specifična. Tovrstne strukture lahko izkoristimo za imobilizacijo, v primeru, da vezava molekule ne oslabi katalitske funkcije encima.

Precej raziskovalnega napora je namenjeno imobilizaciji encimov s pomočjo monoklonskih teles. V postopku dobro definirano regijo encima vežemo na monoklonsko telo, monoklonsko telo pa na nosilni material. Takšna vezava preko »posrednika« omogoča stabilizacijo encimske strukture in bolj nadzorovano imobilizacijo na poljubnem nosilnem materiali (Bruun in sod., 2000).

Prečno povezovanje encimov

Encime lahko vežemo kovalentno medsebojno, ali z drugimi inertnimi proteini (npr. albumini). Tako pripravljene agregate ločimo iz raztopine z usedanjem.

Prečno povezovanje uporabljamo pogosto tudi za dodatno stabilizacijo v imobiliziranih sistemih, npr. prečno povezovanje fizikalno adsorbiranih encimov na površino steklenih kroglic in prečno povezovanje encimov na površino membranskih filtrov (Rios in sod., 2004).

Zaradi težkih reakcijskih razmer, v katerih poteka vezava, je končna aktivnost prečno povezanih biokatalizatorjev ponavadi nizka (Buchholz in sod., 2005).

Novejša metoda izdelave prečno povezanih encimskih kristalov (cross-linked enzyme crystals, CLECs), razvita za potrebe preučevanja strukture encimov s pomočjo rentgenske kristalografije, je zanimiva tudi iz vidika separacijskih in imobilizacijskih postopkov (Noritomi, 2007). Prečno povezani encimski kristali imajo izredno visoko stabilnost. Strukturo in katalitsko funkcijo ohranjajo tudi v nepolarnih topilih, v prisotnosti plinske fazi ali superkritičnega fluida. Njihova čista in trdna zasnova omogoča razvoj novih bio-čipov za integracijo v vezja terenskih in diagnostičnih senzorskih komponent.

6.2.2 Ujetje encimov

Gibanje encimov v reakcijski mešanici lahko omejimo fizično, z imobilizacijo znotraj poroznih materialov. Tvorba kemijskih vezi med encimom in nosilcem pri tem tipu imobilizacije ni nujno potrebne. Pore nosilnega material morajo biti dovolj majhne, da preprečijo uhajanje encima in dovolj velike, da omogočijo prehajanje substratov in produktov.

Ujetje v gel

Encime ujamemo v intersticije, ki nastanejo med prečnim povezovanjem gela. Na voljo so številne kombinacije sredstev za prečno povezavo (glutaraldehid, toluen diizocianat, UV svetloba, ...) in snovi, ki so sposobne tvorbe gelov (alginat, agar, karagenan, ...).

Difuzija substrata do encima v gelu omejuje hitrost katalitske pretvorbe do produkta. Ker sterilizacija gelov ni enostavno opravilo so takšni sistemi dovzetni za mikrobne infekcije in med potekanjem procesa zahtevajo več pozornosti.

Različica vgrajevanja encimov v gel je ko-polimerizacija. Pri tem pristopu encim z kopolimerizacijo imobiliziramo v polimerni matriks. Zaradi kovalentne vezave v samo strukturo nosilnega materiala je verjetnost izpiranja encima iz polimera močno zmanjšana. Chen in sodelavci (2000) poročajo o večji odpornosti tako imobiliziranega encima invertaze, na temperaturne spremembe in spremembe pH vrednosti.

Mikroenkapsulacija

Enkapsulirani encimi so obdani z membranami, ki so prepustni za substrate in produkte.


25

Priprava mikrokapsul navadno poteče v organsko-vodnem dvofaznem sistemu. Emulziji vodne raztopine encimov in organske faze dodamo membranski polimer v organskem topilu. Polimer difundira v kapljice emulzije, kjer tvori stabilne membrane. Oblikovane strukture dosegajo velikosti 1 – 100 μm. Z uporabo lipidno-poliamidnih membran je mogoče enkapsulirati tudi koencime in multiencimske komplekse.

Z mikroenkapsuliranimi encimi dosežemo najvišje koncentracije encimov na enoto prostornine imobiliziranega preparata (Ullmann's Biotechnology ..., 2007).

Reverzne micele

Amfifilne molekule oblikujejo kroglaste strukture, tako da mimimizirajo neugodne polarno-nepolarne interakcije med okoljem in vodnimi molekulami. V polarnem okolju so lipofilni repi obrnjeni v notranjost micele, v nepolarnih topilih pa so micele organizirane obratno, repi so obrnjeni navzven, voda pa se nahaja v notranjosti reverznih micel (Slika 15).

Slika 15: Struktura reverzne micele v nepolarnem topilu

Encimi, ki so raztopljeni v notranjosti takih struktur, ohranijo svojo aktivnost in so zaščiteni pred nepolarnim okoljem z obdajajočim amfifilnim slojem. Membranski reaktorji ponujajo številne prednosti za vodenje procesa katalitske pretvorbe substratov, netopnih v polarnih topilih, s pomočjo reverznih micel, kot sta kontinuirana proizvodnja in poenostavljena sočasna separacija produkta (Serralheiro in sod., 1999).

6.2.3 Filtracija raztopljenih encimov

Imobilizacija encimov se lahko izraža v spremembi encimske aktivnosti in/ali selektivnosti. Kadar je v procesu potrebno uporabiti nativno obliko encima, lahko gibanje encimov v reaktorju omejimo z membrano, ki omogoča prehajanje substratov in produktov ter je neprehodna za večje encimske molekule. V ta namen se uporabljajo ultrafiltracijske in kapilarne membrane ter moduli in pregrade s poroznimi vlakni, ki encime tudi varujejo pred mikrobno infekcijo.

Encimski kofaktorji so ponavadi manjše molekule in zato prehajajo tudi ultrafiltracijske membrane. Z vezavo na večje molekule kofaktorje zadržimo v reakcijski mešanici.

Z izbiro in dodatno obdelavo membran (velikost por, hidrofilnost membrane, ...) vplivamo na selektivnost procesa. Osnovne težave, povezane z uporabo membran so mašenje in kvarjenje membran (adsorpcija in reaktivnost z raznimi snovmi reakcijske mešanice) ter hitrost procesa, omejena z uporom transporta snovi.

H20

nepolarno topilo

nepolarni rep

polarna glava


26

6.3 CELICE

Katalitska aktivnost je pomembna lastnost celic in pripadajočih celičnih organel. Iz tehnološkega vidika so celice pravzaprav različica imobillizacije intracelularnih encimov oz. so: »tovarna« ekstracelularnih encimov in situ, ter vir drugih bioloških molekul s katalitskim delovanjem.

Uporaba izoliranih encimov je v proizvodnji omejena na enostavne sisteme. Pri katalizi večstopenjskih reakcij izkoristimo zaščitno vlogo celične strukture za stabilizacijo katalitskega potenciala encimov in za nemoten potek regeneracije kofaktorjev.

Celice tako uporabljamo bodisi za katalizo kompleksnih reakcij, (i) kjer je vključena ena vrsta encimov; (ii) katalizo reakcij, ki vključujejo več različnih vrst encimov z ali brez kofaktorji in (iii) pri pridobivanju primarnih oz. sekundarnih metabolitov celotnih metabolnih poti.

Raba celic v biotehnoloških postopkih je zaželena (Ullman's Biotechnology ... , 2007):

- ko potrebujemo intracelularne encime, ki so nestabilni v izolirani obliki, - ko mikroorganizmi ne vsebujejo motečih encimov oz. so ti encimi deaktivirani, - ko so substrati in produkti v procesu nizko molarni in hitro prehajajo skozi membrano.

Potek metabolnih poti in regeneracije kofaktorjev je pogojen z vitalnostjo celic, zato je tovrstna večstopenjska pretvorba mogoča le s fermentacijo z živimi celicami. Pravilno izbrane in pripravljene aktivne celice sicer proizvajajo želene produkte, toda v osnovi je njihovo delovanje usmerjeno v lastno preživetje. Za svoje vzdrževalne potrebe porabljajo del kemično vezane energije substrata, zaradi česar je ovirana aplikacija marsikaterega procesa. Nadalje je zaradi vsebnosti živih organizmov v iztoku potrebno dodana obdelava odpadne biomase, kar je dodaten strošek proizvodnega procesa (Buchholz in sod., 2005; Walker in Rapley, 2009).

Celična membrana po eni strani varuje celično notranjost, po drugi strani pa omejuje hitrost transporta substrata v celico in produkta iz celice. Encimi v znotraj-celičnem okolju privzamejo aktivno konformacijo. Na enak način tudi multiencimske strukture ohranjajo znotraj celice stabilno geometrijo, v izolirani obliki pa so precej nestabilne.V primerih, ko preživetje organizma v reakcijskih pogojih ni pomembno, lahko z določenimi tehnikami (npr. z elektroporacijo) povečamo prepustnost celične membrane, odpravimo problematičnost iztoka in se izognemo porabi energije za vzdrževalne potrebe organizma (Ullman's Biotechnology ... , 2007).

Žive celice (živalske, rastlinske celice in mikroorganizmi) oz. uporaba njihovih ohranjenih celičnih struktur ponuja bogatejši izbor biokatalitične aktivnosti, kot uporaba izoliranih encimov in drugih katalitsko aktivnih bioloških snovi.

Živalske celice

Živalske celične in tkivne kulture so dobro uveljavljene tako v raziskovalnem okolju kot v aplikacijah. Raziskovalci v živalskih celičnih kulturah opravljajo rutinsko ekspresijo genov za proizvodnjo rekombinantnih proteinov in genski inženiring protiteles. V proizvodnji vakcin živalske celice izpostavijo oslabljenim virusnim sevom (Deinhardt in Jilg, 1986; Barteling in Vreeswijk, 1991).

