Title 混合ビタミン剤並びに食品中のビタミンDの定量法に関する研究( Dissertation_全文 )

Author(s) 足立, 昌子

Citation 京都大学

Issue Date 1979-11-24

URL https://doi.org/10.14989/doctor.r4002

Right

Type Thesis or Dissertation

Textversion author

Kyoto University

主

論文

　　　　　　　　　　　　　へ　　　　　　　　　　　愚愚

　　　　　　　　　　　モ　ゑマ　ヂ　　　　　　　　　　　　にニゴ

混合ビタミン剤並びに食品中の

ビタミンDの定量法に関する研究

目 次

「マニll：：豊」

第1章

第2章

　2．1

　　2．1．1

　　　2．1．1．1

　　　2．1。1．2

　　　2．1．1，3

　　　2．1．1．4

　　　2．1．1．5

　　2．1．2

　　　2．1．2．1

　　　2．1．2．2

　　2．1，3

　　2．1．4

ビタミンD定量法の現況とその問題点一一一・…一一………一・圃……………’…’層…一……

ガスクロマトグラフィーによるビタミンDの定量…一’……’……’圏……’…一一……’

　　市販混合ビタミン剤中のビタミンD2の定量　一………・一一・・一…一……………

2．2

　2．2．1

　2．2．2

　2．2．3

　2．2．4

2．3

　2．3．1

　2．3．2

　2．3．3

2．4

　2．4．1

　2．4．2

　2．4．3

2．5 小

　通常の混合ビタミン剤一………一……・・一……一…一曲…一一一……一一…一一…一・

　検量線・一…………一…一……・一…一・一…・一一…・・一…・一・・……・幽隅…一…．一＿

　けん化の条件の検討……一一…一……・一・…………・…・…一一・一一……・……一・・一・

　TLCの条件の検討…一…一…一一………一…一…一一…・一…一一一…一…・一・…一一…一一

　標準D2，A並びにEの混合物申におけるD2の定量結果…∴…………一・

　市販混合ビタミン剤申のD2の定量値　　…………一……・一一一一……・一…一…・10

　ビタミンEを多量に含む混合ビタミン剤　　一……一…一一一・…一・…一…一……一一11

　標準D2，E混合物申におけるD2の定量結果　…一…一一一一…一……一一一一12

　市販混合ビタミン剤中のD2の定量値　一一…一…一・……一…一………一・・…・13

　比色法との比較検討結果　…・一一・・一……一・…一…一……一…一・…一一・…一・…一…　13

　保存試験の結果…一一…一…一…一…・一一一………・一…一・一一…・一一…………一・…・14

マグロ肝油並びにビタミンD3樹脂房中のビタミンD3の定量　一一・……一一一16

　D並びに内部標準物質のガスクロマトグラフィー…一一…一…一…一一一・一……一17

　検量線　一一一一一一一圏一一一一一一脚一一一一一一一一一一一『一一一一一一一一一一一一一一一・一一一一一一一一一一一・一一一一一一・一一一圃一一一一一一一一　17

　マグ．ロ肝油のガスクロマトグラフィーによるD3の定量　一…一一…一・…一…・・17

　D3樹脂油のガスクロマトグラフィーによるD3の定量　一…一…一一一…20

照射乾燥酵母中のビタミンD2の定量　一…一……………一………・・一…一・……　21

　検量線・……一……一一・・一一…一……一・一一・一…一…・……一一…・一・一・圃…………・21

　照射乾燥酵母のガスクロマトグラフィーによるD2の定量　　…一……・・一21

　照射紫外線量とD2の生成量との関係　　一・・…・一・一…一一…・……・…一…一22

照射シイタケ申のビタミンD2の定量　………・……・…一一一一一……・……一・一24

　照射シイタケのガスクロマトグラフィーによるD2の定量　　…・一……一一…　24

　照射紫外線量とD2の生成量との関係　　……一一一…一…一…・…一・…・・………26

　シイタケ中のD2含量　…・…・…・…一一…一・・……・・…一・・…・・…一……一・……26

　　括一…一…一…一……・一…。一一…・一…一・一一一……・…噂……一一圃・圃…………・一一27

1

6

6

7

7

7

8

8

第3章　高速液体クロマトグラフィーによるビタミンDの定量　……”……’一…’…’…一…

　3，1　　　　市販混合ビタミン剤中のビタミンD2の定量　…一一一……一・一一…一一……………

　　3．1．1　　　通常の混合ビタミン剤’…一一・…・…一…一…・一一一・……一…一・一…・…一一……一一…

　3，1．1．1

　3．1．1．2

　3．1。1．3

3．1．2

　3．1．2．1

　3，1。2．2

　3．2

　　3．2．1

　　3．2．2

　　3．2．3

　3、3

　　S．3．1

　　3．3．2

　3，4

　　3．4．1

　　3．4．2

　3．5．

　　3，5．1

　　3．5．2

　　3．5．3

　　3，5．4

　　3．5．5

　3．6

第4章

　検量線…卿幽昌…’冒’……9一曹………騨・…・一・…一一…………一一…一一…一一……一

　市販混合ビタミン剤の高速液体クロマトグラフィーによるD2の定量　…・

　GLC法との比較’…………”…幽・一一・一・・一一一…一……一・一一…………一＿＿．．

　ビタミンEを多量に含む混合ビタミン剤　　…一一…・一一・……一一・…一一……・

　市販混合ビタミン剤の高速液体クロマトグラフィーによるD2の定量　…一

　GLC法との比較一………………一胴……………一…一一一・……一一…一一…一一一・

マグロ肝油並び1ζビタミンD3の定量…………一……・一・………・………一・・

　マグロ肝油の高速液体クロマトグラフィーによるD3の定量・…一一…一・一一…

　D3樹脂油の高速液体クロマトグラフィーによるD3の定量・…一…一・……

　G弛C法との比較　…………一………r・一・・…・一…一一…一一・……一・…・……一一

照射乾燥酵母中のビタミンD2の定量…’國…國…幽’……’…一…一…一・一・…一一一一一

　照射乾燥酵母の高速液体クロマトグラフィーによ多D2の定量…一…一一…

　GLC法との比較’”……一’……・一一一……一一・・一…一一…一・一…………一一…一一・一

照射シイタケ中のビタミンD2の定量…一……………一……・一…………一・一

　照射シイタケの高速液体クロマトグラフィーによるD2の定量一…一…一…

　G上C法との比較…”…………一一・一……・一…一…一・…一一・一一一……………・一

牛乳並びに母乳中のビタミンDの定量…”………’…一一……・一…一…・一…一一一

　牛乳中のD3の定量’…’”…………墨’……………’…圏………’”…’…『一’一

　母乳中のDの定量…’’’’”……’…璽囎…’……”’……弓一ロ……一…’…一…一一一・

　UV照射1ζよるD3生成量の検討　　’………一…一一一…一…一・一一一・・一…・…・一一一一

　GC．一MS分析による牛乳中のD3の確認…・…一……一…一一一………一一…一

　D硫酸エステルについての検討‘………“’…’…”……”…暫…’圏’一一…’一・

小 括’……’∵ロ…’…’”……一一…’……一・一…・一一…・………圃一・…一一……一

29

29

29

29

30

30

31

31

33

33

33

34

35

36

36

37

37

37

38

39

39

41

42

42

42

43

　　　ガスクロマトグラフィー並びに高速液体クロマトグラフィーによるプロビタミンD

　　　の定量…’…’……’…’一’……『…’……”用……一一…………一一…一一一一…………一・一…　　45

4．1　　　乾燥酵母中のエルゴステロールの定量　　一……一…・…一一一……一一…一…一…　　45

　4．1．1　　検量『線　……一…一・一…一一…・…一一・一一…一一一一一一…一・一……一・一…・一一・…一…一…　45

　4．1．2　　　無照射乾燥酵母のガスクロマトグラフィーによるエルゴステロールの定量一一46

4．1。3

　　4．1．4

　4．2

　　4．2．1

　　4，2．2

　4．3

　　4．3．1

　　4．3．2

　4．4

第5章総

謝　　1辞

　無照射乾燥酵母の高速液体クロマトグラフィーによるエルゴステロール

　の定量　　………・一………一…’……’…一”【嗣’圃…’……’………”……層…”

　G■C法との比較・………・・……一・…一一…一…・…一一……，…一……＿．．．

シイタケ中のエルゴステロールの定量一…一・……一・・…一・一一一・一・一…………一一一・一

　シイタケのガスクロマトグラフィーによるエルゴステロールの定量…一一…

　シイタケの高速液体クロマトグラフィーによるエルゴスデ面一ルの定量一一．

牛乳中のプロビタミンDの定量一………・一…一一・…一一一・……一……一…一……一

　牛乳の高速液体クロマトグラフィーによるプロDの定量…一一…一幽…・…・一．

　GC－MS分析による牛乳申の7－DHCの確認……一一…一．……一・一．．一

小括＿＿＿＿＿．一＿一＿一＿一．．一一＿幽＿一一＿．＿一＿一＿＿一一．．＿＿一＿一．．

　括…・’…圏…一……一一…一………一……・一一一……・……一…一一……………・

実験の部一……・一一一・…一…一一一……一一……一一一一…一……・…一・…・…・・一一…・一一一一…一一…・一

霞2章に関する実験…’…”………一”噌

第3章に関する実験……”……’…’”‘

第4章に関する実験…一……一’……一一

文献…一’一一・…………・……・一一

用．”圏圏一 @■一璽．　ロー騨■帰．幽一　■唄卿嗣髄一．鴨　騨冒■冨顧圏一甲　幽，一■辱”唇圏　一99巳聖■暫一　■厘一，一胴騨一　隣．圏巳

一，　■　一一胴　■■冒■　閑　■一一　圃■一一　讐■幽■　圃一■雫　唖曜一■“　9■　一　瞥騨■　菖　■昌瞭巳　圃覇■　●　■量層巳　■　■髄　一　唖一一一　一【罹曽

