위장관 관련 기능성 시험

황인경1, 지근억2

서울대학교 생활과학대학 식품영양학과1, 서울대학교 생활과학대학 식품영양학과2

1. 위장관 기능성의 정의 / 513

(1) 위장관 기능의 정의 ·····················································································513

(2) 위장관 기능 조절의 정의 ···········································································513

(3) 위장 기능 조절의 범위 ·············································································514

(4) 위장 기능 조절 관련 기능성 평가 영역 설정 ········································524

2. 위장 기능 조절 관련 기능성 식품의 바이오마커 개발 / 525

(1) 위장관 기능 조절 관련 바이오 마커의 현황 ·············································525

(2) 위 기능 조절 관련 바이오마커의 개발 ······················································526

(3) 장 기능 조절 관련 바이오마커 개발 ·························································527

3. 위장 기능 조절 관련 기능성평가를 위한 시험법 / 528

(1) 위 소화 기능개선 평가 시험법 ···································································528

(2) 위장 운동 기능의 측정 ············································································531

(3) 위 손상의 개선 ····························································································535

(4) H. pylori와 직접적인 관련이 없는 위 손상의 개선 효능 평가법 ········552

(5) 제산능 ·········································································································562

(6) 장내 균총 개선 ····························································································564

(7) 장손상의 개선 ······························································································568

(8) 배변활동 개선 ······························································································575

4. 위장 기능 조절 관련 기능성 평가 시험법 실험결과 / 580

(1) 위 기능 조절 관련 기능성 평가 실험 결과 ·············································580

(2) 장 기능 조절 관련 기능성 평가 실험 결과 ··············································586

5. 참고문헌 / 592

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1. 위장관 기능성의 정의

(1) 위장관 기능의 정의

가. 위 기능의 정의

위는 위로 들어온 음식물을 기계적 분절작용을 통하여 잘게 부수고 펩신과 염산을

포함한 위액을 분비하여 음식물을 분해시키고 살균한다. 또한 위 점막에서 점액을

분비하여 제산 작용을 하며 연동운동을 통하여 십이지장으로 서서히 배출시켜 담

즙과 췌장액의 소화효소가 음식에 충분히 섞이도록 도와주는 기능을 담당한다.

나. 장 기능의 정의

장의 기능은 소장과 대장으로 나누어 정의를 내려야 하며, 소장에서의 장 기능은

여러 가지 소화효소를 분비하고 활발한 운동을 하여 당질, 단백질, 지방의 모든

소화와 흡수가 이루어지는 것이라 할 수 있고, 대장에서의 장 기능은 소장을 거쳐

온 음식물이 세균총에 의해 분해되고, 수분과 단쇄 지방, 비타민 등의 영양소는

흡수되며 나머지 찌꺼기는 대변으로 만들어 배설하는 것을 의미한다.

(2) 위장관 기능 조절의 정의

가. 위 기능 조절의 정의

우리 나라 뿐만 아니라 미국, 일본, 중국 등 다른 나라에서도 건강기능식품에

‘ 위 기능 조절’ 이라는 항목을 포함시키지 않고 있으며 이에 대한 정의 및 설

명은 아직까지 구체적으로 마련되어 있지 않은 실정이다. 따라서 본 연구에서는

다음과 같이 위 기능 조절에 대한 정의를 내리고자 한다.

즉, 위 기능 조절이란, “ 인체의 위 기능 및 활동이 원활하게 될 수 있도록 유지,

촉진, 개선시키는데 유용한 효능을 나타내는 작용” 이다.

나. 장 기능 조절의 정의

또한 장 기능 조절에 있어서는 다음과 같이 정의를 내리고자 한다. 즉, 장 기능

조절이란, “ 인체의 장운동 및 배변활동을 유지, 촉진하고 소화, 흡수를 개선하며

정장작용을 유지하도록 유용한 효능을 나타내는 작용” 이다.

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(3) 위장 기능 조절의 범위

가. 위 기능 저하와 관련된 요인

위 기능 및 활동이 원활하게 될 수 있도록 유용한 효능을 나타내는 작용의 의미

에는 위 기능이 저하되는 것을 막아주며, 기능의 저하가 있는 경우 이를 개선시

켜 주며 유지시켜준다는 의미가 포함되어 있다. 물론 건강기능식품이 질환에 직

접적인 영향을 발휘하는 식품은 아니지만, 위 기능 조절의 범위를 설정하기에 앞

서 위 기능의 저하를 가져오는 대표적인 질환 및 증상을 알아보고 이를 바탕으로

적절한 범위를 구분 짓는 것이 바람직하다.

이와 함께, 위 기능 저하 및 위 관련 질환과 매우 밀접한 관련이 있는 병원미생

물인 Helicobacter pylori 또한 위 기능 조절과 관련하여 중요한 요인이다.

우선 위 기능의 저하와 관련된 대표적인 질환인 위염 (급성위염, 만성위염), 소

화성 궤양, 기능성 위장 질환에 대해서 알아보겠다 (대한소화기학회, 1998; 고려

의학 편집부, 1999; 박경남 et al., 2001; 대한소화기학회, 2002).

위염 (Gastritis)

① 정의

위염은 위점막에 염증세포의 침윤이 있는 급성 또는 만성염증의 상태로 노화,

다양한 외부인자에 대한 비특이적인 반응으로 나타나는 증상이다.

② 분류

임상적으로 위염은 크게 급성위염과 만성위염으로 나뉘어 진다.

급성위염 (acute gastritis)

급성위염은 대개 약물이나 화학물질의 복용으로 인한 급성 손상으로 점막의 출혈

성 미란이나 궤양을 동반하는 경우로 손상이 미약할 때에는 완전 재생이나 회복

이 가능하나, 아주 심한 손상의 경우 치명적일 수 있다. 급성위염이 내시경 생검

의 대상이 되는 경우는 아주 드물지만 크게 다음과 같이 세 가지 유형이 있다.

- 급성출혈성 위염

아스피린, 소염제, 스테로이드 등의 약물, 스트레스, 뇌손 상이나 수술 등

에 동반되는 쇼크에 의해서 일어난다.

- H. pylori에 의한 위염

감염초기에 일시적으로 나타나며 내시경이나 조직학 적인 특징을 찾기가 어

렵지만 상피의 변성, 점액손실, 세포 탈락 등이 동반된 다. 급성기가 지나

면 결국 만성활동성위염으로 진행한다.

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- 급성화농성 위염

화농균에 의한 병변으로 위벽의 농양을 만드나 위점막은 비교적 정상으로 남아

있다.

만성위염 (chronic gastritis)

만성위염은 위의 만성적 염증으로 위점막에 나타나는 염증세포의 출현, 상피세포

의 파괴 또는 구조적인 변형의 유무 및 체부와 전정부 선의 위축의 유무가 특징

이다.

만성위염의 병인은 아직 불투명하지만 H. pylori 감염에 의한 만성위염이 가장

흔하다. 하지만 조직학적 검사에서 항상 H. pylori를 검출할 수 있는 것은 아니

며 H. pylori가 검출되었다고 모두 H. pylori위염이라고 할 수는 없다. 만성위염

의 증상으로는 복부 팽만감, 오심, 구토, 가슴앓이, 상복부동통 등이 있다.

소화성 궤양 (Peptic ulcer)

① 정의

위십이지장 궤양은 소화성 궤양으로 총칭되고 있다.

위액 중에 함유된 위산이나 pepsin에 의한 자기소화에 의해 위벽의 조직결손을

말하는 것으로 점막 조직을 지나 밑에 있는 조직까지 손상을 입는 질병을 말한

다. 그리고 점막층내에 저류한 결손은 통상미란 (erosion)이라고 칭한다.

② 분류

소화성 궤양에는 급성 궤양과 만성 궤양이 있으며 Table 1과 같은 차이가 있다.

Table 1. 급성 궤양과 만성 궤양의 차이

급성 궤양 만성 궤양

원 인 명료 불명

증 상 극심 완만

재 발 (-) (+)

치유 기간 단기 장기

부 위 체부, 전정부 위각부

수 다발 단발

형 부정형 원형

궤양의 심도 얕음 깊음

추벽 집중 별로 없음 많음

출 혈 많음 별로 없음

Ref) 고려의학 편집부(1999)

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③ 병인

발병 인자에는 신경성, 체액성 조절을 받아서 복잡하게 관련되어 있으며 일반적

으로 소화관벽에 대한 공격인자와 방어인자의 균형 붕괴, 공격인자측이 강하게

된 때에 궤양이 생긴다. 또한 최근에는 H. pylori에 의한 감염이 주목되고 있

다.

④ 증상

특이적인 증상은 없지만 공복시 통증이 약 50%에서 나타난다. 십이지장 궤양에

서는 야간에 통증이 심하고 음식물 섭취로써 통증이 경감한다.

기능성 소화불량

① 정의

기능성 소화불량 (functional dyspepsia)이란 조직 병리적 및 생화학적 이상에

의한 기질적 (organic) 병변이 아닌 기능적 (functional) 소화불량을 말한다.

흔히 우리나라에서는 음식을 섭취하고 대변이 무르거나 설사를 할 경우에 소화

가 안 된다고 한다. 그러나 의학적으로는 지속적이거나 반복적으로 상복부에 국

한된 불편감이나 통증 등에 따르는 제반 현상을 소화불량 (dyspepsia)이라고 하

며, 여러 가지 증상이 포함된 질환으로써 한 가지 원인이나 병인으로 설명될 수

없는 복합적인 질환을 총칭한다.

외국의 역학조사에 따르면 유병율이 약 20-30%에 달하며, 1년에 1% 이상의 발생

율을 나타내는 매우 gms한 질환이다. 소화기계통의 질병이 많고, 특히 위장질환

의 발생빈도가 높은 우리나라에서는 대부분의 사람에게서 정도의 차이가 있겠으

나 소화불량의 증상을 경험하리라 추측된다. 최근 방사선 검사 및 내시경 검사

등에 의해 기질적 병변이 비교적 쉽고 간단하게 진단 가능하게 됨으로써 이러한

기질적 병변이 아닌 기능성 병변에 대한 관심이 고조되고 있다. 학자에 따라서

본 질환의 어휘뿐 아니라 증상에 따른 아형 분류의 종류, 분류 기준 등에 아직

도 이견이 있으며, 병인도 다양하게 제시되고 있으나 어느 하나 정설이라기 보

다는 하나의 가설로 받아들여지고 있다. 기질적 병변을 배제한 증상에 따른 진

단이므로 진단기준에도 논란의 여지가 있으며, 치료 또한 증상의 완화목적을 위

한 치료가 주종을 이루며 병인에 따른 원인적 치료는 연구단계에 불과하다.

② 한국에서 기능성 소화불량의 아형 분류

한국에서 기능성 소화불량의 아형을 분류하여 보고자 41개 대학병원 및 종합병

원에서 다기관 연구를 시행하였다. 상부소화관 내시경 검사 또는 방사선 검사를

통해 기질적 병변을 배제하여 기능성 소화불량으로 진단된 1025명 (남자 346명,

여자 679명, 평균나이 43세)을 대상으로 하였다. 가장 흔한 증상은 식후 불쾌감

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이나 포만감이 84.0%로 가장 많았으며, 상복부 팽만감, 트림, 조기 만복감, 식

후 상복부 통증, 상복부 속쓰림 순이었다.

증상에 따라 궤양성 소화불량, 운동이상성 소화불량, 역류성 소화불량, 비특이

성 소화불량의 4군으로 분류하였는데, 운동이상성 소화불량이 74%, 궤양성 39%,

역류성 13%, 비특이성 아형이 14% 이었다. 33%의 환자에서는 두가지 이상의 아

형에 속하는 증상을 갖고 있었다.

이상의 결과로써 구미지역에서는 궤양성 아형이 제일 많은데 비하여, 한국에서

는 기능성 소화 불량증중 운동이상성 아형이 가장 흔하였다.

③ 발병 기전

기능성 소화불량의 발병기전은 아직까지 정확히 밝혀져 있지는 않으나, 여러 가

지의 원인 인자가 제시되고 있다. 현재까지 제시된 중요한 인자들을 살펴보면 다

음과 같다.

- 위장 운동의 이상 : 기능성 소화불량증의 주원인

- 위산

- 헬리코박터 감염

- 내장과민성

- 스트레스

④ 치료의 문제점

기능성 소화불량은 뚜렷한 기질적 병변이 없이 여러 가지 다양한 소화불량 증상

에 의한 진단이기 때문에 치료 또한 단순하지가 않다. 대부분의 증상이 호전과

악화를 반복하며 음식, 스트레스 등에 의해 변화가 심하므로 임상적으로 효과 판

정이 어렵다. 더욱이 위약만을 투여하더라고 13-73%에서 증상의 호전이 있을 수

있으므로 어떠한 치료가 의의있게 효과 있는지를 판단하는데 애로점이 많다.

현재 이러한 기능성 위장질환을 치료하기 위한 방법으로는 약물이 쓰이고 있는데

위산분비 억제제 및 제산제, 위장운동 촉진제, 내장 진통약물 등이 사용되고 있다.

Helicobacter pylori와 위장 질환

1983년 호주의 Warren과 Marshall에 의해 만성위염 환자의 위생검조직에서 처음

으로 분리된 이후, H. pylori는 만성 위염을 비롯한 각종 위, 십이지장 질환들의

원인균으로 제기되고 있으며 국내외 보고에 의하면 만성 위염환자의 70-90%, 위

궤양 환자의 57-90%, 십이지장 궤양 환자의 80-90%에서 위전정부에 H. pylori가

발견된다고 한다. 지난 10여년간 이에 관한 많은 연구가 이어졌으며, 심지어

1996년부터는 ‘ Helicobacter pylori’ 라는 영문 잡지까지 발간되고있는 실정이

다.

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① H. pyloei와 만성 위염

Strickland와 Mackay는 만성 위염을 해부학적 부위와 원인에 따라 A형과 B형으로

분류한 바 있다. B형 위염은 전정부에 흔히 발생하며 위궤양환자의 70%, 십이지

장 궤양환자의 90%에서 동반되는데, B형 위염은 H. pylori 감염과 관련이 깊다고

알려져 있다.

Warren과 Marshall은 대개 만성 위염환자의 70%, 활동성 위염환자의 90% 이상에

서 H. pylori가 발견되었다고 보고한 바 있다. 그러나 소화불량증세와 조직학적

인 위염간에 연관이 그다지 없으며, H. pylori 박멸 치료 후에 조직학적으로 위

염이 호전되더라도, 증세의 호전과 반드시 일치하지 않는다는 점에서 조직학적인

위염의 임상적 의의는 아직 분명하지가 않다. H. pylori 연관 만성 위염환자에서

H. pylori 연관 만성 위염환자에서 H. pylori균의 박멸을 위한 항생제 투여는 아

직 정립되지 않았다.

② H. pylori와 소화성 궤양

H. pylori는 소화성 궤양의 병인에 중요한 원인 인자로서 인정받고 있으며 H.

pylori 양성률은 십이지장 궤양의 90% 이상, 위궤양에서는 70% 정도로 보고되고

있다.

H. pylori가 위, 십이지장 점막에 집락을 형성하여 염증을 일으키면, 가스트린과

위산분비가 증가되며, 점막상피세포에서 점액의 생성이 저하되고 다형핵 백혈구

의 침윤과 분비되는 여러 인자들에 의해 점막손상을 받게 된다. 특히, 십이지장

궤양은 거의 대부분 위전정부에 위염을 동반하여 위전정부와 십이지장의 위상피

화생 부위에서 H. pylori가 발견된다. 즉, H. pylori 감염이되면 증가된 위산에

의해 십이지장에 위상피화생이 생기게 되고, 이곳에 H. pylori가 집락을 형성하

게 되어 염증이 생기고, 전술한 과정을 거쳐 궤양이 발생한다고 알려져 있다. 그

러나 H. pylori 연관만성위염에서 위산분비에 관한 연구는 보고자마다 그 결과가

다양하며 박멸요법 후에도 산분비 연구 결과가 일관되지 못하여 궤양발생에는 여

러 요인들이 관여하리라 생각된다.

③ H. pylori와 위암

최근까지 H. pylori 감염과 위암 발생과 관련이 있음을 주장하는 여러 보고들이

이어졌고, International Agency for Cancer Research에서는 H. pylori를 발암원

으로 분류하기에 이르렀다. H. pylori의 감염에 의해 초래되는 만성 위축성 위염

과 장상피화생은 위암의 전구성 병변으로 알려져 있으며, 반드시 그렇지는 않지

만, 높은 위암 발생율을 보이는 나라에서의 H. pylori 감염 빈도가 대체적으로

높게 보고된다. 현재까지 H. pylori 감염이 위암의 발생에 관여하는 데에는 몇

가지 기전이 제시되고 있는데, 첫째는 감염이 세포의 재생을 증가시켜서 세포분

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화과정에 돌연변이가 생길 수 있으며, 둘째, 염증반응으로 인해 생성된 유기 산

소기는 강력한 돌연변이성 물질이며, 셋째, 계속적인 염증상태가 DNA에 손상을

초래하여 재생능력을 둔화시켜 돌연변이가 생길 수 있다고 주장하고 있다. 그러

나 위암 발생에 있어서 H. pylori가 중요한 역할을 할 것으로 생각되나 그 기전

에 관해서는 추후 지속적인 연구가 필요하다.

④ 치료

H. pylori는 in vitro 상의 감수성 검사에서 대부분의 항생제에 민감하나 생체에

사용할 경우 항균 효과가 떨어져서 항 H. pylori 효과가 뛰어난 bismuth 제제나

강력한 산분비 억제제인 omeprazole 등을 항생제와 서로 병합한 다양한 종류의

투약이 시행되고 있다. 이러한 치료로 H. pylori 연관 위염이 동반된 소화성 궤

양 및 비궤양성 소화불량증 환자에서 H. pylori를 박멸함으로써 증상 및 조직학

적 소견의 호전과 궤양의 재발이 감소되었다는 많은 보고가 있다. H. pylori의

박멸 요법의 치료 성적 보고들을 종합해보면, bismuth, amoxicillin 및

metronidazole 등을 병합한 삼제 요법이 가장 우수한 치료로 알려져 있으며 약

80-93%의 박멸율을 보고하고 있다. 그러나 이 삼제 요법은 63.2%까지도 보고되는

약제의 부작용과 metronidazole 내성균주가 문제점으로 제기되고 있다. 약제의

부작용으로는 오심이 가장 흔하며 이외에도 설사, 구토, 쓴맛 등이 있다.

재발 여부의 추적검사는 대개 1년 후 평가하며 외국의 재감염율은 보고자에 따라

0-35%로 다양하다. 특히, H. pylori 감염율이 높은 국내에서는 치료 후 재감염율

을 줄이기 위한 예방의학적 대책이 필요하며, 백신 개발을 위한 연구가 필요하다.

나. 장 기능 저하와 관련된 요인

장 기능 조절 관련 건강기능식품과 관련지을 수 있는 대표적 증상 및 질환은 다

음과 같은 것이 있다. - 증상 : 장 기능이 원활하지 못할 때에는 소장과 대장의

운동성이 저해되고, 장 점막이 손상되며 염증이 나타나고 장내 균총이 균형을 잃

는 등의 현상으로 복통, 배변에 곤란을 겪거나 설사를 일으키고 결국에는 영양

불량으로 이어질 수 있다

- 질환 : 위와 같은 증상이 심각해지면 질병으로 발전하게 되는데, 소장질환에는

고창, 흡수 불량증, 지방변증, 유당불내증, 글루텐과민장질환, 열대성 스프루

등이 있고, 대장질환에는 변비, 게실증, 게실염, 치질, 설사 (감염성, 비감염

성) 등이 있으며, 소장과 대장 모두에서 일어나는 질환에는 장염 (크론병, 궤양

성 대장염, 베체트병)이 있다 (고려의학 편집부, 1999; 박경남 편저, 2001; 대

한소화기학회, 1998; 대한소화기학회, 2002; 서울대학교 의과대학, 1997; 이상

인 et al., 1999).

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소장질환

① 고창 (Flatulence)

소장 내 가스는 주로 N2, O2, H2, CO2, CH4 로 구성되어 있고 정상적인 소장은 매

일 7-10L의 가스를 처리한다. 이중 대부분이 혈액으로 재흡수되고 약 600mL 의

가스만이 100mL/hr 이하의 속도로 부지불식간에 배출되는데, 혈액으로 재흡수되

고 남은 가스의 양이 600mL을 초과할 경우를 가리킨다. 소장 내에 가스가 차는

것을 느끼는 것은 음식을 먹거나 음료수를 마실 때 공기를 삼키는 공기연하증

(aerophagia) 때문일 수 있는데, 이 가스의 대부분은 위장으로부터 배출되고 아

주 작은 양만이 결장까지 간다. 직장 내 N2와 O2의 농도가 높은 것은 공기 연하증

에 의한 것이고, H2와 CO2의 농도가 높은 것은 박테리아의 발효가 지나치게 증가

한 때문이다.

② 흡수불량증

장은 영양소의 소화와 흡수에서 중요한 역할을 하므로 장질환은 여러 영양소의

결핍을 초래 한다. 흡수불량증은 췌장과 간, 담낭질환 및 소장의 염증, 절제로

인한 흡수면적의 감소 등으로 인한 정상적인 영양소의 흡수가 되지 않는 것을 총

칭한다.

흡수불량증에는 지방 흡수불량, 당질, 단백질 흡수불량, 비타민 B12 흡수불량이

있다. 일반적인 증상으로는 체중이 감소되고, 설사 특히 지방변이 흔하다. 무기

력해지며 나이아신, 비타민 B12, 엽산, 철분겹핍으로 설염이 발생하고 나이아신과

리보플라빈의 결핍으로 구순구각염, 단백질 결핍시에는 부종, 칼슘과 비타민 D

흡수불량시에는 골다공증과 골연화증이 발생한다. 또한 철분이 결핍되면 소적혈

구성 빈혈, 엽산과 비타민 B12 결핍시에는 대적혈구성 빈혈이 오고 비타민 K 결핍

으로 출혈이 있다.

③ 글루텐과민 장질환 (Gluten-sensitive enteropathy)

글루텐 과민성 장질환은 일명 만성소화 장애증(celiac disease) 혹은 비열대성

스프르 (nontropical sprue)라고 불리며 식품 중 글루텐(gluten) 단백질 내에 있

는 gliadin 부분이 소장 (특히 duodenum 이나 proximal jejunum) 점막을 손상시

켜서 융모의 손실을 초래함으로써 영양소 흡수에 장애가 생기는 만성질환이다.

④ 열대성 스프루 (Tropical sprue)

특정한 박테리아에 의해 장이 감염되어 수반되는 급성 감염성 설사의 후유증일

수도 있다. 영양결핍은 감염성 물질에 대한 장점막의 민감성을 증가시킬 수 있

다. 비열대성 스프루와 같이 소장 점막이 짧아지지만 점막세포의 변화는 그다지

크지 않다. 위의 점막은 염증이 있어서 염산과 내인성 인자의 분비가 감소되어

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비타민 B12 흡수가 저하되고 엽산 결핍증이 나타난다. 증상은 야맹증, 설염, 구내

염, 구각증, 창백, 부종과 같은 영양결핍 증상뿐만이 아니라 설사, 식욕감퇴,

복부팽만이 나타나고 또한, 엽산, 비타민 B12 결핍으로 인한 거대적아구성 빈혈도

있다.

⑤ 유당불내증 (Lactose intolerance)

유당불내증은 장점막에 있는 이당류 가수분해효소 중 lactase의 결핍이 그 원인

이다. Lactase 결핍은 유전적이거나 후천적인 퇴화, 이차적인 결핍 등의 원인이

있다. 출생 시부터 lactase가 결핍되어 있거나 출생 시에는 lactase가 정상이었

지만 이유 후 우유 섭취량의 감소로 인하여 lactase가 퇴화된 경우도 있고, 장절

제나 점막손상으로 일시적인 결핍을 보이기도 한다. 성인의 경우는 대부분이 후

천적이다. 증상으로는 부종, 고창, 경련, 설사, 구토가 발생하나 lactose 섭취를

중단하면 이들 증상은 없어진다.

대장질환

① 변비 (Constipation)

변비는 결장안에 대변이 오랜 시간 머물러 있는 경우를 말한다. 대변은 음식을

섭취하고 보통 12-72시간 후에 배설되는데 음식의 내용에 따라, 개인에 따라 배

변시간에 차이를 보인다. 변비를 정의하기 위한 객관적인 판정으로는 1주일 동안

세 번 이하로 배변할 때, 3일 이상 배변하지 않을 때, 한 번의 배변량이 35g 이

하일 때 등이 있지만 개인마다 다르다. 하루에 두 서너번 배변하여도 그 양이 적

고 대부분의 변이 장내에 남아 있어서 만족스럽지 않으면 변비라 할 수 있고,

2-3일에 한 번 배변해도 기분 좋게 배변되어 이것이 습관화되면 변비라 할 수 없

다.

일반적으로 변비의 형태에는 기능성 변비와 기질성 변비가 있으며 이완성 변비, 경

련성 변비, 배변 장애성 변비는 기능성 변비에 속하고, 장관의 협착, 종양이나 장

형태의 이상(긴 S상 결장증, 거대 결장증)으로 인한 것은 기질성 변비에 속한다.

② 궤양성 대장염 (Ulcerative colitis)

궤양성 장염은 대장 점막에 궤양이나 염증이 생긴 만성질환으로 주로 직장에서

시작된다. 그 원인은 잘 밝혀져 있지 않지만 일반적인 원인으로는 유전적인 요

인, 세균성 감염, 영양소 결핍, 특히 고생물가의 단백질 결핍, 면역적 요인 등이

있다. 궤양성 대장염은 20-40세에 가장 흔히 발생하며, 일반적인 증상은 직장 출

혈, 설사, 열, 식욕감퇴, 탈수, 체중감소, 대장 점막의 궤양, 전해질 불균형, 영

양불량 등이고, 혈액손실로 인한 빈혈이 나타날 수 있다. 또한 이 질환을 가진

환자들은 흔히 우울하고 신경질적이며 정서불안이다.

