01_enzimi
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ENZIMI
CATALISI ENZIMATICA. Meccanismo dazione degli enzimi; Energia dl attivazione; Componenti strutturali e funzionali; Nomenclatura e classificazione; Specificit dl substrato ed azione; Modello Lock and Key; Coenzimi principali; Principio di additivit dellenergia libera in reazioni accoppiate.
(nel lievito): un po di storia... Nellantichit, denominati fermenti Diastasi del malto idrolizza lamido pi velocemente dellacido solforico
1835: Prima teoria della catalisi chimica (Berzelius) 1860: Fermentazione causata da sostanze termolabili (Pasteur) 1877: Primo uso del termine enzima 1897: Estrazione dal lievito degli enzimi della fermentazione alcolica, dimostrazione che pu avvenire in assenza di cellule integre (Buchner) 1913: Equazione di Michaelis-Menten, primo modello matematico del funzionamento degli enzimi 1926: Cristallizzazione di ureasi (Sumner) 1930: Cristallizzazione di pepsina, tripsina e chimotripsina: tutti gli enzimi sono proteine (Northrop) 1965: Teoria dellallosterismo (Jacob, Monod, Changeaux) 1992: Lattivit degli enzimi pu essere regolata con modificazioni covalenti (Fischer, Krebs) 1997: Anche RNA pu agire come catalizzatore: non tutti gli enzimi sono proteine 2004: Ruolo dellubiquitina nella distruzione degli enzimi (Ciechanover, Hershko, Rose)
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Alcune caratteristiche della materia vivente Composta da molecole non viventi, vale pi della somma delle sue parti (1+1=3) Si presenta con poche differenze in specie diverse Ogni componente con funzione specifica e insostituibile, pi funzioni per ciascun componente Trasforma lenergia derivata dallambiente costruendo strutture ordinate e complesse da materiale disordinato e semplice Abilit di autoriprodursi in modo preciso utilizzando le informazioni contenute nel proprio interno Capacit evolutiva, irritabilit ed adattamento allambiente Resa ottimale: Svolge solo le reazioni necessarie minimizzando la produzione di prodotti di scarto Impedisce reazioni indesiderate prevenendo il dispendio energetico Porta a termine le reazioni in tempi brevi E indipendente dalle condizioni ambientali (temperatura, pressione) Pu riutilizzare la stessa macchina per molte volte
Energia di attivazione Y si trova ad uno stato energetico inferiore rispetto a X Conversione XY termodinamicamente favorevole
Ma la reazione non pu avvenire se X non acquisisce sufficiente energia per superare la barriera dellenergia di attivazione
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Distribuzione delle molecole a vari livelli di energiaNumero di molecole Energia di attivazioneMolecole con energia maggiore dellenergia di attivazione Energia
Aumento di temperatura
Presenza di un catalizzatore
Energia
Energia di attivazione
AStato inizialeRiduzione dellenergia di attivazione del substrato mediante: Combinazione transitoria col substrato Stabilizzazione dello stato di transizione Inserimento di numerosi stati di transizione con livello energetico inferiore
Energia di attivazione senza catalizzatore
Energia di attivazione con catalizzatore
Energia liberata dalla reazione
PStato finale
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Un enzima immaginario: la metallasi La barretta deve essere piegata prima di essere rotta (stato di transizione) Enzima con alta affinit per il substrato: stabilizza il substrato Enzima con alta affinit per lo stato di transizione: stabilizza lo stato di transizione e accelera la reaziuione
Enzimi: catalizzatori biologici Non modificano lequilibrio della reazione, ma solo la velocit con la quale lequilibrio viene raggiunto Non vengono modificati nella reazione, e al termine della reazione sono subito disponibili per catalizzare una nuova reazione
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H2O2 e catalasi2 H2O2 2 H2O + O2 Catalizzata da catalasi Reazione spostata a destra (Keq alta) ma molto lenta (k velocit bassa)
DNA RNA ribosomi
Struttura generale degli enzimi
Zimogeno (precursore) Apoenzima
Substrato
Prodotto
Sito attivo
ENZIMA ATTIVO Parte non-proteicaione metallico o coenzima
Ubiquitina Lisosomi degradazione Effettore allosterico
Sito allosterico
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Nomenclatura degli enzimi Denominazione classica costituita da 3 parti: Nome del substrato Nome del coenzima Nome della reazione catalizzata + asiEsempio: Lattico-NAD-deidrogenasi
International Enzyme Commission, fondata nel 1956 da Prof. M. Florkin: 77 membri, presidente attuale Angelo Azzi Classificazione degli enzimi secondo il sistema delle classi EC Esempi:Creatin kinasi: EC 2.7.3.2, adenosintrifosfato : creatin N-fosfo trasferasi Lattato deidrogenasi: EC 1.1.1.27, lattato : NAD+ ossidoreduttasi
