猪 2 型圆环病毒 ORF2基因的原核表达

猪 2 型圆环病毒（ PCV2 ）是断奶仔猪多系统衰竭综合征（ PWMS ）的病原，其不但可以引起断奶仔猪发生衰竭、死亡，还与仔猪 A2 型先天性震颤（ CT ）、成年猪皮炎肾炎综合征（ PDNS ）和呼吸道疾病综合征（ PRDS ）有关，更为严重的是 PCV2 的感染可以造成免疫抑制，引起其他各种病原的继发感染，造成的间接损失难以估计。

目前， PCV2 已经成为严重阻碍养猪业发展的主要病原之一

PCV2 全基因为 1 767 bp 或 1 768 bp ，共有 11个阅读框，其中 ORF1 和 ORF2 是其最主要的阅读框。 ORF1 为 945 bp ，编码 315 个氨基酸，编码病毒的复制蛋白，与 PCV1 的 ORF1 编码的蛋白有相同的抗原性。 ORF2 为 702 bp ，编码234 个氨基酸，编码 PCV2 的结构蛋白 - 壳蛋白Cap ，具有较好的免疫原性。 ORF2 的氨基末端区域的 12 ～ 18 和 34 ～ 41 位氨基酸对核定位起重要作用，而 69 ～ 83 和 117 ～ 131 位氨基酸所形成的位点对 PCV2 抗血清有特异性。

本研究利用 PCR 手段，对 ORF2 序列 (AB246193) 进行扩增。由于 ORF2 序列中包含疏水序列，难于进行原核表达，故将其基因序列除去疏水性碱基后约 580bp 克隆入 pET-32a Vector ，在 BL21-ΔE3 中用 IPTG 进行诱导表达。然后通过 SDS-PAGE 对表达蛋白进行检测。测序及 western blot 检测表达产物的正确性。 PCV2 ORF2 基因在大肠杆菌中的顺利表达，为研制 PCV2 的 ELISA 检测方法及其抗体制备奠定了基础。

PCV2 的 DNA 提取 按 TaKaRa 公司 DNA 提取试剂盒说明进

行。

引物设计 GenBank 基因库中已登录 用 Primer Premier 5.0 软件 ORF2 引物序列设计如下： P1 ： 5’-TTA GGA TCC CAA TGG CAT CCT CAA CAC-

3’ P2 ： 5’-TTA AAG CTT AGG GGT TAA GTG GGG-3’ 为了便于克隆在引物 P1 中引入了 BamHⅠ酶切位点，

引物 P2 中引入了 HindⅢ酶切 位点，同时为了方便表达及表达产物的纯化删去了终止密码子，引物由上海博亚生物技

术有限公司合成。稀释为 10pmol/μL ，－ 20℃保存备用。

P1 ： 5’-TTA GGA TCC AA TGG CAT CCT CAA CACC-3’P2 ： 5’-TTA CTC GAG G GGAT TAA GTG GGG-3’

ORF2 的 PCR 扩增： PCR 反应体系 (50μL) 如下： Premix Taq 25μL P1 1μL P2 1μL 模板 DNA 1μL ddH2O 加至 50μL 混匀后放入 PCR 自动扩增仪中进行扩增，扩增程序为： 94℃预变性 2 min ； 94℃变

性 1 min ， 53℃退火 1 min ， 72℃延伸 1.5 min ，共 35 个循环； 72℃延伸 10 min 。

PCR 产物回收 ( 按 TaKaRa 公司 PCR 纯化试剂盒说明

进行 )

目的基因的克隆 扩增片段的克隆参照 pMD18-T 载体克隆

试剂盒使用说明，将扩增片段电泳回收后直接进行连接，随后将连接产物转化DH5α 感受态细胞，用 Amp+挑选阳性克隆。克隆菌用 U-gene 质粒抽提试剂盒提取质粒 DNA ，并进行电泳、酶切、 PCR 扩增和测序鉴定。

PCR 产物与 pMD18-T 载体的连接 pMD18-T vector 的两个 3’ 末端各有一个突出的胸腺嘧啶（ T ），而 TaqDNA 酶具有加尾特性（ A ），可使 PCR 产物形成粘端，这样使连接效率大大提高。