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③ 게실염 (Deverticulitis)

저섬유소식 (조섬유 0-4g/d)으로 발생한다. 오랜기간 섬유소 섭취량이 적으면 장

내 변의 양이 감소되고 따라서 장관이 지름이 적어져 장내의 압력이 커지면 장의

분절 운동이 항진되어 장이 작은 외형 점막 주머니, 즉 게실을 형성한다. 이 게

실은 주로 S상 결장에서 발견되는데 많은 게실이 존재 할 때는 다발성 게실증이

라고 한다. 게실 내에 변이 축적 되면 가끔 장염을 일으키며 때로는 궤양과 천

공까지 나타나는데 이것이 게실염이고 이 경우에는 수술이 필요하다. 게실증 환

자의 10-15%가 게실염으로 진단된다. 증상으로는 복부팽만, 복통, 설사, 변비,

식욕부진, 메스꺼움 등이 있고 화농으로 발열이 있거나 누관, 출혈이 있을 때는

약물치료와 수술을 요한다.

④ 치질 (Hemorrhoids)

치질은 항문 괄약근 주위의 혈관이 파열되어 발생한다. 정맥이 항문관(canal)이

나 항문구멍 (orifice)으로 돌출된 것을 내부치질이라 하고, 외배엽 기관의 피부

가 변형되는 것을 외부치질이라 한다. 치질은 변비, 하제, 관장제의 계속적인 사

용, 임신시에 나타나며 때로는 뚜렷한 이유없이 발생할 수도 있다.

⑤ 설사

많은 액성변이 빠른 속도로 배설되는 것을 설사라고 하며 대개 배변 횟수의 증

가, 대변의 수분 포화도 증가, 장운동의 증가를 말하는데, 가장 객관적인 평가는

대변 무게를 측정하는 것으로 정상인에서는 대변을 하루 100-200g 정도로 보나,

설사를 하는 경우에는 대개 하루 대변량이 250g 이상이 된다. 환자가 호소하는

설사의 의미는 연변을 하루에 한번씩 보는 경우, 변이 굳으면서도 하루에 몇 번

씩 보게 되는 경우 등 개인에 따라 다르다. 설사는 감염성 설사와 비감염성 설사

로 나누어 볼 수 있다.

감염성 설사 (급성 설사): 감염성 설사로는 Rotavirus 등에 의한 바이러스성 설

사, Shigella, Salmonella, Vibrio, Campylobacter jejuni, E. coli, Yersinia

등에 의한 세균성 설사와 기생충에 의한 설사가 있으며, 오염된 식수나 음식을

섭취함으로써 발생한다. 이 경우 설사가 심하고, 복통, 구토 등의 증상을 일으키

며, 발열, 경련 등의 전신 증상을 동반할 수 있다. 대변에서 원인이 되는 균을

배양하여 진단하고, 일부 균에서 항생제 치료를 한다.

비감염성 설사: 비감염성 설사의 원인은 4가지로 분류할 수 있는데 흡수가 잘 안

되고 삼투압이 높은 물질이 장내에 많이 나타났을 경우 (osmotic diarrhea), 장

점막의 투과성의 이상, 정상이온흡수 기전의 억제, 장운동 이상이 있을 때 나타

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난다. 비감염만성 반복성 설사로서 임상에서 가장 보는 것이 과민성 대장 증후군

(IBS) 이다. IBS 이외의 기타 비감염성반복성 만성 설사는 대개가 우리나라에서

그리 흔하지 않은 것들이다. IBS는 장기의 조직학적 이상이 없고 장의 자극 증상

군 (운동기능의 항진)이 계속하거나 간헐적으로 나타나는 것이고 장의 자극증세가

3개월이상 지속되어야 비로소 IBS라고 할 수 있다. 주 증상은 복통과 설사이다.

소장, 대장질환 : 염증성 장질환

염증성 장질환은 장에 발생하는 원인 불명의 만성적인 염증을 뜻하며 통상적으로

특발성 염증성 장질환인 궤양성 대장염과 크론병을 지칭하지만 우리나라에 비교

적 흔한 장형 베체트병도 이에 속한다고 할 수 있다.

① 궤양성 대장염 (Ulcerative colitis)

궤양성 대장염의 육안적 소견은 점막의 부종, 발적, 출혈, 미란 및 궤양을 특징

으로 하며 대부분의 예에서 직장을 침범하고 병변이 직장으로부터 연속하여 나타

나는데, 약 3/4의 예에서는 좌측 대장, 나머지에서는 전체 대장을 침범한다. 대

장의 점막에 국한된 염증이 특징이며 상피세포가 손상됨에 따라 선와내로 중성구

를 포함하는 염증세포가 누출되는 선와농양이 흔히 관찰된다. 주 증상은 혈성 설

사와 복통이며 점액질이 분비되거나 후중증 (tenesmus)이 나타날 수 있고, 발열,

체중 감소 등의 전신 증상이 동반되는 경우가 있다. 증상의 정도는 병변의 범위

와 염증의 정도에 의하여 좌우되며 흔히 관해와 악화를 반복한다.

② 크론병 (Crohn disease)

크론병은 입으로부터 항문에 이르기까지 위장관 어디에서나 생길 수 있으나 회맹

부에 특히 호발 하며 병변은 비연속적, 비대칭적, 다발성으로 발생할 수 있다.

현미경적인 염증은 장의 전 층을 침범하며 육아종성 병변이 흔히 관찰된다. 크론

병의 주 증상은 수양성 설사와 복통이며 혈변은 흔하지 않다. 상당수의 환자에서

항문주위의 열상 또는 누공을 동반되며, 장관 협착 또는 누공에 의한 증상도 비

교적 흔하다. 체중감소 또는 발열 등의 전신증상이 궤양성 대장염에 비하여 흔하

며 임상 경과도 불량하다. 복통은 식후에 심하며, 복부종괴 특히 우하복부 종괴

가 흔하다.

③ 장형 베체트 병 (Intestinal behcet's disease)

장형 베체트병은 복통과 설사등을 보이며 비특이적인 반복하여 재발하는 만성

염증성 질환으로 종종 출혈과 천공을 일으키며 치료에 잘 반응하지 않고 경과가

불량하다.

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(4) 위장 기능 조절 관련 기능성 평가 영역 설정

가. 위 기능 조절 관련 기능성 평가 영역

위 기능 조절 관련 기능성은 다음과 같이 크게 두 가지 범주로 나누어서 평가하

고자 한다.

위 소화기능의 개선

위장의 소화 작용은 화학적 소화와 기계적 소화로 나눌 수 있다. 화학적 소화는

소화 효소의 활성에 의한 음식물의 화학적 분해로 이루어지면, 기계적 소화는 소

화관의 운동에 의한 음식물의 분해 및 이동으로 이루어진다.

그러므로 위장의 소화 기능을 개선하는 효능을 평가하기 위해서는 소화 작용의

두 가지 측면을 모두 고려해야 한다. 따라서 효소를 함유한 건강기능식품의 소화

기능 개선 효과를 평가하기 위해 소화 효소의 활성을 측정해야 하며, 소화 불량

의 주원인인 위장 운동 기능 저하와 관련하여 소화관의 운동 기능을 개선하는

효과와 소화 불량 증상의 개선 효과를 평가해야 한다.

위 손상의 개선

앞에서 살펴본 위 기능 관련 질환 및 증상은 Helicobacter pylori가 크게 관여한

다. 1983년 활동성 만성 B형 위염 환자의 위점막에서 처음 분리된 이후 H.

pylori는 위염, 위십이지장궤양, 위암, 위림프종의 원인으로 대두되고 있다.

이러한 H. pylori에 의한 병독인자로는 편모 (fragella), 요소분해효소(urease),

γ -glutamyl transpeptidase (GGT), cytotoxin-associated gene A(cagA)와

vacuolating cytotoxin (VacA), leucine aminopeptidase와 같은 조직분해효소 등

이 있다고 보고되고 있다 (서울대학교 의과대학, 1997; 박경남 편저, 2001; 대한

소화기학회, 2002). 또한 이러한 H. pylori 뿐만 아니라 위산과다, 스트레스,

NSAID (non-steroidal anti-flammatory drug) 등의 약물 등도 위 기능을 저해하

거나 위손상을 일으킬 수 있다 (대한소화기학회, 2002; 서울대학교 의과대학,

1997; 이상인 et al., 1999). 따라서 위 기능 조절 관련 기능성 평가 범위를 다

음과 같이 두 영역으로 설정하였다.

- H. pylori와 직접적인 관련이 있는 위 손상의 개선

- H. pylori와 직접적인 관련이 없는 위 손상의 개선

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나. 장 기능 조절 관련 기능성 평가 영역

장 기능 조절에서는 다음과 같이 크게 세 가지 영역으로 나누어 기능성을 평가하

고자 한다.

장내 균총 개선

장내에는 수많은 세균들이 서로 공생 또는 길항관계를 유지하며 장내 균총을 구

성하고 있고 이들이 장관 내에서 생성해낸 여러 가지 대사 산물들은 숙주의 영

양, 생리작용, 발암, 노화, 면역 등에 크게 영향을 미친다.

장 운동 장애와 장 손상으로 인한 설사의 개선

설사의 원인은 다양하지만 이 중 장의 운동 저하와 장염 등과 같은 장내 손상으

로 인한 것이 큰 비중을 차지한다.

쾌변

기능성 장 질환, 게실염, 심리적 불안, 대장 통과시간 지연 등으로 인해 현대인

들은 시원하게 배변활동을 하지 못하는 경우가 많다.

2. 위장 기능 조절 관련 기능성 식품의 바이오마커 개발

(1) 위장관 기능 조절 관련 바이오 마커의 현황

바이오 마커라는 개념이 식품의 기능성 평가법에 도입된 것은 최근이다. 식품이

갖는 생체 조절 기능이 많은 주목을 받고 있지만 식품성분은 여러 성분의 복합체

이기 때문에 과학적으로 기능성을 평가하는데 어려움이 있어 객관적으로 손쉽게

측정할 수 있는 바이오 마커의 개발은 다음에 국한되어져 있다. acrolein에 의한

면역학적 기법을 통한 지질과산화물 바이오 마커의 개발 (Uchida et al., 1998),

advanced glycation end products (AGE) 화합물을 통한 당뇨병 합병증의 개발

(Oya et al., 1998), Methyglyoxal을 이용한 당뇨병 발생의 바이오마커 개발

(Ueno et al., 1999), 8-hydroxy-2-seoxyguanosine (8-OG-dG)를 이용한 암의 바

이오 마커 개발 (Hattori et al., 1996)등이다. 소화관 기능 조절 관련 바이오마

커에 대한 연구는 ACS (Adenoma- Carcinoma Sequence)와 de novo colorectal

carcinoma의 경로에 관한 바이오 마커로 immuno histomistry를 통한 BGP

(Brain-type Glycogen Phosphorylase)의 개발 (Tashima et al., 2000), 위종양에

대한 바이오마커로 immunoperoxidase assay를 이용한 mAbDas-1의 개발 (Fayyaz

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et al., 2001), 대장암에 대한 바이오 마커의 개발 (Dolara et al., 2000; Park

et al, 2002) 등이 최근에 연구, 개발되고 있지만 위암이나 대장암 이외에는 아

직까지 뚜렷한 위 기능 조절 관련 바이오 마커가 개발되어 있지 않은 상태이다.

따라서 위 기능과 연관되어 위 손상을 초기에 손쉽게 알 수 있는 바이오 마커의

개발이 필수적이라고 할 수 있다.

(2) 위 기능 조절 관련 바이오마커의 개발

가. 13C 요소호기 검사

시험시작 전의 선별검사 및 2주째, 4주째의 효과 판정검사로 13C 요소호기 검사를

시행한다. 4시간 이상 공복을 유지한 후 13C 요소 75mg을 적당량의 물에 섞어 마

시게 하는데 마시기 직전과 마신 후 30분에 날숨 (호기)을 모아 호기 중의 13CO2

의 농도 변화 (△13CO2)가 4%이상일 때 H. pylori 양성으로 판정한다.

나. 향후 가능성 있는 바이오 마커

다음에 제시하는 바이오 마커의 경우는 건강기능식품에 적용가능한지에 대한 여

부와 신뢰성 및 적합성에 대해 좀더 구체적인 실험 및 연구가 필요한 향후 가능

성 있는 바이오 마커들이다.

Serum pepsinogen (PG) I 과 PG II ratio 측정

PG I level이 <30㎍/L이거나 PG I: PG II ratio 가 < 3.0 이면 위염의 바이오 마

커로 사용 가능하다. 위염일 경우 PG I의 감소, PG II의 증가, 그 ratio의 측정

으로 위염을 진단할 수 있다. 위염일 경우 PG I의 감소가 관찰되며 H. pylori에

의한 위염일 경우 PG II의 증가가 현저히 나타난다. 따라서 PG I 과 PG II의

ratio의 감소로서 위염 판별의 바이오 마커로 활용할 수 있다.

Stool 속의 H. pylori cagA/vac A genes 감별

H. pylori 주요 박테리아 독성 marker로 피험자들의 stool속의 액포가 있는 독성

vac cytotoxin-associated gene product인 cag A를 사용할 수 있다.

세 가지 reference H. pylori strain인 cag A+, vac A s1/m1; cag A+, vacA

s1a/m1; cag A+, vacA s2/m2이 PCR assay에 positive control로서 사용된다.

fecal specimen에서 genomic DNA를 extraction하여 cloning하기 위한 PCR ampli-

cation을 거쳐 DNA sequence 분석을 한다.

따라서 stool 속에 있는 H. pylori 박테리아의 cagA와 vac A gene의 s, m frag ment의

genotyping을 함으로써 H. pylori 감염여부를 진단할 수 있는 바이오 마커가 된다.

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(3) 장 기능 조절 관련 바이오마커 개발

가. MPO (Myeloperoxidase) activity

MPO는 중성구에 풍부하게 존재하는 효소로서 중성구가 활성화되면 분비가 증가되

므로 조직의 염증 정도를 나타내는 양적 지표로 사용될 수 있다. 따라서 장손상

동물 모델에서 바이오마커로 유용하게 사용되고 있다. 대조군에 비하여 유의하게

낮은 수치를 나타내면 효과가 있다고 판정한다.

나. 변의 중량과 수분량

변이 비정상적으로 습기가 없으면 전체 질량이 작고, 수분량도 작아지며 대게 변

비 증상을 나타낸다. 또한 수분이 너무 많으면 설사라고 표현하고, 전체 질량과

수분량이 매우 증가한다. 따라서 변의 중량과 수분량을 측정함으로써 간단하게

쾌변을 위한 기능성 식품을 평가할 수 있다.

다. 향후 가능성 있는 바이오마커

다음에 제시하는 바이오 마커의 경우는 건강기능식품에 적용가능한지에 대한 여

부와 신뢰성 및 적합성에 대해 좀더 구체적인 실험 및 연구가 필요한 향후 가능

성 있는 바이오마커 들이다.

ESR (Erythrocyte Sedimentation Rate) : 적혈구 침강 속도

항응고제가 포함된 전혈을 수직으로 세우면 적혈구의 rouleaux 형성(초기 10분),

일정 속도 침강(40분), RBC packing(10분)의 과정을 거쳐 혈장으로부터 적혈구가

밑으로 가라앉는다. 1시간 후 맨 위 눈금에서 적혈구가 침강한 곳까지의 길이를

mm로 표시한 것이 ESR이다. 염증, 조직손상으로 인해 α -2, β , γ -globulin, 섬

유소가 증가하면 ESR이 증가하게 된다. 따라서 장에 염증이 발생하였을 경우에

대조군에 비하여 유의적으로 높은 값을 나타낸다.

CRP (C-Reactive protein)

Human CRP는 monoclonal anti-CRP antibodies로 coating된 latex particles에 응

집을 보이는데 이를 552nm에서 측정한다. CRP는 염증성 또는 조직 붕괴성 질환의

존재 여부와 그 중등도 판정, 경과 관찰 및 예후 판정에 유용하다. 성인의 경우

< 0.5 mg/dl이면 정상이며, 종양, 염증, stress시 증가하기 때문에 장염의 활성

도를 반영할 수 있는 지표로 사용되고 있다.

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IgG 농도

O'Mahony 등은 활동성 만성 염증성 장질환이 있는 환자에서 장세척액의 IgG의 농

도를 ELISA법으로 측정하였을 때, 대조군에 비해서 유의한 증가가 있음을 보고한

바 있다. 따라서 IgG 농도는 장염증 여부를 판단하는 데에 유용한 지표로 사용될

수 있는 가능성이 많다.

Cytokine

호중구는 혈류를 타고 염증 부위에 이른 다음 혈관 내피 세포벽 사이의 틈을 통

해 혈관 밖으로 빠져 나와 장이 점막과 점막 하층으로 모여든다. 일 부의 호중구

는 장 상피세포 사이의 간격을 통해 장의 내강으로까지 이동하기도 하는데 이렇

게 하여 관찰되는 것이 음와 농양 (crypt abscess)이다. 호중구를 끌어 모으는데

중요한 역할을 하는 것으로 IL-8이나 TNF-α 와 같은 친염증성 cytokine이 있다.

호중구와 같이 장점막으로 모여든 염증 세포들은 또한 각종 cytokine들을 분비하

여 염증 반응을 더욱 증폭시킨다. 이와 반대로 소염성 cytokine인 IL-10은 염증

반응을 억제하고 장 상피세포층의 견고함을 유지시켜 주는 방향으로 작용한다.

Cytokine들은 ELISA법으로 정량할 수도 있고, 대장 점막에서 RNA를 추출하여

cytokine mRNA의 발현을 RT-PCR로 정량할 수도 있다. 단, cytokine 농도는 혈청

내의 농도를 측정한 것인지 혹은 국소 조직에서의 농도를 측정했는지에 따라 다

른 결과를 얻을 수 있고, 조직 전체를 사용했는지 혹은 특정 세포를 분리해서 실

험 했는지 등에 따라 다른 결과를 얻을 수 있다. 따라서 cytokine만으로 판단하

기에는 무리가 있다.

3. 위장 기능 조절 관련 기능성평가를 위한 시험법

위장관 기능 조절과 관련된 기능성 평가 시험법은 위 기능과 장 기능으로 구분하

였고 각 기능에 있어서 시험관 시험 (in vitro), 동물시험 (in vivo), 인체시험의

세 부분으로 나누어 제시하고자 한다.

(1) 위 소화 기능개선 평가 시험법

가. 위 소화기능의 개선

위 소화기능 개선 평가에서는 시험관 시험을 통해 효소식품의 효소 활성도를 평

가하고 동물과 인체 시험을 통해 위장 운동 기능 개선 효과를 평가하고자 한다.

그리고 인체 시험에서 소화 기능의 저하와 관련된 기능성 소화불량의 대표적인

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증상인 식후 불쾌감, 포만감, 상복부 팽만감, 트림, 조기 만복감, 식후 상복부

통증, 상복부 속쓰림의 개선 효과를 평가하여 위의 소화 기능의 개선과 유지 효

과를 보고자 한다.

가. 효소식품의 효소 활성도

α -amylase 활성 평가

① 시료 5.0g을 정확히 측량하고 pH 5.2 완충액에 녹여 100mL로 한 다음 여과하

여 조효소액으로 사용한다.

② 1% 가용성 전분액(pH 5.2)을 기질로 하여 조효소액 1mL를 가한 후 40℃에서

30분간 반응시킨다.

③ 1N-acetic acid로 반응을 정지시킨다.

④ 0.005% KI+I2 용액 10mL를 넣어 발색시키고 660nm에서 흡광도를 측정하여 공

시험차를 뺀 후 시료 g당, 분당 분해된 starch를 μ g으로 표시하여 α

-amylase 활성도를 나타낸다.

⑤ starch 함량은 상기 동일한 KI+I2 용액의 정색에 의한 검량선으로 산출한다.

Β -amylase 활성 평가

① 시료 5.0g을 정확히 측량하고 pH 4.8 완충액에 녹여 100mL로 한 다음 여과하

여 조효소액으로 사용한다.

② 0.5% 가용성 전분액 (pH4.8) 1mL와 조효소액 1mL를 가한 후 30℃, 30분간 반

응시킨다.

③ DNS시약 3mL를 취하여 반응을 정지시킨다.

④ 반응을 정지시킨 후 5분간 중탕하여 550nm에서 흡광도를 측정하고 공시험차를

후 시료 g당, 분당 분해된 maltose를 μ g으로 표시하여 β -amylase 활성도를

나타낸다.

Protease 활성 평가

① 시료 5.0g을 정확히 측량하고 pH 7.0 완충액에 녹여 100mL로 한 다음 여과하

여 조효소액으로 사용한다.

② 2% Casein 용액(pH 7.0)을 기질로 하여 조효소액 1mL를 가한 후 30℃, 20분간

반응시킨다.

③ 0.4M TCA로 반응을 정지시킨다.

④ 반응을 정지시킨 후 0.4M Sodium carbonate solution과 Folin solution을 넣 어

20분간 발색시킨 후 660nm에서 흡광도를 측정하여 공시험차를 뺀 후 시료 g당,

분당 생성된 tyrosine을 μ g 으로 표시하여 protease 활성도를 나타낸다.

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⑤ Tyrosine 함량은 상기 동일한 0.4M Sodium carbonate solution과 Folin

solution의 정색에 의한 검량선으로 산출한다.

◎ 참고 : 김석신 et al., 1999; 김종국 et al.,1990; 김창수 et al., 1988; 이은

주 et al., 2001; 조영수 et al., 1996)

나. 소화불량 개선능

기능성 소화불량의 경우 인체시험을 통해 평가한다는 것이 무리일 수도 있으나

시험관 시험이나 동물시험 보다는 가장 근접하게 접근할 수 있는 방법이라 사료

되어 설정하였다.

실험대상자 선정조건

① 식후 만복감/포만감/불쾌감, 상복부 팽만감, 상복부 이물감, 조기 만복감, 구

역, 구토, 식욕부진 등의 증상 중 최소한 2개 이상의 증상이 중등도 (2점)이

며, 총점의 합이 6점 이상이며 소화불량 증상이 1개월 이상이고, 주된 증상이

통증이 아닌 경우로 한다.

② 상부위장관 내시경 또는 상부위장관 조영술검사에 기질적 병변 (종양, 소화성

궤양, 미란성 위염, 역류성 식도염)이 없으며, 일반혈액검사와 생화학검사에

서 임상적으로 특이 소견을 보이지 않는 보이지 않는 대상자를 선정한다.

증상의 정도 (4단계)

① 0점 : 증상이 없는 경우

② 1점 : 경증 (mild) - 의사가 문진에 의해 상기시켜 줄 경우 환자가 증상이 있

다고 느끼는 정도이며, 치료가 요구되지는 않는 경우

③ 2점 : 증등증 (moderate) - 환자가 증상을 느끼지만, 정상적인 일상 활동에

거의 지장이 없는 경우 ④ 3점 : 중증 (severe) - 환자가 증상을 느끼면서,

정상적인 일상 활동에 방해를 받는 경우 ⇒ 증상의 정도 중 1, 2점에 해당하

는 경우만 실험대상자로 선정함.

제외 기준

① 소화불량 주 증상이 통증인 경우

② 소화불량 증상이 배변 후 없어지거나 배변의 딱딱한 정도나 빈도와 관련이 있

는 경우 (과민성 장 증후군)

③ 부분 위절제술, 소대장 절제술을 포함한 위장관 수술을 받은 경우

④ 실험 결과에 영향을 줄 수 있는 기타 다른 중대한 질환을 앓고 있는 경우

⑤ 임신부, 수유부 등은 제외

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방 법

① 대상자 선정 방법: 환자 기초 정보, 소화기 증상, 상부위장관 내시경 검사 또

는 상부위장관 조영술, 혈액검사, 요검사, 활력징후, 신체검사 실시하여 선정

기준에 적합한 대상자를 판단한다.

② 배정 방식: Double-blind placebo-controlled study를 원칙으로 한다.

③ 투여 방법: 적정량의 시료를 총 28일간 경구 투여한다.

④ 종료 시 평가 항목: 소화기 증상, 중도 탈락 여부, 이상 반응 발생 유무, 시

료투여에 대한 순응도 및 전반적인 평가를 실시한다.

⑤ 유효성 평가: 기능성 소화 불량증에 수반되는 8가지 증상 (식후 만복감/포만

감/ 불쾌감, 상복부 팽만감, 트림, 조기 만복감, 상복부 이물감, 구역, 식욕

부진, 구토)의 총 증상 점수 개선 정도와 개별 증상들의 호전 여부를 분석하

고 연구자에 의한 전반적 평가를 다음과 같이 실시한다.

- 투여 종료 시 증상의 총합이 투여 전에 비해 75% 이상 감소 한 경우:

Excellent (매우 유효)

- 50% - 75% 감소 한 경우 : Good (유효)

- 25% - 50% 감소 한 경우 : Moderate (약간 유효)

- 0% - 25% 감소 한 경우 : Poor (효과 없음)

⑥ 유효성 판정: 5% 유의수준 하에서 대조군보다 유의적인 효과가 입증될 경우

기능성이 있는 것으로 판정한다.

◎ 참고 : 손정일, 2002; 최명규, 2000; 최명규 et al., 1998; 한요셉 et al.,

2003)

다. 보조시험 항목

- 평가시험항목으로 가능성은 있지만 재고(再考)되어야 하는 항목이다.

- 재고 이유 : 기능성 소화불량과의 적합성 및 식품에서의 적용 가능성 때문이다.