■　一　一　”　一　■　”　■　一　．　．　一一■　．　9　■　「　 ■　9　圏　雫　「　■　■　巳　 圃　の　■　．讐　一　騨　■　一　圏　騨　■　■　■　鯛　■　r　■　■　冒　r　■　■　一　一　圏　一　購　圃　脚　騨　團　■　．　一　一

．一．一一一』

D一．．一．．一．一一．一．一＿．．．．．．一．一．．一．．一．．一．一．．．．．．一．．一．一．．一．．一『

47

47

49

49

50

50

51

53

53

55

59

60

60

65

69

72

第1章　ビタミンD定量法の現況とその問題点

　ビタミンD（以下Dと略す。）は抗くる病成分で，搬にはプロビタミンD（プロD）の紫外線

照射によって得られる。プロDは；Fig．1に示すような5．7一ジ手ンステ白一ルの骨格を有し，紫

外線照射によって9，．10位間での開環が起こり，プレビタミンD（プレD）に変わる。このさいル

　　　Fig・1　　．　UV　i・・adi・ti・n．・f　p・。一D、

。。　忽1．

　PrQvitamin　D

HOノ

1

R

CH2

Vitamin　D

R

Toxistero1 　　　　．含．　　　　　H’

HO．　　ミ＼

　　Lu皿istero1

7

眠

OH

R

T註¢hystero1

R

D2系IR呂

D4系IR＝

D6系＝R紹

D3系＝R昌

D5系3R昌

Dブ系：R冒

一1…

ミステロール，タチステロール，トキシステロールなどが副生する。プレDよりDへの異性化反応

は光によらず，溶液状態での単なる加熱で起こり，この反応は可逆反応である。Fig．1に示すよ

うな光および熱異性化反応は，5．7一ジエンステロールであれば側鎖構造が異っていても同様に起

こり，同様の反応成績体を与える。生成したD型の化合物の抗くる病活性には側鎖構造が関与する

ために，プロDおよびプレDとして定義されるものの数は少ない。現在までにFig．1に示すよう

にプロD2～D7がプロDとして認められておりそれぞれの紫外線照射によってD2～D7が得られて

いる。しかしこれらのうち高い生物活性を示すものはD2とD3のみであり，その他は実用的にはほ

とんど顧みられていない。なおプロDではプロD2，プロD3といった名称よりもエルゴズテロール

（ERG），7一デヒド白コレステロール（7－DHC）の方が一般化されているのでそれらを使

用すること． ﾉした。

　D2とD3は哺乳類に対してはほぼ同等の生物効力を示すが，鳥類に対してはD3のみが有効であ

り，D2はD3の1／10以下の画くる病効力を示すにすぎない。そこでDの生物効力単位はD3を標

準物質とし，D3の0．025．μgに相当する潮力をrI．U．とすると1949年にWH　Oで定められて

いる。前述のようにプロDの冷時UV照射溶液中に最初に生成するプレDは単なる加熱操作でDに

異性化される。一方Dの溶液を加熱した時もプレDが生成し，両者閲d）反応は可逆的な熱異性化反

応であり，プレD自Dの平衡状態に到達するまで異性化は進行する。この反応速度は温度のみに依

存し．・溶媒の種類・光・触媒などには影響されない。このようにDが加熱によって一部が容易にプ

レDに変わるという性質は，Dの定量において重大な問題である。なぜなら，ある試料中にDとプ

レDがある含量比で存在していたとしても・この比は試料の保存中に徐々に変化するであろうし，

また定量操作において必要不可欠のけん化操作によっても変化してしまうからである。

　　　　　　　　　　　　　1）　　　　　　　　　　　　　　はDのみの定量値を“ac七ロalD値”そしてDとプレDの定量値K：everling　BuiSmanら

の合計を　“potenもi激D値”ζ定義し，　actualD値を定量することは上記の理由で困難であ

り，プレD自身の生物効力は低いが，体内でDに転換する可能性もあるので，DとプレDの合計値

であるpotentialD値を定量することが試料中のDを評価するための最善の策ではないかと提

案している。著者もこの提案に同調し・以下・広義のDであるpotenUalDを求めることにし

た。

　薬品及び食品中のDを定量することは製剤学の面からも，またDの栄養，代謝の研究や，国民の

栄養状態を調査するなど保健衛生の見地からも非常に重要なことである。DはビタミンA（A）と

ともに最も古くから知られた脂溶性ビタミンの1っであり，この両者は水溶性ビタミンのB1，→B2，

C，ナイアシンとともに栄養学的に最重要なビタミンと考えられてきた。D．以外の5つのビタミン

は比較的・早くから理化学的定量法が開発されたのに対して・Dに関しては，かなり多くの人々の

＿2一

努力があったにもかかわらず，容易に成功せず，最近まで動物試験法．によることが多かった。動物

試験法では飼育，飼料にむつかしい条件があるばかりでなく，試験期間が長期にわた．る（ネズミで

は，1ケ月以上，ヒナの場合でも3週間を要する。）という欠点があり簡便ではない。1960年に

な。てUSP2hうやく動物試灘の代りに，N・。1d呈飯応（試料を靴。。チ、レを含む三塩

化アンチモンとクロロホルムまたは塩化エチレン溶液中で反応させる。）を利用する比色定量法が

採用されるようにな。た．Ni。ld呈色試薬㌔Dの艶試薬のうちで実用的鞭用されて、、る唯

一のものである。しかしながらA・ステロール等も同様に呈色するためにこれら妨害物の除去を完

全にする必要がある・M・lderら4）・上田ら句は各々・段階のカラ…詠グ・・，一で精製、

後，比色法により混合ビタミン剤中のpを定量している。著者もこれらの定量法を追試検討したが，

日常使用するには操作が非常に煩雑である。このように混合ビタミン剤，食品等に含まれるDを理

化学的な方法で迅速且つ正確に定量することの困難な理由として，Dの生物効力が非常に高く（1

μ9＝401・U・ヒトの所要量は幼児の場合が最大で1日4001．U．），そのため1と常1と微量定量が要

求されることや，Dの定量に利用できるような特異反応が発見きれ．ないために妨害物質として混在

する多量のA，ビタミンE（E），ステロール等の影響を除かなければならないことがあげられる。

Dの生化学面での最近のめざましい研究の発展とは対照的にDの理化学的定量法の確立の立ちおく

れは大きい。このため栄養学，公衆衛生学，製剤学等における研究の発展がさまたげられてきた。．

その基本となる定量法の確立が強く要望されている背景の中で著者は迅速且つ正確な定量法を確立

することを計画した。

・96・年Ziff。，6）らはG■Cの条件下でDは輔恥起こし，py，。』とi，。pym診の2っ．

のピークを骸ることを罪した．ついでA。i。li7）らはGLα・おいてDは定量的にpy。。一D

と　isopyro－Dになることから，いずれのピークもDの定量に利用できることを歌い出した。　D

を真空単管中または高沸点溶媒の溶液として150。C以上の温度で加熱するとき，9，10位間で

閉環したpγro－Dと　iSopyrO－Dとに異性化される。この反応はプセDを同様の条件で加熱し

ても起こる。（Fig．2）このようにGLCにおいてDとプレDは全く同一挙動で熱闘回して定量

的にpyroつとisopyro－Dに基づくピークを与旧るので，いずれかのピークを利用して定量すれば，　Dとプレ

Dの合計値のpote．n嫉alD値が求められるので便利である。しかし，水素炎イオン化検出器を

用いるGLCはそのDの検出限界が約10ngであり，比較的Dを多く含む混合ビタミン剤などに

は適当であろう。しかし，Dをごく微量しか含まない食品の分析においては，試料採取量が非常に

多くなり，簡単に入手出来る試料の場合には支障ないが，母乳のように入手困難なものめ場合には

この方法は利用できない。そこで感度の面ですぐれている（Dに対して，検出限界は約2ngであ

る。）HPI」Cにも注目し，6丑CとHPLCを用いて検討することにした。

＿3一

Fig。2 Thermal　isomerization　of　D

R

HO。．

耀

1

R

CH2

ム．qH

∠

“

∠

△

HO

＞150。

　3斐l

Pyro－D

Vitmin　D P．re－D HO

R

H・LCを用いたDの趨・・関しτはT・・・・・…♂）（D、樹脂油），　1ら（ゼ・チ

・で被われたAace・。・。とD，馳）月田10）ら（b，難体）H。f，ass’1）ら（D、樹脂油）並

びにTh。mp，。。12）ら（強僻耳L）の鮎があるが，その適用はD含量の非常1，多い髄のもの

　　　H．1

　　“

Isopyro－D

　　　　9）Tomkins

に限られておウ，食品一般に適用される定量法の報告は全くみられない。また栄養学の観点からも

丁般の食品にも巾広く利用出来る定量法を確立することが必要である。そこで著者は本研究を行っ

た。

　著者が研究の対象とした製剤並びに食品をTable1に示した。　Dを含む食品は非常に限定され

ており，いずれもその代表的なものである。また別にプロDのERGを多量に含む植物性食品例え

ば，茸類，酵母もUV照射すればDが生成するので，照射試料を定量の対象に選ぶと共に，これら

の試料中に含まれるプロbの定量についても検討し＃。また，GLC法とHP玉C法とによって得

られた結果を比較いこれまで全く報告されていなかった両者の相関性を明らかにした。

Table　l　　Samples　for也he　deter卑ination　of　vitamin　D　and

　　　　　　pro＿vitamin　D　bアG］」C　and　H：P玉C　methods

Sample Characもeristic

Mul七ivit翫mins　prepa♂窒≠狽奄盾獅刀@I　　　　　　　E／D≦2，500

（Usual　prel）arations）

Multivitamins　preparations且　　　　　　　E／D＞2，500

（Containing　excess　amounts　of　vitaminE）．

＿4一

Tuna liver

Vitamin D3

Dried

Dried

Cow's

yeast

oils

resin

-ishntake

.and

oils

Human m/i1ks

Containing large amounts t tt 'of vitamin D ･ ･. '' ttt ' ' 'UV irradiated product of ' ' '7-dehy,qrocholesterol 1' '