连接体系如下： 2×rapid ligase buffer 5μL pMD18-T 载体 (50 ng/μL) 1μL T4 DNA 连接酶 (3 U/μL) 1μL ddH2O 3μL 混匀后 16℃连接过夜。

感受态细胞的制备 从 37℃培养过夜的新鲜培养基中挑取 DH5α单菌落，接种于 3

mL （不含抗生素） LB 的培养液中，振荡培养过夜。 取 50μL 过夜培养物，按 1:100 比例接种于 50 mL LB 培养液中剧

烈振荡培养约 3h ，至 OD600 为 0.6 。 无菌条件下，转移细菌培养物至一个无菌且用冰预冷的 50 mL 离

心管中，冰浴 10 min 冷却。 4℃下 4000 r/min 离心 10min ，弃上清，倒置离心管沥干液体，

加入 25 mL 100mmol/Lol/L 冰冷的 CaCl2 溶液，悬浮菌体沉淀，置冰浴放置 45 min 。

4℃下 4000 r/min 离心 10min ，弃上清，用 2 mL 0.1mol/L 冰冷的 CaCl 2 （可含 15%甘油）重悬浮菌体，然后分装于冰冷、无菌的 eppendorf 管中 (100μL/ 管 ) ，可 4℃静置 12 h ～ 24 h备用或冻存于－ 70℃冰箱备长期使用。

连接产物的转化

重组质粒鉴定 在无菌条件下挑取平板上的单菌落，接

种于含有 1 mL 液体 LB 培养基 ( 含有浓度为 100 μg/mL 的 Amp) 的 1.5 mL Ependorff 管中，在 37℃快速振荡 (260-280r/min) 培养 5 ～ 6h ，取 1μL 菌液进行 PCR ， PCR 程序同上， PCR 产物经琼脂糖电泳检测，与预计片段大小相近即为目的重组质粒。

重组质粒的酶切鉴定 在 1.5 mL 管中加入： 10×buffer M 1μL BamHⅠ （ 15 U/μL ） 0.5μL HindⅢ （ 15 U/μL ） 0.5μL 质粒 DNA 6μL ddH2O 加至 10μL 离心混合均匀， 37℃ 作用 3.5 h ， 1.2%琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果。鉴定为阳性的重组质粒分别记为 pMD18-T-ORF2 。

2000

1000750500250100

M1 1 2 3 4 M2

目的基因的核苷酸序列测定 将鉴定过的阳性菌送生物公司进行序列

测定，得到目的基因的序列与已报道的序列进行对比分析，并分析对应的目的蛋白的氨基酸序列组成及理论分子量和等电点。

重组 ORF2 基因原核表达载体的构建 将测序正确的 pMD18-T-ORF2 用 BamHⅠ/Hi

ndⅢ酶切，电泳，切下含 ORF2 条带的凝胶，按说明书用 DNA 回收试剂盒进行回收。

原核表达载体 PET-32a 经 BamHⅠ/HindⅢ酶切后胶回收。按常规方法与回收的 ORF2 连接、转化大肠杆菌 BL21-ΔE3

质粒经酶切鉴定，筛选重组质粒 pET-32a-ORF2 送往上海博亚有限公司进行序列测定，以确定所构建的 pET-32a-ORF2 读码框架的正确性。

重组融合蛋白 PET-32a-ORF2的诱导表达及检测 重组质粒在大肠杆菌 BL21-ΔE3 中的表达 分别挑取含 pET-32a-ORF2 的单个转化菌落接

种于 3 mL 50μg/mL Amp+ 的 LB 培养基中 37℃ 过夜培养后，按 1:100 比例接种于 LB 培养基中于 37℃ 继续培养 3h ，至 OD600=0.6 ～1.0 ，先任取 1 mL 作为对照，而后加入 0.1%的 IPTG 诱导表达，诱导 4h 后收获菌体，以备后用。对不同的阳性克隆分别进行诱导表达，筛选出表达量高的克隆。

同时诱导含空载体 pET-32a 的受体菌作为阴性对照。

表达蛋白的 SDS-PAGE 检测

97.466.2

43.0

31.0

21.0

kDa M 1 2 3 4 5 6 7