- 따라서 차후에 실질적인 실험을 통해 고려해 볼 소지가 있다.

(2) 위장 운동 기능의 측정

가. 동물 시험

Physiograph는 혈압, 맥박, 근전도 등의 생체신호를 전기적신호로 변환시켜 종이

에 기록하는 장치로서 실험동물을 이용한 실험에 이용된다. 동물을 대상으로 위

장 운동 기능을 측정하기 위해서도 physiograph를 사용한다 (김주헌 et al.,

1999; 임승욱 et al., 1993; 홍남두 et al., 1989).

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위 평활근의 운동성 측정

① 각 군마다 5마리의 Sprague Dawley Rats을 타격에 의해 실신시킨 후 즉시 위

를 적출하여 위저부의 평활근 절편 (8×2mm)을 분리한다.

② 각 10mL Kreb 용액을 담은 실험용기 내에 고정한다.

③ 95% 산소와 5% 이산화탄소의 혼합가스를 공급하면서 37℃로 항온 유지시킨 후

Grass 생리 기록기 (Physiograph)를 이용하여 위 평활근의 등장성 수축력

(isometric contraction)을 측정한다.

④ 시료에 대한 반응은 2mg tension으로 1시간 동안 incubation 시킨 후 시료를

원하는 농도로 투여한 뒤 수축력의 증가율을 계산한다.

나. 인체 시험

위장 운동 기능의 측정과 관련된 인체시험은 여러 방법들이 있지만 아직까지는

건강기능식품의 “ 위 소화 기능의 개선” 효과와 관련하여서는 구체적인 시험법

이 마련되어 있지 않고 적합성 여부에 있어 논란이 많아 차후 실질적인 실험을

통해 다시 한번 고려해 보아야 할 것이다.

우선 위장 운동 기능 측정 검사의 장단점을 비교하여 다음과 같이 정리하였다.

위배출 (gastric emptying) 검사

① 신티그래피 위배출검사 (Scintigraphic gastric emptying time)

이 검사법의 원리는 방사선 동위원소를 부착한 표준식을 환자가 먹은 후 위 내

에 남아 있는 방사선 동위원소량을 시간에 따라 신티카메라로 측정하여 위배출

을 계산하는 것이다.

신티그래피 위배출검사는 시간에 따른 위배출량을 정확하게 정량할 수 있고, 사

용하는 방사선양이 적어 안전하고 방법이 표준화되어 있으므로 위배출을 평가하

는 gold standard method로 되어있다. 그러나 표준식의 구성이나 표지자 (pell-

et, 계란 흰자위)의 종류나 촬영방법 등에 따라 검사실 마다 정상치가 다를 수

있다.

음식은 위저부에서 전정부로 이동하므로 (뒤에서 앞으로 이동) 신티카메라로 얻

은 전면상은 후면상보다 측정값이 높게 된다. 이러한 조직감쇄를 보정하기 위해

측면상의 값을 참조하거나 기하학적 평균을 구하여 계산해야 한다. 신티그래피

위배출검사의 단점은 신티카메라가 고가이며 이를 설치할 공간과 유지할 기사가

필요하다는 점이다. lag phase와 t1/2를 정확히 구하기 위해서는 장시간 많은

횟수의 촬영이 필요하다는 점은 국내에서 널리 사용되지 못하고 있는 이유인데

2시간과 4시간의 촬영만으로도 정확하게 평가하는 shortcut method를 국내에 도

입할 필요가 있다.

- 533 -

② 간접적 위배출검사

위에 남아 있는 표준식의 양을 직접 측정하지 않고 위에서 배출된 후 소장에서

흡수되어 혈액이나 환자의 호기로 배출되는 표지자의 양을 측정하는 간접적인

위배출검사도 임상에서 유용되고 있다. acetaminophen 위배출검사가 초기에 개

발되었지만 유동식의 위배출 검사에만 가능하므로 널리 사용되지 않고 있다. 최

근에 들어 13C-substrate를 이용한 위배출검사가 개발되어 있으며, 13C-acetate

는 유동식의 위배출로 13C-octanoic acid는 고형식의 위배출검사의 표지자로 사

용된다. 이들 13C-substrate는 소장에서 빠르게 흡수되므로 간에서 산화되어 호

기로 배출되는 13CO2 양을 측정하여 위배출을 계산하는 방법이다. 13C가 방사선이

없는 안정된 동위원소이므로 임신부나 아이들에게도 검사를 시행할 수 있으며

표준식을 먹인 후 환자의 호기만 모으면 되는 단순한 검사여서 중환자나 병실에

서도 가능한 장점이 있다. 13C-octanoic acid breath test는 신티그래피 위배출검사와 비교적 일치하는 결

과를 보고하고 있어 임상에서 널리 사용될 가능성을 가진 검사법이다. 그러나

이들 간접적 위배출검사법은 표지자가 위에서 배출된 후 소장에서 흡수되고 간

에서 대사되어야 하므로 흡수장애가 있거나 만성 간질환이 있는 경우는 정확성

이 떨어질 수 있으며, 13C를 측정하는 isotope mass spectrometry가 비싸다는 단

점이 있다.

③ 기타 위배출 검사법

초음파를 이용한 방법은 전정부의 용적을 측정하여 위배출을 계산할 수 있으나

고형식의 평가에는 곤란하다. 또한 의사가 장시간 측정해야 하므로 연구목적으

로 많이 사용되나 임상적으로 널리 이용하기 어렵다. 최근에는 doppler 초음파

를 이용한 transpyloric flow를 측정하는 시도가 이루어지고 있으나 그 정확성

과 임상적 응용에는 좀 더 연구가 필요하다.

CT, MRI를 이용하여 위의 용적변화를 계산하는 방법이 최근 3차원재구축이 용이

해지면서 위배출검사로 소개되어 있으나 아직 고가이며 그 정확성이 입증되어

있지 않아 주로 연구목적에만 사용되고 있다. 그 외에 applied potential

tomography, impedence, axial force catheter 등이 위배출검사법으로 보고되어

있으나 널리 사용되고 있지 않다.

위배출검사는 위운동이상질환이 의심되는 환자를 평가하는데 일차적으로 중요한

검사이다. 그러나 위배출의 정도와 임상증상간의 상관관계가 꼭 일치하는 것은

아니며, 당뇨병 환자에서 보듯이 빠른 유동식배출과 고형식의 배출지연이 한 환

자에서 관찰되기도 한다.

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위전도

위전도 (electrogastrography)는 비침습적으로 위의 전기적인 활동을 장시간 기

록하는 방법이다. 최근에 들어 filter가 개발되고 Fourier transformation 등의

분석기법이 발달하여 복벽 위에 전극을 부착하여 위의 서파를 기록할 수 있게 되

었다. 건강인에게 위전도를 시행하여보면 공복 시에 분당 3회의 위서파가 규칙적

으로 나타나며 식사 후에는 분당 3회의 위서파의 amplitude가 증가된다. 분당 3

회인 정상 위서파가 소실되거나 tachygastria 또는 arrhythmia로 대치되거나 식

사 후에 amplitude의 증가가 없는 경우를 이상소견으로 분류한다. 이러한 위전도

의 이상소견들은 여러 위운동이상질환에서 관찰되며 이상소견이 위배출검사와 유

의한 상관관계를 보이고 있어 위 운동이상의 선별검사법으로 유용할 것이라는 보

고가 많다. 위전도는 방법이 간단하고 방사선이 없어 매력적인 검사이지만 위전

도에 기록되는 위서파가 위의 수축운동과 일치되는 것은 아니며, filter나

Fourier transformation 등의 복잡한 분석기법을 통해 얻어지는 위서파의 기록이

얼마나 정확한 가에 대해서는 아직 논란의 여지가 있다. 또한 위전도가 정상 소

견을 보일 때에도 위운동이 정상이라고 단정지을 수 없으므로 널리 임상에 이용

되기에는 한계가 있다.

위소장내압검사 (Antroduodenal manometry)

위소장내압검사는 연구목적으로 주로 사용되는 검사지만 다음 경우에는 임상적으

로 유용하다. 첫째, 운동이상의 원인이 myopathy인지 neuropathy인지의 감별을

위해, 둘째, 전신성 질환의 위장관 침범을 평가하기 위해, 셋째, 치료방법의 선

택을 위해 (예: 위마비증에서 비경구 영양 수액 공급을 결정), 넷째, 기계적 폐

색의 진단, 다섯째, 운동이상이 위나 소장의 원인인지, 양 장기에 같이 병발되어

있는지를 구별하기 위해 사용된다.

위소장내압검사는 정상소견과 운동이상의 잔단기준이 잘 확립되어 있다.

Myopathy의 진단은 위전정부 수축압이 50mmHg 미만이거나 소장 수축압이 20mmHg

이하인 경우이며, Neuropathy는 공복시의 MMC 주기가 소실되거나, 식사 후 정상

적인 fed pattern이 나타나지 않거나, 식사 후 90분 이내에 공복 시에만 보이는

MMC 주기가 나타나는 경우, MMC phase 3의 전파가 제대로 되지 않는 경우가 관찰

되면 진단할 수 있다.

위소장내압검사는 장시간의 검사시간이 소요되며, 침습적인 방법으로 환자에 고

통을 주고, 내압검사관을 위치시키는 데 방사선 조사가 필요하다는 단점이 있으

나 위장관의 신경-근육계의 기능을 평가할 수 있는 가장 좋은 검사법이다. 그러

나 실제 임상에서 이 검사가 반드시 필요한 경우는 많지 않다.

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기타 검사법

환자의 문진과 이학적 검사에서 자율신경계의 이상이 의심되는 경우 (예: 기립성

저혈압)에는 자율신경계의 검사가 환자의 진료에 도움이 될 수 있다. 몇 가지의

신경과 질환은 위장관운동 이상을 동반한다는 것을 항상 염두에 두어야 한다. 예

를 들면 Parkinsonism에서 근신경계의 침범이라든가, multiple sclerosis,

Shy-Drager's disease 등을 들 수 있다. 위장관운동 조절중추의 이상으로도 위장

관운동이상이 동반될 수 있으므로 중추신경계의 이상이 의심되는 경우에서는

brain MRI 등을 시행하여 원인을 찾기도 한다. 폐소세포암에 동반하는 paraneo-

plastic syndrome의 하나로 위의 운동이상이 초기 증상으로 나타나기도 하므로

중년의 애연가인 남자 환자가 심한 체중감소가 있으면서 위운동이상이 동반된 경

우에는 ANNA (anti-neuronal nuclear antibody Ⅰ)의 측정이나 흉부 CT가 진단에

도움이 될 수 있다(이상인 et al., 1999).

(3) 위 손상의 개선

가. 일반적인 항균 활성 시험법

식물 추출물의 항균력 측정

① Agar dilution법

생약재에 대한 항균력은 agar dilution법에 의해 측정할 수 있다. 즉 생육배지

에 각 시료를 적당 농도로 희석하여 petri dish 상에 부어 굳힌 후 액체 배지에

서 배양된 균액 1백금이 취하여 도말한다. 적당한 온도와 시간에서 배양한 후

균의 생육을 관찰하여 생육이 관찰되지 않은 가장 낮은 생약농도를 최소 억제

농도 (minimum inhibitory concentration, MIC)로 정한다.

② 탁도법

탁도법에 의한 항균활성은 초기 균수에 의해 최소저지농도가 달라지므로

3-4×106 정도의 균수가 권장된다. 따라서 시험 균주를 활성화시킨 후 일정 농도

가 되도록 균수를 희석하여 일정한 균수를 접종 배양하면서 균이 생육되지 않는

시간까지 O.D를 측정한다. 이 때 시료의 색에 의해 위양성을 나타낼 수 있으므

로 시료의 농도를 가능한 낮게 하며 시료별 대조를 각각 사용하여야한다. 반드

시 배양이 종료되면 희석하여 평판배지에 도말하여 콜로니를 계수한다.

최소 살균 농도 시험

액체배지 희석법의 대조 시험관액 0.001mL를 평판에 도말하여 배양한다. 하루밤

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배양한 후 콜로니를 계수한다. MIC를 시험하고 난 시험관 중 세균증식이 거의 없

는 시험관의 배양액 0.1mL를 각각 평판배지에 접종하여 하룻밤 배양한다. 집락이

대조집락의 0.1% 이하인 시험관의 항균제 농도가 최소살균농도 (minimum bacter-

icidal concentration, MBC)이다.

MIC와 MBC의 차이가 큰지 적은지에 따라서 항균제를 정균성 (bacteriostatic)과

살균성 (bactericidal)으로 나눈다. 살균성인지 정균성인지는 항균제의 종류, 배

양시간, 시험 세균의 균종에 따라서 달라진다. 살균성 항균제의 MIC와 MBC가 32

배 이상의 차이를 보일 때 그 세균은 tolerance가 있다고 한다.

한천희석법 (agar dilution)

한천희석법은 액체배지 희석법보다 많은 균주를 시험하기에 편리하고, 오염 유

무와 감수성이 다른 변이 세균의 혼합 유무를 알 수 있으며 재현성이 높다.

① 항균제 희석

항균제 용액은 희석액으로 희석하여 mL당 2000, 1280, 160 및 20ug의 용액을 제

조하고, 이것으로 중간 농도인 1280-2.5ug/mL의 용액을 제조한다. 이 용액 2mL

와 배지 18mL의 비율로 섞어서 평판 배지 1매를 만든다. 시험할 세균이 많을 때

는 비례로 항균제 용액과 배지의 양을 증가하면 된다. 통상 검사를 위한 경우에

는 극히 적은 오차를 허용되므로 항균제 용액과 배지의 비를 1:100 또는 1:1000

으로 하면 간편하다.

② 배지

신속히 증식하는 호기성 혹은 통성 혐기성 세균을 시험하기 위해서는 Mueller

Hinton agar를 사용한다. 영양요구도가 큰 세균을 시험하기 위해서는 영양요구

성분을 첨가한다. 혈액을 첨가하면 novoviocin이나 nafcillin 등 단백결합력이

큰 항균제의 MIC는 달라질 수 있다.

필요한 양의 배지 (100mm의 plate 1개당 20mL가 편리함)를 나사마개 용기에 넣

고 가압 멸균하고 50℃로 식힌 후에 항균제 용액을 넣어 잘 섞는다. 혈액을 넣

는 배지는 항균제를 넣고 섞은 다음에 혈액을 넣고 페트리에 붓는다. 배지의 pH

는 7.2-7.4가 되어야 한다. 배지가 고화된 후에 냉장보관한다. 비닐 주머니에

넣으면 4℃에 1주일 간 보존할 수 있다. 그러나 정확한 실험을 위해서는 24시간

이내에 사용하여야 한다.

③ 접종

탁도계를 이용하여 1×108-5×107 CFU/mL가 되게 배양한다. 이 균액을 다시 식염

수나 Mueller-Hinton broth를 써서 1:20으로 희석한다. 0.001-0.002mL의 백금

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이를 써서 점상으로 접종한다. 항균제 농도가 낮은 배지로부터 접종한다. 항균

제가 들어 있지 않은 대조 배지 각 1매에는 항균제가 첨가된 배지에 접종 전과

후에 접종하여 충분한 세균이 있는지, 오염균이 없는지를 확인해야 한다. 접종

한 배지는 접종액이 완전히 흡수될 때까지 놓아 두었다가 35℃에서 호기적 환경

에서 배양한다. CO2 환경에 배양하면 pH가 내려가므로 결과가 부정확하다.

디스크 확산법 (Disk diffusion test)

항균제가 들어 있는 종이 디스크를 세균이 접종된 배지의 표면에 놓는다. 건조된

디스크는 물을 흡수하고 항균제가 녹아서 배지 중으로 퍼지게 된다. 디스크에서

멀어질수록 항균제 농도가 낮아지는 농도 경사가 이루어진다.

배양을 하면 접종된 세균은 배지 중의 항균제 농도가 증식을 억제하지 못하는 곳

에서만 자라게 된다. 즉 디스크 바로 곁의 농도에 의해서도 증식이 억제되지 않

으면 억제대가 전혀 생기지 않으며, 낮은 농도의 항균제에 의해서도 억제되는 세

균은 큰 억제대를 나타내게 된다. 따라서 억제대의 지름과 그 세균에 대한 MIC와

는 역상관계를 보인다. 증식이 느린 세균은 빠른 세균보다 더 큰 억제대를 보이

게 되므로 시험할 수 없다. 원래 이 방법은 증식이 빠른 균들을 대상으로 실험한

다. 억제대의 크기는 또한 약제의 확산성에 따라서도 달라지므로 종류가 다른 항

균제들에 의해서 생긴 억제대의 크기를 가지고 그 항균제들의 항균력의 우열을

비교할 수는 없다.

① 디스크 중의 항균제 농도

디스크 중의 항균제 농도를 정할 때는 높은 농도에 의해서만 증식이 억제되는

균주도 10mm 정도의 억제대를 나타내고, 감수성이 큰 균주라도 30mm 이상의 너

무 큰 억제대를 만들지 않는 농도를 선택하여 정하게 된다.

② 배지

제조 lot에 따라서 성능이 다를 수 있으므로 참조 균주를 시험하여 억제대가 허용

범위에 들어야 하고 배지의 pH는 실온에서 7.2-7.4이어야 하며, 배지는 약 4mm

의 두께가 되도록 하기 위하여 100mm 페트리 접시에 25-30mL를 붓는다. 제 조된

배지는 냉장고에 보관하되 1주일 이상 보관할 때는 비닐 주머니에 넣어서 마르

지 않게 한다. 배지를 사용하기 전에 항온기에 넣어서 표면의 수분을 말린다.

③ 항균제 디스크의 보관

디스크는 2-8℃ 냉장고나 -14℃ 이하에 보관한다. 사용 중인 디스크는 1주일간

은 냉장고에 보관해도 된다. 냉장했던 디스크는 이슬이 맺히는 것을 막기 위해

실온에 1-2시간 두었다가 용기를 열어야 한다. 디스크 놓는 기구는 탈습제와

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함께 뚜껑이 꼭 맞는 용기에 보관해야 한다. 유효기간이 지난 디스크는 사용하

지 말아야 한다.

④ 접종

보관 균주를 계대 배양하여 활성화시킨 후 백금이나 백금침으로 채취하여 5mL의

액체배지에 접종한다. 37℃에서 배양하여 O.D가 0.6이 될 때까지 배양하여 식염

수나 정해진 완충용액에 희석하여 직접 도말하거나 0.6% soft agar 5mL에 균 배

양액 1.0mL를 혼합하여 plating한다. 3-5분 동안 말리고, 15분 이내에 디스크

를 놓는다. 디스크는 접시 가장자리에서 15mm 이상 떨어져야 한다. 억제대가 중

복되지 않게 놓으려면 100mm 이상 떨어져야 한다. 억제대가 중복되지 않게 하려

면 100mm 접시에는 4-5개, 150mm에는 12-13개의 디스크를 놓을 수 있다. 핀셋

끝으로 디스크를 눌러서 배지표면에 접촉시킨다. 디스크를 놓은 15분 이내에 3

5℃ 항온기에 배양한다. CO2 항온기에 배양해서는 안된다.

⑤ 판독

16-18시간 배양 후에 억제대의 지름을 caliper를 사용하여 mm 단위로 측정한다.

해석기준의 동심원 본(template)을 쓸 수도 있다. 집락이 서로 붙거나 거의 붙

을 정도로 자라야 한다. 첨가물을 넣지 않은 배지는 페트리접시 뒤쪽에서 측정

한다. 반사하지 않는 검은색 배경에 접시를 놓고 45℃ 각도로 조명한다. 혈액이

든 배지의 억제대는 배지 표면에서 잰다. 세밀히 관찰하거나, 투과광선이나 확

대경을 써야만 관찰되는 미세한 집락은 무시한다. 내성을 판독할 때는 투과광선

을 쓰고, 미세한 집락이 있으면 내성으로 판단한다. 억제대 안에 큰 집락이 섞

여 있는 것은 내성 변이주이거나 오염균이므로 동정과 감수성 검사를 다시 실시

한다.

⑥ 해석

억제대의 지름을 해석표의 기준에 따라서 감수성 (susceptible), 내성 (resi-

stant), 중간 (intermediate) 또는 중등도 감수성 (moderately susceptible)으

로 해석한다.

- 감수성 : 그 균주의 감염은 그 균종, 그 부위 감염에 권장되는 용량의 항균제

로 치료될 수 있음을 뜻한다.

- 중등도 감수성 : 다량을 투여할 수 있고 독성이 없는 β -lactam 항균제의 일부

에만 적용된다.

- 중간 : 검사결과가 감수성인지 내성인지 불확실함을 뜻한다.

- 내성 : 보통 용량을 투여했을 때의 증식이 억제되지 않는 균주를 뜻한다.

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⑦ 디스크 확산법의 단점

증식이 느린 세균, 혐기성 세균, CO2를 필요로 하는 세균은 시험할 수 없다. 이

러한 세균은 희석법으로 시험해야 한다. 디스크 확산법으로는 확산이 잘되는 항

균제만이 정확한 결과를 보인다. 확산성이 나쁜 물질의 경우 그 결과가 정확치

않으며, 희석법으로 확인하는 것이 좋다(안병용 등(2002)).

나. H. pylori 억제능 평가 시험 (시험관 시험)

H. pylori 억제능을 평가하기 위해 시험관 시험을 수행한 논문들의 대부분은

2-fold dilution법과 paper disk법을 병행하고 있었고 urease activity 억제능

시험을 부가적으로 실험하고 있었다.

H. pylori 억제능을 평가하기 위한 시험관 시험은 다음과 같은 세 가지 방법 중

한 가지 이상을 실시해야 한다 (이정준 et al., 1999; 정현채, 2001; 정후길 et

al., 2001; 하영득, 2001; Fukai, T. et al., 2002; Gadhi, C.A. et al., 2001;

Malekzadeh, F. et al., 2001; Erdem Yesilada et al., 1999; Mina Tabak et

al., 1999).

2-fold dilution법 (agar dilution법)

(MIC; Minimum Inhibitory Concentration, 최소 억제 농도)

① 시료(sample)는 2-fold dilution method에 의해 brucella agar로 원하는 농도

별로 희석한다.

② 여기에 H. pylori를 106 cfu/mL의 농도로 접종하고 37℃ 3일 동안 microaero-

philic atmosphere에서 배양한다.

③ 배양액을 100μ l씩 취하여 brucella 한천 배지에 도말하고 이 plate를 37℃ 3

일 동안 microaerophilic atmosphere에서 배양한다.

④ 배양 후 시료에 대한 최소억제농도 (MIC, 균 생육이 관찰되지 않는 가장 낮은

시료 농도)를 측정하여 H. pylori에 대한 시료의 항균활성을 평가한다.

Paper Disk 법

① Brucella agar 배지에서 H. pylori를 37℃ 3일 동안 배양한다.

② H. pylori를 108-109cfu/mL이 되도록 현탁한 뒤 brucella agar에 도말한다.

③ 균이 도말된 brucella agar 위에 paper disk를 올려 놓는다.

④ 시료는 1mg/mL가 되도록 희석한 뒤 paper disk에 10μ l씩 흡수시킨다.

⑤ plates를 microaerophilic conditions에서 37℃ 3일 동안 배양한다.

⑥ 각 disk 주위로 나타난 inhibition zone의 직경을 측정한다.

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Urease activity 억제능 측정

① Brucella broth에 배양한 H. pylori를 20mM phosphate buffer (pH 7.0)로 2

회 세척한 후 4℃에서 6분간 sonication (또는 10분간 vortexing)시키고 ×rpm

에서 10분간 원심 분리하여 상등액만 수거하여 crude urease로 사용한다. 상

등액의 단백질 농도는 Lowry method에 의해 측정한다.

② 1mL urea broth에 50μ l의 urease를 첨가하여 23℃에서 2시간 반응시키면서

pH 변화와 560nm에서 흡광도 변화를 측정한다.

③ 10 mL urea broth에 시료를 여러 가지 농도로 첨가한 후 pH를 7.0으로 보정하

고 여기에 500 μ l의 urease를 첨가하여 23℃에서 2시간 반응시키면서 pH 변

화를 측정한다.

④ 반응시킨 후 시료를 첨가하지 않은 대조군의 pH 변화를 100%로 기준하여 각

농도별로 시료의urease 활성 저해능을 환산한다.

다. H. pylori의 실험 동물 모델

현재까지 돼지, 개, 원숭이, 치이타를 이용하여 H. pylori의 감염을 유도한 실험

이 있었으나 이러한 동물들은 시간과 비용이 많이 들어 대량으로 실험하기에는

어려움이 많고 인간의 조직병리학적 변화와는 많은 차이를 보였다. 따라서 보다

재현성이 높고 관찰 기간이 짧으며 인간의 조직 변화와 유사한 병변을 유발시킬

수 있는 동물 모델이 필요하게 되었다. 따라서 <Tabel. 2>과 같이 다양한 H.

pylori 감염 동물 모델들이 개발, 제시되어 오고있는데 이중에서 <Tabel. 3>과

같이 여러 고려사항 등을 검토해 볼 때 Mongolian gerbil과 마우스 모델이 가장

적합한 모델로 보인다.

Table 2. H. pylori 감염 동물모델

H. pylori in animals Other gastric Helicobacters

Non-human primates H. felis in cats, mice, rats

Gnotobiotic pigs H. musteale in ferrets

Gerbils and guinea pigs

Cats

Dogs

Mice and rats

Ref) Nedrud(1999)

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Table 3. H. pylori 감염 동물모델 선택시 고려사항

Ref) Nedrud(1999)

위와 같은 동물모델 중 가장 적합하다고 사료되는 Mongolian gerbil과 마우스 모

델의 특징을 조사하여 다음과 같이 정리하였다.

