Immunológiai módszerek GYImmunológiai módszerek GYImmunológiai módszerek GYImmunológiai módszerek GY

1. alkalom1. alkalom1. alkalom1. alkalom

BevezetésBevezetés

2019. 09. 12.2019. 09. 12.Jó i Mihál PhDJó i Mihál PhDJózsi Mihály, PhDJózsi Mihály, PhD

Óra kezdés:15:30 ????15:30 ????

Az Immunológia tankönyv elérhető:http://www.tankonyvtar.hu/hu/tartalom/tamop425/2011_0001_524_Immunologia/adatok.html

Erdei Anna (szerk.):Immunológiai módszerek

Erdei A. (szerk.):Immunológia (Medicina 2012)

Immunológiai Tanszék: Déli Tömb 5 emelet

Immunológiai módszerek Immunológia (Medicina 2012)

honlap: http://immunologia.elte.huImmunológiai Tanszék: Déli Tömb 5. emelet

11 09.12. Bevezetés az immunrendszer működésébe

Tematika – Immunológia módszerek

22 09.19. Ellenanyagok előállítása Poliklonális ellenanyagok jellemzése és előállítása. Monoklonális ellenanyagok jellemzése és előállítása. Ellenanyag tisztítási módszerek; kisózás, ioncserélő kromatográfia, gélszűrés, affinitás kromatográfia. Ellenanyagok módosítása enzimatikus hasítással. Molekuláris genetikai módszekkel létrehozott rekombináns ellenanyagok. Az ellenanyagok felhasználásának területei. Ellenanyagok jelölésének lehetőségei.

10 03 Kí é l ti áll t k t tá k lé i i álá3.3. 10.03. Kísérleti állatok tartása, kezelése, immunizálásaAz immunizálás menete. Az antigének általános jellemzése. Adjuvánsok alkalmazása. Állatmodellek; immunhiányos, autoimmun, génkiütött és transzgénikus modellek.

4.4. 10.10. Az antigén és ellenanyag kapcsolódást követő másodlagos reakciókon alapuló (szerológiai) módszerekImmunelektroforézis. Folyadék fázisban végzett precipitáció; precipitációs görbe, gél közegben végzett immundiffúziós eljárások; Ouchterlony módszer Mancini módszer Agglutinációs reakcióimmundiffúziós eljárások; Ouchterlony módszer, Mancini módszer. Agglutinációs reakció.

5.5. 10.17. elmarad

6.6. 10.24. Az antigén-ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló, jelöléses módszerek I.A jelöléses mérési technikák elve. Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay (ELISA) tecnikák; direkt, indirekt, szendvics. Az ELISPOT módszer. A Western blot technika alapjai. Az immunhisztokémia módszer.

11 07 A ti é ll k lódá ki t tá á l ló j lölé ód k II7.7. 11.07. Az antigén-ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló, jelöléses módszerek II.Áramlási citofluorimetria (FACS), konfokális lézer pásztázó mikroszkópia (CLSM). A módszerek működésének alapjai, eredményeinek értékelése és felhasználási lehetőségei.

8.8. 11.14. A komplementrendszer aktivitásának vizsgálataÖsszkomplement titrálás. Komplementkomponensek mennyiségi meghatározása. Komplement mérések a klinikai gyakorlatban. Komplement mediált lízis.gy p

9.9. 11.21. Steril körülmények között végzett munka feltételei és műszeres háttereSejtkultúra előállítása és fenntartása. Primer sejtkultúrák; humán és állat modellek. Sejtvonalak alkalmazási lehetőségei.Immunsejtek elválasztásaImmunsejtek izolálása, primer sejtkultúra előállítása és fenntartása. Sűrűség-gradiens centrifugálás. Sejtszeparálás mikrogyöngyökkelmikrogyöngyökkel.

10.10. 11.28. Limfoid sejtek funkcionális vizsgálata.B-limfociták funkcionális vizsgálata. Limfociták aktivódásának, citokin termelésének, proliferációjának, apoptózisánaknyomon követésére alkalmazott tecnikák. T-limfociták és NK-sejtek funkcionális vizsgálata. Limfociták aktivódásának, citokin termelésének, proliferációjának, apoptózisának nyomon követésére alkalmazott tecnikák.

