改变生活的生物技术...

改变生活的生物技术

基因编辑与基因治疗

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• 2018年11月26日，中国深圳的科学家贺健奎宣布利用基因手术(Gene Surgery)突变了一对婴儿的CCR5基因，使她们出生后即能天然抵抗艾滋病。消息一经发布，在国内外科研界引起轩然大波。

• 贺建奎所说的的基因手术，利用的是CRISPR基因编辑技术，所期望达到的效果属于基因治疗的范畴。

贺健奎入选自然杂志的2018年10大人物，被称为CRIPSR流氓。

贺健奎通过视频发布消息

基因编辑婴儿

上帝的手术刀

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• 基因治疗的概念

• 基因治疗的发展

• 第一代基因编辑技术

• 第二代基因编辑技术

• 第三代基因编辑技术

• CCR5基因

• 贺健奎事件的评价


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• CCR5基因



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基因与疾病

• 基因型决定表型。所有的疾病背后都存在基因的异常，有的基因异常是疾病的主因，有的基因异常增加了疾病的易感程度。

CFTR基因突变导致囊性纤维化

https://www.yourgenome.org

多个SNP与骨质疏松症相关

BMP2 *rs235754

QPCT *rs3770748

LRP5 *rs4988321rs3736228

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基因治疗

• 基因治疗(gene therapy) 指用正常的基因导入人体细胞，以纠正或补充因基因异常所引起的疾病。导入的基因可以是与异常基因对应、在体内表达具有特异功能的同源基因，也可以是与异常基因无关的治疗基因。

体内基因治疗离体基因治疗

基因异常疾病

基因治疗

基因正常健康

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基因治疗

• 大多数疾病与基因之间的关系尚不明确，存在大量未被发现的新基因和信号网络，限制了基因治疗的应用。

• 基因治疗目前只适用于少数致病机制或治疗方案非常明确的疾病，如单基因遗传病，肿瘤等。

单基因缺陷或异常疾病

基因治疗

疾病

基因A异常

基因B异常

基因C异常

…

?

