ความหลากหลายทางพันธุกรรมของขาวเหลอืง 11 โดยใชเทคนิคอารเอพีดี-พีซีอาร

1. อุปกรณท่ีใชในการทดลอง

1.1 ตัวอยางขาวเหลือง 11

เมล็ดพันธุขาวเหลือง 11 จากกลุมเกษตรกรตําบลดงลิง อําเภอกมลาไสย จังหวัด

กาฬสินธุ

1.2 สารเคมี

1.2.1 สารเคมีท่ีใชในการสกัดดีเอ็นเอ

- Lysis buffer (Tris – HCl, NaCl, EDTA, SDS )

- 10 mg/ug Protenase K

- RNase A

- 20% SDS

- 3.8% Sodium citrate

- 5 M NaCl

- Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)

- Chloroform:Isoamyl Alcohol (24:1)

- 3M Sodium Acetete

- 70% Ethanol

- Isopropanol

- absolute ethanol

- SE buffer

- ไนโตรเจนเหลว

1.2.2 สารเคมีที่ใชในการทําพีซีอาร (PCR)

- Taq DNA Polymerase

- dNTP (dATP dTTP cTP gTP)

- DNA Sample

- MgCl2 - 0.5 x TE buffer

- buffer A (10X)

37

- buffer S (10X)

- buffer V2 (10X)

- Primer

1. Oligo 101 (5 ,to 3,) GCG CCT GGA G

2. Oligo 147

3. Oligo 456

4. Oligo 459

5. Oligo 428

6. Oligo 457

7. OPA 01

8. OPA 03

9. OPA 04

10. OPA 05

11. OPA 07

12. OPA 07A

13. OPA 10

14. UBC 122

15. Hind III

16. C44

1.2.3 สารเคมีท่ีใชในการทํา Gel Electrophoresis

- agarose gel

- 6 X loading buffer

- ethidium bromide

- 0.5 X TBE buffer

1.3 เคร่ืองมือและอุปกรณ

- หลอดไมโครเซนตริฟว (Microcentrifuge tube)

- ไมโครปเปต (Micropipette)

- ทิป (Tip)

- อางนํ้าควบคุมอุณหภูมิ (Water bath)

38

- เครื่องเซนตริฟว (Centrifuge)

- เครื่องไมโครเซนตริฟว (Microcentrifuge)

- ปเปต

- ตูอบ

- เคร่ือง UV Transilluminator

- ตูอบฆาเช้ือ (Autoclave)

- เคร่ือง Thermal Cycler

- เคร่ือง Gel Electrophoresis

- ถุงมือยาง

- กระดาษทิชชู

- บีกเกอร

- มีด/กรรไกร

- Parafilm

- แรค (Rack)

- กระบอกตวง

2. วิธีการทดลอง

2.1 การสกัดดีเอ็นเอ (DNA Extraction)

การสกัดดีเอ็นเอ (DNA Extraction) ดัดแปลงมาจาก Ying และคณะ (1992) นําใบ

ขาวออนๆ มาประมาณ 0.2 กรัม บดใหละเอียดในไนโตรเจนเหลวแลวถายใสในหลอดเซนตริฟวสขนาด

1.5 มิลลิลิตรที่มี Lysis buffer 1.2 มิลลิลิตร จากนั้นบมไวที่อุณหภูมิหอง 15 นาที นําไปปนเหวี่ยงที่

12,000 รอบ นาน 15 นาที ดูดสารละลายใส 700 ไมโครลิตรใสในหลอดใหมเติม RNase 10 ไมโครลิตร

บมไว 1 ช่ัวโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เติมฟนอล:คลอโรฟอรม:ไอโซเอมิลแอลกอฮออล

(25:24:1) 600 ไมโครลิตรผสมใหเปนเนื้อเดียวกัน (สกัดซ้ํา 2 รอบ) นําไปปนเหวี่ยงที่ 12,000 รอบเปน

เวลา 15 นาที ดูดสารละลายใสสวนบน 600 ไมโครลติรใสในหลอดใหม สกดัซํ้าดวยคลอโรฟอรม:ไอโซเอ

มิลแอลกอฮออล (24:1) 600 ไมโครลติร ผสมใหเปนเน้ือเดียวกัน นําไปปนเหว่ียงที่ 12,000 รอบนาน

15 นาท ี ดดูสารละลายใสสวนบน 500 ไมโครลิตรใสในหลอดใหม ทําการตกตะกอนดีเอ็นเอโดยเติม

โซเดียมอะซิเตทเขมขน 3 โมลาร pH 5.2 ปริมาตร 50 ไมโครลิตร และเอทานอลความเขมขน 100

เปอรเซ็นต ปริมาตร 100 ไมโครลิตร เก็บไวในอุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส เปนเวลา 30 นาที นําไป

