实验 双缩脲法测定蛋白质浓度

实验目的1. 学习分光光度法测定的原理和方法2. 学习蛋白质含量测定的原理和方法3. 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法

原理：物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。根据物质对光的吸收特征和吸收强度，对物质进行定性和定量的分析方法，常用紫外—可见分光光度法。

光的电磁波性质光的电磁波性质

射线

x射线

紫外光

红外光

微波

无线电波

10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm

可 见 光

分光光度法

定性分析与定量分析的基础

物质对光的选择吸收

A

max

在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。

A

C

增大

定性分析基础定性分析基础

定量分析基础定量分析基础

I0I参比 样品

入射光 I0

透射光 I

一束单色光通过溶液介质后，光能被吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。 在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。

Lambert—Beer 定律

A=εCL

T （透射比） =I/I0=10-CL lg(1/T)= CL

A 为吸光度； ε 为吸收系数； C 为溶液浓度； L 为溶液光程的厚度

应用（ 1 ）比较吸收光谱曲线 （ 2 ）比较最大吸收波长蛋白质的最大吸收波长为 280nm ，核酸的最大吸收波长为 260nm 。 （ 3 ）比较吸光度的比值

纯 DNA 8.1280

260 nm

nm

A

A

1. 标准曲线法配制一系列不同浓度的标准溶液（至少 5 个）按测定管同样方法处理显色，在选定的波长分别测定各管的吸光度（ A ），以吸光度为纵坐标，标准溶液的浓度（ C ）为横坐标，制作标准曲线。 根据样品的 A 从标准曲线上查得样品含量，再计算出样品的浓度。　　　

常用方法

标准系列

未知样品

　　　　　　　　　　　　　　　　　

标准曲线与样品的测定条件必须一致。 待测样品的浓度必须在标准曲线范围内。

2. 标准管法 CX/AX=CS/AS ，已知 CS ，测定 AS 、 AX ，可求得 CX 。3. 摩尔吸光系数法 C=A/ （为 L=1cm ， C 为 1 mol/L 时

的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。）

分光光度计的使用

单波长单光束分光光度计

0.575

光源 单色器

吸收池

检测器 显示

紫外 - 可见分光光度计

1 ． 722 型分光光度计的外形

2. 仪器操作键介绍“ 方式设定”键（ MODE ）：用于设置测

试方式

“100%T/0ABS” 键：用于自动调整100.0%T(100.0 透射比 ) 或 0ABS( 零吸光度 )

“0%T” 键：用于自动调整零透射比

“ 波长设置”旋钮：用于设置分析波长

3. 样品测试操作① 打开电源开关，使仪器预热 20 分钟② 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位

置上③ 打开样品室盖，将参比溶液倒入比色皿中放入比色皿架靠近

测定者一端位置，并将样品溶液倒入比色皿中放入比色皿架的其它位置，盖好样品室盖。

④ 拉动比色皿架拉杆一小格使比色皿架挡住光路，按“ 0%T”键调透射比为零

⑤ 推入比色皿架使参比溶液位于光路中，盖好样品室盖，按“ 100%T” 调 100% 透射比

⑥ 按“方式键”（ MODE ）将测试方式设置为吸光度方式 A ，此时应显示为 0 ，如果不是则按“ 100%T” 再调 A 零

⑦ 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数

⑧ 实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。在签名本上签名。

返回

光路

返回

光路

返回

美谱达 V-1100D 可见分光光度计测量前的准备开机自检：确认仪器光路中无阻挡物，关上样品室仪器电源开始自检预热：仪器自检完成后进入预热状态，预热时间需在 30 分钟以上

使用说明测量模式选择：按 MODE 键可切换测量模式设置波长：转动波长旋钮可设置测试波长，波长值可从显示器实时读取校准零位：按▽可校准零位校准 100%T ：将放有“参比”的样品槽置于光路中，按△可校准 100%T

测量吸光度第一步：按 MODE 键选定模式为“ A” 模式第二步：旋转波长旋钮到测试波长第三步：将放有“参比”的样品槽置于光路中，按△校准 100%T第四步：将放有“样品”的样品槽置于光路中，读取吸光度值

752 型分光光度计

美谱达 UV-1200 紫外 - 可见分光光度计

蛋白质含量测定的原理和方法

微量凯氏定氮法

被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量 (mol) 相当于被测样品中氨的量 (mol) ，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。

因为蛋白质含氮量通常在 16 % 左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数 6.25 ，便得到该样品的蛋白质含量。