Bakterijske celice lahko uporabimo za ekspresijo humanih proteinov, vendar večina proteinskih struktur po mRNA translaciji še ni biološko aktivnih. Pomembna biokatalitska značilnost živalskih celic je sposobnost posttranslacijskih modifikacij (glikozilacija, tvorba disulfidnih mostičkov, karboksilacija, amidacija ali fosforilacija aminokislinskih ostankov,


27

specifična rez proteinske verige), ki zagotovijo pravilno delovanje proteina (Demain in Vaishnav, 2009).

Navkljub številnim prednostim so živalske celice v praksi občutljive, imajo natančno določene življenjske potrebe, dajejo nizek donos proizvoda in so dovzetne za morebitne infekcije. Največ aplikacij živalskih celic zato zasledimo v medicini, za proizvodnjo bioloških snovi z visoko dodano vrednostjo (Walker in Rapley, 2009).

Rastlinske celice

Razvoj biokatalize s pomočjo živih rastlinskih celic napreduje počasi, delno zaradi omejitev povezanih z gojenjem rastlin (podnebne in vremenske razmere, nizki pridelki, ...), predvsem pa zaradi dragih ekstrakcijskih postopkov in problematičnosti kopičenja celičnih odpadnih metabolitov v vakuolah. Zaradi tega specifičnega problema celice med ekstrakcijo izločajo tudi vsebino vakuol, ki kontaminira produkt.

Gojenje rastlinskih tkivnih kultur je možna alternativa klasični pridelavi rastlin za proizvodnje manjšega obsega. Spoznanja s področja genetskega inženiringa energetskih rastlin se odražajo v novih transgenih rastlinah, ki imajo mikroorganizmom primerljiv donos proizvodnje biomolekul.

Mikroorganizmi

Enostavnejša zgradba mikroorganizmov nam zagotovo ponuja bolj raznovrstni potencial uporabe v primerjavi z njihovimi kompleksnejšimi evolucijskimi sorodniki (Nekrep, 1996). Walker in Rapley (2009) ocenjujeta, da trenutno poznamo manj kot 3 % celokupnega katalitskega potenciala, s katerim razpolagajo mikroorganizmi.

Največ pozornosti biotehnologije so bile v preteklih desetletjih deležne bakterije. Njihove biokatalitske sposobnosti zaposlujemo v živilski industriji in industriji pijač, velik pomen imajo tudi v medicini, kmetijstvu, prehrani živali in čistilnih tehnologijah.

Prokarionti ne vsebujejo celičnih organel, vendar v njihovi protoplazmi potekajo izjemno dovršeni mehanizmi katalize procesov biosinteze in razgradnje. V laboratorijskih pogojih jih gojimo lažje, kot živalske ali rastlinske celice, vendar je njihova uporaba v praksi odvisna od končne kvalitete produkta (separacija celic / metabolitov).

6.4 IMOBILIZACIJA CELIC

Prednost imobilizacije celic pred uporabo suspendiranih kultur intenzivifikacija procesa, je znižanje stroškov biotehnološkega procesa zaradi višje celične gostote, enostavnejše separacije in ponovne oz. kontinuirane rabe kulture. Postopki imobilizacije celic so pravzaprav različica tehnik imobilizacije encimov. Običajno so tehnike celične imobilizacije delovno in cenovno manj zahtevne, saj se izognemo stopnji ekstrakcije in čiščenja encimov. Intracelularni encimi so v takšnih pogojih bolj stabilni, saj jim notranjost celice zagotavlja dodatno zaščito v reakcijski mešanici. Z imobilizacijo dosežemo tudi večjo odpornost celic na strižne sile.

Zaradi imobilizacije celic v procesu biokemijske pretvorbe prihaja tudi do določenih omejitev (Marinšek-Logar, 1999):

- ovirana difuzija in tvorba koncentracijskih gradientov substratov in produktov v reakcijskem mediju,

- pomanjkanje kisika znotraj delcev pri aerobnih procesih, - omejena celična delitev, - metabolne spremembe celic.


28

V naravi pogosto naletimo na sesilne in agregirane oblike mikrobnih kolonij. Vsak še tako inerten material v naravnem okolju postane prej ali slej biološko aktiven zaradi adhezije mikroorganizmov. Lep primer kompleksno organiziranih mikrobnih biofilmov so dentalni plaki. Na razpoložljive površine svojega naravnega okolja se pritrjujejo tudi fluvialni organizmi, ki se razraščajo po površinah in sedimentih ter večjih organizmih rečnega dna. Primer mikrobnih agregatov najdemo na koreninah rastlin iz družine metuljnic, kjer ti simbionti omogočajo biološko fiksacijo dušika iz zraka (Marinšek-Logar, 1999; Fett in Cooke, 2005; Filoche in sod., 2010).

Slika 16: Načini imobilizacije celic (Ullman's Biotechnology ..., 2007)

Laboratorijski oz. industrijski postopki imobilizacije posnemajo in modificirajo organizacijo mikroorganizmov v naravnem okolju (Slika 16). Laboratorijsko sta bili razviti še tehniki imobilizacije z zamreževanjem celic in enkapsulacija celic v membranah.

Glede na rabo nosilnega materiala lahko načine imobilizacije celic razdelimo v sledeče kategorije (Ullmann's Biotechnology ..., 2007):

- imobilizacija brez nosilca - imobilizacija na predhodno pripravljen nosilec, - imobilizacija med pripravo nosilca, - imobilizacija z nadzorovano rastjo / germinacijo spor

6.4.1 Celice na nosilcih

Lastnosti nosilnih materialov za celice v osnovi ne odstopajo od želenih lastnosti nosilcev konvencionalnih katalizatorjev ali encimov. Zaželena je dobra komercialna dostopnost, visoka specifična površina, dobra mehanska in kemična odpornost nosilca, ki ne sme biti toksičen ali razgradljiv za izbrano celično kulturo. V primeru imobilizacije povsem aktivnih celic, je potrebno upoštevati tudi potencial nosilca za kolonizacijo (velikost por in elastičnost materiala).

Adhezija in adsorpcija

Proste celice v raztopini imajo visoko afiniteto za pritrjevanje na trdne snovi. Z dolgotrajno izpostavitvijo nosilnem materialu se celice nanj imobilizirajo same. Navadno je za nastanek

Imobilizacija celic

Vezava na nosilce Ujetje

prečno povezovanje

flokulacija

Agregacija

kovalentna vez

membrane adhezija in adsorpcija

ionska vez

zamreževanje mikro

enkapsulacija


29

biofilma na površini nosilnega materiala potrebna še predhodna vezava makromolekul, ki s celicami vzpostavijo številne vendar šibke elektrostatične sile. Nekateri mikroorganizmi se lahko na nosilec pritrdijo še s flagelami, pili, fimbriji in z ekstracelularnimi polimeri, ki dokončno utrdijo položaj celice na nosilcu. V ustreznem sistemu se vzpostavi ravnotežje med izgubo (strižne sile, abrazija, odmiranje) in rastjo celic biofilma (Marinšek-Logar, 1999).

Čeprav je opisana metoda izredno preprosta, je njena uporaba omejena v težjih reakcijskih pogojih (hitrost mešanja, pH vrednost, ionska jakost). Stabilnost samega biofilma je pogojena tudi s samo vrsto in fiziološkim statusom imobilizirane biomase.

Fizikalna adsorpcija z adhezijo celic na nosilni material je v uporabi v kolonskem čiščenju odpadnih vod. Uveljavlja se tudi na področju proizvodnje zdravilnih bioloških učinkovin z mikrosferičnimi, makroporoznimi in monolitnimi polimernimi nosilci (Ullmann's Biotechnology ..., 2007).

Ionska vez

Elektrostatični naboj celice (npr izrazito negativen pri kvasovkah) tvori z ionsko površino nosilca stabilni kompleks. Nosilni material v uporabi so sintetični ionski izmenjevalci, razni anorganski materiali in modificirani celulozni derivati. Stabilnost imobilizacije je odvisna od pH vrednosti, ionske jakosti, starosti celice in sestave površine nosilca.

Kovalentna vez

Kovalentno povezovanje celic z nosilnim materialom je sicer mogoče, vendar v praksi ni razširjeno. Sredstva, ki inducirajo kovalentno vezavo so namreč zelo reaktivna in pogosto povzročijo znižanje celične aktivnosti in/ali viabilnosti (Ullmann's Biotechnology ..., 2007).

6.4.2 Ujetje celic

Zamreževanje

Zamreževanje celic je razširjena tehnika imobilizacije, pri kateri celice omejimo v strukturne vrzeli med oblikovanjem nosilnega materiala. Celice v pripravljeni strukturi niso vezane na nosilec, temveč je njihovo gibanje omejeno z velikostjo intersticije.

Zaradi milih reakcijskih pogojih, pri katerem poteka zamreževanje, je ta tehnika primerna za vse oblike celic in celičnih delov. Končni preparat je v rinfuzi peletov, kroglic oz. podobnih oblik, z visoko koncentracijo aktivnih celic.

Mosbach in Mosbach (1966) sta razvila osnovno metodo zamreževanja celic v poliakrilamidnem gelu. Postopek temelji na polimerizaciji prostih radikalov

Slika 17: Sod za hitro proizvodnjo kisa

A ‐ sod: h ≈ 2,4 m; dz ≈ 1,1; ds ≈ 0,9m, B ‐ perforirana pregrada, C ‐ prezračevalne odprtine, D ‐ odtočni ventil E ‐ fiksni del pokrova, G ‐ pokrov za dolivanje substrata

Imobilizacija celic je v praksi poznana od leta 1823, odkar je v uporabi Schutzenbachov hitri postopek proizvodnje kisa.

Scutzenbach je za proizvodnjo kisa uporabil pokončno postavljen sod s perforirano pregrado v njegovi notranjosti. Zgornji del soda je tesno zapolnil z lesnimi oblanci, na obodu spodnje komore pa je v enakomernih presledkih namestil prezračevalne odprtine.

