第六章 DNADNA 损伤与修复损伤与修复

DNA damage and repairDNA damage and repair

分子生物学研究中心

第一节 DNA 损伤的原因及后果

电离辐射可见光

氧自由基 H+

烷化剂

8-oxoGP/P

复制错误核苷类似物

mC

U

DNA 损伤类型• 碱基脱落• 碱基修饰 & 去氨基化

• 化学修饰• 光损伤• 链内交联• DNA- 蛋白质 交联• DNA 链断裂• DNA 重组

缺失碱基位点

化学损伤甲基化甲基化甲基化

氧化损伤氧化损伤

DNA 受到大剂量紫外线照射时，形成二聚体

紫外线可引起 DNA 的交联 , DNA 与蛋白质的交联。

电离辐射引起 DNA损伤的机理

电离辐射引起 DNA损伤的机制• 自由基损害• 损伤 DNA 修复系统• MCI 假说

电离辐射引起 DNA损伤的类型

• 产生 ·OH 自由基，导致碱基变化

• 脱氧核糖分解

• DNA 链断裂

• DNA 链、蛋白质的交联

电离辐射导致电离辐射导致 DNA链的断裂

单链断裂：单链断裂： 无差错修复无差错修复

双链断裂：双链断裂： 错误修复错误修复

C

烷化剂引起 DNA损伤 碱基烷基化 : G–C → A–T

碱基脱落 : 甲基磺酸甲酯可使鸟嘌呤7N 烷基化，活化 β— 糖苷键，连接碱基与五碳糖间的共价键变弱，容易折断缺失碱基，造成脱嘌呤作用。

• 导致 DNA 断链 : 磷酸二酯键上的氧被烷基化• 导致 DNA 链交联

• 5-BrdU （酮式 -A ； 烯醇式 -G ）

碱基类似物、修饰剂对 DNA的改变

• 亚硝酸盐氧化脱氨 （ C→U ）

• 羟胺脱甲基 （ T→C ）

• 黄曲霉素 B （攻击碱基）

DNA自发性损伤 碱基错配 Mismatch

互变异构移位

• 脱氨基作用 ( 环外氨基 )• 碱基丢失 → 自发水解

碱基修饰与链断裂

碱基异构式引起 DNA复制的错配

错误配对 G(k) T(e) A(a) C(i)

A(i) C(a) G(e) T(k)

G(k) C(a)

正确配对

A(a) T(k)

环出效应

其它因素引起 DNA损伤• 吖啶类化合物 : 吖啶橙 扁平染料分子 ( 不等交换 )

• 氧自由基 ( 加成反应 \ 小自由基反应 )

DNA损伤的后果

信号传导异常

长时辰效应长时辰效应

老化 肿瘤 疾病

DNA DNA 修复机制修复机制

短期效应短期效应

异常增生和代谢生理功能紊乱 细胞死亡

细胞增殖减少 基因表达异常基因组不稳定

DNA损伤后分子的最终改变• 点突变 ： 转换与颠换

• 缺失

• 插入

• 倒位或转位

• DNA 断裂

DNA重排

DNA 分子内发生较大片段的交换，可以在同一染色体的两条链间发生，也可在不同染色体之间发生，可以是原来的方向或颠倒的方向。

第二节 DNA修复DNA 的修复主要类型 :

直接修复光裂合酶修复切除修复重组修复

跨损伤修复 (SOS 修复 )