11.11. 12.05. Monociták, makrofágok, neutrofil granulociták és dendritikus sejtek funkcionális vizsgálata. A sejtek aktivációjának, antigén felvételének, sejtes kölcsönhatásainak, migrációjának és citokin termelésének maghatározására alkalmazott mérési lehetőségek.

12.12. 12.12. ZH

Immunológiai módszerekMiről lesz szó az előadáson?- Miről lesz szó az előadáson?

1. A legfontosabb immunológiai modellek megismerése, egér ésemberi eredetű sejtek izolálása a steril munka fogalmaemberi eredetű sejtek izolálása, a steril munka fogalma

2. Ellenanyagok előállítása, tisztítása, felhasználásuk területei

3. Immunológiai módszerek – ELISA, ELISPOT, áramlásicitofluorimetria, konfokális mikroszkópia – DIAGNOSZTIKAcitofluorimetria, konfokális mikroszkópia DIAGNOSZTIKA

4. Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata –jt kti á ió ff kt f k iók d fi i iáksejtaktiváció, effektor funkciók, deficienciák

A mai előadás szerkezete

Az immunrendszer biológiai funkciói.

A veleszületett és az adaptív immunrendszer.

Az immunrendszer felépítése és szerveződéseAz immunrendszer felépítése és szerveződése,

az immunrendszer sejtes és molekuláris elemei.

Az immunrendszer szerepe

Normál funkciók:Normál funkciók:

• Az immunrendszer fő feladata a fertőzések elleni védelem.

immunitas (lat.) = védettség, mentesség

Véd egyes tumorok ellen is• Véd egyes tumorok ellen is.

Szerepe betegségekben, terápiás vonatkozások:

• Nem megfelelő működése betegséget okozhat (pl. autoimmunitás, allergia)

• Gátja lehet pl. szervátültetésnek.j p

(A. Abbas nyomán)

Immunválasz: az antigén felismerésétől annak eliminálásáig tartóImmunválasz: az antigén felismerésétől annak eliminálásáig tartó immunológiai folyamat.

Kezdeti fázisában az antigén felismerése, felvétele és feldolgozása történik antigén-bemutató sejtek révén.

A központi fázisban az antigénre specifikus B- és T-sejt klónok felszaporodása és végrehajtó (effektor) sejtté érése történik.

Az effektor fázisban zajlik az antigén semlegesítése vagy eliminációja az antigén-specifikus és nem antigén-specifikus (pl. komplementrendszer,

k fá k ált li f itó i ) f l t k ütt h tá ké tmakrofágok általi fagocitózis) folyamatok együttes hatásaként.

Nyirokszervek

Antigén és immunsejtek kapcsolata, az immunsejtek effektor sejtté érése

Immunsejtek fejlődése

Erdei A. (szerk.): Immunológia (Medicina)

j jj

Veleszületett és adaptív immunitás

mikrobák

veleszületett immunitás adaptív immunitás

epitélium

B-limfocita ellenanyagok

epitélium

fagociták

T-limfocita

g

NK jtk l t

órák napok0 6 12 1 4 7

NK-sejtkomplement

0 6 12 1 4 7

(A. Abbas nyomán)

Veleszületett immunrendszer

veleszületett immunitás a fertőzések kivédéséreveleszületett immunitás a fertőzések kivédésére

• születéstől fogva jelen van

• nem antigén-specifikus (patogén-specifikus)

• többszöri találkozás után nem javul a válasz

• nincs memória

• sejtes és humorális elemeket tartalmaz

Az adaptív immunválasz kialakulásához nélkülözhetetlen, aktiválásában, szabályozásábannélkülözhetetlen, aktiválásában, szabályozásában is fontos szerepet játszik.