Mongolian gerbil을 이용한 H. pylori 감염모델

현재 가장 많이 이용되고 있는 H. pylori 감염의 동물모델로서 특히 만성 활동성

위염, 소화성 궤양, 장상피화생 (intestinal metaplasia) 및 위암을 단계적으로

유발시켜 인체의 위암 발생이나 소화성 궤양과 병리적으로 아주 유사한 특징을

보이고 있다. Mongolian gerbil은 H. pylori 동물모델로서는 우수하나 단점이라

면 가격이 비싸고, 일단 모델이 확립된 후 정확한 병태 생리나 분자생물학적 기

전을 연구하는 데는 제한적이라는 것이다. 그러므로 각종 항체가 많이 개발되어

있고 여러 분자생물학적 기전 연구가 비교적 용이한 마우스 모델에 비하면

Mongolian gerbil은 응용에 있어서 다소 제한적이라고 할 수 있다.

마우스를 이용한 H. pylori 감염모델

① 정상 마우스 모델

그 동안 알려진 H. pylori의 마우스 모델들을 비교하여 볼 때 각종 마우스의 위

점막에 대한 적응 정도가 상당히 불규칙적이고 colonization의 정도가 다양하므

로 이를 표준화 할 필요성을 공감하였다. 이에 1997년 10년간 궤양을 앓아오던

환자에서 분리한 H. pylori를 마우스에 감염이 잘 되도록 적응시켜 이 균주를

SS1이라 명명하였고, 이후 마우스에 대한 각종 모델에는 SS1 strain이나 ATCC

43504 H. pylori strain이 주로 이용되고 있다.

마우스에서는 Mongolian gerbil에서와 유사한 병리 소견을 관찰할 수 있으나

큰 차이로는 장상피화생의 뚜렷한 소견이 Mongolian gerbil보다는 빈도가 낮다

는 점이다. 또 한가지 차이점은 Mongolian gerbil에서는 감염 후 50주, 80주

째에 뚜렷한 위암이 발생되었다는 보고에 비하여 마우스에서는 80주까지 관찰

하였으나 전혀 암화의 증거가 없다는 사실이다. 또한 마우스 모델은 형질전환

마우스나 knock out 마우스를 만들 수 있어 특정 유전자나 유전산물이 H.

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pylori 감염에 어떤 변화를 주는지에 대한 연구에 이용될 수 있는 장점이 있다.

② Transgenic 및 Knock out mouse 모델

IL-10은 생체내에서 항염증작용을 보이는 사이토카인의 대표적인 물질인데

IL-10을 KO시킨 생쥐는 궤양성 대장염과 같은 장질환을 유발하므로 염증성 대

장질환 연구에 IL-4 혹은 IL-2 receptor KO 마우스와 함께 가장 많이 사용되고

있는 동물모델이다. 이러한 IL-10 KO 마우스에 H. felis를 감염시킨 결과 대조

군에 비하여 유의한 과증식성 위염과 함께 위상피세포의 탈분화가 유발됨이 보

고된 바 있는데 이는 H. pylori를 감염시킨 Mongolian gerbil이나 마우스에서

보였던 소견과도 유사하나 훨씬 더 심한 위선의 과증식이 관찰되는 특징이 있

다. 또한 이러한 Transgenic 혹은 KO 마우스를 이용한 H. pylori 감염모델은

H. pylori 감염에 의한 면역계, 암 억제계, 혹은 암 유발 유전자의 기능을 밝

힐 수 있어 H. pylori 감염에 의한 각종 위 질환의 병태 생리를 규명하는데 매

우 중요한 실험 모델이다 (함기백 et al., 2001; Nedrud, J.G., 1999).

H. pylori를 감염시킨 Mongolian Gerbil 모델 시험법

① 실험군인 6주령의 SPF male Mongolian gerbils가 7주령이 될 때 24시간 절식

후 H. pylori (0.5mL, 2.0×108 CFU)의 broth culture를 intragastric

inoculation시킨다. 대조군인 H. pylori-free 그룹은 멸균된 brucella broth

를 intra gas tric intubation시키며, 4시간 뒤에는 gerbils에게 물과 식이를

제공한다.

② 시료는 inoculation 후 4시간부터 실험군과 대조군의 식이에 여러 dose로 제

공하거나 inoculatio 후 2주에 제공하며 (post-H. pylori infection) 이 과정

은 6주에 종료된다.

③ 체중과 식이 섭취량은 매주 측정하고 일반적인 건강 상태는 매일 점검한다.

④ 6주 뒤에 ehter 마취로 희생시킨 뒤 위를 greater curvature를 따라 open한

뒤 내용물은 10mM PBS (pH 7.4)로 세척하여 제거해준다.

⑤ Mucosal thickening과 hemorrhage를 포함한 macroscopic gastric lesions을

평가한 뒤 위 전체 (forestomach와 glandular stomach 포함)의 wet weight를

측정한다.

⑥ 각 위는 2부분으로 나누고 한쪽은 병리학적 관찰을 위해 10% neutral bufferd

formalin으로 고정하고 paraffin에 포매한다.

⑦ Hematoxylin과 eosin (H&E)으로 염색하여 Updated Sydney System을 응용하여

위염의 병리학적 소견을 관찰한다.

⑧ H. pylori의 진단을 위해 glandular stomach 부위의 mucosa samples을 위의

나머지 반쪽으로부터 긁어내어 0.3mL PBS로 균질화시키고 같은 용액으로 희석

시킨다.

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⑨ 이 suspension의 Aliquots (100ul)를 segregating agar plates에 접종시키고

microaerobic 조건하에 37℃에서 5일 동안 배양한다.

⑩ Bacterial colonies는 rapid urease test (CLO test)와 gram staining으로 확

인한 뒤 수를 측정한다.

⑪ 평가 항목 예시

㉮ Cronic active pastritis의 정도는 다음과 같은 parameters에 의한 점수화로

평가한다.

□ lymphocyte infiltration

(0: normal, 1: mild infiltration into lamina propria, 2: moderate

infiltraion into lamina propria, 3: severe infiltraton and lymphoid

follicle formation)

□ polymorphonuclear leukocyte infiltration(0:none, 1:number of cells in

the lamina propria<30 in a field at magnificaton ×400, 2: 30-100/field,

3:>100/field)

□ superficial erosion (0: normal, 1: detection of surface epithelial

cells)

세 가지 parameter에 의한 총점는 0-7 이며, 이를 위염 정도를 판단하는 척도

로 쓴다.

㉯ H. pylori의 detection은 rapid urease test (CLO test)와 gram staining으

로 확인한 뒤 viable bacteria 수를 측정 (log[CFU/stomach])하여 비교한다.

H. pylori를 감염시킨 마우스 모델 실험

① 마우스 실험의 전반적인 과정

금식시킨 mice에 H. pylori를 접종⇒접종 후 ×주부터 시료의 투여 시작⇒시료

투여 종료, mice 희생시킴⇒시료의 H. pylori 억제 능력을 mice의 검체로부터

평가

② 실험동물

6주령의 Male (또는 Female) specific pathogen free C57BL/6 또는 BALB/c mice

③ 실험동물 수

연구논문마다 사용한 mice의 수의 차이가 커서 특정한 수를 지정하기는 어려우

나, 실험 결과가 통계적으로 유의하게 나올 수 있는 mice 수를 설정하여야 한

다. (mice 수 설정 예: 총 60마리 중 20마리는 uninfected group, 나머지 40마

리를 3 group으로 분류하면, 제 1그룹(n=20)은 infection analysis를 위한

group, 제 2그룹(n=10)은 infected, treated group이고, 제 3그룹(n=10)은

infected, untreated group임)

④ H. pylori의 접종

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하룻밤 금식시킨 상태에서 마우스용 위관을 이용하여 한 마리당 0.1mL(1×109

CFU/mL)의 H. pylori를 주입하며, 이틀 간격으로 3번 반복 투여한다.

⑤ 시료 투여 방법 및 treatment 방법

균 접종 후 2주 째에 40 infected mice는 무작위로 3그룹으로 나눈다. 제 1그룹

(n = 20)은 infection analysis를 위해 쓰인다. 마지막 균 접종 뒤 1개월에 5

mice를 죽이고 stomach과 spleen samples를 수집한다. 이 과정을 균 접종 뒤 2,

3, 4개월에도 반복한다. 제 2그룹 (n = 10)은 infected, treated group이다. 10

infected mice는 2주간 경구로 시료를 공급받는다. 제 3그룹은 infected,

untreated group이다. 이 mice는 시료가 들어 있지 않은 공시험물을 2주간 공급

받는다.

마지막 treatment가 끝난 4주째에 제 2, 3그룹의 mice를 희생시켜 stomach과

spleen을 제거하고 추후의 analysis를 위해 준비한다.

⑥ 평가 항목

- gram-staining, identical RAPD(Random-Amplied Polymorphic DNAs (RAPDs),

total protein profiles를 이용하여 mice의 위로부터 분리한 organism이 H.

pylori임을 확인한다.

- 균수는 배양을 통해 정량하며 log10 CFUs per gram of stomach으로 표시하여

처리군과 대조군의 균수의 차이를 비교한다.

- 시드니 체계에 근거하여 histopathological feature를 점수화시킨다.

(The degree of inflammation in antrum and corpus was scored between 0 and

3: 0, normal epithelium; 1, few inflammatory cells; 2, moderate inflamma-

tory cells in several layers; 3, high level of inflammation with

focicontaining >50 inflammatory cells. The grade of gastritis was express-

ed as mean of antrum and corpus scores for each mouse.)

- 처리군과 대조군 간의 Cytokine profiles of splenocytes를 비교한다. (ELISA

를 이용해 IFN-γ , IL-4 농도를 측정)

◎ 참고 : 김성우 et al., 2002; 한상욱 et al., 1999; Liu B.H. et al., 2003;

Masaki Iimuro et al., 2002; Toshihisa Ohta et al., 2001; Yuji Aiba et

al., 1998

라. H. pylori 감염 진단 방법의 장단점 - 인체시험

H. pylori는 점막층에서 서식하고 조직 내로 파고 들어가지는 않지만 면역반응으

로 여러 가지 항체를 만든다. H. pylori를 진단하려면 다른 세균 감염증과 같이

균을 배양하여 분리 동정하거나, 위점막 조직 내에 있다는 것을 조직학적으로 증

명하고, H. pylori가 가지고 있는 urease가 만들어내는 암모니아를 이용할 수 있

으며 최근에는 중합효소연쇄반응 (PCR)법이 이용되고 있다. 임상에 있어 이상적

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인 방법은 예민도와 특이도가 높고, 경제적이며, 피검자가 고통스럽지 않은 쉬운

방법이어야 한다. H. pylori의 진단방법은 침습적 방법과 비침습적 방법으로 구

분되는데 침습적 방법으로는 내시경을 통한 위생검조직의 현미경적 검사, gram

염색 및 배양, rapid urease 검사 등이 있고 비침습적 방법으로는 요소호기검사,

혈청학적 검사 등이 있다.

H. pylori의 배양

균을 배양하는 것은 감염증의 필수적인 진단법이다. H. pylori의 배양 순서는 위

점막을 생검하여 Stuart's transport medium (STM) 또는 0.5mL 생리 식염수에 놓

아 미생물실로 운반한다. 위점막을 조직 파쇄기로 잘게 부수어 점막 표면에서 세

균이 떨어지게 한 다음 배양 배지에 접종하고, 산소 5%, 이산화탄소 10%의 미세

호기성 조건에서 습도 95%, 온도 37℃의 상태에서 4-5일간 배양한다. 작고 물방

울처럼 투명한 균집락을 확인한 후에 oxidase, catalase, urease 검사를 시행하

여 H. pylori를 동정한다.

H. pylori 감염을 확진하는데 있어서 가장 특이도가 높은 방법이지만, 시간이 많

이 걸리고 고가인 단점이 있으며, 모든 검사실에서 시행할 수 있는 방법은 아니

다. 민감도는 검사 센터마다 현저한 차이를 보인다. 세균의 밀도, 운반 상태, 배

지, 배양 상태 등 여러 가지 요인에 의하여 배양의 결과가 달라진다. H. pylori

는 위 내에 고루 분포하고 있지 않으며, 위점막에 장상피화생이 있으면 균이 없

어 생검 위치에 따라 위 음성으로 나오는 경우가 있고 항생제의 사용으로 배양검

사에서 음성으로 나오는 경우도 있다.

조직학적 검사

조직학적 검사로는 단순한 균 검출뿐만 아니라 염증반응의 정도, 위축성 위염,

장상피화생, 이형성증 및 악성 종양 등 위점막의 상태를 확인할 수 있는 장점이

있다.

① Hematoxylin-Eosin 염색법 (H-E염색법)

보편적으로 사용하는 H-E염색법은 값싸고, 정확한 검사이지만, 이 염색만으로는

H. pylori 검출이 불충분하므로 특수염색을 시행한다.

② Giemsa 염색법

H. pylori를 잘 관찰할 수 있고 비교적 염색방법이 쉬워 이용하기에 편리하다는

이점이 있으나 염색하는데 시간이 많이 걸린다는 단점이 있어 여러 가지 개선된

방법을 사용하고 있다.

③ Warthin-Starry 은염색법

위점막에 있는 나선균을 검사하는 가장 고전적인 방법으로 조직에서 나선균을

검사할 때 사용하던 방법으로 현재도 진단에 많이 사용되고 있으나 검사 시간이

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오래 걸리고 검사비가 많이 들어 다른 방법을 선호하는 경향이 있다.

Steiner-Steiner방법은 Warthin-Starry 은염색법과 마찬가지로 나선균은 흑갈색

으로 보이고 배경 조직은 담황색으로 세균을 잘 구별할 수 있을 뿐만 아니라 장

상피화생 부위에 청색으로 염색되어 대비된다.

④ 그 외 균 염색 방법들

Gram 염색법, Acridine organge 염색법, Genta 염색법, 또 이들 방법을 약간씩

변형하여 사용하고 있다.

⑤ 면역 염색

H. pylori에 대한 monoclonal antibody를 이용하여 위점막 조직에서 면역염색으

로 H. pylori를 선명하게 볼 수 있다.

일반적으로 Giemsa 염색법과 은염색법이 H. pylori의 염색에 많이 사용된다.

Giemsa 염색법은 비특이적 반응을 제거하는 것이 어렵고 은염색법은 좋은 염색

표본을 얻을 때까지 숙련이 필요하다. H. pylori를 진단하는 데는 생검 위치가

중요하다. 위전정부 점막에 장상피화생, PPI 사용, 항생제 복용 등으로 위 내에

균이 있는 데도 불구하고 위음성으로 나오는 경우가 있다. 위전정부, 위체부에

서 각각 2개 이상의 생검을 하는 것을 권하고 있다.

신속 요소분해효소 검사 (Rapid urease test)

H. pylori 감염의 진단 방법 중 신속 요소분해효소검사 (rapid urease test)는

H. pylori의 요소 분해효소에 의해 요소가 분해되어 생성되는 암모니아로 인한

pH 상승을 지시약을 이용하여 색깔 변화로 확인하는 방법으로 위 내시경 검사가

시행되는 병원에서 우선적으로 권할 만한 간단한 검사 방법이다. 또한 신속 요소

분해효소검사는 80-95% 정도의 높은 민감도와 95-100% 정도의 우수한 특이도를

나타내어 진단 성적이 우수하고 빠르고 가격도 비싸지 않아 가장 많이 이용되고

있다.

현재까지 시판되고 있는 상품화된 신속 요소분해효소검사로는 CLO가 있는데, 감

염 판정 여부를 24시간까지 기다려야 하므로 이후에는 좀 더 빠른 진단을 할 수

있는 검사 방법으로 PyloriTek 검사와 Hpfast 검사가 개발되었으나 진단 성적에

서는 CLO 검사와 PyloriTek 및 Hpfast 검사가 거의 동일하다고 보고되고 있다.

최근 신속 요소분해효소검사의 종류로서 개발된 Hp Kit는 2시간 이내에 감염 여

부를 진단하는 국내에서 최초로 개발된 국산화 신속 요소분해효소검사이다.

RUT와 조직학적 검사는 쉽고 흔하게 시행되는 검사이며, 특히 RUT의 경우 조직학

적 검사와는 달리 빠르게 결과를 볼 수 있고 병리과 의사의 도움 없이도 진단이

되어 1차 진료를 담당하는 곳에서 흔히 사용되고 있다.

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H. pylori의 내시경적 진단

H. pylori가 urease를 가지고 있어 암모니아를 만드는 원리를 이용하여 0.5M의

urea를 포함하는 0.05% phenol red액을 내시경 검사시 위점막에 살포하는 방법으

로 H. pylori가 만드는 암모니아에 의하여 황색이 적색으로 변하는 것을 관찰하

여 H. pylori가 있다는 것을 확인하고 위점막 내 분포를 생검하지 않고 알 수 있

다. 위 내 산도에 따라서 위 음성 또는 위 양성으로 나올 수 있어 위산분비를 억

제하는 H2 수용체 길항제를 검사 전에 투여하여 위내 산도를 적당히 조절하는 것

이 필요하다. 내시경 검사시 살포하여 생검위치를 정할 수 있고 질병에 따라서

분포양상이 달라 진단에 도움이 된다. H. pylori가 생성하는 암모니아의 양이 적

을 경우 위음성으로 진단될 수 있고, 위축성 위염 환자에서 위산분비가 저하되어

있거나 담즙액의 저류, 궤양이나 미란성병변, 또는 전처치 약제에 의한 위양성의

가능성이 있다. 이 검사 방법의 민감도는 66-87%로 알려져 있다. 단일 검사로 사

용하기보다는 다른 검사법과 병용하여 사용하는 것이 바람직하다.

혈청학적 검사

생검 조직을 이용하지 않고 H. pylori 감염을 진단하는 방법 중 가장 간단한 방

법이다. H. pylori가 감염되면 항체가 형성되는데 혈청 중에 있는 항체가를 보체

결합법, 응집반응법, immuno-blot법을 이용하여 측정할 수 있다. 임상에서 일반

적으로 이용하는 방법은 ELISA를 이용하여 IgG, IgA, IgM을 측정할 수 있는데 진

단적 가치가 가장 높은 방법은 IgG 항체가를 측정하는 방법이다. 각종 진단 kit

가 나와 임상에 이용되고 있는데 정확도는 약간의 차이가있다. 혈청진단은 역학

조사와 같이 대규모의 검사에 유용한 방법으로 감염자를 선별 검사하는 방법으로

도 이용된다. 항생제로 H. pylori 감염을 치료하고 난 후에 균이 완전히 제거되

었는지를 보는 방법으로 혈청검사는 적당하지 않다. 치료 후 6개월에서 12개월에

치료 전 항체가와 비교하여 제균되었는 지를 알 수 있다고 하지만 정확한 방법은

아니다.

H. pylori의 항체가는 혈청에서뿐만 아니라 타액 중에도 있어 타액을 이용한 항

체검사가 가능하다. 피검자에게 불편을 전혀 주지 않고 검사를 할 수 있다는 점

에서 향후 어린이들에서 혈청검사를 대신할 수 있을 것으로 기대한다. 요즘에는

전혈을 이용하여 검사하는 방법과 검사 즉시 결과를 알 수 있는 검사법도 개발되

어 임상에 이용되고 있다.

혈청학적 검사는 진단법마다 민감도 및 특이도가 각기 다르며 지역에 따라 민감

도와 특이도가 다양하게 나온다는 것이 단점으로 지적되어 H. pylori 감염의 표

준적인 진단법으로서의 유용성에 대해서는 아직 논란이 있다.

서정훈 등(1999)의 연구에서 현재 상용 검사로 사용하고 있는 혈청학적 검사 방

법들을 위생검 조직을 이용한 표준검사와 비교하여 국내에서의 혈청학적 검사의

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민감도와 특이도를 조사해 진단적 효용성 여부를 알아본 결과, H. pylori 감염

양성은 총 64명 중 40명(62.5%)이었고 24명에서 감염 음성이었다. 민감도는

QuickVue H. pylori 검사가 75.0%, EZ-HP 검사가 90.0%, Bio-Rad GAP 검사가

85.0%, Cobas Core Ⅱ 검사가 80.0%, Pyloragen 검사가 80.0%이었고 특이도는

66.7%, 45.8%, 62.5%, 70.8%, 70.8%이었다. H. pylori 감염의 진단을 위한 다섯

가지 상용 혈청학적 검사들은 민감도와 특이도가 서로 유사하였고, 유럽이나 미

주 지역의 보고에비해 낮아 국내에서 혈청학적 검사 단독으로 H. pylori 감염 여

부를 판단하기에는 제한점이 있다고 판단된다. 향후 높은 민감도와 특이도를 가

진 혈청학적 검사의 개발이 필요하다.

대변 내에서 H. pylori 검출

대변 항원검사 (stool antigen test)는 multiwell ELISA 방법을 기본으로 하고

있다. 501명의 환자를 대상으로 한 대규모 다기관 연구에서 stool antigen

enzyme immuno-assay를 시행한 결과 H. pylori 검출의 민감도는 94%, 특이도는

92%였다. 107명을 대상으로 한 치료 후의 H.pylori 검출의 민감도는 90%, 특이도

는 95%였다. 이러한 결과가 다기관 연구에서 확인이 되면 H. pylori 치료 전후에

이 방법을 사용할 수 있을 것이며, 특히 영아에서와 같이 요소호기검사를 위한

호기표본을 모으기 어려운 환자에서 H. pylori 감염을 진단하는데 좋은 방법이

될 것이다.

13C 요소 호기 검사

H. pylori가 발견된 이래 상부위장관질환과의 연관성이 많이 연구되었고 H.

pylori 감염에 대한 임상적인 평가는 최근 수년간 기본적인 수기가 되어 왔다.

H. pylori 감염의 진단은 균 배양이 가장 직접적이고 확실한 방법이나 위 십이

지장 점막 생검이 필요하며 배양 방법이 쉽지 않아 임상에서 널리 쓰이는 데는

아직 어려움이 있다. H. pylori가 정상 점막에서는 생성되지 않는 요소 분해효

소를 생산하는 것에 근거한 검사법들이 많이 사용되고 있으며 이중 요소호기 검

사는 대표적인 비침습적인 검사로서 특히 감염의 진단뿐만 아니라 제균 요법 후

치료 효과 판정에 가장 좋은 방법이다. 일단 내시경이 필요 없는 검사라는 장점

이 있으며 전체 위를 검체로 하므로 조직 검사와 같은 검체 추출시의 오차를 방

지할 수 있고 안전하고 검사의 민감도 (90-98%)와 특이도 (92-100%)가 높다. 요

소호기검사의 약물동력학적 특성은 동위원소 13C와 14C로 표지한 요소를 경구 투

여하여 위 내에서 일정 시간 반응시킨 후에 호기 중의 이산화탄소에 함유된 13C와 14C를 측정한다. H. pylori가 위내에 존재하면 표지된 요소는 요소분해효소에 의

해서 암모니아와 이산화탄소로 분해되어 호기 중에 나타나게 된다. 이 때 호흡으

로 검출된 이산화탄소의 비 (13CO2/12CO2 또는

14CO2/12CO2)를 측정하여 감염 여부

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를 진단할 수 있다. 그러므로 요소 호기 검사는 내시경 검사를 이용한 침습적인

진단 방법들에 비해 편안하고 시간을 절감할 수 있는 효과적인 방법이라 할 수

있다. 그러나 진단을 하기 위해서는 최소한 100,000개 이상의 균이 있어야 하고

소량의 균이 있는 경우에 위음성으로 나오는 경우가 있다. 14C을 이용한 요소 호

기 검사와 13C 요소 호기 검사 중에서 안전한 13C 요소 호기 검사법이 많이 이용

되고 있다. 송상훈 외(2001)의 연구에서 요소호기검사의 DOB30은 위염의 활성도

가 높을수록 증가하였고 위선의 위축성 변화가 심할수록 DOB30은 감소하였다. 또

한 H. pylori의 균밀도 등급이 높을수록 DOB30은 증가하였다. 실험 결과에서부터 13C 요소 호기 검사는 H. pylori의 존재 진단뿐만 아니라 위의 조직학적 소견을

반영하고 H. pylori의 균량을 간접적으로 정량할 수 있는 유용한 진단 방법이라

고 할 수 있다.

PCR을 이용한 H. pylori 검출

최근 PCR을 H. pylori 감염 진단에 사용하고 있는데, 극미량의 세균을 진단하는

데 도움이 되고 DNA finger print로 같은 종류의 균이라는 것을 확인하거나 cagA

및 vacA genotype과 같은 H. pylori의 독성인자를 검출할 수 있어 독성이 강한

균주라는 것을 아는데 이용되고 있다. 또한 치료에 사용되는 일부 항생제에 대한

내성을 나타내는 point mutation을 발견할 수 있으며, 대변이나 위액에서 균주를

증명하는 데도 PCR법이 이용된다. 그러나 위음성이 있을 수 있고 검사법이 비싸

고 어려워 아직은 임상에서 일반적인 진단법으로는 잘 이용되지 않는다. 김광하

등 (1997)의 연구에서는 위내시경 조직 생검을 사용한 rapid urease test와 조직

학적검사, 그리고 혈액을 채취하여 H. pylori에 대한 IgG, IgM 항체 검사 및 생

검조직을 사용한 PCR 검사를 시행하여 H. pyroli 검출에 대한 PCR 검사의 민감

도, 특이도, 양성 예측치, 음성 예측치를 타검사와 비교하였다. 연구 결과는, 전

체 42명 중 병변부위 조직검사 결과 13명에서 만성위염, 11명에서 위궤양, 8명에

서 십이지장 궤양, 10명에서 위암으로 진단되었다. 조직학적 검사를 기준으로 각

질병에서의 H. pylori 양성율은 만성 위염 77%, 위궤양 55%, 십이지장궤양 75%,

위암 40%가 나왔다. 전체적으로 보면 조직학적 검사는 62%, CLO test 60%, IgM

88%, IgG 90%, PCR 검사 69%에서 H. pylori 감염 양성으로 나왔다.

