2. 细菌学诊断法是发现牛结核传染源的重要手段和途径，主要包括细菌涂片镜

检、细菌培养试验：

细菌涂片镜检：材料、设备简单，操作方法简便；特异性较差、易出现假阴性

细菌培养试验：周期长，易受杂菌污染

一般只作为牛结核病诊断的辅助方法。

结核菌培养及片段扩增结核菌培养及片段扩增

相关工作

牛 PBMC 细胞形态检测结果

肺泡巨噬细胞抗酸染色结果

• 结果显示，有牛分枝杆菌侵入的肺泡巨噬细胞比例为 7.9% ，胞内出现 5 个以内牛分枝杆菌的肺泡巨噬细胞比例为 5.8% ，出现5-10 个的占 4.6% ，出现 10 个以上的占 1.2% 。

3. 免疫学诊断法 是牛结核诊断方法中应用最广泛，也是目前国内外研究最

多的一类方法。

主要包括：迟发型变态反应、酶联免疫吸附试验 ( ELISA)、 γ- 干扰素试验、免疫层析法（免疫胶体金技术）等。

免疫学诊断法 1. 迟发型变态反应法 目前临床上应用最广泛的方法，也是国际规定测定牛结核病的标

准方法。主要通过两种途径：皮内（为主）和点眼（为辅）。• 优点：方法简单，操作容易，且检出率较高• 缺点：①特异性较差（禽分支、 BCG) ；②滞后效应； ③ 只能用于活体；④假阴性（病情严重）

需要找出一种特异性较高的诊断方法取代 或者辅助该方法的诊断。

结核菌素点眼检查

免疫学诊断法 2. 酶联免疫吸附试验 ( ELISA) 优点：①操作简单，价格低廉，诊断快速 ②对检出重症结核病牛有特殊作用 ③ 可降低非典型分枝杆菌非特异性干扰 ④可避免皮试检测时人为造假影响 ⑤ 方便对野生动物进行结核病的普查 用于 ELISA 的主要诊断抗原： PPD 、 CFP-10 、 ESAT-6 、 MPB70 、 MPB8

3 、 Mce4E 、 RpfC 。使用不同抗原的 ELISA ，其检测的特异性和敏感性不同。

将两种或者两种以上特异性抗原融合蛋白作为牛结核病诊断抗原，在保持高特异性的基础上能大大提高 ELISA 检测牛结核的敏感性。 Aagaard 等使用不同诊断抗原对不同地区的不同牛群检测发现， ESAT-6 与 CFP-10 联合使用在敏感性和特异性上都优于单独使用任一抗原。

抗原 PPDCFP-10

ESAT-6

MPB83

MPB70

CFP-10+ESAT-

6

MPB83+MPB70

特异性%

83.3

100 100 66.7 100 100 83.3

敏感性%

36.4

9.1 9.1 18.2 0 63.6 27.3

迟发型变态反应法与 ELISA 诊断法的比较分析

诊断方法

诊断抗原 基本原理 检出率 特异性

迟发型变态反

应

牛 PPD 主要检测的是机体细胞免疫中的抗

体

在结核病初期和非疫区检出率较高

容易受其他非特异性结核分支杆菌的干扰

ELISA诊断法

ESAT-6 等高特异性蛋白或多种抗原的融合

蛋白

主要检测的是机体体液免疫中的抗

体

在疾病发展的中后期和疫区检出率

高

随着诊断抗原的不断发展，特异性较高

免疫学诊断法

ELISA 与迟发型变态反应相辅相成。在当前实际检疫工作中，采用迟发型变态反应和 ELISA 相结合的方法进行结核病诊断，既有助于提高结核检疫的特异性，又可以大大提高阳性牛的检出率（细胞免疫和体液免疫均可检测）

ELISA 与迟发型变态反应相辅相成。在当前实际检疫工作中，采用迟发型变态反应和 ELISA 相结合的方法进行结核病诊断，既有助于提高结核检疫的特异性，又可以大大提高阳性牛的检出率（细胞免疫和体液免疫均可检测）

免疫学诊断法

原理：致敏的外周血淋巴细胞（ PBL ）在体外培养的条件下，受特异抗原 (如 PPD 或 ESAT-6) 刺激后被活化，并经 16-24 小时的孵育表达并分泌 γ-干扰素，通过一定的技术手段 (ELISA) 对培养上清中的 γ-干扰素进行检测。