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• CCR5基因



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首例基因治疗

Front. Immunol. 2016. 7:314

• 重症联合免疫缺陷病（ADA-SCID)是一种罕见遗传病,新生儿中发病率为20万分之一。

• 患者的腺苷脱氨酶基因(ADA)的发生突变。该突变导致腺

苷和脱氧腺苷的累积。这些

中间产物对于T细胞和B细胞

具有毒性，导致患者的体液

免疫和细胞免疫均发生缺陷。

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ADA-SCID患者

• ADA-SCID患者免疫系统几乎完全失灵，任何一点外来病原体的感染对于患者足以致命。为了避免感染，患者经常会生活严格消毒的气泡舱内，被称为“气泡宝宝”。

www.frontlinegenomics.com https://en.wikipedia.org/wiki/David_Vetter

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ADA-SCID的三种治疗手段

Front. Immunol. 2016. 7:314

注射ADA蛋白骨髓移植

基因治疗

• 1990年，NIH的William Anderson医生获FDA批准开展ADA-SCID的基因治疗。

• 4岁的Ashanthi DeSilva是ADA-SCID患者，她对于腺苷脱氨酶注射失去反应，也找不到骨髓配型。

• Desilva成为了ADA-SCID基因治疗的第一例病人。

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ADA-SCID的基因治疗

Anderson医生与DeSilva上帝的手术刀

• Anderson从Desilva体内分离到T细胞，利用逆转录病毒，将正常的ADA基因转入细胞中，培养后输回Delsilva体内。

• 纠正后的T细胞可以产生ADA，其寿命是缺陷细胞的3-5倍。14


www.genetherapyreview.com

• Ashanthi Desilva与Cindy Kisik作为ADA-SCID患者，是基因疗法的早受益者，她们顽强的存活至今。

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https://primaryimmune.org

1992年，两位患者与医生团队合影 2013年，两位患者与主刀医生合影

• Desilva需要定期注射改造后的T细胞，同时注射ADA蛋白，基因疗法的贡献有限。

• ADA-SCID的基因治疗取得初步成功后，患者、医生和科学家的热情迅速被点燃，行业进入狂热发展的阶段。

• 截至2000年，全球开展了超过500例的临床试验，超过4000名患者参与其中。

• 500例的临床试验全部失败，没有一项推近到大规模临床应用阶段。

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基因治疗的狂热发展

打击一：Gelsinger的悲剧

• 1999年，美国男孩Jesse Gelsinger在参加OTCD基因治疗的临床试验中不幸去世。这是基因治疗诞生后的第一例死亡病例。

• Gelsinger参加的仅仅是治疗方法的安全性测试，即接受注射没有携带OTC基因的腺病毒空载体。但腺病毒引起了强烈的免疫反应，导致多器官衰竭，造成了死亡。

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腺病毒载体将外源基因导入细胞中

https://courses.lumenlearning.com

Jesse Gelsinger

打击二：基因治疗导致白血病

• 1999年，法国科学家开展了针对SCID-X的基因治疗。科学家利用逆转录病毒将正常的IL2RG基因转入造血干细胞中，然后输入患者体内。造血干细胞可以不断产生新的白细胞，从理论上可以终身治愈患者的疾病。

• 1999-2002年，所有患者的免疫能力都恢复良好。

• 2003，9位患者中的5位罹患白血病。

• 逆转录病毒倾向于插入LMO2基因，该基因与白血病密切相关。

• 2002-2012年，剩余4位患者依然健康，SCID-X被治愈。18

2000年，法国科学家宣布实验成功Nature, 2002, 420:116

病毒载体插入原癌基因LMO2附近

Science. 2003, 302:415

• 两场悲剧沉重打击了基因治疗领域。各国监管部门立刻叫停了所有正在进行的基因治疗的临床实验，对基因治疗的临床申请进行严格的审查。

• 2002-2012年，基因治疗陷入低谷。

• 全球科学家对病毒载体进行不断的优化和改良。更安全的病毒载体，例如腺相关病毒(AAV)被陆续开发出来。

• AAV不整合到基因组中，具有组织靶向性。19

在低谷中前行的基因治疗

• 2012年，荷兰UniQure公司的Glybera在欧盟审批上市，是西方第一种基因治疗药物，用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏引起的严重肌肉疾病。