조직학적 검사를 gold standard로 했을 때 PCR 검사의 민감도, 특이도, 양성, 음

성 예측치는 각각 92%, 69%, 83%, 85%였다. 그리고 CLO test의 경우 각각 89%,

88%, 92%, 82%였고, IgM은 92%, 19%, 65%, 60%, IgG는 100%, 25%, 68%, 100%였

다. PCR 검사에 의한 H. pylori 검출은 높은 민감도를 보여주지만 특이도는 다소

낮았다. 이러한 낮은 특이도는 주로 내시경 시행시나 생검시의 균의 오염에 기인

된 것으로, 내시경과 생검겸자의 철저한 세척으로 균의 오염을 최소화 한다면

PCR 검사는 민감도와 특이도가 높은 검사로 임상적으로 유용하게 쓰여질 수 있을

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것이다 (김광하 et al., 1997; 노임환 et al., 1999; 대한소화기학회, 1998; 박

경남, 2001; 서정훈 et al., 1999; 송상훈 et al., 2001).

마. H. pylori 억제능 관련 인체시험 표준시험법

인체 시험 방법

① H. pylori 양성인 피험자의 선별 : 13C-요소호기 검사를 실시하여 피험자를 선

별한다.

② 선별된 피험자의 치료 전 기저검사 : 위 내시경 검사, rapid urease test, 조

직학적 검사를 원칙으로 한다.

③ 배정 방식 : Double-blind placebo-controlled study를 원칙으로 한다.

④ 시험 기간 : 28일 이상으로 한다.

⑤ 시료 섭취량 : 효능을 발휘할 수 있는 적정량

⑥ 치료가 끝난 후의 효능 평가 검사 :

필수 사항은 13C-요소호기 검사이며, 선택사항은 위 내시경 검사, 조직학적 검

사, H. pylori 배양, mRNA expression에 대한 biopsy(치료 후 4주가 지난 뒤

검사를 한 번 더 할 수 있음)이다.

인체 시험시 고려사항

인체시험은 건강기능식품의 기능성 및 안전성을 평가할 수 있는 가장 확실한 방

법이지만 시험대상자 선정에 어려움이 많고 시험비용 및 시험시간이 많이 소요되

며 표준화된 시험법의 부재 등 여러 문제가 존재하기 때문에 인체시험 수행에 있

어서 많은 어려움이 있다. 따라서 본 연구에서는 1990년 세계소화기학회 석상에

서 처음으로 제창된 시드니 체계 (Sydney system)을 기초로 하여 인체시험의 기

준안을 마련하고자 한다. 엄밀한 의미에서 시드니 체계는 위염의 분류 및 내시경

생검 조직을 대상으로 위점막의 병적 상태를 객관적으로 평가하는 방법론에 해당

하지만 그 주된 목적이 H. pylori 세균치료 효과판정에 있다고 해도 과언이 아니

므로 이러한 시드니 체계를 응용하는 것이 무리가 아니다.

① 비침습적 방법의 제안

대상자들에게 내시경 검사 및 생검에 대한 부담을 없애고 신체에 침습적이지 않

은 방법인 13C-요소호기 검사의 활용을 제안하고자 한다. 내시경을 통해 위의 병

리학적 변화를 관찰하고 생검에 의한 H. pylori 분리 배양 실험을 실시하는 것

을 원칙으로 하나 13C-요소호기 검사로 H. pylori 감염 여부를 측정하여 대상자

를 선발하는 방법을 사용할 수 있다.

- 551 -

② 위 내시경 및 생검 시험

- 위의 생검 부위

생검으로 H. pylori의 존재유무를 평가하기 위해서는 전정부와 체부의 생검이

시행되어야 한다. H. pylori 세균이 전정부에서는 없어지지만 체부에서는 살아

남은 경우가 있으므로 체부에서의 생검은 시료의 기능성 평가에 중요하다.

- 내시경 정보와 병리 검사 정보 교환

인체의 병리학적 변화 및 효능에 대한 정확한 판정을 내리기 위해서는 내시경

소견 즉, 점막 주름의 비후, 폴립, 종과, 미란 등의 소견과 그 위치 등에 관한

정보를 사전에 접해야 보다 정확한 평가를 하는데 도움이 된다.

- 다각적인 접근 방법

H. pylori에 감염이 되어 있는 사람을 선택하더라도 각 개인마다 감염 정도에

있어서 차이를 보이게 되며 연령에 따라서 위점막의 위축정도가 다르다. 따라

서 인체시험 수행시 한가지 방법이 아닌 여러 방법을 통한 다각적인 접근 방식

이 요구된다. 특히 이러한 검사들은 민감도와 특이도에 있어서 다음 표와 같이

다르게 나타나므로 이들 간의 장단점이 상충될 수 있도록 시험법을 설계하는

것이 중요하다 (김우호, 2000).

Table 4. 각종 검사법의 민감도와 특이도

검 사 법 민 감 도(%) 특 이 도(%) 13C urea breath test 90-100 80-99 14C urea breath test 90-100 92-100

혈청항체검사 88-96 89-100

분리 배양법 77-94 100

병리 조직학적 검사 93-99 95-99

rapid urease test 86-97 86-98

Ref) Smooth(1994)

바. H. pylori 억제능 평가의 주시험항목과 보조시험항목

시험관 시험과 동물시험, 인체시험에 있어서의 주시험항목과 보조시험항목은 다

음 표와 같다.

- 552 -

Table 5. H. pylori 억제능 시험에 있어서의 주시험항목과 보조시험항목

(4) H. pylori와 직접적인 관련이 없는 위 손상의 개선 효능 평가법

H. pylori와 직접적인 관련이 없는 위 손상의 개선 효능 평가법은 위 손상 개선

(동물, 인체시험)과 제산능 시험으로 구분하여 설정하였다.

가. 위 손상 개선 효능 시험을 위한 동물모델

위 손상 개선 효능을 평가하기 위한 동물모델로는 마우스 또는 랫드가 주로 사용

되고 있으며 다음과 같은 모델이 적합하다고 인정되고 있다.

물리적 요인에 의한 위 손상 모델

① 수침 및 속박 stress성 위 손상 모델

② Shay 결찰(유문결찰 궤양) 모델

화학적 요인에 의한 위 손상 모델

① HCl & EtOH로 유도한 위 손상 모델

② 에탄올로 유도한 위 손상 모델

③ Aspirin으로 유도한 위 손상 모델

주시험항목 보조시험항목

시험관

시험

<항균활성측정>

① 2-fold dilution법(MIC측정)

② Paper disk법

③ Urease activity inhibition

assay

동물

시험

① Gram-staining 또는 H&E 염색,

Warthin-Silver 염색법을 통해 균의

존재 및 병리학적 소견 관찰

② H. pylori의 CFU number 측정

③ Rapid urease test

① Splenocytes의 Cytokine pro-

files (ELISA를 이용해 IFN-γ ,

IL-4 농도를 측정)

② Stomach wet weight

인체

시험

① 13C-요소호기 검사

① ELISA을 이용한 혈청타액의

항체 검사

② PCR을 이용한 검출

③ 위 내시경 및 생검을 통한 검사

㉠ 위 내시경 검사

㉡ 조직학적 검사

㉢ Rapid urease test

㉣ H. pylori 배양(균수 측정)

- 553 -

④ Indomethacin으로 유도한 위 손상 모델

⑤ 초산으로 유도한 위 손상 모델

물리적 요인에 의한 위 손상 모델과 화학적 요인에 의한 위 손상 모델에서 각각 1

종류 이상의 모델로 시험을 실시해야 한다.

수침 및 속박 stress성 위손상 모델

흰쥐를 개별 구속철망에 넣고 수조 내에 흉부까지 침적시키면 주로 위체부에 선

상 혹은 점상으로 위손상이 발생한다. 발생기전은 미주 신경의 흥분에 따른 위운

동의 항진, 산분비의 상승 및 위혈류의 장해 등에 의한다.

① 체중 200g 내외의 수컷 흰쥐(또는 랫드) 6마리를 1군으로 하여 대조군, 양성

대조군, 실험군의 3군으로 나눈다.

② 일반 환경 조건 하에서 24시간 이상 절식시킨다.

③ 대조군에는 일반식이, 양성대조군에는 sucralfate, cetraxate, cimetidine,

omeprazole, miso prostol 중 택일하여 투여한다.

④ 랫트를 24시간 절식시킨 후에 시료를 경구 투여한다.

⑤ 30분 후에 stress cage에 넣어 검상돌기가 물에 잠기도록 물 속에 넣고 수온

을 21±1℃로 유지하며 20시간 동안 방치한다.

⑥ ether 마취하에 치시시킨 후 위를 적출한다.

⑦ 적출한 위를 2% formalin 용액 10mL에 10분간 담구어 고정시킨다.

⑧ 위의 대만부를 따라 절개하여 펼친 후에 위손상 면적 또는 길이를 측정한다.

Shay 결찰 (유문결찰 궤양) 모델

흰쥐를 절식시키고 ether 마취 하에 유문부를 결찰하고 방치하면 전위부에 다수

의 위손상이 80%이상 발생한다. 중증의 경우에는 위천공이 일어날 수도 있다. 이

는 위산과 pepsin의 침식작용에 의한다.

① 체중 200g 내외의 수컷 흰쥐 (또는 랫드) 6마리를 1군으로 하여 대조군, 양성

대조군, 실험군의 3군으로 나눈다.

② 일반 환경 조건 하에서 24시간 이상 절식시킨다.

③ 대조군에는 일반식이, 양성대조군에는 sucralfate, cetraxate, cimetidine,

omeprazole, miso prostol 중 택일하여 투여한다.

④ 24시간 절식시킨 쥐를 ether로 마취한다.

⑤ 마취된 쥐를 개복하고 위의 유문부를 결찰한 후 봉합한다.

⑥ 시료는 위의 유문결찰 후 바로 경구투여한다.

⑦ 12시간 후에 흰쥐를 ether 치사시켜 위를 적출하여 2% formalin 용액 10mL를

넣고 10분간 담그어 고정한다.

- 554 -

⑧ 대만부를 절개하여 발생된 손상부위의 길이 및 면적을 측정한다.

HCl & EtOH로 유도한 위손상 모델

Ethanol이 직접적으로 위점막을 자극하고 점막하 근육층에 부종을 유발시켜 일시

적인 허혈상태를 발생 시킴으로써 산화적 손상으로 인한 세포의 괴사를 유발함과

동시에 HCl이 위점막에 직접적인 자극을 가하고 위운동을 항진하여 급성위염을

일으킨다.

① 체중 200g 내외의 수컷 흰쥐 (또는 랫드) 6마리를 1군으로 하여 대조군, 양성

대조군, 실험군의 3군으로 나눈다.

② 일반 환경 조건 하에서 24시간 이상 절식시킨다.

③ 대조군에는 일반식이, 양성대조군에는 sucralfate, cetraxate, cimetidine,

omeprazole, miso prostol중 택일하여 투여한다.

④ 시료를 경구투여하고 30분 후에 HCl-EtOH (150 mM HCl을 함유한 60% EtOH)

1mL 를 경구투여 한다.

⑤ 절식, 절수하여 1시간 방치 후 ether로 치사시켜 위를 적출한다.

⑥ 적출한 위를 2% formalin 용액 10mL에 10분간 담구어 고정시킨다.

⑦ 위의 대만부를 절개하여 발생된 손상길이 (mm) 또는 손상면적 (mm2)을 측정한다.

에탄올로 유도한 위손상 모델

Ethanol이 직접적으로 위점막을 자극하고 점막하 근육층에 부종을 유발시켜 일시

적인 허혈 상태를 발생시킴으로써 산화적 손상으로 인한 세포의 괴사를 유발하여

급성 위손상을 일으킨다.

① 체중 200g 내외의 수컷 흰쥐 (또는 랫드) 6마리를 1군으로 하여 대조군, 양성

대조군, 실험군의 3군으로 나눈다.

② 일반 환경 조건 하에서 24시간 이상 절식시킨다.

③ 대조군에는 일반식이, 양성대조군에는 sucralfate, cetraxate, cimetidine,

omeprazole, miso prostol 중 택일하여 투여한다.

④ 시료 Xmg를 경구투여하고 30분 후에 무수 에탄올 1mL/100g를 경구투여한다.

⑤ 절식, 절수하여 1시간 방치 후 ether로 치사시켜 위를 적출한다.

⑥ 적출한 위를 2% formalin 용액 10mL에 10분간 담구어 고정시킨다.

⑦ 위의 대만부를 절개하여 발생된 손상길이(mm) 또는 손상면적(mm2)을 측정한다.

Aspirin으로 유도한 위손상 모델

절식 흰쥐에 aspirin을 투여하게 되면 위액의 저류 및 점막 부식에 의해 위가 손

상된다.

① 체중 200g 내외의 수컷 흰쥐 (또는 랫드) 6마리를 1군으로 하여 대조군, 양성

- 555 -

대조군, 실험군의 3군으로 나눈다.

② 일반 환경 조건 하에서 24시간 이상 절식시킨다.

③ 대조군에는 일반식이, 양성대조군에는 sucralfate, cetraxate, cimetidine,

omeprazole, miso prostol 중 택일하여 투여한다.

④ 절식시킨 쥐를 ether로 마취하여 개복한 뒤 위의 유문부를 결찰한 직후 시료

를 경구투여한다.

⑤ 마취에서 깨어나려고 할 때 aspirin 200mg/kg을 경구투여한다.

⑥ 7시간이 경과한 뒤 과량의 ether로 치사시킨다.

⑦ 선위부에서 발생한 위손상 길이 및 면적을 측정한다.

Indomethacin으로 유도한 위손상 모델

인도메타신 (indomethacin) 급성 위손상을 유도한 후 시험시료 투여로 인한 위손

상 개선효과를 본다. Indomethacin을 투여하게 되면 위운동의 항진, 위액분비의

항진, 위혈류의 저하 등으로 위해 위 손상이 일어나게 된다.

① 체중 200g 내외의 수컷 흰쥐 (또는 랫드) 6마리를 1군으로 하여 대조군, 양성

대조군, 실험군의 3군으로 나눈다.

② 일반 환경 조건 하에서 24시간 이상 절식시킨다.

③ 대조군에는 일반식이, 양성대조군에는 sucralfate, cetraxate, cimetidine,

omeprazole, miso prostol 중 택일하여 투여한다.

④ 시료를 경구투여한 후 30분 후에 indomethacin 25mg/kg 씩을 피하주사한다.

⑤ 7시간 후에 ether로 치사시켜 위를 적출시켜 2% formalin으로 10분 동안 고정

시킨다.

⑥ 대만부를 절개하여 발생된 손상의 길이 및 면적을 측정한다.

초산으로 유도한 위손상 모델

흰쥐의 위 점막하 조직의 장막측 또는 위내강에 초산액을 주입하여 2-3일 후에

점막 결손을 수반하는 원형이나 타원형의 손상이 발생한다. 20-40일 후에 치유되

어가지만, 60-80일에는 약 50%가 재발되는 만성궤양으로 된다. 병리학적으로 인

체의 만성궤양과 유사한 것으로 알려져 있다.

① 체중 200g 내외의 수컷 흰쥐 (또는 랫드) 6마리를 1군으로 하여 대조군, 양성

대조군, 실험군의 3군으로 나눈다.

② 일반 환경 조건 하에서 24시간 이상 절식시킨다.

③ 대조군에는 일반식이, 양성대조군에는 sucralfate, cetraxate, cimetidine,

omeprazole, miso prostol중 택일하여 투여한다.

④ Ether 마취하에 개복하여 위를 노출시킨 후 50% 초산 0.06mL을 전위벽의 선위

부에서 subserosal layer 안으로 주입한 후 봉합한다.

- 556 -

⑤ 감염을 막기 위해 3일간 ampicillin 50mg/kg/day를 경구투여한다.

⑥ 수술 후 4일째 되는 날부터 11일 동안 1일 1회 시료를 경구투여한다.

⑦ 수술 15일째 되는 날 ether로 치사시켜 위를 적출한 후 2% formalin으로 10분

간 고정한다.

⑧ 선위부에 생성된 위손상 부위의 길이 및 면적을 측정한다.

나. 주 시험 항목과 보조 시험 항목

위와 같은 동물모델에서 H. pylori와 직접적인 관련이 없는 위 손상 개선 기능성

평가를 위해 다음과 같이 주 시험 항목과 보조 시험 항목을 구분하여 설정하였다.

▣ 주 시험 항목 : 위 손상 길이 및 손상 면적 (위 손상 억제율) 측정

▣ 보조 시험 항목 : 위액 분비량, 위산도 (유리산도 및 총산도), 위점막 표면

pH 측정, 위 점액량, 전혈점도, 혈장점도, 펩신 활성도

주 시험 항목은 필수적으로 실시하여야 하며, 보조시험항목은 필요에 따라 선택하

여 실시하며, 보조시험항목을 모두 실시할 필요는 없는 것으로 사료된다.

위손상 길이 및 면적 (위손상 억제율 또는 손상점수) - 주시험항목

건강기능식품의 효능을 가장 확실하게 알 수 있는 방법으로 시료를 투여한 동물

모델의 위를 적출, 절개하여 손상길이 또는 손상면적을 직접 측정한다. 측정 자

료를 토대로 하여 위손상 억제율 및 개선율, 위손상 점수 및 개선점수를 계산할

수 있다.

① 위 실험모델 중 택일한다.

② 체중 200g 내외의 수컷 흰쥐 (또는 랫드) 6마리를 1군으로 하여 대조군, 양성

대조군, 실험군의 3군으로 나눈다.

③ 일반 환경 조건 하에서 24시간 이상 절식시킨다.

④ 대조군에는 일반식이, 양성대조군에는 sucralfate, cetraxate, cimetidine,

omeprazole, miso prostol 중 택일하여 투여한다.

⑤ 택일한 실험모델의 표준 시험법과 동일한 방법을 수행하여 위를 적출한다.

⑥ 적출한 위를 2% formalin 용액 10mL에 10분간 담구어 고정시킨다.

⑦ 위의 대만부를 절개하여 발생된 손상길이 (mm) 또는 손상면적 (mm2)를 현미경

으로 측정한다.

⑧ 결과 해석

㉮ 위손상 억제율 (또는 개선율) 계산

- 557 -

억제율(%) =대조군의 지수(길이 또는 면적) - 시료군의 지수(길이 또는 면적)

X 100대조군의 지수(길이, 면적)

㉯ 위손상 (또는 위손상 개선) 점수

㉠ 손상면적의 점수화

손상면적(mm2) 점수

손상 없음 0

1-5 1

6-10 2

11-15 3

16-20 4

21-25 5

26 이상 또는 천공 6

㉡ 손상정도의 점수화

손 상 정 도 점수

손상이 없는 경우 0

작은 손상(〈 10mm length)이 1-3개 있는 경우 1

큰 손상(≥ 10mm length)이 1-3개 있는 경우 2

깊은 손상이 1-3개 있는 경우 3

작은 손상이 3개 이상 있는 경우 4

큰 손상이 3개 이상 있는 경우 5

깊은 손상이 3개 이상 있는 경우 6

㉰ 5% 유의수준하에서 대조군, 양성대조군보다 유의적인 효과가 입증될 경우 기

능성이 있는 것으로 판정한다.

위액 분비량 - 보조시험항목

위손상이 있는 경우 위액이 많이 분비될수록 손상을 악화시키므로 위액 분비량을

줄일 경우 위손상 개선에 도움이 된다.

① 위 실험모델 중 택일한다.

② 체중 200g 내외의 수컷 흰쥐 (또는 랫드) 6마리를 1군으로 하여 대조군, 양성

대조군, 실험군의 3군으로 나눈다.

③ 일반 환경 조건 하에서 24시간 이상 절식시킨다.

④ 대조군에는 일반식이, 양성대조군에는 sucralfate, cetraxate, cimetidine,

omeprazole, miso prostol중 택일하여 투여한다.

- 558 -

⑤ 택일한 실험모델의 표준 시험법과 동일한 방법으로 ether 마취시켜 위의 유문

부를 결찰한다.

⑥ 결찰 후 4시간 후에 치사시켜 위를 적출하고 주사기로 위액을 채취한다.

⑦ 채취한 위액을 3,000rpm에서 15분간 원심분리 시킨다.

⑧ 상징액을 수거하여 burette로 정확한 양을 구한다.

⑨ 결과 해석

5% 유의수준하에서 대조군, 양성대조군보다 유의적인 효과가 입증될 경우 기능

성이 있는 것으로 판정한다.

위산도 (유리산도 & 총산도) - 보조시험항목

위액 분비가 많이 줄어들수록 총산도가 감소하며 산도가 낮을수록 위손상 부위를

덜 악화시키게 된다. 위산도는 유리산도와 총산도로 구분할 수 있는데 유리산도

는 위액 중에 나타나 있는 산도를 의미하며 총산도는 여러 조건에 의해 방출되어

나타날 수 있는 산도까지를 포함하고 있어 위손상 조절 건강기능식품의 위산 저

하작용을 평가하기 위해서는 유리산도와 총산도를 모두 고려해야 한다.

① 위 실험모델 중 택일한다.

② 체중 200g 내외의 수컷 흰쥐 (또는 랫드) 6마리를 1군으로 하여 대조군, 양성

대조군, 실험군의 3군으로 나눈다.

③ 일반 환경 조건 하에서 24시간 이상 절식시킨다.

④ 대조군에는 일반식이, 양성대조군에는 sucralfate, cetraxate, cimetidine,

omeprazole, miso prostol 중 택일하여 투여한다.

⑤ 택일한 실험모델의 표준 시험법과 동일한 방법으로 ether 마취시켜 위의 유문

부를 결찰한다.

⑥ 결찰 후 4시간 후에 치사시켜 위를 적출하고 주사기로 위액을 채취한다.

⑦ 채취한 위액을 3,000rpm에서 15분간 원심분리 시킨다.

⑧ 상징액 1mL를 비이커에 취하여 0.5% dimethylaminoazobenzene alcohol 용액

및 1% phenolphthalein alcohol 용액을 각각 2방울씩 가한다.

⑨ 붉은 색을 나타내게 한 후 burette을 이용하여 0.1N NaOH 액을 첨가하여 황색

이 나타날 때까지의 적정값을 유리산도로, 그 후 장미 색조가 나타날 때까지

의 적정값을 총산도로 하며 mEq/L로 표시한다.

⑩ 결과 해석

5% 유의수준하에서 대조군, 양성대조군보다 유의적인 효과가 입증될 경우 기능

성이 있는 것으로 판정한다.

위점막 표면 pH - 보조시험항목

위점막에 손상이 있는 경우 표면 pH가 낮을수록 손상정도가 악화될 수 있다.

- 559 -

① 위 실험모델 중 택일한다.

② 체중 200g 내외의 수컷 흰쥐 (또는 랫드) 6마리를 1군으로 하여 대조군, 양성

대조군, 실험군의 3군으로 나눈다.

③ 일반 환경 조건 하에서 24시간 이상 절식시킨다.

④ 대조군에는 일반식이, 양성대조군에는 sucralfate, cetraxate, cimetidine,

omeprazole, miso prostol 중 택일하여 투여한다.

⑤ 택일한 실험모델의 표준 시험법과 동일한 방법을 수행하여 위를 적출한다.

⑥ 적출한 위를 대만부를 따라 절개한다.

⑦ pH test paper를 이용하여 위점막 표면의 pH를 측정한다.

⑧ 결과 해석

5% 유의수준하에서 대조군, 양성대조군보다 유의적인 효과가 입증될 경우 기능

성이 있는 것으로 판정한다.

위점액량 - 보조시험항목

위점액은 위를 보호하므로 위점액량의 증가는 위손상을 개선시킬 수 있다.

Alcian blue는 점막조직의 당단백 및 soluble mucopoly saccharide와 결합하는

염색약으로 점막세포를 통과하지 않는 불용성 복합체를 생성하므로 점막보호막의

추정에 용이하게 사용되는 방법이다.

① 위 실험모델 중 택일한다.

② 체중 200g 내외의 수컷 흰쥐 (또는 랫드) 6마리를 1군으로 하여 대조군, 양성

대조군, 실험군의 3군으로 나눈다.

③ 일반 환경 조건 하에서 24시간 이상 절식시킨다.

④ 대조군에는 일반식이, 양성대조군에는 sucralfate, cetraxate, cimetidine,

omeprazole, miso prostol중 택일하여 투여한다.

⑤ 택일한 실험모델의 표준 시험법과 동일한 방법을 수행하여 위를 적출한다.

⑥ 적출한 위를 대만부를 따라 절개하고 뒤집어서 선위부 점막면을 밖으로 노출

시킨 후에 차가운 0.25M sucrose 용액으로 선위부를 세척한다. 또는 적출한

위에 0.25M sucrose 용액 10mL를 위 내로 주입한다.

⑦ 이를 0.1%w/v alcian blue 8GX 용액 15mL에 2시간 동안 담근다.

⑧ 이후 0.25M sucrose 용액 15mL로 두 번 헹구어 (각 15분씩) 과량의 염색약을

제거한다.

⑨ 위점액과 결합된 시약을 추출하기 위하여 위 조직을 0.5M MgCl₂용액 15mL에

2시간동안 담근다. 이때 30분마다 1분씩 간헐적으로 shaking을 행한다.

⑩ 얻어진 푸른색의 추출액을 동량의 diethyl ether와 혼합하여 shaking 한 후

3,500rpm에서 10분간 원심분리한다.

⑪ 원심분리로 얻어진 상징액에 대해 605nm에서 흡광도를 측정한다.