Na oblancih se med procesom razrašča acetogena mikrobna združba. Substrat teče preko oblancev skozi perforirano dno v spodnji zbiralnik. Tekočino je potrebno recirkulirati dokler ni dosežena ustrezna koncentracija ocetne kisline v kisu.

Tovrstni sistemi so dandanes opremljeni z avtomatsko obtočno črpalko, razpršilno enoto za

enakomerni nanos substrata na oblance in napravo za aktivno prezračevanje (Wood, 1988).


30

akrilamidnih monomer v vodni suspenziji celic pri nizki temperaturi. V procesu je mogoče nadzorovati število prečnih povezav med monomerami, ki vplivajo na poroznost in mehanične lastnosti materiala. Toksični akrilamidni derivati vplivajo na zmanjšanje celične viabilnosti in encimske aktivnosti.

Hackel in sodelavci (1975) so uvedli imobilizacijski postopek z zamreževanjem celic v aluminijevem alginatu. Alginat je polisaharid, ki ga pridobivamo z ekstrakcijo morskih alg. V prisotnosti multivalnetnih ionov (navadno aluminijevi in kalcijevi ioni) tvori inertno tridimenzionalno mrežo, v katero se ujamejo imobilizirane celice. Nastali gel je močno porozen, z ustrezno velikostjo por, ki ne dovoljuje uhajanja celic.

Kalcijev alginat se v okolju z kelatizirajočimi ligandi raztopi, zato je gel mogoče stabilizirati z naknadno substitucijo kalcijevih ionov. Struktura ni primerna za hitro rastoče celice, saj lahko zaradi povečevanja celične biomase alginatne kroglice razpadejo. Pri izdelavi alginatnih kroglic velja nameniti pozornost premeru kroglice in velikosti por, da proces ne bo pretirano omejen z difuzijo (Marinšek-Logar, 1999).

Membrane

Pri membranski imobilizaciji gibanje posameznih celic ni omejeno s strogem smislu, temveč celice v reaktorju zadržuje membranska prepreka. Celice so v takšnem sistemu izpostavljene topnim komponentam reakcijske mešanice.

V praksi so najbolj razširjeni reaktorski moduli s poroznimi vlakni, pri katerih se dosega višje celične gostote kot v zamreženih nosilcih. Hitrost rasti in razmnoževanja celic vpliva na trajnost procesa, saj prekomerno namnožena celična biomasa poškoduje membrano (Ullmann's Biotechnology ..., 2007).

Mikroenkapsulacija

Mikroenkapsulacija celic je uporabna v procesih, kjer se želimo izogniti neposrednem kontaktu med imobiliziranim organizmom in reakcijskim okoljem, bodisi zaradi škodljivih vplivov imobiliziranih celic (uporaba v terapevtiki), bodisi zaradi možne infekcije aktivne celične biomase z nesterilnim substratom.

Osnovna tehnika temelji na začetni imobilizaciji želenega tipa celic v raznovrstnem naboru polimernih kroglic (premera ~ 20nm do 2 mm) in naknadni tvorbi semipermeabilne membrane na površini kroglice. Matriks kroglic je najpogosteje sestavljan iz različnih vrst alginata, uporabljajo pa se tudi hitozan, kolagen, dekstran, agaroza in razni sintetični polimeri.

Različica mikroenkapsulacije vključuje dodatno raztapljanje polimernega matriksa po tvorbi membrane. Nastanejo votle strukture, ki vsebujejo prosto gibljive celice (Murua in sod., 2008).

6.4.3 Celični agregati

Številne suspendirane kulture težijo k agregaciji pri visoki celični gostoti. Če se celice po delitvi ne morejo ločiti, govorimo o pasivni agregaciji, če pa agregat nastane z gibanjem in združitvijo celic, pa pravimo, da je agregacija aktivna. Različne vrste kvasovk, nitastih gliv, rastlinskih celic in bakterij tvorijo v reaktorju z lebdečim slojem (fluidized bed reactor) agregate, ki so odporni na strižne sile (Scott, 1987).

Med tipi celičnih agregatov razlikujemo flokule, pelete in granule. Kosmiči ali flokuli so krhke strukture nepravilnih oblik, ki po usedanju tvorijo navidezno homogeno plast. Granule in peleti so grudičaste strukture, ki po usedanju ohranijo svojo obliko. Granule se razlikujejo v obliki, kemični strukturi in biološki aktivnosti (Marinšek-Logar, 1999).


31

Umetno agregacijo celic sprožimo z dodatkom polielektrolitov, ali pa s sredstvi za kovalnetno prečno povezovanje (Hua in sod., 2004; Hu in sod., 2007). V nekaterih primerih agregacijo inducira tudi že samo prepihovanje s kisikom (Marinšek-Logar, 1999).

6.4.4 Imobilizacija celičnih organel

Raba imobiliziranih celičnih organel je zanimiva predvsem zaradi energetsko-metabolnih procesov, ki jih ohranjajo v izolirani obliki (npr. ATP regeneracija, proizvodnja H2 in oksidacija metabolitov).

V osemdesetih letih prejšnjega stoletja so raziskovalci posvečali veliko pozornost potencialu imobilizacije kloroplastov za izdelavo alternativnih oblik fotovoltaičnih celic. Dandanes so raziskave usmerjene v razvoj novih oblik gorivnih celic s pomočjo imobilizacije mitohondrijev (Bhardwaj in sod., 1981; Arechederra in sod., 2008).

6.5 LASTNOSTI IMOBILIZIRANIH BIOKATALIZATORJEV

Zadrževanje biokatalitskih komponent v reakcijski mešanici, dosežemo z vezavo, ujetjem ali agregacijo biokatalizatorjev. Različne tehnike imobilizacije v različno vplivajo na zmanjšanje biokatalitske aktivnosti. Slika 18 predstavlja osnovne razloge za nižanje katalitske sposobnosti vezanega biokatalitskega materiala.

Slika 18: Vpliv vezave na aktivnost encimov (po Ullmann's Biotechnology ..., 2007)

Pri uspešni vezavi se tvori kovalentna vez med funkcionalnimi skupinami nosilca in biokatalizatorja, ki niso del katalitsko aktivnega mesta ali veznega mesta za substrat (Slika 18, a). Napačen izbor oz. napačna predpriprava nosilnega materiala se lahko odraža v spremenjeni strukturi (b), inhibiciji (c in d) in steričnem oviranju aktivne katalitske komponente.

Primerjava aktivnosti prostih in imobiliziranih biokatalizatorjev je težavna naloga, saj je čas pretvorbe v imobilizacijskem ogrodju odvisen tudi od transporta snovi. Pri encimih vezanih na nosilni material je aktivnost bolj ohranjena v primeru večje obremenitve nosilca. V razmerah, kjer je prisoten upor transporta snovi, lahko količino imobiliziranega proteina določimo natančno le s titracijo aktivnih mest.

Stabilizacija

Delovanje prostih in imobiliziranih biokatalizatorjev v osnovi omejujejo isti faktorji okolja. Vendar se neredko dogaja, da postopek imobilizacije dodatno stabilizira encimsko strukturo, da ta postane bolj odporna v reakcijskih pogojih. Več-točkovna kovalentna vezava encima utrdi njegovo terciarno in kvartarno strukturo. Vezava aminokislinskih ostankov, ki niso del katalitske regije encima, pa stabilizira strukturo že zaradi njene manjše reaktivnosti (Fernández-Lafuente in sod., 1999).

‐ encim ‐ substrat ‐ nosilec

a b c d e


32

pH optimum

Encimi, ki so imobilizirani na ionske nosilce, dosežejo maksimalno aktivnost pri drugačni vrednosti, kot njihovi prosti homologi. V neposredni bližini površine nosilca z negativnim nabojem je pH vrednost nižja, kot meri pH ostale raztopine, zato je pH optimum biokatalitske molekule, merjen v reakcijski mešanici, navidezno višji. Nosilno ogrodje s pozitivnim nabojem ima recipročni učinek, pH vrednost je v neposredni bližini nižja, zato je izmerjeni pH optimum encima v reakcijski raztopini nižji (Ullmann's Biotechnology ..., 2007).

Polarnost

Polarnost imobilizacijskega matriksa določa njegovo afiniteto do substrata. Privlačne oz. odbojne sile vplivajo na koncentracijo substrata v bližini aktivnih mest biokatalizatorja, s čimer je pogojena hitrost encimske pretvorbe. Pri polarnih substratih dosežemo visoke hitrosti reakcije z uporabo polarnih nosilcev, pri nepolarnih substratih pa so učinkovite hidrofobne površine (Ullmann's Biotechnology ..., 2007).

7 REAKTORJI ZA IMOBILIZIRANE SISTEME

Pri načrtovanju kemijskih reaktorjev moramo poznati termodinamiko in kinetiko reakcije, ki jo nameravamo aplicirati. Termodinamika napoveduje stopnjo kemijske pretvorbe oz. položaj kemijskega ravnotežja med reaktanti in produkti. Kinetika pa je povezana z velikostjo reaktorja in ocenjuje, kako hitro bo mogoče kemijsko ravnotežje doseči.

Fizikalna osnova dimenzioniranja vsakega procesa kemijske pretvorbe zajema mehanizme snovnega in toplotnega transporta med fazami ter mehanizem transporta toplote v okolico. Fizikalni in kemijski model skupaj predstavljata matematični model kemijskega reaktorja.

S simulacijo procesa na laboratorijskem in pilotnem nivoju pridobimo potrebne kinetične podatke ter preverimo oz. popravimo matematični model, ki ga lahko neposredno uporabimo za načrtovanje novega oz. optimizacijo obstoječega komercialnega reaktorja.