Ha funzionato bene fino agli anni 90 (circa 3200 enzimi)
Progetto genoma umano (HUGO): Esistono circa 20,000 geni, in buona parte enzimi
Classificazione internazionale degli enzimi 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 1.1 agisce sul gruppo CHOH del donatore 1.2 agisce sul gruppo aldeidico o chetonico del donatore 1.3 agisce sul gruppo CH-CH del donatore 1.4 agisce sul gruppo CH-NH2 del donatore 1.5 agisce sul gruppo C-NH del donatore 1.6 agisce su NADH2 o NADPH2 1.7 agisce su altri composti azotati 1.8 agisce su gruppi solforati 1.9 agisce sui gruppi eme
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Classificazione internazionale degli enzimi 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 2.1 gruppi ad una unit di carbonio 2.2 gruppi chetonici o aldeidici 2.3 gruppi acilici 2.4 gruppi glicosidici 2.5 gruppi alchilici 2.6 gruppi azotati 2.7 gruppi fosforici 2.8 gruppi contenenti zolfo
Classificazione internazionale degli enzimi 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 3.1 legami esterei 3.2 legami glicosidici 3.3 altri legami 3.4 legami peptidici 3.5 legami C-N non peptidici 3.6 legami anidridici 3.7 legami C-C
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Classificazione internazionale degli enzimi 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami 4.1 legami C = C 4.2 legami C = O 4.3 legami C = N 4.4 legami C = S
Classificazione internazionale degli enzimi 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami 5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel suo isomero 5.1 racemasi 5.2 cis-trans isomerasi
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Classificazione internazionale degli enzimi 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami 5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel suo isomero 6 - ligasi: reazioni di formazione di nuovi legami con rottura di ATP in AMP e pirofosfato o ADP e Pi 6.1 legami C-O 6.2 legami C-S 6.3 legami C-N 6.4 legami C-C
Classificazione internazionale degli enzimi 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami 5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel suo isomero 6 - ligasi: reazioni di formazione di nuovi legami con rottura di ATP in AMP e pirofosfato o ADP e Pi
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Modello Lock and Key: lenzima si combina chimicamente col substrato Emil Fisher 1894 Il sito attivo costituito dal negativo del substrato Si formano legami esatti fra enzima e substrato
Riconoscimento anche tridimensionale Esempio: glicerol kinasi (lega solo il glicerolo in forma alfa) Pu distinguere stereoisomeri D- e L- degli aminoacidi
Spiega la specificit, ma NON spiega la stabilizzazione dello stato intermedio
Un modello pi sofisticato: induced fit + substrate strain Daniel Koshland 1958 (University of California Berkeley) Sito di legame non completamente pre-formato Linterazione fra substrato e enzima induce un cambiamento conformazionale nellenzima che prelude ad un legame pi stabile col substrato (induced fit) Il substrato forzato verso la formazione dei prodotti (substrate strain)
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Il legame enzima-substrato avviene tramite linterazione delle cariche del substrato con alcuni aminoacidi del sito attivo Esempio: proteasi a serina Alterazioni della struttura primaria di un enzima possono mutarne lattivit causando malattie genetiche
Il legame enzima-substrato induce un cambiamento conformazionale nellenzimaEsempio: esochinasi senza e con glucosio
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Il cambiamento conformazionale forza il substrato ad assumere una nuova struttura o conformazioneEsempio: lisozima, che idrolizza i polisaccaridi
Dalla sequenza degli aminoacidi alla struttura delle proteine
Struttura primaria (sequenza degli aminoacidi) Sempre lineare
Struttura secondaria (conformazione della catena) -elica o -a pieghe
Struttura terziaria (tridimensionalit della catena) Relazioni locali o remote dei gruppi R Proteine globulari o fibrose
Struttura quaternaria (interazioni fra pi catene)
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Struttura primaria e mutazioni genetiche Tutte le funzioni delle proteine necessitano del riconoscimento fra zone o domini della proteina con altre molecole o parti di molecola: Enzima-substrato, molecole di adesione-membrane, anticorpo-antigene