常见的 DNA损伤及其修复机制 DNA损伤因素 DNA损伤类型 修复机制

X 射线、氧自由基、烷化剂　 　 自发脱碱基

单链断裂、无碱基位点、氧化性碱基（如 8-氧鸟嘌呤）脲嘧啶

碱基切除修复

紫外线和多环芳烃 环丁烷嘧啶二聚体等大的紫外线光产物和稳定的多环芳烃化合物等大分子 DNA加合物

核苷酸切除修复

抗癌药（如顺铂和丝裂霉素）

双链断裂和链间交联 双链断裂修复（同源重组修复和末端连接）

复制错误和烷化剂 碱基错配和缺失（插入） 错配修复

（ 1 ） DNA断裂口直接修复：

在 DNA 5'-P 端和 3'-OH 端未受损害的情况下，连接酶能够直接修复 DNA

的断裂口。

（ 2 ） DNA紫外线损伤的光复合酶直接修复

（ 3 ） 烷基化碱基的直接修复在 大肠杆菌中的 Ada 酶，可修复甲基化的碱基和甲基化的磷酸二酯键。

⑷ 碱基切除修复

•指切除和替换由内源性化学物作用产生 的 DNA碱基损伤 , 是切除修复的一种。

•受损碱基移除是由多个酶来完成的。

•主要针对 DNA单链断裂和小的碱基改变 及氧化性损伤。

(4) Base Excision Repair

DNA 的损伤的切除修复

碱基缺陷或错配

碱基丢失 结构缺陷

切开 核酸内切酶

核酸外切酶切除

DNA 聚合酶

DNA 连接酶

AP 核酸内切酶

核酸外切酶

切开

切除

修复

连接

糖苷酶

插入酶碱基取代

⑸ 核苷酸切除修复• 体内识别 DNA 损伤最多的修复通路

• 主要修复扭曲双螺旋结构的 DNA 损伤以及阻断基因转录和不识别任何特殊的碱基损失，而是识别双螺旋形状的改变。

• 不识别任何特殊的碱基损失，而是识别双螺旋形状的改变；修复时切除含有损伤碱基的那一段 DNA

。

(5) 核苷酸切除修复 ( 大肠杆菌 )

核苷酸切除修复 ( 基因组修复–人 )

核苷酸切除修复 ( 转录偶联修复 - 人类 )

GGR 和 TCR 的共同修复通路

错配修复校正活性所漏校的碱基 , 使复制的保真性提高 102 ～ 103 倍

错配修复系统 (MRSMismatch RepairSystem)

DNApol (ξ= 10-8)经第二次校正 ξ= 10-11

♪ 错配修复系统组成（ Mismatch repair system）DNA 腺嘌呤甲基化酶 (m6A 甲基化酶 )

DNA polymerase Ⅲ 填补单链 DNA 缺口Helicase SSB 外切核酸酶 (Ⅰ和Ⅶ ) 连接酶

MCE (mismatch correct enzyme) 3 subunits mut H, L, S

扫描新生链中错配碱基

识别新生链中非 m6A 的 GATC序列

酶切含错配碱基的 DNA区段

错配修复

错配修复

大肠杆菌

DNA 甲基化位点

新合成的 DNA

Mis-paired bases

错配修复

重组修复机制

重组修复

☆ DNA 于复制时会越过受损区域进行复制

☆ 经重组修复，受损的 DNA仍然存在于子代的

一个细胞中。☆ 重组修复不会浪费时间， 重组修复可让负

伤的 DNA 在细胞中仍可照常进行分裂。

• 非同源末端连接： DNA 分子之间不需要广泛的同源性，主要是在免疫球蛋白重组时对 DNA 双链进行连接，在细胞有丝分裂 G1/G0 期起主要作用。

重组修复根据 DNA 末端连接需要的同源性，分为

• 同源重组：需要多种蛋白参与；也修复 DNA 复制中的差错；在减数分裂、细胞有丝分裂后期 S/G2 期起主要作用。

(7) SOS 修复

Irradiation of bacteria before virus infection enhanced repair of damaged viral genes but led to mutations.

UVUV’d T4 phage

E. coli

Few surviving phage

UV’d T4 phage

E. coli

Higher frequency of surviving phage, but many mutants.

SOS 修复诱导 DNA 聚合酶活性

•LexA ( 一种 DNA 结合抑制蛋白 ), umuC 和 umuD, 编码 DNA 聚合

酶活性 , 允许复制跨过 损伤位点 , 常插入一个或几个 A 碱基 .