Kemijske reaktorje v praksi dimenzioniramo na osnovi zakona o ohranitvi mase (snovna bilanca) in zakona o ohraniti energije (toplotna bilanca). Na področju reakcijskega inženirstva se uveljavlja tudi raba zakona o ohranitvi gibalne količine, s katerim je danes že mogoče napovedati enostavne geometrijske konfiguracije reaktorja (Levec in Pintar, 2008).

7.1 KINETIKA

Pojav katalize vpliva na kinetiko kemijskih reakcij, termodinamika pa ostaja nespremenjena. S prisotnostjo katalizatorja v reakcijski mešanici se spremeni reakcijska pot od reaktanta do produkta, tako da se kemijsko ravnotežje vzpostavi hitreje. Kinetiko kataliziranih kemijskih reakcij opisujemo glede na zgradbo in organizacijo katalizatorjev (heterogen / homogena oblika), reda reakcije (koncentracija reaktantov) in tip procesa (šaržni, šaržni z napajanjem substrata, neprekinjeni) (Rothenberg, 2008).

Na hitrost kataliziranih reakcij ima vpliv vrsta dejavnikov, od katerih so pomembnejši koncentracija katalizatorja, koncentracija reaktanta in produkta, prisotnost promotorjev in katalizatorskih strupov, temperatura in pH.

Za homogeno kemijsko reakcijo, ki poteka v šaržnem sistemu, lahko zapišemo:

LL ++→++ sSrRbBaA [2]


33

Stehiometrija določa razmerje hitrosti akumulacij posameznih komponent:

dtdn

sdtdn

rdtdn

bdtdn

aSRBA 1111

−=−=−=− [3]

V zaprtem sistemu s konstantnim tlakom in temperaturo, bo hitrost reakcije definirana kot:

častsistemaaprostorninV

komponentetejkoeficientijskistehiometrv

komponentetejmolovmnožinan

dtdn

vVr

j

j

j

j

−−

−−

−−

=11

[4]

Imobilizirani sistemi so pogosto omejeni s prenosom (difuzijo) snovi iz reakcijske mešanice do aktivnega mesta katalizatorja, kar lahko prikažemo z enačbo:

rkatalizatoKproduktPsubstratS

PKSKKS

PS

katalkatal

raztrazt

−−−

+↔↔+bb

[5]

Michaelis–Mentenov kinetični model

Michaelis-Mentenov model sorazmerno dobro opisuje večino eno-ino dvosubstratnih encimskih reakcij (Michaelis in Menten, 1913) ter se pogosto uporablja tudi za opisovanje zgradbe encimov kinetike homogenih reakcij (Rothenberg, 2008). Kadar imajo encimi več aktivnih mest / podenot, je potrebno uporabiti pomožne modele.

Za encimsko katalizirano reakcijo sta Michaelis in Menten zapisala;

reakcijekonsthitrostnekkk

EPESSEk

k

k

.2,1,1

2

1

1

=−+

+→←

→+ −

+

[6]

Katalizator se v prvi fazi veže na substrat. V naslednji fazi se med ireverzibilno razgradnjo intermediatnga kompleksa sprostijo nastali produkti in obnovljen encim. Začetna koncentracija encima je zato ob vsakem času enaka vsoti prostega in vezanega katalizatorja. Hitrost reakcije je torej omejena s koncentracijo katalizatorja.

Michaelis-mentenov model predpostavlja, da je encim (E) nacičen s substratom (S), oz. da je ves encim vezan v intermediatni kompleks (ES). Nastanek kompleksa je reverzibilen, nastanek produkta (P) pa ireverzibilen proces.


34

Pri teh pogojih velja:

[ ][ ]

..max

max

konstMentenovaMichaelisKreakcijehitrostmaksV

substratapretvorbehitrostr

SKSVr

M

S

MS

−−−

−

+=

[7]

Michaelis-Mentenova konstanta (KM) predstavlja tisto koncentracijo substrata, pri kateri je hitrost reakcije enaka polovični vrednosti maksimalne hitrosti pri konkretnih pogojih. KM je potrebno določiti za vsak substrat posebej, in je obratno sorazmerna afiniteti encima za določen substrat.

Rezultati Mihaelis-Mentenove enačbe so razporejeni vzdolž hiperbole (Slika 19), iz katere je razvidno logaritemsko naraščanje hitrosti reakcije v odvisnosti koncentracije substrata (linearno naraščanje pri nizkih koncentracijah substrata, upočasnjeno naraščanje pri visokih vrednostih do asimptote Vmax). Vrednosti KM in Vmax sta značilni za vsak par encim-substrat pri določeni temperaturi, pH in ionski sestavi raztopine.

Slika 19: Michaelis‐Mentenov graf

Pri imobiliziranih katalizatorjih je potrebno upoštevati še upor transporta snovi. V enačbo uvedemo faktor učinkovitosti μ:

[ ][ ]SKSVr

MS += maxμ [8]

Langmuir‐Hinshelwoodov kinetični model

Hineshelwoodow model prerazporeditve atomov, osnovan na Langmuirjevi teoriji idealnih površin (Murzin, 2005), opisuje najbolj pogost mehanizem delovanja heterogenih katalizatorjev (adsorpcija, reakcija, desorpcija). Model je uporaben tudi za opisovanje tistih homogenih katalizatorjev in biokatalizatorjev, kjer mora substrat / reaktant najprej koordinirati s kovinskim atomom / encimom, preden lahko poteče reakcija (Rothenberg, 2008).

Na površinsko vezanem heterogenem katalizatorju je Askupno aktivnih mest. Med procesom katalize se reagent (R) adsorbira na površino katalizatorja in tvori z aktivnim mestom intermediat RA. Po pretvorbi je na katalitsko mesto vezan preoblikovan intermediat PA. Produkt (P) se nato desorbira in omogoči ponovni začetek katalize na tem aktivnem mestu. Hitrostne konstante reakcij (k±1, k±2, k±3) so prikazane v enačbi 9.


35

[ ]

[ ]

mestaktivnihprostihdeležproduktomszasedenihmestaktivnihdeležreagentomzzasedenihmestaktivnihdelež

Pkkhitrost

APPA

kkhitrost

PARA

kRkhitrost

RAAR

A

P

R

PP

k

k

PA

k

k

RA

k

k

−−−

−=

+↔

−=

↔

−=

↔+

−

−

−

−

−

−

θθθ

θθ

θθ

θθ

33

3

3

22

2

2

11

1

1

[9]

Ob predpostavki, da reakcija na površini katalizatorja omejuje hitrost reakcije, potem velja:

[ ] [ ][ ] [ ]

produktakonstravnotežnakaadsorpcijsKreagentakonstravnotežnakaadsorpcijsK

PKRKPKkRKkhitrost

P

R

PR

PR

.

.

1)( 22

−−

++−

= −

[10]

7.2 PRENOS SNOVI

V reakcijski mešanici se reaktanti z difuzijo prehajajo iz raztopine v neposredno bližino aktivnega mesta katalizatorja. Zunanji transportni upor lahko bistveno zmanjša aktivnost katalizatorja.

Aktivno mesto imobiliziranih katalitskih komponent se lahko nahaja tudi v notranjosti nosilnih materialov, npr. znotraj gelov, poroznih struktur, filmov, flokul, ipd. V tem primeru pravimo, da je prenos snovi omejen z notranjim transportnim uporom (Ullmann's Biotechnology ..., 2007).

Zunanji transportni upor

Med prenosom reaktantov iz raztopine do aktivnega mesta katalizatorja in produktov iz površine katalizatorja v raztopino se med katalizatorjem in raztopino vzpostavi difuzijski sloj. V stacionarnem stanju je mogoča hitrost reakcije:

rjakatalizatopovršininapotekakireakcijekonsthitrostnakmejifazninasnoviprenosakoeficientk

BmestunareagentaijakoncentracRAmestunareagentaijakoncentracR

RkRRkhitrost

S

SL

B

A

BSBASL

,.

)(

−−−−

=−=

[11]


36

Če je koncentracija reagenta v raztopini RB, potem velja:

ASLS

S Rkkkhitrost ⋅

+=

1)/( [12]

Zaradi vpliva zunanjega transportnega upora celokupna kinetika procesa navidezno ne ustreza Michealis-Mentenovem modelu glede na koncentracijo substrata v raztopini. Pravilno predstavo o kinetiki dobimo zato v odsotnosti difuzije, kjer je vmax/kSL razmerje ozko. V ta namen je v reaktorskih pogojih potrebni pospešiti prenos snovi (pretok oz. hitrost mešanja), uporabiti manjšo koncentracijo katalizatorjev in znižati reakcijsko temperaturo.

Koeficient prenosa snovi (kSL) je v sistemih z nasutim ali lebdečim slojem je v večji meri odvisen od gostote, viskoznosti ter hitrosti linearnega toka raztopine.

Določevanje hitrosti gibanja raztopine v reaktorjih z mehanskim mešanjem je izredno zahtevno in kompleksno opravilo. Za oceno prenosa snovi komponento hitrosti nadomestimo s podatkom o korelaciji s vhodno močjo mešalca, ali z Reynoldsovim števílom mešalne geometrije (Garcia-Ochoa in Gomez, 2004).