• Glybera利用AAV将功能性的LPL基因传递给骨骼肌。

• Glybera的治疗一次的成本为160万美元，是当时贵的药。

• 截至2016年，Glybera只卖出了一支。2017年，Glybera退市。20

世界上贵的药

https://qtxasset.com https://www.slideshare.net/raredisorders/cord-day-2-gaudet

• 从第一例基因治疗到西方的第一种基因治疗药物，传统的基因治疗主要采用“缺啥补啥”的策略。缺失或发生突变的基因并没有在原位得到修复。 21

缺啥补啥的策略

正常细胞

Gene

异常细胞

基因发生缺失或突变导致功能丧失或者下调，引起疾病

X X X+

Gene

将功能缺失的基因或者有助于治愈疾病的基因转入患者细胞

整合型病毒载体

游离型病毒载体

Gene

• 缺失或发生突变的基因并没有在原位得到修复。22

缺啥补啥的策略

整合型病毒载体，整合位点不确定

游离型病毒载体，目的基因会被稀释

Gene

基因治疗后的细胞

Gene

缺失或者突变的基因

• 某些基因突变，会引起原有功能的增强（例如原癌基因的过量表达），或者产生新的功能（例如HTT蛋白突变后可以自发凝聚）。“缺啥补啥”的策略无法奏效。 23

“缺啥补啥”失效

正常细胞

Gene

异常细胞

基因发生突变，导致功能增强或异常，引起疾病

异常细胞

补充正常基因无法消除突变基因的影响

Gene

Gene

• 在突变基因的原位对突变基因进行破坏，删除或者修复是实现治疗的关键。

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“基因编辑”的策略

异常细胞异常细胞异常细胞正常细胞正常细胞正常细胞

• 基因编辑是针对基因组中的特定序列进行插入、删除、替换等精密操作的基因工程技术。基因编辑技术的诞生极大的拓展了基因治疗的应用对象。

x

• 第一步是“找”到需要编辑的序列。

• 第二部是“切”开序列。

• 第三步是“改”变序列。25

基因编辑的流程

找切改

通过特定的核酸酶，如FokI，可以将序列切开。

• 序列被切开以后，细胞会采用非同源性末端接合(NHEJ)的方式，进行非精确的修复。这种修复方式通常会破坏基因的功能。

• 在模板序列存在的情况下，细胞会采用同源修复(HR)的方式依照模板进行精确的修复。 26

利用DNA修复系统进行“改”

---TAACGGACTAGCATACTTGCTATTTCT---

---TAACGGACTAGC ATACTTGCTATTTCT---

---TAACGGACTAGTACTTGCTATTTCT---NHEJ HR

---TAACGGACTAGC ATACTTGCTATTTCT---

TAACGGACTAGGATACTTGCTATTTCT

---TAACGGACTAGGATACTTGCTATTTCT---

(多用于破坏基因功能)

• 通过特定的核酸酶，科学家可以将序列切开。利用细胞自身的DNA修复系统（NHEJ或HR)，科学家可以对基因进行破坏或者进行预期的改造。

• 基因编辑的关键在于第一步，怎么“找”到需要编辑的序列，即待编辑序列的精确定位。在66亿个碱基对中找到一段目标序列，好比在1万本不同的书里找一句话。 27

基因编辑的关键

10000本红楼梦

TTGCTATTTCTAGCTCTAAATGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACGTACGCAGGTGGACCTGCACCTGCATGCGATCATTTATCTTTCACTGCGGATATTTTAACACGTACGCAGGTGGACCTGCACCTGCATGCGATCATTTATCTTTCACTGCGGTACGCAGGTGGACCTGCACCTGCACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACGTACTATTTCTAGCTCTAAATGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTTATTTCTAGCTCTAAATGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTGCGCAAAATTTGTGCCATCGTA

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• CCR5基因



• 转录因子可以高效识别特定的DNA序列。

• 1983年，Aaron Klug发现转录因子TFIIIA中含有9个串联而相互独立的DNA识别模块。该模块是由30个左右的氨基酸组成的一个手指状结构。其结构核心包括2个Cys加2个His（或者4个Cys）与Zn2+。该模块被称为锌指(Zinc Finger)。

• 每个锌指可以识别3个DNA碱基。 29

第一代基因编辑技术-黄金手指

Annu. Rev. Biochem. 2010. 79:213–31

• ATGC四种碱基的3联组合共有64种。理论上，可以用64种锌指识别所有3联碱基。

• 理论上16个连续的序列在人类基因组中只出现一次。用5-6个锌指串联起来的蛋白，就可以识别一条专一的序列。

• 在组合的锌指后装上一个核酸酶(FokI)，就可以在特定序列附件进行切割。这就是第一代基因编辑技术，锌指核酸酶技术。

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锌指核酸酶技术

Planta (2014) 239:921–939

• 锌指之间会相互干扰。两个相互临近的锌指可能会影响对方与DNA的结合能力。目前已经发现了上千个锌指。

• 针对一段9bp的序列，筛选二联锌指组合，寻找可以分别识别前6个bp (AB)和后6个bp (CD)的锌指。通过比较B和C,找到一个同时类似B和C的E，从而获得可以识别9个bp的三联锌指(AED)。 31