ปนเหว่ียงที ่12,000 รอบ เปนเวลา 15 นาที เทสวนน้ําทิ้ง ลางตะกอนดวยเอทานอลความเขมขน 70

39

เปอรเซ็นต ปริมาตร 500 ไมโครลิตร นําไปปนเหวี่ยงที ่12,000 รอบ อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เปน

เวลา 15 นาที ลางตะกอนซํ้าอีกรองดวยเอทานอล 70 % นําไปปนเหว่ียงท่ี 12,000 รอบ นาน 15

นาที เทสวนใสท้ิง ควํ่าหลอดบนกระดาษทิชชูและซับใหแหงหรอืปลอยแหงในอากาศ ละลายตะกอนดี

เอ็นเอดวย TE buffer ปริมาตร 100 ไมโครลิตร เก็บไวที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส จนกวาจะนําไปใช

งาน

2.2 การตรวจคุณภาพของดีเอ็นเอโดยวิธี Spectrophotometry

นําดีเอ็นเอที่สกัดไดไปวัดคาการดูดกลืนแสง (Optical Density) ที่ 260 นาโนเมตร

(OD260) และที่ 280 นาโนเมตร ถาอัตราสวนของ 260/280 นาโนเมตร มีคาประมาณ 1.7 - 1.9

แสดงวาดีเอ็นเอท่ีสกัดไดมีคุณภาพดี (สุรนิทร ปยะโชคณากุล, 2545 )

2.3 การตรวจคุณภาพของดีเอ็นเอโดยวิธี Electrophoresis

นําดีเอ็นเอท่ีเตรียมไดมาทําการตรวจสอบคุณภาพโดยวิธี Gel Electrophoresis โดย

การนําดีเอ็นเอตัวอยางมาจํานวน 5 ไมโครลติร มาแยกขนาดบน 1% agarose gel ภายใตกระแสไฟฟา

100 V และบัฟเฟอร 0.5X TBE และเปรียบเทียบขนาดของจีโนมของขาวท่ีสกัดไดกับดีเอ็นเอมาตรฐาน

ชนิด Lamda hind III Standard marker

2.4 ปฏิกิริยา PCR (Polymerase Chain Reaction)

นําดีเอ็นเอของขาวเหลือง 11 มาเพิ่มปริมาณโดยใชไพรเมอรแบบสุม เพื่อนํามา

วิเคราะหความหลากหลายของขาวดวยเทคนิค PCR โดยใช PCR Condition ตามวิธีการของ

Klimbunga et al. (2000) โดยทําปฏิกริิยาในปรมิาตร 50 ไมโครลิตร ประกอบดวย 10 mM Tris-HCL

pH8.3, 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 100µm each of (dNTP dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0.4

µm Primer, 50 ng/µl Genomic DNA และ 0.1 unit Taq DNA Polymerase

เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอโดยมี PCR Profile คือ

1. initial denaturation ท่ีอุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที จํานวน 1 รอบ

2. denaturation ท่ีอุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียสนาน 10 วินาที

3. annealing ท่ีอุณหภูมิ 36 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที

4. extention ที่อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 90 วินาที

(ข้ันตอนที่ 2-4 จํานวน 40 รอบ)

5. final extention ที่ 72 องศาเซลเซยีส นาน 5นาที จํานวน 1 รอบ

40

6. เก็บไวที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส จนกวาจะนําไปใชงาน

7. จากน้ันนําผลของปฏิกิริยา PCR มาทําการตรวจสอบขนาดโดยเทคนิค agarose gel

electrophotoresis โดยใช 1.5 % agarose

ผลการวิจัย

1. ผลการศึกษาลายพิมพดีเอ็นเอของขาวเหลือง 11

1.1 ผลการสกัดดีเอ็นเอ

ดีเอ็นเอทีส่กัดไดไดจากใบของขาวเหลอืง 11 โดยทาํการสกัดดเีอ็นเอดัดแปลงจาก Ying และ

คณะ (1992) เม่ือนํามาตรวจวิเคราะหจะพบวาดีเอน็เอมขีนาด 23.1 kb ซ่ึงดีเอ็นเอท่ีไดมีคุณภาพดีแต

จะมีการปนเปอนของโปรตีนและอารเอ็นเอ จึงตองมีการกําจัดโปรตีนและอารเอ็นเอที่ปนเปอนออกอีก