- 560 -

⑫ 0.1%w/v alcian blue 8GX 용액을 0.25M sucrose 용액으로 희석하여 표준 용액

을 만든 후 이를 이용하여 표준곡선을 작성한다.

⑬ ⑪에서 얻어진 흡광도를 표준곡선을 이용하여 위점막과 결합된 alcian blue의

양으로 환산한 후 이를 조직 g당 표시한다.

⑭ 결과해석

5% 유의수준하에서 대조군, 양성대조군보다 유의적인 효과가 입증될 경우 기능

성이 있는 것으로 판정한다.

전혈점도 및 혈장점도 - 보조시험항목

건전한 점막을 유지하기 위해서는 풍부한 혈액의 공급과 보호성 점액의 분비 및

표면의 안정성을 유지하기 위한 상피 세포의 빠른 대치가 필수요건이며, 이 중

스트레스에 의한 위병변을 설명하는데 있어서 중요하게 대두되고 있는 것이 위점

막 혈류흐름의 감소이다. 이러한 스트레스하에서 발생되는 위점막 미세순환의 장

애에 있어서 혈액점도가 중요한 역할을 한다고 알려지고 있다.

① 위 실험모델 중 택일한다.

② 체중 200g 내외의 수컷 흰쥐 (또는 랫드) 6마리를 1군으로 하여 대조군, 양성

대조군, 실험군의 3군으로 나눈다.

③ 일반 환경 조건 하에서 24시간 이상 절식시킨다.

④ 대조군에는 일반식이, 양성대조군에는 sucralfate, cetraxate, cimetidine,

omeprazole, miso prostol 중 택일하여 투여한다.

⑤ 위손상을 일으킨 후 ether로 마취시킨 후 심장천공법(heart puncture)을 이용

하여 혈액을 채취한다.

⑥ 채혈시 항응고제인 EDTA를 사용하는데 일부는 전혈로, 일부는 3,500g에서 10

분간 원심분리하여 혈장을 분리한다.

⑦ 전혈점도 및 혈장점도는 viscometer를 사용하여 37℃, shaking rate 11.25,

45.0, 90.0, 225.0 sec-1에서 측정한다.

⑧ 결과해석

5% 유의수준하에서 대조군, 양성대조군보다 유의적인 효과가 입증될 경우 기능

성이 있는 것으로 판정한다.

펩신 활성도 - 보조시험항목

펩신은 모든 포유동물의 위액에 존재하며 점막 주세포에 불활성화된 형태로 유리

되나 pH 1.8-2.0에서 최대의 단백분해활성을 나타낸다. 따라서 위내의 pH를 높이

게 되면 펩신의 활성도는 낮아지게 되며 이는 위손상의 악화를 경감할 수 있다.

① 위 실험모델 중 택일한다.

② 체중 200g 내외의 수컷 흰쥐 (또는 랫드) 6마리를 1군으로 하여 대조군, 양성

- 561 -

대조군, 실험군의 3군으로 나눈다.

③ 일반 환경 조건 하에서 24시간 이상 절식시킨다.

④ 대조군에는 일반식이, 양성대조군에는 sucralfate, cetraxate, cimetidine,

omeprazole, miso prostol 중 택일하여 투여한다.

⑤ 택일한 실험모델의 표준 시험법과 동일한 방법으로 ether 마취시켜 위의 유문

부를 결찰한다.

⑥ 결찰 후 4시간 후에 치사시켜 위를 적출하고 주사기로 위액을 채취한다.

⑦ 위액 0.1mL에 saline 0.9mL를 가한 후, Sorensen buffer로 용해한 1% bovine

serum albumin (BSA)액 1mL를 첨가한다.

⑧ 37℃에서 30분간 반응시킨 후 0.4M trichloroacetic acid 1mL을 가해 반응을

중지한 다음 3,500rpm에서 30분간 원심분리시킨다.

⑨ 상징액 1mL를 취하여 0.5M Na2CO3 5mL와 Folin reagent 3배 희석액 0.5mL를 넣

어 37℃에서 30분간 반응시킨다.

⑩ 반응 후 660nm에서 흡광도를 측정한다.

⑪ Tyrosine을 0.4M TCA에 농도별로 녹여 상기와 같은 방법으로 흡광도를 측정하

여 표준곡선을 작성한다.

⑫ 펩신의 활성은 30분간 배양에서 유리된 tyrosine의 양으로 표시한다.

⑬ 결과해석

5% 유의수준하에서 대조군, 양성대조군보다 유의적인 효과가 입증될 경우 기능

성이 있는 것으로 판정한다.

◎ 참고 : 김승희 et al., 1998; 김육용 et al., 2000; 김은주 et al., 1999; 박

은지 et al., 1997; 박은지 et al., 1994; 오태영 et al.,1996; 이내경 et al.,

1997; 이후장 et al., 1998; 임종필 et al., 2002; 정기화 et al., 1992; 정춘

식 et al., 1996; 정춘식 et al., 1997; Guaraldo, L. et al., 2001; Pandian,

R.S. et al., 2002; Pasquale, R.D. et al., 1995; Sairam, K. et al., 2002;

Suleyman, H. et al., 2002; Xing, J. et al., 2002)

다. 인체 시험

① 대상자 선정 방법

문진을 실시하여 상부위장관 손상 증상을 가지며, 상부위장관 내시경 검사에서

위 손상이 있는 사람을 선정한다. 문진 및 내시경 소견에 의해 대상자의 위 손

상의 중증도를 4단계로 분류하여 1-2단계 정도의 손상이 있는 사람을 선정한다.

단, 약물 치료가 필요한 심각한 위 손상의 경우 대상자에서 제외한다.

② 배정 방식 : Double-blind placebo-controlled study를 원칙으로 한다.

③ 투여 방법 : 적정량의 시료를 총 28일 이상 경구 투여한다.

④ 종료 시 평가 방법 : 소화기 증상, 중도 탈락 여부, 이상 반응 발생 유무, 시

- 562 -

료 투여에 대한 순응도 및 전반적인 평가를 실시한다.

⑤ 유효성 평가

위손상 증상 (심와부동통, 오심, 구토, 식욕부진, 복부팽만감, 가슴앓이, 토혈

및 하혈 등)의 개선 정도와 위 내시경 하의 병소의 치유 양상을 평가한다.

<유효성 평가 일정 예시>

㉮ 문진 (자각증상의 변동 평가)

시료 투여 개시전, 투여 개시 후 1주, 2주째 실시한다. (개선이 지연될 경우 4

주째에도 평가)

㉯ 내시경에 의한 병소 관찰

시료 투여 개시전, 투여 개시 후 2주째 실시한다. (개선이 지연될 경우 4주째

에도 평가)

⑥ 결과 판정

5% 유의수준하에서 대조군, 양성대조군보다 유의적인 효과가 입증될 경우 기능

성이 있는 것으로 판정한다.

◎ 참고 : 김재웅, 1997; 정규원 et al., 1982

기능성 인정 기준

① 시험관 시험 결과는 양성 판정이 나와야 한다.

② 동물 시험에서 주시험 항목은 반드시 측정하여야 한다.

③ 인체 시험에서 양성 판정이 될 경우 기능성을 인정한다.

④ 인체 시험을 실시하지 못할 경우는 인체 시험을 대신하여 동물 시험에서 적당

한 방법을 실시하여 양성 판정이 나오면 기능성을 인정할 수 있다.

(5) 제산능

위 손상의 개선에 있어 제산능은 중요한 부분이다. 위산은 위 내 소화에 있어 필

수적인 요소이며 동시에 위 손상을 유발할 수 있는 공격 인자로 작용한다. 제산

력 효능을 평가하고자하는 대상 시료에는 탄산수소나트륨과 같은 인위적인 알칼

리성 첨가제가 들어 있지 않아야 한다.

가. Fuchs법

Fuchs법은 공복상태의 위로 간주한 in vitro 모델에서 염산을 가하여 제산 효능

을 평가하는 시험법이다.

① 0.1N 염산 50mL를 300mL 비커에 넣고 증류수를 가하여 100mL로 희석한 다음,

pH-electrode를 장치한다.

- 563 -

② 37±1℃에서 교반하면서 시료 또는 대조물 (증류수) 15mL를 가한다.

③ 1N 염산을 0.2mL/min의 속도로 적가하면서 일정 시간 (30분까지는 1분 간격,

이후는 5분 간격)마다 pH를 측정하여 중화곡선을 작성한다.

④ 중화곡선으로부터 pH가 낮은 상태에서 pH 3.0 이상으로 상승하였다가 다시 pH

3.0으로 하강하기까지 소비된 염산의 총량 (0.1N 염산으로 환산한 mL 수)을

구하여 제산능 (neutralizing capacity)으로 표시한다.

나. Johnson-Duncan법

위 내용물이 장으로 이행하는 양을 고려한 in vitro 실험계에서 제산 효능을 평

가하는 방법이다.

① 0.1N 염산 100mL를 300mL 비커에 취하고 pH-electrode를 장치한다.

② 37±1℃에서 교반하면서 시료 또는 대조물 (증류수) 15mL를 첨가하고 10분 정

도 교반하면서 pH를 측정한다.

③ 2mL/min의 속도로 0.1N 염산을 적가하며 동시에 같은 속도로 반응액을 추출

제거하면서 일정시간 (30분까지는 1분 간격, 이후는 5분 간격)마다 pH를 측정

하여 중화곡선을 작성한다.

④ 중화곡선으로부터 pH가 낮은 상태에서 pH 3.0 이상으로 상승하였다가 다시 pH

3.0으로 하강하기까지 소비된 염산의 총량 (0.1N 염산으로 환산한 mL 수)을

구하여 제산능(neutralizing capacity)으로 표시한다.

다. Rosset-Rice법

과량의 위산이 분비되는 경우를 고려한 모델로서 in vitro 실험계에서 제산능을

평가하는 방법이다.

① 0.1N 염산 30mL와 증류수 70mL를 400mL 비이커에 넣고 pH-electrode를 장치한다.

② 온도를 37±1℃로 유지하며 계속 교반하면서 시료 또는 대조물 (증류수) 15mL

를 가한다.

③ 시료와 동시에 0.1N 염산을 4mL/min의 속도로 가하면서 일정 시간 (30분까지

는 1분 간격, 이후 5분 간격) pH를 측정하여 중화곡선을 작성한다.

④ 중화곡선으로부터 pH가 낮은 상태에서 pH 3.0 이상으로 상승하였다가 다시 pH

3.0으로 하강하기까지 소비된 염산의 총량 (0.1N 염산으로 환산한 mL 수)을

구하여 제산능 (neutralizing capacity)으로 표시한다.

◎ 참고 : 김종국 et al(1990), 김종국 et al(1993)

라. Aspiration법 - 동물시험법

제산력을 in vitro에서 시험하는 방법은 실험 조작이 간편하기는 하지만 인체의

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생리현상에 기인하는 위 내용물 배출, 음식물 섭취 후에 나타나는 위액 분비의

변화 및 개체차에 따른 in vivo 효과를 알 수 없는 단점이 있다. 그러므로 in

vitro뿐 아니라 in vivo에서도 제산력을 평가할 필요가 있다.

① 수컷 흰쥐 (또는 랫드) 6마리를 1군으로 한다.

② 백열등 아래에서 우레탄 (0.8g/kg)을 복강 내 투여하여 흰쥐를 마취시킨다.

③ 검상돌기로부터 2cm 떨어진 곳에서 정중선을 따라서 복부를 절개한 후 유문과

십이지장 사이를 봉합사로 묶고 catheter를 삽입한다.

④ 생리식염수 3mL로 4회 위 내용물을 세척하고 세척 후 1시간 동안 흰쥐를 안정

시킨다.

⑤ 1시간 후 위액을 취하여 pH를 측정한다.

⑥ 경구 존대를 사용하여 시료 (5mL/kg)을 투여하고 시간별로 catheter를 통하여

위액 0.4mL씩을 취하여 pH를 측정한다.

⑦ 채취한 위액은 pH 측정 후 catheter를 통하여 다시 위에 넣어 준다.

⑧ 시료 대신 생리식염수를 같은 양 투여한 군을 대조군으로 한다.

(6) 장내 균총 개선

가. 장내 균총 (intestinal microflora) 개선 원리

인간과 동물의 장관내에는 수많은 세균들이 서로 공생 또는 길항관계를 유지하며

장내균총을 구성하고 있고 이들이 장관내에서 생성해낸 여러 가지 대사산물들은

숙주의 영양, 생리작용, 발암, 노화, 면역 등에 크게 영향을 미친다. 이러한 장

내균총은 건강한 사람에 있어서는 다소 안정적으로 그 균형을 유지하지만 섭취하

는 식이, 약물, 생균제품, 기후, 스트레스 등의 외부 요인과 세균상호간의 관계

에 의해 발생되는 내부요인에 의해 그 조성이 변경될 수 있다. 따라서 이러한 영

향인자들을 조절함으로써 장내균총 조성을 바람직하게 변화시키려는 노력이 활발

하게 이루어지고 있다.

장내균총의 개선을 알아보기 위해 표준균주들의 단독배양방법을 사용할 수도 있

으나 이것은 수많은 균들이 혼합, 서식하고 있는 장내의 상황을 설명하는데 큰

한계가 있으므로 장내의 균총 변화에 대한 현상을 해석하기 위한 in vitro실험방

법에 있어서도 엄격한 혐기 상태의 유지, 장내균들의 혼합배양, in vivo 상태와

유사한 배지조성 등 많은 조건들이 충족되어야만 의미있는 결과를 얻을 수 있을

것으로 생각된다.

나. 장내 균총 개선 시험법 - 시험관 시험법

장내 균총 개선과 관련된 시험항목을 Table 6과 같이 주시험항목과 보조시험항목

- 565 -

으로 구분 설정하였다.

Table 6. 장내 균총 개선 관련 주시험 항목 및 보조시험 항목

분류 주 시험 항목(필수 시험항목) 보조 시험 항목(추가 시험항목)

in vitro - 장내 세균 동정 및 세균수 측정법

: 선택배지, PCR, ELISA 이용

- pH 및 β -glucuronidase와

tryptophanase 의 활성을 측정

in vivo

(human)

- 장내 세균 동정 및 세균수 측정법

: 선택배지, PCR, ELISA 이용

장내 세균 동정 및 세균 수 측정법 - 주시험항목

① 건강한 대상자 3명 이상의 분변을 혼합하여 희석액 (Table 7)으로 103배로 희

석한다.

② 희석 후 modified EG broth (Table 8)에 2.5% 접종한 후 37℃ 항온기에서 배

양하면서 12, 24, 48시간 때의 생균수를 측정한다.

③ 분변은 Sampling 후 곧 바로 실험에 사용하며, 액체배지에 첨가할 각 시료 추

출물의 첨가량은 0.5% (w/v)다. 총 혐기성균 검출배지로는 EG 배지와 BL배지

를 사용하며 Bifidobacteria는 BS 한천 배지로 배양하여 현미경으로 colony를

확인한다. Lactobacillus 는 LBS 한천배지로 Cl. perfringens는

Neomycin-Nagler

(NN) 한천배지로 E. coli는 DHL한천배지를 사용하여 선택적으로 측정한다.

Table 7. 분변 희석 용액의 조성

Component Amount

KH2PO4 4.5g

Na2HPO4 6.0g

L-cysteine-HCl 0.5g

Tween 80 0.5g

Bacto-agar 1.0g

D.W 1000mL

- 566 -

Table 8. Medium composition of modified EG broth

④ 결과 해석

colony 수를 logCFU/mL로 나타내어 값이 클수록 그 균이 잘 자라는 것으로 판단

한다. 결과는 통계분석하여 유의성 검증은 P<0.05로 한다.

총균수는 109CFU/mL이상이 되어야 하고 유익균인 Bifidus균과 Lactobacillus균

을 증식시키고, Cl. perfringes나 E. coli 의 생육은 억제시키는 결과를 나타내

는 것을 장내균총을 개선시킬 수 있는 유용한 소재로 선별한다.

◎ 참고 : 이현아 et al (1997)

pH 및 β -glucuronidase 와 tryptophanase의 활성을 측정 - 보조시험항목

① GAM배지 5mL에 각 시료의 추출물 0.5%를 가하여 배지의 pH를 7.2로 맞춘다.

② pH를 맞춘 뒤 멸균하고 건강한 한국인의 장내세균총으로 신선한 분변을 혐기성

배지로 10배 희석한 액을 5ul 이식한다.

③ 37℃에서 혐기적 배양기에서 20시간 배양한 후 pH 및 β -glucuronidase 와

tryptophanase의 활성을 측정한다.

④ β -glucuronidase 효소활성의 측정: 10mM p-nitrophenyl β -D-glucuronide

0.02mL, 0.1M sodium phosphate buffer 0.38mL을 넣은 반응액에 효소액 0.1mL

에 가하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후 0.5N NaOH 0.5mL을 가하여 반응을 종료

시키고 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 405nm에서 흡광도를 측정한다.

⑤ tryptophanase 효소활성의 측정: 효소액 0.1mL에 complete reaction mixture

(2.75mg pyrophosphate, 19.6mg disodium EDTA dihydrate, 10mg bovine serum

albumin/100mL 0.05M potassium phosphate, pH 7.5)2mL, 0.04M tryptophan

0.1mL, 증류수 0.1mL을 넣어 37℃에서 30분간 반응시킨 후 color

reagent(14.7g p-dimethylaminobenzaldehyde, 52mL H2SO4)2mL을 넣어 반응을 종

료시키고 원심분리하여 550nm에서 흡광도를 측정한다.

Component Amount

Beef extract 2.0g

Proteose peptone No. 3 10.0g

Yeast extract 5.0g

Na2HPO4 4.0g

Soluble starch 0.5g

Glucose 1.5g

L-cysteine 0.4g

Silicon antifoamer 0.25mL

Tween80 0.5g

Distilled water 1000mL

- 567 -

⑥ 결과 해석: 유산균의 성장촉진으로 pH 저하효과를 보고 장내 유해균이 생산하

는 β -glucuronidase와 tryptophanase 저해효과를 측정하여 유효물질의 장내환

경 개선 효과를 알아본다.

◎ 참고 : 신현경 et al., 1995

앞의 표준시험법 외에도 pH를 일정하게 유지한 환경에서 혼합배양하는 방법과 pH

등 여러 조건들을 일정하게 유지하는 연속배양 방법, 또한 인공장기모델 (ex) TIM

: the TNO Gastro-Intestinal track Model)을 이용한 방법 등도 인정하기로 한다.

하지만 이에 대한 심층적인 비교 분석 및 식품소재를 통한 실제 시험 과정을 거쳐

야 할 것으로 사료된다.

다. 장내 균총 시험법 (인체시험)

장내 세균 동정 및 세균 수 측정법 - 주시험항목

① 통계적으로 검증할 수 있는 수의 대상자를 선정한다.

② 시험 식이를 받기 전과 시험 식이 시작 7-10일 후, 그리고 시험 식이 중단

7-10일 후 (총 3회 이상)에 분변을 수거하여, 즉시 혐기성 희석 용액에 넣어

10배로 희석한다.

③ 희석된 시료를 선택 배지에 도말 한다. 선택 배지는 in vitro 시험에서 사용

한 것과 동일하다.

④ 호기적인 배양인 경우는 24시간, 혐기적인 배양의 경우는 48시간동안 37℃에

서 배양한다.

⑤ colony의 모양을 관찰하고 수를 counting한다.

⑥ 결과 해석: 배지에 나타난 colony들에 대하여 Mitsuoka의 방법에 따라 colony

의 모양과 현미경으로 관찰한 균의 형태와 군집 등을 조사함으로

써 속을 동정하 고, colony의 수를 계산하고 여기에 희석배수를

곱하여 분변 1g당 균수 (CFU/g wet feces)로 나타낸다. 통계 분

석하여 유의성 검증은 P<0.05로 행한다.

◎ 참고 : 류병희 et al., 1998; 이기은 et al., 1996; Bartram et al., 1994

이외에 핵산 (DNA, RNA)을 이용한 미생물 동정법 (ex. PCR)과 항원-항체 반응을

이용한 분석기법 (ex. ELISA)을 통한 장내 세균 동정도 가능하다.

- 568 -

(7) 장손상의 개선

장손상의 개선을 평가하기 위한 시험항목을 <Table 9>과 같이 주 시험 항목과 보

조 시험 항목으로 구분하여 설정하였다.

Table 9. 장손상의 개선과 관련된 주 시험 항목과 보조시험

분 류 주 시험 항목(필수 시험항목)보조 시험 항목

(추가 시험항목)

in vivo

(animal)

감염에 의한 장

손상 개선 - 감염원 공격 접종에 의한 시험법

장손상

개선

동물

모델

- TNBS에 의한 유발

- DSS에 의한 유발

- 주 시험항목 이외의

제시 모델

시험법

- Histopatologic change test

(1) macroscopic assessment

(2) microscopic assessment

- MPO(Myeloperoxidase) activity

- IgG, cytokine

(Th1, IFN-γ , TNF-

α , IL-10 등) level

측정

- Colonic mRNA 분석

in vivo(human) - 설문조사를 통한 시험법

⇒ 장 손상 동물 모델의 경우는 두 가지 이상을 시행하되, 주 시험 모델은

반드시 포함되어야 한다.

가. 감염에 의한 장손상 개선 - 주시험항목

① 실험동물을 설정한다.

② 모든 실험군에 감염원 (Rotavirus 등의 바이러스, Shigella, Salmonella,

Vibrio, Campylobacter jejuni, E. coli, Yersinia 등의 세균, 기생충 등)을

공격 접종한다.

③ 실험식이를 공급하며 설사 빈도 조사 및 분변을 채취한다.

④ 분변에서 감염원의 농도를 측정한다.

⑤ 결과해석: 실험식이를 투여한 군에서 설사증 감소율을 recovery %로 표시. 실

험식이 처리군에서 분변중 감염원의 현저한 감소 관찰.

◎ 참고 : 홍종욱 et al., 2001

나. 장손상 개선 - 동물모델

TNBS (Trinitrobenzene sulforic acid)에 의한 유발 - 주시험모델

원리

- 569 -

접촉성 감작 알레르겐인 Trinitrobenzene sulforic acid (TNBS)를 에탄올과 하께

대장에 관장 투여하면 대장염을 유발할 수 있다. 이 때 에탄올은 점막장벽

(mucosal barrier)을 깨서 TNBS를 장벽으로 들어가게 하는 역할을 한다. 사용하

는 TNBS의 용량과 에탄올의 농도는 연구마다 다양하며 연구자에 따라서도 다르

다. 이 모델은 쥐, 토끼, 생쥐에 모두 적용될 수 있으나 각 동물마다 임상양상은

약간씩 다르게 나타난다. TNBS가 장에 저촉되게 되면 산화적인 손상에 의해 급성

전층성 괴사를 일으키게 된다. 관장 후 수일 내에 급성 괴사와 염증이 생기고 그

후로는 단핵구 침윤 등과 함께 만성 염증 소견을 보인다. 쥐에서는 궤양과 섬유

화 등이 잘 보이나 생쥐에서는 궤양이 뚜렷하게 나타나지 않는다. 육아종이 도안

되는 경우도 있으나 항상 그렇지는 않다. TNBS 유발 대장염 및 소장염 모델의 장

점으로는 값싼 쥐를 이용할 수 있다는 점과 반복성이 있다는 점, 전벽성 궤양을

얻을 수 있는점, 면역기전을 통한 병변이므로 만성염증까지 유발할 수 있어 사람

의 염증성 장질환에 근접하다는 점을 들 수 있겠다. 단점으로는 TNBS와 에탄올

양을 쥐와 연구자에 따라 조절해야 하고 경험을 필요로 하며, 병변이 국소적이어

서 면역학적 연구가 어려울 수 있다는 점이다.

표준시험법

① 6주령의 SD rat 또는 BALB/c mice를 준비한다.

② 50% 에탄올에 40mg/mL로 녹인 TNBS를 rat은 1mL, mice는 100㎕씩 항문을 통해

투여하여 장염을 유발한다.

③ 예방 효과 test : 염증을 유발하기 전에 pretreat하고, 염증 유발 수일 후 희

생, 개선 효과 test : 염증 유발시킨 다음날부터 treat하여 수일 후 희생, 예

방 및 개선 효과 test : 염증을 유발하기 전에 pretreat하고, 염증 유발 후에

계속해서 treat하여 수일 후에 희생.

◎ 참고 : villegas et al., 2003

DSS (Dextran sulfate sodium)에 의한 유발

원리

쥐, 생쥐, 햄스터에게 5% DSS (dextran sulfate sodium)를 경구 섭취시키면 대장

염을 유발할 수 있다. 초기 병변은 주로 좌측대장에 발생하며 혈변, 체중 감소,

대장의 축소 및 점막 궤양 등이 생긴다. 점막의 식세포 내에 DSS가 섭취되어 있

고 호중구가 주로 침윤한다. 시간이 지나면서 형질세포 및 림프구 등이 침윤하게

되고 만성 염증의 소견을 띠게 된다. DSS를 100-180일간 장기간 복용시키면 50%

에서 대장암이 생기게 되고 염증 또한 전대장에 걸쳐 나타난다. 이 모델은 쉽게

재연할 수 있고 만성 염증 소견을 얻을 수 있어 약물의 효능 검사나 대장의 이형

성 (dysplasia) 및 선암 (adenocarcinoma)의 연구에 이용되고 있다.

- 570 -

표준시험법

① 6주령의 SD rat 또는 BALB/c mice를 준비한다.

② 5%의 DSS를 마시는 물 (음료수)에 첨가하여 경구투여 한다.

③ 예방 효과 test : 염증을 유발하기 전에 pretreat하고, 염증 유발 수일 후 희생

개선 효과 test : 염증 유발시킨 다음날부터 treat하여 수일 후 희생,

예방 및 개선 효과 test : 염증을 유발하기 전에 pretreat하고, 염증 유발 후에

계속해서 treat하여 수일 후에 희생.