Il dominio preposto al riconoscimento e la molecola da riconoscere devono essere complementari in termini di struttura e di carica Il riconoscimento dipende dalla distribuzione dei gruppi R e dalla sequenza degli aminoacidi Una mutazione della struttura primaria pu impedire o rendere difficile il riconoscimento, causando disfunzioni pi o meno gravi Se ne deriva uno stato patologico, quella mutazione interessa il dominio di riconoscimento Se la mutazione silente (non genera malattie o disfunzioni), possibile che l'aminoacido mutato non sia nel dominio di riconoscimento
Spesso sufficiente la mutazione di un solo aminoacido Tutte le malattie causate da tali mutazioni sono genetiche Tutte le malattie genetiche originano una mutazione della struttura primaria delle proteine
Di tutte le reazioni possibili per un substrato, lenzima ne favorisce una sola Gli enzimi forzano le vie metaboliche attraverso reazioni selezionate (ad es: A > B > H > K > N > T > Z) favorendo il flusso unidirezionale di materiale
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Coenzimi Piccole molecole organiche, spesso derivate da vitamine Si legano allenzima Spesso fungono da secondo substrato
Determinano la specificit della reazione catalizzata
Adenosin trifosfato (ATP) Coenzima delle chinasi, trasferisce un gruppo Pi al substrato Esempio: Glucosio + ATP Glucosio-6-fosfato + ADP In molte chinasi, il substrato vero Mg-ATP
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Nicotinamide Adenina Dinucleotide (NAD+) Coenzima di deidrogenasi Derivato da niacina Trasferisce un protone da/a substrati: lattato + NAD+ piruvato + NADH + H+
Esiste una forma fosforilata NADP+
Flavina adenina dinucleotide (FAD) Coenzima di deidrogenasi Derivato da riboflavina (vit. B6) Trasferisce due protoni da/a substrati Succinato + FAD Fumarato + FADH2
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Coenzima A Trasportatore e attivatore di gruppi acilici (acidi grassi) e di acetato
Metalli di transizione (Fe, Zn, Cu, Mn) Cofattori pi che coenzimi Presenti in 2/3 degli enzimi Agiscono come stabilizzatori della proteina e come donatori/accettori di elettroni (acidi di Lewis), per esempio i citocromi
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CINETICHE CHIMICHE E ENZIMATICHE
Ordine di reazione; Ipotesi per lazione degli enzimi; Equazione di Michaelis-Menten; Velocit massima e KM; Trasformazione di Lineweaver-Burk; Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche.
Cinetiche chimiche (AP)
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Effetto della concentrazione di A (A P) A4 > A3 > A2 > A1[prodotto] Velocit iniziale
A4 A3 A2 A1
Tempo
A1 A2 A3
A4
[A]
Cinetiche chimiche vs cinetiche enzimatiche
Velocit iniziale
Cinetica enzimatica
Cinetica chimica
[A]
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Ipotesi per lazione degli enzimi [S] >> [E]
E + S ES EP E + P Lenzima si lega col substrato per formare ES: reazione reversibile Il complesso ES subisce il cambiamento conformazionale che induce la formazione di P (reazione relativamente lenta) Lenzima rilascia P e torna nello stato iniziale La velocit globale regolata da [ES]
Ordine di reazione Primo ordine AP v=k[A]1, n=1 Secondo ordine A+BP v=k[A]1[B]1, n=2 Pseudo primo ordine A+BP v=k[A]1[B]1, n=2 ma se [B][A], v=k[A]1, n=1 Ordine zero v=k, n=0 v dipende dalla concentrazione del catalizzatore
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Interazione enzima-substratov0
Se [S] molto alto, v0 non cambia allaumentare di [S]
Vmax Ordine 0 Ordine misto
Se [S] alto, v0 controllata da [E] Se [S] intermedio, v0 controllata sia da [S], sia da [E] Se [S] basso, v0 controllata da [S]
1 ordine
[substrato]
Commission on Enzyme Nomenclature of the International Union of Biochemistry Attivit enzimatica: moli di substrato convertito per unit di tempo in condizioni standard di temperatura, pH e forza ionica: 1 katal = 1 mol/s 1 IU = 1 micromole/min
Attivit specifica: attivit enzimatica per mg di proteina (moli/tempo/mg proteina) Espressione di purezza
Costante catalitica o numero di turnover: attivit enzimatica per mole di enzima (moli/tempo/mole enzima)
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Equazione di Michaelis-Menten (1913)
v0 =
Vmax [S] K M + [S]
Leonor Michaelis & Maud MentenLeonor Michaelis (Berlin, January 16, 1875 New York, October 8, 1949). Maud Leonora Menten (Ontario, March 20, 1879 July 26, 1960), among the first women in Canada to earn a medical doctorate. At that time women were not allowed to do research in Canada, therefore she decided to do research in other countries such as the United States and Germany. Accomplished musician and painter.