AGCTAGTCAT/TCAGTC

AGCTAGTCAT/TCAGTCTCGATCANNNNGTCAG

Replication stopsat T/T dimer

Error-prone polymerase allowsreplication to proceed, albeit inaccurately

SOS response:

RecA-P 的三种功能a 、 DNA 重组活性b 、 与 S.S. DNA 结合活性c 、 少数蛋白的 proteinase 活性

当 DNA 正常复制时

（无复制受阻，无 DNA 损伤， 无 TT dimer ） RecA-p 不表现 proteinase 活性

当 DNA 复制受阻 / DNA damaged

细胞内原少量表达的 RecA-p 与 S.S, DNA 结合

激活 RecA-p 的 proteinase 活性

修复损伤LexA-p降解

RecA-p高效表达 SOS open

当 DNA 复制度过难关后

RecA-p很快消失 LexA gene on SOS off

SOS 修复

• DNA 复制不很严格，新合成的DNA 容易造成错误产生突变。

线粒体损伤和修复

• 线粒体的氧化损伤 :

单链断裂、双链断裂、碱基修饰、 DNA 交联、烷化损伤

• 线粒体的损伤修复： 碱基切除修复、错配修复

DNA 修复

•维持 DNA 序列的保真性；

•可在复制前后进行；

•有多种修复机制来纠正 DNA 损伤；

•DNA 修复失败可能导致突变和肿瘤。

细胞周期检查点控制细胞周期检查点控制 真核生物细胞真核生物细胞 DNADNA 受到损伤时细胞除了诱受到损伤时细胞除了诱导修复基因的转录外，还可暂时阻断细胞周期，导修复基因的转录外，还可暂时阻断细胞周期，防止受损防止受损 DNADNA 继续复制，如无法修复，则可诱继续复制，如无法修复，则可诱导细胞进入凋亡。这些都是细胞通过细胞周期导细胞进入凋亡。这些都是细胞通过细胞周期检查点控制（检查点控制（ checkpoint controlcheckpoint control ，又称，又称关卡控制）对关卡控制）对 DNADNA 损伤的应答反应。损伤的应答反应。