Adaptív immunrendszer

A fertőzések leküzdésére kialakult immunitás

t lá ” d é• „tanulás” eredménye

• antigén-specifikus

több ö i t lálk á tá h ték bb• többszöri találkozás után hatékonyabb

• memória van

jt é h áli l k t t t l• sejtes és humorális elemeket tartalmaz

• a veleszületett immunrendszer nélkül nem hatékony

A szervezetben jelenlévő antitestek tükrözik

a fertőzéseket, amelyeket az adott egyed

leküzdött (mikroba-ellenes ellenanyagok)

- diagnosztikai jelentőség

Erdei A. (szerk.): Immunológia (Medicina)

Immunhomeosztázisa veleszületett és az adaptív immunrendszer kölcsönhatása- a veleszületett és az adaptív immunrendszer kölcsönhatása

Erdei A. (szerk.): Immunológia (Medicina)

Az immunválaszkialakulásakialakulása

Erdei A. (szerk.): Immunológia (Medicina)

Az immunrendszer működésében résztvevő sejtek

Az immunrendszer fő sejttípusai

i é b ó j k• antigén-bemutató sejtekaz antigén felvételét, feldolgozását és limfociták számára való bemutatásátvégző sejtek (pl. makrofágok, dendritikus sejtek)

• limfocitákaz adaptív immunrendszer sejtjei, az antigén felismerése után védekező funkciótb töltő jt kké f jlőd k (diff iálód k) T é B li f itákbetöltő sejtekké fejlődnek (differenciálódnak) – T- és B-limfociták

• effektor sejtekf hé é jt k (l k iták) l k ik bák t l títják ( l li f itákfehérvérsejtek (leukociták), amelyek a mikrobákat elpusztítják (pl. limfociták, neutrofil granulociták)

3.1. ábra A vérsejtek képződésének helyszínei az élet folyamán

3.2. ábra A hemopoetikus őssejt aszimmetrikus osztódása

3.3. ábraHemopoézis

A vér összetevői

%-os arány45-651-31-3< 1

20-305-10

(fehérvérsejtek)

A veleszületett immunrendszer elemei

A veleszületett immunitás szerepe

• kezdeti válasz• kezdeti válasz- mikrobákra: alapvető korai válasz fertőzések ellen- szöveti sérülésre, elpusztult sejtekre: fontos szerep a sebgyógyulásban,

szöveti regenerációban

• korlátozott típusú védekező reakciók- gyulladás- antivirális aktivitás- antivirális aktivitás

d tí i itá kti álá• adaptív immunitás aktiválása- a veleszületett immunitás „veszély“ jelzést küld

(A. Abbas nyomán)

A veleszületett immunitás jellemzői

• fejlődéstanilag ősibb mint az adaptív immunrendszer• fejlődéstanilag ősibb, mint az adaptív immunrendszer

• azonnal rendelkezésre áll- mikrobával való találkozás nélkül is működik

• gyorsan aktiválódik v. a helyszínre érkezik

• nincs memórianincs memória

(A. Abbas nyomán)

A veleszületett immunrendszer - 1.

• epitélsejtek• epitélsejtek- defenzinek és egyéb antimikrobiális peptidek

• fagociták- neutrofil granulocitákg- makrofágok- dendritikus sejtek

• speciális limfociták- veleszületett limfoid sejek

(klasszikus antigénreceptort nem expresszálnak, de T-sejt-szerűek)- B1 sejtekj

(A. Abbas nyomán)

A veleszületett immunrendszer - 2.

• plazmafehérjék• plazmafehérjék- komplementrendszer- kollektinek

( C )- pentraxinok (pl. C-reaktív protein)

• citokinek- gyulladásos citokinek (pl IL-1 TNF)gyulladásos citokinek (pl. IL 1, TNF)- kemokinek (pl. IL-8)- antivirális (pl. interferon)

IL: interleukinTNF: tumor nekrózis faktor (A. Abbas nyomán)

Mit ismer fel a veleszületett immunrendszer?immunrendszer?