Containing Iarge amounts

' ' 'of ergostero･l .･

tt tt ttContaining large amo'untsof ergoster.ol ,, ･ '. ' ' ' tt t 'g,O".`,?i.n.i:.g. .SMaii amounts

-5-

第2章ガスクロマトグラフィーによるビタミン．　　　　　　Dの定量

2．1．市販混合ビタミン二二のビタミンD2の定量

　一般に混合ビタミン剤に配合されているDはA，．Eとの共存下にある場合が多く，Dに対するA，

：Eの配合量が非常に大きい。現在日：本で市販されている混合ビタミン剤（a～u）中の各々の配合

比を調べて表にまとめた。（Table　2）A／Dでは1．．U．比で2～12．5の範囲にある。　E／Dで

は重量比で10g～2，000の範囲歩ほとんどであるが，例外的に2，500以上が2，3見受けられ

た。GlC法ではFig．3に示すようにpyro－D2もpyro－D3もA，　Eから分離されるので比色

　　　Table　2　R・aIios　of　vitamln　A（1・U・ratio）and　vitaml鉄E（weight　ratlo）to　vitamln

　　　　　　　　Din　c・㎜erci・1　m曲i・itami・prep・・ati・ns・n・ale　iρJ・pa・．

ト麗三鼎α調，・。）（　　　EIDweight　ratio）贈贈α塩気、。）（。，、齪。、、。）

a

b

C

d

皇

f

ghi

j

k

5

10

10

10

10

12510』

12．5

5

10

10

100

120

160

200

400

400

500

500

600

1

mPO

P

q．

．r

S

t

u

2

エ0

5

10

12．5

10

10

10．．

5

10

　800　8001，000

1，000

1，000

1，200

1，600

2，000

5，000

13，333

法におけるような完全な妨害物の除去操作を行う必要はないが，A，　Eの量が多くなると妨害を受

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　13）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　らは試料の不けん化物をHClで処理けるので，ある程度妨害物の除去を行う必要があるp月田

してAの大部分をanhydro－Aに変えたのち・TLCで妨害物を除去し，次いでG　L　Cを行う方法

を報告しているが，標準品についての検討にとどまり，その実際面への応用は全く行っていない。．

H。㎜。，14）らは2段階のカラム知マトグラ。，rHCによ三三後i9。一Dに異性化し，

G玉C法で製剤中のDの定量を行っているが，非常に操作が煩雑である。このように混合ビタミン

剤中のDの定量：にG］コC法を適用した報告は数少なく，しかもそれらは，非常に煩雑な前処理操作

とかなりの時問を要し簡便な方法とは言いがたい。そこで，著者はより簡便な前処理方法を検討し

た結果，吸着剤にKieselglGF254，展開溶媒にn一ヘキサン・酢酸エチル（4：1）を用い

一6一

Fig．3

Gasch・・m・t・g・a皿・・fD2・D3・AandE

富

）霧

8脅

£

50

0

50

0

50

0

py「o

、

Pひ

ｶ、

O－D　　　2

堰E・py・・一D3

Uisopyro－D

SA

d1 一民塑tgc・pheτ・1SA．ｫ．

ピret‡nQ1

SA．

ｫ．

0 20　　　　　　40　　　　　　60

Retention　time　（mi．n〕

たTLCによって，HCl処理などの操作を行うことなくA，E等の妨害物を簡単に除去出来ること

を確認した。なお，日本で販売されている混合ビタミン剤はすべてDとしてp2を含んでいる。

2．1．1　通常の混合ビタミン剤

　定量操作法の概略はけん化及び不けん化物の分離→TLC→GLCである。以下定量法を確立す

るに至るまでの基本的な検討事項から順に述べる。

2．1．1．1　検量線

　標準D2　10，20，40，60，80，100μg／彫‘とSA50μg／彿6を含むアセトン溶液を第2章

に関する実験の定量：操作法の1）の③（P62）に設定した条件でG5Cに適用したところ，　Fig．

4に示す検量線が得られた。このようにD2は熱望環をおこし，一定条件下では定量的にpyro－

D2とisopyro－D2になる。生成したpyro－D2とisopyro－D2の比率は，1．7：1で血yro這D2

の方が大きいので定量は．pyro－D2の『「クを用いることにした。

2．1．1．2　けん化の条件の検討

　標準D2（8，0001U），　A　pa1皿itate（55，0001U）と：E（60π野）の混合物を作り・けん化

条件の検討を行。た・搬化剤を加えないでけん化を行ゆ、碇量したところ・Eの分醐・由

一7一

Fig．4 Calibration　curves　of　D2　by　GI・C

1．0

2慧

　．0。5．＄

慧

鶯．

£．．

．0

P著「ｱD・

isOPγ「o｝D客

0 　　　　　1．O

w・ight　rati・．（D2／sA）

2．0

来するピーク炉pyrO－D2のピークを妨害した。（Fi．g．5（1））そこで抗酸化剤を種々検討した結

果，20％ピロガロー）レ・．エタノール溶液が最も有効であることがわかった。（Kg．5（皿））

2．1．1．3　TLCの条件の検討

　T■Cの条件を精査し，．吸着剤にK：ieselgelGF254，．展開溶媒にn一．ヘキサン・酢酸エチル

（4：1）を使用すれば・A・E等の妨害物を簡単に除去できることを確認した。Fig．6にこの

条件下でめ標準D，A，　E混合物の不けん化物の薄層クロマトグラムを示す。実線は明確に確認出

来たスポット．であり，点線はうすいスポッ．トである。

2．1．1．4　標準D2，A並びにEの混合物中におけるD2の定量結果

　D2（8，000．IU）・A　palmitate（55，0001U）とE（6脾2）の混合物につき第2章

に関する実験の定量操作法の1）（P61）に従い操作を行いD2の回収率を求めたところTable　3

に示すように満足な結果が得られた。従って前述の検量線は前処理操作を行わないものであるが，

前処理操作による補正は行わず，そのまま使用しても支障はないと考えた。又，Table　4に示す

ようにA／DがIU比で104以下，E／Dが重：量比で2，500以下であるなら，A，Eの混在は上

記のTLCによる前処理操作を用硫た定量を妨害しなかった。日本で市販されている大部分の混合

9ビタミン剤のA／D．及びE．／Dは前記の制限を大きく下回っているので，本法は通常の混合ビタミ

ン剤に対してならば広く一一般的な定量法として使用可能であるb例外的にE／Dが2，500を超え

る混合ビタミ．ン剤も2，3見受けられたが，このような場合でも丁丑Cの前にMulder4）らのPT

A（PhOSphate－treated　alumi．na）カラムクロマトグラフィーを行えばEとD影響を除去でき

一8一

Fig. 5

F ig.

t-'N

d"

Uoen

gonu)･oct

6

Rf

1,O

Th

50

o

50

o

50

o

Gas chromatograms of model preparations

(1) ,J

s

J

･

,

Standard･ pyr :i:-D2 'isopyro-D2 SA,

o,

in- layer

20 ･･ 40 ･ Retention time

chromatograms of

60Cmin) .

a model preparation.

O,5

o

X'::.h.

tt t t / t .-...-.,..--..-....-.....-.-'h･s--.--------t--.-.---L----"---.--t-:---i--:tb:---e-F:;::::---- :-::::;S"

C== ====)s:-'-"-':･'･':-:'-:::"-:'･-'･-'- :':-'::---"

-------------- :･-･: ==----::::::> --･h------･l.----.. --- ---------- Sb - -- t' ---- i---S=- .--.......-.-.-.-.--.-...--".."i-...-..-.-.-.--....."-..-..-"K......-..--."".'."'...-......

< === == =>

(1) (2)

(l)

(2)

Reference solution for TLC (D2fpre-D2)

The unsaponifiable matters of a model

prepGratlon made by mixlng D2(eoOOIU).