锌指核酸酶技术

Nat Methods. 2012. 9:32

GTT GAT AAC

A B

C D

A E D

• 2003-2004年，Sangamo公司获得了包括锌指设计、筛选、优化、实验室和临床应用相关的数个关键专利，垄断了ZFN的开发与应用。 32

技术垄断

Aaron Klug锌指命名人

开发了筛选锌指组合的技术

Srinivasan Chandrasegaran

将锌指与FokI核酸酶相连，证明其精确定

位和剪切功能

Dana Carroll首先证明锌指+核酸酶组合可以破坏果蝇体内基因

David Baltimore首先证明锌手指+核酸酶修复人类细胞中的缺陷基因

Carl Pabo首先解析锌指

3D结构

Sangamo公司早的科学顾问

其成立的锌指技术公司及知识产权被Sangamo公

司收购

创造基因缺陷的专利特许授权给Sangamo公司

修复基因的专利特许授权给

Sangamo公司

2001-2003年，任Sangamo首席科学官、资深副总裁

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• 2017年11月13日，一位44岁的男性亨特氏综合征患者接受了Sangamo公司的基因编辑治疗。该治疗利用AAV6将正常的IDS基因和2个ZFN基因导入患者体内，ZFN在特定位置切断DNA，利用IDS基因进行修复。

From Joseph Muenzer PPT

首例体内基因编辑治疗

• 2019年2月公布的结果显示，患者体内只有很少的细胞整合了正常的IDS基因，其产生的酶水平很低，可能无法逆转病情。

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首例体内基因编辑治疗

https://www.apnews.com

Brian Madeux正在接受治疗

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• CCR5基因



• 黄单胞杆菌是一种常见的植物病原菌。

• 多数菌株分泌不溶于水的非类胡萝卜素性质的黄色素，有些菌株形成胞外荚膜多糖-黄原胶。 36

第二代基因编辑技术-寄生细菌的法宝

From Boris SZUREK PPT

Ulla BonasMartin-Luther-University

Halle-Wittenberg

• 黄单胞菌将AvrBs3蛋白输入植物体内，AvrBs3识别EBE-box的DNA序列，并与之结合，起始UPA20基因的转录，造成细胞膨大等表型。

• 与AvrBs3相似的蛋白被称为类转录激活因子效应物(transcription activator-like effectors, TALEs)。 37

“神话”因子：AvrBs3

Planta (2014) 239:921–939

• AvrBs3含有17.5个高度重复的模块。每个模块含有34个氨基酸。模块的序列高度一致，主要的差异存在于第12和第13位氨基酸，这两个氨基酸被称为重复可变二联氨基酸(repeat variable diresidue, RVD)。 38

转录因子AvrBs3

Acta Cryst. (2013). D69, 1707–1716

• 每个重复的模块可以识别一个DNA碱基。

• 模块通过RVD与碱基结合。特定的RVD与特定的碱基结合。39

纤细的“神话”手指

AvrBs3

Microbial Biotechnology, 2013. 6:230–240

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• TALE蛋白具有可编程性，将识别不同碱基的模块组合在一起，可以识别任意长度和任意序列的DNA。

“神话”蛋白具有可编程性

Science. 2009.326:1509-12.

第二代基因编辑技术-“神话”核酸酶

• 2011年，Sangamo公司证明在TALE蛋白上添加Fok I核酸酶，可以在特定序列上进行切割，由此诞生了第二代基因编辑工具-“神话”核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)

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Nat Rev Mol Cell Biol. 2013. 14(1): 49–55.

TALEN产品的临床实验

• 2016年，Servier、Cellectis和辉瑞公司获得FDA批准，通用型CAR-T细胞(UCART19)，开展治疗复发/难治性急性淋巴细胞白血病的临床实验。

• TALEN技术被用于敲除CAR-T中的TCR和CD52 42

From Cellectis PPT

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• CCR5基因



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第三代基因编辑技术

富有争议的综述

• 1987年，日本科学家在大肠杆菌iap基因的3’端发现了一段“古怪”序列。“古怪”序列含有5段29bp的重复序列，在重复序列之间是32bp的无规律的序列。

• “古怪”序列的功能未知。

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大肠细菌中的古怪序列

J Bacteriol. 1987. 169:5429-5433.