• mikrobák általános struktúráit amelyek a saját sejteken• mikrobák általános struktúráit, amelyek a saját sejtekennincsenek jelen– patogén-asszociált molekuláris mintázatok (PAMP)p g ( )- gyakran olyan molekulák, amelyek a mikrobák túléléséhez vagyfertőzőképességéhez nélkülözhetetlenek (pl. kettősszálú RNS)

• olyan struktúrákat, molekulákat, amelyek sérült vagyelpusztuló saját sejtek(b)en találhatók meg – sérülés/veszély-asszociált molekuláris mintázatok (DAMP)- pl. hősokkfehérjék, ATPp j ,

PAMP: pathogen-associated moleular patternDAMP: damage- / danger-associated molecular pattern (A. Abbas nyomán)

Felismerő molekulák, receptorok

extracelluláris térTLR

bakteriális sejtfal gomba sejtfal

pentraxinok

TLRCLR

citoszól komplement

endoszómakollektinekNLR

bakteriálispeptidoglikán

TLR

virális DNS, RNS virális RNS• nem klonális eloszlásúak

TLRRLR • < 100-féle

• ugyanaz minden sejttípuson

TLR: toll-szerű receptorCLR: C-típusú lektin receptor (A. Abbas nyomán)

NLR: NOD-szerű receptorRLR: RIG-szerű receptor

3.15. ábra Granulociták populációi és funkciói

Neutrofil granulocita- fagocitózis

patogének pusztítása- patogének pusztításaenzimekkel, oxidatív úton stb.

Eozinofil granulocita- paraziták elleni védelem

Bazofil granulocita- allergiás reakciók

e f itál- nem fagocitál

8.5. ábra A granulociták extravazációja

Mononukleáris fagociták: monociták és makrofágok

Fagocitotikus és antigénfelismerő receptorok jelenléte ≈ fagocitózis

Éretlen

TLR-ok ≈ citokintermelés, mikrobiális ölőfunkciók aktiválása

CR-ok, FcR-ok ≈ opszonizált antigének felvétele

Érett, differenciálódott Mf

MHC-I/II: hivatásos Ag prezentáló sejtek

3.12. ábra Makrofágok szerepe immunfolyamatokban

3.14. ábra Dendritikus sejtek (DC) sejtfelszíni moleulái és differenciálódásuk

éretlenéretlenfagocitózis,antigén-felvétel

környéki nyirokcsomóba vándorlás

érett

• patogénfelismerő receptorok számap g pcsökken

• MHC II-expresszió megnő• kostimulátor molekulák száma

megnő• antigénbemutatás

Dendritikus sejtek differenciálódása

Antigén felvétel Migráció

T-sejt aktivációDifferenciálódás

Janeway

3.20. ábra A temészetes ölősejtek (NK) sejtfelszíni molekulái és funkciói

KAR: ölősejtet aktiváló receptorKIR ölő jt t átló tKIR: ölősejtet gátló receptor

ADCC: antitest-függősejtes citotoxicitássejtes citotoxicitás

Erdei A. (szerk.): Immunológia (Medicina)

A komplementrendszerXIX.sz. vége: Fodor József

a lépfenét okozó Bacillus anthracis-szalpimmunizált nyulak savója elpusztítja a kórokozót

Specifikus ellenanyag jelenléte szükségesSpecifikus ellenanyag jelenléte szükséges, de az immunizálással nem nő a hatékonyságKomplementer - kiegészítő

Hőkezeléssel: (56 oC) inaktiválható

- Vérben, testnedvekben inaktív állapotban jelenlévő- egymást láncreakcióban aktiváló faktorok

k kád bál ó l k lák- a kaszkádot szabályozó molekulák- az aktivált komponenseket megkötő sejtfelszíni receptorok

több mint 30 molekulatöbb mint 30 molekula

A komplementrendszer aktiválódása – leegyszerűsítve

klasszikus út lektin út alternatív útklasszikus út(IgG, pentraxinok...)

lektin út(cukor csoportok)

alternatív út(folyamatos)