รอบหนึ่ง เมื่อนําดีเอ็นเอที่ไดมาทําการวิเคราะหโดยวิธี agarose gel electrophoresis โดยใช

agarose gel ท่ีมีความเขมขน 1 เปอรเซ็นต ทําการยอมดวยเอทธิเดียมโบรไมด แลวตรวจดูดีเอ็นเอ

ภายใตแสง UV ดวยเครื่อง Gel document (SYNGENE รุน INGENIUS) พบวาดีเอ็นเอที่ไดมีการ

แตกหักเล็กนอยและมีคุณภาพด ี(ภาพที ่1)

ภาพท่ี 1 การตรวจคุณภาพของดีเอ็นเอดวยวิธี gel electrophoresis (1% agarose gel)

Lane 1 population 1

Lane 2 population 2

Lane 3 population 3

Lane 4 population 4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 M

23.13 kb

kb

2.32 kb

41

Lane 5 population 5

Lane 6 population 6

Lane 7 population 7

Lane 8 population 8

Lane 9 population 9

Lane 10 population 10

Lane 11 population 11

Lane 12 population 12

Lane 13 population 13

Lane 14 population 14

Lane M Lambda/Hind III Marker

1.2 ผลการวิเคราะหดีเอ็นเอโดยเทคนิค RAPD – PCR

นําดีเอ็นเอของขาวมาเพิ่มปริมาณโดยใชไพรเมอรแบบสุมเพื่อนํามาวิเคราะห

ความหลากหลายของขาวดวยเทคนิค PCR โดยใช PCR Condition ตามวิธีการของ Klimbunga et al.

(2000) โดยทําปฏิกิริยาในปริมาตร 25 ไมโครลิตร จากน้ันนาํผลของปฏิกิริยา PCR มาทําการตรวจสอบ

ขนาดโดยเทคนิค agarose gel electrophotoresis โดยใช agarose gel ท่ีมีความเขมขน 1.5 เปอรเซ็นต

ทําการยอมดวยเอทธิเดียมโบรไมด พบวามี PCR product ขนาด 600 900 1000 1500 1900 bp ในทุก

ตัว

42

ภาพท่ี 12 RAPD pattern ท่ีไดจากไพรเมอร Oligo 101

Lane M 100 bp DNA Ladder

Lane NC Negative control

Lane 1 ขาวเหลือง 11 population 1

Lane 2 ขาวเหลือง 11 population 2

Lane 3 ขาวเหลือง 11 population 3

Lane 4 ขาวเหลือง 11 population 4

Lane 5 ขาวเหลือง 11 population 5

Lane 6 ขาวเหลือง 11 population 6

Lane M 100 bp DNA Ladder

M NC 1 2 3 4 5 6 Mbp

1500 1500

10001000

500 500

bp

43

อุปกรณและเครื่องที่ใชในการทดลอง

ภาพที่ 1 เตาอบไมโครเวฟ ภาพที่ 2 เครือ่งปนเหวีย่ง (Centrifuge)

ภาพท่ี 3 เคร่ืองวัดคาดูดกลืนแสง (UV-Biophotometer) ภาพที ่4 เครื่องถายภาพดีเอ็นเอ

44

ภาพที ่5 เครื่อง พีซีอาร (PCR) ภาพท่ี 6 เคร่ืองสปนดดาวน

ภาพที่ 7 เครือ่งเจลอเิล็คโตรโฟรซีสีภาพ ภาพที่ 8 ออรโตปเปต ขนาด10, 200, 1000 Ml

45

ภาพที่ 9 ชุดอปุกรทีใ่ชในการสกัดดีเอ็นเอ ภาพที่ 10 หลอดไมโครเซ็นทริฟวจ ขนาด1,500 Ml

ภาพภาคผนวกท่ี 11 ถาดเตรียมอะกาโรสเจล

ภาพท่ี 12 ตัวอยางเมลด็ขาวเหลือง 11

46

ภาพท่ี 13 ลักษณะของตนขาวเหลือง 11 ภาพท่ี 14 การบดใบขาวในโกรงบดละเอียด

ภาพที ่ 15 ใบขาวที่บดเสร็จเรียบรอยแลว ภาพที ่16 ใบขาวที่อยูในหลอดเซนตริฟวขนาด 1.5 ml

ภาพที ่17 สกัดดีเอ็นเอขาวเหลือง 11 ภาพที ่18 ตรวจวัดคุณภาพดีเอ็นเอ

47

ภาพที ่19 เพิ่มปริมาณดเีอ็นเอโดยใชเครื่อง PCR ภาพที ่20 เตรียมอะกาโรสเจล

ภาพท่ี 21 ทําเจลอิเล็คโตโฟรีซีส ภาพท่ี 22 ตรวจดูแถบลายพิมพดีเอ็นเอ