• 该论文被引用了994次。

• 1993年，西班牙科学家Francisco Mojica在嗜盐古细菌Haloferax mediterranei中也发现类似的“古怪”序列，含30bp重复序列，重复序列之间是约36bp的无规则序列。

• 古细菌和细菌中都含有类似的序列，提示该序列在原核生物中具有重要的功能。

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古细菌中的古怪序列

Francisco MojicaMol Microbiol.1995. 17:85-93

• 2000, Mojica在20个不同的微生物中发现了“古怪”序列。

• 2002年，荷兰科学家与Mojica讨论后，将“古怪”序列命名为CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,含有规律性间隔的短回文重复序列的聚集）. 47

CRISPR的命名

Mol Microbiol. 2000. 36:244-246

• 2005，Mojica发现一种大肠杆菌的一段间隔序列来自于P1噬菌体，携带这一间隔的菌株对P1感染具有抵抗力。

• 同年，两组法国科学家在其他微生物的CRISRP中也发现类似结果。

• CRISPR位点储存了微生物为抵抗感染而建立的适应性免疫系统的关键信息，CRISPR可能重现“过往遗传攻击”的记忆。48

CRISPR的功能初现

Nature. 2014. 513:175-176

J. Mol. Evol. 2005. 60:174–182. 引用1019次Microbiology 2005. 151:653–663. 引用948次Microbiology 2005. 151:2551–2561. 引用1223次

CRISPR为细菌提供免疫力

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• 2007，Danisco公司的科学家证明CRISPR为嗜热链球菌提供了对于噬菌体的免疫力。CRISPR座位的Cas基因参与反应。

• 含有S1S2的间隔序列的嗜热链球菌对噬菌体Ф858 免疫，含有S4的间隔序列的嗜热链球菌对Ф2972免疫。

CRISPR座位中含有噬菌体的序列 Science. 2007. 315:1709–1712.


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• 将S4的间隔序列替换为S1S2间隔序列，可以使链球菌丧失对Ф2972的免疫力，而获得对Ф858 的免疫力。

CRISPR座位中含有噬菌体的序列替换间隔序列改变免疫能力 Science. 2007. 315:1709–1712.


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• 外源DNA被Cas1-Cas2整合到CRISPR座位。

• CRIPSR的间隔序列被转录成crRNA，与核酸酶Cas结合，进行监控。

• 外源DNA再次进入细胞后，在crRNA的引导下，Cas与配对的DNA结合，将DNA切开，实现对外来DNA的免疫。

• CRISPR提供了一种针对特定序列切割的新方法。

Science. 2018. 361:866–869.

CRISPR系统的建立

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• 2012年，法国微生物学家Emmanuelle Charpentier和美国结构生物学家Jennifer Doudna，利用来源于化脓链球菌的Cas蛋白（即Cas9)，配合一条向导gRNA，可以实现对于与gRNA配对的DNA序列的切割。这标志了第三代基因编辑技术-CRISPR/Cas9系统的建立。

2015年，Charpentier（中左）和Doudna (中右) 获得生命科学突破奖Science. 2012. 337:816–821.

CRISPR系统的建立

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天然Cas9系统改造后的Cas9系统

Nat Biotechnol. 2014. 32:347-55.

• 天然CRISPR/Cas9系统中，crRNA需要与tracrRNA部分配对，发挥作用。

• 改造后的Cas9系统用一条gRNA将crRNA和tracrRNA合二为一，简便了操作。

• gRNA可以识别20nt的碱基。

第三代基因编辑技术

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• Cas9自带核酸酶活性，不用偶联Fok I酶。

• 利用RNA来识别DNA，相比蛋白识别DNA更为准确高效。

• 改造gRNA来获得序列特异性，比改造ZFN和TALEN方便的多（ ZFN中10个氨基酸识别一个碱基，TALEN中34个氨基酸识别一个碱基）。Nat Comm. 2018. 9:1911

CRISPR在哺乳动物中的应用

• 2013年，华裔科学家张锋证明CRISPR在人类和小鼠细胞中也可以高效工作，这为CRISPR在人类基因组编辑中的应用奠定了基础。 55

张锋

Science, 2013. 339: 819-823.