C3C3 con ertá

opszonizációC3b

C3 convertáz

fagocitózis

terminális út

gyulladásC3a, C5a C5 convertáz

(MAC)

lízis

MAC: membránkárosító komplex

szabályozó molekulák gátolják a saját sejtek, szövetek károsodását

A komplement szerepe a mikrobák elleni védelemben

elimináció

klasszikus lektin alternatív

elimináció

(fagocitózis, lízis)

klasszikusút

lektinút

alternatívút

C1q MBLC3b

IgG,IgM mikroba

MBL: mannán-kötő lektinIg: immunoglobulin (ellenanyag, antitest)

lízis

lyukak a

komplement

sejtmembránban

C3 C. albicans-onpatogén

p

opszonizáció

fokozottfagocitózis m

ba

(komplementreceptorokszerepe)

agoc

itált

gom

humán szérum - +fa

A komplementrendszer effektor funkciói

Opszonizáció és fagocitózis

Gyulladás

Lízis

Az adaptív immunrendszer működésében

kulcsszerepet játszó limfociták:kulcsszerepet játszó limfociták:a B- és a T-sejtek

Az adaptív immunitás szerepe

• fertőzések ellen hosszan tartó hatékony védettséget ad• fertőzések ellen hosszan tartó, hatékony védettséget ad

• adott antigénre specifikus- az effektor funkciók az adott immunválaszt kiváltó antigénre irányulnak

• immunológiai memória biztosításaó i jt k h ú él tű l jt k é é- memóriasejtek, hosszú életű plazmasejtek révén

Az adaptív immunitás jellemzői

• fejlődéstanilag újabb, ráépült a veleszületett rendszerre- gerincesekkel jelenik meg az evolúció soráng j g

• a B- és T-sejtek jelen vannak, aktivációjukhoz több idő kell- mikrobával való találkozás után a veleszületett immunrendszer aktiválja“- mikrobával való találkozás után a veleszületett immunrendszer „aktiválja

• lassabb reakció- a végrehajtó funkciók ellátását végző, antigénspecifikus sejtklónok megfelelő

számban való felszaporodásához és differenciálódásához napok, akár hetekkellenek

• van memória

• átvihető más egyedbe (specifikus sejtek, ellenanyagok révén)

• klonális eloszlású, kétféle (Ig, TCR), nagyon változatosspecificitású felismerőmolekulák (107-109 félét ismernek fel)

Az adaptív immunrendszer

• limfociták• limfociták- ellenanyagtermelő B-sejtek- segítő (helper) T-sejtek- citotoxikus T-sejtek

• ellenanyagok- immunglobulin (Ig) M, G, A, E, D

• limfokinek (citokinek)- pl. IL-2, IL-4, IL-12, IL-15

IL: interleukin

Antigén-receptor (BCR, TCR) gének

Klónszelekció

A saját struktúrával reagáló limfocita-klónok

g p ( ) gszomatikus rekombinációja 1010

(T- és B-sejtek)negatív szelekciója (deléciója)

Az antigén-specifikus receptort hordozó limfocita-klónok (T- és B-sejtek)

pozitív szelekciójapozitív szelekciója,felszaporodása,

effektor-sejtté érése,memória-sejt keletkezésememória sejt keletkezése

Erdei A. (szerk.): Immunológia (Medicina)

Hogyan találkoznak a limfociták az antigénnel?Hogyan találkoznak a limfociták az antigénnel?

mikrobák

az antigén belépési helye – bőr, légutak, gyomor-béltraktus, urogenitális traktus

epitélium

vérbe jutó

dendritikus sejtaz antigén felvételevérér

vérbe jutóantigén

szabad

nyirokér

vérérszabadantigén

az antigének

kötőszövet

az antigénekösszegyűjtése

nyirokcsomó lépy lép

(A. Abbas nyomán)

A veleszületett immunrendszer adja a 2. jelet A veleszületett immunrendszer adja a 2. jelet a limfociták aktivációjáhoza limfociták aktivációjához

mikrobiálisantigén

1 jel

antigénreceptor

2 jel B-sejteknek:1. jel

2. jelmikrobaellenes

veleszületettimmunválaszB sejt

2. jel B-sejteknek: komplement aktivációs termékek, komplement receptor ismeri fel

veleszületett immunitásáltal indukált molekula

(pl. kostimulátor, komplement)