A palmltate(55000IU) and E(6emg) ' ･ ' tt ' ' ' ' ' tt ･ ･-9- ･'

ることも確認．した。これについては次項で述べる。

　　　Table　3　　　　　R㏄overy　of　vitamin　D2　in　a　model　pfeparation．

Tria1vitamin　D2

Added．　value（1．U．）　Estimated　value（1．U．）

R㏄overy　（％）

1

2

3

4

8，000

8，000

8，000

81060

8，056

7，736

8，008

7，752

100．7

96．7

100．1

96．9

M士SD 98．6±L8　　「　　Note：The．　model　prepa士ation切as　madc　by　mixing　vltamin　D2．（8，0001．U．），　A　palmitate

（55・000LUI　and　E（60　mg）・

了able　4　1n且ue魏ces　of　vitamin　A　and　E　on　the　detcrmina吐lon　of　vi亡amin　D2．

V量tamh1．D2　（1．u．）

　AID（1・U・胆tio）

　　EID（Weight　ratio）

Rccovery　（％）

8，000

8，000

6，000

8，000

8，000

8，000

8，000

41．7

104．2

208．3

1，000

2，500

5，000

10，0qo

　99．4

　95．8i量npossiblβ

　955　96．8impossible

impossible

　　Note：The　model　preparations　we∫e　made　by　mixing　vi1amin　p2（8，0001．U．）．　and　vltamm

Apa正mitate　or　E

2。1．1．5　市販混．合ビタミン剤中のD2の定量値

　市販混合ビタミン剤（試料孤1～5）を薬局より購入直後，第2章に関する実験の定量操作法の

1）（p61）に従い繰り返しD2を定量した。　Fig．7に定量した際のガスクロマトグラムを示した。

いずれの場合にも妨害物による影響を受けることなく定量可能であった。定量値をTable　5に示

した。いずれにおいても定量値間のバラツキは少なく良好な結果が得られた。バラツキを動物試験

法と比較すると，勤試験法では変動係数は、・．・％15）であるのに対い瀦の厳では・．・％で

あった。

　　　Table　5　　Vitamin　D2　con七e且t．　in　co皿meτcia1

　　　　　　　　．「　　　　　　　　　multivitamin　preparations　　　　　　　　，

Sample viもam．in　D2　conten七

Indicated 46，0f　　　　Foun“昂ssay　（M±SD）

一10一

庵1

躍6．2

庵3

ガ6．4

．46．5

2501U／tabr

4001U／．cap。．

2QOIU／tab．

400．IU／3もab．　　　　　　　　　　　！

2501U／6・p．

4

5

5．

4

4

266±　4

404±　9

206±17

4乞2±．25

304±．10．

Fig・7・

　　　Gas． chro皿atQgra皿s

　50．

（卵．

）Φ

切

。

傷の．

ゆ

郎

　0

50

　0

．50

0．

5．0

　0

50

．0

50

0

・fc・皿merci・1．加1tivit・min．prepara℃‡・hs

Saｹ1？、．↓ 　　　　　　　　　　　　↓．ｫ　　　　　　　　」　　「

no．2．　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　’@　　　　　　　↓．　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　．↓　　　　　　　　　　　↓．

no．3．@　　　　　　　↓　　　　　　↓．

@　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　、

no．4．@　　　　　　　↓．　　　　　↓1　　　　　　　　　　　↓

no．5．

@　　　　　　　↓

@　　　　　　　　　　↓．

↓　　　　　　　　　　隔

Standard@　　　　　　　　　　「o－D2　　S亀．　　　　　　　　　Pご　　　　　　　　　　　　i匙。Dy「o－D2

0 2．0　　　　　40　　　　　　60　　RetentiOn　time　〔m．in）

2．1．2　．ビタミンEを多可に含む混合ビタミン剤

・定量操作法の概略はけん化及び不けん化物の分離→？ho．spha七er．もrea．tψd alu血ina．（PTA．）

一11一

カラムクロノマトグラフィー→TLC→G五Cである。

2．1．2．1　標準D2，E混合物中におけるD2の定量結果

D・（80001U）とE酪・・・・・…と細・吻混舗につき第・章・・関する実験の趨操

作法の2）（P63）縦・…の回収率を求めた・． E・g．8（1）はDl（，。。。、U）、。、，。。吻の

憎憎につき舗の混合ビ・・、ン剤の場合・同様の操作法を行。た結果であ・．，，，。．D，の。一

クは媚を受けて趨不可能であら＃・Fig．・α）は上記混一につきPTAヵラ。ク。マトグ。

フ・一（P63）を翻・酷果である・丁丁1ま除去きれ趨可能とな。た．二値を，。bl，

61こ示した・酵共叩収率はほ・・…％に近く・結果は満足すべきものであ。た．

Fig．8

50

0

　50富

冨畏

且　o．8

缶　50

0

G・・．・h・・皿・t。gram・・h・d・1　P・ep3rati6耳，

（1〕　　　　↓　　　　↓

〔11）．　　↓　　　　　↓

Standa「d　p夢・一D、　　S～　　　　　　　　　　　　　響　　　　　　　　　　　　　■sopy「・一D2

@　　　　　　　　　　　・0 20　　　　　　40　　　　　　60

　Retention　ti珊e　（min〕

TabIe　6 Recovery　of　vitamln　D2　in　model　preparations．

　Modelpr舜paratlon

Vitamin　D2

Tria1 Added　value　　　A．　ssayedl

　（1．U．）　　value（1」Uゆ

Recovery　（％）

No．工

（EID＝5，000）

1

28，000

8，000

7，936

7，968

99．2

．99．6

Mean 7，952 99．4

No．2（E／D＝10，000）

1

2

8，000

8，000

7，913

7，800

98．9

98．5

Mean 7，857 98．7

　　Note：The　modcl　preparations　No　s．1　and　2　were　made　by　mixing　8，0001．U．

（0．2mg）of　vitam｛n　D2　with　1，000　and　2，000　mg　of　vitamin　E（4陸一tocopheryl

acetate），　respectively．

一12一

2．1．2．2 市販混合ビタミン剤申のD2の定量値

市販飴ビタミン剤試聯につき通常曜合・．…剤に翻・れ・攣作法（，・、）。行っ

塒のガスクロマトグラムを・・g・9（1）に示・た・騨品の場合と同様にpy，。一D，の・一，は妨

害を受け趨不可能であ・π・． E・g・9①は上記試料に？き・・Aカラ…マ・グ。。，一の操

作を加え暢合である・媚物は除去され・趨可能とな。た。・。bl。7・，示。た趨廊バラ

ツキは小さく，良好な結果が得られた。

Fig．9

富冨旨

＆

8

Gas　ch・…t・gra皿・．・f…merci・1。。1ti。it。mi。．

P「epa「ation　（Sample　no　p6）

50

O

（1〕

@　　　　㌧．

↓．

↓↓

50〔11）

↓・

↓

↓

0

50 StandardPソ奪。一D2　　　　●

1駅py「o璽D2

．．S

0

0　　　　　　　20 4．0 60RetentiOn　time　（min）

Table　7 　　Viもamin　D2　con七ent　in　a　commercial

m・1もi・it・mi・p・ep…ti・n・・nt・ining。XCeSS。皿。Unも，

of　viもamin　E

S呂皿PleVitamin　D2　content

IHdic＆ted　　癒・of・　　　Fouhd　　　　　　　assaア　　（M±SD）

」6．64001U／cap 5 422±15

2．1．3　比色法との比較検討結果

GLC法においては通常の混合・タミ・剤の場合（P6・）旧い操作しD、を回した．比色

一13一

　　　　　　　　　　4）　　　　　　　　　　　ら盗従い操作した。Table　8に各々の結果を示した。両法による定量値法においてはMulder

はほぼ近似しており，このこと．は確立したGLC法による定量法が混合ビタミン剤中のDの定量に

十分利角できることを示して．いる。

Table　8　　　　Dete㎜ination　of　vitamin　D8　in　multlvitamin　powders　and

　　　　　　oiIy　solu重ions　by　both　GLC　and　colorimetric　methods．

Sa恥ple

Indicated　value

of　vitamin　D3　q・u・ノ9）

　LAssayed、value　of　vitamin　D3

By　GLC　method・　By　colorimeIric　　（1．u．19）　　　　method（1．u．19）

Samや1e　no．　7

Sample　no．8　．

Sample　no．9．．

Samp！e　no．10

Sample　no．11

Sample　no．12

Sample駐。．13．

Sample　no．14

4，000

4，000

4，000

4，000

401000

40，000

40，000

40，000

4，040’

4，496

4，004

3，720

39，960

4孕，360

40，600

41，880

3，924

5，176

3，goo

3，732

39，500

45，080

40，420

42，200

2．1．4　保存試験の結果

　室温まオこは虐待条件下で長期に保存されて多量のD，A等の分解物を含む混合ビタミン剤の場合

にも確立したGLC法による定量法が適用できるかどうかにっき検討を行った。試料駈1，2及び

6をそれぞれ購入時の容器に入れたまま密封し，暗所で室温または400Cの恒温槽中に保存した。

室温保存のものは約12ケ月後にまた400C保存のものは1，2，3，6，9，12ケ月後の適当

な時期k試料の一部を取り出してD2を定量した。なお・試料妬．1・2については参考までに第8改

正日本薬局方のA定量法の第2法に従いAの定量も行った。結果は丁鋤ble　9に示すとおりである。

また保存開始時の定量値を100％とした時のD2の残存率はFig．10に示すとおりである。試料

躍6。1，2及び6の40。C，12ケ月保存後の残存率はそれぞれ49．6・44．7及び64．4％であり・

室温12ケ月保存後のそれらは72．6・78．2及び78．5％であった。各試料のガスクロマトグラム

はFig．11に示すように，試料が同一である限り保存条件または保存期間にかかわらず大差はなく・

特にpyro－D2のピークを妨害するようなピークの出現はいずれの場合1とも認めら．れなかった。

＿14一

Table.9 Assayed Valuespreparations hfter

of vitamin

stprage .at

D2 and A in commercial

room temperature or 40℃

multivitamin

Condition

of

storage

AsshYed value (iv!tab. or cap.)

Sample No. 1.l

Sample No, 2 Sample No. 6

D2 A (f) D2 A (f) D2

inltial

40℃, 1 month

4･,2 ip

4,3 e･ e,6 e 4,9 e 4 ,12 4 ' 'RT*,12 e

270

242.

