biyotek_i_ders_primer_mets

BİYOTEKNOLOJİ IBİYOTEKNOLOJİ I

2005-20062005-2006

Prof. Dr. Şule ARIProf. Dr. Şule ARI

Mikrobiyal teknoloji ile üretilen ürünler ve biyoteknolojik alanların sınıflandırılması

1) Tüm hücre (Biyomas üretimi)2) Düşük molekül ağırlıklı maddelerin üretimi

a- Primer metabolitlerin üretimib- Sekonder metabolitlerin üretimic- Organik bileşiklerin biyodönüşümü (biyotransformasyon)

• Yüksek molekül ağırlıklı maddelerin üretimiA- PolisakkaritlerB- LipidlerC- Proteinler

4) Genel mikrobiyal metabolizmaya ait proseslera-Atıkların yıkımı/oksidasyonub-Mineral özütlenmesi

M KROB YA L ÜRÜN/SÜREÇ ÖRNEK KULLANIM ALANI

Hücre kitlesi (biyomas) Tek Hücre Proteini Gıda Dü ük molekül a ırlıklı maddeler Primer Metabolitler Gıda, Tıp Ör: Amino asitler Sekonder Metabolitler Tıp, Gıda, Tekstil Ör: Antibiyotikler Metabolik son ürünler Yakıt, Çevre, Kimya Ör: EtOH Biyodönü üm reaksiyonlarıyla Tıp, Kimya üretilen organik maddeler Ör: Steroidler Yüksek molekül a ırlıklı maddeler Proteinler Deterjan, Tekstil, Ör: Enzimler Gıda, Tıp Polisakkaritler Kimya, Gıda, Tıp Ör: Ksantan Atıkların yıkımı/ oksidasyonu Çevre Mineral ekstraksiyonu Madencilik

Mikroorganizmaların ürettikleri Mikroorganizmaların ürettikleri düşük molekül ağırlıklı düşük molekül ağırlıklı

maddelermaddeler

Mikroorganizmaların ürettikleri Mikroorganizmaların ürettikleri düşük molekül ağırlıklı maddelerdüşük molekül ağırlıklı maddeler

ÇOK SAYIDA MADDE

1- 1- Primer metabolitlerPrimer metabolitler

2- 2- Sekonder metabolitlerSekonder metabolitler

3- 3- Biyodönüşüm Biyodönüşüm ( ( biyotransformasyon biyotransformasyon ))

yoluyla metabolizmaları gereği enzimatik yoluyla metabolizmaları gereği enzimatik olarak bir maddeyi benzerine dönüştürmeolarak bir maddeyi benzerine dönüştürme

PRİMER (Birincil) METABOLİTLERPRİMER (Birincil) METABOLİTLER

• Hücre üremesi ve yaşamını Hücre üremesi ve yaşamını sürdürebilmesi için esassiyel sürdürebilmesi için esassiyel metabolitlermetabolitler– Makromoleküllerin yapıtaşları

• Amino asitler• nükleotidler

– Koenzimler– Vitaminler– Temel metabolik yolların ara ürünleri

• Fumarik, sitrik asitler (Ör: krebs devri araürünleri)


• Organizmanın üremesine paralel üretim

• Fazla miktarda üretilmeleri enerji kaybına neden olacağından üretimleri hücrede sıkı biçimde düzenleme altındadır

• Hücrede fazla miktarda üretilmezler

• Üreme durunca sentezleri de durur


• Gerektiği kadar üretimleri– Feed back inhibisyon : son ürün tarafından

anahtar enzimin aktivitesinin kontrolu


– Represyon: son ürün tarafından metabolik yol enzimlerinin sentezinin baskılanması


• Fazla miktarda üretimleri– Mutasyon:Mutasyon: E.coli’de treonin overproduction– Membran geçirgenliğinin bozulması:Membran geçirgenliğinin bozulması:

Corynebacterium glutamicum’da glutamik asit üretimi

– Rekombinant DNA Teknolojisi:Rekombinant DNA Teknolojisi: Önemli enzimlerin klonlanması, fazlaca katkısı yok

PRİMER METABOLİTLER PRİMER METABOLİTLER

AMİNO ASİTLERAMİNO ASİTLER

Glutamik asitGlutamik asit• Endüstriyel olarak üretilen ilk amino asit• Japonya, 1957• Önceleri; asit hidrolizi ile üretim ve D ve L