Notranji transportni upor

Zaradi koncentracijskih gradientov, ki se vzpostavijo med površino in notranjostjo nosilnega matriksa, poteka prenos snovi skozi strukturo nosilca z difuzijo. Hitrost reakcije je v matriksu odvisna od koncentracije substratov, reaktantov in produktov. Zaradi sprotne pretvorbe substrata/regenta med difuzijo skozi nosilni matriks, je v notranjosti nosilnega materiala vedno manjša koncentracija teh snovi kot na fazni meji. Tako v šaržnih kot pretočnih je hitrost difuzije s fazne meje v notranjost imobilizacijskega matriksa odvisna od koncentracije substrata v reaktorju. V pretočnih sistemih ostaja koncentracija substratov enaka, medtem ko se v šaržnem reaktorju količina substrata spreminja (porablja) s časom. Učinkovitost prehoda snovi je večja, kadar je debelina oz. velikost delcev nosilca manjša. Celokupni vpliv difuzije opišemo s faktorjem učinkovitosti η:

raztopinivreakcijeneekvivalenthitrostreakcijehitrostcelokupna

=η [13]

Za potrebe kinetičnih študij je tudi notranji transportni upor potrebno docela izničiti (η = 1). Večjo prehodnost nosilca dosežemo z uporabo manjših nosilnih delcev, nižjo koncentracijo katalitskega materiala v mešanici, z uporabo bolj poroznih (večji premeri por) nosilnih materialov in z vodenjem procesa pri nižjih temperaturah.

7.3 LABORATORIJSKI REAKTORJI

Kinetične parametre in meritve aktivnosti imobiliziranih katalizatorjev opravljamo v strnjenem sloju katalizatorja (reaktor s strnjenim slojem – stolpni / cevni reaktor), v homogeni suspenziji katalizatorjev (reaktorji z mešanjem), ali z razširjeno katalitsko plastjo (reaktor z lebdečim slojem).

V kolonskih reaktorjih se vzpostavijo vzdolžni gradienti substratov / reaktantov in produktov, prihaja pa lahko tudi do nepopolne razporeditve sestavin vtoka (t.i. channeling). Tem nezaželenim učinkom se je mogoče izogniti z visokim pretokom in uporabo tankih slojev


37

katalizatorja. Z mešanjem reaktorske vsebine se koncentracijskim gradientom v raztopini sicer izognemo, vendar moramo upoštevati vpliv strižnih sila na odpornost in aktivnost katalizatorja.

Inženirski kompromis med strnjenimi in suspendiranimi katalizatorji predstavljajo reaktorji z lebdečim katalizatorskim slojem, kjer je za pravilno obratovanje sistema potrebno zagotoviti zadostno gostoto delcev v fluidizirani plasti. Prednosti lebdečega sloja so: zanemarljiv padec talka pri prehajanju tekočine skozi sloj, majhna obraba lebdečih delcev, enakomerna disperzija vtoka in preprečeno mašenje sloja.

7.4 VRSTE REAKTORJEV

V splošnem izbiro ustrezne vrste reaktorja pogojujejo številni pogoji, od katerih je odvisen reaktorski učinek (Laskin, 1985; Moo-Young, 1988; Buchholz in sod., 2005; Najafpour, 2007; Ullmann's Biotechnology ..., 2007):

- koncentracija reagentov in produktov / biomase v sistemu, - komercialna dostopnost substrata, - stabilnost in inhibitornost produkta, - kinetika kemijskih reakcij / lastnosti metabolizma, - koncentracije in aktivnost katalitske komponente, - mešanje reaktorske vsebine, - vpliv strižnih sil, - vzdrževanje temperature, - uvajanje raznih plinov, - poraba energije, - šaržno / pretočno delovanje, - zahteve po sterilnosti, - zahtevana stopnja nadzorovanja procesnih pogojev, - zaključni postopki (separacija produkta), - ravnanje z odpadki / odpadnimi vodami.

Pri bioreaktorjih z imobilizirano biomaso se reaktorske konfiguracije in kapacitete razlikujejo še glede na lastnost same imobilizirane snovi (lastnosti katalitske komponente; lastnost imobilizacijskega matriksa; velikost, odpornost, aktivnost delcev ...) ter lastnosti transportnega upora.

Večina reaktorjev lahko deluje v šaržnem, pol-šaržnem ali pretočnem načinu. Industrijski reaktorji so tlačne posode (večinoma do 3 atm), opremljene z lino za opazovanje procesa in sondami za spremljanje pH vrednosti, temperature in raztopljenega kisika. Ustrezno mešanje reaktorske vsebine zagotavljajo mešala, nameščena na vrha ali dnu reaktorja.

V industrijskih aplikacijah zasledimo tri osnovne oblike delovanja bioreaktorjev: (i) stacionarno delovanje brez dodatnega prezračevanja vsebine (~70 %, v proizvodnji fermentiranih živil), (ii) stacionarno delovanje s prezračevanjem vsebine (~10 %) in (iii) prezračevanje in mešanje bioreaktorske vsebine (~20 %, kjer je potrebna rast organizmov v procesu).

Bilanco zadrževanja neke komponente v reaktorskem sistemu lahko zapišemo kot:


38

⎥⎥⎥⎥

⎦

⎤

⎢⎢⎢⎢

⎣

⎡

−

⎥⎥⎥⎥

⎦

⎤

⎢⎢⎢⎢

⎣

⎡

+

⎥⎥⎥⎥

⎦

⎤

⎢⎢⎢⎢

⎣

⎡

−

⎥⎥⎥⎥

⎦

⎤

⎢⎢⎢⎢

⎣

⎡

=

⎥⎥⎥⎥

⎦

⎤

⎢⎢⎢⎢

⎣

⎡

sistemuvkomponente

aporabljanjhitrost

sistemuvkomponentenastajanjahitrost

sistemaizkomponenteodvajanjahitrost

sistemuvkomponentedovajanjahitrost

sistemuvkomponente

eakumulacijhitrost

[14]

Za komponente v mešalnem reaktorju torej velja:

reakcijehitrostrsistemaaprostorninV

pretokFkomponentetejijakoncentracC

VrFCFCdt

VCd

i

jjjj

−−−

−−

+−= 1101 )()()(

)(

[15]

7.4.1 Šaržni reaktor s popolnim premešanjem (batch‐stirred‐tank reactor)

Mešalni reaktor je najpogosteje uporabljen reaktor v industriji. Obratuje lahko v šaržnem (Qvtok=0, Qiztok=0), pol-šaržnem (Qvtok>0, Qiztok=0) ali v pretočnem (Qvtok>0, Qiztok>0) režimu.

Šaržni reaktor s popolnim premešanjem (Slika 20) ponuja preprosto osnovno opremo in enostavno zagotavljanje aseptičnosti v proizvodnjah manjšega obsega.

Slabosti sta zamudnost delovnih postopkov med šaržami (praznitev, čiščenje, polnitev) in zahtevno vodenje procesa med potekom, zaradi nestacionarnih pogojev in spreminjanja okolja med procesom (Pavko, 1996).

Za šaržni mešalni reaktor s konstantnim volumnom se enačba 15 poenostavi:

jj r

dtdC

= [16]

Hitrost reakcije (rj) ima pozitiven predznak v primeru nastajanja (sinteza produktov, rast celic) in je negativna v primeru izginevanja (poraba reaktantov) j-te komponente v sistemu. V procesu katalize je hitrost reakcije navadno odvisna od količine katalizatorja (mc):

Vmr

dtdC cjmj ,= [17]

Z integracijo enačbe 16 nato izračunamo potrebni zadrževalni čas (τ):

j

jCj

Cj rdC

0∫=τ [18]

Zadrževalni čas je odvisen od tipa reakcije in se razlikuje za npr. reakcijo, ki poteka po Michaelis-Mentenovi krivulji, reakcijo z inhibitornimi produkti in avtokatalitsko reakcijo (Ullman's Biotechnology ..., 2007)).


39

Slika 20: Šaržni in pol‐šaržni reaktor s popolnim premešanjem

Šaržnem režimu, kjer med samim procesom v reaktor dodajamo substrat oz. reaktante (Slika 20), pravimo šaržno obratovanje z napajanjem (semi-batch reactor). Glede na volumen je ta proces nestacionaren, vendar se v procesu zaradi sprotne pretvorbe lahko vzpostavi kvazistacionarno stanje substrata/reaktantov. Ta način obratovanja omogoča nadzor procesa s primerno izbiro pretoka in koncentracije vnosa limitnega faktorja v sistem. V bioprocesih lahko po sterilni izpraznitvi ohranimo del medija, ki ga uporabimo za ponovno napajanje. Pri neustreznih mešalnih izvedbah prihaja pri visokih koncentracijah substrata/reaktantov v reaktorju do različnih koncentracijskih predelov (Pavko, 1996).

7.4.2 Kontinuirani reaktor s popolnim premešanjem (continious stirred‐tank reactor, CSTR)

Kontinuirani mešalni reaktor (Slika 21) obratuje z neprekinjenim pretokom medija skozi reaktor. Na ta način ob konstantni prostornini reakcijske mešanice in koncentracije vhodnega substrata v reaktorju dosežemo stacionarno stanje.

Slika 21: CSTR in kontinuirani reaktor z reciklom

Pri stalnih pogojih lahko iz enačbo 15 izrazimo zadrževalni čas komponente v CSTR sistemu:

1

10

j

jj

rCC −

=τ [19]

Z reciklom biomase (biomass recycle reactor) v kontinuiranem postopku gojenja dosežemo večjo stabilnost sistema. V kontaktnem postopku iz reaktorskega iztoka v zunanjem usedalniku pridobivamo aktivno biomaso za povratno bogatenje reaktorske vsebine (Slika 21). Na ta način v reaktorju nekajkrat povečamo koncentracijo aktivne biomase. V praski se postopek uporablja za čiščenje odpadnih voda z izredno nizkimi vsebnostmi organske snovi oz .sušine.

7.4.3 Cevni reaktor (plug‐flow tubular reactor)

V idealnih pogojih je v reaktorju z vzdolžnim tokom (Slika 22) v prečnem prerezu enako stanje, kot v šaržnem reaktorju s popolnim premešanjem. V tem primeru, ko j-ta komponenta

CSTR z reciklom

Qvtok Qiztok

CSTR

vodna faza

Qvtok Qiztok

usedalnik Qrecikel

Qiztok'

šaržni reaktor pol‐šaržni reaktor

vodna faza

Qvtok


40

potuje s tokom in se pri tem vzdolžno ne disperzira, prav tako velja enačba 15. Takšno laminarno gibanje predstavimo s prispodobo nevidnega čepa, ki potuje s tokom (plug-flow).