224

210

208

134

196'

2,970

2,940

2,850

2,650

2,030

2,780

(O.97)

(O.97)

(O.87)

(O.81)

(O.66)

(O.83)

412

34&

260

240

226

184

332

2,650

'2,590 ' '2,190

1,960

'

1,820

2,510

(O.94)

(O.91)

(O.76)

(O.73)

(O.7Q)

(O.79)

410

ss8

290

264

322

* RT=roo!n temperature

Fig. 10 Residual ratepreparations

of vitamin D2

after storage

in

a.t

corrunercial mtiltivitamin

room temperature or 400C

100

Aep 80Usg 6o=co

.-

= 40-tuEoe-t 20

o

Sample no

;oom

.1

temperatures 100

80

Sapaple

roorp

no.2tseMPerature

t･J,t

400c 6e

40

20

o

12OStorage

3

period

4o"c

69( month ) 12

loe

80

'60

40

zo

e

Sample no.6' !OOrns",temperature

140'c

o･ 3 6 9 3 6 9 12

-l 5-

Fig．11Gas　chromatograms　of　comlnercial　multivitamin

preparatlons

富〕霧

ぎ

房

£

50

0

50

0

50

0

No．．1

Pnitia1

　　◎

S0　，12m

py

､1幸叫ザ　

12month

20　　　　　40　　　　　　60

Retention　time　（min）

2．2　マグロ肝油重びにビタミンD3樹脂油中のビタミンD3の定量．

　天然物中におけるDの産出は非常に限定されている。その申で唯一の豊富な資源は魚の肝油であ

　　　　　1．6）　　　　　　らはタラの肝油中のDの定量をGLC法により行っている。試料の不けん化物をメタる。Bell

ノール冷却，ジギトニン沈殿法並びに2段階のカラムクロマトグラフィーで精製後，三塩化アンチ

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　14）モン試薬によりiso－Dに異性化しTMS化の後G．LCを適用している。別にHo㎜es　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　らも

ジギトニン沈殿法，2段階のカラムクロマトグラフィー，TLCにより精製し，　iSo－Dに異性化

の後GLC法でタラの肝油中のDめ定量を行っているが，両法共に非常に操作が煩雑でφる。　D3

樹脂油は7－DHCのUV照射物より7－DHCの大部分をメタノールを加えて一20。Cに放置し，

更にタチステロールを無水マレイン酸付加反応で除いたのち，濃縮したものをいい，市販油溶液は

これを植物油などで適当に濃度を希釈したものであり，医薬品や飼料の原料として使用されている。

マグロ肝油では混合ビタミン剤の場合と異なり，定量に際しステロールによる妨害を．受けたのでジ

ギトニン・セライトカラムクロマトグラフィーでステロールの大部分を除去することにした。しか

しながら，これだけの前処理操作では不十分で，未知物質がpyro－D3のピークを妨害し定量可

能とはならなかった。そこで未知物質を除去するためにいろいろな前処理操作を試みたが，満足す

べき結果が得られず，TMS化することによりはじめて定量可能となった。一方D3樹脂油に対し

ては植物油中のステロールを除去するためにマグロ肝油の場合と同様にジギトニン・セライトカラ

一16一

ムクロマトグラフィーを使用し，UV照射した試料尽ので田MS化の操作を行うことにした。

2．2．1　D並びに内部標準物質のガスクロマトグラフィー

　D2，D3及びそれらのTMS体とCholesteryl　ace七a七e（CA），S七igmas七eryl

呂ce七ate（SA）のGLCの二時時間並びにCAに対する各々の相対保時時聞を求めてTable

・・17 ?Eた。齢ビタ・・剤暢合では内部標勒質として，盛恥てきた、・。。ble一、。カ、

らもわかるようにD3系はD2系よりも保時時間が短かく各々のTMS体はTM：．S化していないもの

より更に短かい。このようにD3のTMS．体の場合操作時間を短縮する目的でSAより保時時間の短

いCAを使用することにした。

T・bl・iO　R・t・nti・nもim・・昂nd・el・七i・ρ．・et・n事i・nti血・・

　　　　　　of　vitam耳n　D　and　steryl　acetate

．COmp・und Retell．tion　time

　　　（min）

Relative　rete耳tio孕

　　　1time

D2　　　　　　　　　　　　　　　44．6／54．1

D3　　　　　　　　　　　　　　　38．0／45．7

D2雪MS　ether　　　　　　　　26．0／40．4

D3　TMS　ether　　　　　　♀2．0／34．5

Cholesteryl　aceもate　　　　　59．4

Stigmasteryl　ace捻te　　　90・1

0．マ5／0．91

0．64／0．77

0．44／0．6．8

0．37／0．58

　　1．00

　　1．52．

Note：Vitamin　D　gives　twin　peaks　due七〇pyro－and

　　　　iSopy．ro－D．

2．2。2検量線

　標準D3，50，100，150，200，250μg！砺6とCA　100μg乃4』を含むベンゼン・ピリジン

（95：5）溶液の0．5解6にっき第2章に関する実験の定量操作法の3）の④（P．6．4）に従ってτM

S化後GLCに適用してFig．12に示す検量線が得られた。　このようにTMS化した場合にも熱

閉環をおこし，定量的にpyro－D3　TMSとisopyro－D3　TMSに変化することを利用する定

量に際しては，大きなピークを与えるpyro一．D3　TMSを利用すること．にした。

2．2．3　マグロ肝油のガスクロマトグラフィーによるD3の定量

　Fig．13　はマグロ肝油を第2章に関する実験の定量操作法の3）（P　63）に従っ．て操作したの．

一17一

：Fig．12　Calibraもion　curves　of　vitamlnD3　TMS　eもher　by　GLC

　　華

　　鍾1・5

　　葛2。つ

．判　Σ：

2私1．Oo『、

．2eo盆メ00．58紹に

　　さ

　　占　0　　当　　O　　e　．

py「臣D3TQhe「

　　　＼

1sopyrO－D3T凹S　ether

0．5　　　　1、O　　　　l，5　　　 2，0

　　We19ht「G㌻io（D3／CA！

2．5

ち，G■Cを行った時のガスクロマトグラムである。　Fig．13（1）は試料閃けん化物をそのままG

Lcに適用した結果であり多量に共存するステ．ロール類によりpyro－D3及びisopyro－D3の

ピーク．は妨害を受けて定量不可能であった。Fig．13（H）は試料好けん化物をジギトニン・セライ

トカラムクロマトグラフィー並びにTLCで処理した後，得られたガスクロマトグラム．である。ス

テロール類は除去されたものの，Dと同一挙動をとる未知物質がpアrO－D3のピークを妨害し，定．

量不可能であった。Fig．13（旺）はFig．13（のに更にTMS化の操作を加えた時のガスクロマトグ

ラムである。図からわかるように，．未知物質とpyrO－D3TMS体のピークは分離し，定量可能と

なった。以上の結果に基ブいてマグロ肝油中のD3を定量するためには試料不けん化物をジギトニ

．ン・セライトカラムクロマトグラフィーとTLCを行い，　TMS化の後G．LCに適用する方式を採

用することにした。次に，マグロ肝油1gにつきD3を16，0001U添加し第2章に関する実験の

定量操作法の3）（P63）に従って操作しD3の添加回収実験を行った。　Table　11に示すよう

に回収率は99・5％と良好な結果が得られた。従って・前処理操作を行っていない検量線について

の補正は行わずそのまま使用することにした。またD3の定量値は10，800±1501U／g（M±

SD）で第8改正日本薬局方のA定量法第2法に従い定量したAの値は95，3001U／gであった。

これらの値を山川18）らが報告している値と比較するとDはその範囲内（10，000～45，0001U／

g）であり，Aはやや高めであった。

＿18一

'Fig. 13 Gas ehromatograms of tuna liver oil

50

o

50

o

50ge

v$8g.o O

50

o

,lr,O-D3

cAisio,pyro-D3"'

(111)PYrO.-D3T"ISis"epyro-

p3TMs.Ci

P･Y Igs:3¥l,:,l-D,l],if,li;:g:i,,,..,,cAsxi}:''tt"

o 20

Retention

40

time (min)

60

Table ll Determina.tion apd recovery test of vitamin Ds in a tuna liver eil.

Assaed value of vitarnin･D s a.U.lg)

Trial Without addition･ of Vitamin Ds (a)

16,O()O I.U. ofvitamin Ds added (b)

b-aRcoovery (%) ･

1

2

3

4

10,720

10,920

IO,960

10,600

26,320

26,640

27,Ooo

26,920

15,600

15,720

16,040

16,320

97.5

98.3

1co.3

192.0

Mean±S.D. 10,800±ISO 99.5±1.8

-19-

2．2．4．D3樹脂油のガスクロマトグラフィーによるD3．の定量

　Fig．14はD3樹脂白白のD3の定量法を検討した結果である。　Fig．14　q）は試料不けん化物を

直接TMS化したもののガスクロマトグラムであり，植物ス．テロールによると思われる多くの妨害

がみられた。Fig．14（証）は試料不けん化物をジギトニン・セライトカラムクロマトグラフィーを

行ったのち，TMS化したもののガスクロマトグラムである。ジギトニン試薬でジギトナイドを形

成しないルミステロールや残存するタチステロールに由来するピークがみられ，定量不可能であっ

た。Fig．14⑲は試料不けん化物をジギトニン・セライトカラムクロ．マトグラフィーとTlCを

行．いTMs化したもののガスク．ロマトグラムである。図からわかるようにpyro－D3　TMS体の

こ一クを妨害していたものはT．LCで除去され，定量可能となった。以上の結果に基づいて，　D3

樹脂油中のD3を定量するためには，マグロ肝油の場合と同様の操作法を．採用することにした。次

Fig・14　q・・ch耳qm・t・9・・m．・・fヤit・miの・・e・i皿・i1

50

0

50

　　　Q

　　50藁

霧

88

．畠．　0

50

0

（D

CA　ゆ

qD　py「o翌3T門S．　　　　　CA@　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1解py「o－D3T凹S