Assunzioni di Michaelis-Menten E + S ES E + P 1 solo substrato Fattore limitante: formazione di ES Tutto E ES Non esiste E libero E saturo di S
ES stazionario
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Ipotesi v0=Vmax/2 KM = [S] quando v0=Vmax/2 E una concentrazione (dimensioni moli/litro) E indipendente da [E]
v0 =
Vmax [ S] K M + [S]
Vmax Vmax [S] = 2 K M + [S] 1 [S] = 2 K M + [S] K M + [S] = 2 [ S] K M = [S]
Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatichev0 Vmax
Vmax/2
KM
[S]
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Trasformazione di Lineweaver-Burk
v0 =
Vmax [S] K M + [S]
Y
1 K M + [S] = v 0 Vmax [S] 1 KM [S] = + v 0 Vmax [S] Vmax [S] 1 KM 1 1 = + v 0 Vmax [S] VmaxX
Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche
1 KM 1 1 = + v0 Vmax [S] Vmax1/v0
1/Vmax
-1/KM
1/[S]
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Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche
Grafico di Lineweaver-Burk V0 Vmax Vmax/2 1/V0
1/Vmax
KM
[S]
-1/KM
1/[S]
Esochinasi (HK) e glucochinasi (GK) Glucosio + ATP Glucosio-6-fosfato + ADP [glucosio] in sangue: 5 mM [glucosio] intracellulare: 0.2-2 mM Muscolo: HK Inibita da Glucosio-6-fosfato Utilizzo di glucosio indipendente da [glucosio] in sangue
Epatociti: GK Non inibita da Glucosio-6-fosfato Trasformazione di glucosio in glicogeno dipendente da [glucosio] in sangue
Pancreas: GK Non inibita da Glucosio-6-fosfato Sensore di [glucosio] in sangue per la produzione di insulina
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Metabolismo dellalcoolAlcool deidrogenasi Aldeide deidrogenasi
CH3-CH2OH CH3-CHO CH3-COO Etanolo Acetaldeide Acetato KM di alcool deidrogenasi per etanolo: 1 mM (46 mg/l) Enzima saturo dopo pochi drinks (anche uno) Metabolizzazione segue una cinetica di ordine zero Velocit: 10 g/h Diminuzione del tasso nel sangue: 0.15 g/l Indipendente dal tasso iniziale
KM di aldeide deidrogenasi per acetaldeide: 0.01 mM
3 varianti con poche differenze in termini di KM e Vmax
Livello di acetaldeide 1/1000 di quello di etanolo In presenza di isoforma con KM=1 mM, accumulo di acetaldeide Oriental flush
0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0
60 50
[alcool] in sangue, g/l
[aldeide], M
40 30 20 10KM=1 mM KM=0.01 mM
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Tempo, ore dopo 0.6 g/kg
Tempo, ore dopo 0.6 g/kg
REGOLAZIONE DELLATTIVIT ENZIMATICA
Necessit fisiologica; Catene enzmatiche; Controllo del livello di enzima; Ubiquitina; Fattori fisici e chimici di modulazione dellattivit; Inibizione competitiva e non competitiva; Compartimentalizzazione intracellulare; Modificazioni allosteriche e covalenti; Allosterismo e cooperativit; Cinetica degli enzimi allosterici e cooperativi.
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Il buon funzionamento della cellula richiede che le varie attivit enzimatiche siano regolate In condizioni di stato stazionario, i processi cellulari non funzionano mai al massimo delle loro capacit, ma possono anche venire completamente disattivati: Non produrre prodotti inutili Economizzare energia Aumentare rapidamente lattivit se necessario
Reversibilit delle reazioni enzimatiche Lenzima favorisce il raggiungimento dellequilibrio, quindi in teoria potrebbe catalizzare anche la reazione inversa A B Ma, se B substrato di una reazione successiva, la prima reazione diventa praticamente irreversibile ABC Ci vale per catene anche molto lunghe di reazioni (catene enzimatiche) ABCDE Anche se le singole reazioni enzimatiche sono reversibili, in pratica il flusso unidirezionale perch il prodotto di una reazione funge da substrato per la reazione successiva Spesso il prodotto terminale di una sequenza di reazioni (E) inibisce il deflusso della stessa catena a livello della prima reazione A B Laccumulo di E chiude il rubinetto La mancanza di E riapre il rubinetto
ABCDE
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Caratteristiche generali delle reazioni regolatorie G