目前， IFN-γ 检测方法在许多国家推广使用，且已有检测试剂盒出售。

3. γ- 干扰素诊断法3. γ- 干扰素诊断法

免疫学诊断法3. γ- 干扰素诊断方法3. γ- 干扰素诊断方法

结 果牛结核 PPD 检疫及 IFN-γ 试剂

盒检测结果检疫省区 检测头数 PPD 阳性牛头数( 头 )

PPD 阳性率（ % ）

IFN-γ 检测阳性头数（头）

IFN-γ 阳性牛比例（ % ）

IFN-γ 阳性牛占 PPD

阳性牛比例（ % ）

山东 856 7 0.81 4 0.46 57

宁夏 1063 6 0.56 3 0.28 50

黑龙江 770 3 0.38 2 0.26 66.7

Total 2589 16 - 9 - -

利用建立的牛 γ- 干扰素双抗体夹心 ELISA 技术，建立牛结核 γ- 干扰素检测方法。

这种方法既可以作为特异性强的早期诊断方法，还可以作为自然感染与 BCG 免疫的鉴别诊断方法，从而为高危牛群接种疫苗免疫的可能性奠定技术基础。

免疫学诊断法 判断标准： 阴性结果：在试纸条上只出现一条紫红色的

条带（对照带）（图 A） 阳性结果：试纸条上出现两条紫红色的条带

（检测带和对照带）（图 B） 无效结果：在胶体金试纸条的对照带处不出

现紫红色的条带（图 C）

A B C

免疫胶体金结果示意图

4. 免疫胶体金技术4. 免疫胶体金技术

免疫学诊断法诊断方法 优点 缺点

γ-干扰素诊断法

简单快速，灵敏度和特异性高

成本较高 ；检测过程复杂、对样品的要求也高；假阳性率高

免疫胶体金技术

简便快速，特异性强、敏感性高，肉眼判读，实验结果易保存，无需特殊仪器设备和试剂

起步较晚，胶体金相关的临床诊断试剂盒开发应用的还比较少

PCR 诊断技术 反应灵敏，特异性强

对技术技术质量要求很高；容易受污染出现假阳性；受标本中抑制物质的影响又会出现假阴性；试剂盒缺乏规范化、标准化

γ- 干扰素诊断法、免疫胶体金技术、 PCR 诊断法的优缺点分析γ- 干扰素诊断法、免疫胶体金技术、 PCR 诊断法的优缺点分析

三种方法都有简便快速，特异性强、敏感性高等优点，有很好的应用前景，但技术还不够成熟，试剂盒缺乏规范化、标准化，还需要对这些技术做进一步的研究和完善，并加快试剂盒的研制。

三种方法都有简便快速，特异性强、敏感性高等优点，有很好的应用前景，但技术还不够成熟，试剂盒缺乏规范化、标准化，还需要对这些技术做进一步的研究和完善，并加快试剂盒的研制。

4. 分子生物学检测

• 4.1 牛分枝杆菌基因片段扩增

• 4.2 特异性重组蛋白表达分析

• 4.3 结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌复合群成员的鉴定

利用分子克隆技术，以牛结核分支杆菌标准菌株全基因组为模板体外扩增基因。利用分子克隆技术，以牛结核分支杆菌标准菌株全基因组为模板体外扩增基因。

582bp

MPB70 基因的 PCR 扩增MPB70 基因的 PCR 扩增

2000 bp

750 bp

500 bp

200 bp

100 bp

1 M

1000 bp

MPB83 基因的 PCR 扩增MPB83 基因的 PCR 扩增

600bp600bp

4.1 牛分枝杆菌基因片段扩增

牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的 PCR分型鉴定结果

• M.tb 、 M.bovis 占双阳性牛分离率分别为 22.2% 、 55.6% ；在检测牛中， M.tb 、 M.bovis 的平均分离率分别为 0.073 % 、 0.19% 。

结核菌基因多态性分析

图 5.1 H37Rv 24 个串联重复序列位点分布电泳图M 为 100bpMarker ，其余泳道从左到右依次为 H37Rv 中 24 个 VNTR 位点 PCR 产物的分布情况

结核菌基因多态性分析

图 5.2 临床分离株 FC 24 个串联重复序列位点分布电泳图M 为 100bpMarker ，其余泳道从左到右依次为临床分离株 FC 中 24 个 VNTR 位点 PCR 产物的分布