消化 CO2+SO2+H2O+NH3 ↑+ 浓

H2SO4

N

NH3+H2SO4 (NH4)2SO4

蒸馏 H2O+Na2SO4+NH3↑(NH4)2SO4+NaOH

吸收 NH3+H3BO3 NH4HB4O7+H2O

滴定

NH4HB4O7+HCl+H2O NH4Cl+H3BO3

氮的总量测定—凯氏定氮法

原理：当脲加热至 180oC 时，两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下能与硫酸铜生成紫红色络合物，即发生双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故蛋白质与碱性硫酸铜也能形成紫红色络合物 , 在一定条件下其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可用来进行蛋白质定量。最大波长位于 540nm处。本法测定蛋白质范围为 1-10mg

双缩脲法

540 nm

Folin- 酚试剂法 (Lowry 法 )

Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进 Folin

试剂 (磷钼酸—磷钨酸试剂 ) ，蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高（ 20-250g ）、较紫外吸收法灵敏 10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。

紫外分光光度法

由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在 280 nm 波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值 (OD280) 与其含量呈正比关系，可用作定量测定。

利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。

总蛋白定量分析－ BCA （ Bicinchoninic acid ，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）

准确灵敏： BCA 试剂的蛋白质测定范围是 20 －2000μg/mL ； Micro BCA 试剂测 定范围是 0.5-

20μg/mL

快速： 45 分钟内完成测定，比经典的 Lowry 法快4倍而且更加方便经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量 不受样品中离子型和非离子型去污剂影响 检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝

基本原理： 碱性条件下，蛋白将 Cu2+还原为 Cu+ ， Cu+ 与BCA 试剂形成紫颜色的络合物，测定其在 562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。

考马斯亮蓝染色法

考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律 ，因此可以通过测定染料在 595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高 10 － 100μg （比 Lowry 法灵敏 4倍）。

Coomassie Dye-Based 蛋白质定量

PROTEIN +

Amax = 595nm

BLUE

Acid

Coomassie G-250

Protein - DyeComplex

O CH2CH3

NH

CCH3 CH3

NCH2

SO3-

CH3CH2 NCH2

CH2CH3

SO3Na

+

蛋白质含量的测定

紫外吸收法 双缩脲法 Folin- 酚法 考马斯亮蓝法

检测波长 280 nm 540 nm 650 nm 595 nm

检测范围 0.1-1.0 mg 1-10 mg 25-250µg 10-100 µg

繁琐程度 简便 较简便 较简便 较简便

应用 纯度高样品 快速但不十分精确

受多种因素干扰 干扰较少

本次实验采用双缩脲法测定蛋白质含量

一、操作步骤1. 取 15支试管，按下表编号、加试剂（做 2个平行组）管号 0 1 2 3 4 5 6 样品牛血清白蛋白 (mg)

0 0.6 1.2 2.4 3.6 4.8 6.0

2mg/mL牛血清白蛋

白体积(mL)

0 0.3 0.6 1.2 1.8 2.4 3.0 －

待测液体积 (mL)

－ － － － － － － 3.0*（取 2个不同体积）

蒸馏水(mL)

3.0 2.7 2.4 1.8 1.2 0.6 0 0

OD540

2.各管混匀后，加入双缩脲试剂 3.0mL ， 37oC 反应30min 。3. 以 0号管调零，测定各管 540nm 光吸收值。

二、结果处理1.绘制标准曲线 以牛血清白蛋白含量为横坐标， OD540 为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 样品的计算 根据样品的 OD540 从标准曲线上查得样品的蛋白质

含量（ mg ），再根据样品的体积计算出样品的浓度。三、注意事项1.须于显色后 30min内测定，且各管由显色到比色时

间应尽可能一致。2. 样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。3. 用坐标纸绘制标准曲线，注明轴名称及单位。4. 比色杯的使用

微量移液器的使用

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• 吸液：调好量程后，用大拇指将按钮按下至第一停点，然后慢慢松开按钮回原点，吸取所需液体。

• 排液：接着将按钮按至第一停点，排出液体• 排出残液：稍停片刻继续按按钮至第二停点，吹出残余的液体。最后松开按钮。

设定量程时，切忌使移液器量程旋钮超出其标示的最小和最大量程。在将枪头套上移液器时，切忌使劲地用枪砸枪头盒。 正确的方法是将移液枪（器）垂直插入枪头中，稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合。吸液时，要轻推轻吸，切忌将样品吸入移液器腔内。当移液枪头里有液体时，切忌将移液器水平放置或倒置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。使用完毕，把移液枪的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧，竖直挂在移液枪架上。

移液器使用注意事项