（11D @py・・ず3TMS　　　　望　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　i・gpyピ・一D3T凹S

pyro工D3T凹S　　　　CA　　　　　　　　　i・・gy「o凹D3T凹S

0 20　　　　　　　40　　　　　　　　60

Retent10n　tllne　（min）

＿20一

にD3樹脂油16検体中のD3を各々1回ずつ定量した。（Table　12）

Table　　1．2 Determinat董On　of　vita斑in　D3　in　vitamin　D3　resin　oils．

Vitamin　b呂σ．U．ノ9） V至ta田孟nD3（1．U，19）

SampleNo．

Indicatedvalue

Asbayed

val鵬SampleNo． 撫ted櫨9d

1

2

3

4

5

6

78

100，000

100，000

．100，000

100，000

100，000

100，000

fOO，000

100，000

．89，300

91，400

110，300

78，800

92，200

79，600

75，000

83，700

9

10

11

12

13

14

15

16

10・oqo

10，000

10，000

ioρ00

10，000．

10，000

10ρ00

．10，000

10，200

7，960

8，000

．7，960

8，440

8，160

7β60

9，480

23照射乾燥酵母中のビタミゆ・の趨

　乾燥酵母は第9冊子日本薬局方で串accharomycesに属する酵母の野守を乾燥して粉末とした

ものと記載され・常用量1ま・日． T～・・9どな。ている・このものは栄養補給・食欲梅・消化不良・

便秘に対する整腸剤に用いられる。UV照射した酵母中のD2の定量に関しては：Bmchmannlgb

比色法が報告されている。しかし，比色法であるため，妨害物の完全除去の必要性から非常に煩雑

である。乾燥酵母にはErgosもelolが豊富に存在することは古くからよく知られている。一方D

は含まれていないと報告され20λUV照射によ。て初めて生成する．よ。てDの定量はUV照射

したものにつき行った。

2．3．1検量線

　標準D220，40，80，120，160，200μg／麗とSA100μg／笏‘を含むベンゼン・ピリジン

（95：5）溶液の0．5躍6につき第2章に関する実験の定量操作法の3）の④（：P64）に従ってτM

s化の後Ghcに適用してFig．・15．に示す検量線が得られた。　D2の場合と同様にTMs化した場

含も熱閉環をおこしpyro－D2TMSとisopyro－D2　TMSに定量的になる。　定量に際しては

大きなピークを示すpyro－D2　TMSを利用することにした。

2．3．2　照射乾燥酵母のガスクロマトグラフィーによるD2の定量

一21一

Fig．15C・1ibrati・n・・rv・・．・f　D2　TMS・the「by　GLC

　2　更

　お

　§

。望1週目N

貯認鍵盃。5 Wあの　　

㌫瓜　o

　自

　盃

　）0

py「o“D2皿s

Vt㎞「

　　　へ．

is・pyr・’D2TMS

　　　　　　ethef

0 0．4 0．8　　　　1。2　　　　1．6　　　　 2．O

W・ight　rati・（D2／SA）

　乾燥酵母試料庵1を健康線ランプより10c卿離し（照射エネルギー：20E－Vito即製）1時間照

射しτ得た照射乾燥酵母を試料とし・D2の定量条件の検討を行った。．Fig・16（Dは試料不けん化

物を直接TMS化したもののガスクロマトグラムであり，多量に共存するステロール類によりpy■o

－D2及びisopyro－D2のTMS体のピークは妨害されて定量不可能であった。　Fig．16Φ）は試

料不けん化物をジギトニン・セライトカラムクロマトグラフィーを行ったのちTMS化したものの

ガスクロマトグラムである。ステロール類の多くは除去されたが・pyrO－D2のTMS体に重な

る妨害物のピークがあり定量不可能であった。Fig．16（皿）は試料不けん化物にっきTLCを行った

のちTMS化したもののガスクロマトグラムである。図からわかるようにpyrO－p2の里MS体の

ピークを妨害するような化合物はTLCでほとんど除去され定量可能となった。以上の結果に基づ

いて照射乾燥酵母中のD2を定量するためには・試料不けん化物をT：LC処理後，　TMS化いG

LCを行う方式を採用することにした』次に前記で得られた照射乾燥酵母に標準D2を8001U／g

添加し，D2の回収率を求めたところTable　13に示すように，満足すべき結果が得られた。従っ

て前処理操作による補正は必要．でないと判断し，検量線をそのまま使用することにした。

2．3．3　照射紫外線量とD2の生成量との関係

　乾燥酵母試料孤2に健康線ランプの光を20E－VI　ton／1涜のエネルギーで時聞を変えて照射し

三拝操作を行ったものと行わないものにづき第2章に関する実験の定量操作法の4）（P64）に従

一22一

F ig.

ntsR'

woen･=

enanoct

16

50

o

50

o

50

o

50

o

o

GLC behavior of irradiated dried yeastSaponificationTMS

(I)SA-`

SaponificationDl' gitonin-celiteTMS

(li)

SAt:r`:s-:-lts

'¥aLcponificationsATMSqll),7YrOor?l,;IMpySro-2Y/":,TMS:,,tttv

standardPslYr0 7iJT,t:i)ro-D2TMsSiS.1

･v.10 20 30

Retention time ( min

40

)

50

Tab!e 13

Determination and recovery test of vitamin D2 in dried yeast

TrialAssayed value of vitaminD 2 (IU/g)

Added valueWith addition of vitam inD2 (A)

without addition ofvitaminD2 (B) A-B

Reco ve ry

(%)

l

2

3

4

5

800800800800800

1, 8OO ,1,76O1,93O1,8OO1,76O

930 9301,lOO1,OOO . 910

870830830800850

1O8.81O 3.8

1O3.81OO.O1O6.3

M±SD 970±69 1O4.5+3

Note : Thewith

samples ofa Erythemal

dried Yeastultraviolet'

werelamp

irradiated for(2oE-viton/67S )

lhr

-2 3 --

い，D2を定量しその生成量を調べた。その結果Fig．17　に示すように撹拝操作を行った場合に

．は生成量：は15分で最大（6651U／g）に到達し，以後急激に減少した。一方撹拝操作を行わない

場合には1時間で最大（5201U／g）となり，以後漸減した。なおいずれの場合も前者では15

分まで，後者では30分までの照射において照射紫外線量とD2の生成量には比例関係が成立した。

なお無照射時においてD2は検出されなかった。

Fig．17D2　i・d…dyeast・f・・r・rrad・・t・・n〔・・E－V・…／・m2）

600

500

爲≧

巳　400

口N

　　300も

茗

．耳

目

200

100

0

　昌　1．宰

　ll

昌

ヂ1￥

　9　　　　　　　　・ロ　　　　　　　ロ

ξ

1　　、1　　終3　　　　㌦ら

蜜ξ

ぎ

義　　With　Sti。。i。g

Without　Stirring　　　重

0 30　　　　　　　 60　　　　　　　 90　　　　　　 120

　　　1rradiatiOn　tirne　（min）

2．4　照射シイタケ中のビタミンD2の定量

賜。イタ舛のD、の趨に関しては有本ら璽）蘭22）らの比色法が報告きれている．いずれ

の場合もその操作が煩雑である。シイタケ中にかなりの量のErgosもerolが含まれていることは

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　21）占くから知られているがD2は殆んど含まれておらず　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・UV照射によって初めて生成してくる。

従って乾燥酵母の場合と同様にD宴の定量はUV照射したシイタケに適用した。

2．4．1　照射シイタケのガスクロマトグラフィーによるD2の定量

　乾燥シイタケに健康線ランプの光を20E－Viton／読のエネルギーで丁子部に30分間照射し

た後粉末状にしたものについてD2の定量条件の検討を行った。　Fig．18月目は試料不けん化物を直

＿24一

接τMS化したもののガスクロマトグラムであり・多量に共存するステ三一ル類によりpγro－D2

及びisopyro－D2のTMS体のピークは妨害されて定量不可能であった。以降乾燥酵母の場合．

と同様に検討し・照射シイタケ中のD・碇量するためには試料不けん化物教乃C｝・三三TM

S化し，GLCを行う方式を採用することにした。しかし乾燥シイタケを3E－Viton／i痘のエ累

ルギーで，5～30分間程度健康線ランプの光を照射した時に．はD2の生成量が200～8001U／

gと少ないのでGLCでの定量限界以上とするために試料の採取量を多くしたとこち，共存するス

テロール類の絶対量が多くなり・．アセトン・その他の有機溶媒に完全に溶解せず・結晶が析出して

操作が不可能となったので，やむをえずジギトニ．ン・セ．ライトカラムクロマトグラフィーを行って

ステロール類の大部分を除去したのち丁丑Cを適用し，TMS化の後GLCを行うこと1ζした。次

Fig．18　Gas　chromatogr．ams　of　irradiated　drでed　”Shiitake”

男

50

0

50

0

50

0

50

0

Saponification　　　　　番

T図S　　　　　　T凹S－pyro－D2（D S．A．

SaPOnificationDigltOhうn－celiteTMS

TMS－pyro－D2

　（ID ジ“看sopy「o騨D2S．A。

Saponificatioh懸　　〆・・S－py・・一D2

（lID

　　　　　　　　　　病垂S－is・py「・曽D2S．A。

Standard

ξ！T凹S－py・・’D2

ピT図S－isopyro騨D2

S．A．

0 20 　　　　40　　　　　　　　　　　60

RetentてOn．tTme　（　min　）

一25一

に20E－Viton／罐のエネルギーで30分間照射して得た乾燥シイタケに標準D2を1，6001U／9

添加してD2の回収率を求めたところTable　14に示すようにほぼ100％に近い満足すべき結果

が得られた。

．Table　　14　　DclerHl三natb斐〕：md　rec‘｝very　test（，f　vhごLmh．L　D2　h1（lri｛唆［Shhtake

E・tim・t・d・・lue・，f・it・mli・．i）・（1U／9）

Trlal

Addud　vこdueWlth｛idditbm」l　Withl，ut　addill‘」1】v三tI壁min　Dz（A）　・r　vil・［mh1　D2くH）

、A一・・一B

Recし，very

　（％）

1

2．

3

4

5

L600

L600

1，600

1、600・

1，6（X）

2，540

2，81）0

2，730

2，710

2，540

　S70

1，1坦

1，060

1，070

　980

1，670

1，690

L670

L64｛〕

1，560

104．4

・105。6

104．4

102，5

　97．5

M＝上SD 1，02吐85 102，9茸，8，・

Note＝．The　sample（）f　dricd　Shiitake　were　irradiated　for　30聖nln　with　a　Erythcmahdtraviolct　laml⊃（20E－Vit‘｝n／¢m2）．