V primeru neidealnega toka fluida za opis mešanja uporabljamo model disperzno-čepastega toka (Levec in Pintar, 2009). Večinoma se odklon čepastega toka se demonstrira glede na obliko porazdelitvene funkcije zadrževalnih časov. Pri simetrični porazdelitvi poleg čepastega toka upoštevamo še molekularno in turbilnetno difuzijo (eddy diffusion). Zaradi tovrstne longitudinalne disperzije je hitrost prenosa snovi mnogo večja kot ob odsotnosti tega pojava.

Slika 22: Cevni in pol‐cevni reaktor

Sklenjen oz. zaključen cevni reaktor (semi-plug flow) je kombinacija cevnega in popolnoma premešanega reaktorja z neprekinjenim pretokom (Slika 22). Glede na razmerje krožnega pretoka proti pretoku vtoka in iztoka določimo prevladujoče karakteristike (ožje razmerje - cevni sistem, širše razmerje - CSTR).

Širše razmerje pretokov dodatno stabilizira sistem (vačja puferska kapaciteta sistema, boljša odpornost na sunkovite spremembe obremenitve). Zato se v čistilnih napravah, ki obratujejo v sklenjenem režimu, učinkovitost čiščenja ob deževju bistveno zmanjša (krajši zadrževalni čas, izplakovanje biomase, slabša kinetika, slabše usedanje).

7.4.4 Reaktorji z nasutim ali strnjenim slojem (packed‐bed reactors, fixed‐bed raectors)

Večino kontinuiranih industrijskih aplikacij heterogenih katalizatorjev spada v skupino cevnih reaktorjev z nasutim ali strnjenim slojem (Slika 23). Reaktor z nasutim slojem je v celoti napolnjen s polnilom iz katalitskih zrn. V reaktorju s strnjenim slojem so zrna združena / vgrajena v eno ali več prečno predelnih pregrad, ki so nameščene v enakomernih presledkih vzdolž cevnega reaktorja.

Zaradi sprotne pretvorbe reagentov, se pri prehajanju reaktorja ustvarijo koncentracijski gradienti reaktanta in produkta vzdolž reaktorske strukture in znotraj samih katalitskih struktur.

Reaktor s strnjenim slojem se pogosto uporablja za dvofazno katalitsko reakcijo. Če je v sistemu prisotna še kapljevinasta faza, tak reaktor imenujemo kapalni reaktor (plin-trdna snov).

Kapalni reaktor (trickle bed reactor) je večfazni reaktor, v katerega uvajamo kapljevino na vrhu reaktorja, nato pa ta pronica navzdol skozi nasuti / strnjen sloj, plin, ki ga uvajamo v reaktor na spodnji strani, pa potuje navzgor (Slika 23). Takšne naprave se večinoma uporabljajo v petrokemični industriji in pri čiščenju industrijskih odpadnih vod z oksidacijo.

sklenjen cevni reaktor

Qvtok

Qiztok

cevni reaktor

Qtok

Qkrožni tok


41

Slika 23: Primer postavitve reaktorjev z nasutim in strnjenim slojem ter kapalnega reaktorja

7.4.5 Reaktorji z vstopnim curkom zraka (airlift pressure cycle reactors)

Reaktorji z mešanjem s curkom vstopnega zraka so uporabni predvsem v aerobnih procesih z intenzivno dinamiko. Reaktorsko vsebino mešamo z uvajanjem plina v tekočo fazo s pomočjo dinamičnih ali statičnih prezračevalnikov. Statični prezračevalniki (šobe, perforirane in porozne plošče, ...) zrak med uvajanjem v raztopino le razpršijo, medtem ko dinamični prezračevalniki (injektorji, Venturinijeve in odbojne šobe, ...) omogočajo sočasno uvajanje plinaste in tekoče faze v reaktor (Berovič, 1996).

Kolona z mehurčki (Slika 24) je tipični predstavnik reaktorja z mešanjem s vstopnim curkom zraka. To je izredno vitek stolpni rektor z razmerjem premera proti višino od 1:3 do 1:15.

Reaktorji z lebdečim slojem (fluidized bed reactors) so stolpni rektorji, v katerih vzdržujemo razširjen sloj trdnih katalitski delcev (Slika 24). S curkom vstopnega zraka in tekočine dosežemo zadrževanje trdnih katalitskih delcev v lebdečem položaju.

Slika 24: Primer dveh reaktorjev z vstopnim curkom zraka

ter reaktorja z obtočno črpalko (od leve proti desni)

Ustrezno hitrost vtoka določimo glede na gostoto tekočine in velikost delcev. Učinkovitost pretvorbe je obratno sorazmerna velikosti reaktorja, zato so laboratorijske različice tovrstnih reaktorjev pogosto opremljene z reciklom. Visok pretok tekočine omogoča hiter transport substrata in produktov iz imobiliziranih katalitskih komponent (Berovič, 1996).

nasuti sloj

strnjeni slojkapalni reaktor

Qtok tekočine

Qtok plina

QiztokQvtok

Qtekočina

Qplin

kolona z mehurčki

Qtekočina

Qplin

lebdeči sloj biomase mešanje z reakcijskim curkom


42

Reaktorji z lebdečim slojem se večinoma uporabljajo v procesih, kjer je potrebna rast celic. Aplikacije vključujejo rabo v čistilnih postopkih odpadnih voda in v proizvodnji kisa (Najafpour, 2007).

Reaktorji z obtočno črpalko (loop reactors) kot način mešanja in prezračevanja uporabljajo kroženje same procesne brozge (Slika 24).

7.4.6 Membranski reaktorji

Membranski reaktorji so reaktorji, pri katerih zadržujemo katalitsko komponento v reakcijski raztopini z membransko separacijo (Slika 25). Perfuzijski reaktorji izkoriščajo membransko pregrado za pomnoževanje produkcijske biomase, medtem ko dializni rektorji odvajajo toksične produkte in nizko molekularne inhibitorje. (Vasić-Rački in Berovič, 1996).

Slika 25: Primer imobilizacije aktivne biomase z membransko pregrado

Razvoj membran je omogočil njihovo integracijo v številne tipe reaktorjev, zato lahko tipe membranskih reaktorjev razdelimo glede na številne kriterije (Ullmann's Biotechnology ..., 2007):

- vrsta membrane (ultrafiltracijska, mikrofiltracijska, dializna, pervaporacijaska, ...), - število različnih membran, - prepustnost (za substrat / produkt), - oblika membrane (ploščata, cilindrična, votla, spiralna, monolitna, lamelna, ...), - gonilo transporta skozi membrano (pritisk / koncentracijski gradient), - število tekočih faz, - vrsta katalizatorja (heterogeni katalizatorji, encimi, celice), - način imobilizacije katalizatorja (v raztopini / v membrani), - sterilnost.

7.4.7 Mikro in nano reaktorske perspektive

Z razvojem novih materialov in novih ter natančnejših tehnik obdelave materialov postaja v aplikacijah vedno bolj pomembna uporaba mikroreaktorjev. Katalitski mikroreaktorji se uveljavljajo v izdelavi analitskih čipov (t.i. laboratorij na čipu, lab-on-chip), zdravniških pripomočkov (npr. srčnih spodbujevalcev, prenosnih dializnih modulov ipd.) in proizvodnji energentov (metan, biodiesel, ter ostalih kemikalij. Še posebno zanimiva aplikacija je uporaba mikroreaktorjev za izdelavo nanodelcev (Jovanovič, 2009).

Zaradi izredno majhnih razdalj, ki jih morajo premagati reaktanti v reakcijski mešanici, da dosežejo katalitsko aktivno mesto, ti sistemi praktično niso omejeni z uporom transporta in imajo

Qiztok

Qvtok


43

veliko razmerje med volumnom in površino (105-106 m2/m3). Zaradi večje učinkovitosti same pretvorbe (Slika 26), dosegamo z 10-100krat manjšimi reaktorskimi volumni in 5-50krat manjšo maso ostale strojne opreme identične proizvodne kapacitete kot v konvencionalnih proizvodnih procesih. Omogočena sta tudi učinkovita rabe energije (enostavna namestitev toplotnih izmenjevalcev ipd.) in večinoma enostavnejši separacijski postopek.

Slika 26: Faktor učinkovitosti glede na različne oblike in velikosti katalizatorja (po Levenspiel, 1998) [Thielov modul (φ) je razmerje med osnovno hitrostjo reakcije v odsotnosti transportnega upora

in med hitrostjo difuzije skozi delec]

Pri prehodu na proizvodni nivo pri mikroreaktorjih ne govorimo več o povečevanju obsega proizvodnje (upscalling), temveč kar s pomnoževanjem (vzporedno/zaporedno vezavo) mikroreaktorskih modulov dosežemo želeno proizvodno kapaciteto (numbering-up).

Obstoječa tehnologija omogoča design reaktorjev še nižje od mikro-metričnih velikosti. Raziskave samo-organizirajočih nano-reaktorjev postavljajo nove izzive področju reakcijskega inženirstva. Vriezema in sodelavci (2005) so opravili obširen pregled uporabe nano-reaktorskih struktur, v katerem so opisali tudi njihov potencial na področjih vseh predstavljenih katalitskih sistemov.

8 ZAKLJUČEK

Osnovni pregled načinov priprave heterogenih katalizatorjev, heterogenizacije homogenih katalizatorjev in imobilizacije biokatalitskih komponent razkrije nekaj osnovnih principov zadrževanja katalitske komponente v reakcijskem okolju:

1. »imobilizacija« brez nosilnega materiala (filtracija),

2. imobilizacija na pripravljen nosilni material,

3. imobilizacija med sintezo nosilnega materiala,

4. imobilizacija z nadzorovano sintezo katalizatorja / rastjo celic.