B-sejt receptor ismeri fel

2. jel T-sejteknek:kostimulátor molekulák,

limfociták klonálisfelszaporodása

,amelyeket a mikrobák indukálnak az APC-n a veleszületett válasz felszaporodása,

differenciálódása kezdetén

adaptív immunválasz

(A. Abbas nyomán)

A T- és a B-limfociták általi antigénfelismerés

B sejt T sejt

az antigénmegjelenése

oldott vagy részecske, sejt felszínén

saját sejtek MHC molekuláihoz kötötten

az antigén natív fehérje peptidekaz antigén természete

natív fehérje, szénhidrát, lipid, stb.

peptidek

ligandum konformációs v.  MHC‐peptid komplexszekvenciális determináns

receptor BCR‐ bivalens TCR ‐monovalens

Nagy fajlagosságú

más sejtek közreműködése

‐ antigén feldolgozó és bemutató sejt (APC)

antigénátalakítás, f ld l á

‐ enzimatikus lebontás,

BCRTCR

antigénfelismerésfeldolgozás peptid szállítás az APC‐ben

koreceptorok CD19, CD21, CD40 CD4, CD8,CD28/CTLA4 TCRCD28/CTLA4

TCR: T-sejt receptor BCR: B-sejt receptor APC: antigén-bemutató sejt

Antigénprezentáció- híd a veleszületett és adaptív immunitás között

Exogén antigének – MHC II – Th sejt aktiváció

Endogén antigének – MHC I – Tc sejt aktiváció

Az adaptív immunrendszer sejtjei- T-sejtek (αβ)- T-sejtek (αβ)

Segítő T-sejtek Ölő T-sejtek Szabályozó T-sejtekSegítő T sejtekCD4+

Ölő T sejtekCD8+

Szabályozó T sejtek

CitokintermelésTh1 IL 2 TNF INF

Vírussal fertőzött,t jt k l títá

nTreg, Tr1, Th3Th1: IL-2, TNFα, INFγ

Th2: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10tumoros sejtek elpusztítása Szupresszáló hatású sejtek

2.1. ábra Az antigének felépítése

Antigén amit az adaptív immunrendszer felismer (antiszomatogén : Detre László)

Immunogenitás - tolerogenitás - antigenitás

3.22. B limfociták membránfehérjéi és funkcióik

Ellenanyagmolekula (antitest, immunglobulin, Ig) általános s erke eteáltalános szerkezete

- kb.160 kDa-os glikoprotein2 kö ű lá (L li ht h i )- 2 könnyű lánc (L light chain)

- 2 nehéz lánc (H heavy chain)diszulfid hidakkal és nem kovalens kötésekkel összekötvenem-kovalens kötésekkel összekötve

- domén szerkezet (Ig domén)- Antigénkötő és effektor régió

Erdei A. (szerk.): Immunológia (Medicina)

10.3. Humán immunglobulinok

Antitest, ellenanyag, immunglobulin (Ig)

14.17. ábra Az ellenanyagok által közvetített effektorfunkciók

13.12. ábra A B és a T-limfociták effektor funkciói

A veleszületett és az adaptív immunrendszert i k j ll őireceptorainak jellemzői

LPS, mannán, tejkolsav, dsRNS

Szolubilis vagy sejtfelszíniSzolubilis vagy sejtfelszíni

Erdei A. (szerk.): Immunológia (Medicina)

A veleszületett és az adaptív immunrendszert i k é jtj i k köl ö h táreceptorainak és sejtjeinek kölcsönhatása

Antigén felismerése

Veleszületett immunsejtekVeleszületett immunsejtek aktiválása

Kostimulátor molekulákKostimulátor molekulák megjelenése, citokinek

termelése, antigén-bemutatásbemutatás

ADAPTÍV immunsejtek jaktivációja

Erdei A. (szerk.): Immunológia (Medicina)