CRISPR风暴

• 2013以后，全球科学界兴起使用和研究CRISPR的风暴。

• CRISRP在细菌、真菌、植物、动物等几乎所有的系统中都能发挥作用。除了基因编辑，CRISPR还被用于基因调控，DNA显影，RNA编辑等，极大的促进了生命科学研究。 56

Nat Comm. 2018. 9:1911Science. 2018. 361:866–869.

CRISPR基因治疗

• 2018年8月，美国和欧盟批准了首个基因编辑临床试验，针对的是输血依赖型地中海贫血症。

• 研究人员从患者的外周血中收集造血干细胞，然后使用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑。经过编辑的细胞CTX001将作为干细胞移植的一部分被输回患者体内，随后对患者进行监测，以确定经过编辑的细胞何时开始产生成熟健康的血细胞。

57https://med.sina.com/article_detail_103_1_65003.html

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• CCR5基因



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• 2018年11月26日，中国深圳的科学家贺健奎宣布利用基因手术(Gene Surgery)突变了一对婴儿的CCR5基因，使她们出生后即能天然抵抗艾滋病。消息一经发布，在国内外科研界引起轩然大波。

• 贺建奎所说的的基因手术，利用的是CRISPR基因编辑技术，所期望达到的效果属于基因治疗的范畴。

贺健奎入选自然杂志的2018年10大人物，被称为CRIPSR流氓。

贺健奎通过视频发布消息

基因编辑婴儿

CCR5

为什么对CCR5基因的改造

能预防艾滋病？

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HIV和AIDS

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• 人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV) 造成人类免疫系统缺陷，是导致艾滋病(AIDS)的元凶。

• 1981年，第一例艾滋病被报道。人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。2018年，全球共有3790万人感染艾滋病，新增感染病例170万人，新增死亡人数77万人。https://www.who.int/gho/hiv/hiv_013.png

AIDS的治疗

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• 目前没有任何可以治愈艾滋病的方法，也没有可行的疫苗。

• 1995，美籍台湾科学家何大一提出的鸡尾酒疗法是目前佳的治疗方法，可以较大限度地抑制病毒的复制。

何大一

柏林病人

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• 2006年，德国柏林Charité医院报道一种极富想象力的艾滋病治疗方法，接受治疗的患者Timothy Brown被称为“柏林病人”。迄今为止，Timothy体内至今未检测出HIV，被认为是第一例HIV彻底治愈的患者。

https://thesoutherndaily.co.za/index.php/2015/11/22/hiv-aids-cure-meet-the-first-man-to-be-fully-cured-of-hiv/

柏林病人

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• Timothy在1990年代中期成为艾滋病毒携带者，需要服用抗病毒药物。不幸的是，他随后又患上了白血病。

• 主治医生将带有CCR5Δ32突变的造血干细胞移植到Timothy体内，一石二鸟，同时治愈了Timothy Brown的艾滋病和白血病。

Retrovirology 2013, 10:145

CCR532阻止HIV感染

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https://parentsguidecordblood.org/en/news/umbilical-cord-blood-bank-fight-hiv-and-aids

• HIV需要与细胞膜上的名为CCR5的受体蛋白结合,才能进入淋巴细胞体内。

• CCR5是一个7次跨膜的蛋白，CCR532突变导致第四和第五跨膜区之间的序列发生32个碱基的缺失，并造成移码突变。突变的CCR5不能被运送到细胞表面，也不能与HIV结合。

https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/File:CCR5_Protein.png

CCR5蛋白（黄色） CCR532阻止HIV进入细胞

天然人群携带CCR532

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• 1994年，科学家通过研究一个永远不得AIDS的男同性恋，发现了CCR532的突变。

• CCR5Δ32主要集中在欧洲高加索人种的后裔中，基因频率高达10%，大概有1%为纯合子。CCR5Δ32似乎并不对携带者健康有显著影响，所以人群中才可能有占相当比例天然的纯合子。

Human Immunology. 2017. 78:710–717

针对CCR5的基因治疗

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• 2014年，Sangamo公司启动临床实验，利用ZFN技术破坏了T细胞中的CCR5基因，研究人员把改造后的T细胞注回感染者体内，每人一次性注入100亿个T细胞。

• 在停药的6名感染者中，有4人体内的HIV数量变少，还有1人病毒检测结果呈阴性。研究人员后来发现，这名感染者体内本来就有CCR5突变基因。

N Engl J Med. 2014. 370: 901–910.