◎ 참고 : Setoyama et al., 2003; Naito et al., 2003; Macoto et al., 2003

보조 시험 동물모델

다음 Table 10에 제시한 동물 모델 중, 주시험 동물모델을 제외한 것들을 보조시

험 동물모델로 한다. 즉, IL-10 (Intereukin-10) deficiency 모델, SAMP1/Yit 모

델, C3H/HeJBir spontaneous 모델, acetic acid 모델, 면역복합체/포르말린 모

델, HLA-B27/beta2 microglobulin 모델, T세포 수용체 knockout 모델 등을 보조

시험 동물모델로 설정하였다.

Table 10. 장 손상 동물 모델 비교

종류 방법 병변 장점 단점

TNBS

(Trinitrobe

nzene

sulforic

acid)

TNBS를 에탄올과 함께 대장에 관장 투여

수일 내에 급성 괴사와 염증. 그 후로는단핵구 침윤 등과 함께 만성 염증

값싼 쥐를 이용, 반복성, 전벽성 궤양.사람의 염증성 장질환에 근접하다는 점

TNBS와 에탄올 양을 쥐와 연구자에따라 조절 해야 함.병변이 국소적

DSS

(Dextran

sulfate

sodium)

5% DSS를 경구 섭취

초기 좌측대장에 발생하며 혈변, 체중 감소, 대장의 축소 및 점막 궤양 나중에 만성 염증 유발됨.

쉽게 재연할 수 있고 만성 염증 소견을 얻을 수 있음.

IL-10

deficincyIL-10 유전자를 knockout

십이지장, 상부 공장, 상부 대장이 심함. 분절성인 경우 많음

장의 점막 상피에 MHI Ⅱ 항원이 높게 발현

Th 1 반응에 치우쳐 있다.

- 571 -

종류 방법 병변 장점 단점

SAMP1/Yit Senescence-accelerated mouse line을 20대 이상 Inbred.

20주령이 되면 자발적으로 회장염 유발

C3H/HeJBir

spontaneous

급성과 만성 양상을 모두 가짐. 궤양,

음와 농양, 상피

재생의 조직 소견.

자발적이고

면역체계와 연관되어

인간이 염증성

장질환과 유사하다.

중증의 경우의 연 구에는 부적합.

돌연변이가 밝혀져

있지 않다.

Acetic acid희석된 acetic acid를

대장 내강 내로 주입

상피괴사와

점막,점막하고

유근충의 부종

방법이 쉽고 비용이

적게 든다.

염증이 비특이적이고

만성적이지 않다.

이론적으로 사람의

염증성 장질환의

성격과 다르다

면역복합체/

포르말린

0.45% unbuffered

formaldehyde 4mL를

직장에 주입하고,

2시간 후에 0.85mL의

면역 복합체를

정맥주사

호중구 침윤, 호산구

침윤, 급성 음와염,

음와 농양

염증의 지속 기간 이 짧고 비용이 많이

든다.

재연성이 적어 약제의 치료효과

연구에는 부적합

HLA-B27/bet

a2

microglobul

in

대장에 단핵구가 미만성으로 침윤되어

있으며,조직소견은

일정하지 않다.

장내세균, 면역체 계, 감수성 유전자

등이 질병의 발생에

주는 영향을 연구할

수 있다

대장염의 재발과

관해를 볼 수 없고

급성기가 없으며,

잠복기가 길고

비용이 많이 든다

T 세포

수용체

knckout

T 세포 수용체가 돌연변이에 의해 결손

대장점막에 급성 및 만성 염증 세포가

침윤.

음와 농양

궤양이나 육아종,

섬유화 등은

관찰되지 않는다

Ref) 정현채, 2001

나. 장손상 개선 시험항목 (동물시험)

Histophysiological change test (조직 생리학적 평가)

① Macroscopic assessment (육안으로 평가)

절제한 대장을 종축으로 열고 생리식염수로 씻은 후, 직장에서부터 맹장까지 궤

양과 미란 등의 병변이 있는지 관찰하고 대장병변의 정도를 육안적으로 평가하

여 발적 및 비후 정도, 궤양의 크기 등을 기준으로 10등급으로 분류한다.

◎ 참고 : 장동경 et al., 1998

- 572 -

Table 11. 육안평가표

Score Gross morphology

0 no damage

1 hyperemia

2 hyperemia and thickening

3 linear ulceration without hyperemia or thickening

4 2 or more sites of ulceration

5 ulceration > 1cm along the length of clolon

6-10 if ulceration > 2cm, the score is increased by 1 for each

additional cm of involvement

② Microscopic assessment(현미경으로 관찰)

Table 12. 현미경 관찰을 통한 평가표

희생한 동물의 대장 말단 부분의 조직을 sampling하여 종축으로 열고, 10%

formaldehyde (in PBS buffer) 용액에 고정시킨다. 고농도의 에탄올에 탈수시키

고, paraffin에 파뭏는다. Deparaffinized 시켜서 rotary microtome (Leica Ultr

acut)으로 7㎛ (두께)로 자른다. 자른 section을 슬라이드 글라스 위에 놓고

hematoxylin-eosin으로 염색하여 광학 현미경으로 관찰한다. 위의 <Table 16>에

따라 염증 정도를 점수화한다.

◎ 참고 : Hong et al., 2002

Score Gross morphology

0

1

2

<ulceration>

no ulcer

small ulcers < 3 mm

lare ulcer > 3mm

0

1

2

3

<inflammation>

none

mild

moderate

severe

0

1

2

3

<depth lesion>

none

submucosa

muscularis propria

serosa

8 maximum score

- 573 -

MPO (Myeloperoxidase) activity

MPO는 중성구의 neutrophilic granule에 풍부하게 존재하는 효소로서 염증이 발

생하여 중성구가 활성화되면 분비가 증가되므로 조직의 염증 정도를 나타내는 양

적 지표로 사용될 수 있다.

표준시험법

① 먼저 점막 50mg을 취하여 0.5% hexadecyl-trimethylammonium bromide (HETAB)

와 10mM EDTA가 포함된 10mM PBS, pH 7.0, 1mL을 넣어 voltexing 한다.

② -70℃로 얼렸다 녹이기를 3번 반복하고 (혹은 sonication) 나서 20,000g, 4℃

에서 30분간 원심분리한다.

③ 상층액을 취하여 1.6mM tetramethyl benzidine (TMB)를 넣고 37℃에서 5분간

반응시키고, 0.1 또는 0.3mM H2O2를 첨가한다.

④ 37℃에서 3분간 반응시키고 나서 catalase (20㎍/mL)와 0.2M sodium acetate

를 첨가하여 반응을 종결시킨다.

⑤ spectrophotometer로 655nm에서 흡광도를 측정한다.

⑥ 결과해석: 1 unit은 1분 동안에 1 μ mol의 H2O2를 물로 환원시키는 능력으로

정의하고 최종적인 단위는 protein 양으로 나누어 unit/mg protein으로 한다.

◎ 참고 : Maity et al., 2003

보조 시험 항목 (동물모델)

- IgG, cytokine (Th1, IFN-γ , TNF-α , IL-10 등): ELISA kit를 사용하여 측정

한다.

- colonic mRNA: RT-PCR을 사용하여 측정한다.

다. 장손상의 개선 (인체시험)

설문조사를 통한 시험법

원리

장운동 장애로 인한 장기능장애를 보이는 대상자들과 염증으로 인한 장기능장애

를 보이는 대상자들을 각각 대조군과 실험군으로 나누고 일정기간 동안 실험군에

서만 기능성 시료를 투여한 후, 설문조사를 통해 효과를 판정한다.

표준시험법

① 성인에서 3주 이상 설사가 지속되고 복통, 피로감, 체중감소, 어지럼증을 호

소하는 사람을 대상으로 하고 상부위장관질환, 대장용종이나 대장암 및 크론병,

궤양성 대장염 환자는 배제한 반건강인을 모집한다.

- 574 -

② 통계적으로 유의성을 검증할 수 있는 사람의 수를 정하여 이들을 두 군으로

나누어 한 군에서는 유효물질 Xmg을 매끼 식사와 함게 하루 3회 4주일간 복용하

게 하며, 또 다른 군에서는 유효물질과 크기와 모양이 같은 것을 (placebo)복용

하게 한다.

③ 매주 방문하도록 하고 2, 3, 4차 방문 시 받은 것을 지참하게 하고 복용의 충

실도와 부작용의 유무 및 종류를 점검한다.

◎ 참고 : 이정일 et al., 1987; 김용태, 1992; Soren et al., 2000

관찰 및 임상검사 종목과 방법

① 1차 방문시는 설사 및 제반 병력 청취를 실시한다. 1차 방문시 연구자는 시험

유효물질 복용전 24시간 동안의 설사의 횟수를 기준으로 설사의 심한 정도를

3~4회일때에는 심함, 1.2 회일 때 중등도라고 하고 복용전 1주일 동안 1~2회일

때에는 경미한 것으로 평가한다.

② 1, 2차 방문시 대상자의 목표 증상들 (복통, 복부 팽만감, 배변의 긴박감)과

관련 증상들(식욕부진, 허약감, 구갈, 현기증, 피로)에 대하여 각 증상별로 증

상의 심한 정도를 나타내는 지수 0 (증상 없음), 1 (대상자가 증상을 느낄 정도

이나 정상적인 일상 활동에 지장이 없는 중등도 증상), 2 (정상적인 일상 활동

에 지장이 있는 심한 증상), 까지의 4단계로 평가한다.

③ 1, 2차 방문시 설사의 심한 정도를 대상자가 시각적 아날로그 척도 (visual

anlogue scale, VAS)에 표시하도록 한다. 대상자 자신이 판단하는 유효물질의

효과에 대하여도 VAS에 표시하도록 한다.

효과 평가 기준 및 방법 (5차 방문시)

① 변이 형태가 있으면서 임상증상이 거의 소실된 경우를 특효 (excellent), 변

이 형태가 있거나 임상증상이 현저히 개선된 경우를 유효 (good), 변의 굳기나

임상증상이 약간 개선된 경우를 약간 저효 (moderate), 효과가 거의 없는 경우

를 무효 (no effect)로 판정. 유효와 무효를 보인 환자는 효과가 없는 것으로

간주

② 설사가 완화될 때까지 소요된 시간은 대상자가 기록일지에 기록한 내용을 근

거로 산정. 지사효과가 처음 나타날 때까지의 소요 시간 (time to first

relief, TFR)이 24시간 이내일 경우 조기효과 (early event)가 있는 것으로 간

주. 완전한 지사 효과가 나타나는 때까지의 소요시간 (time to complete rel-

ief, TCR)은 TFR 이후 48시간 동안 형태 있는 대변만을 보거나 또는 배변이 없

는 경우 처음 유효물질 복용 시간으로부터 그 48시간의 시작 시간까지로 함.

변비양 기간 (constipation-like period)은 48시간동안 전혀 대변을 보지 못하

는 경우로 함

- 575 -

③ 설사가 완화될 때까지 복용한 물질의 수는 대상자 기록 일지로 산정

④ 설사의 심한 정도는 VAS 로 평가

통계 분석 방법

① 제반변수는 중앙값 및 25-75% 범위로 표시

② 통계 프로그램은 StatView Ⅱ (v 1.03, Abacus Concepts, U.S.A)를 이용하여

양군 사이의 연속변수나 증상 지수의 비교는 Mann-Whitney U test로, 동일군 내

에서 1차 방문과 2차 방문간의 변수 비교는 Wilcoxon signed-rank test, 양군

사이의 증례 수의 비교는 χ 2 test로 검증하고, 유의수준은 0.05 미만으로 함

결과해석

- 대상자의 특성

완료된 예들에서 1차 방문시 유효물질 투여군과 위약군 사이의 성별, 연령, 설사

의 지속기간 및 심한 정도,VAS, 목표 및 관련증상들의 정도의 차이가 없어야 한

다.

- 시험 유효물질의 효과

① TFR (지사 효과가 처음 나타날 때까지의 소요시간), 조기효과, TCR (완전한

지사 효과가 나타나는 때까지의 소요시간)은 유효물질처리군에서 유의하게 높게

관찰되어야 한다.

② 환자가 느끼는 주관적인 설사의 정도를 나타내는 VAS 는 유의한 차이 보여야

한다.

③ 목표 및 관련 증상들 중 복통, 식욕부진은 개선정도가 유효물질 처리군에서

유의적으로 높아야 한다.

④ 임상적 효과를 전체적으로 종합하여 각 연구자가 내린 유효물질의 전반적 효

과는 유효물질 처리군에서 유의하게 높아야 한다.

(8) 배변활동 개선

가. 원리

대장은 배설되기 전의 음식 찌꺼기를 보관하며, 소화되지 않은 음식물을 발효시

켜 단쇄지방 (acetate, propionate, butyrate 등), 아민류, 암모니아, 이산화탄

소, 메탄, 수소가스 등을 만든다. 대장까지 내려온 음식 찌꺼기는 대장의 기능에

영향을 미친다.

섭취한 음식물 중 cellulose성 섬유질은 75-100% , pectin과 non-cellulose성 섬

유질의 27-100%가 대장에 들어오게 된다. Cellulose성 섬유질은 대부분 배설이

되지만 pectin과 non-cellulose성 섬유질들은 5% 정도만 배설되고 나머지는 대장

- 576 -

에 있는 세균에 의해 기질로 이용되어 대장기능을 좌우하게 된다. 즉 장내의 유

용균인 비피더스균이나 황산균이 증식하여 장관내는 pH가 저하되어 산성화되고,

바람직하지 않은 장내 세균의 증식은 억제된다. 그 결과 비피더스균이 우세한 장

내균총이 형성되어 부패물 등이 감소하고 장내 환경이 개선된다.

섬유질에 의해 생성되는 단쇄지방산은 대장내 세균의 세포증식을 촉진시키고, 대

장내 질소를 세균의 단백합성에 이용되게 하므로 결과적으로 대장내 질소를 감소

시킨다. 인간의 대장 점막 (esp, 하행결장)은 에너지원으로 butyrate를 절대적으

로 필요로 하며, 점막세포가 butyrate를 흡수하지 못하면 궤양성 대장염이 발생

하게 된다. 즉 단쇄지방산은 정상적으로 점막세포 성장을 촉진하여 점막을 강화

하는데 매우 중요한 작용을 한다.

Cellulose성 섬유질은 대변의 양을 증가시키고 배출시간을 현저히 감소시킨다.

음식물이 장에 오래 정체되면 압력이 높아져 게실염과 같은 질환을 일으키는데

cellulose성 섬유질은 장 내부 압력을 감소시켜 변의 양을 늘리고, 배변 회수를

증가시키며, 통과시간을 짧게 한다. 또한 cellulose성 섬유질의 소화과정 중의

지방, 담즙산 등을 흡착하여 같이 배설되게 하므로 혈중 중성지방과 콜레스테롤

의 양을 유의적으로 감소시킨다.

식이섬유소는 이와 같이 대장내 균총에 의한 발효를 증가시켜 단쇄지방산을 생성

하여 pH를 낮추고, 낮은 pH에서는 담즙산과 지방산이 이온화되지 않은 형태로 배

설되므로 대장 점막을 손상시키는 정도가 약하기 때문에 대장암의 발생률을 낮춘

다고 보고되고 있다.

나. 표준시험법

배변활동 개선과 관련된 기능성을 평가하기 위한 시험항목을 Table 13과 같이 주

시험항목과 보조시험 항목으로 구분 설정하였다.

Table 13. 배변활동 개선과 관련된 주 시험 항목과 보조 시험 항목

분류 주 시험 항목 보조 시험 항목

동물 시험

- 변의 중량 및 수분량

- 소화관 운동능

① 황산 바륨을 이용한 방법

② 장관 운동 기록법

(physio graph)

인체 시험

- 변의 중량 및 수분량

- 소화관 운동능

(장관 통과 시간)

- 문진과 설문 조사

- 577 -

⇒ 인체시험에 있어서 주 시험 항목 중, 변의 중량 및 수분량과 소화관 운동능 둘

중의 하나 이상은 필수이며, 문진과 설문조사만으로는 인정하지 않는다.

다. 동물 시험 - 보조시험항목

변의 중량 및 수분량

① 통계적으로 검증할 수 있는 수의 실험 동물 (일반적으로 성숙한 흰쥐를 사용)

을 실험군과 대조군으로 나누고 실험군에게는 실험 식이를, 대조군에게는

placebo를 일정 기간동안 제공한다.

② 대시케이지에서 4일동안 배설되는 대변을 하루 1회씩 수집

③ 즉시 습중량을 칭량한 후 냉동건조

④ 건중량을 칭량하고 습중량과의 차이를 수분함량으로 함

⑤ 결과 해석: 분변의 양과 수분량이 대조군과 유의적인 차이를 보임.

소화관운동능 (이동속도) - 황산바륨을 이용한 방법

생체 내의 소화관 운동은 자율 신경에 의해 조절된다. Choline성 약제, 항

adrenaline제제는 소화관 운동을 촉진하며 항 choline 제제, adrenaline, 도파민

등은 소화관 운동을 억제한다. 식품 중의 난소화성 식이섬유가 소화관 운동에 영

향을 주는 정도는 식품의 종류마다 달아 일관성이 없지만 대체로 불용성 식이섬

유에 비해 수용성 식이섬유가 더 큰 영향을 주는 것으로 나타난다. 일반적으로

흰쥐에서 황산바륨을 경구 투여하여 이것의 소화관내 이동속도를 측정하는 in

vivo 실험이 일반적이다.

표준시험법

① 통계적으로 검증할 수 있는 수의 실험 동물 (일반적으로 성숙한 흰쥐를 사용)

을 실험군과 대조군으로 나누고 실험군에게는 실험식이를, 대조군에게는

placebo를 일정 기간동안 제공한다.

② 실험 동물을 16시간 이상 절식시킨다.

③ 소장의 운동에 영향을 주는 약물을 투여한 경우 일정시간 (피하나 경구투여인

경우 30분-1시간, 정맥투여인 경우 15분)후에 10% 황산 바륨 (5% 아라비아 고무

현탁액)을 흰쥐용 경구투여기로 10mg/kg 의 수준으로 투여한다.

④ 10% 황산 바륨 투여 30분~1시간 후에 흰쥐의 경부를 단두기로 절단하고 두부

를 밑으로하여 방혈시킨다.

⑤ 흰쥐의 복부를 정중선을 따라 절개하고 위의 유문부에서부터 직장부까지 장이

끊어지지 않도록 적출한다.

⑥ 적출한 소화관은 절개하여 황산 바륨의 최선단부를 확인한다.

- 578 -

⑦ 적출한 소화관은 측정하기 쉽도록 늘려서 유문부에서 황산바륨 선단부까지의

이동거리를 측정한다. 그리고 유문부부터 직장부까지의 거리 (소화관 전체길이)

를 측정한다.

⑧ 투여한 황산 바륨의 소화관 이동률 (T)을 구하기 위해 소화관 전체길이 (A)와

황산바륨의 최선단부까지의 이동거리 (B)로부터 다음 식을 이용해 산출한다.

(T=(B/A)×100(%))

⑨ 결과해석: 위의 식으로 결과를 나타낼 경우 통과시간의 절대값을 구하는 것이

아니라 각 군의 T값을 구하여 비교함으로서 실험 식이의 효과가 어느 정도 나타

나는지를 알아볼 수 있다.

소화관운동능 (이동속도) - 장관 운동 기록법 (Physio graph)

① 통계적으로 검증할 수 있는 수의 실험 동물 (일반적으로 성숙한 흰쥐를 사용)

을 실험군과 대조군으로 나누고 실험군에게는 실험식이를, 대조군에게는

placebo를 일정 기간동안 제공한다.

② 실험동물을 희생시킨 후, 즉시 복강을 열고 원하는 부위의 장을 적출한다.

③ 적출한 장을 100% O2가 공급되고 있는 정상 생리적 영양액속에서 길이 2.0cm,

폭 0.5cm가 되게 근 절편을 제작한다.

④ 제작된 근 절편을 20mL 용 organ bath 저부에 고정시키고 다른 쪽 끝을 근수

축 변환기에 연결하여 physio graph를 통하여 평활근의 등장성 수축 (isomeri-

tic contraction)을 기록한다. Organ bath 내의 영양액은 37℃를 유지하며,

100% O2를 계속 공급한다.

⑤ 결과해석: migrating myoelectric complex (MMC) cycle로 장운동성을 분석한

다.

◎ 참고 : 김주헌, 1987; 남치주, 2002

라. 인체 시험

변의 중량 및 수분량

① 배변에 곤란을 느끼는 반 건강인과 일주일에 3-4회 이하의 변을 보는 사람을

대상으로 하며, 통계적으로 검증할 수 있는 수의 실험군과 대조군을 선정한다.

② 3일동안 배설되는 대변을 하루 모두 수집하여 즉시 습중량을 칭량

③ 냉동건조시킨 뒤 건중량을 칭량하고 습중량과의 차이를 수분함량으로 함

④ 결과해석: 분변의 양과 수분량이 대조군과 유의적인 차이를 보임.

◎ 참고 : 식품영양실험핸드북, 2000

- 579 -

소화관 운동능 (이동속도)

① 배변에 곤란을 느끼는 반 건강인과 일주일에 3-4회 이하의 변을 보는 사람을

대상으로 하며, 통계적으로 검증할 수 있는 수의 실험군과 대조군을 선정하고,

실험군에게는 실험 식이를, 대조군에게는 placebo를 일정 기간동안 공급한다.

② 시험 식이를 중단하는 날에 20개 이상의 표지자 (Sitzmarks T.M.)를 아침식사

전후의 일정한 시간에 경구투여 한다.

③ 표지자의 경구 투여 후 만 3일째와 만 5일째에 골반부를 충분히 포함하는 복

부방사선촬영 (KUB)을 하여 그 진행정도를 확인한다.

④ 좌, 우측 대장과 직장 및 S상 결장의 구분은 제 5번 요추와 골반출구 (pelvic

outlet)을 연결하는 선의 상부와 척추의 극돌기 (spinous process)를 연결하는

선의 우측을 우측대장, 척추의 극돌기를 연결하는 선의 좌측으로 제 5번 요추와

전상장골릉 (anterior superior iliac crest)을 연결하는 선의 상부를 좌윽대

장, 5번 요추와 골반출구, 5번 요추와 전상장골릉을 연결하는 선의 하부를 직장

및 S상 결장으로 구분한다.

⑤ 결과해석: 표지자의 20%이상 대장에 남아 있으면 변비로 진단되며, 링의 남은

분포를 보고 소화관 이동 속도를 평가할 수 있다.

◎ 참고 : 노임환 et al., 1990; 정문기 et al., 1996; Guimaraes et al., 2001

배변활동 개선과 관련된 문진, 설문조사

① 피험자는 반 건강인으로 정하고 피험자수는 통계적인 처리에 의해 유의 수준

의 판정이 가능한 인원수로 설정하여 실험군과 대조군으로 나눈다. 사전조사에

의해 배변횟수가 일정할 때 일주일간의 배변횟수에 따라 그룹 설정을 하는 것이

바람직하고, 주당 3-4회 이하의 배변을 보이는 대상자를 선정한다.

② 피험자의 변의 특성을 조사표로 사전조사를 하여 배변횟수의 차가 적고 묽은

변 혹은 정상변의 변 특성을 나타내지 않는 피험자로 한다.

③ 실험군에게는 실험 식이를, 대조군에게는 placebo를 일정기간 동안 제공한다.

④ 시험식품 조사표를 피험자에게 배포하고 시험일정, 조사표의 회수일정, 주의

사항 등을 철저히 교육한다.

⑤ 피험자 전원에게 배변횟수, 배변량, 변의 단단한 정도, 색, 냄새, 통변감을

수치화한 표를 제공하고 이를 순차적으로 회수한다.

⑥ 결과 해석: 조사표의 항목에 대해 개개의 데이터, 몸의 상태, 특기사항 등을

기록하고 통계적으로 해석한다. 유의수준 선정과 함께 적절한 검정방법을 이용

해 유의한 결과가 있는지 도출한다. 통계법은 모집단의 분포양식에 따라 선정되

나 정규분포를 기대할 수 없는 경우에는 t-test 보다 Wilcoxo 검정이나 부호검

정이 적합하다.

◎ 참고 : 나현주 et al., 2000; 안태석, 1999

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4. 위장 기능 조절 관련 기능성 평가 시험법 실험결과

(1) 위 기능 조절 관련 기능성 평가 실험 결과

가. 실험 1-1. HCl & EtOH로 유도한 위 손상의 억제 효과

실험동물: 서울대학교 동물사육장의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 분양 받아 실

험에 사용하였다. 일반적인 사육 환경은 NIH guide line을 따랐으며, 조명은 12

시간 간격으로 조절하였다. 절식시키기 전까지 고형사료 (Rodent diet 5057,

Purina Korea)와 물을 자유롭게 섭취하도록 하였다.

실험 시료

① 약쑥 (Artemisia asiatica Nakai) 추출물: 강화도에서 생산된 사자발쑥 (숙

성, 건조시킨 사자발쑥을 구매)

② 부추 (Allium tuberosum Rottler) 추출물: 경기도 하남시에서 생산된 조선부

추

추출물 제조 방법

① 추출: 시료 분량의 5배의 95% ethanol을 시료에 가해 20℃ Water Bath에서 4

시간씩 3회 반복 추출 하였다.

② 감압 농축: 40℃에서 감압 농축하여 용매를 날려보낸 뒤 농축된 추출물을 얻

었다.

③ 동결 건조: 농축된 추출물에 남아 있는 용매를 제거하기 위해 동결 건조하여

농축물을 건조하여 최종시료를 얻었다.