2．4．2　照射紫外線量とD2の生成量との関係

　乾燥シイタケを20E－Vi七〇n／c涜のエネルギーで時間を変えてUV照射したのち第2章に関す

る実験の定量操作法の5）（p64）に従ってD2を定量いD2生成量を調べた。　Fig．19に示す

ように照射時間の増加と共にD2の生成量は増加して5時聞で最大となり，更に照射を続けたとこ

ろ，D2生成量は漸次減少していった。次に乾燥シイタケの1日の食用量（約2個）からD2の所要

量（4001U／日）を充足するためにはどの程度の照射を行えばよいかを知る目的で，・同じロッ’』ト

の乾燥シイタケを3E－VitOn／編のエネルギーの紫外線で5～30分間照射したのち第2章に関す

る実験の定量操作法の5）（P64）に従ってD2を定量した。　Fig．20に示すように，この実験条

件下では照射紫外線とD2の生成量との聞にはほ岬直線関係が成立し却。1分聞の照射に対するD2

生成量は291ツ9であった・D・の所要量・シイタケの・日常用食用量（約2個）などを考えると・

この条件下では10～15分間の照射を必要とした。

2．4．3　シイタケ申のD2含量’

　和歌山，大分，愛媛，岩手，群馬各県産の乾燥シイタケを無照射時並びに3E－Viton／c擁　で

15分間，20E－Viton／磁で5時商UV照射したものにつきD2を定量したところTable　15

に示す結果を得た。かなりの個体差が認められた。無照射時においてはいずれもD2は含まれてい

なかった・

一26一

Fig，　19　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Fig．　20

　　　　　E・ti・・t・d・a1・e・・f・it・・i・D2　i・d・i・d　llShiit・ke「‘・ft・・va・iou5．times　of　i「「adiati。n

　　　　　with　a　Erythemal　ultraviolet　lamp．

　5000§

：4000

浄30。。

・≡、

窪2。。。

暮

1．｝000

　　0

Irradlation　energy

！

’

～

’

’

’

；’

’

’

，’

’

　　　　　220　E－Viton／c国

　　　　　　　　　　　　　　　　　〆〆曜一…蜘亀 _鴨　ミ

＼ヨ800

　　論。。

　　信

　　ξ400

　　こ

　　ξ2・。．

　　範　　》　　0

0　1　23　4　5　6．7h　　　　　　I￥・radiation　timeO　　　1200　　2400　　3600　　4800　　6000　　7200．　8400

Q蝋・m・f1・・曲t・d・・e・・y（E－V・t一・・ノ・m2＞．

Irr、di、ti。，　e，e，gy　3　E－Vit。・／，m2

6

o

0　5101520．2530min　　　　－Irradiation　timeO　　　 15　　　30　．　　45　　　60　　　75．　　90

〔～uantu飢　of　frradiated　energy　（．E－VitOh．

　　　　　　　　　　　　　。i，／、m2）

Table　15 Assayed　vaiue　of

vl乳・ml・b、　ln　d・ied　Slliit・k。　p，。d。ced

at　d三fferent　P玉aces　after　irrad…ation

with　a　耳rytheynal　ultraviolet　lamp

Assayed　value

Place Vit［・min　D、（田／9）

Witllout　3E－Vit‘レh／20E－Viton

irr・di・lti・n　cm215min／cm25h

WakayamaOlta．

Ehime

Iwate

Gunma

0

0

0

0

0

430．

61t｝

410

290

290

4，800

5，720

6，940

3，48Q

1，610

2．5　小　　　括

GLCを用いてDの定量につき検討し，次のような結論を得た。

　1．GLCを用いて混合ビタミン剤等のDの定量法を確立した。試料によって多少の違いはある

　　が所要時間は3～4時間の範囲にあり，これまでの動物試験法，比色法にくらべかなり簡便と

一27一

　なった。

2．三物試験法並びに比色法では分離不可能であったD2並びにD3をGLCを用いることにより・

分離可能とし，試料中のD2並びにD3の存在状態を明らかにした。

3．D，A等の分解物を多く含む試料でも適用可能であったので，製剤申のDの安定性試験にも

　利用出来ることを明らかにした。

4・著者の検討した範囲での乾燥酵母並びにシイタケ中にはDは含有されていなかった。

一28一

第3章高速液体クロマトグララィ＝による　　　　　　ビタ．ミンDの定量

3．1． s販混合ビタミン平中のビタミンD2の定量

・・m・…g）らはぜ・チ・で被われたA・ce七…とD、雛中のD、を・・m・・hyl・ulf。x・d，．

を簾てゼ・チ・膜腋。た後直細璋C繭肌て島・る．また且・f・・ss11）．らはAを諦三

物中のD・をけん化晒その耐確物を酵H・・αζ適用・て三三Cの場合と向様にH

PLCにおいてもF’gづ21．に示亨ようにpre－D・も・A・E．と分離す否の飾色法ρような完全．

な妨害伽除去操師う曙はない・三者・まこれ・でG平・法で得た経験轡・H耳¢法に・

り混合ビタ・ミン斉P中ρDの二言齢し芽・な郷噂G五Cの場合1は異り・”’g・31

　　　Fig．21　　　　　　　　　　　HP・c・f．％P31・吟P、…6－D・・．．A・nd　E．

50

富

〕＄

容

牙

　　0£

d1－oし一tocopherol．　　↓

内1三富醤1。

毫ち

retino1．

一

0 10　　　　孝0　　　　30　　　　　　tlme　（min）．Retention

・・耐・う・・b・とpre－D・は分離す・ので…と・・ρ一b・を合訂・てD・鐸・なければな

らない。

3．1．1　通常の混合ビタミ．ン剤

糧欝法概略はけん咽び不けんイヒ物の分野TLC→H且Cで樋・

3．1．1．1　検量線

標準・・または…一…2…6・・11…乃・と・一ナ．・．・一ル2・μ9／・齢む益で．・タ

ン溶液を第3章に関する実験の定量操作法1）あ③（P66）に設定した条件で亘P■Cに適吊しで

検量線を作成した。（Fig．22．）この図において，，同じ含量の時のD豊とpre－D2の内部標準物聲…．

一29一

に対するピーク面積比の比を計算していったところ・pre－D2はD2に対して0．45であった。

Fig．22 C・1iわrati…　urves。f　D20「D3　by　HPLC

．95・o罵

器

捻

鴬

8

Go

D3

　＼

、㌔2

P「o一D3

＼

pre－D2

　　　0。2　　　　0．4　　　　0．6

Weigh．t　ratiQD3・・pre－D3（D2・・p・e｝D2）／賦，n・phth・1

そこでpre－D2の標準溶液を毎回調製することは非常に手間がかかるので，、試料中のpre－D2

含量はpre－D2のピーク面積を，標準D2のそれと比較して得られた値に換算係数．0．45を乗じて

求めることにした。D3系についても同様である。なおpre－D2はD250η野を二塩化エチレン50

叛4中で30分間還流させた後うTLCで精製し得た。

3，1．1．2　市販混合ビタミン剤の高速液体クロマトグラフィーによるD2の定量

　F童g．23（1）は市販混合ビタミン剤試料瓢7を試料として，その不けん化物を直接H：PLCに適

用したものの高速液体クロマトグラムである。D2のピークはわずかながらEの分解物により妨害

を受け，定量不可能であった。これに対しFig．23（旺）はGLCの前処理の場合と同様に，試料不

けん化物をTLCに適用して妨害物を除去した後HPLqに適用した結果であり，TLCの適用に

よって定量可能となった。従ってHPLC法の場合にもGLC法と同様の前処理操作を適用するこ

とにした。次に市販混合ビタミン剤（試料甑2及び鳳7）を購入直後に，D2を定量したところ，

バラツキは少なく良好な結果が得られた。（丁駄ble　16）

3．1．1．3　GLC法との比較．

　市販混合ビタミン剤試料妬．7につき，確立したGI、G法並びにHPLC法で各タ30回ずつD2

の定量を行い，両者の間の相関関係を調べた。（Fig．24）相関係数は0．958でありL両法によ

る結果の問には高度の相関関係があることがわかった。

一30「

Fig．23

　巴

雷

8詠

£

　HighF士）erformance　liquid　ch士6血atograms　of

　commercial　multivitalnin　prepa．rations

50．

0

50．．

0

50

0

（1

諏P．n’f’cat’o

TL．C

S母ponificati．on

　鴨1蹴影　　　　　　　　　　　　o覧　　　　　　　　　　　　，・　　　　　　　　　　　　ll

0 ユ0己．　　　　．．L．．．．20　　　　　　　　「：30．　Re．tehtion．time．．亡lnih）

丁昂ble．16 Vit吊mi・D．・c・nt・・もi・．1・・皿me・rial

叫lti・it．・min．P・ep…！i6n・

SaInple Vitam．in　D2　con七en．t．

Indicated ％、of

≠唐唐＜A

Fouhd（M：：ヒSD）

妬．2

砿7

40q．IU／c．a．P。

盆00．iu／tab．

5．

5

4．．06±4

20．1±1．6

3・1・2　ビタミ1シEを．多墨に含．む準合ビタ．．ミシ剤

H蕪欝略糊噺　をイ騨騨岬ケ∵グラフィ．「→∵9→

S…2・．・．轍齢ζ・．．・．・斉ゆ高三体・▽々・．ダ・・．づ．rlrタうP・ρ騨

F・g…．（1）は市販昂・タ・．・剤（試柵・．・．室温・き年鵜）の不け”晦・．LC｝噸．

後H・・Gを行…も鋤高醐如7．・グラムであ・・．T．LCの噸三三ダ1即櫛

害物による影響を受け．るので・GL〈）の場合と同様さらにPTA．カ．ラムクロマ．トグラフ．．ブ．．一｝とよ1る

一31一．

Fig. 24Correlation between

methods (commercial

' 'D2 values by

multiVitamin

GLC and HPLC

preparation)

T.A

.E1

RL;,

$,k

AX

Bi}`

$ tu

AN

.24Q

220

200

eeeV ee

eeee

/ e'e tt

.