酵母细胞的细胞周期检查点控制机制酵母细胞的细胞周期检查点控制机制

DNA 损伤在 S 期 DNA 损伤在 G1 和 G2 期

G1 S G2 M

POL2RFC5DPB11

RAD9RAD17RAD24MEC3MEC1,TEL1

RAD53

哺乳类动物的细胞周期检查点控制机制哺乳类动物的细胞周期检查点控制机制DNA 损伤

P21Gadd 45 Bax

P53

CDK/cyclin Gadd45 Gadd45-PCNA

Blocking cell cycle Excision repairing Cell apoptosis

第三节 DNA损伤和修复的生物参考标志

一、甲基化损伤修复相关基因

甲基转移酶（ MGMT ）把 O6- 甲

基鸟嘌呤的甲基转移到自身的半胱氨酸残

基上，修复甲基化的 DNA 。 MGMT 突

变可作为甲基化损伤的基因型标记物。

二、切除修复相关的酶和基因•尿嘧啶糖基化酶为主要的始动因素，可作为 DNA 损伤的生物标记物。

•大肠杆菌 Uvr 基因家族、人 ecrr 基因和切除修复基因等

三、错配修复相关基因•MSH2 、 MLH1等蛋白参与错配修复，而错配修复的缺陷往往是癌变的第一步。

•错配修复基因： Muthls 系统、人类的hmsh2/3 、 hpmsl1/2 、 Mutsa 、 msh6 。

•错配修复基因的微卫星序列的不稳定性

（ microsatellite instability ， MI ）

四、 DNA 聚合酶 β

• DNA 聚合酶 β参与辐射损伤和化学损伤的修复，并对细胞的生长具有调节作用。

• DNA 聚合酶 β 的突变可导致碱基切除修复功能的缺陷。

五、 DNA加合物也可作为修复功能的生物标记物

DNA加合物可作为 DNA 损伤的暴露标记物和效应标记物，其去除的速度也可作为 DNA 修复功能的生物标记物。

DNA 损伤和修复的生物学意义

• 避免基因组的不稳定性、癌症和细胞死亡是至关重要的。

• DNA 修复途径可以识别和修复特异的DNA 损伤，保证生物物种的遗传稳定性。

与 DNA 修复有关的人类遗传疾病：

• 着色性干皮病 (Xeroderma pigmentosum)

• 布伦氏症候群 (Bloom’s syndrome)

• 遗传性大肠癌 (Hereditary nonpolyposis colon

cancer ； HNPCC)

着色性干皮病(Xeroderma pigmentosum)

• 是一种隐性遗传性疾病，有些呈性联遗传。因核酸内切酶异常造成 DNA 修复障碍所致。临床以光暴露部位色素增加和角化及癌变为特征。

• 1. 幼年发病，常有家族发病史。• 2. 面部等暴露部位出现红斑、褐色斑点及斑片，

伴毛细血 管扩张，间有色素脱失斑和萎缩或疤痕。皮肤干燥。数年内发生基底细胞癌、鳞癌及恶性黑素瘤。

• 3.皮肤和眼对日光敏感。• 4. 病情随年龄逐渐加重，多数患者于 20岁前因恶

性肿瘤而死亡。• 5. 组织病理 晚期出现表皮非典型性增生、日光角

化及鳞癌和基底细胞癌等恶性肿瘤。

着色性干皮病患儿脸部特征

着色性干皮病背部 ,

着色性干皮病组织切片

着色性干皮病的并发症

着色性干皮病的治疗• 避免紫外线照射

• 避免肿瘤致病因子

• 对症治疗

遗传性大肠癌的临床特征

• 发病早 (~45 岁 )

• 肿瘤好发部位• 肠外肿瘤的类型

遗传性大肠癌 (HNPCC)

• 息肉较少

• 30-60% 有内膜肿瘤

• 恶性肿瘤好发部位

• 胰腺癌发生率

大肠癌发生的危险因素 (CRC)

0 20 40 60 80 100

General populationGeneral population

Personal history of Personal history of colorectal neoplasiacolorectal neoplasia

Inflammatory Inflammatory bowel diseasebowel disease

HNPCC mutationHNPCC mutation

FAPFAP

5%5%

15%–20%15%–20%

15%–40%15%–40%

70%–80%70%–80%

>95%>95%

Lifetime risk (%)Lifetime risk (%)

错配基因的改变

多发性家族性结肠癌

多发性家族性结肠癌

错配基因的改变 :

MSH2, MSH6, PMS1 ，

MLH1, MSH3, PMS2.

HNPCC 中错配基因突变的概率

MSH2 MSH2 ~30%~30%

MLH1MLH1~30%~30%

PMS1 PMS1 (rare)(rare)

PMS2PMS2 (rare)(rare)

MSH6 MSH6 (rare)(rare)

Unknown ~30%Unknown ~30%

SporadicSporadic FamilialFamilial

HNPCCHNPCC

FAPFAP

Rare CRCRare CRC syndromessyndromes

Liu B et al. Liu B et al. Nat MedNat Med 2:169, 1996 2:169, 1996

HNPCC 发生的危险因素

• 基因携带者发生的危险因素 :– 早期 : 20-25岁– 妇女 : 年龄 (?) 25-35岁

• HNPCC 家族成员之一发生的概率 :– 胃癌发生 : 早期发生年龄 3-35 岁 , 复发 1-2

年– 尿道肿瘤发生 : 30-35 岁 , 复发 1-2 年

NCCN practice guidelines in oncology – v.1.2003

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