formların oluşumu• Etanol, organik çözücüler ve bazı

vitaminlerden sonra endüstiriyel olarak üretildi

AMİNO ASİTLERAMİNO ASİTLERGünümüzde amino asitler,

• Fermentasyon

• İmmobilize enzimlerle

üretilir

AMİNO ASİTLERAMİNO ASİTLER• Gıda

– Tat artırıcı Ör. Glutamik asit– Yem katkısı

• Öncül bazı maddelerin sentezi Ör: Aspartam: fenil alanin ve aspartik asitten

üretilir• Enzim eksikliği hastalıklarına bağlı olarak

besinlerden yararlanılamamsı durumunda tedavi amaçlı

Amino asit Dünyada yıllık üretim (ton ) Kullanım alanı L- alanin 130 Tat artırıcı DL-alanin 700 Tat artırıcı L- arginin 1000 njeksiyon, kozmetik L- aspartat 4000 Tat artırıcı, aspartam üretimi L-asparagin 50 Tedavi L- cystein 700 Ekmek katkısı, antioksidan L- glutamat 370.000 Tat artırıcı L- glutamin 500 Tedavi Glysin 6000 Organik sentezi L-histidin 200 Tedavi L-izolösin 150 njeksiyon L- lösin 150 njeksiyon L-lisin 70.000 Yem katkısı, injeksiyon DL- metionin 70.000 Yem katkısı L- metionin 150 Tedavi L- ornitin 50 Tedavi L- fenil alanin 30.000 njeksiyon, tedavi, aspartam

üretimi L-prolin 100 njeksiyon L-serin 50 Kozmetik L-treonin 150 Yem katkısı L- triptofan 200 njeksiyon terapi L-tirozin 100 njeksiyon, L-DOPA sentezi L-valin 150 njeksiyon

AMİNO ASİTLERAMİNO ASİTLER• Yüksek hayvanlardaESANSİYEL AMİNO ASİTLER Lisin, Metionin, Triptofan, Lösin, İzolösin,

Valin, Fenil alanin, Treonin, Arginin sentezlenmez

• Tahıllar– Ucuz A.A. Kaynakları Lisin, Metionin, Triptofan oranları düşükMISIRDA %0.2 lisin, ETTE %2.6

AMİNO ASİTLERAMİNO ASİTLERE.coli’de birçok A.A.’in kontrolü1. Sentezlenmiş enzimlerin aktivitelerinin

kontrolu2. Yeni enzim sentezinin kontrolu3. AttenüasyonENDÜSTRİYEL ÖLÇEK İÇİN ENDÜSTRİYEL ÖLÇEK İÇİN

MİKROORGANİZMANIN ÜRETTİĞİ MİKROORGANİZMANIN ÜRETTİĞİ A.A. MİKTARI YETERLİ DEĞİLDİR !!!A.A. MİKTARI YETERLİ DEĞİLDİR !!!

MİKTARLARI ARTIRILMALIDIR !!!!!MİKTARLARI ARTIRILMALIDIR !!!!!

AMİNO ASİT ÜRETİM YOLLARIAMİNO ASİT ÜRETİM YOLLARI

MEMBRAN GEÇİRGENLİĞİNİN MEMBRAN GEÇİRGENLİĞİNİN DEĞİŞTİRİLMESİDEĞİŞTİRİLMESİ

• Corynebacterium-Brevibacterium

• Biotin açlığı membran geçirgenliğinin artışıglutamat sekresyonu

Biotin:Biotin: yağ asitleri sentez yolu ilk enzimi asetil Co A karboksilazın prostetik grubu


REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİREKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİÖr. Treonin, triptofan üretimindeÇok yararlı değil• Her prototrofta A.A. sentez enzimleri var• Negatif kontrol nedeniyle fazla miktarda

inhibe olmamış enzim miktarının artışına gerek yok

• Sadece enzim değil aynı zamanda prekürsör artışı da gerekli


ENZİMLERLE A.A. ÜRETİMİENZİMLERLE A.A. ÜRETİMİ

L-Aspartik asit Fumarik asit + NH3

aspartaz

1 mM %95

L-Aspartik asit Fumarik asit + NH3aspartaz

2 mM 2 mM

ENZİMLERLE A.A. ÜRETİMİNİN ENZİMLERLE A.A. ÜRETİMİNİN AVANTAJLARIAVANTAJLARI

1. Yüksek miktarda üretim, Kolay elde edilebilirlik

2. Reaksiyon ortamı reaktanları basit, kolay saflaştırma

3. Yüksek verim

4. Küçük fermentasyon kullanımı

5. İmmobilizasyona kolay uygulama


MUTANTLARLA A.A. ÜRETİMİMUTANTLARLA A.A. ÜRETİMİ

Oksotrofik mutantlar

• Metabolik yolda bloke olmuş aşamadan önceki ara ürünün birikimi– Ara ürünün üretimi– Ara ürünün başka bir metabolite

dönüştürülmesi


MUTANTLARLA A.A. ÜRETİMİMUTANTLARLA A.A. ÜRETİMİ

Oksotrofik mutantlarOksotrofik mutantlar• Penisilin seleksiyonu

– Oksotrof seçimi

Ör: arginin oksotrofu seçimi

Mutasyon minimal besiyeri + penisilin

Bölünen hücrelerde hücre duvarı yapımının inhibisyonuprototrofların ölümü

Ölmeyenlerin minimal besiyeri + arginin ortamında seçilmesi


• OKSOTROFİK MUTANTLAROKSOTROFİK MUTANTLAR– Dallanmış yollara ait A.A’ler– Dallanmamış yollara ait A.A.’ler