情况

结核菌基因多态性分析

对临床株基因组 DNA 样品进行 VNTR 的 12 个位点的扩增、琼脂糖电泳，电泳结果反应了临床株在各位点的特异性片段大小。

图 5-8 某临床株 12 个 VNTR 位点扩增图谱， M 为 DL100 的 Marker ， 1-12 所对应的位点以此为 ETR-C 、 ETR-B 、MIRU-26 、 QUB-26 、 Mtub04 、 MIRU-31 、 MIRU-23 、 MIRU-20 、 QUB-11b 、 MIRU-4 、 MIRU-40 、 Mtub21

M 1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10 11 12

MPB70 重组蛋白 Western-Blot 分析 MPB83 重组蛋白 Western-Blot 分析

利用基因重组技术表达牛结核分枝杆菌 Mce4A 、 Mce4E 蛋白和 Rpf 蛋白，并对这三个蛋白进行 Ni-NTA镍柱纯化、透析复性，在体外获得Mce4A 、 Mce4E 蛋白和 Rpf 蛋白。

利用基因重组技术表达牛结核分枝杆菌 Mce4A 、 Mce4E 蛋白和 Rpf 蛋白，并对这三个蛋白进行 Ni-NTA镍柱纯化、透析复性，在体外获得Mce4A 、 Mce4E 蛋白和 Rpf 蛋白。

97.4 kDa

66.2 kDa

43.0 kDa

31.0 kDa

20.1 kDa

M 1 2 3

29KD29KD

26KD26KD

4.2 特异性重组蛋白表达分析

三、 牛结核的防控

• 1. 国外防控措施

• 2. 我国防控现状

1. 国外防控措施

•消灭或控制牛结核病的国家和地区，大多采取检疫、隔离、扑杀相结合的防控策略。

•国外也开展疫苗（主要用于动物）的研发工作。

澳大利亚从上世纪 70年代正式开始牛结核的根除工作，现 已基本根除了牛结核。根除过程中使用的技术措施主要包括：

对“无疫区”、“暂时无疫区”等地区状况和疑似、感染等畜群状况进行了规定，并制定了不同地区间的迁移标准；

检疫过程中主要使用尾根皮肤试验和比较变态反应试验，官方兽医机构对未感染结核病的奶牛颁发合格证；

建立完善的屠宰场检疫体系和动物标识追踪体系；

完善的实验室工作，主要利用细菌培养验证检疫出来的阳性样品。

2. 我国防控现状

•目前主要采取检疫净化(检-淘）的措施。–2000-2007年全国动物结核病防治共检疫监测牛2123.3万头（次），其中奶牛1703.99万头（次），扑杀病畜 4.9万头，其中奶牛4.7万头。

•该防控措施的实施为牛结核病疫情的控制发挥了重要作用。

参加了北京市密云县的结核病牛净化工作。

具体实施方案

健康牛群 :平时加强防疫、检疫和消毒措施，防止疾病传入。

污染牛群 :反复进行多次检疫，不断出现阳性病畜，则应淘汰污染群的开放性病畜及生产性能不好、利用价值不高的结核菌素阳性反应病畜。

结核菌素反应阳性牛群: 应定期与经常地进行临诊检查，必要时进行细菌学检查，发现开放性病牛立即淘汰。

最好对结核菌素阳性牛及时处理，不予保留饲养，根绝传染源。

病牛所产犊牛出生后只吃3～5天初乳，以后则由检疫无病的母牛供养或喂消毒乳。

犊牛应在出生后 1月龄、 3～ 4月龄、6月龄进行 3次检疫，凡呈阳性者必须淘汰处理。如果三次检疫都呈阴性反应，且无任何可疑临诊症状，可放入假定健康牛群中培育。

假定健康牛群：为向健康牛群过渡的畜群，应在第一年每隔 3 个月进行一次检疫，直到没有一头阳性牛出现为止。然后再在一年至一年半的时间内连续进行 3次检疫。如果 3次均为阴性反应即可称为健康牛群。

•防治人结核病的主要措施是早期发现，严格隔离，彻底治疗。牛乳应煮沸后饮用；婴儿普遍注射卡介苗。治疗人结核病有多种有效药物，以异烟肼、链霉素和对氨基水杨酸钠等最为常用。

祝大家工作顺利 !节日快乐！

谢谢大家！