中国开展的AIDS的基因治疗

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• 2019年，北京大学邓宏魁等科学家利用CRISPR/Cas9技术，将供体来源的人造血干细胞中的CCR5破坏，然后输到患有白血病合并艾滋病的患者体内。

• 术后19个月的随访发现，患者白血病处于持续完全缓解状态。

• 5%的骨髓细胞带有CCR5突变。短暂停止服用抗HIV药物期间，CCR5突变的T细胞表现出一定程度抵御HIV感染的能力。

N Engl J Med 2019; 381:1240-1247

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• CCR5基因



贺健奎的实验流程

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HIV Carrier HIV Negative

Cas9

SgRNA

Blastocysts

ICSI & Cas9 + sgRNA injection

Lulu

NanaPreganancy

• 携带HIV的父亲和未携带HIV的母亲提供精卵。

• 体外受精完成后，注射Cas9蛋白和sgRNA。

• 培养至囊胚期，胚胎移植。• 妊娠• 产下双胞胎露露和娜娜。

实验的必要性

对于携带HIV的父亲来说，基因编辑是

避免其后代感染HIV的唯一选择吗？

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实验的必要性

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• 男性的艾滋病患者通过服用抗HIV药物降低病毒载量，配偶在妊娠阶段服用抗HIV药物，禁止母乳喂养等手段都可以有效降低自然生殖的婴儿感染HIV的几率。

• 2013年，意大利科学家发明“洗精术”，可以去除精液中的HIV，然后用于辅助生殖。该方法可将妻子和孩子的艾滋病感染率降低到0.1%以下。国外机构可提供成熟服务。

Am J Obstet Gynecol. 2013. 208(5):402.e1-9.

针对HIV携带者的洗精术

实验的合法性

目前的法律法规

是否允许制造基因编辑的婴儿？

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实验的合法性

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• 2003年，卫生部颁布的《人类辅助生殖技术规范》规定“男女任何一方患有严重的精神疾患、泌尿生殖系统急性感染、性传播疾病”“不得实施体外受精—胚胎移植及其衍技术”。

• 2003年，科技部和卫生部联合发布的《人胚胎干细胞研究伦理指导原则》规定“（一）利用体外受精、体细胞核移植、单性复制技术或遗传修饰获得的囊胚，其体外培养期限自受精或核移植开始不得超过 14 天。（二）不得将前款中获得的已用于研究的人囊胚植入人或任何其它动物的生殖系统。”

• 贺健奎在招募信息中简单写到：招募感染者，可以洗精、做试管婴儿。(三联周刊报道）

实验的科学性

诞生的基因编辑的婴儿是否

只携带CCR5的突变？

75

实验的科学性

76

• Sangamo和邓宏魁通过基因编辑改造患者成体干细胞，再输回患者体内。基因编辑不会改变身体内其他细胞的遗传物质，不会影响生殖细胞，不会传递给下一代。

• 贺健奎在受精卵阶段进行基因编辑，受精卵发育形成基因编辑的个体，该个体的所有细胞（包括生殖细胞）都带有基因编辑的痕迹，这些痕迹可以被传递给下一代。

• 贺健奎的基因编辑一旦出错，会影响几乎所有细胞，无法逆转。

CRISPR受精卵

基因编辑的受精卵

发育

个体含有部分基因编辑

的细胞

基因编辑的个体

脱靶效应

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• CRISPR系统具有脱靶效应，除了切割目的序列以外，还可能在相似的序列上切割，造成非预期的基因组序列的改变。