시료 투여 방법

12% Tween 80 (Sigma)용액에 추출물을 녹여 1.6mL의 시료 용액을 만들어 존대로

경구 투여하였으며, 시료의 dose는 50mg/kg, 250mg/kg, 500mg/kg (body weight)

이었다. 대조군에는 12% Tween 80 용액 1.6mL를 경구 투여하였다.

실험방법

① 체중 330±15g의 Sprague-Dawley계 male rats 5마리를 1군으로 하여 대조군,

약쑥실험군 (50mg/kg, 250mg/kg, 500mg/kg), 부추실험군 (50mg/kg, 250mg/kg,

500mg/kg)에 대한 실험을 실시하였다.

② 시료를 경구 투여하기 전에 24시간 이상 절식시켰다.

- 581 -

③ 시료를 경구 투여하였다.

④ HCl-ethanol (150 mM HCl을 함유한 60% ethanol) 1mL를 경구 투여하였다.

⑤ 절식, 절수하여 1시간 방치 후 염산케타민(유한양행) 50mg/mL 3mL를 복강 투

여하여 치사시켰다.

⑥ 위를 적출하고 위의 대만부를 절개해 pH paper를 사용하여 위의 pH를 측정하

였다.

⑦ 위를 생리식염수에 세척하고 여과지로 물기를 제거해 준 뒤 무게를 측정하였

다.

⑧ 위를 2% formalin 용액 10mL에 10분간 담구어 고정시켰다.

⑨ 위에 발생된 손상길이 (mm) 또는 손상면적 (mm2)을 Digital Caliper로 측정하

였다.

결과해석 방법

손상 지수의 산출은 다음과 같은 식을 이용하여 억제율 (%)을 구하였다.

억제율(%) =대조군의 손상 면적 - 시료군의 손상 면적

X 100대조군의 손상 면적

자료의 처리 및 분석

실험결과 얻은 수치는 평균치와 표준편차를 계산하고 대조군과 실험군간의 차이

는 Student's t-test를 사용하여 5% 유의수준에서 유의성을 검증한다.

실험결과

Table 14. Rat의 염산-에탄올로 유발한 위 손상에 대한 약쑥과 부추 추출물의

효과 (위 손상 면적, mm2)

TreatmentDose

(mg/kg, p.o)

No. of

animals

Lesion index (mm2)

(mean±S.D.)

Inhibition

(%)

대조군 3 36.94±27.59

약쑥 실험군

50 4 4.25±4.99 88.5

250 5 0.47±0.55 98.7

500 5 3.39±6.11 90.8

부추 실험군

50 3 6.45±9.50 82.5

250 5 2.80±5.25 92.4

500 5 0 100

- 582 -

고찰

자극에 의한 위 손상의 유발 실험에서 가장 중요한 통제 요인은 각 개체별로 동

일한 환경에서 동일한 자극을 주어야 한다는 것이다. 실험 결과에서 알 수 있듯

이 약쑥 추출물과 부추 추출물 모두 위 손상 억제에 있어 높은 효과를 나타냈는

데, 이 효과를 판단할 때에는 시료 자체가 지닌 기능성뿐만 아니라 결과에 영향

을 미칠 수 있는 위 손상 유발 조건이 동일했는가도 중요하다. 본 실험은 rats를

24시간 절식시킨 뒤 시료를 투여하고 30분 뒤에 위 손상 자극 (HCl-ethanol)을

주었는데, 위의 대만부를 절개하여 내부를 관찰한 결과, 여러 마리의 rats에서

시료 외의 물질 (배설물 및 깔개)로 보이는 위 내용물이 상당량 존재하였다. 시

료 외의 위 내용물의 영향으로 HCl-ethanol에 의한 위 손상이 제대로 유발되지

않는다면 시료에 의한 위 손상 억제 효과가 과다 평가될 가능성이 있다. 또한 본

실험의 결과에서 동일군 내의 개체들간에 위 손상 면적의 차이가 큰 것도 불완전

한 절식으로 인해 각 rat 개체별 위 손상이 동일한 조건에서 유발되지 않은 데에

원인이 있을 수 있다. 대조군과 실험군 사이의 위 손상 면적의 평균치간에 차이

가 큰 데도 불구하고 동일군 내의 개체들의 위 손상 면적의 차이가 커 (큰 표준

편차) t-test 결과에서 유의한 차이를 나타내지 않았다. 따라서 동일한 조건에서

위 손상을 유발시키기 위해 향후 실험에서는 완전한 절식을 위한 조치가 필요하

다. 예를 들어, cage에서 배설물이 아래로 떨어져 rat이 접근할 수 없도록 높이

가 높은 wired plate를 깔개 대신 cage 바닥에 장치해야 한다. 본 실험의 문제점

을 해결하기 위해 보충 실험을 실시하여 시료의 위 손상 억제 효과를 다시 점검

해 보았다.

나. 실험 1-2. HCl & EtOH로 유도한 위 손상 억제 효과 보충 실험

실험방법

보충 실험의 실험 동물, 실험 시료, 추출물 제조 방법, 시료 투여 방법은 실험

1-1과 동일하다. 단, 이 실험에서는 양성대조군을 추가하여 대조군, 양성대조군,

부추실험군을 대상으로 실험을 하였으며, 대조군에는 12% Tween 80 용액 1.6mL를

경구 투여하였고 양성대조군에는 cimetidine (sigma) 100mg/kg을 12% Tween 80

용액에 녹여 1.6mL의 용액을 만들어 경구 투여하였으며 부추실험군에서는 부추

추출물 500mg/kg을 12% Tween 80 용액에 녹여 1.6mL의 용액을 만들어 경구 투여

하였다. 실험에 사용된 rat은 체중 444±24g의 Sprague-Dawley계 male rats이었으

며 절식기간동안 철저한 통제를 위해 cage에 wired plate를 장치하였다. 그 외의

실험 과정은 실험 1-1과 동일하며 실험 결과 해석 방법과 자료의 처리 및 분석

방법도 1-1과 동일하다.

- 583 -

실험결과

Table 15. Rats의 염산-에탄올로 유발한 위 손상에 대한 cimetidine과 부추

추출물의 효과 (위 손상 면적, mm2)

TreatmentDose

(mg/kg, p.o)

No. of

animals

Lesion index (mm2)

(mean±S.D.)

Inhibition

(%)

대조군 3 1451.10±334.08

양성 대조군

(cimetidine)100 4 38.81±31.92

*97.3

부추 실험군 500 5 0.85±1.89*

99.9

* significantly different from the control (p<0.05)

<대조군>

<양성대조군>

<부추 실험군>

Fig. 1 대조군, 양성 대조군, 부추 실험군의 위 사진

- 584 -

고찰

본 실험의 결과는 실험 1-1과 비교하여 대조군의 위 손상 정도가 훨씬 심하다는

것을 알 수 있다. 또한 실험 1-1에서 동일군내의 개체별 손상 정도의 차가 커서

대조군과 실험군 간의 유의한 차이가 없는 것에 반해, 본 실험에서는 동일군내의

개체별 손상 정도의 차가 대조군과 실험군 간의 유의한 차이를 가릴 정도로 크지

않았으므로 그 결과 대조군과 실험군의 손상 면적이 유의하게 차이가 났다

(p<0.05). 보충 실험에서 절식의 철저한 통제를 통해 시료 투여 전의 위 공복 조

건을 동일하게 유지한 것이 이와 같은 실험 결과를 얻는 데에 중요한 요인으로

작용하였다고 사료된다.

다. 실험 2. 수침구속 Stress에 의한 위 손상의 억제 효과

실험동물 및 시료 제조투여 방법: 실험 동물 및 시료 제조투여 방법은 HCl-

ethanol로 유도한 위 손상 실험과 동일하다.

실험방법

① Sprague-Dawley계 male rats 2마리를 1군으로 하여 대조군, 양성대조군

(cimetidine 100mg/kg), 약쑥실험군 (50mg/kg, 250mg/kg, 500mg/kg), 부추실험

군 (50mg/kg, 250mg/kg, 500mg/kg)에 대한 실험을 실시하였다.

② 일반 환경 조건 하에서 24시간 절식시킨다.

③ 시료를 경구 투여한다. 시료의 제조 및 투여 방법은 HCl-ethanol로 유도한 위

손상 실험과 동일하다.

④ 시료를 경구 투여한 후 30분 후에 속박틀에 Rat을 구속하여 항온수조에서 수

침을 시작한다. (수온 21±1℃ 유지)

⑤ 20시간 방치한 뒤 ketamine 3mL를 복강 투여하여 치사시킨다.

⑥ 위를 적출하고 위의 대만부를 절개해 pH paper를 사용하여 위의 pH를 측정한

다.

⑦ 위를 생리식염수에 세척하고 여과지로 물기를 제거해 준 뒤 무게를 측정한다.

⑧ 위를 2% formalin 용액 10mL에 10분간 담구어 고정시킨다.

⑨ 위에 발생된 손상길이(mm) 또는 손상면적(mm2)을 Digital Caliper로 측정한

다.

결과해석 방법

손상 지수의 산출은 다음과 같은 식을 이용하여 억제율(%)을 구하였다.

- 585 -

억제율(%) =대조군의 손상 면적 - 시료군의 손상 면적

X 100대조군의 손상 면적

자료의 처리 및 분석

본 실험의 경우 침수속박 스트레스 유발 과정을 검증하기 위한 예비 실험으로

각 군당 마리수를 2마리로 하여 시료의 효능을 평가하였으므로 통계적인 유의성

은 검증하지 않았다.

실험결과

Table 16. Rat에서 침수-속박 스트레스로 유발한 위 손상에 대한 cimetidine,

약쑥 추출물, 부추 추출물의 효과 (손상 면적, mm2)

TreatmentDose

(mg/kg, p.o)No. of animals Lesion index(mm2)

Inhibition

(%)

대조군 2 14.05

Cimetidine 100 1 0.69 95.1

약쑥 실험군250 2 1.95 86.2

500 2 1.10 92.2

부추 실험군250 2 5.66 59.7

500 2 1.62 88.5

고찰

수침·속박 스트레스로 인한 위 손상 유발 실험에서는 개체별로 속박과 수침에 있

어서 동일한 스트레스를 주는 것이 중요하다. 예비 실험에서는 속박틀이 rat의

몸을 완전히 속박하여 위궤양 유발이 잘 되었다. 예비 실험 후 본 실험을 실시하

였으나 예비 실험에서보다 무게가 가벼운 rat을 사용하여 완전히 몸을 속박하지

못하여 궤양 유발이 제대로 되지 못하였다. 이처럼 속박틀이 rat의 몸을 완전히

속박하지 못하는 경우 스트레스에 의한 위 손상이 제대로 유발되지 않으며, 수침

시에 속박틀 안에서 몸을 움직여 물이나 배변물을 먹을 수 있다. 본 실험에서 사

용한 속박틀은 아크릴 재질로 되어 있는데, 속박틀의 크기가 상당히 커서 예비실

험 결과 400g이 충분히 넘는 rat을 대상으로 실험을 해야만 스트레스로 인한 위

손상이 제대로 유발될 수 있었다. 속박틀에 속박이 완전히 될 수 있는 크기를 지

- 586 -

닌 rat을 사용해거나 속박틀을 사용하고자 하는 rat의 체구에 맞게 제작하여 사

용해야 할 것이다.

다. 위 손상 동물 모델의 문제점 및 향후 연구 방향

실험동물을 사용한 대부분의 위 손상 유발 관련 논문들은 다량의 시료의 단 회

투여 후 자극에 의한 위 손상 유발의 방법을 사용하였다. 하지만, 건강기능식품

의 경우 약물과 달리 단 회 투여가 아니라 단기간이라 해도 한 달 이상 섭취하게

되므로, 건강 기능 식품의 효능 평가에 있어 단 회 투여 효과를 평가하는 것보다

는 한 달 이상의 장기 투여 효과를 평가하는 것이 바람직하다. 향후 연구에서는

장기간 시료 투여의 효능 평가법을 설정하여 실제 효능 평가에 적용해보는 연구

가 필요하다. 또한 이 경우 장기간의 시료 투여 방법이나 위 손상을 유발하는 자

극의 적절한 세기와 제공 시기, 개체의 적응 현상 등이 고려되어야 한다.

(2) 장 기능 조절 관련 기능성 평가 실험 결과

가. DSS로 유발한 장손상 동물모델

DSS (dextran sulfate sodium)에 의해 유발한 장염은 앞서 실험법에서도 언급하

였듯이 실험 방법이 간단하고, 쉽게 재연할 수 있으며 만성 염증 소견을 얻을 수

있어 시료의 효능 검사에 매우용이하다(정현채, 2001). 이 같은 사실을 검증하기

위하여 실제 mouse를 실험 동물로 하여 장염유발 실험을 시행하였다.

실험동물: 8-12 주령 된 female, Balb/c mouse를 DSS를 처리한 군과 처리하지

않은 군 (대조군)으로 나누어 각 군당 6마리씩 사용하였다.

실험방법

Drinking water에 5% DSS를 첨가하여 7일 동안 경구투여 하였다. 이 후 동물을

희생하고, 체중을 측정하였다. 또한 장 손상 동물 실험의 주 시험법대로

histopathologic change test (macroscopic assessment, microscopic assess-

ment)를 시행하였다. 5% DSS를 7일간 처리하였을 때 외양적으로 표시가 날 만큼

대조군에 비해서 처리군의 weight가 유의적으로 차이가 남을 확인할 수 있었다.

또한 <Figure 3>에서 볼 수 있는 것처럼 DSS를 처리한 군에서는 처리하지 않은

군과는 달리 장 상피세포층이 매우 얇아지고, 파괴되며 lymphocyte 들이 침윤되

었다. 이와 같은 실험 결과를 통해서 DSS가 장 손상을 유발시킴을 확인할 수 있

었다. 따라서 DSS로 유발한 장 손상 동물모델은 장 손상을 개선하는 기능성 식품

의 평가에 사용할 동물 실험 모델 적합하다고 보여진다.

- 587 -

실험결과 및 고찰

0

5

10

15

20

25

G1 G2

group

weight(g)

Fig. 2. 체중변화(G1: DSS 처리군, G2: DSS 처리하지 않은 군)

< DSS 처리하지 않은 군> <DSS 처리군>

Fig. 3. 조직생리학적 변화 관찰

나. 장내균총평가를 위한 Bifidobacterium selective media 개발

앞서 장내 균총 개선 평가를 위한 실험법으로 제시한 것이 선택 배지를 이용한

세균의 동정 및 세균수 측정이었다. 이 실험법은 현재까지 장내 균총 평가를 위

하여 가장 보편적으로 쓰여지고 있는 실험법으로서 많은 논문들에서 검증이 되어

져 왔다. 그런데 이 실험법은 적합하지 않은 선택 배지를 사용하거나, 선택 배지

의 선택성이 떨어져 여러 가지 균이 혼재하여 배양될 경우, 또한 약한 균은 제대

로 배양되지 않는 배지를 사용하게 되면, 정확한 장내 세균수의 측정이 이루어지

지 않는다. 따라서 선택성이 강하면서도 target 균만은 잘 배양되는 적절한 선택

- 588 -

배지의 개발이 필수적으로 요구된다. 현재 식품공전에 올려져 있는 선택배지들은

이와 같은 배지의 조건들이 충족되지 않는 것들이 많다. 이번 실험은 장내 대표

적인 유익균인 Bifidobacterium을 효과적으로 배양할 수 있는 선택배지를 선정하

는 실험이다. 현재 식품공전의 Bifidobacterium 선택 배지는 BS agar media이다.

본 실험에서는 BS(Bifidobacterium selective) agar 외에, RB(Raffinose-Bifi-

dobacterium) agar(Hartemink et all., 1996), AMC(Arroyo, Martin and Cot-

ton) media(Arroyo et al., 1995), TP(Transgalactooligosaccharide propionate)

media(Ji et al., 1994), 그리고 혐기성 균의 비선택배지 BL(Briggs lver) media

(Mitsuoka, 1984)를 사용하였으며, 이 다섯 가지 배지의 특성을 비교하는 실험을

시행하였다.

실험재료 및 방법

건강한 성인 남녀 8명을 선정하여 대상자의 분변을 받는 즉시 1g을 측정하여, 혐

기성 희석 용액 (PBS)에 넣고 10-fold serial dilution을 시행하였다. 희석된 시

료를 BS agar, RB agar, AMC media, TP media, BL agar에 도말 하였다. 배지의

조성은 <Table 20-24>에 나타내었다. 도말이 끝나면 산소를 치환하여, 37℃에서

48시간동안 혐기적으로 배양하였다. 배양이 끝나면 colony의 모양을 관찰하고 수

를 counting하였다. 배지에 나타난 colony들에 대하여 Mitsuoka의 방법에 따라

colony의 모양과 현미경으로 관찰한 균의 형태와 군집 등을 조사함으로써 속을

동정하였다. 또한 최종적으로 서로 다른 모양의 colony를 따서 MRS broth

media(Hardy)에 다시 배양하고 F6PPK (fructose-6-phosphoketolase) test를 실시

하였고, 양성반응이 나올 경우에 Bifidobacterium임을 확인하였다.

결과는 colony의 수를 counting하고 여기에 희석배수를 곱하여 분변 1g 당 균 수

(CFU/g wet feces)로 나타내었다.

Table 17. Raffinose-Bifidobacterium agar의 조성

ingredients amount(/L) ingredients amount(/L)

Agar bacteriological No.1 18g D(+)-raffinose 7.5gsodium caseinate 5g yeast extract 5glithium chloride 3g sodium propionate 15gL-cysteineHCl 0.5g sodium propionate 0.5gbromocresolpurple 1%

solution.15mL salts-solution 40mL

pH 6.7

*salt soulutionamount(g/L)

MgSO4 0.2 CaCl2 0.2 K2HPO4 1.0 KH2PO4 1.0 NaHCO3 10.0 NaCl 2.0

- 589 -

Table 18. AMC media의 조성

ingredients amount(/L) ingredients amount(/L)

Lab-lemco 10g yeast extract 3g

peptone 10g glucose 5g

starch 1g sodium acetate 3g

sodium chloride 5g Cysteine HCl 0.5g

Lithium chloride 2g Sodium propriate 3g

nalidixic acid 0.02g polymixin B sulphate 0.0085g

kanamycin sulfate 0.05g Iodoaceteate 2,3,5Triphenyltetrazilium 0.0125g

pH 6.8

Table 19. TP agar의 조성

ingredients amount(/L) ingredients amount(/L)

Trypticase(BBL) 10g Proteose peptone NO.3 5g

Ammonium sulfate 3gPotassium phosphate,

monobasic2g

Potassium phosphate,

dibasic1g L-cysteineHCl 0.5g

Magnesium sulfate 0.2g Agar 15g

Filter-sterilized 20%

TOS(Yakult)50mL

Filter-sterilized 30%

sodium propionate pH

7.0

50mL

pH 7

Table 20. BS agar의 조성

* 121℃, 15분간 멸균하여 50℃로 냉각시킨 후, horse blood 5%를 첨가한다.

ingredients amount(/L) ingredients amount(/L)

Beef Extract 3g Liver Extract 5g

Yeast Extract 5g Proteose Peptone 10g

Tryptone 5g Soypeptone 3g

Dipotassium Phosphate 1g Monopotassium Phosphate 1g

Magnesium Sulfate 0.2g Sodium Chloride 0.01g

Manganese Sulfate 0.00674g L CysteineHClH2O 0.5g

Ferrous Sulfate 0.01gPolysorbate 80

(Tween 80)1g

Agar 15gSodium Propionate

Paromomycin Sulfate15g

Neomycin 100mg Lithium Chloride 3g

pH 7.2

Soluble Starch 0.5g Glucose 10g

- 590 -

Table 21. BL agar의 조성

ingredients amount(/L)

lab lemco

proteose peptone no.3

tryptone

soytone peptone

yeast extract

glucose

soluble starch

tween 80

liver extract *

solution A **

solution B ***

L-cysteine HCl

agar

horse blood ****

2.4g

10.0g

5.0g

3.0g

5.0

10.0g

0.5g

1mL

150mL

10mL

5mL

0.5g

15g

50mL

* liver extract: dissolve 10g liver extract powder in 170mL D.W →

maintain it at 55℃ during 1 hour (stirring) → cooling it and then

control pH 7.2 → filtration → store at 4℃

** solution A: KH2PO4 25g + K2HPO4 25g + D.W 250mL

*** solution B: NaCl 0.5g + MgSO4 7H2O 10g + FeSO4 7H2O 0.5g + MnSO4 0.34g +

D.W 250mL

**** horse blood는 mixture를 autoclave 하고, 50-60℃로 냉각시킨 후에 첨가

실험 결과 및 고찰

Table 22. 비선택 배지(BL media)에서 측정한 human feces sample의 총균수와

Bifidobacteria 생균수

sampleBifidobacteria Total bacteria

(CFU/g) (CFU/g)

A 6.0×107 6.0×107

B 1.2×109 1.4×109

C 2.2×108 2.4×108

D 4.6×109 4.8×109

E 9.0×108 1.2×109

F 6.4×109 1.2×1010

G 5.0×108 1.1×1010

H 3.1×109 3.3×109

- 591 -

Table 23. 선택 배지에서 측정한 human feces sample의 Bifidobacteria 생균수

sampleRB AMC TP BS

(CFU/g) (CFU/g) (CFU/g) (CFU/g)

A 1.0×106 2.2×109 1.0×107 2.0×108

B 5.0×107 1.7×109 1.4×108 6.0×108

C 1.0×106 3.6×108 1.0×107 6.0×107

D 1.5×108 1.3×109 1.9×108 1.2×108

E 5.0×107 9.5×108 2.0×108 1.0×107

F 1.0×108 4.2×108 1.0×108 2.3×109

G 1.0×108 2.2×109 1.0×107 8.2×107

H 4.0×107 1.9×109 4.0×107 1.7×108

�����������������������������������

���������������������������������������������

����������������������������

����������������������������������������

���������������������������������������������

��������������������������������������������������

��������������������������������������������������

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����������������������������������������

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�������������������������������������������������������

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��������������������������������������������������

����������������������������������������

������������������������������������

��������������������������������������������������

��������������������������������������������������

���������������������������������������������

����������������������������������������

����������������������������������������

�������������������������������������������������������

������������������������������������

��������������������������������������������������

0

2

4

6

8

10

12

A B C D E F G H

Samples

LogN/g

��������RB

��������AMC

����������TP

��������BS

Fig. 4. RB, AMC, TP 그리고 BS media에서 측정한 human feces sample의

Bifidobacteria 생균수 (log10 cfu/g wet weight)

BL non-selelctive media에는 다양한 형태의 colony가 자라는데, Bifidobacte-

rium은 갈색의 비교적 작은 colony를 형성하였다.

이는 fructose-6-phosphoketolase (F6PPK) test 양성 반응으로 확인할 수 있었

다. Table 22에 BL 배지에서 자란 혐기성 총균수와 Bifidobacteria의 수를 나타

- 592 -

내었는데, 대상자 중 한 명을 제외한 전원이 BL 배지에서 자란 여러 가지 혐기성

균 중에서 Bifidobacterium이 가장 많은 수를 차지하였다. 선택 배지를 이용한

Bifidobacteria 생균수 측정 결과는 Table 23과 Fig. 3에 나타내었다. 가장 많은

수의 균이 자란 배지는 AMC 배지이고, RB 배지는 가장 적은 수가 자랐다. AMC 배

지는 BL 배지에서 자란 Bifidobacteria의 수와 근접하거나 혹은 더 많은 수의 균

이 자람이 확인되어 균의 생존 면에서 매우 우수함을 알 수 있었으며, TP 배지와

BS 배지는 네 가지 배지 중 중간 정도의 colony 수를 보여 주었다. RB 배지는 8

개의 samples 중 7개에서 가장 적은 CFU (colony forming unit)을 나타내어

Bifidobacteria의 생존이 어렵다는 점에서 부적절한 배지라고 생각되었다. AMC

배지에서는 모양은 같으나 크기가 다른 colony가 관찰되었는데 직경이 약 2mm

(large), 0.5mm-1.5mm (medium), 0.5mm 이하 (small)의 세 가지 colony로 나누어

볼 수 있었다. large와 medium colony는 F6PPK test를 통하여 Bifidobacteria임

을 확인할 수 있었으나 small colony는 MRS broth 배지에 다시 배양하기가 어려

워 확인할 수 없었다. 이번 실험은 간단한 효소 활성 test를 통해서

Bifidobacteria의 생존과 선택성을 검증하였기 때문에 자세한 종의 동정은 시행

하지 않았다. 따라서 추가적인 실험에 의해 small colony가 어떤 종인지 확인이

필요하다고 생각된다. TP 배지와 BS 배지는 비교적 균일한 colony를 보여주고 있

기는 하지만, sample에 따라서 Clostridium이나 E. coli로 짐작되는 colony가 나

타나기도 하였다. RB 배지는 yellow와 purple색의 두 가지 colony를 관찰할 수

있었다. yellow colony는 Bifidobacteria로 판명되었고, purple colony는 3개의

samples에서 관찰되었는데 Bifidobacteria가 아님이 확인되었다. 색의 구별이 분

명하여 Bifidobacteria와 다른 균의 확인은 비교적 용이하였다. 이와 같은 실험

결과로 볼 때 현재 식품 공전에 올려져 있는 BS 배지는 다른 배지와 비교하였을

때 선택성이 뛰어나지 않으면서, 균의 생존율이 낮아서 장내 Bifidobacteria의

생균수 측정에는 부적합하다고 보여진다. AMC 배지는 small colony에 대한 종의

동정이 필요하기는 하지만 균의 생존율의 다른 배지에 비하여 월등히 우수함으로

현재로서는 가장 적합하다고 생각된다.

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