Pri tem je učinkovitost imobilizacije odvisna od tehnike imobilizacije, vrste nosilnega materiala, koncentracije katalitske komponente in reakcijskih pogojev med imobilizacijo in aplikacijo imobiliziranega materiala (vrednost pH, temperatura, vrsta reaktorja, kinetika). Odpirajo se številna nova področja imobilizacije, ki se morajo soočiti še z izgubo katalitske selektivnosti in/ali aktivnosti, preden bo možen prenos teh sistemov v prakso.


44

Uspešnost aplikacije izbrane imobilizacijske tehnike je odvisna od cene in kvalitete komercialno dostopne katalitske komponente, stroškov same imobilizacije, učinkovitosti sistema, investicijskega kapitala ter stroškov čiščenja (Laskin, 1985).

Kapaciteto proizvodnega sistema oz. samo reaktorsko prostornino določimo na podlagi aktivnosti katalizatorja oz. koncentracije imobiliziranih aktivnih mest. Pomembna je tudi kvaliteta katalizatorja. Neredko v laboratoriju razpolagamo s čistimi katalizatorji, ki so komercialno dostopni v raznih oblikah čistosti, od česar je odvisna tudi njihova cena. Na ceno katalitske komponente vpliva še njena stabilnost med skladiščenjem in med delovanjem, ter sposobnost obnavljanja imobiliziranega katalizatorja. Ponovna uporaba nosilnega materiala je nujno potrebna za komercialno uspešno aplikacijo. Ta predpostavka seveda ne velja v primeru, ko nosilni material predstavljajo same celice.

Stroški izvedbe imobilizacije so odvisni od potrebnega delovnega obsega in potrebnih kemikalij in so večji za bolj zapletene postopke. Katalizatorji, ki so imobilizirani s pomočjo kovalentnih vezi so manj izpostavljeni izpiranju iz matriksa, vendar pa je njihova priprava dražja od adsorpcijskih metod.

Stroški investicije so v večji meri pogojeni s stroški izdelave reaktorske posode, opreme za avtomatizacijo procesa in nosilnega materiala za imobilizacijo. Dolgoročno predstavlja znesek investicije na enoto proizvoda manjši delež stroškov proizvodnje. V primeru, da neka obstoječa tehnologija že proizvaja podoben proizvod, so investicijski stroški še posebno pomembni.

Obstoječe aplikacije imobiliziranih sistemov vključujejo rabo v analitiki (v diagnostiki, senzorjih stanja okolja, laboratorijskih čipih ...), terapevtski medicini (senzorji za klinične študije, dostava zdravilnih učinkovin), proizvodnji kemikalij in kemičnih izdelkov (naftni derivati; etanol, fruktozni sirupi, aminokisline, ocetna kislina, aspartam, ...) in v čistilnih tehnologijah (proizvodnja bioplina, nitrifikacija & denitrifikacija, čiščenje izpušnih plinov).

Z vzporednim razvojem designa umetnih celic in mikro-reaktorjev ter samo-organizirajočih nano-reaktorskih struktur, lahko pričakujemo, da bodo imobilizirani sistemi v prihodnosti posegli na marsikatero področje našega življenja.

9 VIRI

Arechederra R., Minteer S.D. 2008. Organelle-based biofuel cells: Immobilized mitochondria on carbon paper electrodes. Electrochimica Acta, 53, 23: 6698-6703

Baricelli P., Morfes G., Páez D.E.. 2001. Synthesis, characterization and catalytic activity of the water-soluble tungsten complex [W(CO)3(MeCN)(TPPMS)2], TPPMS=(C6H5)2P(m-C6H4SO3Na)•2H2O: the unprecedented transformation of the complex into a hybrid (homogeneous/heterogeneous) catalyst precursor during two-phase catalytic hydrogenation upon changes in reaction conditions. Journal of Molecular Catalysis, A: Chemical, 176, 1-2: 1-10

Barteling S.J., Vreeswijk J. 1991. Developments in foot-and-mouth disease vaccines. Vaccine, 9, 2: 75-88

Bayer E.A., Belaich J.P., Shoham Y., Lamed R. 2004. The cellulosomes: multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides. Annual Review of Microbiology; 58: 521-54.

Berovič M. 1996. Bioreaktorji za aerobne procese. V: Biotehnologija. Osnovna znanja. Raspor P. (ur.). Ljubljana, Bia: 437-458.

Bhardwaj R., Pan R.L., Gross E.L. 1981. Solar energy conversion by chloroplast photoelectrochemical cells. Nature 289: 396 - 398

Bond C.G. 1987. Heterogeneous Catalysis: Principles and Applications, 2nd ed. New York, Oxford University Press: 176 str.

Bowker M. 2008. The Basis and Appliactions of Heterogeneous Catalysts. Reprint. Oxford, Oxford University Press: 92 str.


45

Breaker R.R. 2002. Engineered allosteric ribozymes as biosensor components. Current Opinion in Biotechnology, 13, 1: 31-39

Bruun L., Koch C., Jakobsen M.H., Aamand J. 2000. New monoclonal antibody for the sensitive detection of hydroxy-s-triazines in water by enzyme-linked immunosorbent assay. Analytica Chimica Acta, 423, 2: 205-213

Bucke C. 1983. Immobilized Cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B 300: 369-389

Buchholz K., Kasche V., Bornscheuer U.T. 2005. Biocatalysts and Enzyme Technology. Weinheim, Willey-VCH: 447 str.

Chakrabarty D.K., Viswanathan B. 2009. Heterogeneous Catalysis. Kent, New Age Science, 315 str.

Chen Y., Kang E.T., Neoh K.G., Tan K.L. 2000. Covalent immobilization of invertase onto the surface-modified polyaniline from graft copolymerization with acrylic acid. European Polymer Journal, 36, 10: 2095-2103

Chiola V., Ritsko J.E., Venderpool C.D. 1971. Processes for producing low-bulk density silica. US patent 3556725

Corma A. 1995. Inorganic Solid Acids and Their Use in Acid-Catalyzed Hydrocarbon Reactions. Chemical Reviews, 95, 3: 559-614

Corma A. 1997. From Microporous to Mesoporous Molecular Sieve Materials and Their Use in Catalysis. Chemical Raviews, 97, 6: 2373–2420

Corma A., Garcia H. 2004. Supramolecular Host-Guest Systems in Zeolites Prepared by Ship-in-a-Bottle Synthesis. European Journal of Inorganic Chemistry, 2004, 6: 1143-1164

Cubillos Lobo J.A. 2005. Heterogeneous asymmetric epoxidation of cis-ethyl cinnamte over Jacobsen’s catalyst immobilized in inorganic porous materials. Doctoral dissertation. Aachen, Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen, 144 str.

De Vos D.E., Dams M., Sels B.F., Jacobs P.A. 2002. Ordered Mesoporous and Microporous Molecular Sieves Functionalized with Transition Metal Complexes as Catalysts for Selective Organic Transformations. Chemical Reviews, 102, 10: 3615–3640

Deinhardt F., Jilg W. 1986 Vaccines against hepatitis. Annales de l'Institut Pasteur. Virologie, 137: 79-95

Demain A.L., Vaishnav P. 2009. Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms. Biotechnology Advances, 27, 3: 297-306

Fett W.F., Cooke P.H. 2005. A survey of native microbial aggregates on alfalfa,clover and mung bean sprout cotyledons for thickness as determined by confocal scanning laser microscopy, Food Microbiology, 22, 2-3: 253-259

Fernández-Lafuente R., Rodríguez V., Mateo C., Fernández-Lafuente G., Arminsen P., Sabuquillo P., Guisán J.M. 1999. Stabilization of enzymes (D-amino acid oxidase) against hydrogen peroxide via immobilization and post-immobilization techniques. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 7: 173–179

Filoche S., Wong L., Sissons C.H. 2010. Oral Biofilms: Emerging Concepts in Microbial Ecology. Journal of Dental Research; 89: 8-18

Garcia-Ochoa F.F., Gomez E. 2004. Theoretical prediction of gas–liquid mass transfer coefficient, specific area and hold-up in sparged stirred tanks. Chemical Engineering Science, 59: 2489-2501

Gordon C.M. 2001. New developments in catalysis using ionic liquids. Applied Catalysis A: General, 222, 1-2: 101-117

Hagen J. 2006. Industrial catalysis : A practical approach. 2nd, completely revised and extended ed. Weinheim : Wiley-VCH: 507 str.

Hanson C.V., Nishiyama Y., Paul S. 2005. Catalytic antibodies and their applications. Current Opinion in Biotechnology, 16, 6: 631-636

van Heerbeek R. Kamer P.C.J., van Leeuwen P.W.N.M., Reek J.N.H. 2002. Dendrimers as Support for Recoverable Catalysts and Reagents. Chemical Reviews, 102, 10: 3717–3756

Ho F., Li S.Y., Lin S.C., Hsu W.H. 2004. Integrated enzyme purification and immobilization processes with immobilized metal affinity adsorbents. Process Biochemistry, 39, 11: 1573-1581

Hoffmann R.1998. Döbereiner's Lighter. American Scientist, 86, 4: 326


46

Horváth I.T., Rábai J. 1994. Facile Catalyst Separation Without Water: Fluorous Biphase Hydroformylation of Olefins. Science, 266, 5182: 72 – 75

Hu Y. Du Y., Yang J., Tang Y. Li J. Wang X. 2007. Self-aggregation and antibacterial activity of N-acylated chitosan. Polymer, 48, 11: 3098-3106

Hua L., Sun Z.H., Zheng P., Xu Y. Biocatalytic resolution of -pantolactone by glutaraldehyde cross-linked cells of Fusarium moniliforme CGMCC 0536. Enzyme and Microbial Technology, 35, 2-3: 161-166

Jain K.K. 2006. Nanoparticles as targeting ligands. Trends in Biotechnology, 24, 4:143-145

Jäschke A. 2001. Artificial ribozymes and deoxyribozymes. Current Opinion in Structural Biology, 11, 3: 321-326

JCBN. Enzyme Nomenclature. Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN). London, School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary University of London (01. jan. 2010). http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/ (12. jan. 2010).