'

e e'ee

y=o

･(.887X+14

r=O.9S8 )

200

D2 assayed

-220

by GLC

24o

(IUIcap.)

Fi'g.25

Aeey-)'

¢ co = o n m･. o･･ ]c

50

o

50

o

so

o

High-performance liquid

commercia1 mu1tivitamin

chromatograrns of

preparatlons

TLC(1)

Saponification.tieltlll-'tt."e

SaPonification¥ie,,l,,'-'t:ttttt

standa'dd'n:Z?ivhp.t).9BzDN2g}l:et

o 1 O' 20 30

alli mp E? -p CJ 1]H % t: tCB , Fig.25 (I) VC Ek vil- .} 5 ia gai=iltz l}l ve ik 8 ;l-Lre ig flJfie e ig . t: . eofi

-3 2-

法．に従い，繰り返しD2の定量を行ったところ満足すべき結果を得た。（Table　17）

　　　Table　17　　　Viもamin　D2　co日置ent　in　commercial

　　　　　　　　　　　mulもivitamin　preparations

Sa皿ple vitamin　D2　contenも

Indicated　　ノ伍．of　　Found

　　　　　　assaア　（M土SD）

46．6 4001Uン／cap．’ @5 238±11

3。L2．2　GLC法との比較

　市販混合ビタミン剤（試料砺．6，室温，3年保存）にっき，確立したGLC法並びにHPLC

法で各々5回ずつ繰り返し定量を行った。（Table　18． j両法による定量値はほぼ近似しぜいた。な

お保存開始時の定量値を100％とした時，室温で3年間保存後のD2の残存率は54．9％であった。

　　　Table　18　　　Determination　of　vi七aminD2　iR　commercial．

　　　　　　　　　　　mulむiviもamin　preparations　bアbo七h　GLC　and　EPLC

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　me七hod8

　Sample　　　　　　　　　　　　妬．of

（lll’器、甥．　aS町

Assayed　value　of　vitaminD2　（IU／cap。）

By　GLC　method． @by．HP乃C　method

　　　（M±SD）　　　（M±SD）

（、。臨） 5 225±15 238±11

3・2　マグロ肝油並びにビタミンD3樹脂油層のドタミンD3の定量

　水産物中のDの定量に関gては，比色法並びにGLC法による報告は見られるが，HI）LCを用

いた報告はいまだ見られない。一方HPLCを用いたD3樹脂油中のDの定量に関しては，

H・…ssl 戟jらまた・・・・…t・8）らの結・励，共・・講を酵H，。C、，翻。ている．著

者もGLC法により検討した結果に基づいてHP五dを用いて検討を行った。

3．2．1　マグロ肝油の高速液体クロマトグラフィーによるD3の定量

一33一

　Fig．26（1）はマグロ肝油の不けん化物をジギトニン・セライトカラムクロマトグラフィー．に適用

後HPLCを行った時の高速液体クロマトグラムである。共存する妨害物によりD3のピークは影

Fig，26

50

　0ε50

＄

ぎ

量。

匡50

0

High－P爾・f・・m・・ce．1iq・id・h・・m・tdgram・

of　tuna　liver　oils

Saponjficationcigitonin－celite

↓

〔］）　　　典1竃

Oo

SaponificationDigitonin－celite ↓

TLC　　　　　　A（11）　　　呉

ll，亀

St・ndard必・・phth・1 鷺3

轟響1

pre－D3

h1亀

．0 10　　　　　　　20　　　　　　　30

Retention　time　〔min〕

響を受け，定量不可能であらた。Fig．26①）は試料不けん化物をジギトニン・セライトカラムク

ロマトグラフィー並びにTLCを行ったものの高速液体クロマトグラムである。G．LCの場合と同

様に未知物質がD3のピークを妨害し，定量不可能であった。　GLC法ではTMS化の操作を加え

ることにより，はじめて未知物質とpyro－D3　TMSのピークとが分離し定量可能となったが，

HP上C法の場合にはTMS化を行うとGI、Cの場合とは異って極端に三時時間が早くなるため，

溶出液から検討しなおさなければならない。従って統一した定量条件をとるためにHPLCではT

MS．化を行わない方針を．とつ．てきた。幸にしてセグロ肝油申のD3に関してはGLC法で定量可能

となるので，GLC法でのみ定量を行うことにした。

3，2．2　D3樹脂油の高速液体クロマトグラフィーによるD3の定量

Fig．27（DはD，翻正油・試料翫・の不けん化物を直接HPLCに適用したものρ高速液体

クロマトグラムであり，Fig．27（皿）は試料不けん化物をTLCに適用しD3並びにpre－D3画分

をかきとり，HPLCに適用したものの高速液体クロマトグラムである。両者の定量値はほぼ等し

かっ．た。この結果を基にD3の定量の際には試料不けん化物を直接HPLCに適用することにした。

一34一

F．ig。27 H’gh”pP・f一孕ce・’q・・d・㎞・吻9士…．

．Qf．．vit・mih　p3　resi・・ils

50

　　　0　　

巴　　　50．

の．

の

。

画め　

Φ　　O

　　l50

　　　　　　　　　　　　　　0

　　　　　　　　　　　　　　　0．　■10．、．．．．20．．．．30

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Rr．・←癖。h．・i興・．伽．i・）．

蟹幣翻藏申ρD岬した．．（Table．1．9．）

P棚輝郷1～5につき・確立レ嘔・珠並岬・L噸各々・．回ずつ・・の輝

を行っ．た。．（Table　20）．．商法による定量値はほぼ近似．してい津r．．

Table　19

Saponificationc智．〔1）　　　　　　　　　　　　　　鱒　　　　　　　　　　　　　ll．　　　　　　　　　　　　　．ll　　　　　　　　　　　　　l㌔ ↓愛錨ヲ置u

C

1亀．

塁呈き．n’f’cat’o・　　↓・・メ・・IU！・　　　（11）　　毛　　　　　　　　　　　　　o。

Standa「d必・・聖…　9，．．

@　　　　　　　　　　　　　謹．．

@　　　　　　　　　　　　　轟　　　　　　　　　　　　　　93

．P「eつ3

Deter血ination of　vitaminb3　in　vi七amin．D3 resin　oilS

Sample　妬．．

．VitaminD3．（工｛1／9）

Indica毛ed．．

　　　　　value

Assaナed　　　　　valU61

1

2

3

4

5

100，000100．，0．00

100，000．

100，000100，000．

　9Q，400

　95，700

112，800　．7．7，900

．95，000

Table　20　De七er．ln．ination．of　vi七昂m．i耳．D3　in　vitaminD3

　　　　　　　　　　　resin　oilsゆy　GLC　呂nd　HPLC　methods．

Sample　妬．．

Indicaもed　valueof　v三七amin：D3

　　　　　（Iu／9）

Assaしyed　val．ue　of　vi．taminD3（IU／g）

ByGI、Clheth6d　By　HpLC　metれod

1

2

3

4

5

100，000100，00010．6，000

100，000．

100．，000

　89，300　91，400．

．109，300

　78，800　92，2．00〕．

9．O，400　9．5，7．00

11．♀，．8．．qo．1．

　．77，．3Q．．9．

X5，00．0

一35一

3．3　照射乾燥酵母中のビタミンD2の定量

　前章においてGLC法により照射乾燥酵母中のD2の定量法を確立したことを述べた。そこでH

PLCについても検討を行った。

3．3．1　照射乾燥酵母の高速液体クロマトグラフィーによるD2の定量

　Fig．28（1）は燃5化20E－Viton／屍のエネルギーで1時聞UV照射した後，けん化しその

不けん化物を直接HPLCに遮用した時の高速液体．クロマトグラムである。　D，のピークは妨害物

　　　Fig．28　　　　　　　　　　High－performance　liquid　chrolnatograms

　　　　　　　　　　of．　irradiated　dried　yeast

　　　　　　　　50

富

）霧

自

辞

畠

0

50

0

50

0

Saponification

@　〔1〕　　　　●

↓

亀

，1

曹騒

ll・1

SaponificationsLC

↓

（11）　　糞　　　　　　　　　　ol

oo・1

Standard@　　　　　　　　ゐ・妙th・1

@　　　　　　　　　　　いre－D2

ε・

llo1

●6

0 10　　　　　　　20　　　　　　　30

RetentiOn　time　〔min）

の影響を受け定量不可能であった。そこでT・LCρ）操作を加えるとFig．28（のに示すように，定

量可能となった。前記のUV照射乾燥酵母中の砺を繰り返し第3章に関する実験の定量操作法の4）

（P67）に従い定量したところ，バラツキは小さく良好な結果が得られた。（Table　21）

　　　Table　21　Determina七ion　of　vitaminD3　i且irradiated　dried　yeast

Sample ／6．ofaSsay

Vita皿in　D2　（IU／望）

Assayed　value（M±SD）

万6．5 5 620±22

＿36一

3．．3．2．GLC法との比較

　乾燥酵母試料孤5に20E－Vi　ton／読のエネルギーで1時間照射したものにっき，確立したG丑