• 目前没有成熟可靠的单细胞全基因组测序来评价脱靶效应。

Nat Biotechnol. 2015. 33(2): 187–197. https://blog.horizondiscovery.com/off-target-gene-editing-by-crispr-cas9-an-update

脱靶效应

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• 在体外培养阶段，露露的胚胎中发现了一个脱靶位点，该位点远离已知的功能基因，不含有非编码RNA序列和转录因子结合位点。

• 风险已告知家属，家属同意继续移植实验。

贺健奎PPT

实验的科学性

CCR532突变对于

基因编辑婴儿是否安全？

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中国人群中引入CCR5突变的风险

80

• 虽然CCR532在部分北欧群体中的比例，但这一等位基因在非欧种群中存在的比例非常低，在中国人群中至今没有鉴定到其纯合突变。

• 将CCR5Δ32等位基因或其它CCR5突变引入中国人的遗传背景中存在的风险难以估量。

部分北欧人群

CCR532 ~10% ~0%

中国人群

实验的科学性

基因编辑婴儿的CCR5的突变

是否与CCR532一致？

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CCR5的突变

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• 贺健奎实验的初衷是利用CRISPR在CCR532所在的sg4区域进行切割，产生DNA双链断端(DSB)。在修复的过程中，引起CCR5的移码突变，破坏CCR5的功能。

sg4区域位于32突变附近贺健奎PPT

未知突变

83• 每人携带2拷贝CCR5基因。露露的一份CCR5没有变化，另一份少了15bp。娜娜的一份CCR5少了4个bp，另一份多了1个bp。

贺健奎PPT

基因编辑产生新的CCR5突变蛋白

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• CCR532在184aa后发生移码突变，多编码了31个全新的氨基酸。突变蛋白全长215aa。

• Nana(+1bp)在184aa后发生移码突变，比CCR532多编码了11个全新的氨基酸。突变蛋白全长226aa。

• Nana(-4bp)在185aa后发生移码突变，多编码了9个全新的氨基酸，这些氨基酸不存在CCR532中。突变蛋白全长194aa。

• Lulu(-15bp)缺少了180-184位的5个氨基酸，其他序列与野生型CCR一致。突变蛋白全长347aa。

WT CCR5CCR532

CCR5-Nana+1bpCCR5-Nana-4bpCCR5-Lulu-15bp

未知功能的CCR5突变

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• 娜娜的两个CCR5突变，都导致了CCR5翻译的提前终止，极有可能破坏CCR5的功能，也许可以模拟CCR532的效果。

• 露露的一份CCR5蛋白缺少了5个氨基酸，其他序列与野生型一致，它对于CCR5功能的影响未知，风险更大。

• 贺健奎团队预测该缺失突变可能会导致蛋白构象不稳定，风险已告知家属，家属同意继续移植实验。

贺健奎PPT

对贺健奎的实验评价

不必要

不合法

不科学

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• 贺健奎事件为“违规操作以博取眼球的行为”做了错误的示范。

• 贺健奎的实验部分证明了基因编辑婴儿在技术上的可行性，可能打开了基因优生法的“潘多拉魔盒”。

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贺健奎事件的影响

GATTACA中的未来世界使用基因优生法进行阶级划分

• 露露和娜娜很可能会终生受到公众的关注，从而影响其正常的生活。她们一旦出现任何异常，将是Jesse Gelsinger事件的重演，政府很有可能采取“强监管”措施，限制基因治疗领域的发展。

• 贺健奎事件严重损害了中国科研界的声誉，国际合作方为了避免卷入类似的丑闻，会减少或避免与中国的学术交流。

88

贺健奎事件的影响

• 2019-1-22，调查组有关负责人表示，对贺建奎及涉事人员和机构将依法依规严肃处理，涉嫌犯罪的将移交公安机关处理。对已出生婴儿和怀孕志愿者，广东省将在国家有关部门的指导下，与相关方面共同做好医学观察和随访等工作。

• 科学无关道德，但科学家有道德，而且必须有。

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贺健奎事件的后续处理

谢谢大家!

改变生活生物技术

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改变生活的生物技术...

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