Jovanovič G. 2009. Microtecnology – One likely future of chemical processes. Predavanje v okviru doktorskega študija Kemijska znanost, 16.12.2009, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo.

Kirstein D. 1996. Chelate Mediated Immobilization Of Proteins. Advances in Molecular and Cell Biology, 15, 1: 247-256

Klemet I., Lütjens H., Knochel P. 1997. Transition Metal Catalyzed Oxidations in Perfluorinated Solvents. Angewandte Chemie International Edition in English, 36, 13: 1454-1456

Koch D., Leitner W. 1998. Rhodium-Catalyzed Hydroformylation in Supercritical Carbon Dioxide. Journal of the American Chemical Society, 120, 51: 13398-13404

Kwan E.E. 2005. Factors affecting the relative efficiency of general acid catalysis. Journal of Chemical Education, 82, 7:1026-1030

Laskin A.I. 1985. Enzymes and Immobilized Cells in Biotechnology. Menlo Park, The Benjamin/Cummings Publishing Company: 317 str.

Lee C.H., Lin T.S., Mou C.Y. 2009. Mesoporous materials for encapsulating enzymes. Nano Today, 4: 165-179

Levec J., Pintar A. 2008. Analiza in načrtovanje kemijskih reaktorjev. Uvod v reakcijsko inženirstvo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo. 20 str.

Levec J., Pintar A. 2009. Analiza in načrtovanje kemijskih reaktorjev. Reaktorji z neidealnim tokom fluida. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo. 43 str.

Levenspiel O. 1998. Chemical Reaction Engineering, 3rd Edition. , Willey-VCH: 688 str.

Lewis C.A.Jr.; Wolfenden R. 2008. Uroporphyrinogen decarboxylation as a benchmark for the catalytic proficiency of enzymes. PNAS 105/45: 17328-17333

Lilley D.M.J. 2005. Structure, folding and mechanisms of ribozymes. Current Opinion in Structural Biology, 15, 3: 313-323

Linder M., Teeri T.T. 1997. The roles and function of cellulose-binding domains. Journal of Biotechnology, 57, 1-3: 15-28

Marinšek-Logar R. 1999. Imobilizacija v anaerobnih čistilnih tehnologijah (študijsko gradivo za predmet Varstvo okolja v živinoreji). Domžale, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko, Inštitut za mikrobiologijo in mikrobno biotehnologijo: 18 str.

McGovern P.E. 2004. Fermented beverages of pre- and proto-historic China. PNAS 101/51: 17593-17598

McGovern P.E. 2009. Homo Imbibens. V: Uncorking The Past. The quest for Wine, Beer, and other Alcoholic Beverages- McGovern. P.E. Berkeley, University of California Press: 1-27

Mehnert C.P. 2005. Supported Ionic Liquid Catalysis. Chemistry - A European Journal, 11, 1: 50-56

Michaelis L., Menten M.L. 1913. Die Kinetik der Invertinwirkung. Biochemische Zeitschrift, 49: 333

Mosbach, K.; Mosbach, R.. 1996. Entrapment of Enzymes and Microorganisms in Synthetic Cross-linked Polymers and their Application in Column Techniques. Acta Chemica Scandinavica, 20: 2807-2810

Moo-Young M. 1988. Bioreactor immobilized enzymes and cells: fundamentals and applications. Essex, Elsevier Applied Science Publishers: 327 str.


47

Mouret G., Mozet K., Muhr H., Plasari E., Martin M. 2009. Production of Al2O3–TiO2 catalyst supports with controlled properties using a co-precipitation process. Powder Technology, 190, 1-2: 84-88

Murzin D.Y. 2005. On surface heterogeneity and catalytic kinetics. Industrial Engineering and Chemistry Research, 44, 6: 1688-1697

Müller J., Niemeyer C.M. 2008. DNA-directed assembly of artificial multienzyme complexes. Biochemical and Biophysical Research Communications, 377, 1: 62-67

Murua A., Portero A., Orive G., Hernández R.M., de Castro M., Pedraz J.L. 2008. Cell microencapsulation technology: Towards clinical application. Journal of Controlled Release, 132, 2: 76-83

Najafpour, G. D. 2007- Biochemical engineering and biotechnology, 1st ed. Amsterdam, Elsevier, 421 str.

Nekrep F.V. 1996. Bakterije in Arheje. V: Biotehnologija. Osnovna znanja. Raspor P. (ur.). Ljubljana, Bia: 15-49

Nelson J.M., Griffin E.G. 1916. Adsorption of Invertase. Journal of the American Chemical Society, 39: 1109-1115

Noritomi H., Sasanuma A., Kato S., Nagahama K. 2007. Catalytic properties of cross-linked enzyme crystals in organic media, Biochemical Engineering Journal, 33, 3: 228-231

Olivier-Bourbigou H., Magna L., Morvan D. 2010. Ionic liquids and catalysis: Recent progress from knowledge to applications. Applied Catalysis A: General, 373, 1-2: 1-56

Palmer, T., Bonner, P.L.R. 2007. Enzymes : biochemistry, biotechnology and clinical chemistry, 2nd ed. Chichester : Horwood: 416 str.

Pavko A. 1996. Masne balance in načini vodenja bioprocesov. V: Biotehnologija. Osnovna znanja. Raspor P. (ur.). Ljubljana, Bia: 425-435.

Pechini M.P. 1967. Method of preparing lead and alkaline earth titanates and niobates and coating method using the same to form a capacitor. US patent 3330697.

Peters J.M., Franke W.W., Kleinschmidt J.A. 1994. "Distinct 19 S and 20 S subcomplexes of the 26 S proteasome and their distribution in the nucleus and the cytoplasm". Journal of Biological Chemistry, 269, 10: 7709-7718

Raney M. 1940. Catalysts From Alloys. Industrial and Engineering Chemistry, 32, 9: 1199-1203

Rios G.M., Belleville M.P., Paolucci D., Sanchez J. 2004. Progress in enzymatic membrane reactors – a review. Journal of Membrane Science, 242, 1-2: 189-196

Rodnina M.V. 2007. Beringer M., Wintermeyer W. How ribosomes make peptide bonds. Trends in Biochemical Sciences, 32, 1: 20-26

Rothenberg G. 2008. Catalysis. Concepts and Green Applications. Weinheim, Willey-VCH: 279 str.

Santen R.A., Van Leuwen P.W.N.M., Moulijn J.A. Averill B.A. 2000. Catalysis: An Integrated Approach Series. 2nd ed. Amsterdam, Elsevier Science B.V.: 582 str.

Scott C.D. 1987. Immobilized cells: a review of recent literature. Enzyme and Microbial Technology, 9, 2: 66-72

Sellin M.F., Webb P.B., Cole-Hamilton D.J. 2001. Continuous flow homogeneous catalysis: hydroformylation of alkenes in supercritical fluid–ionic liquid biphasic mixtures. Chemical Communications: 781-782

Serralheiro M. L. M., Prazeres D. M. F., Cabral J. M. S. 1999. Continuous production and simultaneous precipitation of a dipeptide in a reversed micellar membrane reactor. Enzyme and Microbial Technology, 24, 8-9: 507-513

Takimoto C.H., Calvo E. 2008. Principles of Oncologic Pharmacotherapy. V: Pazdur R., Wagman L.D., Camphausen K.A., Hoskins W.J. Cancer Management: A Multidisciplinary Approach, 11. ed., CMP Healthcare Media LLC: Chapter 3: 1-9

The Nobel Prize in Chemistry 1989. Stockholm, The Nobel Foundation. http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1989/ (20. dec. 2009).

Ullmann’s Biotechnology and Biochemical Engineering. Volume 1 & 2. 2007. Weinheim, Willey-VCH: 855 str.

Vasić-Rački D., Berovič M. 1996. Integrirani bioreaktorji. V: Biotehnologija. Osnovna znanja. Raspor P. (ur.). Ljubljana, Bia: 551-567.

Vriezema D.M., Comellas Aragone`s M., Elemans J.A.A.W., Cornelissen J.J.L.M., Rowan A.E., Nolte R.J.M. Self-assembled nanoreactors. Chemical Reviews, 105, 4: 1445–1490

Walker J. M., Rapley R. 2009. Molecular Biology and Biotechnology. 5th ed. Cambridge, RSC: 604 str.


48

Welton T. 2004. Ionic liquids in catalysis. Coordination Chemistry Reviews 248 (2004) 2459–2477

Wood B.J.B. 1998. Microbiology of Fermented Foods. Volume 1. 2nd ed. London, Thomson Science: 440 str.

Zheng X., Jiang J., Liu X., Jin Z. 1998. Thermoregulated phase transfer ligands and catalysis. III. Aqueous/organic two-phase hydroformylation of higher olefins by thermoregulated phase-transfer catalysis. Catalysis Today, 44: 175-182

Zhu H., Ding Y., Yin H., Yan L., Xiong J., Lu Y., Luo H., Lin L. 2003. Supported rhodium and supported aqueous-phase catalyst, and supported rhodium catalyst modified with water-soluble TPPTS ligands. Applied Catalysis, A: General, 245: 111-117

Yu X., Acehan D., Ménétret J.F., Booth C.R., Ludtke S.J., Riedl S.J., Shi Y., Wang X., Akey C.W. 2005. A Structure of the Human Apoptosome at 12.8 Å Resolution Provides Insights into This Cell Death Platform, Structure, 13, 11:1725-1735

osojnikg_2009_imobilizacija

Documents