ÖR: L-Ornitin XX L-sitrullin L-Arginin

L-sitrullin üretimi ile oksotrof seçimi

Ornitin

birikimi


• OKSOTROFİK MUTANTLAROKSOTROFİK MUTANTLAR

DEZAVANTAJLAR:DEZAVANTAJLAR:– Sentez edilemeyen ara ürünün eklenme

zorunluluğu• Maliyet artışıMaliyet artışı• Fazla ilave edilmesi durumunda negatif kontrol Fazla ilave edilmesi durumunda negatif kontrol

nedeniyle sentezin durmasınedeniyle sentezin durması


• REGÜLATÖR MUTANTLARREGÜLATÖR MUTANTLAR– Negatif regülasyon mekanizması bozulmuş Negatif regülasyon mekanizması bozulmuş

mutantlarmutantlar– Ucuz ve kompleks besiyerlerinde üretimUcuz ve kompleks besiyerlerinde üretim– Dallanmış ve dallanmamış yolara ait Dallanmış ve dallanmamış yolara ait

regülatör mutantlarregülatör mutantlar


• DALLANMAMIŞ YOLLARA AİT REGÜLATÖR DALLANMAMIŞ YOLLARA AİT REGÜLATÖR MUTANTLARMUTANTLAR

Regülatör mutantlarda biyosentez yolunun ilk Regülatör mutantlarda biyosentez yolunun ilk kademesini şifreleyen enzim geni değişerek kademesini şifreleyen enzim geni değişerek feed back regülasyona duyarsız (feed back feed back regülasyona duyarsız (feed back insensitif) hale gelirinsensitif) hale gelir

Bu nedenle son ürün veya son ürün Bu nedenle son ürün veya son ürün analoglarının fazla miktarda bulunmaları analoglarının fazla miktarda bulunmaları halinde bile amino asitin fazla miktarda halinde bile amino asitin fazla miktarda üretimi mümükün olurüretimi mümükün olur


• DALLANMAMIŞ YOLLARA AİT DALLANMAMIŞ YOLLARA AİT REGÜLATÖR MUTANTLARREGÜLATÖR MUTANTLAR

Serretia marcescesSerretia marcesces’de ’de prolinprolin overproduction overproduction

1.1. Mutasyonla sentezin ilk kademesini Mutasyonla sentezin ilk kademesini şifreleyen enzim geninin şifreleyen enzim geninin (glutamat kinaz)(glutamat kinaz) değişimi değişimi

2.2. Prolin analogları kullanımıProlin analogları kullanımı3.3. Analog varlığında yabani tiplerin ölümüAnalog varlığında yabani tiplerin ölümü

Analoğun glutamat kinazın allosterik Analoğun glutamat kinazın allosterik yerine ya da regülatör proteine yerine ya da regülatör proteine bağlanması, toksik etki nedeniyle bağlanması, toksik etki nedeniyle amino asit açlığı ve hücre ölümüamino asit açlığı ve hücre ölümü


• DALLANMIŞ YOLLARA AİT DALLANMIŞ YOLLARA AİT REGÜLATÖR MUTANTLARREGÜLATÖR MUTANTLAR– Aspartat familyası a.a’leri (lisin, metionin, Aspartat familyası a.a’leri (lisin, metionin,

treonin, izolösin)treonin, izolösin)– Piruvat familyası a.a’leri (valin, lösin)Piruvat familyası a.a’leri (valin, lösin)– Aromatik aile (triptofan, fenil alanin, Aromatik aile (triptofan, fenil alanin,

tirozin)tirozin)


• DALLANMIŞ YOLLARA AİT REGÜLATÖR DALLANMIŞ YOLLARA AİT REGÜLATÖR MUTANTLARMUTANTLAR– Aspartat familyası a.a’lerinden lisin ve triptofanınAspartat familyası a.a’lerinden lisin ve triptofanın

• PER PER (P(Protein rotein EEfficiency fficiency RRatioatio) ) değeri değeri 0.850.85• %0.004 lisin ve %0.007 triptofan ilavesiyle PER değeri %0.004 lisin ve %0.007 triptofan ilavesiyle PER değeri

2.552.55

– Brevibacterium flavumBrevibacterium flavum’da ’da oksotrofik mutantlarlaoksotrofik mutantlarla lisin overproducer’i lisin overproducer’i 3g lisin/litre, 3g lisin/litre, PROSES PAHALI PROSES PAHALI

– Regülatör mutantlaRegülatör mutantla yolun ilk enzimi asparto yolun ilk enzimi asparto kinazın lisin analoğu S-amino etil sistein (SAEC) kinazın lisin analoğu S-amino etil sistein (SAEC) ile inhibe olmaması sonucu overproducer seçimi ile inhibe olmaması sonucu overproducer seçimi 60g lisin/litre60g lisin/litre

biyotek_i_ders_primer_mets

Documents